第一篇：lamp技術介紹以及在微生物檢測中的應用

研究生課程論文

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微生物檢測技術

LAMP技術及其在微生物檢測中的應用

王 飛

生命科學學院

微生物

2011216016 11 年 12 月日

課 題姓 學

專

學

LAMP技術及其在微生物檢測中的應用

摘要：環介導等溫擴增(1oop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術是近年來發展出的一種敏感、特異、方便快捷的核酸擴增技術。與傳統PCR方法相比，LAMP不需要熱循環，為等溫擴增，且由于LAMP反應中產生大量的副產物一白色焦磷酸鎂沉淀，擴增產物可不經過電泳，通過肉眼觀察或濁度計即可判定結果。因此LAMP是一種不需要熱循環儀、肉眼即可判定結果的高度特異和敏感的DNA擴增方法。近年LAMP技術在病原微生物檢測及食品微生物檢測上已有廣泛應用，本文就LAMP極其在這兩方面的研究進展作一綜述。關鍵詞：LAMP；環介導等溫擴增；核酸擴增

Application of LAMP in detection of microorganism

Abstract: LAMP(loop-mediated isothermal amplification)method, which develops in recent years, is a sensitivity, special and convenience nucleic acid amplification technique.To compare with the traditional PCR, LAMP, which needn’t hot circle, is constant temperature amplification.Because LAMP can produce a mount of coproduce, magnesium pyrophosphate, which is a white precipitation, the result can be estimated by eyes or nephelometer without electrophoresis.In recent years, the application of LAMP in detection of disease pathogen and microorganism in food had been wide studied.These articles summarize the studies in these two aspects.Key words: LAMP;loop-mediated isothermal amplification;nucleic acid amplification

1.引言

核酸體外擴增技術是分子生物學領域最重要的研究手段之一，以檢測核酸為基礎的分子診斷技術已廣泛應用于臨床醫學和微生物檢測等領域。目前，核酸體外擴增技術主要包括常規PCR擴增和等溫擴增兩大類。常規PCR包括單一PCR[1]、[2][3][4-8]復合PCR、套式PCR、競爭性PCR和實時熒光定量PCR，等溫擴增包括核酸序列依賴擴增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)[9]、滾環DNA 擴增(rolling circle DNA amplification，RCA)[10]、指數式擴增反應(exponential amplification reaction，EXPAR)[11]、連接酶鏈擴增反應(ligase chain reaction，LCR)[12]、鏈置換擴增反應(strand displacement amplification，SDA)[13]和環介導等溫擴(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[14]技術等。常規PCR擴增由于快速、靈敏度和特異性高等優點廣泛用于分子診斷領域，但由于常規PCR擴增需要配套的控溫精密的儀器和復雜的實驗程序，大大提高了檢測成本。等溫擴增技術是近年來發展迅速的一類核酸體外擴增檢測技術，其區別于常規PCR擴增技術的關鍵在于擴增反應的溫度不同，無需控溫精密的實驗儀器和復雜的實驗程序。上述幾種等溫核酸擴增技術中，LAMP技術由于具有快速、高效、靈敏度高、特異性高和可定量分析等優點已經廣泛用于臨床和微生物分子診斷領域。本文就LAMP技術的原理、引物設計及其在分子診斷和檢測領域的應用進行綜述。

2.LAMP的技術特點

2.1 LAMP技術的定義

LAMP是一種敏感的鏈取代核酸擴增技術,這種方法能在恒溫條件下(約65℃)、一個小時內,將目的DNA從幾個拷貝擴增到109個拷貝。LAMP技術擴增、檢測目的核酸片斷,一般以200~300bp為宜,一般實驗流程包括:GenBank檢索目的基因片斷(并通過BLAST確定該片斷與其他物種基因的同源性),人工或在線設計引物組,引物合成、Bst DNApolymerase large fragment(若進行RT-LAMP擴增,還需加入AMV反轉錄酶)及相關緩沖液準備,確定反應體系、擴增,反應結果判定等[15]。2.2 LAMP引物

LAMP技術的引物設計，比PCR技術要復雜[16]。它針對靶基因的6個區域設計4種特異的引物，包括對內引物FIP和BIP，和一對外引物F3和B3。若再增加一對環引物(1oop primer)，便可使反應加速，提高擴增效率。相關文獻[17,18]對引物設計的技術做了詳細的報道，并且目前已開發出用于LAMP引物設計的相關軟件，如Primer Explorer version 3軟件，使引物設計更加簡便。2.3 LAMP擴增原理

60～65℃是雙鏈DNA復性及延伸的中間溫度，是一種動態活性溫度，因此，DNA在此溫度下合成是可能的。利用4種特異引物依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環[19]。擴增分兩個階段。第1階段為起始階段，上游內部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結合，在鏈置換DNA聚合酶作用下向前延伸啟動鏈置換合成，外部引物F3與模板F3c結合并延伸,置換出完整的FIP連接的互補單鏈，FIP上的F1c與此單鏈上的F1為互補結構，自我堿基配對形 成環狀結構。以此鏈為模板，下游引物BIP與B3先后啟動類似于FIP和F3的合成，形成啞鈴狀結構的單鏈，迅速以3`末端的F1區段為起點，以自身為模板，進行DNA 合成延伸形成莖環狀結構，該結構是LAMP基因擴增循環的起始結構。第2 階段是擴增循環階段，以莖環狀結構為模板，FIP與莖環的F2c區結合，開始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會形成環狀結構，迅速以3′末端的B1區段為起點，以自身為模板，進行DNA合成延伸及鏈置換，形成長短不一的2條新莖環狀結構的DNA，BIP引物上的B2與其雜交，啟動新一輪擴增，且產物DNA長度增加一倍。在反應體系中添加2條環狀引物LF和LB,它們也分別與莖環狀結構結合啟動鏈置換合成，周而復始。擴增的最后產物是具有不同個數莖環結構、不同長度DNA的混合物，且產物DNA為擴增靶序列的交替反向重復序列。2.4 LAMP產物的檢測

(1)電泳檢測：LAMP的產物可以用瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察，由于產物是混合物，故呈現出特異的梯狀條帶，經限制性內切酶酶切之后呈現單一靶序列條帶[20]。

(2)熒光檢測：SYBR Green I 熒光染料只與雙鏈DNA小溝結合，當它與DNA

［21］雙鏈結合時，肉眼觀察熒光染料由橘黃色變為綠色，紫外線下可以發出熒光，在一個體系內，其信號強度代表了雙鏈DNA 分子的數量，熒光強度檢測可以用實

時定量PCR儀進行。

(3)濁度檢測：是其特有也是最常用最便捷的檢測方法，在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2＋結合，產生副產物焦磷酸鎂的白色沉淀。反應方程式如下：

（DNA）n-1 ＋ dNTP＝（DNA）n ＋ P2O74－ P2O7 ＋ 2Mg ＝Mg2P2O7（沉淀）

其具有極高的特異性，只要用肉眼觀察[22]或濁度儀在400nm光下檢測濁度就能 夠判斷擴增與否，并對起始模板定量，達到實時定量的檢測[23]。2.5 LAMP的特點

LAMP 與以往的核酸擴增方法相比具有如下優點：

(1)操作簡單，LAMP核酸擴增是在等溫條件下進行，對于中小醫院只需要水浴鍋即可，產物檢測用肉眼觀察或濁度儀檢測沉淀濁度即可判斷，對于RNA 的擴增只需要在反應體系中加入逆轉錄酶就可同步進行（RT-LAMP）,不需要特殊的試劑及儀器。

(2)快速高效，因為不需要預先的雙鏈DNA熱變性，避免了溫度循環而造成的時間損失，核酸擴增在1h內均可完成，添加環狀引物后時間可以節省1/2，多數情況在20～30min均可檢測到擴增產物,且產物可以擴增至109倍,達0.5mg/mL，應用專門的濁度儀可以達到實時定量檢測。

(3)高特異性，由于是針對靶序列6個區域設計的4種特異性引物，6個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故其特異性極高。

(4)高靈敏度，對于病毒擴增模板可達幾個拷貝，比PCR高出數量級的差異。同時LAMP還有一些不足的地方。由于LAMP擴增是鏈置換合成，靶序列長度 好在300bp以內，大于500bp則較難擴增，故不能進行長鏈DNA的擴增。由于靈敏度高，極易受到污染而產生假陽性結果，故要特別注意嚴謹操作，以及在產物的回收鑒定、克隆、單鏈分離[21]方面均遜色于傳統的PCR 方法。

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2＋3.LAMP技術在人類傳染病病原檢測中的應用

3.1 DNA病原檢測

DNA類致病病原主要為DNA病毒和DNA細菌。相對而言，LAMP技術對DNA病毒的檢測研究相對較多。

2005年Enomoto等[23]對單純皰疹病毒的I型和II型分別設計LAMP引物，彼此之間保持高度特異性，并發現瓊脂糖凝膠電泳比沉淀直接觀測在靈敏度上高2～10倍；對18份病人拭子進行檢測，I型和II型檢出率分別為50％和56％.特異性為

[24][25]90％和100％。Yoshikawa和Ihira等分別建立了人皰疹病毒6型和7型的LAMP檢測方法，他們設計的LAMP引物具有高度的特異性和敏感性，且對人皰疹病毒 6型的研究還發現，當提高引物濃度時，靈敏度可提高一倍。Suzuki等[26]對巨細胞病毒進行了LAMP技術的研究，不但證實了該技術用于巨細胞病毒檢測敏感、特異，還對構建巨細胞病毒質粒cDNA標準品的定量檢測進行了探討，其檢測標準曲

線的相關系數達到99．4％。Yamada等[24]對細小病毒B19也進行了相應檢測，證實LAMP技術比常規PCR技術靈敏100倍，還成功嘗試了SYBR Green I直接染色判定檢測結果。

在細菌病原檢測方面，Hara-Kudoa等[27]對沙門氏菌的39個血清型220個菌株進行了LAMP檢測，運用了3種結果判定方法；靈敏度達到2．2cfu／管，明顯高出常規PCR。Maeda等[27]在對牙齦卟啉單胞菌的檢測中也運用了3種結果判定方法，發現瓊脂糖電泳和SYBR Green I的檢測極限相近，直接沉淀觀測法則低10倍；此外，通過real-time PCR和real-time LAMP的比較發現，后者在快速性、便捷性上有較大優勢。最近，Yano等[23]對腸毒素大腸桿菌的LTI及STI基因的LAMP研究再次驗證了該法的特異性(非LTI及STI基因型的Ecoli及其他細菌均不擴增)及高靈敏性，加人環引物后擴增時間可以從60分鐘縮至35分鐘。3.2 RNA病原檢測

人類傳染病的RNA病原主要是指RNA類病毒。RNA類病毒的基因組有變異大和進化快的特點，它不但是許多重大傳染病的病原，也是當前人們研究的重點。Thai等根據SARS冠狀病毒的保守序列1b Rep gene開放讀碼框設計了包括環引物在內的6條引物，進行了一步法RT—LAMP檢測；檢出時間早至11分鐘，檢測極限達到0.01PFU，靈敏度比RT-PCR高100倍；對49例臨床鼻、咽拭子進行RT-LAMP和RT-PCR對照檢測，RT-LAMP的靈敏性達到100％,產物經限制性內切酶酶切及測序驗證其特異性達到87％。Shirato等[26]對59例人呼吸道合胞病毒進行了RT-LAMP、病毒分離和免疫學檢測，檢出率分別為61％、34％和56％;此外，還對RSV的A、B亞型分別設計特異引物，并進行產物酶切鑒定。研究表明，RT-LAMP是一種穩定可靠、敏感度高的實用型檢測技術。今年Yoshida等[27]建立了從臨床病樣中檢測腮腺炎病毒的LAMP方法，其引物組針對腮腺炎病毒基因組中血紅球凝集素一唾液酸苷酶編碼區域設計，可用于鑒別腮腺炎Hoshino疫苗株和循環野生株。

Pafida等[28]建立了不同血清型登革熱病毒的一步法real-time RT-LAMP檢測，該法的檢出率達100％,而常規RT—PCR和細胞培養分離的檢出率只是87％和81％ 且不與黃病毒科其他病毒有交叉反應。Kumsaki等[28]對危害性很大的埃博拉病毒(Zaire Ebola virus)也進行了real-time RT-LAMP檢測研究。在體外轉錄得到高濃度

3目標RNA后實施定量RT—LAMP檢測，26分鐘內可以測到10拷貝，30分鐘內可以測到104個拷貝。Toriniwa等[25]也成功地將real-time RT-LAMP應用到日本乙腦病毒的檢測上。

由于諾如病毒(Nomvirus)基因型間的多樣性和型內的高變異性，其RT—LA MP引物的設計難度較高，操作也相對復雜。Fukuda等[26]對I型和Ⅱ型諾如病毒分別設計了9條和13條特異引物，并對26份臨床糞便進行一步法單管RT-LAMP擴增，結果RT-LA MP對I型和Ⅱ型諾如病毒的檢測極限分別達到100個拷貝／管和1000個拷貝／管；與傳統的RT-PCR相比，RT-LAMP對工型諾如病毒的特異性為94％，I型諾如病毒為100％。[25]4.LAMP在食品病原微生物檢測中的應用

4.1食品中大腸桿菌的檢測

腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic Escherichia coli EHEC)是指能夠引起人類出血性腸炎的一類大腸桿菌,主要經口傳播。該菌引起的食物中毒首先在美國于1982年爆發,之后在世界各地相繼發現病例。即使在衛生條件較好的國家,大多數腸道傳染病已基本得到控制,但EHEC感染問題仍日益嚴重,越來越受到各國的高度重視。在美國、加拿大、英國和日本等發達國家,都發生過E.Coli O157的暴發流行。2001年盧林秋等進行的調查表明,我國食品中也存在E.Coli O157菌株。EHEC類型多,血清型復雜,常規檢測方法難以有效實現快速、靈敏地進行全面檢測。2003年Maruyama[27]等用原位LAMP方法檢E.ColiO157∶H7O27(有一個stx1基因和兩個stx2基因)的stx2基因,并用FITC標記抗E.ColiO157∶H7抗體,在紫外下照射。試驗結果顯示,較原位PCR而言,溫和的滲透性及低等溫條件使得原位LAMP引起較少的細胞損傷,并且在DNA擴增中允許使用熒光抗體標記。此外,Maruyama還發現LAMP方法的背景顏色較淺。因此,LAMP方法是一種特異性強、敏感性高、省時、省力的EHEC檢測方法。

侵襲性大腸桿菌(Enteroinvasive E.coli EIEC)是一種腸道侵襲性細菌。它侵入腸黏膜上皮細胞,在細胞內繁殖引起細胞變性,使腸上皮出現損傷,導致黏膜固有層發生炎癥、潰瘍、出血,臨床上表現出細菌性痢疾癥狀,所以當初稱之為志賀痢疾樣大腸桿菌(Shigelloid E.coli)。國內于1984年首次報道了EIEC引起的食物中[28]毒。可見EIEC是一組較重要的腹瀉病原菌。然而,由于其生化反應不典型,部分血清型與志賀菌屬間存在抗原交叉,從而給鑒定工作帶來了很多困難。因此,在日常檢測工作中往往被忽視或誤報為志賀菌屬。從流行病學方面來考慮,準確的病原學診斷是必不可少的。2005年Song[29]等用LAMP方法對EIEC和志賀氏菌的同源基因ipaH進行檢測。作者從病人的腹瀉樣便中分離出38株腸病原體用于檢測LAMP方法的特異性,一株志賀氏菌YSH6000用于比較LAMP和PCR的敏感性。LAMP方法對所有的致賀氏菌及EIEC呈陽性,對其它菌呈陰性;整個LAMP實驗在2h以內完成,其最小檢測限達到8個菌落單位。相比較而言, PCR的檢測限為8×102個菌落單位。LAMP方法是特異性強、敏感性高的EIEC快速檢測方法。4.2沙門氏菌的檢測

沙門氏菌(Salmonella)是引起食品中毒和傷寒的主要病原菌,主要通過污染食品和水源而傳播。沙門氏菌引起的食物中毒最常見。約占細菌性食物中毒的42.6%-60%。目前所使用的沙門氏菌分離培養、生化反應、血清學和傳統PCR技術等檢測方法操作繁瑣、費時、靈敏度低、易污染,已不適于食品和水源的衛生監測和流行病學調查。2005年,KayokoOhtsuka[30]等對疑被感染沙門氏菌的水樣雞蛋中進行抽樣(110個樣品)檢測并與分離培養及PCR做比較。結果顯示, PCR漏檢了10%, LAMP及分離培養的檢出率為100%;LAMP是比分離培養更快速、靈敏的檢測技術。因此, LAMP方法是快速、靈敏、特異的沙門氏菌檢測方法,是雞蛋車間管理的可靠監控手段。4.3白斑綜合癥病毒的檢測

白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是世界水產養殖業危害最嚴重的病原之一,它不僅存在對蝦中,而且存在于其他的甲殼類動物中,例如,螃蟹、小龍蝦等。該病毒分子量較大、結構特異,是已知動物病毒中最大的病毒。

Lightner報道,WSSV在所有對蝦病毒中,毒力最強,危害最大。2003年Tomoya Kono等根據WSSV-DNA序列設計4條引物F1、F2、B1c、B2c(大小分別為20nt、19 nt、22 nt、20 nt),用LAMP方法和巢式PCR對對蝦組織中分離的WSSV-DNA進行擴增,比較了兩種方法的檢測限。結果表明,LAMP的檢測限達到1fg,一步法PCR的檢測限是100pg,二步法PCR是10fg,說明LAMP方法的靈敏度遠遠高于PCR。由此可知, LAMP方法是WSSV的快速、高效檢測方法。4.4檢測傳染性造血器官壞死病毒

LAMP方法不僅可以擴增DNA,而且可以擴增RNA。只要在原反應體系中加入RNA反轉錄酶(15U/μL)即可傳染性造血器官壞死病(infectioushematopoietic

necrosis virus, IHNV)是一種RNA病毒,主要引起大馬哈魚和虹鱒魚苗和幼魚的傳染性造血器官壞死病,造成脾臟和前腎造血器官壞死。IHNV是迄今為止世界上已經報道的共約50種魚類病毒中危害極為嚴重的一種。2004年Gunimaladevi等首次發表了用LAMP方法檢測虹鱒魚及鮭魚中的IHNV。作者同時用LAMP及RT-LAMP方法檢測虹鱒魚的IHNV,并比較LAMP與巢式PCR的檢測靈敏度。研究結果顯示, LAMP和RT-LAMP方法的檢測限相似,而比PCR高一個10的數量級。此研究表明LAMP方法具有簡便、快速、特異性和靈敏度高等特點,是極具前途的快速檢測IHNV的方法。

5.LAMP技術前景展望

LAMP 是本世紀發展起來的一種分子生物學技術，雖然還存在諸多的缺點和不足，但它在不斷地改進和完善，它最主要的優點是不需要昂貴的儀器設備、操作程序簡單、擴增快速高效，適合各種條件下的快速檢測，實用性強，故其應用范圍越來越廣泛。綜上所述，我們有理由相信LAMP 作為一種核酸擴增的快速檢測方法，將會有更廣闊的應用前景。

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第二篇：微生物技術在城市生活垃圾處理中的應用

微生物技術在城市生活垃圾處理中的應用

msw生物處理技術主要包括好氧和厭氧生物處理。好氧生物處理如：好氧堆肥、生物反應器填埋等，其工藝中的微生物主要有細菌、放線菌、真菌等微生物種群。厭氧生物處理，如：厭氧消化、厭氧填埋等，其工藝中的微生物又稱“瘤胃微生物”，主要有水解細菌、產氫產乙酸菌群和產甲烷菌群等。

在msw好氧生物降解過程中，細菌憑借強大的比表面積，可以快速將可溶性底物吸收到細胞中，進行胞內代謝。總的來說，其數量要比放線菌和真菌多得多。當然，在不同的環境中分離的細菌在分類學上具有多樣性，主要有假單胞菌屬（pseudomonas）、克雷伯氏菌屬（klebsiella）以及芽孢桿菌屬（bacillus）的細菌。在堆肥過程中，細菌總數的變化趨勢是高-低-高。堆肥初期，有機廢物中攜帶有的大量細菌分解有機物質釋放能量，使堆體溫度上升，此時，常溫細菌受到抑制，嗜溫細菌活躍；當堆溫升至高溫階段，只有少量的嗜熱細菌可以活動；高溫期過后，隨著有機成分的減少，堆體溫度降低，嗜溫及常溫細菌又開始活躍，使細菌總數上升。整個好氧降解過程中，嗜溫細菌是堆肥系統中最主要的微生物。

現代生物技術與環境保護

現代生物技術是以DNA分子技術為基礎，包括微生物工程，細胞工程，酶工程，基因工程等一系列生物高新技術的總稱。現代生物技術不僅在農作物改良、醫藥研究、食品工程方面發揮著重要作用，而且也隨著日益突出的環境問題在治理污染、環境生物監測等方面發揮著重要的作用。自20 世紀 80年代以來生物技術作為一種高新技術，已普遍受到世界各國和民間研究機構的高度重視，發展十分迅猛。與傳統方法比較，生物治理方法具有許多優點。

（1）生物技術處理垃圾廢棄物是降解破壞污染物的分子結構，降解的產物以及副產物，大都是可以被生物重新利用的，有助于把人類活動產生的環境污染減輕到最小程度，這樣既做到一勞永逸，不留下長期污染問題,同時也對垃圾廢棄物進行了資源化利用。

（2）利用發酵工程技術處理污染物質，最終轉化產物大都是無毒無害的穩定物質，如二氧化碳、水、氮氣和甲烷氣體等，常常是一步到位，避免污染物的多次轉移而造成重復污染，因此生物技術是一種既安全又徹底消除污染的手段。

（3）生物技術是以酶促反應為基礎的生物化學過程，而作為生物催化劑的酶是一種活性蛋白質，其反應過程是在常溫常壓和接近中性的條件下進行的，所以大多數生物治理技術可以就地實施，而且不影響其他作業的正常進行，與常常需要高溫高壓的化工過程比較，反應條件大大簡化，具有設備簡單、成本低廉、效果好、過程穩定、操作簡便等優點。

所以，當今生物技術已廣泛應用于環境監測、工業清潔生產、工業廢棄物和城市生活垃圾的處理，有毒有害物質的無害化處理等各個方面。

第三篇：微生物檢測技術復習資料

名詞解釋

1病原微生物：感染人、動植物，導致疾病發生的有害微生物。

2無菌操作：用于防止微生物進入人體組織或其它無菌范圍的操作技術稱為無菌操作 3滅菌：用物理和化學方法殺滅或清除傳播媒介上一切微生物的方法

4菌落總數：指食品檢樣經過處理，在一定條件下培養后所得1g或1mL檢樣中所含細菌菌落的總數。

5大腸菌群：寄居于人及溫血動物腸道內的腸居菌，隨大便排出體外。食品中大腸菌群數越多，說明食品受糞便污染的程度越大。微生物：一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱。包括病毒、細菌、真菌、原生動物和某些藻類。

7微生物檢測：基于微生物學的基本理論，利用微生物實驗技術，根據各類產品衛生標準的要求，研究產品中微生物的種類、性質、活動規律等，用以判斷環境、產品等衛生質量的一門應用技術。菌落：將細菌接種在固體培養基上經18∽24小時培養，長出肉眼可見的來源于一個細胞的細菌集團。莢膜：在某些細菌細胞外壁外存在著一層松散透明、厚度不定的膠狀物質叫莢膜。10消毒：殺滅或清除傳播媒介上病原微生物,使其達到無害化的FF。

填空簡答

1飲用水的微生物檢測

大腸菌群是指示水質受糞便污染的指示菌，細菌總數指示水體受污染物污染的情況。我國GB5749-85《中華人民共和國國家標準 生活飲用水衛生標準》中規定生活飲用水細菌總數每毫升不得超過100個，大腸菌群每升不得超過3個。培養基的分類（按物理性質）：液體、固體、半固體、脫水培養基

3病毒的組成：核酸和蛋白質革蘭氏染色：陰紅陽紫 5 細菌特殊結構的功能：

鞭毛：是細菌的運動器官，鞭毛菌在液體環境下可自由移動，速度迅速，抗原性 1化學趨向性運動，有助于細菌向營養物質處前進，而逃離有害物質.2.與細菌致病性相關

3.可用以細菌的鑒定和分類

菌毛：菌毛是在某些細菌表面存在著一種比鞭毛更細、更短而直硬的絲狀物，須用電鏡觀察。特點是：細、短、直、硬、多，菌毛與細菌運動無關，根據形態、結構和功能，可分為普通菌毛和性菌毛兩類。前者與細菌吸附和侵染宿主有關，后者為中空管子，與傳遞遺傳物質有關。

芽孢：芽孢是細菌的休眠體，對不良環境有較強的抵抗能力。耐熱性、抗逆性強（抗熱、抗輻射、抗化學物質和抗靜水壓等能力）

莢膜：①抗吞噬作用②黏附作用③抗有害物質的損傷作用④抗干燥作用⑤當缺乏營養時，莢膜可被利用作碳源和能源，有的莢膜還可作氮源。肺炎雙球菌：光滑型(簡稱S型)產生莢膜，有毒；粗糙型(簡稱R型)不產生莢膜，無毒。7 芽孢：抗逆性強

8瘋牛病

牛海綿狀腦病（Bovine spongiform encephalopathy, BSE），又稱瘋牛病，是一種侵犯牛中樞神經系統的慢性的致命性疾病，由一種非常規的病毒——朊病毒（Prion）引起的一種亞

急性海綿狀腦病，這類病還包括綿羊的搔癢病、人的克-雅氏病（Creutzfeldt-Jakob Syndrome , CJD）（又稱早老癡呆癥）、庫魯病以及最近發現的致死性家庭性失眠癥等等。

朊病毒是一類非正常的病毒，它不含有通常病毒所含有的核酸，而是一種不含核酸僅有蛋白質的蛋白感染因子。

朊病毒屬于亞病毒，亞病毒包括：類、擬、朊病毒三類。人類三大流行病原：線蟲（原生、無脊椎動物動物）分類：包括自由生活線蟲（海洋、淡水和土壤中）和危害植物的病原線蟲人類病原真菌的分類：

1）淺部真菌：侵犯皮膚、毛發、指甲，為慢性，頑固性，但影響身體較小；

2）深部真菌：可侵犯全身內臟，嚴重的可引起死亡。

3）此外，有些真菌寄生于糧食、飼料、食品中，能產生毒素引起中毒性真菌病。12原核微生物常見類群

1）真細菌：細菌、放線菌、藍細菌、支原體、立克次氏體和衣原體

2）古生菌 13真菌類群

鞭毛菌亞門、接合菌亞門、子囊菌亞門、擔子菌亞門、半知菌亞門細菌的基本形態

細菌的種類雖然很多，但其基本形態只有三種：球菌（葡萄球菌、雙球菌、鏈球菌、四聯球菌、八疊球菌）、桿菌、螺旋菌（弧菌和螺菌）。15 病毒的分類

1）按感染的對象分

動物病毒、植物病毒、細菌病毒、昆蟲病毒及真菌病毒，另外尚有亞病毒——類病毒(Viroids)擬病毒(Virusoid)和朊病毒(Prion)。

2）按遺傳物質分類分

DNA病毒和RNA病毒兩大類

（噬菌體寄生于細菌中病毒的總稱。）高壓蒸汽滅菌指標： 0.10MPa，121℃，20min左右純種分離的技術方法

1）固體培養基純種分離技術:① 稀釋倒平板法；② 涂布平板法 ③平板劃線分離法；④稀釋搖管法——厭氧微生物的分離

2）液體培養基純種分離技術——稀釋法（不可靠）

3）單細胞（孢子）分離——顯微分離

4）選擇培養: ① 選擇平板培養② 富集培養

問答題

1、微生物有益方面

1）微生物與糧食增產

固氮、解磷、解鉀、生長激素、分解大分子碳源等促生產功能，抗病蟲害。

2）微生物與能源供應

產乙醇、產甲烷、分解長鏈烴或脂肪酸為短鏈燃料，微生物電池、微生物采油。

3）微生物與資源開發

發酵產乙醇、丙酮、水楊酸等化工產品。

4）微生物與環境保護

微生物修復:重金屬、降解塑膠廢品、凈化污水、監測環境污染等。

5）微生物與人類健康

生物制品：菌苗、疫苗、類毒素等；

代謝產物：胰島素、白細胞介素、干擾素、鏈激酶及青霉素等抗生素。

2、微生物有害方面

1）人類疾病

1347年，鼠疫造成歐洲約2500萬人死亡。

2）動植物疾病，降低食物產量及品質

1843-1847年，歐洲馬鈴薯晚疫病，餓死100萬人，164萬逃往北美。

3）污染水源、加工食品、醫藥

完達山刺五加致死事件、太湖藍藻污染等。

4）破壞人類生活用品

家具、化妝品等損害、污染

3樣品采集的原則

1）根據檢驗目的、樣品特點、批量、檢驗方法、微生物的危害程度等確定采樣方案。

2）采樣、保存、運輸、接收過程應遵循無菌操作程序，采取必要的措施保持樣品的原有狀態，防止樣品中原有微生物的種類、數量變化(避免采樣引入新的污染或者對微生物的殺滅因子)。

3)采樣要講究方法、有代表性，不同的樣品有不同的要求，特別是某些特殊樣品。

4)注意采樣時間和種類：一般原則是根據不同疾病的特點和臨床表現，確定采樣時間和標本種類。

5)注意生物安全：采樣中避免造成人員感染、標本和環境的污染。采用防護裝備，注意安全操作和安全包裝樣品。

6)樣品的包裝、密封標志要明確，以備查詢。（用于衛生質量評價的樣品，應標明樣品名稱、編號、采樣時間、采樣量、采樣者、檢測項目等。）

利用某一特定微生物特有的基因序列，設計特異性引物進行PCR擴增。若有條帶，則說明待測樣品中含有目的菌，且目的菌的含量與條帶的亮度呈正相關；若無條帶，則說明待測樣品中無目的菌。微生物檢驗的任務

1）研究各類產品的樣品采集、運送、保存以及預處理方法，提高檢出率。

2）根據各類產品的衛生標準要求，選擇適合不同產品、針對不同檢測目標的最佳檢測方法，探討影響產品衛生質量的有關微生物的檢測、鑒定程序以及相關質量控制措施；利用微生物檢驗技術，正確進行各類樣品的檢驗。

3）正確進行影響產品衛生質量的有關微生物的快速檢測方法、自動化儀器的使用，并認真進行檢驗結果的分析和試驗方法的評價。

4）及時對檢驗結果進行統計、分析、處理，并及時準確地進行結果報告。

5）對影響產品衛生質量及人類健康的相關環境的微生物進行調查、分析與質量控制。微生物的特點：個體小、比表面大；分布廣、種類多；代謝強、繁殖快；易變異、抗性強 7 科赫法則:①分離、純化單菌落;②分別接種寄主;③從致病寄主分離出相應菌株 8 微生物檢測的意義

1）衡量動植物性產品衛生質量的重要指標，也是判定被檢產品能否食用的科學依據。

2）可以判斷產品加工環境衛生狀況，對產品被微生物污染的程度作出正確的評價，為各項

衛生管理工作提供科學依據，提供傳染病和人類、動物和食物中毒的防治措施。

3）“預防為主”：可以有效地防止或者減少食物中毒、人畜共患病的發生，保障人民的身

體健康。

4）對提高產品質量、避免經濟損失、保證出口等方面具有政治上和經濟上的重要意義。*微生物檢測與植物檢疫

植物檢疫目的：發現、檢出和鑒定有害微生物、昆蟲、雜草等，作為出證或檢疫處理的依據。外來有害生物爆發的因素：天敵、環境、寄主、潛在危害的認識（人為因素）。

關系：植物檢疫的一部分，主要負責檢測引起植物病害的微生物，防治病原物的進入或流出，保證農林園藝業安全。

設計題

病原微生物采集、分離、鑒定方案

第四篇：PCR技術在微生物鑒定中的應用

昆蟲分子生物學

課程論文

學

院: 課

程: 學

號:

姓

名:

植物保護學院

昆蟲分子生物學

任課教師:

職稱:

教授

成 績:

2015年8月29日

PCR技術在微生物鑒定中的應用

摘要 隨著科學技術的發展和突破，PCR技術已在多個領域得到廣泛地應用，特別是在微生物檢測中的應用。細菌16S rDNA測序鑒定需進行DNA擴增、測序和分析，其設備條件和實驗成本比傳統的表型鑒定更高，從鑒定的準確率來看，其具有的優勢毋庸置疑。同時，隨著微生物檢測技術的不斷發展,BOX-PCR技術在微生物的多樣性研究中也已得到應用。使用真菌ITS區域序列通用引物PCR擴增和DNA序列測定的方法，簡便快速、成本低穩定性好、結果可靠，適合實驗室常規使用，可用于常見的和疑難真菌菌種快速鑒定。

關鍵詞 PCR；16S rDNA；BOX-PCR；ITS；細菌；真菌

PCR(polymerase chain reaction, PCR)即聚合酶鏈式反應，它是一種體外酶促合成擴增特定DNA片段的方法，1985年美國Karray等學者首創了PCR技術并由美國Cetus公司開發研制[1]。隨著科學技術的發展和突破，PCR技術已在多個領域得到廣泛地應用，如微生物檢測、獸醫學、水產養殖、環境科學、食品安全等領域，包括基因的克隆、修飾、改建、構建cDNA文庫、遺傳病傳染病的診斷、法醫學鑒定、物種起源、生物進化分析、流行病學調查等。由于該技術具有較強的靈敏度、準確度和特異性，又能快速進行檢測，因而其應用領域也在不斷延伸[2-3]。隨著PCR技術的不斷發展，在常規PCR技術的基礎上又衍生出了許多技術，如多重PCR（mutiplex，PCR）技術[4]、實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR）技術[5]、單分子PCR技術[6]等。PCR技術原理

PCR技術是根據待擴增的已知DNA片段序列，人工合成與該DNA 2條鏈末端互補的2段寡核苷酸，引物在體外將待檢DNA序列模板在酶促作用下進行擴增。PCR的整個技術過程經若干個循環組成，一個循環包括連續的3個步驟：第1步是高溫條件下的DNA模板變性，即模板DNA在93~94℃的條件下變性解鏈；第2步是退火，即人工合成的2個寡核苷酸引物與模板DNA鏈3’端經降溫至55℃退火；第3步是延伸，即在4種dNTP底物同時存在的情況下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物鏈將沿著5’~3’方向延伸與模板互補的新鏈[7]。經過這個循環后合成了新鏈可將其作為DNA模板繼續反應，由此循環進行。循環進程中擴增產物的量，以指數級方式增加，一般單一拷貝的基因循環25~30次，DNA可擴增l00萬~200萬倍[1]。PCR技術在細菌鑒定中的應用

細菌檢測包括傳統的形態學檢查、分離培養、生化鑒定、免疫分析等多種方法，其中

第五篇：免疫學檢測技術在食品安全中的應用

免疫學檢測技術在食品安全中的應用

楊明

（甘肅農業大學 動物醫學院，甘肅 蘭州 730070）

食品安全問題在21世紀的今天已經成為全世界關注的重大問題，對國家的經濟發展和消費者的身體健康產生了重大影響。隨著我國市場經濟的的不斷完善和發展，食品行業對外貿易與日劇增，食品的質量與安全問題已成為影響農業和食品工業產品競爭力的關鍵因素。同時，由于我國人民生活已由溫飽型食物結構轉向營業健康型食物結構，全民食品營業衛生知識得到普及。人民的飲食消費觀念也由數量型轉向質量型，對食品衛生質量標準的要求越練越高，這就對食品檢測技術提出更高的要求。

由于食品種類豐富，食品中檢測的有毒有害物質種類和組分繁多，需要檢測的物質質量極低，樣品中待檢物的濃度常為μg、ng甚至 pg級，除此之外，許多檢測物除需檢測物質本身，還涉及其衍生物和降解物測定。區別同位異構體以及元素的價態等。因此食品檢測要求檢測方法更加準確、快速、方便，也使得其他學科的先進技術不斷應用于食品檢測領域中來，由于新技術的引入，食品行業開發出了許多自動化程度和精確度很高的檢測儀器，這不僅縮短了分析時間，減少了人力誤差，也大大提高了食品分析檢測的速度、靈敏度和準確度。現代食品檢測技術主要包括以下幾個方面：①計算機視覺技術；②現代儀器分析技術；③食品物性的力學、聲學和電學檢測技術；④電子傳感檢測技術；⑤生物傳感技術；⑥核酸探針檢測技術；⑦PCR基因擴增技術；⑧免疫學檢測技術。

免疫學檢測技術是食品檢測技術中的一個重要組成部分，特別是三大免疫技術——熒光免疫技術、酶免疫技術、放射免疫技術在食品檢測中得到了廣泛應用。利用免疫學檢測技術可檢測細菌、病毒、真菌、各種毒素、寄生蟲等，還可用于蛋白質、激素、其他生理活性物質、藥物殘留、抗生素等的檢測，其檢測方法簡便、快速、靈敏度高、特異性強，特別是單克隆抗體的發展，使得免疫檢測方法特異性更強，結果更準確。

免疫分析是抗原與抗體的特異性、可逆性結合為基礎的分析技術。1959年，Yalow和Berson 將發射性同位素示蹤與免疫反應相結合建立了發射免疫測定法，從而開創了免疫分析這一嶄新領域，次后又發展了許多替代或非同位素免疫免疫分析法。

1．免疫熒光技術在食品檢測中的應用

免疫熒光分析（Immuno Fluorescence Assay , IFA）始創于20世紀40年代初，1942年Cons等首次報道用異硫氰酸熒光素標記抗體，檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗體，但此種熒光素標記物的性能較差，未能推廣應用，20世紀50年代，Riggs等合成性能較為優良的異硫氰酸熒光素。Mashall等對熒光抗體的標記方法又進行了改進，從而使得免疫熒光技術逐漸推廣應用。1．1 基本原理

抗體與熒光素結合后，并不影響其與相應的抗原發生特異性反應，事先將待測抗原固定與玻璃載玻片上，滴加熒光標記抗體，若熒光標記抗體與相應的抗原發生特異性結合反應，不能被緩沖液沖掉，載熒光顯微鏡下可觀察到熒光，否則熒光抗體被緩沖液沖掉，在顯微鏡下觀察不到熒光。1．2 熒光免疫測定法的分類

根據標記熒光產生的方式不同分為底物標記熒光測定法、熒光偏振免疫測定法、熒光猝滅增強免疫測定法。FIA可使用均相或非均相分析方式，均相FIA應用較多。

1．2．1 底物標記熒光測定法

底物標記熒光測定法（SLFIA）使用一種酶的底物標記待測物，底物本身無熒光，在受到相應酶的催化時能轉變為熒光物，當標記底物與抗體結合產生的空間位阻阻礙了酶與標記底物間的接觸，樣品中的待測物通過競爭作用使游離的酶標結合物或熒光強度增加。1．2．2熒光偏振免疫測定法

使用偏振光作為激發光時，視分子的運動狀態，發射的熒光可能是振動方向各向隨機化的普通熒光，或是只在某一平面振動的偏振熒光（ploarized fluorescence）在反應液中，游離的標記物分子體積小，在布朗運動中轉動速度快，受偏振光照射后產生的熒光偏振方向被分散，不能產生偏振光，只發射普通熒光；與抗體結合的標記物分子體積增大，布朗運動速度減慢，甚至不能轉動而形成定向排列，所以受偏振光激發后能產生偏振熒光，樣品中的待測物的量越大，偏振熒光的強度越高。

1．2．3 熒光淬滅免疫測定法

熒光淬滅免疫測定法（Fluoresecent Quenching Immunoassay）的原理是當熒光標記物與抗體結合后發生熒光淬滅。熒光猝滅的機制尚不清楚，熒光淬滅可能與標記物與抗體結合后導致電子振動狀態的改變有關。1．2．4熒光增強免疫測定法

熒光增強免疫測定法（Fluoresecent Enhancement Immunoassay）的原理與熒光淬滅增強免疫測定法相似，不同的是標記物與抗體結合后熒光強度增強。酶免疫檢測技術在食品檢測中的應用

酶免疫檢測技術是在20世紀60年代在熒光和組織化學的基礎上發展起來的一種新技術，最初用酶代表熒光素標記抗體作為生物組織中抗原的鑒定和定位。隨后發展為用于鑒定免疫擴散及免疫電泳板上的沉淀線，到1971年，Engrall等用堿性磷酸酶標記抗原或抗體，建立了酶聯免疫吸附試驗（ELISA），這一技術因其高度的準確性、特異性、應用范圍廣、檢測速度快以及費用低等優點，是目前食品檢測中令人矚目的有發展前途的一種新技術。2．1 酶免疫技術的基本原理

用酶標記已知的抗原（抗體），然后與樣品在一定條件下反應，如果樣品中含有相應的抗體（抗原），抗原抗體結合形成復合物中所帶酶分子遇到底物時，能催化底物水解、氧化或還原，產生顯色反應，這樣就可以定性定量測定樣品中的抗體（抗原）。2．2 酶免疫技術的分類

酶免疫技術發展迅猛，種類繁多，酶免疫技術分為酶免疫組化技術和酶免疫測定技術，酶免疫測定技術又分為均相免疫測定和異相免疫測定技術，異相免疫測定技術又分為固相免疫測定技術和液相免疫測定技術。2．3 酶聯免疫吸附測定技術 2．3．1 基本原理

抗體（抗原）與酶結合后，仍然能和相應的抗原（抗體）發生特異性結合，將待測樣品事先包被于固相載體表面，加入酶標抗體（抗原），酶將抗體（抗原）于吸附于固相載體上相應的抗原（抗體）發生特異性結合反應，形成酶標記的免疫復合物，不能被緩沖液沖掉，當加入酶的底物時，底物發生化學反應，呈顏色變化，顏色深淺與待測抗原或抗體的量有關，可定性或定量測定抗原或抗體。ELISA常用的方法有直接法、間接法、雙抗體夾心法、雙夾心法和競爭法。2．3．2 ELISA技術在食品安全性檢測中的應用及前景

ELISA技術把抗原抗體特異性與酶反應的敏感性相結合，使食品在未經分離的提取的情況下，即可進行定性和定量分析。近年來，該技術在食品安全檢測中正逐步推廣應用，用于細菌及其毒素、真菌及其毒素、病毒、寄生蟲的檢測。還用于蛋白質、激素、農業殘留、獸藥殘留和抗生素及食品成分和劣質食品的檢測分析。ELISA技術由于靈敏度高、特異性強、檢測費用低和易于商品化，具有十分廣闊的應用前景。

3．放射免疫技術在食品檢測中的應用

放射免疫技術（Radio Immunoassay ,RIA）是以放射性核素為標記物的標記免疫分析法。是由Yalow和Berson于1960年創建的標記免疫分析技術。由于標記物放射性核素的檢測靈敏性，本法靈敏度高，測定準確性良好，特別適應于蛋白質、激素和多肽的精確定量測定。3．1 基本原理

放射免疫分析的基本原理是標記抗原和非標記抗原對特異性抗體的競爭結合反應。在這一反應系統中，作為試劑的標記抗原和抗體的量是固定的，抗體量一般采用能結合40％-50%的標記抗原，而受檢標本中的非標記抗原是變化的，根據標本中抗原的量不同，得到不同的反應結果。當標記抗原、非標記抗原和特異性抗體三者同時在于一個反應系統時，由于標記抗原和非標記抗原對特異性抗體具有相同的結合力，因此兩者相互競爭特異性的抗體，由于標記抗原與特異性抗體的量是固定的，故標記抗原抗體復合物形成的量就隨著非標記抗原的量而改變。非標記抗原量增加，相應的結合較多的抗體，從而抑制了標記抗原對抗體的結合，是標記抗原抗體復合物的量相應減少，游離的標記抗原相應的增加，亦即抗原抗體復合物中的放射性強度與受檢標本中抗原的濃度呈反比。若將抗原抗體復合物與游離的標記抗原分開，分別測定其放射強度，就可計算出結合的標記抗原（B）與游離的標記抗原（F）的比值（B/F），這與標本中的抗原呈函數關系。用一系列不同的標準抗原進行測定，計算相應的B/F值，可得到一條劑量反應曲線，受檢標本在同樣條件下進行測定，計算B/F值，即可在劑量反應曲線是查出標本中的抗原含量。放射免疫測定 分為液相放射免疫測定和固相放射免疫測定。3．2 放射免疫技術在食品檢測中的應用

RIA測定就是應用放射性物質代替ELISA中的標記酶作為抗原或抗體耦聯物，在食品安全檢測中最常見的同位素是3H和14C。1978年，Charm在RIA技術的基礎上發展了放射免疫檢測技術（RRA），放射免疫檢測在快速檢測方面最成功的是CharmⅡ6600/7600抗生素快速檢測系統，該系統就是利用專一受體來識別結合于同一類抗生素族中的母環以便最快速同時檢測同一抗生素族在樣品中的殘留情況。目前，CharmⅡ7600檢測系統就β－內酰胺類、氯霉素類、四環素類、磺胺類、氨唑西林及堿性磷酸酶這六項檢測以被FDA認可。放射免疫技術由于可以避免假陽性，適宜于陽性率較低的大量樣品檢測，對水產品、肉類產品、果疏產品中的農藥殘留量的檢測中廣泛應用。還可檢測經食品傳播的細菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生蟲及小分子物質和大分子物質。如南京農業大學用放射免疫測定牛奶中的天花粉蛋白。

4．免疫膠體金檢測技術在食品檢測中的應用

免疫膠體金檢測技術又叫Rosa.Tests法，是利用膠體金顆粒進行標記的一項新技術。4．1基本原理

氯金酸（HAuCl4）在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成負電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩定的膠體狀態，故稱膠體金。膠體金標記，實質上是蛋白質等分子被吸附到膠體金顆粒表面的過程，吸附機理可能是膠體金顆粒表面帶有負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而行形成牢固結合，用已知還原法可以方便地從HAuCl4制備各種不同的粒徑，不同顏色的膠體金顆粒，這種球形的顆粒對蛋白質有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌A蛋白、毒素、免疫球蛋白、糖蛋白、酶、抗生素、激素等非共價結合。

免疫膠體金檢測原理是利用了金顆粒具有電子密度的特性，當這些標記物在相應配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點。因而可用于定性或定量的快速檢測方法中。這一方法可通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。4．2 免疫膠體金技術在食品檢測中的應用

該技術當前主要用于在牛奶中檢測抗生素，可在十分鐘內快速檢測牛奶中的抗生素，利用該技術可檢測的抗生素種類有六種，β－內酰胺、四環素、磺胺二甲嘧啶、恩諾沙星和黃曲霉毒素，可檢測的β－內酰胺藥物有氨芐青霉素、阿莫西林、鄰氯青霉素頭孢噻呋、頭孢霉素和青霉素G等。由于該技術結果直觀、操作簡單，在食品安全檢測中有廣闊的應用前景。單克隆抗體技術在食品檢測中的應用

抗體主要由B淋巴細胞合成，每個B淋巴細胞有合成一種抗體的遺傳基因，如果能選出一個制造一種專一抗體的細胞進行培養，就可以得到由單細胞經分裂增殖而形成的細胞群，即克隆。單克隆細胞將合成一種決定簇的抗體。1975年，Kohler和 Milstein發現將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成了雜交細胞即可產生抗體，又可無限增殖，從而創 立了單克隆抗體雜交瘤技術。這一技術為醫學和生物學基礎研究開創了新紀元，是免疫學領域的重大突破。5．1 基本原理

B淋巴細胞具有專一性的合成針對某一抗原決定簇的抗體，但這種B淋巴細胞不能在體外生長，而骨髓瘤細胞可在體外生長，應用細胞雜交技術使骨髓瘤細胞與免疫的淋巴細胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細胞即雜交瘤細胞，這種雜交瘤細胞即具有專一性合成某一抗體的特性，也具有瘤細胞能在體外無限增殖的特性，用這種雜交瘤細胞培養的細胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異性單克隆抗體，這種用雜交瘤技術制備的單克隆抗體稱為第二抗體，主要抗原能引起小鼠的抗體應答，應用雜交瘤技術可獲得幾乎所有抗原的單克隆抗體。5．2 單克隆抗體技術在食品檢測中的應用

單克隆抗體在食品檢測中最大的優點是特異性強，不易出現假陽性。在食品檢測中有廣泛的應用前景。目前人們已制備出各種經食品傳播和引起食物中毒的細菌及毒素、真菌及毒素、病毒、寄生蟲、農藥、激素等的單克隆抗體并建立的檢測方法。

磺胺二甲嘧啶和克倫特羅（瘦肉精）這兩種藥物被歐美各國和我國列為獸藥殘留控制重點，國內研究出了用于動物性食品中磺胺二甲嘧啶檢測的單克隆抗體試劑盒和克倫特羅殘留檢測的多克隆試劑盒。這兩種試劑盒具有特異性強、儀器化程度低、樣品前處理簡單、檢測時間短，在實際生產中應用前景廣闊，填補了國內空白。

單克隆抗體檢測技術可在十分鐘內快速檢測有機磷類、氨基甲酸酯類、有機氯類、擬除蟲菊酯類及激素類的殘留量為農產品的優質安全提供技術支持。

英國建立了自動肉制品中的沙門氏菌的單克隆抗體檢測方法，人們還制出了單核增生性李特氏桿菌的單抗，用單抗ELISA檢測該菌。乳中氯霉素的單克隆抗體檢測技術也被建立。

食品儲藏過程中會受到霉菌污染，現已從青霉、毛霉等霉菌中提取耐熱性抗原制成單克隆抗體用ELISA方法可檢出加熱和未加熱食品中的霉菌。免疫測定新技術

6．1 脂質體免疫測定法

脂質體免疫測定法（LIA）是一種較新的免疫測定技術，脂質體是由磷脂或由其他類脂分子在水相中自發形成的一種密閉的雙分子單層或多層囊泡，脂質體表面還可以連接抗原或抗體分子。這種生物模擬膜在形成過程中能包裹水及其中的溶質（染料或酶），膜的穩定性可隨免疫反應有規律變化。根據釋放出的標記物的量進行測定，所以LIA具有很高的信號放大作用。目前LIA主要存在脂質體的穩定性和非特異性溶解問題。6．2 克隆酶給予體免疫測定法

克隆酶給予體免疫測定法（CEDIA）是一種新型均相免疫測定法。CEDIA中使用由重組DNA技術獲得的?半乳糖苷酶兩個獨立的蛋白質片段，這兩個片段獨立存在時無酶活性，但兩個片段結合則顯示催化活性。以此作為分析方法的基礎。其中較小片段稱為酶給予體片段（ED），另一片段稱為酶受體片段（EA）。ED標記物與抗體集合后不再與EA形成酶，所以當樣品中待測物增 加時則游離ED標記物增多，使反應液中酶產生增加，經底物顯色測定。CEDIA是目前靈敏度較高的均相免疫測定法。6．3 發光免疫測定法

發光免疫測定法（CLIA）常用魯米諾（Luminol）、異魯米諾（Isoluminol）及其衍生物進行標記。這些環肼類化合物在堿性條件下可被氧化產生3-胺基苯二甲酸鹽和430nm的發射光。在魯米諾的芳氨基上進行烴鏈取代后產光性能增強，但若置換芳氨基則發光被破壞。另外丫叮酯也用于發光標記。CLIA操作簡單、靈敏度高、測定速度快。但CLIA產光物質發光時間極短（數秒鐘），測定誤差較大。6．4免疫傳感器技術

免疫傳感器是生物傳感器的一種，近年來已取得迅速發展。免疫傳感器的探頭主要由兩部分組成；感受器：通常覆有連接有特異性抗體的可更換的傳感膜；換能器：能將抗原抗體產生的信號轉換為可供儀器檢測的電信號。免疫傳感器使用對象廣泛，專一性較強，高度的自動化，微型化與集成化減少對使用者及環境技術條件的依賴，測定速度快，適合現場或野外操作。6．5 多組分免疫測定法

根據不同檢測物標記方法互不相同，分析條件和檢測信號互不干擾。同一反應液中同時檢測不同的檢測物。但這種方法必須使幾種標記物的測定條件相互協調，其靈敏度和組分數受到限制。

免疫反應最大的特點是高度選擇性，抗原抗體的親和數通常為109或更高。作為一種分析手段，免疫分析技術操作簡單、速度快、分析成本低，在食品安全檢測中已表現出巨大的應用潛力。此外免疫分析技術能與其他技術聯用，在聯用方法中免疫技術即可作為高效液相色譜（HPLC）或氣相色譜法（GC）等測定技術的樣品進化或分離手段，也可作為其離線或在線檢測方法。這些方法結合了免疫分析的選擇性，靈敏性與HPLC，GC等技術的高速，高效分離和準確檢測能力，使分析過程簡化，分析成本下降，拓展了待測物范圍。

免疫分析測定法提供的待測物組分或結構方面的信息太少，一般不具備多殘留分析能力；免疫分析過程復雜，影響因素眾多，且不易控制，結果易于出現假陽性，方法難以標準化；方法建立過程復雜，研究周期長，某些待測物半抗原難以合成。免疫測定法不可能取代色譜或光譜等常規分析方法，只能作為其重要補充。

參考文獻

[1]現代食品檢測技術.趙杰文,孫永海主編.中國輕工業出版社.北京,2005:4.[2]獸藥殘留分析.趙俊鎖,邱月明,王超主編.上海科學技術出版社.2002:2.[3]食品安全與衛生.曹小紅主編.科學出版社.2006:7.[4]獸醫免疫學.杜念心主編.中國農業出版社.北京:1997.[5]分子免疫學.余傳霖主編.上海醫科大學出版社.復旦大學出版社.上海:2001.[6]細胞和分子免疫學.余伯泉主編.科學出版社.2001.[7]乳和乳制品檢測技術.翁鴻珍主編.中國輕工業出版社.北京:2006.[8]乳品安全和乳品檢測技術.龐廣昌,陳慶森,劉志和,等主編.科學出版社.北京： 2005.