第一篇：臨床檢驗(yàn)中PCR技術(shù)的應(yīng)用

臨床檢驗(yàn)中PCR技術(shù)的應(yīng)用

青海紅十字醫(yī)院檢驗(yàn)科 楊軍 檢驗(yàn)士 關(guān)鍵詞：pcr ：pcr的應(yīng)用

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類，其分別代表幾代實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗(yàn)的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對(duì)DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點(diǎn)。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強(qiáng)度而且也減少了污染的機(jī)會(huì)，具有極高的使用價(jià)值。

PCR檢測(cè)的臨床應(yīng)用范圍：用于疾病的早期診斷，疾病的鑒別診斷，疾病的病因確定，藥物療效的評(píng)價(jià)，治療效果的評(píng)價(jià)，治愈標(biāo)準(zhǔn)的確定

通常用PCR法檢測(cè)血清中的乙肝病毒。PCR法檢測(cè)乙肝的優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在：

① 早期診斷，因?yàn)镻CR擴(kuò)增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。

② 對(duì)低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長(zhǎng)期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無(wú)法檢出，可以用PCR法檢出。③ 療效跟蹤及病程判斷，因?yàn)镻CR能半定量檢測(cè)乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標(biāo)。在治療過(guò)程中通過(guò)監(jiān)測(cè)血清或白細(xì)胞中病毒基因存在與否及其動(dòng)態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗(yàn)的方法主要是ELISA法測(cè)定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無(wú)法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽(yáng)性或假陰性。同時(shí)血清中抗體的出現(xiàn)及動(dòng)態(tài)變化與病人病情無(wú)線性相關(guān)關(guān)系。RT-PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(RT)后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)。

PCR檢測(cè)在性傳播性疾病(STD)的診斷中有較廣泛的應(yīng)用。經(jīng)典的性傳播疾病有梅毒、淋病、腹股溝淋巴肉芽腫、軟銳濕癘、硬下疳等。而在現(xiàn)代STD中、解尿支原體及沙眼衣原體引起的非淋菌性尿道炎(NGU)可能更具有代表性意義。檢測(cè)標(biāo)本無(wú)特殊限制：

痰、尿、腹水、胸水、關(guān)節(jié)液、血、肺泡灌洗液、腦脊液、分泌物等均可送檢PCR檢測(cè)淋球菌。淋病的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，其確診主要是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查。傳統(tǒng)的方法有涂片染色法，分離培養(yǎng)法和用來(lái)檢測(cè)淋球菌抗原的EIA-Gonozyme系統(tǒng)法。近年來(lái)，熒光定量PCR診斷技術(shù)的應(yīng)用，使淋病的快速診斷有重大突破。

循環(huán)系統(tǒng)以腸道小RNA病毒感染最具代表意義，如柯薩奇病毒等。這些病毒經(jīng)腸道粘膜、淋巴結(jié)進(jìn)入血液，最終可定位于心肌細(xì)胞中導(dǎo)致心肌炎。目前對(duì)這些病毒的血液樣本檢測(cè)往往比較困難。PCR用于柯薩奇病毒檢測(cè)時(shí)因其是RNA病毒所以應(yīng)注意樣本的保存。外在環(huán)境中存在大量RNA酶，病毒脫殼后RNA將被迅速降解。一般用于RNA檢測(cè)的血清常溫下不應(yīng)超過(guò)24小時(shí)，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下

PCR敏感性高可以檢測(cè)出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動(dòng)態(tài)狀況

（1）參考文獻(xiàn)：《中國(guó)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志》2001.11:13-14

(2)

姜懷春pcr技術(shù)研究新進(jìn)展。重慶工商大學(xué)報(bào)，2005.22（4）：232-235

第二篇：PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

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醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類，其分別代表幾代實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗(yàn)的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對(duì)DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點(diǎn)。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強(qiáng)度而且也減少了污染的機(jī)會(huì)，具有極高的使用價(jià)值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開(kāi)創(chuàng)性意義。這些改進(jìn)都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡(jiǎn)便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見(jiàn)傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲(chóng)病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學(xué)等廣泛領(lǐng)域中有相當(dāng)高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

常見(jiàn)的傳染性疾病有細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應(yīng)的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國(guó)具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國(guó)是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細(xì)胞中增殖，也可以長(zhǎng)期存留在骨髓細(xì)胞或外周血白細(xì)胞中。通常用PCR法檢測(cè)血清中的乙肝病毒。有報(bào)道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細(xì)胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能。PCR法檢測(cè)乙肝的優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在：①早期診斷，因?yàn)镻CR擴(kuò)增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。②對(duì)低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長(zhǎng)期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無(wú)法檢出，可以用PCR法檢出。③療效跟蹤及病程判斷，因?yàn)镻CR能半定量檢測(cè)乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標(biāo)。在治療過(guò)程中通過(guò)監(jiān)測(cè)血清或白細(xì)胞中病毒基因存在與否及其動(dòng)態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗(yàn)的方法主要是ELISA法測(cè)定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無(wú)法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽(yáng)性或假陰性。同時(shí)血清中抗體的出現(xiàn)及動(dòng)態(tài)變化與病人病情無(wú)線性相關(guān)關(guān)系。RT－PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測(cè)出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動(dòng)態(tài)狀況。RNA純化要求嚴(yán)格，是RT－PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對(duì)樣本中的RNA進(jìn)行分離純化，使這一問(wèn)題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉(zhuǎn)錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV/MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實(shí)現(xiàn)單管單酶單人份的擴(kuò)增要求，這樣就在不降低擴(kuò)增敏感性的條件下，一步完成擴(kuò)增，不僅簡(jiǎn)化操作，而且又減少污染，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。國(guó)內(nèi)本公司已采用這種技術(shù)推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長(zhǎng)期存在于血清中。在PCR檢測(cè)時(shí)，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細(xì)胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國(guó)胃炎發(fā)病率之高估計(jì)比乙型肝炎更嚴(yán)重，對(duì)HP的檢測(cè)應(yīng)受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的重視。對(duì)HP的檢測(cè)可以用生化法測(cè)試尿素酶或用免疫法測(cè)試血清中對(duì)HP特異性抗體，也可對(duì)胃液、胃粘膜樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測(cè)HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系統(tǒng)感染性疾病主要的有肺結(jié)核、非典型性肺炎等。結(jié)核桿菌感染曾給人類健康帶來(lái)很大威脅，一度是較嚴(yán)重的致死性疾病之一。解放以后由于對(duì)結(jié)核病的預(yù)防的重視，特別是特效抗癆藥物的出現(xiàn)，使結(jié)核病流行基本被控制。近來(lái)結(jié)核病有抬頭的趨勢(shì)，基原因可能有兩方面，其一是耐藥株的不斷出現(xiàn)，其二是對(duì)結(jié)核預(yù)防重視不足。結(jié)核菌痰涂片鏡檢陽(yáng)性率太低，酶標(biāo)法又因抗原交叉反應(yīng)易出現(xiàn)假陽(yáng)性，結(jié)核檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是結(jié)核菌培養(yǎng)法。但培養(yǎng)法費(fèi)時(shí)昂貴并且受到用藥的影響，在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。PCR在結(jié)核菌檢測(cè)方面有簡(jiǎn)便、敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)。一般認(rèn)為樣本中內(nèi)要有100個(gè)左右的結(jié)核菌即可被檢出。目前用于結(jié)核菌PCR診斷的試劑，其引物主要來(lái)源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色體重復(fù)插入序列IS986、IS960、IS6110、染色體質(zhì)粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色體重復(fù)插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介紹并使用了IS986基因設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增產(chǎn)物為245BP，研究表明這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌有特異性。而后Thierry又介紹了插入序列IS6110基因，并認(rèn)為這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌具有比IS986更高的特異性及敏感性，最適合M.TB的檢測(cè)。結(jié)核菌痰標(biāo)本的PCR檢測(cè)應(yīng)注意以下幾種常見(jiàn)的問(wèn)題。其一，多條帶。即擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后有三條或三條以上的螢光除最前面的引物以外有兩條產(chǎn)物帶，這與插入序列本身各片段長(zhǎng)度有差異、結(jié)核菌在治療過(guò)程中染色體畸變、斷裂、缺欠及不等位交換有關(guān)。這種擴(kuò)增結(jié)果的判斷應(yīng)特別注意，凡在陽(yáng)性對(duì)照相應(yīng)位置有明顯條帶的判陽(yáng)性，否則應(yīng)為陰性，或建議病人過(guò)一些時(shí)間后再?gòu)?fù)檢一次；其二，結(jié)核痰樣本PCR檢測(cè)時(shí)，要使樣本充分液化，否則痰液中的粘液成份將影響擴(kuò)增效果，甚至?xí)?dǎo)致嚴(yán)重非特異性擴(kuò)增，電泳結(jié)果呈霧狀；基三，結(jié)核痰樣本PCR檢測(cè)結(jié)果可能表現(xiàn)為陽(yáng)性、陰性交替出現(xiàn)，這與結(jié)核病灶的不規(guī)律排菌有關(guān)。

循環(huán)系統(tǒng)以腸道小RNA病毒感染最具代表意義，如柯薩奇病毒等。這些病毒經(jīng)腸道粘膜、淋巴結(jié)進(jìn)入血液，最終可定位于心肌細(xì)胞中導(dǎo)致心肌炎。目前對(duì)這些病毒的血液樣本檢測(cè)往往比較困難。PCR用于柯薩奇病毒檢測(cè)時(shí)因其是RNA病毒所以應(yīng)注意樣本的保存。外在環(huán)境中存在大量RNA酶，病毒脫殼后RNA將被迅速降解。一般用于RNA檢測(cè)的血清常溫下不應(yīng)超過(guò)24小時(shí)，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR檢測(cè)在性傳播性疾病(STD)的診斷中有較廣泛的應(yīng)用。經(jīng)典的性傳播疾病有梅毒、淋病、腹股溝淋巴肉芽腫、軟銳濕癘、硬下疳等。而在現(xiàn)代STD中、解尿支原體及沙眼衣原體引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意義。梅毒是由梅毒螺旋體感染布致，首先在局部形成硬軟下疳，布后經(jīng)血行播散到全身，最嚴(yán)重的是波及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。感染早期，梅毒螺旋體大量存在于硬下疳中，可以用生理鹽水濕棉簽擦去皮疹表面污物再用鈍刀片輕輕刮去上皮及結(jié)痂，用潔凈棉簽取滲出液樣本作PCR檢測(cè)，其敏感性及特異性極高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺體其取樣方法同埂下疳，三期梅毒皮疹中一般無(wú)螺旋體存在，因此III病人及部分無(wú)皮疹的I、II期梅毒病人可以取EDTA抗凝全血檢測(cè)。淋病是目前發(fā)病率最高的性傳播性疾病之一，由淋病雙球菌引起。淋病雙球菌一般為胞內(nèi)寄生，常見(jiàn)的感染部位為外生殖器、尿道粘膜最常見(jiàn)。在尿道及外生殖器分泌物中有許多非致病的雙菌存在，對(duì)分泌物拭子進(jìn)行涂片鏡檢時(shí)，常導(dǎo)致誤診。另外目前非淋球菌性尿道炎的發(fā)病率不斷增加，鑒別診斷特要，培養(yǎng)法準(zhǔn)確但費(fèi)時(shí)且費(fèi)用高，受用藥的影響。PCR法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隱性質(zhì)粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因設(shè)計(jì)的引物特異性高但其敏感性低；隱性質(zhì)粒設(shè)計(jì)的引物敏感性高但偶爾出現(xiàn)多條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷結(jié)果時(shí)應(yīng)以陽(yáng)性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)，凡在陽(yáng)性對(duì)照相應(yīng)部位有明顯條帶的為陽(yáng)性，其余均為陰性。以往對(duì)沙眼衣原體及解脲支原體的檢測(cè)主要靠培養(yǎng)法，費(fèi)時(shí)且昂貴，簡(jiǎn)便快速的PCR檢測(cè)對(duì)其有極高的使用價(jià)值。沙眼衣原體、解脲支原體樣本來(lái)源主要是尿道及宮頸分泌物拭子，由于分泌物中有許多污物含有PCR擴(kuò)增的抑制劑，因此每次采樣時(shí)盡量避免采集過(guò)多膿性分泌物，如果宮頸分泌物太多可以先用濕棉簽將表面的分泌物擦去，再用潔凈的濕棉簽輕壓旋轉(zhuǎn)采集宮頸脫落細(xì)胞送檢，其準(zhǔn)確性更高。PCR也可以用檢測(cè)單純皰疹病毒、EB病毒、乳頭瘤病毒等。引物尖銳濕疣的病毒是人類乳頭瘤（HPV）,可致生殖系統(tǒng)感染的乳頭瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究結(jié)果表明，在乳頭瘤病毒引起的良、惡性生殖器病變中，與血清型的關(guān)系并不密切，經(jīng)常有交叉或多型民時(shí)感染。為簡(jiǎn)化操作，對(duì)其基因?qū)Ρ确治鰧ふ夜餐蛄性O(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物可以同時(shí)檢出這幾種型別的病毒既簡(jiǎn)化操作又減少費(fèi)用是一種極理想的方法。

我國(guó)惡性腫瘤為人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的發(fā)病率最高，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的60％以上。引起腫瘤的原因非常復(fù)雜包括外界環(huán)境因素及遺傳背景。外界因此可分為三大類即化學(xué)、物理及生物因素。腫瘤與遺傳有關(guān)的證據(jù)越來(lái)越多，除已知的單基因遺傳腫瘤如視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤等以外，還在幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中觀察到原癌基因的重排，這些基因的變化常導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)控失調(diào)終形成腫瘤。癌基因是指在自然或?qū)嶒?yàn)條件下具有潛在誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的基因，它們是在研究逆轉(zhuǎn)錄病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)的。目前已知的腫瘤基因有60多種，1969年Hubner根據(jù)Rous(1911)的實(shí)驗(yàn)，在小雞肉瘤濾液中發(fā)現(xiàn)一種能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后來(lái)又在其它哺乳動(dòng)物基因中發(fā)現(xiàn)與病毒癌基因同源序列，這種正常的細(xì)胞基因表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化有關(guān)。但若被某種因素激活就會(huì)轉(zhuǎn)化為有活力的癌基因，通常稱之為原癌基因（Proto Oncogene）。為了與病毒癌基因區(qū)分，分別用V-Onc及C-Onc基因來(lái)代表。目前了解較多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常細(xì)胞中，并表達(dá)生物功能，只有在原癌基因被激活后才能誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可能的原癌基因活化機(jī)理有：①點(diǎn)突變，受到射線、化學(xué)因素、生物因素的誘導(dǎo)，這樣微小的變化，就會(huì)活化癌基因，活化的基因產(chǎn)物僅有極微的結(jié)構(gòu)差異，但在功能在卻有很大的區(qū)別。②獲得啟動(dòng)子，原癌基因從病毒基因中獲得啟動(dòng)子而活化。③基因易位，內(nèi)外界因素能導(dǎo)致染色體的某些基因易位、重排使原來(lái)無(wú)活性的原癌基因移至某些強(qiáng)的啟動(dòng)因子或增強(qiáng)子附近而被活化。④原癌基因的過(guò)量擴(kuò)增，原癌基因產(chǎn)物一般與生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體、跨膜信息蛋白有關(guān)或功能相近，過(guò)度表達(dá)時(shí)，會(huì)因調(diào)控失常而引起細(xì)胞癌變。另一類與腫瘤相關(guān)的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因較復(fù)雜，作用機(jī)理不太清楚。癌基因檢測(cè)中常用的分子生物學(xué)技術(shù)有：雜交、DNA分子克隆、PCR擴(kuò)增及序列分析。PCR擴(kuò)增簡(jiǎn)便、快捷有較強(qiáng)的實(shí)用性，甚至可從病人體液樣本中檢測(cè)活化的癌基因而不需取活組織，對(duì)癌癥的早期診斷有極重要的意義。Ras基因是1964年首次從大鼠肉瘤的急性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分離出來(lái)取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首命名。1982年首次在人膀胱細(xì)胞細(xì)胞癌中檢出有轉(zhuǎn)化能力的ras基因與Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性稱C-H-ras基因，后從肺細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)了與Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，從神經(jīng)母細(xì)胞中又發(fā)現(xiàn)了N-ras基因。Ras基因激活的最常見(jiàn)方式是點(diǎn)突變。人類原發(fā)腫瘤時(shí)點(diǎn)突變主要發(fā)生在密碼子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行滅活，根據(jù)其點(diǎn)突變的情況可以基因診斷、療效觀察。用PCR擴(kuò)增樣本ras原癌基因，再使用雜交法、限制性內(nèi)切酶消化或產(chǎn)物測(cè)序法檢測(cè)基因的突變情況即可用診斷。P53是抑制癌基因的代表，位于17號(hào)染色體短臂上，其產(chǎn)物為53KD分子量的蛋白從此而得名，可分為突變型和野生型，前者為癌基因，后者為抗癌基因。1979年Cane發(fā)現(xiàn)了P53蛋白Eliyahu發(fā)現(xiàn)了p53基因有抑癌作用。P53突變后其產(chǎn)物突變蛋白穩(wěn)定性增加，半衰期較野生型基因產(chǎn)物長(zhǎng)，在細(xì)胞內(nèi)堆積，可以用免疫組化法測(cè)出。PCR-RELP、PCR-SSCP則因方法簡(jiǎn)單、快速、特異性高，更具有實(shí)用價(jià)值。在SSCP分析中，單鏈DNA因堿基序列的變異，導(dǎo)致構(gòu)型改變，在進(jìn)行凝膠電泳時(shí)，其泳動(dòng)速率發(fā)生改變，從布將變異的DNA與正常DNA區(qū)分開(kāi)，統(tǒng)計(jì)表明100-300bp分子大小的ssDNA突變檢出率可達(dá)97％，300-450bp標(biāo)出率可達(dá)69％，因此大于400bp的片段多態(tài)性應(yīng)采用其它方法檢測(cè)。

遺傳病是由于遺傳基礎(chǔ)異常而引起的疾病，人類遺傳病約有3000多種，患者占總?cè)丝跀?shù)的10％。遺傳病大概可分為單基因、多基因及染色體遺傳病。常用診斷方法有家系譜分析、染色體檢查（特別是顯帶法）、生物化分析等。隨分子生物學(xué)發(fā)展，基因診斷愈來(lái)愈表現(xiàn)出其優(yōu)越性，PCR技術(shù)是基因診斷的主要技術(shù)之一，為快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)人類遺傳病開(kāi)辟了一個(gè)新的途徑，預(yù)計(jì)與遺傳相關(guān)的疾病的檢測(cè)有80％將在3-5年內(nèi)被PCR法所取代。PCR在遺傳病診斷應(yīng)用中，可以利用引物直接擴(kuò)增變化的基因產(chǎn)物，也可以結(jié)合應(yīng)用限制內(nèi)切酶，分子雜交及電泳圖譜分析進(jìn)行診斷。應(yīng)用較為廣泛的有PCR法檢測(cè)中海貧血、苯丙酮尿癥、血友病、脆性X綜合癥及性別鑒定等。地中海貧血（Thalassmia）是世界上最常見(jiàn)的單基因遺傳病，不有同類型，以a地中海貧血及在中海貧血最常見(jiàn)。a珠蛋白基因位于11號(hào)染色體短臂上，a珠蛋白基因突變致血紅蛋白的全成減少或缺失，表現(xiàn)溶血性貧血，肝脾腫大，在我國(guó)發(fā)病率為0.66％，貴州、四川等地高發(fā)可達(dá)2.2％。應(yīng)用PCR技術(shù)可以直接檢測(cè)突變的基因診斷此病。苯丙酮尿癥（Phenylketouria,PKU）是一種常染色體隱性遺傳病。病人肝臟苯丙氨酸羥化酶嚴(yán)重缺乏使苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化為酷氨酸血癥，出現(xiàn)腦組織損傷，智力障礙。此病患者出生時(shí)正常，出生后一經(jīng)確診立即停止母乳喂養(yǎng)，采用低苯丙氨酸飲食治療8-10年不致影響患者智力，但低苯丙氨酸飲食代價(jià)之昂貴是一般家庭所不能承受的，關(guān)鍵在于避免患兒出生。因此本病的早期診斷有極其重要的意義。PCR結(jié)合斑點(diǎn)雜交能有效診斷PKU。遺傳性疾病的基因變化很復(fù)雜，單基因固定位點(diǎn)變異布致病的情況很少，因此基因診斷過(guò)程中往往需要PCR技術(shù)與限制性內(nèi)切酶、斑點(diǎn)雜交、聚丙烯酰胺膠電泳圖譜分析及擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析結(jié)合，作綜合判斷。

優(yōu)生學(xué)包括基礎(chǔ)優(yōu)生學(xué)、社會(huì)優(yōu)生學(xué)、臨床優(yōu)生學(xué)及環(huán)境優(yōu)生學(xué)。孕期檢查及產(chǎn)前診斷是臨床優(yōu)生學(xué)的最重要內(nèi)容之一。孕期檢查除一般項(xiàng)目外還能及時(shí)了解孕婦是患有某些對(duì)胎兒發(fā)育有嚴(yán)重影響的疾病如風(fēng)疹病毒感染、沙眼衣原體、解脲支原體、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、弓體感染等，及時(shí)發(fā)現(xiàn)及時(shí)治療并采取有效措施預(yù)防發(fā)展成為宮內(nèi)感染。PCR技術(shù)對(duì)這些病原體的檢測(cè)簡(jiǎn)便而確實(shí)，另外利用PCR技術(shù)可以對(duì)地中海貧血、血友病、苯丙酮尿癥、脆性X綜合癥等遺傳性疾病進(jìn)行宮內(nèi)診斷。可見(jiàn)PCR在優(yōu)生優(yōu)育方面有很高的應(yīng)用價(jià)值。

PCR技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)法醫(yī)學(xué)的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠(yuǎn)比血清學(xué)或等方法確實(shí)可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個(gè)內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列作探針，從人的基因庫(kù)中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術(shù)成功地應(yīng)用于個(gè)人識(shí)別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當(dāng)樣本DNA數(shù)量不足時(shí)或DAN嚴(yán)重降解則不能正常檢出。且雜交技術(shù)常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護(hù)措施。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對(duì)極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進(jìn)行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，具有單位點(diǎn)特征的稱為VNTR結(jié)構(gòu)，多位點(diǎn)串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。由于VNTR在等位基因中的多態(tài)性便構(gòu)成了遺傳標(biāo)記。使用PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)合對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜分析即可進(jìn)行個(gè)人識(shí)別及親子鑒定。由2-6核苷組成的重復(fù)串聯(lián)序列稱為微衛(wèi)星。在人類基因組中，微衛(wèi)星更加豐富。微衛(wèi)星的重復(fù)序列比VNTR短，擴(kuò)增分型簡(jiǎn)便，易于自動(dòng)化，在VNTR或微衛(wèi)星不僅重復(fù)片段的數(shù)量不同而且重復(fù)片段的核苷酸也具有多態(tài)性。在VNTR或微衛(wèi)星多態(tài)性分析時(shí)，如再結(jié)合堿基配對(duì)分析可以藜得更大量的信息，這一種更有希望的標(biāo)志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理論上其對(duì)嫌疑人的排除率為99.999％。PCR技術(shù)可以完成替代早期的Southern印跡法進(jìn)行多態(tài)性分析而且操作簡(jiǎn)便，敏感性及準(zhǔn)確性都有大幅度的提高。當(dāng)然PCR技術(shù)在法醫(yī)中的應(yīng)用仍在起步階段有許多技術(shù)問(wèn)題等待解決，如樣本中的抑制劑、檢村中DNA的損報(bào)告?zhèn)CR擴(kuò)增污染等。想念隨著PCR技術(shù)的不斷完善它將在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有更加廣泛的應(yīng)用。

第三篇：PCR在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

PCR在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類，其分別代表幾代實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗(yàn)的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對(duì)DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點(diǎn)。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強(qiáng)度而且也減少了污染的機(jī)會(huì)，具有極高的使用價(jià)值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開(kāi)創(chuàng)性意義。這些改進(jìn)都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡(jiǎn)便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見(jiàn)傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲(chóng)病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學(xué)等廣泛領(lǐng)域中有相當(dāng)高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

常見(jiàn)的傳染性疾病有細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應(yīng)的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國(guó)具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國(guó)是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細(xì)胞中增殖，也可以長(zhǎng)期存留在骨髓細(xì)胞或外周血白細(xì)胞中。通常用PCR法檢測(cè)血清中的乙肝病毒。有報(bào)道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細(xì)胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能。PCR法檢測(cè)乙肝的優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在： ① 早期診斷，因?yàn)镻CR擴(kuò)增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。② 對(duì)低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長(zhǎng)期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無(wú)法檢出，可以用PCR法檢出。③ 療效跟蹤及病程判斷，因?yàn)镻CR能半定量檢測(cè)乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標(biāo)。在治療過(guò)程中通過(guò)監(jiān)測(cè)血清或白細(xì)胞中病毒基因存在與否及其動(dòng)態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗(yàn)的方法主要是ELISA法測(cè)定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無(wú)法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽(yáng)性或假陰性。同時(shí)血清中抗體的出現(xiàn)及動(dòng)態(tài)變化與病人病情無(wú)線性相關(guān)關(guān)系。RT－PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測(cè)出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動(dòng)態(tài)狀況。RNA純化要求嚴(yán)格，是RT－PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對(duì)樣本中的RNA進(jìn)行分離純化，使這一問(wèn)題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉(zhuǎn)錄的酶大致可以分為二大類，即低逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV/MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，高逆轉(zhuǎn)錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實(shí)現(xiàn)單管單酶單人份的擴(kuò)增要求，這樣就在不降低擴(kuò)增敏感性的條件下，一步完成擴(kuò)增，不僅簡(jiǎn)化操作，而且又減少污染，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。國(guó)內(nèi)本公司已采用這種技術(shù)推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長(zhǎng)期存在于血清中。在PCR檢測(cè)時(shí)，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細(xì)胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國(guó)胃炎發(fā)病率之高估計(jì)比乙型肝炎更嚴(yán)重，對(duì)HP的檢測(cè)應(yīng)受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的重視。對(duì)HP的檢測(cè)可以用生化法測(cè)試尿素酶或用免疫法測(cè)試血清中對(duì)HP特異性抗體，也可對(duì)胃液、胃粘膜樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測(cè)HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系統(tǒng)感染性疾病主要的有肺結(jié)核、非典型性肺炎等。結(jié)核桿菌感染曾給人類健康帶來(lái)很大威脅，一度是較嚴(yán)重的致死性疾病之一。解放以后由于對(duì)結(jié)核病的預(yù)防的重視，特別是特效抗癆藥物的出現(xiàn)，使結(jié)核病流行基本被控制。近來(lái)結(jié)核病有抬頭的趨勢(shì)，基原因可能有兩方面，其一是耐藥株的不斷出現(xiàn)，其二是對(duì)結(jié)核預(yù)防重視不足。結(jié)核菌痰涂片鏡檢陽(yáng)性率太低，酶標(biāo)法又因抗原交叉反應(yīng)易出現(xiàn)假陽(yáng)性，結(jié)核檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是結(jié)核菌培養(yǎng)法。但培養(yǎng)法費(fèi)時(shí)昂貴并且受到用藥的影響，在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。PCR在結(jié)核菌檢測(cè)方面有簡(jiǎn)便、敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)。一般認(rèn)為樣本中內(nèi)要有100個(gè)左右的結(jié)核菌即可被檢出。目前用于結(jié)核菌PCR診斷的試劑，其引物主要來(lái)源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色體重復(fù)插入序列IS986、IS960、IS6110、染色體質(zhì)粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色體重復(fù)插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介紹并使用了IS986基因設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增產(chǎn)物為245BP，研究表明這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌有特異性。而后Thierry又介紹了插入序列IS6110基因，并認(rèn)為這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌具有比IS986更高的特異性及敏感性，最適合M.TB的檢測(cè)。結(jié)核菌痰標(biāo)本的PCR檢測(cè)應(yīng)注意以下幾種常見(jiàn)的問(wèn)題。其一，多條帶。即擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后有三條或三條以上的螢光除最前面的引物以外有兩條產(chǎn)物帶，這與插入序列本身各片段長(zhǎng)度有差異、結(jié)核菌在治療過(guò)程中染色體畸變、斷裂、缺欠及不等位交換有關(guān)。這種擴(kuò)增結(jié)果的判斷應(yīng)特別注意，凡在陽(yáng)性對(duì)照相應(yīng)位置有明顯條帶的判陽(yáng)性，否則應(yīng)為陰性，或建議病人過(guò)一些時(shí)間后再?gòu)?fù)檢一次；其二，結(jié)核痰樣本PCR檢測(cè)時(shí)，要使樣本充分液化，否則痰液中的粘液成份將影響擴(kuò)增效果，甚至?xí)?dǎo)致嚴(yán)重非特異性擴(kuò)增，電泳結(jié)果呈霧狀；基三，結(jié)核痰樣本PCR檢測(cè)結(jié)果可能表現(xiàn)為陽(yáng)性、陰性交替出現(xiàn)，這與結(jié)核病灶的不規(guī)律排菌有關(guān)。

循環(huán)系統(tǒng)以腸道小RNA病毒感染最具代表意義，如柯薩奇病毒等。這些病毒經(jīng)腸道粘膜、淋巴結(jié)進(jìn)入血液，最終可定位于心肌細(xì)胞中導(dǎo)致心肌炎。目前對(duì)這些病毒的血液樣本檢測(cè)往往比較困難。PCR用于柯薩奇病毒檢測(cè)時(shí)因其是RNA病毒所以應(yīng)注意樣本的保存。外在環(huán)境中存在大量RNA酶，病毒脫殼后RNA將被迅速降解。一般用于RNA檢測(cè)的血清常下不應(yīng)超過(guò)24小時(shí)，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR檢測(cè)在性傳播性疾病（STD）的診斷中有較廣泛的應(yīng)用。經(jīng)典的性傳播疾病有、淋病、腹股溝淋巴肉芽腫、軟銳濕癘、硬下疳等。而在現(xiàn)代STD中、解尿支原體及沙眼衣原體引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意義。是由螺旋體感染布致，首先在局部形成硬軟下疳，布后經(jīng)血行播散到全身，最嚴(yán)重的是波及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。感染早期，螺旋體大量存在于硬下疳中，可以用生理鹽水濕棉簽擦去皮疹表面污物再用鈍刀片輕輕刮去上皮及結(jié)痂，用潔凈棉簽取滲出液樣本作PCR檢測(cè)，其敏感性及特異性極高。二期皮疹中也存在螺體其取樣方法同埂下疳，三期皮疹中一般無(wú)螺旋體存在，因此III病人及部分無(wú)皮疹的I、II期病人可以取EDTA抗凝全血檢測(cè)。淋病是目前發(fā)病率最高的性傳播性疾病之一，由淋病雙球菌引起。淋病雙球菌一般為胞內(nèi)寄生，常見(jiàn)的感染部位為外生殖器、尿道粘膜最常見(jiàn)。在尿道及外生殖器分泌物中有許多非致病的雙菌存在，對(duì)分泌物拭子進(jìn)行涂片鏡檢時(shí)，常導(dǎo)致誤診。另外目前非淋球菌性尿道炎的發(fā)病率不斷增加，鑒別診斷特要，培養(yǎng)法準(zhǔn)確但費(fèi)時(shí)且費(fèi)用高，受用藥的影響。PCR法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隱性質(zhì)粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因設(shè)計(jì)的引物特異性高但其敏感性低；隱性質(zhì)粒設(shè)計(jì)的引物敏感性高但偶爾出現(xiàn)多條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷結(jié)果時(shí)應(yīng)以陽(yáng)性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)，凡在陽(yáng)性對(duì)照相應(yīng)部位有明顯條帶的為陽(yáng)性，其余均為陰性。以往對(duì)沙眼衣原體及解脲支原體的檢測(cè)主要靠培養(yǎng)法，費(fèi)時(shí)且昂貴，簡(jiǎn)便快速的PCR檢測(cè)對(duì)其有極高的使用價(jià)值。沙眼衣原體、解脲支原體樣本來(lái)源主要是尿道及宮頸分泌物拭子，由于分泌物中有許多污物含有PCR擴(kuò)增的抑制劑，因此每次采樣時(shí)盡量避免采集過(guò)多膿性分泌物，如果宮頸分泌物太多可以先用濕棉簽將表面的分泌物擦去，再用潔凈的濕棉簽輕壓旋轉(zhuǎn)采集宮頸脫落細(xì)胞送檢，其準(zhǔn)確性更高。PCR也可以用檢測(cè)單純皰疹病毒、EB病毒、乳頭瘤病毒等。引物尖銳濕疣的病毒是人類乳頭瘤（HPV）,可致生殖系統(tǒng)感染的乳頭瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究結(jié)果表明，在乳頭瘤病毒引起的良、惡性生殖器病變中，與血清型的關(guān)系并不密切，經(jīng)常有交叉或多型時(shí)感染。為簡(jiǎn)化操作，對(duì)其基因?qū)Ρ确治鰧ふ彝蛄性O(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物可以同時(shí)檢出這幾種型別的病毒既簡(jiǎn)化操作又減少費(fèi)用是一種極理想的方法。

我國(guó)惡性腫瘤為人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的發(fā)病率最高，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的60％以上。引起腫瘤的原因非常復(fù)雜包括外界環(huán)境因素及遺傳背景。外界因此可分為三大類即化學(xué)、物理及生物因素。腫瘤與遺傳有關(guān)的證據(jù)越來(lái)越多，除已知的單基因遺傳腫瘤如視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤等以外，還在幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中觀察到原癌基因的重排，這些基因的變化常導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)控失調(diào)終形成腫瘤。癌基因是指在自然或?qū)嶒?yàn)條件下具有潛在誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的基因，它們是在研究逆轉(zhuǎn)錄病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)的。目前已知的腫瘤基因有60多種，1969年Hubner根據(jù)Rous（1911）的實(shí)驗(yàn)，在小雞肉瘤濾液中發(fā)現(xiàn)一種能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后來(lái)又在其它哺乳動(dòng)物基因中發(fā)現(xiàn)與病毒癌基因同源序列，這種正常的細(xì)胞基因表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化有關(guān)。但若被某種因素激活就會(huì)轉(zhuǎn)化為有活力的癌基因，通常稱之為原癌基因（Proto Oncogene）。為了與病毒癌基因區(qū)分，分別用V-Onc及C-Onc基因來(lái)代表。目前了解較多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常細(xì)胞中，并表達(dá)生物功能，只有在原癌基因被激活后才能誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可能的原癌基因活化機(jī)理有：①點(diǎn)突變，受到射線、化學(xué)因素、生物因素的誘導(dǎo)，這樣微小的變化，就會(huì)活化癌基因，活化的基因產(chǎn)物僅有極微的結(jié)構(gòu)差異，但在功能在卻有很大的區(qū)別。②獲得啟動(dòng)子，原癌基因從病毒基因中獲得啟動(dòng)子而活化。③基因易位，內(nèi)外界因素能導(dǎo)致染色體的某些基因易位、重排使原來(lái)無(wú)活性的原癌基因移至某些強(qiáng)的啟動(dòng)因子或增強(qiáng)子附近而被活化。④原癌基因的過(guò)量擴(kuò)增，原癌基因產(chǎn)物一般與生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體、跨膜信息蛋白有關(guān)或功能相近，過(guò)度表達(dá)時(shí)，會(huì)因調(diào)控失常而引起細(xì)胞癌變。另一類與腫瘤相關(guān)的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因較復(fù)雜，作用機(jī)理不太清楚。癌基因檢測(cè)中常用的分子生物學(xué)技術(shù)有：雜交、DNA分子克隆、PCR擴(kuò)增及序列分析。PCR擴(kuò)增簡(jiǎn)便、快捷有較強(qiáng)的實(shí)用性，甚至可從病人體液樣本中檢測(cè)活化的癌基因而不需取活組織，對(duì)癌癥的早期診斷有極重要的意義。Ras基因是1964年首次從大鼠肉瘤的急性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分離出來(lái)取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首名。1982年首次在人膀胱細(xì)胞細(xì)胞癌中檢出有轉(zhuǎn)化能力的ras基因與Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性稱C-H-ras基因，后從肺細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)了與Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，從神經(jīng)母細(xì)胞中又發(fā)現(xiàn)了N-ras基因。Ras基因激活的最常見(jiàn)方式是點(diǎn)突變。人類原發(fā)腫瘤時(shí)點(diǎn)突變主要發(fā)生在密碼子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行滅活，根據(jù)其點(diǎn)突變的情況可以基因診斷、療效觀察。用PCR擴(kuò)增樣本ras原癌基因，再使用雜交法、限制性內(nèi)切酶消化或產(chǎn)物測(cè)序法檢測(cè)基因的突變情況即可用診斷。P53是抑制癌基因的代表，位于17號(hào)染色體短臂上，其產(chǎn)物為53KD分子量的蛋白從此而得名，可分為突變型和野生型，前者為癌基因，后者為抗癌基因。1979年Cane發(fā)現(xiàn)了P53蛋白Eliyahu發(fā)現(xiàn)了p53基因有抑癌作用。P53突變后其產(chǎn)物突變蛋白穩(wěn)定性增加，半衰期較野生型基因產(chǎn)物長(zhǎng)，在細(xì)胞內(nèi)堆積，可以用免疫組化法測(cè)出。PCR-RELP、PCR-SSCP則因方法簡(jiǎn)單、快速、特異性高，更具有實(shí)用價(jià)值。在SSCP分析中，單鏈DNA因堿基序列的變異，導(dǎo)致構(gòu)型改變，在進(jìn)行凝膠電泳時(shí)，其泳動(dòng)速率發(fā)生改變，從布將變異的DNA與正常DNA區(qū)分開(kāi)，統(tǒng)計(jì)表明100-300bp分子大小的ssDNA突變檢出率可達(dá)97％，300-450bp標(biāo)出率可達(dá)69％，因此大于400bp的片段多態(tài)性應(yīng)采用其它方法檢測(cè)。

遺傳病是由于遺傳基礎(chǔ)異常而引起的疾病，人類遺傳病約有3000多種，患者占總?cè)丝跀?shù)的10％。遺傳病大概可分為單基因、多基因及染色體遺傳病。常用診斷方法有家系譜分析、染色體檢查（特別是顯帶法）、生物化分析等。隨分子生物學(xué)發(fā)展，基因診斷愈來(lái)愈表現(xiàn)出其優(yōu)越性，PCR技術(shù)是基因診斷的主要技術(shù)之一，為快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)人類遺傳病開(kāi)辟了一個(gè)新的途徑，預(yù)計(jì)與遺傳相關(guān)的疾病的檢測(cè)有80％將在3-5年內(nèi)被PCR法所取代。PCR在遺傳病診斷應(yīng)用中，可以利用引物直接擴(kuò)增變化的基因產(chǎn)物，也可以結(jié)合應(yīng)用限制內(nèi)切酶，分子雜交及電泳圖譜分析進(jìn)行診斷。應(yīng)用較為廣泛的有PCR法檢測(cè)中海貧血、苯丙酮尿癥、血友病、脆性X綜合癥及性別鑒定等。地中海貧血（Thalassmia）是世界上最常見(jiàn)的單基因遺傳病，不有同類型，以a地中海貧血及在中海貧血最常見(jiàn)。a珠蛋白基因位于11號(hào)染色體短臂上，a珠蛋白基因突變致血紅蛋白的全成減少或缺失，表現(xiàn)溶血性貧血，肝脾腫大，在我國(guó)發(fā)病率為0.66％，貴州、四川等地高發(fā)可達(dá)2.2％。應(yīng)用PCR技術(shù)可以直接檢測(cè)突變的基因診斷此病。苯丙酮尿癥（Phenylketouria,PKU）是一種常染色體隱性遺傳病。病人肝臟苯丙氨酸羥化酶嚴(yán)重缺乏使苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化為酷氨酸血癥，出現(xiàn)腦組織損傷，智力障礙。此病患者出生時(shí)正常，出生后一經(jīng)確診立即停止母乳喂養(yǎng)，采用低苯丙氨酸飲食治療8-10年不致影響患者智力，但低苯丙氨酸飲食代價(jià)之昂貴是一般家庭所不能承受的，關(guān)鍵在于避免患兒出生。因此本病的早期診斷有極其重要的意義。PCR結(jié)合斑點(diǎn)雜交能有效診斷PKU。遺傳性疾病的基因變化很復(fù)雜，單基因固定位點(diǎn)變異布致病的情況很少，因此基因診斷過(guò)程中往往需要PCR技術(shù)與限制性內(nèi)切酶、斑點(diǎn)雜交、聚丙烯酰胺膠電泳圖譜分析及擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析結(jié)合，作綜合判斷。

優(yōu)生學(xué)包括基礎(chǔ)優(yōu)生學(xué)、會(huì)優(yōu)生學(xué)、臨床優(yōu)生學(xué)及環(huán)境優(yōu)生學(xué)。孕期檢查及產(chǎn)前診斷是臨床優(yōu)生學(xué)的最重要內(nèi)容之一。孕期檢查除一般項(xiàng)目外還能及時(shí)了解孕婦是患有某些對(duì)胎兒發(fā)育有嚴(yán)重影響的疾病如風(fēng)疹病毒感染、沙眼衣原體、解脲支原體、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、弓體感染等，及時(shí)發(fā)現(xiàn)及時(shí)治療并采取有效措施預(yù)防發(fā)展成為宮內(nèi)感染。PCR技術(shù)對(duì)這些病原體的檢測(cè)簡(jiǎn)便而確實(shí)，另外利用PCR技術(shù)可以對(duì)地中海貧血、血友病、苯丙酮尿癥、脆性X綜合癥等遺傳性疾病進(jìn)行宮內(nèi)診斷。可見(jiàn)PCR在優(yōu)生優(yōu)育方面有很高的應(yīng)用價(jià)值。

PCR技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)法醫(yī)學(xué)的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠(yuǎn)比血清學(xué)或等方法確實(shí)可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個(gè)內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列作探針，從人的基因庫(kù)中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術(shù)成功地應(yīng)用于個(gè)人識(shí)別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當(dāng)樣本DNA數(shù)量不足時(shí)或DAN嚴(yán)重降解則不能正常檢出。且雜交技術(shù)常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護(hù)措施。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對(duì)極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進(jìn)行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，具有單位點(diǎn)特征的稱為VNTR結(jié)構(gòu)，多位點(diǎn)串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。由于VNTR在等位基因中的多態(tài)性便構(gòu)成了遺傳標(biāo)記。使用PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)合對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜分析即可進(jìn)行個(gè)人識(shí)別及親子鑒定。由2-6核苷組成的重復(fù)串聯(lián)序列稱為微衛(wèi)星。在人類基因組中，微衛(wèi)星更加豐富。微衛(wèi)星的重復(fù)序列比VNTR短，擴(kuò)增分型簡(jiǎn)便，易于自動(dòng)化，在VNTR或微衛(wèi)星不僅重復(fù)片段的數(shù)量不同而且重復(fù)片段的核苷酸也具有多態(tài)性。在VNTR或微衛(wèi)星多態(tài)性分析時(shí)，如再結(jié)合堿基配對(duì)分析可以藜得更大量的信息，這一種更有希望的標(biāo)志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理論上其對(duì)嫌疑人的排除率為99.999％。PCR技術(shù)可以完成替代早期的Southern印跡法進(jìn)行多態(tài)性分析而且操作簡(jiǎn)便，敏感性及準(zhǔn)確性都有大幅度的提高。當(dāng)然PCR技術(shù)在法醫(yī)中的應(yīng)用仍在起步階段有許多技術(shù)問(wèn)題等待解決，如樣本中的抑制劑、檢村中DNA的損報(bào)告?zhèn)CR擴(kuò)增污染等。想念隨著PCR技術(shù)的不斷完善它將在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有更加廣泛的應(yīng)用。

第四篇：PCR技術(shù)將在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域迎來(lái)新契機(jī)

PCR技術(shù)將在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域迎來(lái)新契機(jī)

來(lái)源：廣東醫(yī)學(xué)2010年2月第31卷第3期

周高英，葉鋒

北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司(北京100176)

1985年，Mullis發(fā)明的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)在醫(yī)學(xué)界掀起了基因診斷技術(shù)的熱潮，PCR技術(shù)憑借快速、簡(jiǎn)便、靈敏等優(yōu)點(diǎn)以驚人的速度廣泛應(yīng)用于臨床基因診斷等領(lǐng)域，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。但十多年的臨床實(shí)踐表明，PCR技術(shù)本身在工作流程標(biāo)準(zhǔn)化、PCR儀器標(biāo)準(zhǔn)化和PCR產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化等方面還存在著若干弊端，這導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果上的差異，這已經(jīng)成為當(dāng)前困擾臨床醫(yī)師、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員以及患者的普遍問(wèn)題。本文將從PCR技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展回顧、診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)化以及PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域的新契機(jī)等3個(gè)方面進(jìn)行闡述。PCR技術(shù)及產(chǎn)業(yè)發(fā)展歷史回顧

1985年，美國(guó)MULLIS等[1]發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)，使人們夢(mèng)寐以求的體外無(wú)限擴(kuò)增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實(shí)，并依靠此項(xiàng)技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1989年，Hoffmann—La Roche公司和Cetus公司開(kāi)始將PCR技術(shù)應(yīng)用于臨床診斷領(lǐng)域。1996年，美國(guó)Applied Biosystems公司推出全球首款實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，并在歐美各國(guó)悄然興起，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，因而在各級(jí)臨床實(shí)驗(yàn)室得以迅速推廣[3]。PCR技術(shù)于90年代中期在國(guó)內(nèi)全面展開(kāi)臨床應(yīng)用工作，但是由于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)本身存在著許多局限性(如產(chǎn)物不能準(zhǔn)確定量、容易交叉污染、導(dǎo)致假陽(yáng)性等)，在1998年遭到了衛(wèi)生部門的明令禁止。此后，由于熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)以及國(guó)內(nèi)外學(xué)者的不懈努力，政府相關(guān)部門于2002年頒布《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》和《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》等一系列準(zhǔn)入文件，從制度上規(guī)范了PCR實(shí)驗(yàn)室運(yùn)作，建立起有效的質(zhì)量保障體系[4]。目前，已有多家國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)廠商涉足研發(fā)生產(chǎn)適用于臨床診斷的PCR檢測(cè)試劑盒，并在PCR產(chǎn)品市場(chǎng)中占得先機(jī)。經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展和完善，熒光定量PCR技術(shù)在國(guó)內(nèi)科研、檢測(cè)和診斷領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，無(wú)論是產(chǎn)品種類、產(chǎn)品質(zhì)量、技術(shù)優(yōu)勢(shì)和市場(chǎng)規(guī)模均可與國(guó)外廠家相媲美，另外，由于試劑價(jià)格遠(yuǎn)低于進(jìn)口產(chǎn)品，國(guó)產(chǎn)PCR診斷試劑占領(lǐng)了絕大部分國(guó)內(nèi)市場(chǎng)份額。臨床PCR診斷試劑產(chǎn)品的弊端

臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化并非單一因素，它由諸多關(guān)鍵性環(huán)節(jié)組成，其中工作流程標(biāo)準(zhǔn)化、PCR儀器標(biāo)準(zhǔn)化和PCR試劑產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化是PCR臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化的核心內(nèi)容。目前國(guó)家頒布的《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》和《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》等一系列準(zhǔn)入文件從根本上規(guī)范了工作流程標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題；對(duì)PCR儀器標(biāo)準(zhǔn)化而言，一些進(jìn)口PCR儀器依靠高度的穩(wěn)定性、可重復(fù)性和高效的數(shù)據(jù)分析軟件，已實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和標(biāo)準(zhǔn)化操作流程；由于價(jià)格占優(yōu)，國(guó)產(chǎn)PCR診斷試劑占據(jù)了國(guó)內(nèi)的大部分市場(chǎng)，但是由于不同的廠家缺乏統(tǒng)一的檢查標(biāo)準(zhǔn)，往往使得同一實(shí)驗(yàn)室不同檢測(cè)批次間或不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一標(biāo)本檢測(cè)間結(jié)果存在較大差異。這已經(jīng)成為困擾臨床醫(yī)生、患者以及實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的普遍問(wèn)題，這也是當(dāng)前不同實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果有條件互認(rèn)的一個(gè)巨大障礙。目前對(duì)于PCR診斷產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化主要存在以下4個(gè)問(wèn)題：

2.1 定量的目的和意義不明 除少數(shù)種類試劑外，目前已上市的大部分試劑盒并不是報(bào)告原始樣本中病原體的濃度，而是核酸提取后產(chǎn)物的靶基因濃度，并不能真正反映原取材樣本的靶基因的真正含量。選擇合適的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本是減少實(shí)驗(yàn)誤差的第一個(gè)過(guò)程，然而不同實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)樣品并不具有通用性，很難確保實(shí)驗(yàn)樣品的均一性。在人體，血液樣本容易收集、相對(duì)恒定、能確保不同樣本間的比較，對(duì)血液中病原體進(jìn)行定量檢測(cè)更精確且有實(shí)際意義。然而對(duì)于如尿液、痰液、淋巴液、拭子、組織塊等樣本，由于采樣時(shí)患者的生理狀況和取樣部位等因素，雖然用物理、化學(xué)或酶的方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行了處理，但仍然無(wú)法做到均一性

和可比性，因此其所謂的定量?jī)H僅是針對(duì)核酸提取物中靶基因定量。

2.2 定量的依據(jù)不妥據(jù)調(diào)查，目前市場(chǎng)上PCR定量試劑無(wú)一例外都采用質(zhì)粒做為試劑盒定量標(biāo)準(zhǔn)。由于質(zhì)粒是一種人為構(gòu)建的脫氧核糖核酸載體，環(huán)狀物理構(gòu)象存在特殊性，和線性的基因組DNA相比，PCR擴(kuò)增效率上具有差別。因此，先進(jìn)行質(zhì)粒拷貝數(shù)定值，再通過(guò)比較各個(gè)樣品擴(kuò)增曲線Ct值來(lái)獲得病原體基因組DNA的濃度，這樣的流程缺乏嚴(yán)謹(jǐn)?shù)倪壿嬕罁?jù)。有些廠家甚至用質(zhì)粒標(biāo)定RNA(有的病毒遺傳物質(zhì)為RNA)拷貝數(shù)，就更加無(wú)據(jù)可依。同時(shí)，采用與待檢樣本性質(zhì)差異很大的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品或質(zhì)控品，也無(wú)法回避檢測(cè)過(guò)程的基質(zhì)效應(yīng)。

2.3 定量的準(zhǔn)確性不能保證核酸提取：臨床樣本的多樣性給核酸的提取和純化提出了新的問(wèn)題，目前提取方法有手工提取、柱提取、磁珠提取等，不同的提取方法各有其的優(yōu)勢(shì)，因此很難建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的臨床標(biāo)本制作處理過(guò)程，這對(duì)于樣本的預(yù)處理、核酸的提取、提取的效率評(píng)估，也是核酸純化方法標(biāo)準(zhǔn)化的重要指標(biāo)。內(nèi)標(biāo)選擇：目前多數(shù)PCR試劑生產(chǎn)廠商并沒(méi)有引入質(zhì)量控制措施(如內(nèi)標(biāo))和校正品，這對(duì)于病原體數(shù)量準(zhǔn)確定量就無(wú)從談起。雖然醫(yī)院對(duì)于某一兩次檢測(cè)值的精確度要求不是太高，但對(duì)于那些引起重大疾病的病原體，如乙型肝炎病毒載量的長(zhǎng)期監(jiān)控，準(zhǔn)確量化就成為臨床十分迫切的要求，這也是現(xiàn)階段體外診斷試劑生產(chǎn)廠家亟待突破的瓶頸。PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程：不同的PCR儀器、不同廠家的試劑、不同的操作者也是造成實(shí)驗(yàn)定量不準(zhǔn)確的重要指標(biāo)之一。

2.4 試劑缺乏穩(wěn)定性穩(wěn)定性是體外診斷試劑必須具有的基本屬性，是確保產(chǎn)品在使用過(guò)程中安全有效的重要指標(biāo)。通過(guò)對(duì)不同條件下產(chǎn)品的主要質(zhì)量指標(biāo)隨時(shí)間變化情況的檢測(cè)，可以為產(chǎn)品的保存條件和有效期的確定提供依據(jù)。而試劑方法的標(biāo)準(zhǔn)化以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用是保證實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的前提，在日常檢驗(yàn)工作中應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將極大地改善不同實(shí)驗(yàn)室間檢驗(yàn)結(jié)果的可比性，從而逐步實(shí)現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)室間檢驗(yàn)結(jié)果有條件的互認(rèn)。PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域的新契機(jī)

分子生物學(xué)發(fā)展至今，人類基因組的草圖早已繪就[6]，許多信號(hào)傳導(dǎo)通道也已闡明[7]，PCR技術(shù)已經(jīng)成為分子生物學(xué)十分便利的工具。然而談到與臨床檢驗(yàn)相結(jié)合，仍有許多待改進(jìn)的地方，未來(lái)的PCR臨床發(fā)展之路，需要更加緊密地結(jié)合臨床、體外診斷(IVD)基本要求和新材料、自動(dòng)化技術(shù)等研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)理論，并在產(chǎn)品設(shè)計(jì)、制造工藝上取得新的突破，只有這樣方能有效彌補(bǔ)目前PCR技術(shù)存在的缺陷，進(jìn)一步拓寬這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用空間。

3.1 標(biāo)準(zhǔn)化首先，PCR技術(shù)面臨的歷史任務(wù)是解決標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題。應(yīng)該說(shuō)，定量這一概念的提出為PCR標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程邁出了第一步，但這還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。標(biāo)準(zhǔn)化不僅意味著統(tǒng)一的量化形式，更重要的是建立固定、可重復(fù)的流程，嚴(yán)謹(jǐn)完備的質(zhì)量控制體系，一致且具可比性的評(píng)估方法。滿足這些條件，機(jī)器自動(dòng)化無(wú)疑是最好的選擇。

3.2 自動(dòng)化近2O年，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)以驚人的速度和規(guī)模獲得了巨大的發(fā)展，其中自動(dòng)化的迅速發(fā)展尤為迅猛，它將傳統(tǒng)的人工檢測(cè)手段提高到自動(dòng)化檢測(cè)的新水平，為精確、微量、快速和組合檢驗(yàn)提供了有力的保障，自動(dòng)化已成為臨床檢驗(yàn)的趨勢(shì)。PCR擴(kuò)增的自動(dòng)化早已實(shí)現(xiàn)，因而核酸提取純化的自動(dòng)化就顯得更為重要。近年來(lái)各儀器廠商紛紛推出磁珠法提取儀器，如Roche MagNA Pure LC，利用電磁效應(yīng)以及納米級(jí)的磁性顆粒進(jìn)行核酸的分離純化，其提取效率相比之前的自動(dòng)化系統(tǒng)有了明顯提高[8]。核酸提取純化與PCR擴(kuò)增聯(lián)為一體的自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)則是臨床診斷的趨勢(shì)，如Handy-Lab公司的Jaguar全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)。儀器的自動(dòng)化是臨床PCR標(biāo)準(zhǔn)化的最佳選擇，自動(dòng)化程度越高，標(biāo)準(zhǔn)化越容易實(shí)現(xiàn)。雖然目前這些儀器以及配套耗材的價(jià)格偏高，但并不影響各大醫(yī)院對(duì)這些新生技術(shù)平臺(tái)的接納。近年來(lái)，政府對(duì)重大傳染病(如乙肝、丙肝、結(jié)核等)項(xiàng)目予以資金上的支持，旨在加強(qiáng)這些重大傳染病的監(jiān)控與防治。目前這些儀器設(shè)備已進(jìn)入醫(yī)院和院方檢驗(yàn)的需求進(jìn)一步磨合，加上生產(chǎn)成本平攤之后，完全取代人工操作的情景必將成為現(xiàn)實(shí)。

3.3 高通量(1)絕對(duì)通量的提高。過(guò)去PCR 由于通量不高而一直受人詬病，不久前挪威公司DiaGenic聯(lián)合關(guān)國(guó)ABI公司開(kāi)發(fā)出類似普通生物芯片的Taqman微量液體反應(yīng)板，讓人們看到了PCR微型化并實(shí)現(xiàn)高通量的希望[9-10]。該儀器含有384孔獨(dú)立反應(yīng)體系，具有良好的靈敏度、特異性和寬泛的動(dòng)力學(xué)范圍。

在新的技術(shù)平臺(tái)下，精細(xì)繁瑣PCR加樣的工作將完全由儀器取代，精密度進(jìn)一步得到改善。另外，新的加樣方式進(jìn)一步微縮反應(yīng)體系，1塊普通的PCR反應(yīng)板便能同時(shí)進(jìn)行上萬(wàn)個(gè)反應(yīng)，1次即能檢遍人體內(nèi)的多種基因的表達(dá)情況。Abgene公司推出的水浴熱循環(huán)儀PCR一次可完成24塊板(96孔、384孔、1 536孔)的PCR，最大通量1次測(cè)序反應(yīng)可達(dá)到24×1 536=36 864個(gè)樣本，真正實(shí)現(xiàn)了儀器的高通量。(2)相對(duì)通量的提高。相比于那些體積大的高通量?jī)x器，臨床實(shí)驗(yàn)室更需要一些系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、體積小、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作、分析通量高的儀器。如ABI公司推出的StepOnePlus采用了獨(dú)特的的VerriFlexTM 加熱模塊，它具有6個(gè)獨(dú)立控制的peltier加熱塊，相當(dāng)于6臺(tái)PCR，為具有優(yōu)化得到的有不同的退火溫度的引物和探針的用戶提供了操作的靈活性。

3.4 PCR技術(shù)的發(fā)展擴(kuò)大了臨床應(yīng)用(1)應(yīng)用種類和范圍擴(kuò)展。受益于生物信息學(xué)迅速發(fā)展，PCR檢測(cè)的種類和范圍也在日漸擴(kuò)大，從一開(kāi)始純粹檢測(cè)人體中的感染源，到現(xiàn)在檢測(cè)各種基因的突變?nèi)笔В袛嗖≡w的耐藥性或人體對(duì)于某些疾病的易感性，從而實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥和治療[11]。目前已在遺傳病的產(chǎn)前篩查、致病病原體的檢測(cè)、癌基因的檢測(cè)和診斷、DNA指紋、個(gè)體識(shí)別、親子關(guān)系鑒別及法醫(yī)物證、動(dòng)植物檢疫等方面展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。(2)結(jié)合其他分子生物學(xué)技術(shù)擴(kuò)展。近十年來(lái)，PCR技術(shù)衍生出許多精細(xì)分支，它與免疫學(xué)方法、核酸雜交以及測(cè)序技術(shù)的結(jié)合大大豐富了分子生物學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域，目前眾多PCR衍生技術(shù)和相關(guān)技術(shù)已應(yīng)運(yùn)而生，并在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，如TaqMan MGB探針技術(shù)使得單純使用PCR技術(shù)對(duì)單個(gè)堿基的突變進(jìn)行檢測(cè)成為可能，在臨床上可以對(duì)疾病相關(guān)位點(diǎn)(如耐藥位點(diǎn))進(jìn)行檢測(cè)；PCR結(jié)合測(cè)序技術(shù)，測(cè)序技術(shù)是在產(chǎn)生PCR產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，一次能獲得更多的序列信息，被視為核酸序列研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”，特別適用于多個(gè)疾病相關(guān)位點(diǎn)的檢測(cè)(如乙肝病毒P區(qū)耐藥位點(diǎn)檢測(cè)、EGFR、KRAS等靶向藥物耐藥突變檢測(cè))；單堿基延伸技術(shù)(single base ex-tension，SBE)，該技術(shù)可對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，這是很多高通量SNP分型技術(shù)的基礎(chǔ)。高通量的SNP分型在臨床上適用于大量標(biāo)本的快速檢測(cè)，如在人群中篩查攜帶某個(gè)疾病相關(guān)位點(diǎn)的個(gè)體。高分辨熔解曲線技術(shù)(HRM)是在PCR體系中加入飽和熒光染料，通過(guò)控制體系的溫度變化，繪制PCR產(chǎn)物的溫度熔解曲線圖。依據(jù)雜合異源雙鏈的原理，不同的DNA雙鏈由于長(zhǎng)度、GC含量、錯(cuò)配性等存在差異而具有不同的溫度熔解曲線。該技術(shù)特別適用于那些無(wú)需確定突變位置和類型的快速篩查，如Kras基因12、13位密碼子的任一突變，若使用TaqMan，需要多個(gè)反應(yīng)檢測(cè)8種基因型，而HRM 只需要檢測(cè)野生型和非野生型。這些新技術(shù)的應(yīng)用極大地增強(qiáng)了PCR技術(shù)對(duì)于基因細(xì)小差別的分辨能力，將PCR技術(shù)精細(xì)化的應(yīng)用潛力提升到了一個(gè)新的層面。結(jié)語(yǔ)

盡管PCR技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域多年，但當(dāng)前仍被視為一種輔助的臨床診斷方法。不過(guò)隨著分子生物學(xué)理論的快速發(fā)展，PCR技術(shù)與新材料、自動(dòng)化科學(xué)的結(jié)合日益緊密，并融合新的工藝設(shè)計(jì)，逐漸凸顯出以標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化、高通量以及精細(xì)化為代表的幾大發(fā)展趨勢(shì)。這些因素不僅為將來(lái)的PCR診斷試劑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展預(yù)留了廣闊空間，而且指明了方向，同時(shí)對(duì)現(xiàn)有的PCR產(chǎn)品和產(chǎn)業(yè)格局提出了挑戰(zhàn)和變革要求。綜上所述，PCR技術(shù)以及相關(guān)產(chǎn)業(yè)即將在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域迎來(lái)全新的發(fā)展契機(jī)。

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第五篇：PCR技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用

PCR技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用

姓名

專業(yè)

翟揚(yáng)威 學(xué)號(hào) 11042106

食品科學(xué)與工程 班級(jí) 11-1

[摘要]: 如今食品營(yíng)養(yǎng)、安全問(wèn)題備受關(guān)注，是關(guān)系到人們健康和國(guó)家發(fā)展的重大課題，有關(guān)食品安全檢測(cè)的技術(shù)受到重視,其中 PCR技術(shù)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)以及快速準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)在食品檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛的認(rèn)可.現(xiàn)主要介紹一下PCR技術(shù)檢測(cè)食品微生物的優(yōu)點(diǎn)，且分析了PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用及一些新的PCR檢測(cè)技術(shù)，并說(shuō)明了這些技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]: 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR 食品檢測(cè) 微生物

近年來(lái)，PCR技術(shù)在食品工業(yè)中倍受重視，例如：基因克隆、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)、微生物檢測(cè)、食品成分及產(chǎn)地的檢測(cè)等，推進(jìn)了基因工程在食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

首先，我們得了解PCR技術(shù)是什么？作用原理是什么？

PCR即聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)，是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究 的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研 究和檢測(cè)鑒定。過(guò)去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時(shí)便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。

PCR技術(shù)的基本原理：該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來(lái)啟動(dòng)合成，通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此為起始點(diǎn)，沿模板5′→3′方向延伸，合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。

參加pcr反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、D-NTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則： ①引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。

PCR 技術(shù)檢測(cè)微生物的基本原理是在被檢測(cè)微生物核酸序列, 在PCR 體系下經(jīng)高溫變性、低溫退火、適溫延伸三步循環(huán)將單個(gè)核酸分子序列以2的指數(shù)進(jìn)行大量復(fù)制擴(kuò)增的過(guò)程。即在檢測(cè)時(shí), 被檢測(cè)微生物雙鏈DNA 序列在94℃變性解鏈成雙鏈, 55℃特異性引物與單鏈DNA 結(jié)合, 72℃在引物的引導(dǎo)延伸復(fù)制檢測(cè)微生物DNA 序列。以上三步進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增得到大量的被檢測(cè)微生物DNA 序列, 最后一般在凝膠電泳下檢測(cè)目的DNA。理論上只要樣品中有一個(gè)分子的微生物就可以在短時(shí)間內(nèi)用PCR 技術(shù)檢測(cè)到。食品中污染微生物種類很多, 即使是同一種食品中微生物種類也有很多, 用傳統(tǒng)的方法檢測(cè)食品中微生物要分離出所有的微生物很困難。特別是在檢測(cè)食品中的弱勢(shì)菌時(shí), 可能很難用傳統(tǒng)的方法檢測(cè)出來(lái), 特別是有些微生物很難培養(yǎng), 而用PCR 技術(shù)檢測(cè)這些微生物可以避免這些問(wèn)題, 因此, 利用PCR 技術(shù)能夠比較準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中微生物。

PCR技術(shù)在食品成分測(cè)定方面的應(yīng)用也倍受關(guān)注，如動(dòng)物源性成分的測(cè)定等。

近年來(lái)，瘋牛病、羊癢病及禽流感等疾病通過(guò)食品的傳播，由于食品安全性與質(zhì)量監(jiān)督的需要及宗教信仰等問(wèn)題，有必要對(duì)食品中的動(dòng)物源成分進(jìn)行檢測(cè)，僅靠傳統(tǒng)的外觀鑒別，無(wú)法準(zhǔn)確判定其實(shí)際成分。PCR 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物肉類的物種檢測(cè)與飼料中的動(dòng)物成分檢測(cè)。陳文炳[20]等，應(yīng)用了PCR技術(shù)檢測(cè)12種加工食品中豬、牛、羊、雞等動(dòng)物源性成分，并開(kāi)發(fā)了真核生物所共有的18S核糖體DNA(18S R-DNA)與食品中多種動(dòng)物物種特異性基因片段之間的二重PCR檢測(cè)方法，以提高檢測(cè)效率與準(zhǔn)確性，節(jié)約檢測(cè)成本。王麗媛[21]等，利用單重PCR和多重PCR對(duì)部分市售肉制品進(jìn)行檢測(cè)，以確定食品中是否含有動(dòng)物源性成分及其含量。此方法操作簡(jiǎn)便，快速準(zhǔn)確，節(jié)省費(fèi)用。植物源性成分的測(cè)定

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)產(chǎn)品出口大國(guó)，加入WTO后，隨著農(nóng)產(chǎn)品出口量的增加，國(guó)外對(duì)出口食品質(zhì)量的要求也隨之提高。為確保食品的品質(zhì)和安全，為我國(guó)食品的進(jìn)出口貿(mào)易嚴(yán)格把關(guān)，保證我國(guó)人民日常生活的食品安全和生命健康。因此，開(kāi)發(fā)出準(zhǔn)確方便的鑒定食品有效成分的方法，具有重大意義。陳文炳[22]等本研究以豆粉與豆奶粉中的大豆成分(內(nèi)源Lectin基因)、食品中的玉米(IVR 基因)、馬鈴薯(PATA基因)、番茄(PG基因)等成分以及真核生物中普遍存在的核糖體DNA(18S R-DNA)片段為研究對(duì)象，進(jìn)行單一與二重PCR擴(kuò)增，以擴(kuò)增產(chǎn)物作為分子標(biāo)記，建立加工食品中植物源性有效成分的分子生物學(xué)鑒定技術(shù)，為食品質(zhì)量與安全管理提供技術(shù)支持。

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