第一篇：臨床檢驗中PCR技術(shù)的應(yīng)用

臨床檢驗中PCR技術(shù)的應(yīng)用

青海紅十字醫(yī)院檢驗科 楊軍 檢驗士 關(guān)鍵詞：pcr ：pcr的應(yīng)用

醫(yī)學(xué)檢驗大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類，其分別代表幾代實驗診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強度而且也減少了污染的機會，具有極高的使用價值。

PCR檢測的臨床應(yīng)用范圍：用于疾病的早期診斷，疾病的鑒別診斷，疾病的病因確定，藥物療效的評價，治療效果的評價，治愈標準的確定

通常用PCR法檢測血清中的乙肝病毒。PCR法檢測乙肝的優(yōu)勢表現(xiàn)在：

① 早期診斷，因為PCR擴增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。

② 對低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。③ 療效跟蹤及病程判斷，因為PCR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標。在治療過程中通過監(jiān)測血清或白細胞中病毒基因存在與否及其動態(tài)變化即能準確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗的方法主要是ELISA法測定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時血清中抗體的出現(xiàn)及動態(tài)變化與病人病情無線性相關(guān)關(guān)系。RT-PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(RT)后再進行PCR擴增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)。

PCR檢測在性傳播性疾病(STD)的診斷中有較廣泛的應(yīng)用。經(jīng)典的性傳播疾病有梅毒、淋病、腹股溝淋巴肉芽腫、軟銳濕癘、硬下疳等。而在現(xiàn)代STD中、解尿支原體及沙眼衣原體引起的非淋菌性尿道炎(NGU)可能更具有代表性意義。檢測標本無特殊限制：

痰、尿、腹水、胸水、關(guān)節(jié)液、血、肺泡灌洗液、腦脊液、分泌物等均可送檢PCR檢測淋球菌。淋病的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，其確診主要是進行實驗室檢查。傳統(tǒng)的方法有涂片染色法，分離培養(yǎng)法和用來檢測淋球菌抗原的EIA-Gonozyme系統(tǒng)法。近年來，熒光定量PCR診斷技術(shù)的應(yīng)用，使淋病的快速診斷有重大突破。

循環(huán)系統(tǒng)以腸道小RNA病毒感染最具代表意義，如柯薩奇病毒等。這些病毒經(jīng)腸道粘膜、淋巴結(jié)進入血液，最終可定位于心肌細胞中導(dǎo)致心肌炎。目前對這些病毒的血液樣本檢測往往比較困難。PCR用于柯薩奇病毒檢測時因其是RNA病毒所以應(yīng)注意樣本的保存。外在環(huán)境中存在大量RNA酶，病毒脫殼后RNA將被迅速降解。一般用于RNA檢測的血清常溫下不應(yīng)超過24小時，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下

PCR敏感性高可以檢測出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動態(tài)狀況

（1）參考文獻：《中國醫(yī)學(xué)檢驗雜志》2001.11:13-14

(2)

姜懷春pcr技術(shù)研究新進展。重慶工商大學(xué)報，2005.22（4）：232-235

第二篇：PCR技術(shù)在臨床檢驗中的應(yīng)用

PCR技術(shù)在臨床檢驗中的應(yīng)用

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醫(yī)學(xué)檢驗大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類，其分別代表幾代實驗診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強度而且也減少了污染的機會，具有極高的使用價值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創(chuàng)性意義。這些改進都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學(xué)等廣泛領(lǐng)域中有相當(dāng)高的實際應(yīng)用價值。

常見的傳染性疾病有細菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應(yīng)的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細胞中增殖，也可以長期存留在骨髓細胞或外周血白細胞中。通常用PCR法檢測血清中的乙肝病毒。有報道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能。PCR法檢測乙肝的優(yōu)勢表現(xiàn)在：①早期診斷，因為PCR擴增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。②對低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。③療效跟蹤及病程判斷，因為PCR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標。在治療過程中通過監(jiān)測血清或白細胞中病毒基因存在與否及其動態(tài)變化即能準確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗的方法主要是ELISA法測定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時血清中抗體的出現(xiàn)及動態(tài)變化與病人病情無線性相關(guān)關(guān)系。RT－PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進行PCR擴增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動態(tài)狀況。RNA純化要求嚴格，是RT－PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對樣本中的RNA進行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉(zhuǎn)錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV/MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實現(xiàn)單管單酶單人份的擴增要求，這樣就在不降低擴增敏感性的條件下，一步完成擴增，不僅簡化操作，而且又減少污染，提高檢測的準確性。國內(nèi)本公司已采用這種技術(shù)推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長期存在于血清中。在PCR檢測時，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國胃炎發(fā)病率之高估計比乙型肝炎更嚴重，對HP的檢測應(yīng)受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的重視。對HP的檢測可以用生化法測試尿素酶或用免疫法測試血清中對HP特異性抗體，也可對胃液、胃粘膜樣本進行細菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系統(tǒng)感染性疾病主要的有肺結(jié)核、非典型性肺炎等。結(jié)核桿菌感染曾給人類健康帶來很大威脅，一度是較嚴重的致死性疾病之一。解放以后由于對結(jié)核病的預(yù)防的重視，特別是特效抗癆藥物的出現(xiàn)，使結(jié)核病流行基本被控制。近來結(jié)核病有抬頭的趨勢，基原因可能有兩方面，其一是耐藥株的不斷出現(xiàn)，其二是對結(jié)核預(yù)防重視不足。結(jié)核菌痰涂片鏡檢陽性率太低，酶標法又因抗原交叉反應(yīng)易出現(xiàn)假陽性，結(jié)核檢測的金標準是結(jié)核菌培養(yǎng)法。但培養(yǎng)法費時昂貴并且受到用藥的影響，在實際應(yīng)用中受到限制。PCR在結(jié)核菌檢測方面有簡便、敏感、特異的優(yōu)點。一般認為樣本中內(nèi)要有100個左右的結(jié)核菌即可被檢出。目前用于結(jié)核菌PCR診斷的試劑，其引物主要來源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色體重復(fù)插入序列IS986、IS960、IS6110、染色體質(zhì)粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色體重復(fù)插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介紹并使用了IS986基因設(shè)計的引物擴增產(chǎn)物為245BP，研究表明這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌有特異性。而后Thierry又介紹了插入序列IS6110基因，并認為這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌具有比IS986更高的特異性及敏感性，最適合M.TB的檢測。結(jié)核菌痰標本的PCR檢測應(yīng)注意以下幾種常見的問題。其一，多條帶。即擴增產(chǎn)物電泳后有三條或三條以上的螢光除最前面的引物以外有兩條產(chǎn)物帶，這與插入序列本身各片段長度有差異、結(jié)核菌在治療過程中染色體畸變、斷裂、缺欠及不等位交換有關(guān)。這種擴增結(jié)果的判斷應(yīng)特別注意，凡在陽性對照相應(yīng)位置有明顯條帶的判陽性，否則應(yīng)為陰性，或建議病人過一些時間后再復(fù)檢一次；其二，結(jié)核痰樣本PCR檢測時，要使樣本充分液化，否則痰液中的粘液成份將影響擴增效果，甚至?xí)?dǎo)致嚴重非特異性擴增，電泳結(jié)果呈霧狀；基三，結(jié)核痰樣本PCR檢測結(jié)果可能表現(xiàn)為陽性、陰性交替出現(xiàn)，這與結(jié)核病灶的不規(guī)律排菌有關(guān)。

循環(huán)系統(tǒng)以腸道小RNA病毒感染最具代表意義，如柯薩奇病毒等。這些病毒經(jīng)腸道粘膜、淋巴結(jié)進入血液，最終可定位于心肌細胞中導(dǎo)致心肌炎。目前對這些病毒的血液樣本檢測往往比較困難。PCR用于柯薩奇病毒檢測時因其是RNA病毒所以應(yīng)注意樣本的保存。外在環(huán)境中存在大量RNA酶，病毒脫殼后RNA將被迅速降解。一般用于RNA檢測的血清常溫下不應(yīng)超過24小時，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR檢測在性傳播性疾病(STD)的診斷中有較廣泛的應(yīng)用。經(jīng)典的性傳播疾病有梅毒、淋病、腹股溝淋巴肉芽腫、軟銳濕癘、硬下疳等。而在現(xiàn)代STD中、解尿支原體及沙眼衣原體引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意義。梅毒是由梅毒螺旋體感染布致，首先在局部形成硬軟下疳，布后經(jīng)血行播散到全身，最嚴重的是波及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。感染早期，梅毒螺旋體大量存在于硬下疳中，可以用生理鹽水濕棉簽擦去皮疹表面污物再用鈍刀片輕輕刮去上皮及結(jié)痂，用潔凈棉簽取滲出液樣本作PCR檢測，其敏感性及特異性極高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺體其取樣方法同埂下疳，三期梅毒皮疹中一般無螺旋體存在，因此III病人及部分無皮疹的I、II期梅毒病人可以取EDTA抗凝全血檢測。淋病是目前發(fā)病率最高的性傳播性疾病之一，由淋病雙球菌引起。淋病雙球菌一般為胞內(nèi)寄生，常見的感染部位為外生殖器、尿道粘膜最常見。在尿道及外生殖器分泌物中有許多非致病的雙菌存在，對分泌物拭子進行涂片鏡檢時，常導(dǎo)致誤診。另外目前非淋球菌性尿道炎的發(fā)病率不斷增加，鑒別診斷特要，培養(yǎng)法準確但費時且費用高，受用藥的影響。PCR法簡便、快捷、準確非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隱性質(zhì)粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因設(shè)計的引物特異性高但其敏感性低；隱性質(zhì)粒設(shè)計的引物敏感性高但偶爾出現(xiàn)多條帶的擴增產(chǎn)物，判斷結(jié)果時應(yīng)以陽性對照為標準，凡在陽性對照相應(yīng)部位有明顯條帶的為陽性，其余均為陰性。以往對沙眼衣原體及解脲支原體的檢測主要靠培養(yǎng)法，費時且昂貴，簡便快速的PCR檢測對其有極高的使用價值。沙眼衣原體、解脲支原體樣本來源主要是尿道及宮頸分泌物拭子，由于分泌物中有許多污物含有PCR擴增的抑制劑，因此每次采樣時盡量避免采集過多膿性分泌物，如果宮頸分泌物太多可以先用濕棉簽將表面的分泌物擦去，再用潔凈的濕棉簽輕壓旋轉(zhuǎn)采集宮頸脫落細胞送檢，其準確性更高。PCR也可以用檢測單純皰疹病毒、EB病毒、乳頭瘤病毒等。引物尖銳濕疣的病毒是人類乳頭瘤（HPV）,可致生殖系統(tǒng)感染的乳頭瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究結(jié)果表明，在乳頭瘤病毒引起的良、惡性生殖器病變中，與血清型的關(guān)系并不密切，經(jīng)常有交叉或多型民時感染。為簡化操作，對其基因?qū)Ρ确治鰧ふ夜餐蛄性O(shè)計的簡并引物可以同時檢出這幾種型別的病毒既簡化操作又減少費用是一種極理想的方法。

我國惡性腫瘤為人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的發(fā)病率最高，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的60％以上。引起腫瘤的原因非常復(fù)雜包括外界環(huán)境因素及遺傳背景。外界因此可分為三大類即化學(xué)、物理及生物因素。腫瘤與遺傳有關(guān)的證據(jù)越來越多，除已知的單基因遺傳腫瘤如視網(wǎng)膜細胞瘤、腎母細胞瘤等以外，還在幾乎所有的腫瘤細胞中觀察到原癌基因的重排，這些基因的變化常導(dǎo)致細胞增殖調(diào)控失調(diào)終形成腫瘤。癌基因是指在自然或?qū)嶒灄l件下具有潛在誘導(dǎo)細胞惡性轉(zhuǎn)化的基因，它們是在研究逆轉(zhuǎn)錄病毒時發(fā)現(xiàn)的。目前已知的腫瘤基因有60多種，1969年Hubner根據(jù)Rous(1911)的實驗，在小雞肉瘤濾液中發(fā)現(xiàn)一種能誘導(dǎo)宿主細胞轉(zhuǎn)化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后來又在其它哺乳動物基因中發(fā)現(xiàn)與病毒癌基因同源序列，這種正常的細胞基因表達產(chǎn)物與細胞生長、增殖、分化有關(guān)。但若被某種因素激活就會轉(zhuǎn)化為有活力的癌基因，通常稱之為原癌基因（Proto Oncogene）。為了與病毒癌基因區(qū)分，分別用V-Onc及C-Onc基因來代表。目前了解較多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常細胞中，并表達生物功能，只有在原癌基因被激活后才能誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化，可能的原癌基因活化機理有：①點突變，受到射線、化學(xué)因素、生物因素的誘導(dǎo)，這樣微小的變化，就會活化癌基因，活化的基因產(chǎn)物僅有極微的結(jié)構(gòu)差異，但在功能在卻有很大的區(qū)別。②獲得啟動子，原癌基因從病毒基因中獲得啟動子而活化。③基因易位，內(nèi)外界因素能導(dǎo)致染色體的某些基因易位、重排使原來無活性的原癌基因移至某些強的啟動因子或增強子附近而被活化。④原癌基因的過量擴增，原癌基因產(chǎn)物一般與生長因子、生長因子受體、跨膜信息蛋白有關(guān)或功能相近，過度表達時，會因調(diào)控失常而引起細胞癌變。另一類與腫瘤相關(guān)的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因較復(fù)雜，作用機理不太清楚。癌基因檢測中常用的分子生物學(xué)技術(shù)有：雜交、DNA分子克隆、PCR擴增及序列分析。PCR擴增簡便、快捷有較強的實用性，甚至可從病人體液樣本中檢測活化的癌基因而不需取活組織，對癌癥的早期診斷有極重要的意義。Ras基因是1964年首次從大鼠肉瘤的急性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分離出來取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首命名。1982年首次在人膀胱細胞細胞癌中檢出有轉(zhuǎn)化能力的ras基因與Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性稱C-H-ras基因，后從肺細胞癌中發(fā)現(xiàn)了與Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，從神經(jīng)母細胞中又發(fā)現(xiàn)了N-ras基因。Ras基因激活的最常見方式是點突變。人類原發(fā)腫瘤時點突變主要發(fā)生在密碼子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行滅活，根據(jù)其點突變的情況可以基因診斷、療效觀察。用PCR擴增樣本ras原癌基因，再使用雜交法、限制性內(nèi)切酶消化或產(chǎn)物測序法檢測基因的突變情況即可用診斷。P53是抑制癌基因的代表，位于17號染色體短臂上，其產(chǎn)物為53KD分子量的蛋白從此而得名，可分為突變型和野生型，前者為癌基因，后者為抗癌基因。1979年Cane發(fā)現(xiàn)了P53蛋白Eliyahu發(fā)現(xiàn)了p53基因有抑癌作用。P53突變后其產(chǎn)物突變蛋白穩(wěn)定性增加，半衰期較野生型基因產(chǎn)物長，在細胞內(nèi)堆積，可以用免疫組化法測出。PCR-RELP、PCR-SSCP則因方法簡單、快速、特異性高，更具有實用價值。在SSCP分析中，單鏈DNA因堿基序列的變異，導(dǎo)致構(gòu)型改變，在進行凝膠電泳時，其泳動速率發(fā)生改變，從布將變異的DNA與正常DNA區(qū)分開，統(tǒng)計表明100-300bp分子大小的ssDNA突變檢出率可達97％，300-450bp標出率可達69％，因此大于400bp的片段多態(tài)性應(yīng)采用其它方法檢測。

遺傳病是由于遺傳基礎(chǔ)異常而引起的疾病，人類遺傳病約有3000多種，患者占總?cè)丝跀?shù)的10％。遺傳病大概可分為單基因、多基因及染色體遺傳病。常用診斷方法有家系譜分析、染色體檢查（特別是顯帶法）、生物化分析等。隨分子生物學(xué)發(fā)展，基因診斷愈來愈表現(xiàn)出其優(yōu)越性，PCR技術(shù)是基因診斷的主要技術(shù)之一，為快速、準確地檢測人類遺傳病開辟了一個新的途徑，預(yù)計與遺傳相關(guān)的疾病的檢測有80％將在3-5年內(nèi)被PCR法所取代。PCR在遺傳病診斷應(yīng)用中，可以利用引物直接擴增變化的基因產(chǎn)物，也可以結(jié)合應(yīng)用限制內(nèi)切酶，分子雜交及電泳圖譜分析進行診斷。應(yīng)用較為廣泛的有PCR法檢測中海貧血、苯丙酮尿癥、血友病、脆性X綜合癥及性別鑒定等。地中海貧血（Thalassmia）是世界上最常見的單基因遺傳病，不有同類型，以a地中海貧血及在中海貧血最常見。a珠蛋白基因位于11號染色體短臂上，a珠蛋白基因突變致血紅蛋白的全成減少或缺失，表現(xiàn)溶血性貧血，肝脾腫大，在我國發(fā)病率為0.66％，貴州、四川等地高發(fā)可達2.2％。應(yīng)用PCR技術(shù)可以直接檢測突變的基因診斷此病。苯丙酮尿癥（Phenylketouria,PKU）是一種常染色體隱性遺傳病。病人肝臟苯丙氨酸羥化酶嚴重缺乏使苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化為酷氨酸血癥，出現(xiàn)腦組織損傷，智力障礙。此病患者出生時正常，出生后一經(jīng)確診立即停止母乳喂養(yǎng)，采用低苯丙氨酸飲食治療8-10年不致影響患者智力，但低苯丙氨酸飲食代價之昂貴是一般家庭所不能承受的，關(guān)鍵在于避免患兒出生。因此本病的早期診斷有極其重要的意義。PCR結(jié)合斑點雜交能有效診斷PKU。遺傳性疾病的基因變化很復(fù)雜，單基因固定位點變異布致病的情況很少，因此基因診斷過程中往往需要PCR技術(shù)與限制性內(nèi)切酶、斑點雜交、聚丙烯酰胺膠電泳圖譜分析及擴增產(chǎn)物序列分析結(jié)合，作綜合判斷。

優(yōu)生學(xué)包括基礎(chǔ)優(yōu)生學(xué)、社會優(yōu)生學(xué)、臨床優(yōu)生學(xué)及環(huán)境優(yōu)生學(xué)。孕期檢查及產(chǎn)前診斷是臨床優(yōu)生學(xué)的最重要內(nèi)容之一。孕期檢查除一般項目外還能及時了解孕婦是患有某些對胎兒發(fā)育有嚴重影響的疾病如風(fēng)疹病毒感染、沙眼衣原體、解脲支原體、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、弓體感染等，及時發(fā)現(xiàn)及時治療并采取有效措施預(yù)防發(fā)展成為宮內(nèi)感染。PCR技術(shù)對這些病原體的檢測簡便而確實，另外利用PCR技術(shù)可以對地中海貧血、血友病、苯丙酮尿癥、脆性X綜合癥等遺傳性疾病進行宮內(nèi)診斷。可見PCR在優(yōu)生優(yōu)育方面有很高的應(yīng)用價值。

PCR技術(shù)的出現(xiàn)對法醫(yī)學(xué)的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠比血清學(xué)或等方法確實可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列作探針，從人的基因庫中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術(shù)成功地應(yīng)用于個人識別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當(dāng)樣本DNA數(shù)量不足時或DAN嚴重降解則不能正常檢出。且雜交技術(shù)常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護措施。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，具有單位點特征的稱為VNTR結(jié)構(gòu)，多位點串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。由于VNTR在等位基因中的多態(tài)性便構(gòu)成了遺傳標記。使用PCR技術(shù)對其進行擴增結(jié)合對擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜分析即可進行個人識別及親子鑒定。由2-6核苷組成的重復(fù)串聯(lián)序列稱為微衛(wèi)星。在人類基因組中，微衛(wèi)星更加豐富。微衛(wèi)星的重復(fù)序列比VNTR短，擴增分型簡便，易于自動化，在VNTR或微衛(wèi)星不僅重復(fù)片段的數(shù)量不同而且重復(fù)片段的核苷酸也具有多態(tài)性。在VNTR或微衛(wèi)星多態(tài)性分析時，如再結(jié)合堿基配對分析可以藜得更大量的信息，這一種更有希望的標志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理論上其對嫌疑人的排除率為99.999％。PCR技術(shù)可以完成替代早期的Southern印跡法進行多態(tài)性分析而且操作簡便，敏感性及準確性都有大幅度的提高。當(dāng)然PCR技術(shù)在法醫(yī)中的應(yīng)用仍在起步階段有許多技術(shù)問題等待解決，如樣本中的抑制劑、檢村中DNA的損報告?zhèn)CR擴增污染等。想念隨著PCR技術(shù)的不斷完善它將在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有更加廣泛的應(yīng)用。

第三篇：PCR在臨床檢驗中的應(yīng)用

PCR在臨床檢驗中的應(yīng)用

醫(yī)學(xué)檢驗大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類，其分別代表幾代實驗診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強度而且也減少了污染的機會，具有極高的使用價值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創(chuàng)性意義。這些改進都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學(xué)等廣泛領(lǐng)域中有相當(dāng)高的實際應(yīng)用價值。

常見的傳染性疾病有細菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應(yīng)的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細胞中增殖，也可以長期存留在骨髓細胞或外周血白細胞中。通常用PCR法檢測血清中的乙肝病毒。有報道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能。PCR法檢測乙肝的優(yōu)勢表現(xiàn)在： ① 早期診斷，因為PCR擴增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。② 對低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。③ 療效跟蹤及病程判斷，因為PCR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標。在治療過程中通過監(jiān)測血清或白細胞中病毒基因存在與否及其動態(tài)變化即能準確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗的方法主要是ELISA法測定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時血清中抗體的出現(xiàn)及動態(tài)變化與病人病情無線性相關(guān)關(guān)系。RT－PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進行PCR擴增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動態(tài)狀況。RNA純化要求嚴格，是RT－PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對樣本中的RNA進行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉(zhuǎn)錄的酶大致可以分為二大類，即低逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV/MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，高逆轉(zhuǎn)錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實現(xiàn)單管單酶單人份的擴增要求，這樣就在不降低擴增敏感性的條件下，一步完成擴增，不僅簡化操作，而且又減少污染，提高檢測的準確性。國內(nèi)本公司已采用這種技術(shù)推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長期存在于血清中。在PCR檢測時，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國胃炎發(fā)病率之高估計比乙型肝炎更嚴重，對HP的檢測應(yīng)受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的重視。對HP的檢測可以用生化法測試尿素酶或用免疫法測試血清中對HP特異性抗體，也可對胃液、胃粘膜樣本進行細菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系統(tǒng)感染性疾病主要的有肺結(jié)核、非典型性肺炎等。結(jié)核桿菌感染曾給人類健康帶來很大威脅，一度是較嚴重的致死性疾病之一。解放以后由于對結(jié)核病的預(yù)防的重視，特別是特效抗癆藥物的出現(xiàn)，使結(jié)核病流行基本被控制。近來結(jié)核病有抬頭的趨勢，基原因可能有兩方面，其一是耐藥株的不斷出現(xiàn)，其二是對結(jié)核預(yù)防重視不足。結(jié)核菌痰涂片鏡檢陽性率太低，酶標法又因抗原交叉反應(yīng)易出現(xiàn)假陽性，結(jié)核檢測的金標準是結(jié)核菌培養(yǎng)法。但培養(yǎng)法費時昂貴并且受到用藥的影響，在實際應(yīng)用中受到限制。PCR在結(jié)核菌檢測方面有簡便、敏感、特異的優(yōu)點。一般認為樣本中內(nèi)要有100個左右的結(jié)核菌即可被檢出。目前用于結(jié)核菌PCR診斷的試劑，其引物主要來源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色體重復(fù)插入序列IS986、IS960、IS6110、染色體質(zhì)粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色體重復(fù)插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介紹并使用了IS986基因設(shè)計的引物擴增產(chǎn)物為245BP，研究表明這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌有特異性。而后Thierry又介紹了插入序列IS6110基因，并認為這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌具有比IS986更高的特異性及敏感性，最適合M.TB的檢測。結(jié)核菌痰標本的PCR檢測應(yīng)注意以下幾種常見的問題。其一，多條帶。即擴增產(chǎn)物電泳后有三條或三條以上的螢光除最前面的引物以外有兩條產(chǎn)物帶，這與插入序列本身各片段長度有差異、結(jié)核菌在治療過程中染色體畸變、斷裂、缺欠及不等位交換有關(guān)。這種擴增結(jié)果的判斷應(yīng)特別注意，凡在陽性對照相應(yīng)位置有明顯條帶的判陽性，否則應(yīng)為陰性，或建議病人過一些時間后再復(fù)檢一次；其二，結(jié)核痰樣本PCR檢測時，要使樣本充分液化，否則痰液中的粘液成份將影響擴增效果，甚至?xí)?dǎo)致嚴重非特異性擴增，電泳結(jié)果呈霧狀；基三，結(jié)核痰樣本PCR檢測結(jié)果可能表現(xiàn)為陽性、陰性交替出現(xiàn)，這與結(jié)核病灶的不規(guī)律排菌有關(guān)。

循環(huán)系統(tǒng)以腸道小RNA病毒感染最具代表意義，如柯薩奇病毒等。這些病毒經(jīng)腸道粘膜、淋巴結(jié)進入血液，最終可定位于心肌細胞中導(dǎo)致心肌炎。目前對這些病毒的血液樣本檢測往往比較困難。PCR用于柯薩奇病毒檢測時因其是RNA病毒所以應(yīng)注意樣本的保存。外在環(huán)境中存在大量RNA酶，病毒脫殼后RNA將被迅速降解。一般用于RNA檢測的血清常下不應(yīng)超過24小時，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR檢測在性傳播性疾病（STD）的診斷中有較廣泛的應(yīng)用。經(jīng)典的性傳播疾病有、淋病、腹股溝淋巴肉芽腫、軟銳濕癘、硬下疳等。而在現(xiàn)代STD中、解尿支原體及沙眼衣原體引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意義。是由螺旋體感染布致，首先在局部形成硬軟下疳，布后經(jīng)血行播散到全身，最嚴重的是波及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。感染早期，螺旋體大量存在于硬下疳中，可以用生理鹽水濕棉簽擦去皮疹表面污物再用鈍刀片輕輕刮去上皮及結(jié)痂，用潔凈棉簽取滲出液樣本作PCR檢測，其敏感性及特異性極高。二期皮疹中也存在螺體其取樣方法同埂下疳，三期皮疹中一般無螺旋體存在，因此III病人及部分無皮疹的I、II期病人可以取EDTA抗凝全血檢測。淋病是目前發(fā)病率最高的性傳播性疾病之一，由淋病雙球菌引起。淋病雙球菌一般為胞內(nèi)寄生，常見的感染部位為外生殖器、尿道粘膜最常見。在尿道及外生殖器分泌物中有許多非致病的雙菌存在，對分泌物拭子進行涂片鏡檢時，常導(dǎo)致誤診。另外目前非淋球菌性尿道炎的發(fā)病率不斷增加，鑒別診斷特要，培養(yǎng)法準確但費時且費用高，受用藥的影響。PCR法簡便、快捷、準確非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隱性質(zhì)粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因設(shè)計的引物特異性高但其敏感性低；隱性質(zhì)粒設(shè)計的引物敏感性高但偶爾出現(xiàn)多條帶的擴增產(chǎn)物，判斷結(jié)果時應(yīng)以陽性對照為標準，凡在陽性對照相應(yīng)部位有明顯條帶的為陽性，其余均為陰性。以往對沙眼衣原體及解脲支原體的檢測主要靠培養(yǎng)法，費時且昂貴，簡便快速的PCR檢測對其有極高的使用價值。沙眼衣原體、解脲支原體樣本來源主要是尿道及宮頸分泌物拭子，由于分泌物中有許多污物含有PCR擴增的抑制劑，因此每次采樣時盡量避免采集過多膿性分泌物，如果宮頸分泌物太多可以先用濕棉簽將表面的分泌物擦去，再用潔凈的濕棉簽輕壓旋轉(zhuǎn)采集宮頸脫落細胞送檢，其準確性更高。PCR也可以用檢測單純皰疹病毒、EB病毒、乳頭瘤病毒等。引物尖銳濕疣的病毒是人類乳頭瘤（HPV）,可致生殖系統(tǒng)感染的乳頭瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究結(jié)果表明，在乳頭瘤病毒引起的良、惡性生殖器病變中，與血清型的關(guān)系并不密切，經(jīng)常有交叉或多型時感染。為簡化操作，對其基因?qū)Ρ确治鰧ふ彝蛄性O(shè)計的簡并引物可以同時檢出這幾種型別的病毒既簡化操作又減少費用是一種極理想的方法。

我國惡性腫瘤為人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的發(fā)病率最高，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的60％以上。引起腫瘤的原因非常復(fù)雜包括外界環(huán)境因素及遺傳背景。外界因此可分為三大類即化學(xué)、物理及生物因素。腫瘤與遺傳有關(guān)的證據(jù)越來越多，除已知的單基因遺傳腫瘤如視網(wǎng)膜細胞瘤、腎母細胞瘤等以外，還在幾乎所有的腫瘤細胞中觀察到原癌基因的重排，這些基因的變化常導(dǎo)致細胞增殖調(diào)控失調(diào)終形成腫瘤。癌基因是指在自然或?qū)嶒灄l件下具有潛在誘導(dǎo)細胞惡性轉(zhuǎn)化的基因，它們是在研究逆轉(zhuǎn)錄病毒時發(fā)現(xiàn)的。目前已知的腫瘤基因有60多種，1969年Hubner根據(jù)Rous（1911）的實驗，在小雞肉瘤濾液中發(fā)現(xiàn)一種能誘導(dǎo)宿主細胞轉(zhuǎn)化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后來又在其它哺乳動物基因中發(fā)現(xiàn)與病毒癌基因同源序列，這種正常的細胞基因表達產(chǎn)物與細胞生長、增殖、分化有關(guān)。但若被某種因素激活就會轉(zhuǎn)化為有活力的癌基因，通常稱之為原癌基因（Proto Oncogene）。為了與病毒癌基因區(qū)分，分別用V-Onc及C-Onc基因來代表。目前了解較多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常細胞中，并表達生物功能，只有在原癌基因被激活后才能誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化，可能的原癌基因活化機理有：①點突變，受到射線、化學(xué)因素、生物因素的誘導(dǎo)，這樣微小的變化，就會活化癌基因，活化的基因產(chǎn)物僅有極微的結(jié)構(gòu)差異，但在功能在卻有很大的區(qū)別。②獲得啟動子，原癌基因從病毒基因中獲得啟動子而活化。③基因易位，內(nèi)外界因素能導(dǎo)致染色體的某些基因易位、重排使原來無活性的原癌基因移至某些強的啟動因子或增強子附近而被活化。④原癌基因的過量擴增，原癌基因產(chǎn)物一般與生長因子、生長因子受體、跨膜信息蛋白有關(guān)或功能相近，過度表達時，會因調(diào)控失常而引起細胞癌變。另一類與腫瘤相關(guān)的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因較復(fù)雜，作用機理不太清楚。癌基因檢測中常用的分子生物學(xué)技術(shù)有：雜交、DNA分子克隆、PCR擴增及序列分析。PCR擴增簡便、快捷有較強的實用性，甚至可從病人體液樣本中檢測活化的癌基因而不需取活組織，對癌癥的早期診斷有極重要的意義。Ras基因是1964年首次從大鼠肉瘤的急性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分離出來取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首名。1982年首次在人膀胱細胞細胞癌中檢出有轉(zhuǎn)化能力的ras基因與Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性稱C-H-ras基因，后從肺細胞癌中發(fā)現(xiàn)了與Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，從神經(jīng)母細胞中又發(fā)現(xiàn)了N-ras基因。Ras基因激活的最常見方式是點突變。人類原發(fā)腫瘤時點突變主要發(fā)生在密碼子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行滅活，根據(jù)其點突變的情況可以基因診斷、療效觀察。用PCR擴增樣本ras原癌基因，再使用雜交法、限制性內(nèi)切酶消化或產(chǎn)物測序法檢測基因的突變情況即可用診斷。P53是抑制癌基因的代表，位于17號染色體短臂上，其產(chǎn)物為53KD分子量的蛋白從此而得名，可分為突變型和野生型，前者為癌基因，后者為抗癌基因。1979年Cane發(fā)現(xiàn)了P53蛋白Eliyahu發(fā)現(xiàn)了p53基因有抑癌作用。P53突變后其產(chǎn)物突變蛋白穩(wěn)定性增加，半衰期較野生型基因產(chǎn)物長，在細胞內(nèi)堆積，可以用免疫組化法測出。PCR-RELP、PCR-SSCP則因方法簡單、快速、特異性高，更具有實用價值。在SSCP分析中，單鏈DNA因堿基序列的變異，導(dǎo)致構(gòu)型改變，在進行凝膠電泳時，其泳動速率發(fā)生改變，從布將變異的DNA與正常DNA區(qū)分開，統(tǒng)計表明100-300bp分子大小的ssDNA突變檢出率可達97％，300-450bp標出率可達69％，因此大于400bp的片段多態(tài)性應(yīng)采用其它方法檢測。

遺傳病是由于遺傳基礎(chǔ)異常而引起的疾病，人類遺傳病約有3000多種，患者占總?cè)丝跀?shù)的10％。遺傳病大概可分為單基因、多基因及染色體遺傳病。常用診斷方法有家系譜分析、染色體檢查（特別是顯帶法）、生物化分析等。隨分子生物學(xué)發(fā)展，基因診斷愈來愈表現(xiàn)出其優(yōu)越性，PCR技術(shù)是基因診斷的主要技術(shù)之一，為快速、準確地檢測人類遺傳病開辟了一個新的途徑，預(yù)計與遺傳相關(guān)的疾病的檢測有80％將在3-5年內(nèi)被PCR法所取代。PCR在遺傳病診斷應(yīng)用中，可以利用引物直接擴增變化的基因產(chǎn)物，也可以結(jié)合應(yīng)用限制內(nèi)切酶，分子雜交及電泳圖譜分析進行診斷。應(yīng)用較為廣泛的有PCR法檢測中海貧血、苯丙酮尿癥、血友病、脆性X綜合癥及性別鑒定等。地中海貧血（Thalassmia）是世界上最常見的單基因遺傳病，不有同類型，以a地中海貧血及在中海貧血最常見。a珠蛋白基因位于11號染色體短臂上，a珠蛋白基因突變致血紅蛋白的全成減少或缺失，表現(xiàn)溶血性貧血，肝脾腫大，在我國發(fā)病率為0.66％，貴州、四川等地高發(fā)可達2.2％。應(yīng)用PCR技術(shù)可以直接檢測突變的基因診斷此病。苯丙酮尿癥（Phenylketouria,PKU）是一種常染色體隱性遺傳病。病人肝臟苯丙氨酸羥化酶嚴重缺乏使苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化為酷氨酸血癥，出現(xiàn)腦組織損傷，智力障礙。此病患者出生時正常，出生后一經(jīng)確診立即停止母乳喂養(yǎng)，采用低苯丙氨酸飲食治療8-10年不致影響患者智力，但低苯丙氨酸飲食代價之昂貴是一般家庭所不能承受的，關(guān)鍵在于避免患兒出生。因此本病的早期診斷有極其重要的意義。PCR結(jié)合斑點雜交能有效診斷PKU。遺傳性疾病的基因變化很復(fù)雜，單基因固定位點變異布致病的情況很少，因此基因診斷過程中往往需要PCR技術(shù)與限制性內(nèi)切酶、斑點雜交、聚丙烯酰胺膠電泳圖譜分析及擴增產(chǎn)物序列分析結(jié)合，作綜合判斷。

優(yōu)生學(xué)包括基礎(chǔ)優(yōu)生學(xué)、會優(yōu)生學(xué)、臨床優(yōu)生學(xué)及環(huán)境優(yōu)生學(xué)。孕期檢查及產(chǎn)前診斷是臨床優(yōu)生學(xué)的最重要內(nèi)容之一。孕期檢查除一般項目外還能及時了解孕婦是患有某些對胎兒發(fā)育有嚴重影響的疾病如風(fēng)疹病毒感染、沙眼衣原體、解脲支原體、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、弓體感染等，及時發(fā)現(xiàn)及時治療并采取有效措施預(yù)防發(fā)展成為宮內(nèi)感染。PCR技術(shù)對這些病原體的檢測簡便而確實，另外利用PCR技術(shù)可以對地中海貧血、血友病、苯丙酮尿癥、脆性X綜合癥等遺傳性疾病進行宮內(nèi)診斷。可見PCR在優(yōu)生優(yōu)育方面有很高的應(yīng)用價值。

PCR技術(shù)的出現(xiàn)對法醫(yī)學(xué)的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠比血清學(xué)或等方法確實可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列作探針，從人的基因庫中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術(shù)成功地應(yīng)用于個人識別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當(dāng)樣本DNA數(shù)量不足時或DAN嚴重降解則不能正常檢出。且雜交技術(shù)常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護措施。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，具有單位點特征的稱為VNTR結(jié)構(gòu)，多位點串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。由于VNTR在等位基因中的多態(tài)性便構(gòu)成了遺傳標記。使用PCR技術(shù)對其進行擴增結(jié)合對擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜分析即可進行個人識別及親子鑒定。由2-6核苷組成的重復(fù)串聯(lián)序列稱為微衛(wèi)星。在人類基因組中，微衛(wèi)星更加豐富。微衛(wèi)星的重復(fù)序列比VNTR短，擴增分型簡便，易于自動化，在VNTR或微衛(wèi)星不僅重復(fù)片段的數(shù)量不同而且重復(fù)片段的核苷酸也具有多態(tài)性。在VNTR或微衛(wèi)星多態(tài)性分析時，如再結(jié)合堿基配對分析可以藜得更大量的信息，這一種更有希望的標志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理論上其對嫌疑人的排除率為99.999％。PCR技術(shù)可以完成替代早期的Southern印跡法進行多態(tài)性分析而且操作簡便，敏感性及準確性都有大幅度的提高。當(dāng)然PCR技術(shù)在法醫(yī)中的應(yīng)用仍在起步階段有許多技術(shù)問題等待解決，如樣本中的抑制劑、檢村中DNA的損報告?zhèn)CR擴增污染等。想念隨著PCR技術(shù)的不斷完善它將在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有更加廣泛的應(yīng)用。

第四篇：PCR技術(shù)將在臨床檢驗領(lǐng)域迎來新契機

PCR技術(shù)將在臨床檢驗領(lǐng)域迎來新契機

來源：廣東醫(yī)學(xué)2010年2月第31卷第3期

周高英，葉鋒

北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司(北京100176)

1985年，Mullis發(fā)明的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)在醫(yī)學(xué)界掀起了基因診斷技術(shù)的熱潮，PCR技術(shù)憑借快速、簡便、靈敏等優(yōu)點以驚人的速度廣泛應(yīng)用于臨床基因診斷等領(lǐng)域，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。但十多年的臨床實踐表明，PCR技術(shù)本身在工作流程標準化、PCR儀器標準化和PCR產(chǎn)品標準化等方面還存在著若干弊端，這導(dǎo)致檢測結(jié)果上的差異，這已經(jīng)成為當(dāng)前困擾臨床醫(yī)師、實驗室技術(shù)人員以及患者的普遍問題。本文將從PCR技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展回顧、診斷試劑的標準化以及PCR技術(shù)在臨床檢驗領(lǐng)域的新契機等3個方面進行闡述。PCR技術(shù)及產(chǎn)業(yè)發(fā)展歷史回顧

1985年，美國MULLIS等[1]發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)，使人們夢寐以求的體外無限擴增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實，并依靠此項技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎。1989年，Hoffmann—La Roche公司和Cetus公司開始將PCR技術(shù)應(yīng)用于臨床診斷領(lǐng)域。1996年，美國Applied Biosystems公司推出全球首款實時熒光定量PCR技術(shù)，并在歐美各國悄然興起，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染、自動化程度高等特點，因而在各級臨床實驗室得以迅速推廣[3]。PCR技術(shù)于90年代中期在國內(nèi)全面展開臨床應(yīng)用工作，但是由于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)本身存在著許多局限性(如產(chǎn)物不能準確定量、容易交叉污染、導(dǎo)致假陽性等)，在1998年遭到了衛(wèi)生部門的明令禁止。此后，由于熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)以及國內(nèi)外學(xué)者的不懈努力，政府相關(guān)部門于2002年頒布《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》和《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范》等一系列準入文件，從制度上規(guī)范了PCR實驗室運作，建立起有效的質(zhì)量保障體系[4]。目前，已有多家國內(nèi)外生產(chǎn)廠商涉足研發(fā)生產(chǎn)適用于臨床診斷的PCR檢測試劑盒，并在PCR產(chǎn)品市場中占得先機。經(jīng)過多年的發(fā)展和完善，熒光定量PCR技術(shù)在國內(nèi)科研、檢測和診斷領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，無論是產(chǎn)品種類、產(chǎn)品質(zhì)量、技術(shù)優(yōu)勢和市場規(guī)模均可與國外廠家相媲美，另外，由于試劑價格遠低于進口產(chǎn)品，國產(chǎn)PCR診斷試劑占領(lǐng)了絕大部分國內(nèi)市場份額。臨床PCR診斷試劑產(chǎn)品的弊端

臨床實驗室檢驗標準化并非單一因素，它由諸多關(guān)鍵性環(huán)節(jié)組成，其中工作流程標準化、PCR儀器標準化和PCR試劑產(chǎn)品標準化是PCR臨床檢驗標準化的核心內(nèi)容。目前國家頒布的《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》和《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范》等一系列準入文件從根本上規(guī)范了工作流程標準化問題；對PCR儀器標準化而言，一些進口PCR儀器依靠高度的穩(wěn)定性、可重復(fù)性和高效的數(shù)據(jù)分析軟件，已實現(xiàn)了實驗數(shù)據(jù)的可靠性和標準化操作流程；由于價格占優(yōu)，國產(chǎn)PCR診斷試劑占據(jù)了國內(nèi)的大部分市場，但是由于不同的廠家缺乏統(tǒng)一的檢查標準，往往使得同一實驗室不同檢測批次間或不同實驗室對同一標本檢測間結(jié)果存在較大差異。這已經(jīng)成為困擾臨床醫(yī)生、患者以及實驗室技術(shù)人員的普遍問題，這也是當(dāng)前不同實驗室間結(jié)果有條件互認的一個巨大障礙。目前對于PCR診斷產(chǎn)品標準化主要存在以下4個問題：

2.1 定量的目的和意義不明 除少數(shù)種類試劑外，目前已上市的大部分試劑盒并不是報告原始樣本中病原體的濃度，而是核酸提取后產(chǎn)物的靶基因濃度，并不能真正反映原取材樣本的靶基因的真正含量。選擇合適的實驗標本是減少實驗誤差的第一個過程，然而不同實驗的實驗樣品并不具有通用性，很難確保實驗樣品的均一性。在人體，血液樣本容易收集、相對恒定、能確保不同樣本間的比較，對血液中病原體進行定量檢測更精確且有實際意義。然而對于如尿液、痰液、淋巴液、拭子、組織塊等樣本，由于采樣時患者的生理狀況和取樣部位等因素，雖然用物理、化學(xué)或酶的方法對標本進行了處理，但仍然無法做到均一性

和可比性，因此其所謂的定量僅僅是針對核酸提取物中靶基因定量。

2.2 定量的依據(jù)不妥據(jù)調(diào)查，目前市場上PCR定量試劑無一例外都采用質(zhì)粒做為試劑盒定量標準。由于質(zhì)粒是一種人為構(gòu)建的脫氧核糖核酸載體，環(huán)狀物理構(gòu)象存在特殊性，和線性的基因組DNA相比，PCR擴增效率上具有差別。因此，先進行質(zhì)粒拷貝數(shù)定值，再通過比較各個樣品擴增曲線Ct值來獲得病原體基因組DNA的濃度，這樣的流程缺乏嚴謹?shù)倪壿嬕罁?jù)。有些廠家甚至用質(zhì)粒標定RNA(有的病毒遺傳物質(zhì)為RNA)拷貝數(shù)，就更加無據(jù)可依。同時，采用與待檢樣本性質(zhì)差異很大的質(zhì)粒作為標準品或質(zhì)控品，也無法回避檢測過程的基質(zhì)效應(yīng)。

2.3 定量的準確性不能保證核酸提取：臨床樣本的多樣性給核酸的提取和純化提出了新的問題，目前提取方法有手工提取、柱提取、磁珠提取等，不同的提取方法各有其的優(yōu)勢，因此很難建立一個標準化的臨床標本制作處理過程，這對于樣本的預(yù)處理、核酸的提取、提取的效率評估，也是核酸純化方法標準化的重要指標。內(nèi)標選擇：目前多數(shù)PCR試劑生產(chǎn)廠商并沒有引入質(zhì)量控制措施(如內(nèi)標)和校正品，這對于病原體數(shù)量準確定量就無從談起。雖然醫(yī)院對于某一兩次檢測值的精確度要求不是太高，但對于那些引起重大疾病的病原體，如乙型肝炎病毒載量的長期監(jiān)控，準確量化就成為臨床十分迫切的要求，這也是現(xiàn)階段體外診斷試劑生產(chǎn)廠家亟待突破的瓶頸。PCR實驗過程：不同的PCR儀器、不同廠家的試劑、不同的操作者也是造成實驗定量不準確的重要指標之一。

2.4 試劑缺乏穩(wěn)定性穩(wěn)定性是體外診斷試劑必須具有的基本屬性，是確保產(chǎn)品在使用過程中安全有效的重要指標。通過對不同條件下產(chǎn)品的主要質(zhì)量指標隨時間變化情況的檢測，可以為產(chǎn)品的保存條件和有效期的確定提供依據(jù)。而試劑方法的標準化以及標準物質(zhì)的應(yīng)用是保證實驗室檢驗結(jié)果準確性的前提，在日常檢驗工作中應(yīng)用標準物質(zhì)，將極大地改善不同實驗室間檢驗結(jié)果的可比性，從而逐步實現(xiàn)不同實驗室間檢驗結(jié)果有條件的互認。PCR技術(shù)在臨床檢驗領(lǐng)域的新契機

分子生物學(xué)發(fā)展至今，人類基因組的草圖早已繪就[6]，許多信號傳導(dǎo)通道也已闡明[7]，PCR技術(shù)已經(jīng)成為分子生物學(xué)十分便利的工具。然而談到與臨床檢驗相結(jié)合，仍有許多待改進的地方，未來的PCR臨床發(fā)展之路，需要更加緊密地結(jié)合臨床、體外診斷(IVD)基本要求和新材料、自動化技術(shù)等研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)理論，并在產(chǎn)品設(shè)計、制造工藝上取得新的突破，只有這樣方能有效彌補目前PCR技術(shù)存在的缺陷，進一步拓寬這項技術(shù)的應(yīng)用空間。

3.1 標準化首先，PCR技術(shù)面臨的歷史任務(wù)是解決標準化問題。應(yīng)該說，定量這一概念的提出為PCR標準化進程邁出了第一步，但這還遠遠不夠。標準化不僅意味著統(tǒng)一的量化形式，更重要的是建立固定、可重復(fù)的流程，嚴謹完備的質(zhì)量控制體系，一致且具可比性的評估方法。滿足這些條件，機器自動化無疑是最好的選擇。

3.2 自動化近2O年，檢驗醫(yī)學(xué)以驚人的速度和規(guī)模獲得了巨大的發(fā)展，其中自動化的迅速發(fā)展尤為迅猛，它將傳統(tǒng)的人工檢測手段提高到自動化檢測的新水平，為精確、微量、快速和組合檢驗提供了有力的保障，自動化已成為臨床檢驗的趨勢。PCR擴增的自動化早已實現(xiàn)，因而核酸提取純化的自動化就顯得更為重要。近年來各儀器廠商紛紛推出磁珠法提取儀器，如Roche MagNA Pure LC，利用電磁效應(yīng)以及納米級的磁性顆粒進行核酸的分離純化，其提取效率相比之前的自動化系統(tǒng)有了明顯提高[8]。核酸提取純化與PCR擴增聯(lián)為一體的自動化檢測系統(tǒng)則是臨床診斷的趨勢，如Handy-Lab公司的Jaguar全自動檢測系統(tǒng)。儀器的自動化是臨床PCR標準化的最佳選擇，自動化程度越高，標準化越容易實現(xiàn)。雖然目前這些儀器以及配套耗材的價格偏高，但并不影響各大醫(yī)院對這些新生技術(shù)平臺的接納。近年來，政府對重大傳染病(如乙肝、丙肝、結(jié)核等)項目予以資金上的支持，旨在加強這些重大傳染病的監(jiān)控與防治。目前這些儀器設(shè)備已進入醫(yī)院和院方檢驗的需求進一步磨合，加上生產(chǎn)成本平攤之后，完全取代人工操作的情景必將成為現(xiàn)實。

3.3 高通量(1)絕對通量的提高。過去PCR 由于通量不高而一直受人詬病，不久前挪威公司DiaGenic聯(lián)合關(guān)國ABI公司開發(fā)出類似普通生物芯片的Taqman微量液體反應(yīng)板，讓人們看到了PCR微型化并實現(xiàn)高通量的希望[9-10]。該儀器含有384孔獨立反應(yīng)體系，具有良好的靈敏度、特異性和寬泛的動力學(xué)范圍。

在新的技術(shù)平臺下，精細繁瑣PCR加樣的工作將完全由儀器取代，精密度進一步得到改善。另外，新的加樣方式進一步微縮反應(yīng)體系，1塊普通的PCR反應(yīng)板便能同時進行上萬個反應(yīng)，1次即能檢遍人體內(nèi)的多種基因的表達情況。Abgene公司推出的水浴熱循環(huán)儀PCR一次可完成24塊板(96孔、384孔、1 536孔)的PCR，最大通量1次測序反應(yīng)可達到24×1 536=36 864個樣本，真正實現(xiàn)了儀器的高通量。(2)相對通量的提高。相比于那些體積大的高通量儀器，臨床實驗室更需要一些系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單、體積小、容易實現(xiàn)自動化操作、分析通量高的儀器。如ABI公司推出的StepOnePlus采用了獨特的的VerriFlexTM 加熱模塊，它具有6個獨立控制的peltier加熱塊，相當(dāng)于6臺PCR，為具有優(yōu)化得到的有不同的退火溫度的引物和探針的用戶提供了操作的靈活性。

3.4 PCR技術(shù)的發(fā)展擴大了臨床應(yīng)用(1)應(yīng)用種類和范圍擴展。受益于生物信息學(xué)迅速發(fā)展，PCR檢測的種類和范圍也在日漸擴大，從一開始純粹檢測人體中的感染源，到現(xiàn)在檢測各種基因的突變?nèi)笔В袛嗖≡w的耐藥性或人體對于某些疾病的易感性，從而實現(xiàn)個體化用藥和治療[11]。目前已在遺傳病的產(chǎn)前篩查、致病病原體的檢測、癌基因的檢測和診斷、DNA指紋、個體識別、親子關(guān)系鑒別及法醫(yī)物證、動植物檢疫等方面展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。(2)結(jié)合其他分子生物學(xué)技術(shù)擴展。近十年來，PCR技術(shù)衍生出許多精細分支，它與免疫學(xué)方法、核酸雜交以及測序技術(shù)的結(jié)合大大豐富了分子生物學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域，目前眾多PCR衍生技術(shù)和相關(guān)技術(shù)已應(yīng)運而生，并在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，如TaqMan MGB探針技術(shù)使得單純使用PCR技術(shù)對單個堿基的突變進行檢測成為可能，在臨床上可以對疾病相關(guān)位點(如耐藥位點)進行檢測；PCR結(jié)合測序技術(shù)，測序技術(shù)是在產(chǎn)生PCR產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，一次能獲得更多的序列信息，被視為核酸序列研究的“金標準”，特別適用于多個疾病相關(guān)位點的檢測(如乙肝病毒P區(qū)耐藥位點檢測、EGFR、KRAS等靶向藥物耐藥突變檢測)；單堿基延伸技術(shù)(single base ex-tension，SBE)，該技術(shù)可對突變位點進行檢測，這是很多高通量SNP分型技術(shù)的基礎(chǔ)。高通量的SNP分型在臨床上適用于大量標本的快速檢測，如在人群中篩查攜帶某個疾病相關(guān)位點的個體。高分辨熔解曲線技術(shù)(HRM)是在PCR體系中加入飽和熒光染料，通過控制體系的溫度變化，繪制PCR產(chǎn)物的溫度熔解曲線圖。依據(jù)雜合異源雙鏈的原理，不同的DNA雙鏈由于長度、GC含量、錯配性等存在差異而具有不同的溫度熔解曲線。該技術(shù)特別適用于那些無需確定突變位置和類型的快速篩查，如Kras基因12、13位密碼子的任一突變，若使用TaqMan，需要多個反應(yīng)檢測8種基因型，而HRM 只需要檢測野生型和非野生型。這些新技術(shù)的應(yīng)用極大地增強了PCR技術(shù)對于基因細小差別的分辨能力，將PCR技術(shù)精細化的應(yīng)用潛力提升到了一個新的層面。結(jié)語

盡管PCR技術(shù)已經(jīng)進入臨床檢驗領(lǐng)域多年，但當(dāng)前仍被視為一種輔助的臨床診斷方法。不過隨著分子生物學(xué)理論的快速發(fā)展，PCR技術(shù)與新材料、自動化科學(xué)的結(jié)合日益緊密，并融合新的工藝設(shè)計，逐漸凸顯出以標準化、自動化、高通量以及精細化為代表的幾大發(fā)展趨勢。這些因素不僅為將來的PCR診斷試劑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展預(yù)留了廣闊空間，而且指明了方向，同時對現(xiàn)有的PCR產(chǎn)品和產(chǎn)業(yè)格局提出了挑戰(zhàn)和變革要求。綜上所述，PCR技術(shù)以及相關(guān)產(chǎn)業(yè)即將在臨床檢驗領(lǐng)域迎來全新的發(fā)展契機。

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第五篇：PCR技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用

PCR技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用

姓名

專業(yè)

翟揚威 學(xué)號 11042106

食品科學(xué)與工程 班級 11-1

[摘要]: 如今食品營養(yǎng)、安全問題備受關(guān)注，是關(guān)系到人們健康和國家發(fā)展的重大課題，有關(guān)食品安全檢測的技術(shù)受到重視,其中 PCR技術(shù)以其靈敏度高、特異性強以及快速準確等優(yōu)勢在食品檢測領(lǐng)域得到廣泛的認可.現(xiàn)主要介紹一下PCR技術(shù)檢測食品微生物的優(yōu)點，且分析了PCR技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用及一些新的PCR檢測技術(shù)，并說明了這些技術(shù)在食品微生物檢測中的發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]: 多聚酶鏈式反應(yīng) PCR 食品檢測 微生物

近年來，PCR技術(shù)在食品工業(yè)中倍受重視，例如：基因克隆、轉(zhuǎn)基因食品檢測、微生物檢測、食品成分及產(chǎn)地的檢測等，推進了基因工程在食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

首先，我們得了解PCR技術(shù)是什么？作用原理是什么？

PCR即聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)，是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究 的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研 究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。

PCR技術(shù)的基本原理：該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此為起始點，沿模板5′→3′方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。

參加pcr反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、D-NTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則： ①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

PCR 技術(shù)檢測微生物的基本原理是在被檢測微生物核酸序列, 在PCR 體系下經(jīng)高溫變性、低溫退火、適溫延伸三步循環(huán)將單個核酸分子序列以2的指數(shù)進行大量復(fù)制擴增的過程。即在檢測時, 被檢測微生物雙鏈DNA 序列在94℃變性解鏈成雙鏈, 55℃特異性引物與單鏈DNA 結(jié)合, 72℃在引物的引導(dǎo)延伸復(fù)制檢測微生物DNA 序列。以上三步進行循環(huán)擴增得到大量的被檢測微生物DNA 序列, 最后一般在凝膠電泳下檢測目的DNA。理論上只要樣品中有一個分子的微生物就可以在短時間內(nèi)用PCR 技術(shù)檢測到。食品中污染微生物種類很多, 即使是同一種食品中微生物種類也有很多, 用傳統(tǒng)的方法檢測食品中微生物要分離出所有的微生物很困難。特別是在檢測食品中的弱勢菌時, 可能很難用傳統(tǒng)的方法檢測出來, 特別是有些微生物很難培養(yǎng), 而用PCR 技術(shù)檢測這些微生物可以避免這些問題, 因此, 利用PCR 技術(shù)能夠比較準確地檢測食品中微生物。

PCR技術(shù)在食品成分測定方面的應(yīng)用也倍受關(guān)注，如動物源性成分的測定等。

近年來，瘋牛病、羊癢病及禽流感等疾病通過食品的傳播，由于食品安全性與質(zhì)量監(jiān)督的需要及宗教信仰等問題，有必要對食品中的動物源成分進行檢測，僅靠傳統(tǒng)的外觀鑒別，無法準確判定其實際成分。PCR 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于動物肉類的物種檢測與飼料中的動物成分檢測。陳文炳[20]等，應(yīng)用了PCR技術(shù)檢測12種加工食品中豬、牛、羊、雞等動物源性成分，并開發(fā)了真核生物所共有的18S核糖體DNA(18S R-DNA)與食品中多種動物物種特異性基因片段之間的二重PCR檢測方法，以提高檢測效率與準確性，節(jié)約檢測成本。王麗媛[21]等，利用單重PCR和多重PCR對部分市售肉制品進行檢測，以確定食品中是否含有動物源性成分及其含量。此方法操作簡便，快速準確，節(jié)省費用。植物源性成分的測定

我國是一個農(nóng)產(chǎn)品出口大國，加入WTO后，隨著農(nóng)產(chǎn)品出口量的增加，國外對出口食品質(zhì)量的要求也隨之提高。為確保食品的品質(zhì)和安全，為我國食品的進出口貿(mào)易嚴格把關(guān)，保證我國人民日常生活的食品安全和生命健康。因此，開發(fā)出準確方便的鑒定食品有效成分的方法，具有重大意義。陳文炳[22]等本研究以豆粉與豆奶粉中的大豆成分(內(nèi)源Lectin基因)、食品中的玉米(IVR 基因)、馬鈴薯(PATA基因)、番茄(PG基因)等成分以及真核生物中普遍存在的核糖體DNA(18S R-DNA)片段為研究對象，進行單一與二重PCR擴增，以擴增產(chǎn)物作為分子標記，建立加工食品中植物源性有效成分的分子生物學(xué)鑒定技術(shù)，為食品質(zhì)量與安全管理提供技術(shù)支持。

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