第一篇：杞菊地黃丸定性檢查及含量測定解讀

杞菊地黃丸定性檢查及含量測定

前言：實驗依據：有熟地之膩補腎水,即有澤瀉之宣泄腎濁以濟之;有英肉之溫澀肝經,即有丹皮之清瀉肝以佐之;有山藥收攝脾經,即有獲菩之淡滲脾濕以和之。藥止六味,而大開大合,三陰并治,詢補方之正鵲也”。本方配伍具有“三補”、“三瀉”的特點,但中熟地黃用量是山萸肉、山藥兩藥之和,且三辛傭明顯重于三瀉。枸杞和菊花增加了清肝明目的效果。現對杞菊地黃丸中各味藥材進行定性鑒別和含量測定。

關鍵詞;杞菊地黃丸；定性鑒別；含量測定；

1.地黃(鮮躍全)

定性鑒別（TLC法）

實驗儀器：超聲發生器、研缽、燒杯、微量移液管、、吹風機、研缽、燒杯、硅膠G薄層板、實驗材料：杞菊地黃丸 熟地黃 澤瀉 茯苓 枸杞子 牡丹皮 山茱萸 山藥細粉 菊花

實驗試劑：乙酸乙酯、冰醋酸、10%硫酸、蒸餾水正丁醇、甲苯、冰醋酸、無水乙醇、10%硫酸、蒸餾水

試驗方法

1.1供試品溶液的制備

1.1.1取杞菊地黃丸(濃縮丸)6g，研碎，加乙醇超聲處理分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇使溶解，作為供試品溶液。

1.1.2供試品溶液的制備

稱取顆粒劑2.2 g，研磨成細粉，加甲醇40 ml，超聲振蕩30 min。過濾。濾液濃縮至干,加乙酸乙酯2 ml溶解,得供試液。1.2對照品的制備

另取毛蕊花糖苷對照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。

1.3對照藥材的制備

稱取熟地黃浸膏粉0.5 g，按照供試品溶液制備方法，制得熟地黃藥材的對照液。

1.4陰性對照液的制備

按處方比例，取除去熟地黃以外的其余藥材，同供試品溶液制備方法分別制成陰性對照液。稱取澤瀉0.75g、茯苓0.75g，30ml水加熱回流提取1個小時，過濾，提取液濃縮至一定濃度；取枸杞子0.5g、牡丹皮0.75g,山茱萸1g和菊花0.5g，70%乙醇加熱回流提取1個小時，過濾，濃縮成適當濃度；合并以上兩種濃縮液，加山藥細粉1g；加70%乙醇20 mL，加熱回流提取1個小時，濾過，蒸干，加適量水溶解，分別用10ml乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇lml使溶解，作為陰性對照溶液。1.5薄層色譜法

1.5.1照薄層色譜法《中國藥典》(2010年版)附錄YIB試驗，吸取上述溶液各5uL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯—乙酸乙醋—冰醋酸((24 : 8 : 1)為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。

1.5.2薄層色譜照薄層色譜法《中國藥典》(2010年版)附錄YIB試驗，吸取上述溶液各5uL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水-甲醇(6∶3∶3∶2)為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，顯相同顏色的斑點且陰性對照液色譜在該位置上不顯斑點。

2.山藥（周開放）

【性味與歸經】味甘，性平。歸脾、肺、腎經。【功能與主治】補脾養胃，生津益肺，補腎澀精。

實驗材料：回流裝置、冷凝裝置、水浴鍋、坩堝、燒杯、微量移液管、硅膠G薄層板、吹風機。

實驗試劑：乙酸乙酯、甲醇、濃氨試液、無水乙醇、10％磷鉬酸。試驗方法

2.1供試品溶液的制備

取本品（杞菊地黃丸）粉末5g，加二氯甲烷30ml，加熱回流2小時，濾過，濾液蒸干，殘渣加二氯甲烷1ml使溶解，作為供試品溶液。2.2對照品的制備

另取山藥對照藥材5g，同法制成對照藥材溶液。對照藥材加二氯甲烷同法制成對照藥材溶液。

2.3陰性對照液的制備

按處方比例，取除去山藥以外的其余藥材，同供試品溶液制備方法分別制成陰性對照液。

1.稱取澤瀉0.75g、茯苓0.75g和熟地黃2g，30ml水加熱回流提取1個小時，過濾，提取液濃縮至一定濃度；

2.取枸杞子0.5g、山茱萸1g、牡丹皮0.75g和菊花0.5g，70%乙醇加熱回流提取1個小時，過濾，濃縮成適當濃度； 3.合并以上兩種濃縮液;加70%乙醇20 mL，加熱回流提取1個小時，濾過，蒸干，加適量水溶解，分別用10ml乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇lml使溶解，作為陰性對照溶液。2.5薄層色譜法試驗

照薄層色譜法《中國藥典》(2010年版)附錄YIB試驗，吸取上述溶液各5uL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液(9：1：0.5)為展開劑展開，取出，晾干，噴以10％磷鉬酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點且陰性對照液色譜在該位置上不顯斑點。

3.茯苓（劉保松）

實驗器材：50ml圓底燒瓶，冷凝管，蒸發皿，水浴鍋，過濾裝置，硅膠G薄層板，紫外檢測儀，吹風機

實驗材料：茯苓對照藥材、杞菊地黃丸

實驗試劑：乙醚，甲醇，甲苯，乙酸乙酯，甲酸，2%香草醛硫酸溶液，乙醇。

3.1供試品溶液制備

取杞菊地黃丸濃縮丸6g，研碎，加乙醚50ml(量筒)，超聲處理10分鐘，濾過(濾紙，漏斗)，濾液蒸干(蒸發皿，水浴鍋)，殘渣加甲醇1ml使溶解(移液管)，作為供試品溶液。3.2對照品藥材制備

取茯苓對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。

3.3陰性對照溶液制備

按處方比例，取除去茯苓以外的其余藥材，同供試品溶液制備方法制成缺茯苓陰性對照液。3.4薄層色譜法試驗

照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取上述兩種溶液各2ul，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯一乙酸乙酯一甲酸((20 ：5 ：0.5)為展開劑(移液管)，展開，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸溶液一乙醇(4：1)混合溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰(吹風機)。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點。或者照薄層色譜法(中國藥典20015年版中國藥典)試驗，吸取上述溶液各5uL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯一乙酸乙酯一冰醋酸((24 : 8 : 1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

4.澤瀉（王金龍）

實驗器材：氧化鋁柱，水浴鍋，蒸發皿，過濾裝置，硅膠H薄層板，紫外檢測儀，吹風機

實驗材料：澤瀉對照藥材、杞菊地黃丸

實驗試劑：乙酸乙酯，23-乙酰澤瀉醇B對照品，環己烷，乙酸乙酯，5%硅鎢酸乙醇。

4.1供試品溶液制備

取杞菊地黃丸濃縮丸6g，研碎，加乙酸乙酯20 m1(量筒)，超聲處理30分鐘，濾過(濾紙，漏斗)，濾液加于氧化鋁柱(200-300目，5g，內徑為l cm，干法裝柱)上，用乙酸乙酯10ml洗脫(移液管)，收集洗脫液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯l ml(移液管)使溶解，作為供試品溶液。4.2對照品藥材制備

取澤瀉對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。

4.3對照品溶液制備

另取23-乙酰澤瀉醇B對照品，加乙酸乙酯制成每1 ml含2mg的溶液，作為對照品溶液。4.4陰性對照溶液制備

按處方比例，取除去澤瀉以外的其余藥材，同供試品溶液制備方法制成缺澤瀉陰性對照液。稱取澤瀉0.75g、熟地黃2g，30ml水加熱回流提取1個小時，過濾，提取液濃縮至一定濃度；取枸杞子0.5g、山茱萸1g、牡丹皮0.75g和菊花0.5g，70%乙醇加熱回流提取1個小時，過濾，濃縮成適當濃度；合并以上兩種濃縮液，加山藥細粉1g；加70%乙醇20 mL，加熱回流提取1個小時，濾過，蒸干，加適量水溶解，分別用10ml乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇lml使溶解，作為陰性對照溶液。

4.5薄層色譜法試驗

照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取上述兩種溶液各5ul，分別點于同一硅膠H薄層板上，以環己烷一乙酸乙酯(1 : 1）為展開劑(移液管)，展開，取出，晾干，噴以5%硅鎢酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰(吹風機)。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。或者照薄層色譜法(中國藥典20015年版中國藥典)試驗，吸取上述溶液各5uL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯一乙酸乙酯一冰醋酸((24 : 8 : 1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

5.丹皮（雷銘宇）

儀器：加熱回流裝置、薄層板、紫外光燈

材料：乙酸乙酯、蒸餾水、甲醇、牡丹皮對照藥材、乙醚、丙酮、丹皮酚對照品、環己烷、鹽酸、三氯化鐵、乙醇 定性鑒別（TLC法）

5.1 供試品溶液的制備

取本品15g（天平），研碎，加水100ml，加熱回流3 0分鐘，放冷，離心，取上清液，用乙酸乙酯50ml（50ml量筒）振搖提取，分取乙酸乙酯液，蒸干（水浴鍋），殘渣加甲醇lml使溶解，作為供試品溶液。5.2對照藥材溶液提取

取牡丹皮對照藥材1g（天平），研碎，加乙醚40ml，加熱回流1 小時，濾過，濾液揮去乙醚，殘渣加丙酮lml（量筒）使溶解，作為供試品溶液。5.3對照品溶液的制備

取丹皮酚對照品，加丙酮制成每lml含lmg的溶液，作為對照品溶液。5.4陰性對照溶液的制備

取處方中除丹皮外的其余藥味，稱取澤瀉0.75g、茯苓0.75g、熟地黃2g和山茱萸1g，30ml水加熱回流提取1個小時，過濾，提取液濃縮至一定濃度（水浴鍋）；取枸杞子0.5g和菊花0.5g，70%乙醇加熱回流提取1個小時，過濾，濃縮成適當濃度；合并以上兩種濃縮液，加山藥細粉1g；加70%乙醇20 mL，加熱回流提取1個小時，濾過，蒸干，加適量水溶解，分別用10ml乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇lml使溶解，作為陰性對照溶液。5.5.1薄層條件

照薄層色譜法（通則0502)試驗，吸取上述三種溶液各

10ul分別點于同一硅膠G 薄層板上，使成條狀，以環己烷-乙酸乙酯（3：1)為展開劑（層析缸），展開，取出，晾干，噴以鹽酸酸性5 %三氯化鐵乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的條斑。5.5.2薄層板

硅膠Ｇ薄層板20ｃｍ×20ｃｍ×0.4ｃｍ,105℃ ,活化30ｍｉｎ備用;展開劑:-環乙烷-乙酸已酯-冰醋酸(10∶1∶0.1);斑點觀察:置紫外燈下(λ=254ｎｍ)檢識定位 5.6丹皮酚的含量測定 5.6.1材料與方法

紫外分光光度計、型電熱恒溫鼓風干燥箱、紫外分析儀劑均為99.9%無水乙醇、水為二次蒸餾水 5.6.1.2材料

牡丹皮、丹皮酚對照品

5.6.1.3對照品標準溶液的制備

精確稱取丹皮酚對照品0.005g置于 50ml燒杯中，以無水乙醇溶解’ 轉至 100ml容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，得到 50ug/ml 的丹皮酚對照品溶液

5.6.1.4結果與分析

5.6.1.4.1測定波長的選擇

以無水乙醇為對照品，在274nm出測的最大波長 5.6.1.4.2線性關系考察

分別吸取對照品溶液0.5ml，1ml，1.5ml，2ml，2.5ml，3.0ml，3.5ml，4ml，置于25ml容量瓶中!，用無水乙醇稀釋至刻度搖勻。以無水乙醇為空白溶液在 274nm 波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標樣品濃度為橫坐標繪制標準曲線。

5.6.1.4.3丹皮酚含量測定

準確稱取牡丹皮粉末 3.000g（分析天平），置于50ml錐形瓶中，加入25ml無水乙醇，60度恒溫水浴2h，趁熱過濾，置于25ml容量瓶中用無水乙醇溶液定容，作為供試品溶液。量取5份0.1ml牡丹皮供試品溶液分別置于25ml容量瓶中。用無水乙醇定容至刻度，搖勻，以無水乙醇為空白對照，于274nm波長處測定吸光度，測量三次，取平均值。丹皮酚含量測定結果如下表。

吸光度

檢出量ug/ml

平均檢出量ug/ml 丹皮酚含量

6.菊花（鄔學良）

定性鑒別（TLC法）

實驗器材：水浴鍋，超聲提取儀，過濾裝置，硅膠H薄層板,聚酰胺薄膜，紫外檢測儀、錐形瓶、分析天平、回流裝置、蒸發皿、5ml量瓶、25ml棕色量瓶 實驗材料：菊花，綠原酸供試品、杞菊地黃丸

實驗試劑：稀鹽酸，乙酸乙酯，甲醇，乙醇，正丁醇，甲酸，冰醋酸、氯仿

實驗方法

6.1供試品溶液制備方法

6.1.1取本品杞菊地黃丸（濃縮丸），研細(過一號篩)取約1g，精密稱定（分析天平）,置錐形瓶中,精密加人50％甲醇50ml,稱定重量,加熱回流2小時,冷卻,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取（10ml移液管）續濾液10ml,蒸干殘渣加氯仿5ml,浸漬3分鐘,棄去氯仿液,殘渣揮去氯仿（水浴，蒸發皿）,加水適量使溶解,并轉移5ml棕色量瓶中,加水至刻度,搖勻,即得。6.2對照品溶液的制備

取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50％甲醇制成每1 ml含綠原酸35μg的溶液，即得(10℃以下保存)。6.3對照藥材溶液制備

另取菊花對照藥材粉末1g，同供試品溶液制法制成對照藥材溶液。

6.4陰性對照溶液的制備

取處方中除菊花外的其余藥味，按上述供試品溶液制備陰性對照溶液。稱取澤瀉0.75g、茯苓0.75g和熟地黃2g，30ml水加熱回流提取1個小時，過濾，提取液濃縮至一定濃度；取枸杞子0.5g、牡丹皮0.75g和山茱萸1g，70%乙醇加熱回流提取1個小時，過濾，濃縮成適當濃度；合并以上兩種濃縮液，加山藥細粉1g；加70%乙醇20 mL，加熱回流提取1個小時，濾過，蒸干，加適量水溶解，分別用10ml乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇lml使溶解，作為陰性對照溶液。6.5照薄層色譜法 6.5.1薄層板

薄層板：硅膠板H 乙酯-甲酸-冰醋酸-水(1：15：1：1：2)的上層溶液，乙酸乙酯-甲酸-水（7：2.5：2.5）的上層溶液，乙酸乙脂:甲酸:水:乙醇(1:1:1:0.2)上層液，乙酸乙酯-正丁醇-水（4:5:1）的上層溶液 6.5.2薄層板

聚酰胺薄膜板展開劑：36%乙酸吸取上述四種溶液各0.5～1μl，分別點于同一硅膠板上，用展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

7.山茱萸（陳明璐）

實驗儀器：加熱回流裝置、高效液相色譜儀、滲漏裝置、吹風機、十八烷基硅烷鍵合硅膠

實驗材料：杞菊地黃丸、蒸餾水、乙酸乙酯、甲醇、山茱萸藥材、熊果酸對照品、甲苯、乙酸乙酯、冰醋酸、磷酸、莫諾苷、馬錢苷 7.1.供試品溶液的制備

取本品15g，研碎，加水100ml，加熱回流 30 分鐘，放冷，離心，取上清液，用乙酸乙酯 50ml 振搖提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇 lml 使溶解，作為供試品溶液。7.2對照藥材溶液的制備

取山茱萸對照藥材1g，加乙醚 40ml，加熱回流1小時，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯 lml 使溶解，作為對照藥材溶液。7.3樣品溶液的制備

另取熊果酸對照品，加乙酸乙酯制成每lml 含 lmg的溶液，作為對照品溶液

7.4陰性對照品溶液的制備

按處方比例和制法制備不含山茱萸的陰性樣品，制成陰性樣品溶液。稱取澤瀉0.75g、茯苓0.75g和熟地黃2g，30ml水加熱回流提取1個小時，過濾，提取液濃縮至一定濃度；取枸杞子0.5g、牡丹皮0.75g和菊花0.5g，70%乙醇加熱回流提取1個小時，過濾，濃縮成適當濃度；合并以上兩種濃縮液，加山藥細粉1g；加70%乙醇20 mL，加熱回流提取1個小時，濾過，蒸干，加適量水溶解，分別用10ml乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇lml使溶解，作為陰性對照溶液。7.5定性檢測

照薄層色譜法（通則0502)試驗，吸取〔鑒別〕（5)項下的供試品溶液及上述對照藥材溶液和對照品溶液各 5μl，分別點于同一硅膠 G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲酸（15 : 2 : 1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm)檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的斑點。

8.4.2吸取上述三種溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯-氯仿-甲酸（3：2：1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈365nm下檢視。

參考文獻：1.2015年《中國藥典》第一部

2.中華民族民間醫藥 2015 年8 月第24 卷第16 期 Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy，2015，Vol.24，No.16 3.第41 卷第12 期2013 年6 月廣州化工Guangzhou Chemical IndustryVol.41 No.12June.2013 4.[1]鄧如偉,冉蘭,李穎,張榕.杞菊地黃顆粒中六味藥材的薄層色譜鑒別[J].華西藥學雜志,2005,03:264-266.5.李永霞，靳湘，杜霞.高效液相色譜法測定杞菊地黃丸中綠原酸的含量[J].中國醫院藥學雜志.1549-1550.1.杞菊地黃丸中山藥的測定 2.杞菊地黃丸中茯苓的測定 3.杞菊地黃丸中澤瀉的測定 4.杞菊地黃丸中菊花的測定 5.杞菊地黃丸中枸杞的測定 6.杞菊地黃丸中丹皮的測定 7.杞菊地黃丸中山茱萸的測定

讀書的好處

1、行萬里路，讀萬卷書。

2、書山有路勤為徑，學海無涯苦作舟。

3、讀書破萬卷，下筆如有神。

4、我所學到的任何有價值的知識都是由自學中得來的。——達爾文

5、少壯不努力，老大徒悲傷。

6、黑發不知勤學早，白首方悔讀書遲。——顏真卿

7、寶劍鋒從磨礪出，梅花香自苦寒來。

8、讀書要三到：心到、眼到、口到

9、玉不琢、不成器，人不學、不知義。

10、一日無書，百事荒廢。——陳壽

11、書是人類進步的階梯。

12、一日不讀口生，一日不寫手生。

13、我撲在書上，就像饑餓的人撲在面包上。——高爾基

14、書到用時方恨少、事非經過不知難。——陸游

15、讀一本好書，就如同和一個高尚的人在交談——歌德

16、讀一切好書，就是和許多高尚的人談話。——笛卡兒

17、學習永遠不晚。——高爾基

18、少而好學，如日出之陽；壯而好學，如日中之光；志而好學，如炳燭之光。——劉向

19、學而不思則惘，思而不學則殆。——孔子

20、讀書給人以快樂、給人以光彩、給人以才干。——培根

第二篇：植物組織中淀粉含量的測定

植物組織中淀粉含量的測定 2007-01-12 08:55 Ⅰ 蒽酮硫酸法

一、原理

淀粉是由葡萄糖殘基組成的多糖，在酸性條件下加熱使其水解成葡萄糖，然后在濃硫酸的作用下，使單糖脫水生成糠醛類化合物，利用蒽酮試劑與糠醛化合物的顯色反應，即可進行比色測定。

二、實驗材料、試劑與儀器設備

（一）實驗材料 任何植物材料。

（二）試劑

濃硫酸（比重 1.84）。9.2mol/L HClO 4。

2%蒽酮試劑，同實驗 24。

（三）儀器設備

電子天平，容量瓶： 100 mL 4 個、50 mL 2 個，漏斗，小試管若干支，電爐，刻度吸管 0.5mL 1 支、2.0 mL 3 支、5 mL 4 支，分光光度計，記號筆。

三、實驗步驟

1.標準曲線制作

取小試管11支從0～10編號，按表24-3加入溶液和蒸餾水。

以下步驟按苯酚法或蒽酮法均可，見方法一或方法二，繪制相應的標準曲線。

表24-3 各試管加入標準液和蒸餾水量

管 號 0 1～2 3～4 5～6

7～8 9～10 淀粉標準液(ml)

0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸 餾 水（ml）

2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0

淀粉含量（mg）

0 40 80 120 160 200 2.樣品提取 稱取 50 ～ 100 mg 粉碎過 100 目篩的烘干樣品，置于 15 mL 刻度試管中，加入 6 ～ 7 mL 80 ％乙醇，在 80 ℃水浴中提取 30 min，取出離心（3000 rpm）5 min，收集上清液。重復提取兩次（各 10 min）同樣離心，收集三次上清液合并于燒杯，置于 85 ℃恒溫水浴，使乙醇蒸發至 2 ～ 3 mL，轉移至 50 mL 容量瓶，以蒸餾水定容，供可溶性糖的測定。

向沉淀中加蒸餾水 3 mL，攪拌均勻，放入沸水浴中糊化 15 min。冷卻后，加入 2 mL 冷的 9.2 mol/L 高氯酸，不時攪拌，提取 15 min 后加蒸餾水至 10 mL，混勻，離心 10 min，上清液傾入 50 mL 容量瓶。再向沉淀中加入 2 mL 4.6 mol/L 高氯酸，攪拌提取 15 min 后加水至 10 mL，混勻后離心 10 min，收集上清于容量瓶。然后用水洗沉淀 1 ～ 2 次，離心，合并離心液于 50 mL 容量瓶用蒸餾水定容供測淀粉用。

3.測定 取待測樣品提取液 1.0 mL 于試管中，再加蒽酮試劑 5 mL，快速搖勻，然后在沸水浴中煮 10 min，取出冷卻，在 620 nm 波長下，用空白調零測定光密度，從標準曲線查出淀粉含量（mg）。

四、結果計算 ：含量（%）=100*C*VT/V1*1000*W

式中： C ——從標準曲線查得淀粉量，mg。V T ——樣品提取液總體積 , mL。V 1 ——顯色時取樣品液量，mL。W ——樣品重，g。

0.9 ——由葡萄糖換算為淀粉的系數。

Ⅱ 碘-淀粉比色法

一、原理

對于淀粉含量較少的植株樣品，也可采用碘–淀粉比色法。淀粉在加熱情況下能溶于硝酸鈣溶液中，當碘化鉀和硝酸鈣共存時，碘能以碘–淀粉藍色化合物沉淀全部淀粉。將此沉淀溶于堿液，并在酸性條件下與碘作用形成藍色溶液進行比色。

二、實驗材料、試劑與儀器設備

（一）實驗材料 任何植物材料。

（二）試劑 ． 80 ％硝酸鈣溶液。． 0.5 ％碘液：稱 5.00 g 結晶碘和 10.00 g 碘化鉀，放入研缽混合干研，然后加 10 mL 蒸餾水研至全部碘溶解，將溶液全部轉入 1000 mL 容量瓶定容后，貯于磨口試劑瓶。

3 ． 5 ％含碘硝酸鈣溶液：取 10 mL 80 ％的硝酸鈣溶液，加入 160 mL 水再加入 3 mL 0.5 ％的碘液混勻，現用現配。．標準淀粉溶液：稱取純淀粉 50 mg 于研缽中，加 3 mL 80 ％硝酸鈣溶液，研細并轉移到 100 mL 的三角瓶中，用 15 mL 80 ％的硝酸鈣溶液沖洗研缽，無損地收集于三角瓶中。將三角瓶置于沸水浴中煮沸 5 min，冷卻后全部轉入 50 mL 容量瓶中并定容。此液為 1 mg/mL 的淀粉標準液。． 0.1 mol/L NaOH。6 ． 0.1 mol/L HCl。

（三）儀器設備

分析天平，研缽，容量瓶，量筒，三角瓶，水浴，小漏斗，電爐，離心機，離心管，試劑瓶。

三、實驗步驟 ．稱取 1 ～ 3 g 葉片，剪碎放入研缽，加 5 mL 80 ％的硝酸鈣溶液，研磨成糊狀移入 100 mL 的三角瓶中，用 10 mL 80 ％的硝酸鈣沖洗研缽，無損地收集于三角瓶中，瓶口蓋上小漏斗，在沸水浴上煮沸 3 ～ 5 min（葉片含淀粉少的 3 min，含淀粉多的 5 min），使樣品中淀粉轉變為膠體溶液。．給三角瓶中加 20 mL 蒸餾水，混合液轉入離心管中離心（2000 ～ 3000 rpm）2 ～ 3 min，將離心后的淀粉膠體渾濁液移入 100 mL 容量瓶（淀粉含量少時，可移入 50 mL 容量瓶），三角瓶及離心沉淀物用 5 ～ 10 mL 熱蒸餾水沖洗并同樣離心，離心液并入容量瓶中（共洗 2 ～ 3 次）定容，即為淀粉提取液。．取 5 ～ 10 mL 淀粉待測液，加入到盛有 2 mL 0.5 ％碘液的離心管中，混勻靜置 15 min 后離心（3000 rpm）5 min，棄上清液。沉淀用 5 ％的含碘硝酸鈣溶液沖洗兩次，向沖洗后的沉淀中加入 10 mL 0.1 mol/L 的 NaOH 混勻，將離心管浸入沸水內 5 min，使沉淀溶解。將溶液轉入 50 mL 容量瓶中，加入 0.3 mL 0.5 ％碘液，用 30 mL 左右的水沖洗并入容量瓶，加入 2 mL 1mol/L 的鹽酸，用水定容并顯色，在 590 nm 波長處測定光密度。4 ．繪制標準曲線 取標準淀粉溶液（1 mg/mL）0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 6 個離心管中，用 80 ％硝酸鈣溶液將各管的體積補足至 5 mL，再向各管加入 2 mL 0.5 ％碘液，混勻靜置 15 min 后離心，其他操作同樣品測定步驟，顯色后在 590 nm 波長下測定光密度。此系列溶液的淀粉含量分別為 0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg，然后以光密度為橫坐標，以淀粉含量為縱坐標繪制標準曲線。

四、結果計算 ：含量（%）=100*C*VT/V1*1000*W 式中： C ——從標準曲線查得淀粉量，mg。V T ——樣品提取液總體積 , mL。V 1 ——顯色時取樣品液量，mL。W ——樣品重（g）。

III 旋光法（谷物淀粉含量的測定）

一、原理： 酸性氯化鈣溶液與磨細的含淀粉樣品共煮，可使淀粉輕度水解。同時鈣離子與淀粉分子上的羥基絡合，這就使得淀粉分子充分地分散到溶液中，成為淀粉溶液。淀粉分子具有不對稱碳原子，因而具有旋光性，可以利用旋光儀測定淀粉溶膠的旋光度（α），旋光度的大小與淀粉的濃度成正比，據此可以求出淀粉含量。溶提淀粉溶膠所用的酸性氯化鈣溶液的pH值必須保持2.30，密度須為1.30，加時間的長短也要控制在一定范圍。因為只有在這些條件下，各種不同來源的淀粉溶液的比旋度［α］才都是203°，恒定不變。樣品中其他旋光性物質（如糖分）須預先除去。

二、材料、儀器設備及試劑：

（一）材料：面粉或其他風干樣品

（二）儀器設備：1.植物樣品粉碎機；2.離心機；3.分析天平；4.粗天平；5.旋光儀及附件；6.三角瓶；7.分樣篩（100目）；8.布氏漏斗、抽濾瓶及真空泵；9.離心管；10.小電爐。

（三）試劑：

三、實驗步驟：

1.樣品準備：（1）稱取樣品：將樣品風干、研磨、通過100目篩，精確稱取約2.5g樣品細粉（要求含淀粉約2g，請參考附注估計），置于離心管內。（2）脫脂：加乙醚數ml到離心管內，用細玻棒充分攪拌，然后離心。傾出上清液并收集以備回收乙醚。重復脫脂數次，以去除大部分油脂、色素等（因油脂的的存在會使以后淀粉溶液的過濾困難）。大多數谷物樣品含脂肪較少，可免去這個脫脂手續。（3）抑制酶活性：加含有氯化高汞的乙醇溶液10ml到離心管內，充分攪拌，然后離心，傾去上清液，得到殘余物。（4）脫糖：加80％乙醇10ml到離心管中，充分攪拌以洗滌殘余物（每次都用同一玻棒），離心，傾去下清液。重復洗滌數次以去除可溶性糖分。

2.溶提淀粉：（1）加醋酸－氯化鈣：先用醋酸氯化鈣溶液約10ml加到離心管中，攪拌后全部傾入250ml三角瓶內，再用醋酸氯化鈣溶液50ml分數次洗滌離心管，洗滌液并入三角瓶內，攪拌玻棒也轉移到三角瓶內。（2）煮沸溶解：先用蠟筆標記液面高度，直接置于加有石棉網的小電爐上，在4min～5min內迅速煮沸，保持沸騰15min～17min，立即將三角瓶取下，置流水中冷卻。煮沸過程中要時加攪拌，勿令燒焦；要調節溫度，勿使泡沫涌出瓶外；常用玻璃將瓶側的細粒擦下；并加水保持液面高度。

3.沉淀雜質和定容：（1）加沉淀劑：將三角瓶內的水解液轉入100ml容量瓶，用醋酸氯化鈣溶液充分洗滌三角瓶瓶，并入容量內，加30％ZnSO41ml混合后，再加15％K4Fe（CN）61ml，用水稀釋至接近刻度時，加95％乙醇一滴以破壞泡沫，然后稀釋到刻度，充分混合，靜置，以使蛋白充分沉淀。（2）濾清：用布氏漏斗（加一層濾紙）吸氣過濾。先傾清溶液約10ml于此濾紙上，使其完全濕潤，讓溶液流干，棄去濾液，再傾清溶液進行過濾，用干燥的容器接受此濾液，收集約50ml，即可供測定之用。

4.測定旋光度：用旋光測定管裝滿濾液，小心地按照旋光儀使用說明，進行旋光度的測定。淀粉（％）＝α×N×100/{[α]20D×L×(W－K)}×100 式中：α：用鈉光時觀測到的旋光度；［α］20 D：淀粉的比旋度，在這種方法條件下為203°；L：旋光管長度（cm）；W：樣品質量（g）；K：樣品水分含量（％）；N：稀釋倍數；100：換算為百分率。也可以不用上列公式計算，改用工作曲線來求得淀粉含量，這樣準確度高些。

Ⅲ、淀粉含量的測定

一、目的

掌握植物組織中淀粉含量測定的原理和方法。

二、原理

淀粉用鹽酸水解轉化成葡萄糖后，測定葡萄糖含量，根據葡萄糖含量換算成淀粉含量。

三、材料、儀器設備及試劑

材料、儀器設備及試劑與上述蔗糖的測定相同，另增加碘試劑；100ml、250ml容量瓶。碘試劑（碘化鉀—碘溶液）的配制：稱取碘化鉀20g及碘10g溶于100ml蒸餾水中。使用前需稀釋10倍。

四、實驗步驟

1.葡萄糖標準曲線制作與上述還原糖含量測定相同。2.淀粉的水解

取上述還原糖含量測定中經85﹪乙醇浸提后的全部淀粉殘渣，放入100ml三角瓶中，加 入6mol·L－1鹽酸10ml，混勻，在沸水浴中加熱10min－30min（用碘試劑檢查淀粉水解程度，直至不顯藍色為止），再加蒸餾水20ml,搖勻并過濾于100ml容量瓶中，過濾后殘渣再用蒸餾水沖洗3次，一并過濾入容量瓶，定容至100ml。準確取出10ml過濾液置入250ml容量瓶中，加酚酞2滴，用10﹪NaOH中和至微紅色，用蒸餾水定容至250ml，待測。

3.還原糖含量測定

取4 支25ml刻度試管，編號，其中3支（三個重復）分別加入待測液2ml,1支空白管加2ml蒸餾水代替樣品液，然后各管再加入DNS試劑1.5ml，搖勻，混合液在沸水浴中加熱5min，然后用自來水冷卻，各加入21.5ml蒸餾水使總體積為25ml，搖勻，在520nm波長下測定吸光度（A）值。

五、結果計算

根據待測液的吸光度從上述標準曲線中查出其相應的還原糖含量，然后按下公式計算出樣品中還原糖（葡萄糖）含量和淀粉含量的百分率。

淀粉水解液總量（ml）從標準曲線上查得還原糖(mg)×————————————

測定時水解液用量（ml）

還原糖（﹪）= ———————————————————————————×100

（葡萄糖）樣品重（mg）

粗淀粉含量（﹪）= 葡萄糖含量 × 0.9

式中系數0.9依據淀粉（C6 H10 O5）n水解時吸收n 個分子水。

第三篇：植物組織游離脯氨酸含量的測定

植物組織游離脯氨酸含量的測定

原理

植物在逆境條件下，游離脯氨酸便會大量積累，且積累指數與植物的抗逆性有關。因此，脯氨酸可作為植物抗逆性的一項生化指標。

采用磺基水楊酸提取植物體內的游離脯氨酸，不僅大大減少了其他氨基酸的干擾，快速簡便，而且不受樣品狀態(干或鮮樣)限制。在酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反應生成穩定的紅色縮合物，用甲苯萃取后，此縮合物在波長520nm處有一最大吸收峰。脯氨酸濃度的高低在一定范圍內與其消光度成正比。材料、儀器設備及試劑 1．材料

植物葉片

2．儀器設備

分光光度計；水浴鍋：漏斗：大試管(20m1)；具塞刻度試管(20m1)注射器或滴管(5～lOml)。3．試劑

(1)3％磺基水楊酸溶液

(2)甲苯；

(3)2.5％酸性茚三酮顯色液：冰乙酸和6mo1.L-l磷酸以3:2混合，作為溶劑進行配制，此液在4℃下2～3天有效；

‘

(4)脯氨酸標準溶液：準確稱取25mg脯氨酸，用蒸餾水溶解后定容至250ml，其濃度為100ug.mL-l。再取此液10ml，用蒸餾水稀釋至lOOml，即成10μg．mL-1的脯氨酸標準液。

1．標準曲線制作

（1）取7支具塞刻度試管按表9.2-1加入各試劑。混勻后加玻璃球塞，在沸水中加熱40min。

(2)取出冷卻后向各管加入5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質。靜置待分層后吸取甲苯層以0號管勻對照在波長520nm下比色。

（3）以消光值為縱坐標，脯氨酸含量為橫坐標，繪制標準曲線，求線性回歸方程

表9．2．1各試管中試劑加入量 試管

0

脯氨酸標準溶液(m1)

0

0．2

0．4

0．8

1．2

1．6

2．0

水(m1)

1．8

1．6

1．2

0．8

0．4

0

冰乙酸(m1)

茚三酮顯色液(m1)

樣品測定

（1）脯氨酸提取：取不同處理的剪碎混勻植物葉片0．2～0．5g(干樣根據水分含量酌減)，分別置于大試管中，加入5m1 3％磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提10min。

(2)取出試管，待冷卻至室溫后，吸取上清液2m1，加2m1冰乙酸和3m1顯色液，于沸水浴中加熱40min，下步操作按標準曲線制做方法進行甲苯萃取和比色（向各管加入5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質。靜置待分層后吸取甲苯層以0號管勻對照在波長520nm下比色）。

(3)結果計算：從標準曲線中查出測定液中脯氨酸濃度 脯氨酸含量的百分數。

脯氨酸[μg.g-1(干或鮮重)](C．V)·(a·W)－1

式中：C一提取液中脯氨酸濃度(PS)，由標準曲線求得：

V － 提取液總體積（ml）

A---測定時所吸取得體積（ml）

W-----樣品重（g）

第四篇：天然氣水露點水含量測定方法總結

天然氣處理與加工

—天然氣水露點/水含量測定方法總結

姓名：

班級：

學號：

日期：

目

錄

一．前言

二．天然氣水含量的測定 1.絕對法

（1）吸收稱重法(ISO11541)（2）卡爾費休法(ISO10101)<1>.電位滴定法 <2>.庫侖法

（3）電解法（SY/T7507-1997）（4）紅外法 2.相對法（1）色譜法（2）濕度計法

<1>.電容法 <2>.壓電法 <3>.電導法 <4>.光學法

三．天然氣水露點的測定

冷卻鏡面法(GB/T17238-1998)四．參考文獻

一．前言

水蒸氣含量或水露點是商品天然氣一項重要的技術指標。天然氣從地下產出,一般均含有一定量的水。而且天然氣在輸配過程中通過積存有水的管網,也會使水存在于天然氣中。水會形成水合物,可能引起管線水堵。在低溫條件下,可能造成管線冰堵。水還會使管線、設備和儀表產生腐蝕,直接影響天然氣計量的準確度,給天然氣的安全生產和使用造成極大危害。管輸天然氣、車用壓縮天然氣等產品標準(SY7514-1988和SY/T7546-1996)均對水的含量做了嚴格規定。故測定天然氣的水含量、水露點尤為重要，下面二三部分對其測定方法進行了總結。

二．天然氣水含量的測定

1.絕對法

（1）吸收稱重法(ISO11541)吸收稱量法是一種簡便易操作,且能用于高壓下在線測定的方法。國際上頒布了ISO11541：1997《天然氣-高壓下水含量的測定》，該方法適用于壓力>1 MPa、水含量≧10 mg/m3的天然氣,也可應用于含硫化氫的天然氣。

基本原理為一定體積的氣體通過充填有顆粒狀P2O5的吸收管,氣體中水被P2O5吸收形成磷酸。吸收管增加的重量即為氣體中所含水的量。在氣體流速為2~3 m3/h,總的通過體積為1.5~3 m3的條件下,方法不確定度預計為測定值的±5%(但不優于5 mg/m3),檢測限預計為10 mg/m3。水含量的測定：按圖3裝配測定裝置。在吸收管中填入顆粒狀的P2O5后稱量吸收管(m0),將吸收管裝入壓力容器中。調節流速讓氣體通過吸收管,待通過量達到1.5~3 m3時,減壓后卸下壓力容器,再一次稱量吸收管(m1)。吸收量不應超過吸收管吸收容量一半,否則無效。

（2）卡爾費休法(ISO10101-1,2,3)

ISO/TC193于1993年頒布了以卡爾費休法測定天然氣中水含量的3項國際標準,即導論、電位滴定法和庫侖法。

卡爾費休法的基本原理是氣體樣品中的水同卡爾費休試劑(吡啶/甲醇混合物)中的碘和二氧化硫發生反應。反應式為: CH3OH+SO2+R3Ny[R3NH]SO3CH3 H2O+I2+[R3NH]SO3CH3+2R3Ny[R3NH]SO4CH3+2[R3NH]I 在應用中將根據實際情況選擇使用電位滴定法和庫侖法。

<1>.電位滴定法

該方法適用于水含量在5~5 000 mg/m3的天然氣。方法原理為一定體積的氣體通過含相對少量堿性吸收液的吸收池,氣體中所含的水溶于吸收液中,然后用卡爾費休試劑滴定,終點由電位法確定。卡爾費休試劑相當的水含量適宜值約為5 mg/ml。

水含量的測定:卡爾費休電位儀平面示意圖見圖1。在滴定池中 加入適量的堿性吸收液,滴加卡爾費休試劑反復調零直至穩定。需要的話也可加入足夠量的水來調零。待取樣管線吹掃干凈后,將取樣管線同滴定池連接,并通入一定量的氣體,滴加試劑使指針保持在零位。記錄流量計上的讀數V、溫度T及壓力值P和滴加的試劑體積VR。由于取樣管線和樣品流等的不確定度,第一次滴定結果通常誤差較大,故舍棄。多次重復測定,取平均值。

<2>.庫侖法

該方法適用于水含量在5~5 000 mg/m3的天然氣和其它氣體。方法原理為一定體積的氣體通過含無水陽極溶液的滴定池。氣體中水被陽極溶液溶解吸收。由碘化物電解產生的碘按卡爾費休試劑反應原理同水發生反應。用庫侖法測定消耗的碘即可得到溶解水的量。

水含量的測定：卡爾費休庫侖儀平面示意圖見圖2。在陽極溶液池中加入適量的標準溶液,然后滴定。滴定結果應在誤差范圍內同標準溶液實際含水量一致。待取樣管線吹掃干凈后,將取樣管線同滴定池連接,邊通入一定量的氣體,邊滴定。對低水含量氣體,則推薦待通入氣體達到一定量后再開始滴定。當氣體中水含量低于100 mg/m3時,應進行空白試驗(在氣體入口安裝一個P2O5吸收管)以校正樣品攪動造成的碘蒸發損失。由于取樣管線和樣品流等的不確定度,第一次滴定結果通常誤差較大,故放棄。多次重復測定,取平均值。

（3）電解法（SY/T7507-1997）

SY/T7507-1997規定了用電解法測定天然氣中水含量的方法,適用于水含量體積分數小于4 000×10-6的天然氣。若天然氣中無凝液存在且總硫含量小于500 mg/m3,對測定無影響。

電解法測定天然氣中含水量的原理是樣品氣以一定的恒速通過電解池,其中的水分被電解池內的五氧化二磷膜層吸收,生成亞磷酸后被電解為氫氣和氧氣排出,而五氧化二磷得以再生。電解電流的大小正比于樣品氣中的水含量,故可用電解電流來量度樣品氣中的水量。

測定儀器：天然氣工業常用的USI-1A型微量水分測定儀，其基本結構如圖2所示(圖中干燥器4內裝有40~60目5A分子篩)。（4）紅外法

基本原理：包括水蒸氣在內的大多數氣體都會在特定的波長上吸收紅外線,且吸光率是與該氣體的濃度有關,因而測定吸光率即可測定氣體中的水蒸氣含水量。2.相對法（1）色譜法

基本原理:用帶有熱導池檢測器的氣相色譜儀，由色譜拄將試樣中水與其它組分分離，根據記錄下的水的峰面積(或峰高)，用外標法計算水分的含量。

定性分析：試樣中的水分采用純物對照保留時間定性。首先用l 注射器向汽化室注入O．1μL純水，并記下水的保留時間，然后經六通閥進一燃氣試樣，出峰后對照純水的保留時間找出試樣中的水峰。定量分析：試樣的水分含量采用外標法定量計算，即用與試樣中水分含量相應的標準試樣進行外標定量，也可采用甲醇作外標物進行 定量。（2）濕度計法 <1>.電容法

基本原理：傳感元件為貼有一層金箔的純鋁片,后者經硫酸處理而形成一個多孔的氧化鋁層,從而構成電容器的2個電極。當氣流中水蒸氣被氧化鋁層吸收時,電容就相應發生變化。<2>.壓電法

基本原理：傳感元件大多為石英制作的壓電晶體。把兩側裝有電極且涂敷了吸濕性物質的壓電晶體片安裝在共振器上,當后者以特定的頻率振動時,其頻率與電極厚度、晶體類型、電極質量等因素有關。壓電晶體吸收了氣流中的水蒸氣后,振動頻率就相應發生變化。<3>.電導法

基本原理：當一種不飽和鹽溶液與含水蒸氣的氣體接觸時,前者就吸收后者中的水蒸氣,直到兩者的水蒸氣分壓相平衡。在鹽溶液吸收水蒸氣后,其電導也相應發生變化。<4>光學法

基本原理：傳感元件為法貝一佩羅德(FABRY一PERaT)型光學共振器,它由約20片反射指數不同的薄片組成。反射指數高的材料一般為金屬氧化物(如氧化錯),而反射指數低的材料則為吸濕性物質。當光學共振器吸收水蒸氣后,其反射光譜相應發生變化,吸收水分愈多則被反射光的波長愈長,故分析反射光譜的變化即能測定氣體中的水蒸氣含量。

關于以上方法測定水含量的比較總結如表1所示：

三．天然氣水露點的測定

冷卻鏡面法(GB/T17238-1998)該標準等效采用國際標準ISO6327-1981《天然氣水露點的測定冷卻鏡面凝析濕度計法》。制訂國標前,由四川石油管理局天然氣研究院對ISO6327進行了驗證研究。結果表明:該國際標準的精密度較高,測定范圍寬,檢測下限低,適合于等效采用作為國家標準,但為能適應我國天然氣工業的實際情況,擴大了測定范圍。

冷卻鏡面凝析濕度計法是通過檢測濕度計上的水蒸氣凝析物或檢查鏡面上凝析物的穩定性來測定水露點。經處理的管輸天然氣的水露點范圍一般為-25℃~5℃。在相應的氣體壓力下,水含量的體積分數為50×10-6~200×10-6。特殊情況下水露點測定范圍也可以更寬。如果樣品在測試系統中的總壓力大于或等于大氣壓,上述濕度計不需校正也可用于測定水的蒸氣壓,水蒸氣分壓與所測露點間的關系取決于所用方法和測量水平。如果測定環境中含有凝析溫度接近或高于水露點的氣體,則水露點℃的測定相當困難。

儀器與測定：以美國千德勒(EG&G Chandler)石油儀器公司 生產的13-200型露點儀為例,其基本結構如圖1所示。測定時,樣品氣先進入樣品池,用出口閥調節出口流量至最佳。向致冷室注入致冷劑使導冷桿降溫,與之連接的鏡面溫度也隨之下降。當通過觀察 孔見到鏡面中央開始有微小的圓形露點出現時,記下此溫度值;再升溫觀察露點剛好消失的溫度。前后兩個溫度的平均值即為水露點。

四．參考文獻 陳賡良.測定天然氣水蒸氣含量/水露點的方法與儀器.石油儀器，2000,14（4）陳賡良.天然氣物性的直接測定.石油儀器，1999,13（6）3 羅 勤，邱少林.天然氣中水含量分析方法標準簡介.石油與天然氣化工，2000,96 4 顏曉琴.四種天然氣水含量分析方法的對比研究.石油與天然氣化工,2012,41(3)5 張寶成，李春瑛.人工煤氣、天然氣和液化石油氣中水分的氣相色譜分析,1996,12(2)6 萬征平.電解法測定天然氣含水量評價及改進措施.中國石油長慶油田分公司第一采氣廠 楊 芳,石曉松.吸收稱量法測定天然氣中的水含量.化學研究與應用,2008,20(5)

第五篇：HPLC測定有關物質和含量方法驗證小結

本貼的目的：討論目前審評尺度下，藥品研發過程中，分析方法的驗證項目及目的，試驗方法，試驗要求

本帖僅僅針對于HPLC方法進行討論

方法開發的內容不在本帖討論范圍內

1．有關物質（適用于API，制劑，也適用于起始物料，中間體）

有關物質方法驗證的前提條件：

1.各雜質與主峰的混合溶液能用擬定的分析方法有效分離

2.根據混合溶液中各峰的紫外吸收波長（或單獨測定各組分紫外吸收），選擇合適的檢測波長。多波長檢測（如有）則分別考察。

3.在檢測波長下，選擇峰高最小的，計算S/N，預估主成分濃度 4.各雜質純度已知

5.根據合成跟蹤檢測，合理制定各雜質的限度 6.供試品溶解方法和提取方法得到合理證明

1.1專屬性： 1.1.1概念

在其他成分（如其他雜質，輔料，溶劑）可能存在的情況下，擬定的分析方法能正確測定被檢測物的能力。1.1.2試驗方法 1.1.2.1定位試驗： A.目的

對各已知雜質和主峰進行定位 B.試驗方法：

a．配制一定濃度（能夠顯示出峰純度，一般為0.1mg/ml）的各已知雜質溶液、擬檢測濃度的主成分作為定位溶液

b．配制限度濃度各已知雜質與檢測濃度的主成分的混合溶液作為分離度試驗溶液 c．使用擬定分析方法分別進行定位。C.試驗要求：

a．空白應不干擾各雜質的測定：如雜質附近有空白峰，二者分離度應大于1.5；雜質峰保留時間處不得為梯度峰拐點

b．定位溶液中，已知雜質與主峰的峰純度應符合規定

c．分離度試驗溶液中，主峰與相鄰雜質的分離度應大于2.0（至少1.5）；各已知雜質之間的分離度應大于1.5（至少1.2）； 1.1.2.2強制降解試驗 A.目的

一是通過考察藥品在一系列劇烈條件下的穩定性，了解該藥品內在的穩定特性及其降解途徑與降解產物。其二，這些試驗也能在一定程度上對有關物質分析方法用于檢查降解產物的專屬性進行驗證。B.試驗方法

對于高溫、光照、強酸、強堿及強氧化劑的濃度及時間、取樣方式等沒有明確的規定。具體品種具體模索，初步試驗了解樣品對影響的因素（高溫、光照、酸、堿、氧化）等條件基本穩定情況后，進一步調整破壞試驗條件，只要使主藥有一定量的降解，并對可能的降解途徑和降解機制進行分析，保證實驗的意義即可。試驗一般的范圍為：

強酸：0.1~5.0mol/L HCl溶液或視情況調節時間，溫度，體積 強堿：0.1~5.0mol/L NaOH溶液或視情況調節時間，溫度，體積

強氧化劑：30%的H2O2或視情況配制不同濃度的溶液或視情況調節時間，溫度 高溫：固體狀態下穩定的主藥，可以考慮溶解后以液體狀態進行試驗 光照：固體狀態下穩定的主藥，可以考慮溶解后以液體狀態進行試驗 C.試驗要求

a.一般樣品含量控制在85%—90%范圍（歸一化法），不一定要求每個條件都能降解出來。

b.在進行酸、堿、強氧化破壞試驗時，每個試驗最好都要做相應的空白（溶劑，空白輔料，復方制劑還包括除去某一主藥的其他組分）破壞試驗作為輔助。

c.主峰純度符合規定，與相鄰雜質分離度大于2.0（至少1.5），已知雜質與相鄰雜質分離度大于1.2 d.物料守恒，即未破壞主藥的C/A與破壞后的C/A值相比，結果在0.9~1.1之間

e.關于破壞試驗，更多內容請參閱lyslinjiu版主在帖子【討論】2013-專屬性實驗（強制降解試驗）2013-專屬性實驗（強制降解試驗）-丁香園論壇

f.在此處做梯度時間（如有）延長驗證試驗。即將分析方法的梯度中，有機相比例最大的時長延長（建議延長時間為主峰保留時間或10~20min），考察是否降解出難以洗脫的物質在擬定方法的梯度周期內能有效檢出。進一步考察分析方法的合理性

1.2定量限 1.2.1概念

樣品中能被定量測定的最低量，有定量意義。1.2.2驗證方法 A.目的

考察雜質的能被定量的最低量，同時評判供試品濃度的選擇是否合理 B.試驗方法

配制限度濃度的各已知雜質與主成分的混合溶液作為貯備液，進樣，逐步稀釋至S/N約為10時，得定量限。C.試驗要求

定量限濃度不得高（修正，原為低）于限度濃度的1/5

1.3檢測限 1.3.1概念

樣品中能被檢測出的最低量，僅作為限度試驗指標和定性鑒別的依據，沒有定量意義。1.3.2驗證方法 A.目的

考察雜質的最低檢出量，同時評判供試品濃度的選擇是否合理 B.試驗方法

配制限度濃度的各已知雜質與主成分的混合溶液作為貯備液，進樣，逐步稀釋至S/N約為3時，得檢測限。C.試驗要求

檢測限濃度不得高（修正，原為低）于限度濃度的1/10

1.4溶液穩定性 1.4.1目的

考察被測各溶液在特定時間周期內的穩定性 1.4.2試驗方法

a.配制系統適應性溶液、供試品溶液、對照品溶液，在室溫條件下，分別在各時間點進樣 b.如不穩定，需考察在低溫條件下的溶液穩定性

c.時間范圍根據試驗需要來確定。比如做回收率中需要至少連續測定9份供試品，是所有單個驗證項目中最長的，選擇這個時間點是可以的。也有考慮到以后需要測定更多的樣品，選擇更長的時間范圍。1.4.3試驗要求

a.系統適應性溶液，各峰之間分離度應符合要求。b.對照品溶液峰面積RSD應小于2.0% c.供試品溶液，雜質個數和雜質量應一致，峰面積RSD應小于5.0%；不得檢出新增雜質 d.如不穩定，需臨用現配或低溫保存

1.5儀器精密度 1.5.1概念

同一溶液，連續進樣6次，其tR和峰面積的精密度，考察儀器的進樣精密度 1.5.2試驗方法

配制限度濃度的各雜質和主成分的混合溶液，連續進樣6次 1.5.3試驗要求 a.tR的RSD小于2.0% b.各峰面積RSD小于2.0%

1.6線性與校正因子 1.6.1概念

在設計的范圍內，被測物濃度與峰面積的線性關系 1.6.2試驗方法

配制各雜質和主成分的混合溶液，逐步稀釋，濃度范圍從定量限至限度濃度的120%以上，至少配制5份以上溶液。由2人分別進行。1.6..3試驗要求

a.線性關系系數r大于0.990 b.Y軸截距應在100％響應值的25％以內 c.響應因子的相對標準差應不大于10% d.2人測得斜率之比在0.98~1.02之間

e.計算出來的校正因子應進行修約，在0.9~1.1范圍內的，修約為1.0進行計算；0.2~5.0范圍內的，按校正因子計算；0.2~5.0范圍外的，按外標法計算。

1.7精密度 1.7.1概念

同一個均勻供試品，經多次取樣測定結果之間的接近程度。1.7.2重復性 1.7.2.1試驗方法

由同一試驗人員，取同一均勻供試品，平行配制6份供試品溶液，測定雜質百分含量。1.7.2.2試驗要求

a.檢出雜質個數，雜質相對保留時間，各雜質百分含量均應一致 b.單個雜質的百分含量的極差應在其含量±10%以內 c.雜質總量的RSD應小于5.0% 1.7.3中間精密度 1.7.3.1試驗方法 同一實驗室，由不同試驗人員在不同時間使用不同設備，平行配制6份供試品溶液，測定雜質百分含量。1.7.3.2試驗要求 a.同1.7.2.2-a和b b.單個雜質和雜質總量的RSD應小于10.0%

1.8回收率 1.8.1概念

用擬定分析方法所測得結果與真實值接近的程度。1.8.2試驗方法

a.配制各雜質的混合貯備液

b.稱取供試品適量，精密加入混合雜質貯備液適量，配制成溶液，使供試品濃度為測定濃度，雜質濃度分別為限度濃度的50%，100%，150%。各濃度均平行配制3份 c.配制混合雜質對照品溶液和自身對照溶液 1.8.3試驗要求

a.各濃度下的回收率應在90%~110%之間 b.回收率（N=9）的RSD應小于10.0% c.用加校正因子的自身對照法計算結果應與雜質外標法計算結果一致

1.9耐用性 1.9.1概念

在擬定的分析方法有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度，為所建立的分析方法用于常規檢測提供依據

1.9.2試驗方法

a.分析方法中可變動的因素有：流動相組成比例，水相pH，柱溫，色譜柱（同一品牌不同批次，不同品牌的常用色譜柱），流速，檢測波長

b.配制系統適應性溶液，供試品溶液，對照品溶液進行測定 1.9.3試驗要求

a.系統適應性溶液應符合規定；如不符合規定，則需更嚴格控制所變化的因素，直至找到一個合適的范圍；如指定色譜柱，嚴格控制pH等等

b.檢測雜質個數，雜質的相對保留時間應與精密度結果一致 c.測得雜質量應與精密度結果一致

2．含量測定（適用于API，制劑，也適用于單個雜質控制）含量測定方法驗證的前提條件：

1.空白（溶劑和輔料）和各雜質不干擾主峰的測定

2.根據主成分的紫外吸收波長（復方需分別單獨測定各組分紫外吸收），選擇合適的檢測波長。多波長檢測（如有）則分別考察。

3.在檢測波長下，計算S/N，預估主成分濃度 4.供試品溶解方法和提取方法得到合理證明

2.1專屬性： 2.1.1概念

在其他成分（如其他雜質，輔料，溶劑）可能存在的情況下，擬定的分析方法能正確測定主成分的能力。2.1.2試驗方法 2.1.2.1定位試驗： A.目的同1.1.2.1-A B.試驗方法同1.1.2.1-B C.試驗要求：

a．空白應和各雜質不得干擾主成分的測定，主峰保留時間處不得為梯度峰拐點（如有）b．定位溶液中，主峰的峰純度應符合規定

c．分離度試驗溶液中，主峰與相鄰雜質的分離度應大于2.0 2.1.2.2強制降解試驗 A.目的

一是通過考察藥品在一系列劇烈條件下的穩定性，了解該藥品內在的穩定特性及其降解途徑與降解產物。其二，這些試驗也能在一定程度上對含量測定分析方法用于檢查主成分的專屬性進行驗證。B.試驗方法 同1.1.2.2-B C.試驗要求

a.主峰純度符合規定，與相鄰雜質分離度大于2.0 其他同1.1.2.2-C

2.2定量限 2.2.1概念

樣品中能被定量測定的最低量，有定量意義。2.3.2驗證方法 A.目的

考察主成分的能被定量的最低量，同時評判供試品濃度的選擇是否合理 B.試驗方法

配制檢測濃度的主成分溶液，進樣，逐步稀釋至S/N約為10時，得定量限。C.試驗要求

定量限濃度不得高（修正，原為低）于檢測濃度的1/10

2.3溶液穩定性

試驗要求為主成分峰面積RSD小于2.0% 如溶出檢測方法同含量，建議考察一個溶出曲線周期內的溶液穩定性 其他同1.4項下 2.4儀器精密度

試驗要求為主成分峰面積RSD小于2.0% 其他同1.5項下

2.5線性與校正因子 2.5.1概念

在設計的范圍內，被測物濃度與峰面積的線性關系 2.5.2試驗方法

配制主成分貯備液，逐步稀釋，濃度范圍從檢測濃度80%至120%，至少配制5份以上溶液。由2人分別進行。2.5.3試驗要求 同1.6.3

2.6精密度 2.6.1概念

同一個均勻供試品，經多次取樣測定結果之間的接近程度。2.6.2重復性 2.6.2.1試驗方法

由同一試驗人員，取同一均勻供試品，平行配制6份供試品溶液，測定主成分百分含量。2.6.2.2試驗要求

6份供試品含量結果RSD應小于2.0% 2.6.3中間精密度 2.6.3.1試驗方法

同一實驗室，由不同試驗人員在不同時間使用不同設備，平行配制6份供試品溶液，測定主成分百分含量。2.6.3.2試驗要求

a.6份供試品含量結果RSD應小于2.0% b.12份供試品含量結果RSD應小于2.0%

2.7回收率 2.7.1概念

用擬定分析方法所測得結果與真實值接近的程度。2.7.2試驗方法

a.API在精密度，線性和專屬性推算出來的情況下可豁免驗證

b.制劑：稱取空白輔料適量（相當于100%檢測濃度的主藥），精密加入對照品（或已知含量的主藥）適量，配制成溶液，使供試品濃度分別為測定濃度80%，100%，120%。各濃度均平行配制3份 c.配制對照品溶液 2.7.3試驗要求

a.各濃度下的回收率應在99%~101%之間 b.回收率（N=9）的RSD應小于2.0%

2.8耐用性 2.8.1概念

2.8.2試驗方法：同1.9.1 2.8.3試驗要求：同1.9.2 測得結果應與精密度結果一致 其他同1.9.3