第一篇：PCR及其改進技術在食品安全檢測中的應用

PCR及其改進技術在食品安全檢測中的應用

當今社會，食品中存在的污染情況越來越嚴重。豬肉注水、奶粉摻假、蔬菜有機農藥含量超標等等，嚴重影響著人們的身體健康。PCR改進技術可以簡化檢測步驟、提高檢測精準度，具有操作簡便、檢測速度快、檢測精度高等優點，在食品安全檢測工作中的使用率高、使用范圍廣泛。

食品安全檢測的主要內容

食品安全檢測的內容比較復雜，涉及面廣泛，主要的檢測內容是：食品污染成分、食品營養成分、食品是否具有添加劑以及食品質量的總體檢測等等。食品安全檢測的指標主要包括：成分分析、農藥殘留分析、食品添加劑分析、微量元素分析和有害物質分析等。常用的食品安全就按冊方法有兩種：一種是傳統的常規分析法，一種是儀器分析法。儀器分析法是食品安全檢測中的最常用的方法。

食品安全檢測人員對食品檢測的檢驗要求有三部分內容：①要嚴格按照標準中規定的分析步驟依次進行，在實驗室中，要對所有的不安全因素采取防護措施，其中，不安全因素都包括：爆炸、腐蝕、燒傷等等；②在實驗室中，檢測人員需要準確、詳細地記錄檢測的方法和數據等信息；③在食品安全檢測完成后，檢測人員需要檢測數據的統計和整理工作。

PCR及其改進技術概括

PCR的是指聚合酶鏈反應技術或者多聚酶鏈反應技術，常用于放大特定的DNA，主要優點有簡潔、方便、敏感、重復性好和自動化等.傳統的PCR技術在很多方面存在著不足，經過改進后有了很多較為明顯的優點，但是，實時定量PCR技術和多重PCR技術在某些方面仍然有問題。使用實時定量PCR技術時首先需要有專門的儀器，技術成本高，存在的檢測結果偏差大。多重PCR技術具有非特性結合問題，在使用多重PCR技術時如果不注意觀察樣本和樣本之間的反應和作用，會發生假陽性或者假陰性的問題。

傳統的PCR技術在食品檢測中的具體應用

檢測食品中所含成分。比如，人們在買肉的時候會考慮到肉里面有沒有摻假、是否注過水、屠宰前的家畜有沒有患有疾病等等。為了保證消費者的合法權益和身體健康，食品安全檢測人員可以使用PCR技術方便、快捷的將食品中存在的不合格現象檢測出來，降低食品安全隱患。

用于檢測食品中的病菌。在1992年，有些相關報道中提出了PCR檢測技術，經過多年的研究和實踐，將PCR技術應用到食品安全檢測中得到了很大的回響。用PCR技術檢測食品中攜帶的病菌，例如，豬羊牛肉中的大腸桿菌。

檢測食品中包含的營養成分。隨著人們生活水平的逐漸提升，人們越來越注重養生。食物中含有的營養成分和主要物質都是人們關心的重點。在走親訪友的時候，一般會送老人和孩子營養價值比較高的禮品。有很多經過加工的食品，人們對肉眼看不出食品質量的好壞，那么如何判斷食品中含有的營養成分，就需要食品檢測人員使用PCR技術進行檢測。

PCR改進技術在食品檢測中的具體應用

PCR-DGGE在食品檢測中的應用。DGGE技術又稱變性梯度凝膠電泳技術。PCR-DGGE技術是一種聚合酶鏈反應技術和變性梯度凝膠電泳技術結合在一起的新技術，具有敏感性高、特異性強的優點。使用PCR-DGGE技術進行食品檢測技術，可以將食品中DNA提取出來，利用食品的基因和食品的核酸對食品進一步的監測。比如：利用PCR-DGGE技術對奶酪進行檢測，可以檢測出奶酪中存在乳桿菌、乳酸菌和乳球菌包括污染物等等。

實時定量PCR技術在食品檢測中的應用。實時定量PCR技術是在PCR技術的基礎上，結合熒光信號來進行實時檢測。實時定量PCR技術主要采用的是完全閉管檢測，實時定量PCR技術是PCR改進技術中操作最方便、結果最準確、用時最短的一種。在各種食品安全檢測中得到了廣泛使用。

多重PCR技術在食品檢測中的具體應用。多重PCR技術是在傳統、單一的PCR技術基礎上改進后的技術。多重PCR技術一次可以?z測出多種病菌，像是大腸埃希菌、沙門菌屬、霍亂弧菌等菌類均可一次檢測出來。多重PCR技術操作簡單、快速、結果精準，多用于對番茄、大豆、玉米等轉基因食品的檢測中。

隨著毒豆芽、瘦肉精、地溝油等各種食品污染問題的產生，人們對食品的質量產生了很大的懷疑。一些黑心商家只注重經濟效益，違規經營，生產食品質量不合格。通過對食品進行安全檢驗，分析食品中所含的成分和營養比例，促進食品事物的健康、安全發展，提高人們的飲食安全。在食品安全檢測工作中使用PCR技術可以很大程度上解決食品安全中存在的問題。

作者簡介：

陳冬梅，碩士，伊犁州食品藥品檢驗所，高級工程師，食品負責人

第二篇：pcr檢測技術

《食品安全學》綜述

PCR快速檢測技術綜述

1．前言

聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點；能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍，是肉眼能直接觀察和判斷；可從一根頭發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾個星期才能做到的事情，用PCR幾個小時便可完成。PCR技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑。

該酶促反應最基本的3個環節是：[1]模板DNA的變性，即在94℃下模板雙鏈DNA變為單鏈DNA；[2]引物與模板鏈的特異性復性；[3]引物鏈的延伸。

2.研究的目的與意義

聚合酶鏈反應（PCR）技術建立以來，定性技術不斷改進和完善，可以達到檢測單個靶序列的水平、但實際工作中常需要定量檢測標本中核酸，而不是某一特定序列存在與否，借助PCR對基因快速、敏感、特異而準確定量成為目前分子生物學技術研究的熱點之一。定量PCR旨在評估樣品中靶分子數，此測定可以是絕對的，如每微克樣本中靶DNA的分子數；也可以是相對定量，即與設定的內參照或外參照比較而言。鑒于PCR方法主要有5個，即對PCR產物的直接定量、極限稀釋法、靶基因與參照基因的同步擴增、競爭性PCR和熒光定量PCR[1]。這幾種放啊各有利弊，對其選擇取決于靶基因的特性、對PCR產量的期望值、對準確度的要求、需要相對還是絕對定量。

人類對于核酸的研究已經有100多年的歷史。20世紀60年代末70年代初，人們致力于研究基因的體外分離技術。但是，由于核酸的含量較少，一定程度上限制了DNA的體外操作。Khorana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想。但是，當時的基因序列分析方法尚未成熟，對熱具有較強穩定性的DNA聚合酶還未發現，寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動合成階段，這種想法似乎沒有任何實際意義。

1985年，美國科學家Kary Mullis在高速公路的啟發下，經過兩年的努力，發明了PCR技術，并在Science雜志上發表了關于PCR技術的第一篇學術論文。從此，PCR技術得到了生命科學界的普遍認同，Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學獎。

但是，最初的PCR技術相當不成熟，在當時是一種操作復雜、成本高昂、“中看不中用”的實驗室技術。1988年初，Keohanog通過對所使用的酶的改進，提高了擴增的真實性。爾后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術的擴增效率大大提高。也正是由于此酶的發現使得PCR技術得到了廣泛地應用，使該技術成為遺傳與分子生物學 分析的根本性基石。在以后的幾十年里，PCR方法被不斷改進：它從一種定性的分析方法發展到定量測定；從原先只能擴增幾個kb的基因到目前已能擴增長達幾十個kb的DNA片段。到目前為止，PCR技術已有十幾種之多，例如，將PCR與反轉錄酶結合，成為反轉錄PCR，將PCR與抗體等相結合就成為免疫PCR等。3.國內外研究現狀

3.1.基礎研究方面的應用

目前從事分子生物學的實驗室和研究人員，幾乎每天都在使用PCR，可以說幾乎沒有一個分子生物學家沒有使用過PCR。因此，PCR與分子克隆一樣是分子生物學實驗室的常規方法，可用于達到以下目的：

[1] 擴增目的基因和鑒定重組子； [2]克隆基因；

[3]基因功能和表達調控的研究； [4]基因組測序； [5]制備單鏈模板； [6]致突變；

3.2.PCR在臨床上的應用[2]

[1]在遺傳學上的應用：人類的遺傳性疾病是因為某一堿基序列發生了突變，使之缺失或形成某一限制性內切酶的識別位點，通過PCR結合限制片段長度多態性分析（PCR-RFLP），就可以從基因的水平對遺傳性疾病進行分析。例如，血友病甲是一種常見的遺傳性出血性疾病，患者體內缺乏凝血因子FVIII這是由于基因第14個外顯子的第336位氨基酸的編碼基因發生了突變，產生了一個新的PstI酶切點，因此可以使用PCR-RFLP對血友病進行診斷。PCR還可以用來檢測遺傳性耳聾和Leber遺傳性視神經病。

[2]在腫瘤研究中的應用：PCR已日益廣泛應用于腫瘤的病因與發病機理研究以及腫瘤診斷與治療的研究中。例如，差異顯示PCR技術能針對不同腫瘤尋找其特異而敏感的標志物，并用于腫瘤早期診斷、判斷預后及療效評估。另一方面，在使用普通放療、化療的同時可結合定量PCR技術檢測微小殘留病灶，以進一步改進治療方案。此外，由于癌癥的發生在一定意義上是單個細胞分子發生變化，因而可以使用單細胞PCR技術對癌癥的發病機理進行研究。[3]在基因分型中的應用：當進行器官移植時并須先組織配型工作，此時常應用序列特異性寡核苷酸多態性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）對人類白細胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）進行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段長度多態性也可以用于對HLA的分型。3．3.在法醫學中的應用[3]

例如：最早應用DNA限制性片段長度多態性結合PCR-RFLP來進行法醫學個體識別和親子鑒定。目前發現在真核生物基因組編碼和非編碼序列中的短串聯重復序列的重復次數在個體間存在著差異，因此可以使用短串聯重復PCR技術對其進行分析。使用PCR技術進行法醫鑒定的優點是樣品用量小并且適于對高度降解材料的檢測。除剛才提到的之外，可變數目串聯重復序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法醫學個體識別和親子鑒定。所以，綜上所述，PCR的確是一種分子生物學研究的基礎技術。在它30多年的發展中衍生出了諸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突變PCR和定量PCR等十幾種不同的技術方法。PCR技術可以為基因工程提供目的基因，并廣泛地應用于個體識別、親子鑒定、免疫配型、疾病診斷等方面。可以說，PCR已經滲透到了生命科學的各個領域。21世紀是生物工程的世紀。我相信，在今后的發展中PCR技術會不斷地得到擴充和完善，PCR技術也將4.相關檢測技術 4.1.技術原理

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。實驗中發現，DNA在高溫下也能發生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。發現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床。4.2.工作原理

類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR 擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍 4.3.工作步驟

標準的PCR過程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2.退火（25℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度 5.研究方案

醫學檢驗大致可分為形態學、生物化學、血清免疫學和分子生物學幾大類，其分別代表幾代實驗診斷技術。60年代DNA雙螺旋結構及半保留復制模式的出現，70年代基因重組及體外基因克隆技術、分子雜交技術的應用使分子生物學在疾病診斷中得到了長足的發展。特別是1985年Mullis發明了聚合酶鏈式反應（PCR）技術，使醫學界真正興起了基因診斷技術熱，成為現代醫學發展的又一里程碑。用于臨床檢驗的PCR技術與經典的PCR反應在操作上稍有區別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對DNA純化有限，但適應臨床微量、快速的特點。另外PCR反應體系中各組成成份往往都預分裝到反應管中，既減少操作者的工作強度而且也減少了污染的機會，具有極高的使用價值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創性意義。這些改進都不影響PCR效果，同樣表現出高特異性、高敏感性、簡便快捷等PCR最優秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優生優育、法醫學等廣泛領域中有相當高的實際應用價值。5.1研究方法

① 早期診斷，因為PCR擴增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。

② 對低持續感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內的病毒長期低復制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。

③ 療效跟蹤及病程判斷，因為PCR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數量多少的最直接指標。在治療過程中通過監測血清或白細胞中病毒基因存在與否及其動態變化即能準確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗的方法主要是ELISA法測定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時血清中抗體的出現及動態變化與病人病情無線性相關關系。RT－PCR技術使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉錄為cDNA（RT）后再進行PCR擴增，這種技術稱之為逆轉錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內復制的動態狀況。RNA純化要求嚴格，是RT－PCR的技術關鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對樣本中的RNA進行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉錄酶，如AMV/MLV逆轉錄酶，高溫逆轉錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實現單管單酶單人份的擴增要求，這樣就在不降低擴增敏感性的條件下，一步完成擴增，不僅簡化操作，而且又減少污染，提高檢測的準確性。國內本公司已采用這種技術推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長期存在于血清中。在PCR檢測時，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經口－口途經傳播并定位于胃粘膜上皮細胞，早期表現為淺表性胃炎，可發展成為胃潰瘍。我國胃炎發病率之高估計比乙型肝炎更嚴重，對HP的檢測應受到廣大醫務工作者的重視。對HP的檢測可以用生化法測試尿素酶或用免疫法測試血清中對HP特異性抗體，也可對胃液、胃粘膜樣本進行細菌培養及菌種鑒定。PCR法檢測HP非常敏感且特異性高，有研究發現可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP.PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，5.2.技術路線

PCR技術

聚合酶鏈式反應技術（PCR）是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的方法。具有特異性強、敏感性高、快速、簡便、可擴增RNA或cDNA、對起始材料質量要求低等優點。5.3.所用儀器與材料

引物: PCR產物的特異性主要取決于引物鏈的特異性。由于存在同源序列，隨意設計的引物鏈，其PCR產物在電泳分析時可能出現多條鏈，因此在設計引物鏈時應充分考慮引物特異性。引物長度一般為15-30個堿基,G+C含量為40-60%,濃度0.1-1umol/L。TaqDNA聚合酶：濃度為1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶單位用量增長可能導致非特異DNA擴增。模板DNA：應避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑及能結合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制備方法有加熱法、凍溶法、超聲波粉碎法、堿變性法、SDS裂解法等多種。

4×dNTPs ： dNTP儲存液pH應為7.0，在反應體系中，4種dNTP的濃度應相同，每種dNTP的濃度以50-200 umol/L為宜。緩沖液及其他成份：PCR反應體系中，一般采用Tris-HCl緩沖液。適宜的Mg2+濃度為高于dNTP總濃度0.2-2.5 mmol/L。

6．研究內容

PCR技術的出現對法醫學的發展也有不可低估的作用。在法醫物證如血斑、毛發、組織碎片等的確證，DAN多態性分析遠比血清學或等方法確實可靠。早期DNA多態性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個內含子中的串聯重復序列作探針，從人的基因庫中篩選出小衛量DNA，使用阿交法產生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術成功地應用于個人識別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當樣本DNA數量不足時或DAN嚴重降解則不能正常檢出。且雜交技術常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護措施。PCR技術的出現，可以對極少量物證如一根毛發、一滴血液、極小精斑都可以進行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構成的串聯重復DNA序列，具有單位點特征的稱為VNTR結構，多位點串聯成為衛星DNA。6．1.檢測對象

常見的傳染性疾病有細菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環、泌尿生殖等不同系統相應的病變。消化系統感染性疾病在我國具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國是乙肝高發區，乙肝病人為世界乙肝病人總數的50％。[4]乙肝病毒經血液傳播，病毒主要在肝細胞中增殖，也可以長期存留在骨髓細胞或外周血白細胞中。通常用PCR法檢測血清中的乙肝病毒。有報道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細胞中檢出乙肝病毒，這些發現提示其它傳染途經存在的可能 6．2檢測內容

PCR反應混合物經過循環擴增后，所需做的工作就是檢測反應液中是否存在預期擴增產物及產物的特異性。目前已經發展了許多檢測分析PCR擴增產物的方法。包括凝膠電泳、高壓液相色譜、核酸探針雜交、探針捕獲酶免疫分析、酶切圖譜分析、單鏈構型多態性分析、核酸序列分析。

PCR技術類型[5]

免疫PCR技術 原位PCR技術 不對稱PCR技術 巢式PCR技術 反向PCR技術 逆轉錄PCR技術

復合PCR技術

彩色PCR技術

抗原捕獲PCR技術 增敏PCR技術

酶標PCR技術

二溫式PCR技術

錨定PCR技術

定量PCR技術

毛細管PCR技術

多重PCR技術

巢式或套式PCR技術 7.預期目標PCR 技術在大腸桿菌O157: H7檢測中

（1)簡單PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段為基礎設計了一對引物,擴增產物為633bp的DNA片段。其退火溫度為60℃－63℃, 應用煮沸法與基因釋放法,大腸桿菌O157: H7檢出限分別為25與38CFU/ml,檢測時間為3h。Thomas等用PCR擴增了slt基因片段。引物： 正鏈5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3', 反鏈5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’

其PCR產物由凝膠電泳測定,檢測時間為ld。

徐建國等根據O157: H7 特有的hlyA、B基因序列設計了PCR引物,產物為338bp。

PCR技術在大腸桿菌O157: H7檢測中（2）多重PCR:由于鑒定O157: H7血清型不能僅僅依靠簡單PCR,近年來國外學者對多重PCR方法在大腸桿菌O157: H7的診斷價值方面進行了研究。Meng等同時擴增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其長度分別為633、210、484bp。此引物設計可有效區別O157: H7血清型與O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一個單一反應中同時擴增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa質粒保守序列,其產物分別為1087、227、224、166bp。嚴笠選用針對大腸桿菌O157: H7志賀樣毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三對引物,在同一擴增體系中進行PCR,檢測12株不同來源的O157: H7大腸桿菌及其它致病性大腸桿菌及沙門菌、志賀菌15株。結果復合PCR方法較單一PCR方法具有較高的特異性，12株O157: H7取得了穩定、可靠的陽性結果。能迅速、有效地與其它致病性大腸桿菌及沙門氏菌、志賀菌相鑒別。

PCR技術在大腸桿菌O157: H7檢測中的應用（3）原位PCR: kurokawa等不用培養過程,直接用原位PCR技術結合落射顯微鏡,在單細胞水平快速檢測O157: H7。

4.23SrRNA在大腸桿菌O157: H7分型、檢測中

傳統的細菌分類方法主要依賴于細菌的形態學、代謝產物、酶活性和表面抗原等特征。隨著現代分子生物學理論和技術的迅速發展，微生物檢測進入了基因時代，以核糖體核糖核酸序列為基礎的分類方法為微生物的鑒別提供了新的分子生物學方法。[6]如16srRNA、23srRNA、16-23srRNA區間序列分析等等，它完全不同于傳統方法，具有快速、簡便、敏感和特異等優點。

參考文獻

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第三篇：免疫學檢測技術在食品安全中的應用

免疫學檢測技術在食品安全中的應用

楊明

（甘肅農業大學 動物醫學院，甘肅 蘭州 730070）

食品安全問題在21世紀的今天已經成為全世界關注的重大問題，對國家的經濟發展和消費者的身體健康產生了重大影響。隨著我國市場經濟的的不斷完善和發展，食品行業對外貿易與日劇增，食品的質量與安全問題已成為影響農業和食品工業產品競爭力的關鍵因素。同時，由于我國人民生活已由溫飽型食物結構轉向營業健康型食物結構，全民食品營業衛生知識得到普及。人民的飲食消費觀念也由數量型轉向質量型，對食品衛生質量標準的要求越練越高，這就對食品檢測技術提出更高的要求。

由于食品種類豐富，食品中檢測的有毒有害物質種類和組分繁多，需要檢測的物質質量極低，樣品中待檢物的濃度常為μg、ng甚至 pg級，除此之外，許多檢測物除需檢測物質本身，還涉及其衍生物和降解物測定。區別同位異構體以及元素的價態等。因此食品檢測要求檢測方法更加準確、快速、方便，也使得其他學科的先進技術不斷應用于食品檢測領域中來，由于新技術的引入，食品行業開發出了許多自動化程度和精確度很高的檢測儀器，這不僅縮短了分析時間，減少了人力誤差，也大大提高了食品分析檢測的速度、靈敏度和準確度。現代食品檢測技術主要包括以下幾個方面：①計算機視覺技術；②現代儀器分析技術；③食品物性的力學、聲學和電學檢測技術；④電子傳感檢測技術；⑤生物傳感技術；⑥核酸探針檢測技術；⑦PCR基因擴增技術；⑧免疫學檢測技術。

免疫學檢測技術是食品檢測技術中的一個重要組成部分，特別是三大免疫技術——熒光免疫技術、酶免疫技術、放射免疫技術在食品檢測中得到了廣泛應用。利用免疫學檢測技術可檢測細菌、病毒、真菌、各種毒素、寄生蟲等，還可用于蛋白質、激素、其他生理活性物質、藥物殘留、抗生素等的檢測，其檢測方法簡便、快速、靈敏度高、特異性強，特別是單克隆抗體的發展，使得免疫檢測方法特異性更強，結果更準確。

免疫分析是抗原與抗體的特異性、可逆性結合為基礎的分析技術。1959年，Yalow和Berson 將發射性同位素示蹤與免疫反應相結合建立了發射免疫測定法，從而開創了免疫分析這一嶄新領域，次后又發展了許多替代或非同位素免疫免疫分析法。

1．免疫熒光技術在食品檢測中的應用

免疫熒光分析（Immuno Fluorescence Assay , IFA）始創于20世紀40年代初，1942年Cons等首次報道用異硫氰酸熒光素標記抗體，檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗體，但此種熒光素標記物的性能較差，未能推廣應用，20世紀50年代，Riggs等合成性能較為優良的異硫氰酸熒光素。Mashall等對熒光抗體的標記方法又進行了改進，從而使得免疫熒光技術逐漸推廣應用。1．1 基本原理

抗體與熒光素結合后，并不影響其與相應的抗原發生特異性反應，事先將待測抗原固定與玻璃載玻片上，滴加熒光標記抗體，若熒光標記抗體與相應的抗原發生特異性結合反應，不能被緩沖液沖掉，載熒光顯微鏡下可觀察到熒光，否則熒光抗體被緩沖液沖掉，在顯微鏡下觀察不到熒光。1．2 熒光免疫測定法的分類

根據標記熒光產生的方式不同分為底物標記熒光測定法、熒光偏振免疫測定法、熒光猝滅增強免疫測定法。FIA可使用均相或非均相分析方式，均相FIA應用較多。

1．2．1 底物標記熒光測定法

底物標記熒光測定法（SLFIA）使用一種酶的底物標記待測物，底物本身無熒光，在受到相應酶的催化時能轉變為熒光物，當標記底物與抗體結合產生的空間位阻阻礙了酶與標記底物間的接觸，樣品中的待測物通過競爭作用使游離的酶標結合物或熒光強度增加。1．2．2熒光偏振免疫測定法

使用偏振光作為激發光時，視分子的運動狀態，發射的熒光可能是振動方向各向隨機化的普通熒光，或是只在某一平面振動的偏振熒光（ploarized fluorescence）在反應液中，游離的標記物分子體積小，在布朗運動中轉動速度快，受偏振光照射后產生的熒光偏振方向被分散，不能產生偏振光，只發射普通熒光；與抗體結合的標記物分子體積增大，布朗運動速度減慢，甚至不能轉動而形成定向排列，所以受偏振光激發后能產生偏振熒光，樣品中的待測物的量越大，偏振熒光的強度越高。

1．2．3 熒光淬滅免疫測定法

熒光淬滅免疫測定法（Fluoresecent Quenching Immunoassay）的原理是當熒光標記物與抗體結合后發生熒光淬滅。熒光猝滅的機制尚不清楚，熒光淬滅可能與標記物與抗體結合后導致電子振動狀態的改變有關。1．2．4熒光增強免疫測定法

熒光增強免疫測定法（Fluoresecent Enhancement Immunoassay）的原理與熒光淬滅增強免疫測定法相似，不同的是標記物與抗體結合后熒光強度增強。酶免疫檢測技術在食品檢測中的應用

酶免疫檢測技術是在20世紀60年代在熒光和組織化學的基礎上發展起來的一種新技術，最初用酶代表熒光素標記抗體作為生物組織中抗原的鑒定和定位。隨后發展為用于鑒定免疫擴散及免疫電泳板上的沉淀線，到1971年，Engrall等用堿性磷酸酶標記抗原或抗體，建立了酶聯免疫吸附試驗（ELISA），這一技術因其高度的準確性、特異性、應用范圍廣、檢測速度快以及費用低等優點，是目前食品檢測中令人矚目的有發展前途的一種新技術。2．1 酶免疫技術的基本原理

用酶標記已知的抗原（抗體），然后與樣品在一定條件下反應，如果樣品中含有相應的抗體（抗原），抗原抗體結合形成復合物中所帶酶分子遇到底物時，能催化底物水解、氧化或還原，產生顯色反應，這樣就可以定性定量測定樣品中的抗體（抗原）。2．2 酶免疫技術的分類

酶免疫技術發展迅猛，種類繁多，酶免疫技術分為酶免疫組化技術和酶免疫測定技術，酶免疫測定技術又分為均相免疫測定和異相免疫測定技術，異相免疫測定技術又分為固相免疫測定技術和液相免疫測定技術。2．3 酶聯免疫吸附測定技術 2．3．1 基本原理

抗體（抗原）與酶結合后，仍然能和相應的抗原（抗體）發生特異性結合，將待測樣品事先包被于固相載體表面，加入酶標抗體（抗原），酶將抗體（抗原）于吸附于固相載體上相應的抗原（抗體）發生特異性結合反應，形成酶標記的免疫復合物，不能被緩沖液沖掉，當加入酶的底物時，底物發生化學反應，呈顏色變化，顏色深淺與待測抗原或抗體的量有關，可定性或定量測定抗原或抗體。ELISA常用的方法有直接法、間接法、雙抗體夾心法、雙夾心法和競爭法。2．3．2 ELISA技術在食品安全性檢測中的應用及前景

ELISA技術把抗原抗體特異性與酶反應的敏感性相結合，使食品在未經分離的提取的情況下，即可進行定性和定量分析。近年來，該技術在食品安全檢測中正逐步推廣應用，用于細菌及其毒素、真菌及其毒素、病毒、寄生蟲的檢測。還用于蛋白質、激素、農業殘留、獸藥殘留和抗生素及食品成分和劣質食品的檢測分析。ELISA技術由于靈敏度高、特異性強、檢測費用低和易于商品化，具有十分廣闊的應用前景。

3．放射免疫技術在食品檢測中的應用

放射免疫技術（Radio Immunoassay ,RIA）是以放射性核素為標記物的標記免疫分析法。是由Yalow和Berson于1960年創建的標記免疫分析技術。由于標記物放射性核素的檢測靈敏性，本法靈敏度高，測定準確性良好，特別適應于蛋白質、激素和多肽的精確定量測定。3．1 基本原理

放射免疫分析的基本原理是標記抗原和非標記抗原對特異性抗體的競爭結合反應。在這一反應系統中，作為試劑的標記抗原和抗體的量是固定的，抗體量一般采用能結合40％-50%的標記抗原，而受檢標本中的非標記抗原是變化的，根據標本中抗原的量不同，得到不同的反應結果。當標記抗原、非標記抗原和特異性抗體三者同時在于一個反應系統時，由于標記抗原和非標記抗原對特異性抗體具有相同的結合力，因此兩者相互競爭特異性的抗體，由于標記抗原與特異性抗體的量是固定的，故標記抗原抗體復合物形成的量就隨著非標記抗原的量而改變。非標記抗原量增加，相應的結合較多的抗體，從而抑制了標記抗原對抗體的結合，是標記抗原抗體復合物的量相應減少，游離的標記抗原相應的增加，亦即抗原抗體復合物中的放射性強度與受檢標本中抗原的濃度呈反比。若將抗原抗體復合物與游離的標記抗原分開，分別測定其放射強度，就可計算出結合的標記抗原（B）與游離的標記抗原（F）的比值（B/F），這與標本中的抗原呈函數關系。用一系列不同的標準抗原進行測定，計算相應的B/F值，可得到一條劑量反應曲線，受檢標本在同樣條件下進行測定，計算B/F值，即可在劑量反應曲線是查出標本中的抗原含量。放射免疫測定 分為液相放射免疫測定和固相放射免疫測定。3．2 放射免疫技術在食品檢測中的應用

RIA測定就是應用放射性物質代替ELISA中的標記酶作為抗原或抗體耦聯物，在食品安全檢測中最常見的同位素是3H和14C。1978年，Charm在RIA技術的基礎上發展了放射免疫檢測技術（RRA），放射免疫檢測在快速檢測方面最成功的是CharmⅡ6600/7600抗生素快速檢測系統，該系統就是利用專一受體來識別結合于同一類抗生素族中的母環以便最快速同時檢測同一抗生素族在樣品中的殘留情況。目前，CharmⅡ7600檢測系統就β－內酰胺類、氯霉素類、四環素類、磺胺類、氨唑西林及堿性磷酸酶這六項檢測以被FDA認可。放射免疫技術由于可以避免假陽性，適宜于陽性率較低的大量樣品檢測，對水產品、肉類產品、果疏產品中的農藥殘留量的檢測中廣泛應用。還可檢測經食品傳播的細菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生蟲及小分子物質和大分子物質。如南京農業大學用放射免疫測定牛奶中的天花粉蛋白。

4．免疫膠體金檢測技術在食品檢測中的應用

免疫膠體金檢測技術又叫Rosa.Tests法，是利用膠體金顆粒進行標記的一項新技術。4．1基本原理

氯金酸（HAuCl4）在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成負電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩定的膠體狀態，故稱膠體金。膠體金標記，實質上是蛋白質等分子被吸附到膠體金顆粒表面的過程，吸附機理可能是膠體金顆粒表面帶有負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而行形成牢固結合，用已知還原法可以方便地從HAuCl4制備各種不同的粒徑，不同顏色的膠體金顆粒，這種球形的顆粒對蛋白質有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌A蛋白、毒素、免疫球蛋白、糖蛋白、酶、抗生素、激素等非共價結合。

免疫膠體金檢測原理是利用了金顆粒具有電子密度的特性，當這些標記物在相應配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點。因而可用于定性或定量的快速檢測方法中。這一方法可通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。4．2 免疫膠體金技術在食品檢測中的應用

該技術當前主要用于在牛奶中檢測抗生素，可在十分鐘內快速檢測牛奶中的抗生素，利用該技術可檢測的抗生素種類有六種，β－內酰胺、四環素、磺胺二甲嘧啶、恩諾沙星和黃曲霉毒素，可檢測的β－內酰胺藥物有氨芐青霉素、阿莫西林、鄰氯青霉素頭孢噻呋、頭孢霉素和青霉素G等。由于該技術結果直觀、操作簡單，在食品安全檢測中有廣闊的應用前景。單克隆抗體技術在食品檢測中的應用

抗體主要由B淋巴細胞合成，每個B淋巴細胞有合成一種抗體的遺傳基因，如果能選出一個制造一種專一抗體的細胞進行培養，就可以得到由單細胞經分裂增殖而形成的細胞群，即克隆。單克隆細胞將合成一種決定簇的抗體。1975年，Kohler和 Milstein發現將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成了雜交細胞即可產生抗體，又可無限增殖，從而創 立了單克隆抗體雜交瘤技術。這一技術為醫學和生物學基礎研究開創了新紀元，是免疫學領域的重大突破。5．1 基本原理

B淋巴細胞具有專一性的合成針對某一抗原決定簇的抗體，但這種B淋巴細胞不能在體外生長，而骨髓瘤細胞可在體外生長，應用細胞雜交技術使骨髓瘤細胞與免疫的淋巴細胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細胞即雜交瘤細胞，這種雜交瘤細胞即具有專一性合成某一抗體的特性，也具有瘤細胞能在體外無限增殖的特性，用這種雜交瘤細胞培養的細胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異性單克隆抗體，這種用雜交瘤技術制備的單克隆抗體稱為第二抗體，主要抗原能引起小鼠的抗體應答，應用雜交瘤技術可獲得幾乎所有抗原的單克隆抗體。5．2 單克隆抗體技術在食品檢測中的應用

單克隆抗體在食品檢測中最大的優點是特異性強，不易出現假陽性。在食品檢測中有廣泛的應用前景。目前人們已制備出各種經食品傳播和引起食物中毒的細菌及毒素、真菌及毒素、病毒、寄生蟲、農藥、激素等的單克隆抗體并建立的檢測方法。

磺胺二甲嘧啶和克倫特羅（瘦肉精）這兩種藥物被歐美各國和我國列為獸藥殘留控制重點，國內研究出了用于動物性食品中磺胺二甲嘧啶檢測的單克隆抗體試劑盒和克倫特羅殘留檢測的多克隆試劑盒。這兩種試劑盒具有特異性強、儀器化程度低、樣品前處理簡單、檢測時間短，在實際生產中應用前景廣闊，填補了國內空白。

單克隆抗體檢測技術可在十分鐘內快速檢測有機磷類、氨基甲酸酯類、有機氯類、擬除蟲菊酯類及激素類的殘留量為農產品的優質安全提供技術支持。

英國建立了自動肉制品中的沙門氏菌的單克隆抗體檢測方法，人們還制出了單核增生性李特氏桿菌的單抗，用單抗ELISA檢測該菌。乳中氯霉素的單克隆抗體檢測技術也被建立。

食品儲藏過程中會受到霉菌污染，現已從青霉、毛霉等霉菌中提取耐熱性抗原制成單克隆抗體用ELISA方法可檢出加熱和未加熱食品中的霉菌。免疫測定新技術

6．1 脂質體免疫測定法

脂質體免疫測定法（LIA）是一種較新的免疫測定技術，脂質體是由磷脂或由其他類脂分子在水相中自發形成的一種密閉的雙分子單層或多層囊泡，脂質體表面還可以連接抗原或抗體分子。這種生物模擬膜在形成過程中能包裹水及其中的溶質（染料或酶），膜的穩定性可隨免疫反應有規律變化。根據釋放出的標記物的量進行測定，所以LIA具有很高的信號放大作用。目前LIA主要存在脂質體的穩定性和非特異性溶解問題。6．2 克隆酶給予體免疫測定法

克隆酶給予體免疫測定法（CEDIA）是一種新型均相免疫測定法。CEDIA中使用由重組DNA技術獲得的?半乳糖苷酶兩個獨立的蛋白質片段，這兩個片段獨立存在時無酶活性，但兩個片段結合則顯示催化活性。以此作為分析方法的基礎。其中較小片段稱為酶給予體片段（ED），另一片段稱為酶受體片段（EA）。ED標記物與抗體集合后不再與EA形成酶，所以當樣品中待測物增 加時則游離ED標記物增多，使反應液中酶產生增加，經底物顯色測定。CEDIA是目前靈敏度較高的均相免疫測定法。6．3 發光免疫測定法

發光免疫測定法（CLIA）常用魯米諾（Luminol）、異魯米諾（Isoluminol）及其衍生物進行標記。這些環肼類化合物在堿性條件下可被氧化產生3-胺基苯二甲酸鹽和430nm的發射光。在魯米諾的芳氨基上進行烴鏈取代后產光性能增強，但若置換芳氨基則發光被破壞。另外丫叮酯也用于發光標記。CLIA操作簡單、靈敏度高、測定速度快。但CLIA產光物質發光時間極短（數秒鐘），測定誤差較大。6．4免疫傳感器技術

免疫傳感器是生物傳感器的一種，近年來已取得迅速發展。免疫傳感器的探頭主要由兩部分組成；感受器：通常覆有連接有特異性抗體的可更換的傳感膜；換能器：能將抗原抗體產生的信號轉換為可供儀器檢測的電信號。免疫傳感器使用對象廣泛，專一性較強，高度的自動化，微型化與集成化減少對使用者及環境技術條件的依賴，測定速度快，適合現場或野外操作。6．5 多組分免疫測定法

根據不同檢測物標記方法互不相同，分析條件和檢測信號互不干擾。同一反應液中同時檢測不同的檢測物。但這種方法必須使幾種標記物的測定條件相互協調，其靈敏度和組分數受到限制。

免疫反應最大的特點是高度選擇性，抗原抗體的親和數通常為109或更高。作為一種分析手段，免疫分析技術操作簡單、速度快、分析成本低，在食品安全檢測中已表現出巨大的應用潛力。此外免疫分析技術能與其他技術聯用，在聯用方法中免疫技術即可作為高效液相色譜（HPLC）或氣相色譜法（GC）等測定技術的樣品進化或分離手段，也可作為其離線或在線檢測方法。這些方法結合了免疫分析的選擇性，靈敏性與HPLC，GC等技術的高速，高效分離和準確檢測能力，使分析過程簡化，分析成本下降，拓展了待測物范圍。

免疫分析測定法提供的待測物組分或結構方面的信息太少，一般不具備多殘留分析能力；免疫分析過程復雜，影響因素眾多，且不易控制，結果易于出現假陽性，方法難以標準化；方法建立過程復雜，研究周期長，某些待測物半抗原難以合成。免疫測定法不可能取代色譜或光譜等常規分析方法，只能作為其重要補充。

參考文獻

[1]現代食品檢測技術.趙杰文,孫永海主編.中國輕工業出版社.北京,2005:4.[2]獸藥殘留分析.趙俊鎖,邱月明,王超主編.上海科學技術出版社.2002:2.[3]食品安全與衛生.曹小紅主編.科學出版社.2006:7.[4]獸醫免疫學.杜念心主編.中國農業出版社.北京:1997.[5]分子免疫學.余傳霖主編.上海醫科大學出版社.復旦大學出版社.上海:2001.[6]細胞和分子免疫學.余伯泉主編.科學出版社.2001.[7]乳和乳制品檢測技術.翁鴻珍主編.中國輕工業出版社.北京:2006.[8]乳品安全和乳品檢測技術.龐廣昌,陳慶森,劉志和,等主編.科學出版社.北京： 2005.

第四篇：PCR技術在食品工業中的應用

PCR技術在食品工業中的應用

姓名

專業

翟揚威 學號 11042106

食品科學與工程 班級 11-1

[摘要]: 如今食品營養、安全問題備受關注，是關系到人們健康和國家發展的重大課題，有關食品安全檢測的技術受到重視,其中 PCR技術以其靈敏度高、特異性強以及快速準確等優勢在食品檢測領域得到廣泛的認可.現主要介紹一下PCR技術檢測食品微生物的優點，且分析了PCR技術在食品檢測中的應用及一些新的PCR檢測技術，并說明了這些技術在食品微生物檢測中的發展。

[關鍵詞]: 多聚酶鏈式反應 PCR 食品檢測 微生物

近年來，PCR技術在食品工業中倍受重視，例如：基因克隆、轉基因食品檢測、微生物檢測、食品成分及產地的檢測等，推進了基因工程在食品產業的發展。

首先，我們得了解PCR技術是什么？作用原理是什么？

PCR即聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)，是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點；能在一個試管內將所要研究 的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研 究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑。

PCR技術的基本原理：該技術是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此為起始點，沿模板5′→3′方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。

參加pcr反應的物質主要有五種即引物、酶、D-NTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則： ①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

PCR 技術檢測微生物的基本原理是在被檢測微生物核酸序列, 在PCR 體系下經高溫變性、低溫退火、適溫延伸三步循環將單個核酸分子序列以2的指數進行大量復制擴增的過程。即在檢測時, 被檢測微生物雙鏈DNA 序列在94℃變性解鏈成雙鏈, 55℃特異性引物與單鏈DNA 結合, 72℃在引物的引導延伸復制檢測微生物DNA 序列。以上三步進行循環擴增得到大量的被檢測微生物DNA 序列, 最后一般在凝膠電泳下檢測目的DNA。理論上只要樣品中有一個分子的微生物就可以在短時間內用PCR 技術檢測到。食品中污染微生物種類很多, 即使是同一種食品中微生物種類也有很多, 用傳統的方法檢測食品中微生物要分離出所有的微生物很困難。特別是在檢測食品中的弱勢菌時, 可能很難用傳統的方法檢測出來, 特別是有些微生物很難培養, 而用PCR 技術檢測這些微生物可以避免這些問題, 因此, 利用PCR 技術能夠比較準確地檢測食品中微生物。

PCR技術在食品成分測定方面的應用也倍受關注，如動物源性成分的測定等。

近年來，瘋牛病、羊癢病及禽流感等疾病通過食品的傳播，由于食品安全性與質量監督的需要及宗教信仰等問題，有必要對食品中的動物源成分進行檢測，僅靠傳統的外觀鑒別，無法準確判定其實際成分。PCR 技術已被廣泛應用于動物肉類的物種檢測與飼料中的動物成分檢測。陳文炳[20]等，應用了PCR技術檢測12種加工食品中豬、牛、羊、雞等動物源性成分，并開發了真核生物所共有的18S核糖體DNA(18S R-DNA)與食品中多種動物物種特異性基因片段之間的二重PCR檢測方法，以提高檢測效率與準確性，節約檢測成本。王麗媛[21]等，利用單重PCR和多重PCR對部分市售肉制品進行檢測，以確定食品中是否含有動物源性成分及其含量。此方法操作簡便，快速準確，節省費用。植物源性成分的測定

我國是一個農產品出口大國，加入WTO后，隨著農產品出口量的增加，國外對出口食品質量的要求也隨之提高。為確保食品的品質和安全，為我國食品的進出口貿易嚴格把關，保證我國人民日常生活的食品安全和生命健康。因此，開發出準確方便的鑒定食品有效成分的方法，具有重大意義。陳文炳[22]等本研究以豆粉與豆奶粉中的大豆成分(內源Lectin基因)、食品中的玉米(IVR 基因)、馬鈴薯(PATA基因)、番茄(PG基因)等成分以及真核生物中普遍存在的核糖體DNA(18S R-DNA)片段為研究對象，進行單一與二重PCR擴增，以擴增產物作為分子標記，建立加工食品中植物源性有效成分的分子生物學鑒定技術，為食品質量與安全管理提供技術支持。

參考文獻

[1]張玉霞，黃鳴.食品檢驗中多重PCR技術的應用.中國衛生檢驗雜志, 2008年5月第18卷第5期 P958-960 [2]陳師勇、莫照蘭、徐永立.水產養殖病原微生物檢測技術研究進展.海洋科學,2002.26(9)P31-35 [3]楊衛軍,張小軍,張坤朋,張光杰.PCR技術在食品微生物檢測中的應用.安陽工學院學報,2004(4)p16-18 [4]張玉霞，黃鳴.食品檢驗中多重PCR技術的應用.中國衛生檢驗雜志, 2008年5月第18卷第5期 P958-960 [5]陳師勇、莫照蘭、徐永立.水產養殖病原微生物檢測技術研究進展.海洋科學,2002.26(9)P31-35 [6]楊衛軍,張小軍,張坤朋,張光杰.PCR技術在食品微生物檢測中的應用.安陽工學院學報,2004(4)p16-18

第五篇：PCR技術在臨床檢驗中的應用

PCR技術在臨床檢驗中的應用

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醫學檢驗大致可分為形態學、生物化學、血清免疫學和分子生物學幾大類，其分別代表幾代實驗診斷技術。60年代DNA雙螺旋結構及半保留復制模式的出現，70年代基因重組及體外基因克隆技術、分子雜交技術的應用使分子生物學在疾病診斷中得到了長足的發展。特別是1985年Mullis發明了聚合酶鏈式反應（PCR）技術，使醫學界真正興起了基因診斷技術熱，成為現代醫學發展的又一里程碑。用于臨床檢驗的PCR技術與經典的PCR反應在操作上稍有區別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對DNA純化有限，但適應臨床微量、快速的特點。另外PCR反應體系中各組成成份往往都預分裝到反應管中，既減少操作者的工作強度而且也減少了污染的機會，具有極高的使用價值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創性意義。這些改進都不影響PCR效果，同樣表現出高特異性、高敏感性、簡便快捷等PCR最優秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優生優育、法醫學等廣泛領域中有相當高的實際應用價值。

常見的傳染性疾病有細菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環、泌尿生殖等不同系統相應的病變。消化系統感染性疾病在我國具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國是乙肝高發區，乙肝病人為世界乙肝病人總數的50％。乙肝病毒經血液傳播，病毒主要在肝細胞中增殖，也可以長期存留在骨髓細胞或外周血白細胞中。通常用PCR法檢測血清中的乙肝病毒。有報道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細胞中檢出乙肝病毒，這些發現提示其它傳染途經存在的可能。PCR法檢測乙肝的優勢表現在：①早期診斷，因為PCR擴增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。②對低持續感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內的病毒長期低復制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。③療效跟蹤及病程判斷，因為PCR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數量多少的最直接指標。在治療過程中通過監測血清或白細胞中病毒基因存在與否及其動態變化即能準確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗的方法主要是ELISA法測定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時血清中抗體的出現及動態變化與病人病情無線性相關關系。RT－PCR技術使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉錄為cDNA（RT）后再進行PCR擴增，這種技術稱之為逆轉錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內復制的動態狀況。RNA純化要求嚴格，是RT－PCR的技術關鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對樣本中的RNA進行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉錄酶，如AMV/MLV逆轉錄酶，高溫逆轉錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實現單管單酶單人份的擴增要求，這樣就在不降低擴增敏感性的條件下，一步完成擴增，不僅簡化操作，而且又減少污染，提高檢測的準確性。國內本公司已采用這種技術推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長期存在于血清中。在PCR檢測時，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經口－口途經傳播并定位于胃粘膜上皮細胞，早期表現為淺表性胃炎，可發展成為胃潰瘍。我國胃炎發病率之高估計比乙型肝炎更嚴重，對HP的檢測應受到廣大醫務工作者的重視。對HP的檢測可以用生化法測試尿素酶或用免疫法測試血清中對HP特異性抗體，也可對胃液、胃粘膜樣本進行細菌培養及菌種鑒定。PCR法檢測HP非常敏感且特異性高，有研究發現可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系統感染性疾病主要的有肺結核、非典型性肺炎等。結核桿菌感染曾給人類健康帶來很大威脅，一度是較嚴重的致死性疾病之一。解放以后由于對結核病的預防的重視，特別是特效抗癆藥物的出現，使結核病流行基本被控制。近來結核病有抬頭的趨勢，基原因可能有兩方面，其一是耐藥株的不斷出現，其二是對結核預防重視不足。結核菌痰涂片鏡檢陽性率太低，酶標法又因抗原交叉反應易出現假陽性，結核檢測的金標準是結核菌培養法。但培養法費時昂貴并且受到用藥的影響，在實際應用中受到限制。PCR在結核菌檢測方面有簡便、敏感、特異的優點。一般認為樣本中內要有100個左右的結核菌即可被檢出。目前用于結核菌PCR診斷的試劑，其引物主要來源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色體重復插入序列IS986、IS960、IS6110、染色體質粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色體重復插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介紹并使用了IS986基因設計的引物擴增產物為245BP，研究表明這一基因對人型結核菌有特異性。而后Thierry又介紹了插入序列IS6110基因，并認為這一基因對人型結核菌具有比IS986更高的特異性及敏感性，最適合M.TB的檢測。結核菌痰標本的PCR檢測應注意以下幾種常見的問題。其一，多條帶。即擴增產物電泳后有三條或三條以上的螢光除最前面的引物以外有兩條產物帶，這與插入序列本身各片段長度有差異、結核菌在治療過程中染色體畸變、斷裂、缺欠及不等位交換有關。這種擴增結果的判斷應特別注意，凡在陽性對照相應位置有明顯條帶的判陽性，否則應為陰性，或建議病人過一些時間后再復檢一次；其二，結核痰樣本PCR檢測時，要使樣本充分液化，否則痰液中的粘液成份將影響擴增效果，甚至會導致嚴重非特異性擴增，電泳結果呈霧狀；基三，結核痰樣本PCR檢測結果可能表現為陽性、陰性交替出現，這與結核病灶的不規律排菌有關。

循環系統以腸道小RNA病毒感染最具代表意義，如柯薩奇病毒等。這些病毒經腸道粘膜、淋巴結進入血液，最終可定位于心肌細胞中導致心肌炎。目前對這些病毒的血液樣本檢測往往比較困難。PCR用于柯薩奇病毒檢測時因其是RNA病毒所以應注意樣本的保存。外在環境中存在大量RNA酶，病毒脫殼后RNA將被迅速降解。一般用于RNA檢測的血清常溫下不應超過24小時，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR檢測在性傳播性疾病(STD)的診斷中有較廣泛的應用。經典的性傳播疾病有梅毒、淋病、腹股溝淋巴肉芽腫、軟銳濕癘、硬下疳等。而在現代STD中、解尿支原體及沙眼衣原體引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意義。梅毒是由梅毒螺旋體感染布致，首先在局部形成硬軟下疳，布后經血行播散到全身，最嚴重的是波及中樞神經系統。感染早期，梅毒螺旋體大量存在于硬下疳中，可以用生理鹽水濕棉簽擦去皮疹表面污物再用鈍刀片輕輕刮去上皮及結痂，用潔凈棉簽取滲出液樣本作PCR檢測，其敏感性及特異性極高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺體其取樣方法同埂下疳，三期梅毒皮疹中一般無螺旋體存在，因此III病人及部分無皮疹的I、II期梅毒病人可以取EDTA抗凝全血檢測。淋病是目前發病率最高的性傳播性疾病之一，由淋病雙球菌引起。淋病雙球菌一般為胞內寄生，常見的感染部位為外生殖器、尿道粘膜最常見。在尿道及外生殖器分泌物中有許多非致病的雙菌存在，對分泌物拭子進行涂片鏡檢時，常導致誤診。另外目前非淋球菌性尿道炎的發病率不斷增加，鑒別診斷特要，培養法準確但費時且費用高，受用藥的影響。PCR法簡便、快捷、準確非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隱性質粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因設計的引物特異性高但其敏感性低；隱性質粒設計的引物敏感性高但偶爾出現多條帶的擴增產物，判斷結果時應以陽性對照為標準，凡在陽性對照相應部位有明顯條帶的為陽性，其余均為陰性。以往對沙眼衣原體及解脲支原體的檢測主要靠培養法，費時且昂貴，簡便快速的PCR檢測對其有極高的使用價值。沙眼衣原體、解脲支原體樣本來源主要是尿道及宮頸分泌物拭子，由于分泌物中有許多污物含有PCR擴增的抑制劑，因此每次采樣時盡量避免采集過多膿性分泌物，如果宮頸分泌物太多可以先用濕棉簽將表面的分泌物擦去，再用潔凈的濕棉簽輕壓旋轉采集宮頸脫落細胞送檢，其準確性更高。PCR也可以用檢測單純皰疹病毒、EB病毒、乳頭瘤病毒等。引物尖銳濕疣的病毒是人類乳頭瘤（HPV）,可致生殖系統感染的乳頭瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究結果表明，在乳頭瘤病毒引起的良、惡性生殖器病變中，與血清型的關系并不密切，經常有交叉或多型民時感染。為簡化操作，對其基因對比分析尋找共同序列設計的簡并引物可以同時檢出這幾種型別的病毒既簡化操作又減少費用是一種極理想的方法。

我國惡性腫瘤為人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的發病率最高，占惡性腫瘤死亡總數的60％以上。引起腫瘤的原因非常復雜包括外界環境因素及遺傳背景。外界因此可分為三大類即化學、物理及生物因素。腫瘤與遺傳有關的證據越來越多，除已知的單基因遺傳腫瘤如視網膜細胞瘤、腎母細胞瘤等以外，還在幾乎所有的腫瘤細胞中觀察到原癌基因的重排，這些基因的變化常導致細胞增殖調控失調終形成腫瘤。癌基因是指在自然或實驗條件下具有潛在誘導細胞惡性轉化的基因，它們是在研究逆轉錄病毒時發現的。目前已知的腫瘤基因有60多種，1969年Hubner根據Rous(1911)的實驗，在小雞肉瘤濾液中發現一種能誘導宿主細胞轉化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后來又在其它哺乳動物基因中發現與病毒癌基因同源序列，這種正常的細胞基因表達產物與細胞生長、增殖、分化有關。但若被某種因素激活就會轉化為有活力的癌基因，通常稱之為原癌基因（Proto Oncogene）。為了與病毒癌基因區分，分別用V-Onc及C-Onc基因來代表。目前了解較多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常細胞中，并表達生物功能，只有在原癌基因被激活后才能誘導細胞轉化，可能的原癌基因活化機理有：①點突變，受到射線、化學因素、生物因素的誘導，這樣微小的變化，就會活化癌基因，活化的基因產物僅有極微的結構差異，但在功能在卻有很大的區別。②獲得啟動子，原癌基因從病毒基因中獲得啟動子而活化。③基因易位，內外界因素能導致染色體的某些基因易位、重排使原來無活性的原癌基因移至某些強的啟動因子或增強子附近而被活化。④原癌基因的過量擴增，原癌基因產物一般與生長因子、生長因子受體、跨膜信息蛋白有關或功能相近，過度表達時，會因調控失常而引起細胞癌變。另一類與腫瘤相關的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因較復雜，作用機理不太清楚。癌基因檢測中常用的分子生物學技術有：雜交、DNA分子克隆、PCR擴增及序列分析。PCR擴增簡便、快捷有較強的實用性，甚至可從病人體液樣本中檢測活化的癌基因而不需取活組織，對癌癥的早期診斷有極重要的意義。Ras基因是1964年首次從大鼠肉瘤的急性逆轉錄病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分離出來取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首命名。1982年首次在人膀胱細胞細胞癌中檢出有轉化能力的ras基因與Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性稱C-H-ras基因，后從肺細胞癌中發現了與Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，從神經母細胞中又發現了N-ras基因。Ras基因激活的最常見方式是點突變。人類原發腫瘤時點突變主要發生在密碼子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行滅活，根據其點突變的情況可以基因診斷、療效觀察。用PCR擴增樣本ras原癌基因，再使用雜交法、限制性內切酶消化或產物測序法檢測基因的突變情況即可用診斷。P53是抑制癌基因的代表，位于17號染色體短臂上，其產物為53KD分子量的蛋白從此而得名，可分為突變型和野生型，前者為癌基因，后者為抗癌基因。1979年Cane發現了P53蛋白Eliyahu發現了p53基因有抑癌作用。P53突變后其產物突變蛋白穩定性增加，半衰期較野生型基因產物長，在細胞內堆積，可以用免疫組化法測出。PCR-RELP、PCR-SSCP則因方法簡單、快速、特異性高，更具有實用價值。在SSCP分析中，單鏈DNA因堿基序列的變異，導致構型改變，在進行凝膠電泳時，其泳動速率發生改變，從布將變異的DNA與正常DNA區分開，統計表明100-300bp分子大小的ssDNA突變檢出率可達97％，300-450bp標出率可達69％，因此大于400bp的片段多態性應采用其它方法檢測。

遺傳病是由于遺傳基礎異常而引起的疾病，人類遺傳病約有3000多種，患者占總人口數的10％。遺傳病大概可分為單基因、多基因及染色體遺傳病。常用診斷方法有家系譜分析、染色體檢查（特別是顯帶法）、生物化分析等。隨分子生物學發展，基因診斷愈來愈表現出其優越性，PCR技術是基因診斷的主要技術之一，為快速、準確地檢測人類遺傳病開辟了一個新的途徑，預計與遺傳相關的疾病的檢測有80％將在3-5年內被PCR法所取代。PCR在遺傳病診斷應用中，可以利用引物直接擴增變化的基因產物，也可以結合應用限制內切酶，分子雜交及電泳圖譜分析進行診斷。應用較為廣泛的有PCR法檢測中海貧血、苯丙酮尿癥、血友病、脆性X綜合癥及性別鑒定等。地中海貧血（Thalassmia）是世界上最常見的單基因遺傳病，不有同類型，以a地中海貧血及在中海貧血最常見。a珠蛋白基因位于11號染色體短臂上，a珠蛋白基因突變致血紅蛋白的全成減少或缺失，表現溶血性貧血，肝脾腫大，在我國發病率為0.66％，貴州、四川等地高發可達2.2％。應用PCR技術可以直接檢測突變的基因診斷此病。苯丙酮尿癥（Phenylketouria,PKU）是一種常染色體隱性遺傳病。病人肝臟苯丙氨酸羥化酶嚴重缺乏使苯丙氨酸不能轉化為酷氨酸血癥，出現腦組織損傷，智力障礙。此病患者出生時正常，出生后一經確診立即停止母乳喂養，采用低苯丙氨酸飲食治療8-10年不致影響患者智力，但低苯丙氨酸飲食代價之昂貴是一般家庭所不能承受的，關鍵在于避免患兒出生。因此本病的早期診斷有極其重要的意義。PCR結合斑點雜交能有效診斷PKU。遺傳性疾病的基因變化很復雜，單基因固定位點變異布致病的情況很少，因此基因診斷過程中往往需要PCR技術與限制性內切酶、斑點雜交、聚丙烯酰胺膠電泳圖譜分析及擴增產物序列分析結合，作綜合判斷。

優生學包括基礎優生學、社會優生學、臨床優生學及環境優生學。孕期檢查及產前診斷是臨床優生學的最重要內容之一。孕期檢查除一般項目外還能及時了解孕婦是患有某些對胎兒發育有嚴重影響的疾病如風疹病毒感染、沙眼衣原體、解脲支原體、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、弓體感染等，及時發現及時治療并采取有效措施預防發展成為宮內感染。PCR技術對這些病原體的檢測簡便而確實，另外利用PCR技術可以對地中海貧血、血友病、苯丙酮尿癥、脆性X綜合癥等遺傳性疾病進行宮內診斷。可見PCR在優生優育方面有很高的應用價值。

PCR技術的出現對法醫學的發展也有不可低估的作用。在法醫物證如血斑、毛發、組織碎片等的確證，DAN多態性分析遠比血清學或等方法確實可靠。早期DNA多態性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個內含子中的串聯重復序列作探針，從人的基因庫中篩選出小衛量DNA，使用阿交法產生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術成功地應用于個人識別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當樣本DNA數量不足時或DAN嚴重降解則不能正常檢出。且雜交技術常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護措施。PCR技術的出現，可以對極少量物證如一根毛發、一滴血液、極小精斑都可以進行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構成的串聯重復DNA序列，具有單位點特征的稱為VNTR結構，多位點串聯成為衛星DNA。由于VNTR在等位基因中的多態性便構成了遺傳標記。使用PCR技術對其進行擴增結合對擴增產物凝膠電泳圖譜分析即可進行個人識別及親子鑒定。由2-6核苷組成的重復串聯序列稱為微衛星。在人類基因組中，微衛星更加豐富。微衛星的重復序列比VNTR短，擴增分型簡便，易于自動化，在VNTR或微衛星不僅重復片段的數量不同而且重復片段的核苷酸也具有多態性。在VNTR或微衛星多態性分析時，如再結合堿基配對分析可以藜得更大量的信息，這一種更有希望的標志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理論上其對嫌疑人的排除率為99.999％。PCR技術可以完成替代早期的Southern印跡法進行多態性分析而且操作簡便，敏感性及準確性都有大幅度的提高。當然PCR技術在法醫中的應用仍在起步階段有許多技術問題等待解決，如樣本中的抑制劑、檢村中DNA的損報告傷、PCR擴增污染等。想念隨著PCR技術的不斷完善它將在法醫學領域中有更加廣泛的應用。