第一篇：【微生物檢測】 關于使用微生物方法測定食品中葉酸含量的一點心得

【微生物檢測】+關于使用微生物方法測定食品中葉酸含量的一

點心得

時光荏苒，下筆之時才猛然驚覺自己已經在微生物檢測一線奮斗了6年之久，6年里從懵懂到興奮，從興奮到麻木，再從麻木到坦然，6年里有過厭倦，有過迷惘，但是最后都堅持了下來，雖然現在已經不在檢測一線工作（還是與檢驗有關，但是不再進行實驗），回想6年來走過的路，還是感慨良多，當初的微生物檢測經驗也還是寶貴的工作經驗積累，這次就先談談微生物與維生素的關系，文筆有限，既歡迎志同道合的朋友的點贊，也歡迎各路大神大師的神級吐槽，希望我們可以一起討論，一起進步~ 不知道現在的小伙伴們測試食品中的葉酸、維生素B12和游離生物素都是用什么方法呢？是比較繁瑣的傳統的微生物方法呢，還是比較簡便快速的試劑盒法呢，估計很多小伙伴們都選用試劑盒法了，畢竟時代在進步，檢測水平也在不斷提升，但是就像電視機的問世并沒有取代收音機一樣，傳統的微生物方法雖然繁瑣，耗時較長，但是靈敏度高，不容易漏檢，所以還是有它的優勢在，所以下面我就著重的跟小伙伴們分享一下使用微生物方法（光密度法）測試食品中葉酸的過程中可能會出現的問題以及一些注意事項，希望能給大家提供一些幫助或者拓寬一下大家的檢測思路。

葉酸的測定

葉酸的測定一般常用的有兩種方法，分別是GB5413.16-2010和GB5009.211-2014，前者主要針對的是嬰幼兒食品，尤其是嬰幼兒乳制品，后者的檢測對象比較寬泛，適用于多種類型的食品，比如水果蔬菜等天然食品，還有淀粉含量比較高的米粉類制品，以及葉酸含量較高的營養強化劑等，所以面對不同的樣品，要選擇合適的標準進行測試。

測定原理之類的標準上都有，測試之前仔細看清楚就行，這里就不再贅述了，下面就按照日常的測試流程給大家梳理一遍，里面會提及常見的問題及注意事項。

1、標準溶液的制備：標準品一定要準確稱量，而且計算需要量的時候要考慮標準品含水量之類的因素，不要算錯了，標準溶液是標桿，它如果出現錯誤，后面的每一步就都沒有意義了，配置的時候記得加氨水，葉酸標準品是溶于堿性環境的，不加氨水溶解不完全，建議除了工作液現用現配外，儲備液和中間液先都一起配好，貼好試劑標簽，放4℃冰箱保存，還有要注意，配置標準溶液時不要稱樣，稱樣的時候不要配置標準溶液，以防交叉污染。

2、樣品的制備以樣液的提取：GB5413.16-2010里面需要配制的磷酸緩沖液有四種，但其實實際用下來感覺沒什么區別，所以平時常用的是含有0.05mol/L抗壞血酸的磷酸緩沖液（5413和5009通用），如果使用5413的方法，樣品是比較容易溶解的乳粉類，就可以直接稱量到容量瓶里面進行定容，如果樣品是含淀粉較多的面條或米粉類，先稱取樣品到潔凈的150mL小燒杯里，加入30mL含有0.05mol/L抗壞血酸的磷酸緩沖液，121℃滅菌15min，冷卻到室溫后加入1mLα-淀粉酶溶液和1mL木瓜蛋白酶溶液，（這里我沒有加雞胰酶，因為我個人認為雞胰酶適用于酶解天然物質中含有的天然葉酸，像嬰幼兒米粉之類的樣品都經過葉酸強化了，天然葉酸含量已經遠遠低于強化的葉酸含量，所以用不用雞胰酶分解已經意義不大，如果是天然面條或米粉，可以按標準加4mL雞胰酶）然后就放到36℃培養箱里過夜培養，不要超過24h，然后105℃水解5min（這一步是降解前面加入的酶，去除酶對實驗的影響）調pH，用水定容，然后進行后續提取操作。這里要注意區分樣品的基質，油性的樣品基本不適用微生物方法來測葉酸的含量，我試過很多次，感覺無法從油水分離的東西里面提取葉酸，如果大家有好的方法，歡迎推薦并討論哦~ 如果使用5009方法，樣品是天然物質的一定要趁新鮮的時候取樣，而且要快速，當天取樣當天操作，減少葉酸損失，樣品是堅果或者大米之類的，需要先粉碎成粉末狀，不然提取不完全，樣品是營養強化劑的，注意計算稀釋倍數，以免稀釋過程中出現錯誤，多次稀釋時也要注意減少誤差，不然對后面的實驗結果產生較大的影響。提取過程跟5413差不多，該加酶的加酶，該過濾的過濾。

3、培養基的制備：葉酸測定用培養基最好買進口的（推薦BD家的，不是我不支持國貨，國產培養基不知道是營養物質不夠還是怎么的，就是測試效果不好，為了獲得不錯的實驗結果還是選擇BD的吧），然后就是煮沸的時候多讓它沸騰幾次，讓培養基完全溶解，冷卻到手能拿住燒杯的溫度，過濾，過濾，過濾，重要的事情說三遍，一定要過濾煮沸過的培養基，去除雜質，不然有可能整條標線都會廢掉，然后讓過濾過的培養基在冰箱中過夜，第二天再用。

4、菌種的制備：鼠李糖乳桿菌（之前也叫干酪乳桿菌）活性很好，不需要像標準中敘述的先劃平板再接肉湯那么麻煩，直接肉湯培養就好，先做一管磁珠，-70℃凍干保存，用之前直接挑一個磁珠接入乳酸桿菌肉湯，36℃培養不要超過20小時，否則菌會長過，活性太強，影響結果準確性，這個有磁珠的肉湯管不要丟，可以在4℃冰箱中保存一個月，下一次接菌直接從含有磁珠的肉湯管里面分別吸取一滴分別加入兩管新鮮的乳酸桿菌肉湯，這樣一來是備用，二來是保證下次吸取的菌液活性較好，如果大家覺得一個月時間有點太久，可以使用半個月就重新接一個磁珠。

5、標準曲線的制作：這個就完全按照標準來做就好，注意5413和5009的標液濃度不一樣，制作標準曲線時加入的量也不一樣，兩種方法的滅菌溫度都是121℃，5min，15分鐘太久了，會使培養基變色，影響實驗結果，滅菌后要迅速冷卻試管，可以放在冰水里面冷卻，不然培養基顏色也會變深，影響實驗結果。一般標準曲線和樣品測試管我都會做兩平行，保證結果準確性和重現性，我覺得雙平行是在實驗準確性和可行性之間一個比較好的平衡點。加水、培養基、標液和樣液的時候推薦使用吸管法吸取，最好用洗耳球吸取，其次是用電動槍吸管法，當然這兩種方法非常考驗臂力，基本做完實驗兩條胳膊已經麻木了，但是這樣操作誤差比較小，最后的實驗結果會比較準確，如果你實在不愿意用吸管，那就用移液槍吧，但是一定要注意吸取液體以后要把粘在吸管外的液體掛掉再加入試管，這一步中多一滴或者少一滴對后續會有非常大的影響，所以一定要小心哦。

6、接菌及培養：培養過的肉湯，要離心，再用0.9%的生理鹽水清洗，去除培養基的顏色對實驗的影響，一定要洗夠3遍，不能偷懶，然后從制備好的菌懸液里面吸取40uL加入一支新的生理鹽水管，用這支菌懸液來加菌，每管加一滴就夠了（這個40uL是長期實驗總結出來的經驗數據，對我的實驗效果最好，不一定全部適用，新手小伙伴不要抄作業哦），然后36℃培養，不要超過20h，否則容易長過了，后面的試管沒梯度，沒辦法做標線，也沒辦法讀數據了。

7、測定：這個也沒啥好說的，就按照標準上的要求操作就好，一般來說雙平行讀出的數據差別不會很大，如果兩條標線讀數差別很大的話就要反思一下前面的步驟哪里出現了問題，下次要注意哦

8、試管、容量瓶、燒杯等容器的清潔：實驗完成后，所用到的試管、容量瓶、燒杯等容器一定要清洗干凈，做到無殘留，不然下一次實驗就會讓你生無可戀，一般我會配制硫酸重鉻酸鉀溶液來浸泡實驗用到的容器，先清洗，再浸泡24小時后再用蒸餾水清洗，最后放到250℃烘箱烘干4小時以上，所以小伙伴們要計算好實驗時間和容器的使用量，合理安排資源哦。當然，硫酸重鉻酸鉀溶液配制起來比較危險，是用濃硫酸配的，配制時一定要做好防護措施，注意安全，而且硫酸重鉻酸鉀溶液對環境也不是很友好，大家可以試著去找一些玻璃器皿的清潔劑，如果有用的好的品牌的話也歡迎推薦給我喲（我是試用過幾個牌子的清潔劑，但效果都不是很理想，所以就一直還在用傳統的泡酸法）~ 最后的最后，再劃一遍重點：

1、配標液的時候注意計算稱取的量，一般都是很微少的量，用分析天平稱量的時候要準確，最好關門關窗，不要有過多的走動，注意不要交叉污染；

2、注意區分樣品的基質，選擇相應的適合的方法進行檢測（建議拒絕油性基質的樣品，因為真心提取不出來），注意看不同方法的檢出限，如果樣品里葉酸含量低于標準檢出限，建議退單或者推薦使用非微生物方法進行檢測，如果一定要用微生物方法測試，注意規避自己的風險，出具報告時需注明“樣品中葉酸含量低于標準檢出限，結果僅供參考”等意義相近的術語，減少投訴風險；

3、培養基注意一定要過濾，樣液制作過程去也要過濾，過濾是實驗成功的一個很重要的步驟，一定不能偷懶哦；

4、菌種培養注意不要讓菌長過了，保持最佳活性，才能有好結果；

5、定容的過程中有時用水，有時用含有0.05mol/L抗壞血酸的磷酸緩沖液，實驗過程中一定要注意分清楚哦；

6、實驗用的玻璃器皿一定要清洗干凈，無殘留；

7、稀釋倍數、計算公式要搞清楚，不要出現計算或換算方面的錯誤。

本來想把維生素B12和游離生物素也寫進來，結果啰啰嗦嗦寫了一篇葉酸已經這么多了，害怕大家審美疲勞，那就把這三種維生素的測定分開寫吧，也方便大家查看，真是不寫不知道，一寫嚇一跳，原來自己是個話癆體質，好吧，話癆時間有限，文筆也有限，希望大家不要嫌棄，多多關注后續文章，關于葉酸的測定目前我也就想到這么多了，希望能幫到大家，如果有遺漏沒有提到的地方歡迎大家查漏補缺，或者大家還有什么疑問可以在評論區提問，有時間的話都會回復大家的啦，至此，本篇完結。

第二篇：表面微生物檢測方法

空氣、食品接觸面微生物檢驗方法、檢驗標準 目的：

檢測生產車間空氣、操作人員手部、與食品有直接接觸面的機械設備的微生物指標，生產區域環境當中病原微生物的監控，達到規定標準，以控制食品成品的質量。參照標準：

中華人民共和國國家標準《一次性使用衛生用品衛生標準》GB15979－1995、《HACCP原理與實施》、中華人民共和國國家標準《公共場所空氣微生物檢驗方法細菌總數測定》GB/T 18204.1－2000、中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準SN 0169-92/SN 0172-92/ SN 0170-92、出入境檢驗檢疫局二000四年《出入食品微生物檢驗培訓教材》中《出入食品生產廠衛生細菌檢驗方法》、日本東京冷凍食品檢驗方法。采樣與檢測方法：

3.1空氣的采樣與測試方法 3.1.1樣品采集：(1)取樣頻率：

a)車間轉換不同衛生要求的產品時，在加工前進行采樣，以便了解車間衛生清掃消毒情況。b)全廠統一放長假后，車間生產前，進行采樣。

c)產品檢驗結果超內控標準時，應及時對車間進行采樣，如有檢驗不合格點，整改后再進行采樣檢驗。

d)實驗性新產品，按客戶規定頻率采樣檢驗。e)正常生產狀態的采樣，每周一次。（2）采樣方法

在動態下進行，室內面積不超過30 m2，在對角線上設里、中、外三點，里、外點位置距墻1 m；室內面積超過30 m2，設東、西、南、北、中五點，周圍4點距墻1 m。采樣時，將含平板計數瓊脂培養基的平板(直徑9 cm)置采樣點(約桌面高度)，并避開空調、門窗等空氣流通處，打開平皿蓋，使平板在空氣中暴露5 min。采樣后必須盡快對樣品進行相應指標的檢測，送檢時間不得超過6h，若樣品保存于0～4℃條件時，送檢時間不得超過24h。3.1.2菌落培養：

（1）在采樣前將準備好的平板計數瓊脂培養基平板置37℃±1℃培養24 h，取出檢查有無污染，將污染培養基剔除。（2）將已采集樣品的培養基在6 h內送實驗室，細菌總數于37℃±1℃培養48h觀察結果，計數平板上細菌菌落數。（3）菌落計算：

a)記錄平均菌落數，用“個/皿”來報告結果。用肉眼直接計數，標記或在菌落計數器上點計，然后用5～10倍放大鏡檢查，不可遺漏。

b)若培養皿上有2個或2個以上的菌落重疊，可分辨時仍以2 個或2個以上菌落計數。3.2工作臺（機械器具）表面與工人手表面采樣與測試方法： 3.2.1樣品采集：(1)取樣頻率：

a)車間轉換不同衛生要求的產品時，在加工前進行擦拭檢驗，以便了解車間衛生清掃消毒情況。

b)全廠統一放長假后，車間生產前，進行全面擦拭檢驗。

c)產品檢驗結果超內控標準時，應及時對車間可疑處進行擦拭，如有檢驗不合格點，整改后再進行擦拭檢驗。

d)實驗新產品，按客戶規定擦拭頻率擦拭檢驗。e)對工作表面消毒產生懷疑時，進行擦拭檢驗。f)正常生產狀態的擦拭，每周一次。（2）采樣方法：

a)工作臺（機械器具）：用浸有滅菌生理鹽水的棉簽在被檢物體表面（取與食品直接接觸或有一定影響的表面）取25cm2 的面積，在其內涂抹10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內送檢。

b)工人手：被檢人五指并攏，用浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲面，從指尖到指端來回涂擦10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內送檢。（3）采樣注意事項： 擦拭時棉簽要隨時轉動，保證擦拭的準確性。對每個擦拭點應詳細記錄所在分場的具體位置、擦拭時間及所擦拭環節的消毒時間 3.2.2 細菌·大腸菌群的檢測培養: 樣液稀釋：將放有棉棒的試管充分振搖。此液為1：10稀釋液。如污染嚴重，可十倍遞增稀釋，吸取1ml 1：10樣液加9ml無菌生理鹽水中，混勻，此液為1：100稀釋液。3.2.2.1 細菌總數：

（1）以無菌操作，選擇1～2個稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿（平行樣），將已融化冷至45℃左右的平板計數瓊脂培養基傾入平皿，每皿約15ml，充分混合。

（2）待瓊脂凝固后，將平皿翻轉，置36℃±1℃培養48 h后計數。（3）結果報告：報告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數 3.2.2.2大腸菌群：（1）平板法: a)以無菌操作，選擇1～2個稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿（平行樣），將已融化冷至45℃左右的去氧膽酸鹽瓊脂培養基傾入平皿，每皿約15ml，充分混合。待瓊脂凝固后,再覆蓋一層培養基，約3-5 ml。

b)待瓊脂凝固后，將平皿翻轉，置36℃±1℃培養24h后計數。c)結果計算：以平板上出現紫紅色菌落的個數乘以稀釋倍數得出。d)結果報告：報告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數（2）試管法: a)以無菌操作，選擇3個稀釋度各取1ml樣液分別接種到BGLB肉湯培養基中，每個稀釋度接種三管。

b)置BGLB肉湯管于36℃±1℃培養48±2h。記錄所有BGLB肉湯管的產氣管數。

c)結果報告：按BGLB肉湯管產氣管數，查MPN表報告每25cm2食品接觸面中或每只手的大腸菌群值。

3.2.3 金黃色葡萄球菌檢測（1）定性檢測

a)取1ml 稀釋液注入滅菌的平皿內，傾注15-20ml的B-P培養基，（或是吸取0.1稀釋液，用L棒涂布于表面干燥的B-P瓊脂平板），放進36±1℃的恒溫箱內培養48±2小時。b)從每個平板上至少挑取1個可疑金黃色葡萄球菌的菌落作血漿凝固酶實驗。

c)結果報告：B-P瓊脂平板的可疑菌落作血漿凝固酶實驗為陽性，即報告手（工器具）上有金黃色葡萄球菌存在。（2）定量檢測 a)以無菌操作，選擇3個稀釋度各取1ml樣液分別接種到含10﹪氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯培養基中，每個稀釋度接種三管。

b)置肉湯管于36±1℃的恒溫箱內培養48小時。劃線接種于表面干燥的B-P瓊脂平板，置36℃±1℃培養45～48小時。

c)從B-P瓊脂平板上，挑取典型或可疑金黃色葡萄球菌菌落接種肉湯培養基，36℃±1℃培養20～24小時。

d)取肉湯培養物做血漿凝固酶試驗，記錄試驗結果。

e)報告結果：根據凝固酶試驗結果，查MPN表報告每25 cm2食品接觸面中或每只手的金黃色葡萄球菌值。

3.3工廠環境中病原體的檢測計劃與方法

檢測計劃：為了保證食品安全，工廠應該對生產環境中的病原微生物進行檢測和評估，檢測項目包括李斯特菌，沙門氏菌等病原體微生物，化驗室應該按照一定的計劃對生產場所環境中的病原體進行檢測，其中包括地面、下水道、排水溝、墻壁、天花板、設備框架、運輸的支架，冷藏裝置、速凍機、傳送帶、設備的螺絲、維修工具等部位。當某個點檢測到病員微生物時，應該對環境中的相似點加大檢測頻率；在把所有的預定點檢測完后，應該對環境中的病原微生物的存在狀況進行全面評估，在下一次環境檢測循環過程中加強檢測容易出現病原體的環境點，達到持續改進的目的。

檢測頻率: 每月兩次,每次每個區域至少選取5個檢測點,分別進行檢測。

3.3.1 環境李斯特菌的檢測方法（3MTM PetrifilmTM 環境李斯特菌的測試片）3.3.1.1 用涂抹棒，海綿或者其他采樣設備收集環境樣本。

3.3.1.2 將收集的樣本添加10毫升滅菌的緩沖蛋白胨水，將樣本與緩沖蛋白胨混合1分鐘，將樣品置于室溫（20-30℃）1小時，最久不超過1.5小時，以修復損傷的李斯特菌。3.3.1.3 將測試片放在平坦處，掀起上層膜。

3.3.1.4 用移液器垂直滴加3毫升樣品到下層膜中央，將上層膜緩慢蓋下，以免產生氣泡。3.3.1.5 輕輕將塑料壓板放在位于接種區上層膜上，不要壓，扭轉或者滑動壓板。提起壓板等至少十分鐘，以使膠體凝固。

3.3.1.6 將測試片透明面朝上，可疊放至十片，在37℃±1℃培養26-30小時，可以用標準菌落記數器或者其他光學放大器判讀，不要記數圓形輪廓上的菌落，因為他們不受選擇性培養基的影響。

3.3.1.7 對于定性檢測，根據紫紅色菌落是否存在，結果記為檢出或者未檢出。3.3.2 環境中沙門氏菌的檢測方法

3.3.2.1采樣地點: 選取采樣點時因盡量選取微生物容易滋生的地方 冷凍車間

FD車間

東區初加工

傳遞窗口表面、排水溝、排水溝出口、墻壁、地面

卸料間 墻壁、墻角、地面、天花板、物料車表面

東區精加工

地面、墻壁、墻角、排水溝、排水溝出口、速動機鏈條、天花板

暫存間

墻壁、地面、天花板、墻角、墻縫

西區初加工

傳遞窗口表面、地面、墻壁、排水溝、排水溝出口

挑選間

墻壁、地面、天花板、墻角、墊板

西區精加工

地面、墻壁、墻角、排水溝、排水溝出口、速動機鏈條、天花板

包裝室

墻壁、地面、天花板、金探傳送帶表面、落地料存放處

3.3.2.2 操作步驟

3.3.2.2.1采樣應在生產開始后進行，用已浸潤過的棉拭在選定的被測表面旋轉涂抹約100cm2的面積，然后將棉拭放回涂抹試管并蓋緊。3.3.2.2.2將樣品帶回實驗室，每5個點混合成一個樣品, 登記編號,按照SN0170-92標準及時檢測，若有陽性結果出現，應逐步對所混合的每個點分別檢測。

物體表面涂抹菌落總數計算方式：物體表面細菌總數（cfu/c㎡）=平皿上菌落的平均數*采樣液稀釋倍數/采樣面積（cm2）

根椐GB15979－2002《一次性衛生用品衛生標準》的標準,生產環境衛生指標 1 裝配與包裝車間空氣中細菌菌落總數應≤2 500 cfu/m3。2 工作臺表面細菌菌落總數應≤20 cfu/cm2。

3.工人手表面細菌菌落總數應≤300 cfu/只手，并不得檢出致病菌。人員和環境衛生檢測方法

一、空氣采樣及檢驗方法

1培養基：普通營養瓊脂平板，按GB4789.28中3.7條配制 2采樣（空氣沉降法）

2.1布點：面積小于30平方米的車間，設一對角線，在線上取3點，即中心一點，兩端在距墻1米處各取一點；面積大于30平方米的車間，設東、西、南、北、中5個點，其中東、西、南、北點均距墻1米。

2.2采樣高度：與地面垂直高度80-150厘米。

2.3采樣方法；用直徑為9厘米的普通營養瓊脂平板在采樣點上暴露20分鐘蓋上送檢培養。3培養：于37℃培養24小時。4檢測頻率：每周 空氣質量標準：

生車間、熟車間、成品車間：低于100個 半成品庫、成品庫：低于10個

二、設備的采樣與檢驗方法

根據生產過程所要求的重點衛生部位，實驗室對其進行涂抹采樣，進行細菌總數檢驗。1采樣方法

1.1涂抹法（適用于表面平坦的設備和工器具產品接觸面）

取經過滅菌的鋁片框（框內面積為50平方厘米）放在需檢查的部位上，用無菌棉球蘸上無菌生理鹽水擦拭鋁片中間方框部分，擦完后立即將棉球投入盛有10毫升無菌生理鹽水的試管中，此液每毫升代表5平方厘米。

1.2貼紙法（適用于表面不平坦的設備和工器具接處面）

將無菌規格紙（5×5厘米，紙質要薄而軟）用無菌生理鹽水泡濕后，于需測部分分別貼上兩張，兩張紙面積共50平方厘米，然后取下放入盛有10毫升無菌生理鹽水的試管中，此液每毫升代表5平方厘米。2檢驗方法

2.1細菌總數的檢驗

將上述樣液充分振搖，根據衛生情況，相應地做10倍遞增稀釋，選擇其中2-3個合適的稀釋度作平皿傾注培養，培養基用普通營養瓊脂，每個稀釋度作2個平皿，每個平皿注入1毫升樣液，于37℃培養24小時后計菌落數。結果計算

表面細菌總數（cfu/cm2）=平皿上菌落的平均數×樣液稀釋倍數/30×2 2.2致病菌的檢驗

沙門氏菌，參照GB4789.4進行 金黃色葡球菌，參照GB7918.5進行

4.檢驗合格標準：細菌總數10－100個∕cm2，5.關鍵點：細菌總數≤10個∕cm2 一般區域：細菌總數≤100個∕cm2

三、人員手表面細菌污染情況的檢驗

1.采樣方法：用一支蘸有無菌生理鹽水的棉拭子涂擦被檢對象手的全部，反復兩次，涂擦的時候棉拭子要相應地轉動，擦完后，將手接觸部分剪去，將棉拭子放入裝有10毫升無菌生理鹽水的試管內送檢培養。

2.檢驗方法：同工器具表面細菌總數檢驗方法。

3.結果計算：每只手表面的細菌總數（cfu/只手）=平皿上菌落的平均數×樣液稀釋倍數

四、消毒液藥效的微生物學鑒定法

1采樣對象：正常使用的消毒液，和已知配制好備用的消毒液 2采樣及檢驗方法

在無菌條件下，用無菌吸管吸取1毫升樣液，加入9毫升稀釋液中混勻，對于醇類與酚類消毒劑，稀釋液用普通營養肉湯即可；對于含氯消毒劑、含碘消毒劑，需在肉湯中加入0.1%硫代硫酸鈉，對洗必泰、季銨鹽類消毒劑，需在肉湯中加入3%（W/V）土溫80和0.3%卵磷脂；對醛類消毒劑，需在肉湯中加入0.3%甘氨酸；對于含有表面活性劑的各種復方消毒劑，需在肉湯中加入（W/V）土溫80，以中和被檢樣液中的殘效作用，將注入了樣液的稀釋液充分搖勻，取1毫升注入平皿，隨之倒入普通營養瓊脂，待瓊脂凝固后，翻轉平皿，將平皿于37℃條件下培養24小時后計平板上生長的菌落數。3結果分析

平板上有菌生長，表明被檢樣液中有殘存活菌，若每個平板菌落數在10個以下，仍可用于消毒，若每個平板菌落數超過10個，說明每毫升被檢樣液含菌量已超過100個，即不宜在用于消毒。

該公式是一個經驗公式.它的理論模式依據是:100CM2的面積上10MIN降落的菌落數, 等于1升空氣中所含的細菌總數.系數50000基于上述假說和單位換算而來.細菌總數(CFU/M3)=5/10T*100/A*1000*N=50000*N/AT

5/10T:實際放置了5MIN;

100/A:A單一培養皿面積;

1000:1M3=1000L啊,換算成m3

1、空氣細菌落菌數單位既然是cfu/m3，那采樣時應該還要記錄放置平皿的高度。

2、食品安全管理體系中罐頭行業有個標準如下：

落下菌數

空氣污染程度

評價

30以下

清潔

安全

30～50

中等清潔

50～70

低等清潔

應加注意

70～100

高度污染

對空氣要進行消毒

100以上

嚴重污染

禁止加工

3、是否可根據企業相應的加工產品微生物指標進行自行制定？

第三篇：食品微生物檢測實驗室要求

自來水水池至少有兩個，工作臺，藥品試劑柜，超凈工作臺（無菌室），滅菌鍋，培養箱，冰箱，干燥箱，電子天平，顯微鏡，平皿，試管，三角瓶等玻璃器皿。這些都是必備基本設備，只要能擺放的下就可以。

一、微生物實驗室設計

微生物實驗室由準備室、洗滌室、滅菌室、無菌室、恒溫培養室和普通實驗室六部分組成。這些房間的共同特點是地板和墻壁的質地光滑堅硬，儀器和設備的陳設簡潔，便于打掃衛生。

二、微生物實驗室基本要求

（一）準備室

準備室用于配制培養基和樣品處理等。室內設有試劑柜、存放器具或材料的專柜、實驗臺、電爐、冰箱和上下水道、電源等。

（二）洗滌室

洗滌室用于洗刷器皿等。由于使用過的器皿已被微生物污染，有時還會存在病原微生物。因此，在條件允許的情況下，最好設置洗滌室。室內應備有加熱器、蒸鍋，洗刷器皿用的盆、桶等，還應有各種瓶刷、去污粉、肥皂、洗衣粉等。

（三）滅菌室

滅菌室主要用于培養基的滅菌和各種器具的滅菌，室內應備有高壓蒸汽滅菌器、烘箱等滅菌設備及設施。

（四）無菌室

無菌室也稱接種室，是系統接種、純化菌種等無菌操作的專用實驗室。在微生物工作中，菌種的接種移植是一項主要操作，這項操作的特點就是要保證菌種純種，防止雜菌的污染。在一般環境的空氣中，由于存在許多塵埃和雜菌，很易造成污染，對接種工作干擾很大。1.無菌室的設置

無菌室應根據既經濟又科學的原則來設置。其基本要求有以下幾點：

（1）無菌室應有內、外兩間，內間是無菌室，外間是緩沖室。房間容積不宜過大，以便于空氣滅菌。最小內間面積2×2.5＝5m2，外間面積1×2＝2m2，高以2.5m以下為宜，都應有天花板。

（2）內間應當設拉門，以減少空氣的波動，門應設在離工作臺最遠的位置上；外間的門最好也用拉門，要設在距內間最遠的位置上。（3）在分隔內間與外間的墻壁或“隔扇”上，應開一個小窗，作接種過程中必要的內外傳遞物品的通道，以減少人員進出內間的次數，降低污染程度。小窗寬60cm、高40cm、厚30cm，內外都掛對拉的窗扇。

（4）無菌室容積小而嚴密，使用一段時間后，室內溫度很高，故應設置通氣窗。通氣窗應設在內室進門處的頂棚上（即離工作臺最遠的位置），最好為雙層結構，外層為百葉窗，內層可用抽板式窗扇。通氣窗可在內室使用后、滅菌前開啟，以流通空氣。有條件可安裝恒溫恒濕機。

2.無菌室內設備和用具

（1）無菌室內的工作臺，不論是什么材質、用途的，都要求表面光滑和臺面水平。

（2）在內室和外室各安裝一個紫外燈（多為30W）。內室的紫外線燈應安裝在經常工作的座位正上方，離地面2m，外室的紫外線燈可安裝在外室中央。

（3）外室應有專用的工作服、鞋、帽、口罩、盛有來蘇兒水的瓷盆和毛巾、手持噴霧器和5%石炭酸溶液等。

（4）內室應有酒精燈、常用接種工具、不銹鋼制的刀、剪、鑷子、70%的酒精棉球、工業酒精、載玻璃片、特種蠟筆、記錄本、鉛筆、標簽紙、膠水、廢物筐等。3.無菌室的滅菌消毒

（1）薰蒸：這是無菌室徹底滅菌的措施。無菌室使用了較長時間，污染比較嚴重時，應進行薰蒸滅菌。可用甲醛、乳酸或硫磺薰蒸。（2）噴霧：在每次使用無菌室前進行。噴霧可促使空氣中微粒及微生物沉降，防止桌面、地面上的微塵飛場，并有殺菌作用。可用5%石炭酸噴霧。

（3）紫外線照射：在每次使用無菌室前進行。紫外線有較好的殺菌效果。通常應開啟紫外線燈照射30～60min。

（五）恒溫培養室1.培養室的設置

（1）培養室應有內、外兩間，內室是培養室，外室是緩沖室。房間容積不宜大，以利于空氣滅菌，內室面積在3.2×4.4＝14m2左右，外室面積在3.2×1.8＝6m2左右，高以2.5m左右為宜，都應有天花板。

（2）分隔內室與外室的墻壁上部應設帶空氣過濾裝置的通風口。（3）為滿足微生物對溫度的需要，需安裝恒溫恒濕機。（4）內外室都應在室中央安裝紫外線燈，以供滅菌用。2.培養室內設備及用具（1）內室通常配備培養架和搖瓶機（搖床）。常用的搖瓶機有旋轉式、往復式兩種。（2）外室應有專用的工作服、鞋、帽、口罩、手持噴霧器和5%石炭酸溶液、70%酒精棉球等。

3.培養室的滅菌、消毒 同無菌室的滅菌、消毒措施。小規模的培養可不啟用恒溫培養室，而在恒溫培養箱中進行。

（六）普通實驗室

進行微生物的觀察、計數和生理生化測定工作的場所。室內的陳設因工作側重點不同而有很大的差異。一般均配備實驗臺、顯微鏡、柜子及凳子。實驗臺要求平整、光滑，實驗柜要足以容納日常使用的用具及藥品等。

第四篇：食品微生物檢驗采樣方法

食品微生物檢驗采樣方法

按照上述采樣方案,能采取最小包裝的樣品就采取完整包裝,必須拆包裝取樣的應按無菌操作進行。

不同類型的食品應采用不同的工具和方法: 1.液體樣品：充分混勻,以無菌操作開啟包裝,用100mL無菌注射器抽取,注入無菌容器。2半固體樣品：以無菌操作拆開包裝,用無菌勺子從幾個部位挖取樣品,放入無菌容器。3.固體食品：大塊整體食品應用無菌刀具和鑷子從不同部位割取,割取時應兼顧表面與深部,注意樣品的代表性;小塊大包裝食品應從不同部位的小塊上切取樣品,放入無菌容器。若為檢驗食品的污染情況，可取表層樣品；若為檢驗食品品質的情況，應從深部取樣。4.冷凍食品：大包裝小塊冷凍食品按小塊個體采取;大塊冷凍食品可以用無菌刀從不同部位削取樣品或用無菌小手鋸從凍塊上舉取樣品,也可以用無菌鉆頭鉆取碎屑狀樣品,放入容器。固體食品和冷凍食品的取樣還應注意檢驗目的,若需檢驗食品污染情況,可取表層樣品;若需檢驗其品質情況,應取深部樣品。5.生產工序監測

(1)車間用水。自來水樣從車間各水龍頭上采取冷卻水;湯料等從車間容器不同部位用100mL無菌注射器抽取。

(2)車間臺面、用具及加工人員手的衛生監測。用5cm2孔無菌采樣板及5支無菌棉簽擦拭25cm2面積。若所采表面干燥,則用無菌稀釋液潤濕棉簽后擦拭;若表面有水,則用干棉簽擦拭,擦拭后立即將棉簽頭用無菌剪刀剪入盛樣容器。

(3)車間空氣采樣。直接降塵法。將5個直徑90mm的普通營養瓊脂平板分別置于車間的四角和中部,打開平皿蓋5min,然后蓋蓋送檢。

第五篇：水及食品中微生物的檢測(實驗報告)

水及食品中微生物的檢測

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食品微生物檢驗方法為食品監測必不可少的重要組成部分。它不僅是衡量食品衛生質量的重要指標之一，也是判定被檢食品能否食用的科學依據之一。通過食品微生物檢驗，可以判斷食品加工環境及食品衛生環境,能夠對食品被細菌污染的程度作出正確的評價，為各項衛生管理工作提供科學依據,提供傳染病和人類，動物和食物中毒的防治措施[1]。食品微生物檢驗是以貫徹“預防為主”的衛生方針，可以有效地防止或者減少食物中毒人畜共患病的發生，保障人民的身體健康；同時，它對提高產品質量，避免經濟損失，保證出口等方面具有政治上和經濟上的重要意義。

水是食品生產中的重要原料，必須符合飲用水的標準、水是否合乎標準，除需對其感官質量、放射性物質、與健康有關的無機成分等進行分析測定外，還必須對微生物進行檢測。通常通過水中細菌總數和大腸桿菌群數來確定水的衛生質量，如果水源被糞便污染，則有可能也被腸道病原菌污染而引起傷寒、痢疾、霍亂等腸道疾病的流行，但腸道病原菌在水中數量較少，又容易變異死亡。因此，從水中特別是自來水中分離病原菌有困難。而大腸桿菌是腸道好氧菌中最普遍和數量最多的一種，所以，常將其作為糞便污染的標志，即根據水中大腸桿菌的數目來判斷水源是否被污染，并間接測水源受腸道病原菌污染的可能性。一般規定，1ml自來水總的總菌數不得超過100個；每1000ml自來水中大腸菌群不超過3個。同樣，細菌總數和大腸菌群數也是大多數食品微生物指標中的兩項指標，只是數量要求隨不同的食品而異。

細菌總數是指被檢樣品經過處理（如剪碎、研勻），在一定條件下培養后，所得1g或1ml檢樣中所含細菌菌落的總數。由于一個活細胞能形成一個菌落，因此，菌落就是待測樣品所含的活菌數。由于每種細菌都有一定的生理要求（如對氧、培養溫度、培養基的pH等），所以，培養時應該用不同的培養條件及不同的生理條件去滿足其要求，才能將各種細菌都培養出來。但在實際工作中，一般都只用一種常用的方法去作細菌菌落總數的測定，所得結果指包括一群能在牛肉膏蛋白胨瓊脂上或其他培養基上生長的嗜中溫性需氧菌的菌落總數。本實驗通過取樣對自來水和黃酒中的微生物進行了檢測，以期了解該兩樣樣品中微生物含量是否符合飲用標準，并熟悉水及食品中微生物的檢測方法。

食品在食用前的各個環節中，被微生物污染往往是不可避免的。評價食品被微生物污染的程度，要采用微生物檢驗指標采進行。常采用的微生物檢驗指標為三項細菌指標，即細菌

數量(主要是菌落總數)、大腸菌群最近似數（MPN）和致病菌[2]。

1.材料與方法

1.1材料

湖水、黃酒

1.2培養基

肉膏蛋白胨瓊脂培養基；乳糖膽鹽發酵培養基；伊紅美藍固體培養基；乳糖發酵培養基；

1.3儀器

恒溫培養箱（溫州康鼎凈化工程有限公司）；超凈工作臺（蘇州宏瑞凈化科技有限公司）；蒸汽式高壓滅菌鍋（諸城市永泰機械有限公司）。

1.4細菌總數的測定

1.4.1采樣

瓶裝發酵酒的取樣：用點燃的酒精棉球灼燒瓶口滅菌，用石炭酸紗布蓋好，再用滅菌開瓶器將瓶啟開，倒入500ml滅菌磨口瓶中，覆蓋一滅菌紗布，輕輕震蕩使氣體逸出，待檢。

湖水的取樣：將無菌帶玻璃塞的廣口瓶浸入離湖面10-15cm水下，盛滿后將瓶口蓋好，再從水中取出，待檢或保存于4℃冰箱保存。1.4.2檢樣稀釋

將1ml待測液加入含9ml無菌水的試管中，制成10-1稀釋液，再吸取1ml稀釋液加入到含含9ml無菌水的試管中，制成10-2稀釋液，同法，配制稀釋度為10-

3、10-

4、10-5的稀釋液。1.4.3傾注培養

選擇10-4和10-5兩個稀釋液，分別取1ml于平皿內，及時倒入約45℃肉膏蛋白胨瓊脂培養基約15ml，搖動混勻，待凝固后將平皿倒置于36±1℃的恒溫箱內培養24±2h后取出，計算平板內菌落總數。

1.5大腸菌群檢驗

1.5.1 檢樣稀釋

將1ml待測液加入含9ml無菌水的試管中，制成10-1稀釋液，再吸取1ml稀釋液加入到含含9ml無菌水的試管中，制成10-2稀釋液。1.5.2乳糖膽鹽發酵

分別取1、10-

1、10-2稀釋液1ml注入乳糖膽鹽發酵管，每個稀釋度接種3管，于36±1℃的恒溫箱里倒置培養24±2h，如乳糖膽鹽發酵管不產氣則可報告為大腸菌群陰性；如有產氣者，則按下列程序進行。1.5.3分離培養

將產氣的發酵管分別接種于伊紅美藍瓊脂平板上，于36±1℃恒溫箱倒置培養18-24h。觀察菌落形態，做革蘭氏染色和復發酵證實實驗。1.5.4復發酵證實實驗

在伊紅美藍瓊脂平板上挑取：①紫紅色，具有金屬光澤的菌落；②深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；③淡紅色，中心較深的菌落。具有以上特征的菌落均為可疑大腸桿群菌落，挑取1-2個進行革蘭氏染色，同時對應接種到乳糖發酵管內進行復發酵，于36±1℃的恒溫箱倒置培養24±2h，觀察產氣情況。凡在乳糖發酵管內產氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報告為大腸菌群陽性；如不產氣或革蘭氏陽性，則可報告大腸軍群陰性。

2結果與分析

2.1細菌總數

表1 湖水的細菌總數測定結果

樣品 1 2平均菌落數 菌落總數（個/ml)

取湖水、黃酒稀釋度為10-4和10-5的稀釋液于牛肉膏蛋白胨培養基內混合培養，每一稀釋度2個平板。將平皿倒置于36±1℃的恒溫箱內培養24±2h后取出，采用肉眼直接觀察計數各平板的菌落數，并計算兩者的菌落數，結果如表1所示。

由表可知湖水的細菌含量為1.25*105個/ml，比黃酒的細菌含量高。查閱資料得，1ml自來水的總菌數不得超過100個，本實驗所測的樣品湖水和黃酒中的菌落總數均超過100個，所以細菌都超標，不符合安全標準。

湖水10-4 12 13 12.5

1.3×105

湖水10-55 5

黃酒10-4

0 0 0

<1×104

黃酒10-5

0 0 0

2.2大腸菌群檢驗結果

表2 湖水及黃酒的大腸菌群檢驗的結果

伊紅美籃平板上

稀釋度 管號 乳糖膽鹽發酵

有無可疑菌落

1003 1

10-13 1

10-23

分別取黃酒和湖水1、10-

1、10-2稀釋液1ml注入乳糖膽鹽發酵管，每個稀釋度接種3管，進行乳糖膽鹽發酵的實驗。結果如表2所示。湖水的三個稀釋度的九只試管中大腸菌群均為陽性，即都含有大腸桿菌。而黃酒的三個稀釋度的九只試管中大腸菌群均為陰性。查MPN檢索表可得出每100ml湖水中大腸菌群最可能數>2400個，每100ml黃酒中大腸菌群最可能數<30個。這表明了湖水中大腸桿菌含量較高，而黃酒中大腸桿菌含量較低。

無氣泡

無

紅色

無氣泡 大腸桿菌群陰性

無氣泡

無

紅色

無氣泡 大腸桿菌群陰性

無氣泡

無

紅色

無氣泡 大腸桿菌群陰性

革蘭氏染色 復發酵

結論

3討論

食品中的微生物有許多種類，有的可導致人類產生疾病，有的對人類無害，也有的可產生一些不能令人忽視的代謝產物，因此食品中的微生物，尤其是一些致病微生物常常是作為人類是否能夠食用該食品的重要指標。特別是近年來隨著環境污染的加劇和生態平衡的不斷破壞，可導致人類感染的致病菌的種類越來越多，病原微生物對人類的威脅越來越大。在食品生產、加工、儲存、運輸、銷售等各個環節中都有污染致病微生物的可能。一旦污染，微生物將大量繁殖而引起食品腐敗變質，或導致食源性感染和食物中毒，對人們的危害極大，快速檢驗方法是社會的迫切需要。

參考文獻 ：

[1] 龍夫.食品微生物快速檢測技術動向[J].食品安全, 2004, 6:55-56

[2] 陳慶森, 馮永強.食品中致病菌的快速檢測技術的研究現狀與進展[J].食品科學, 2003, 24(11): 148-152