第一篇：分子生物學在醫學檢驗中的臨床應用及前景

分子生物學在醫學檢驗中的臨床應用及前景 班級：2013級科碩6班 專業：臨床檢驗診斷學 姓名：姜世濤

學號：20*** 評分： 導師簽名：

分子生物學是一門正在蓬勃發展的學科，新技術和應用條件的不斷出現，為檢驗醫學的發展提供了嶄新的時代并提供新的機遇和挑戰。分子生物學是以核酸、蛋白質等生物大分子為研究對象的學科，分子生物學技術即建立在核酸生化基礎上的一類研究手段，現已廣泛應用于醫學檢驗中，同時也逐漸滲入數理科學、結構基因組學、功能基因組學和環境基因組學，研究內容也從DNA鑒定、擴展到核酸及表達產物分析，技術不斷進步為微生物檢驗、腫瘤診斷及評估、遺傳病診斷、兔疫系統疾病診斷提供重要依據和創新思路。在結構基因組學、功能基因組學和環境基因組學蓬勃發展形勢下，分子診斷學技術將會取得突破性進展。一．利用分子生物學技術檢測樣品中核酸水平

PCR[1]技術是目前應用較廣泛和成熟的臨床檢測方法，在法醫學、常見傳染病、性病、寄生蟲和優生優育等領域有很高的應用價值，尤其對肝炎病毒的早期診斷。1．核酸分子雜交技術和基因芯片技術

核酸分子雜交技術也稱為基因探針技術，利用核酸的變性、復性和堿基互補配對的原理，用已知的探針序列檢測樣本中是否含有與之配對的核苷酸序列的技術，是印跡雜交、基因芯片等技術的基礎。目前基因芯片技術可廣泛應用在腫瘤基因表達譜差異研究、基因突變、基因測序、基因多態性分析、微生物篩選鑒定、遺傳病產前診斷等方面。另外，現已獲得一些微生物的全基因序列，包括百余種病毒，多種細菌(流感嗜血桿菌、產甲烷球菌及實驗室常用的大腸桿菌等)和一些酵母等。因此，將一種或多種病原微生物的全部或部分特異的保守序列集成在一塊基因芯片上，可快速、簡便地檢測出病原體，判斷侵入機體引起感染性疾病的病原微生物(病毒、細菌或寄生蟲等)，從而對疾病作出診斷及鑒別診斷。2．單核苷酸多態性分析(SNP)技術

在人群中，個體基因的核苷酸序列存在差異性，稱為基因多態性。基因多態性位點普遍存在于人的基因組中。如果在某個家庭中，某一致病基因與特定的多態性片段緊密連鎖，就可以用這一多態性片段作為一種”遺傳標記”來判斷家庭成員或胎兒是否攜帶有致病基因。目前認為基因多態性是個體的”身份證”，因此，基因多態性分析技術已經廣泛應用于群體遺傳學研究、疾病連鎖分析和關聯分析、疾病遺傳機制研究、腫瘤易感性研究、個性化用藥等諸多方面。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析技術為臨床檢測提供了依據。SNP是一種最常見的遺傳變異，在人類DNA多態性中，SNP約占90％。SNP是指在基因組內特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基。SNP與RFLP和STR等DNA標記的主要不同在于：它不再以”長度”的差異作為檢測手段，而是直接以序列的差異作為標記。由于SNP是二態的，易于自動化批量檢測，易于計算機分析結果，因此SNP檢測已廣泛地應用于疾病的連鎖分析及關聯分析、腫瘤的雜合性缺失研究、疾病遺傳機制研究、個性化用藥研究等諸多領域。盡管SNP檢測在搜尋疾病基因方面有潛在的價值，但實際應用中卻比人們想象的要難得多，它需要花費大量的時間進行篩查，才能建立可靠的SNP分析圖譜。3．microRNA是潛在的臨床診斷工具 microRNAs(miRNAs)是一類分布廣泛的小的非編碼蛋白質的RNAs，其功能是負調控基因表達。在正常組織中，miRNA轉錄，加工，結合到靶mRNA的互補位點，通過抑制蛋白翻譯或是改變mRNA的穩定性來抑制基因表達，維持細胞生長、增殖、分化和死亡的正常進行。不同miRNA的分布有組織特異性，因此在生理和病理條件下，miRNA的表達水平存在差異。成熟miRNA水平下降可能是由于miRNA生物合成的任何步驟的缺陷造成的，而這最終將導致不適當的miRNA的靶蛋白的表達。最后的結果可能導致過度增殖、侵入、凋亡的減少、不能正常分化或者去分化，引起腫瘤的形成。最近的證據表明，miRNA突變或者異位表達與多種人類癌癥相關，miRNAs可以起到腫瘤抑制基因或者癌基因的功能。目前已知的miRNA中，大約50％在基因組上定位于與腫瘤相關的脆性位點，這說明miRNAs在腫瘤發生過程中起了至關重要的作用。例如，mir-125b一1，線蟲lin一4的同源基因，在染色體的1lq24脆性位點，在很多乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宮癌病人中有缺失。若能確定多種腫瘤的miRNA表達譜特征庫，可以幫助診斷和治療腫瘤。由于miRNAs可以從福爾馬林固定的石蠟包埋的樣品中分離出來，這使得miRNA表達譜特征庫建立成為可能。在此基礎上，用特定的miRNAs表達差異圖譜，還可以用于預測病人的預后。另外從治療的角度，miRNA表達譜可能為臨床上確定一個治療方案提供一個強有力的工具。

二、蛋白組學技術在臨床檢驗中的應用 隨著生物體全基因組序列的解析，特別是人類基因組序列草圖的完成，基因組學研究重點不可避免地從結構基因組學轉向功能基因組學，因此在上世紀90年代中期，蛋白質組學正研究成為基礎研究的重要支柱。蛋白組學是在基因組學之后又一組學，其發展之迅速，是由于其能夠較為全面的考察蛋白層面的表達情況，有利于獲得各種蛋白、多肽因子等信息從而對相關機制進行更深入的研究[2]。蛋白質組學研究的是在不同時間和空間發揮功能的特定蛋白質群體，從而揭示和說明生命活動的基本規律。與基因組相比蛋白質組具有多樣性和可變性，雖然可以通過PCR、基因芯片等方法顯示生物體的基因水平，但mRNA水平(包括mRNA的種類和含量)并不能完全反映出蛋白質的表達。由此可見，對一個機體而言，基因的數目是恒定的，而蛋白質的種類和數目在生理和病理等不同條件下，其表達也不同。若能獲得與某種疾病相關的蛋白水平的差異表達信息，將為臨床診斷、治療和預后提供有力依據。1．蛋白質芯片技術蛋白質芯片技術是近年來蛋白質組學研究中興起的一種新的方法，它類似于基因芯片，是將蛋白質點到固相物質上，然后與要檢測的組織或細胞等進行”雜交”，再通過自動化儀器分析得出結果。這里所指的”雜交”是指蛋白與蛋白之間如(抗體與抗原)在空間構象上能特異性的相互識別。例如免疫芯片，是一種特殊的蛋白質芯片，它在臨床分子診斷學有著明顯的發展潛力，如腫瘤標志的檢測、不同激素的測定，自身免疫性疾病中多種自身抗體或抗原的檢測和超敏反應中多種過敏原的篩查等。

2．液體芯片飛行時間質譜技術在臨床檢測中的應用根據探針標記和色譜分析的原理，液體芯片飛行時間質譜主要由兩部分組成：磁珠部分即液體芯片部分；飛行時間質譜儀部分，用于獲取磁珠捕獲的蛋白質質量和含量，根據不同質荷比的蛋白質在長度一定的真空管中飛行所需時間不同，被測定的蛋白質以一系列波鋒的形式出現，并由此繪制出待測蛋白的質譜圖，可發現各樣本間的蛋白質表達和含量的異同。

液體芯片一飛行時間質譜技術利用磁珠俘獲腫瘤患者與健康對照體液中低豐度特異蛋白或多肽，經飛行時間質譜測定和軟件分析，建立由兩者差異表達蛋白或多肽組成的質譜圖模型，用于預測未知樣品的歸屬。液體芯片飛行時間質譜技術主要用于從復雜體液如血清、血漿、尿液、唾液或腦脊液、組織裂解液、細胞培養上清液中發現潛在的生物標志物。一方面，該技術能夠在生物液體中檢測指示特異疾病的生物標志物模式或生物標志物譜，另一方面，該技術還可以鑒定單個的生物標志物候選物。在哈佛大學女子醫院、紐約斯隆-凱特琳癌癥研究所、麻省總醫院、貝勒醫學院等世界一流醫院和醫學研究所中，該技術已廣泛應用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腦膠質瘤、頭頸鱗癌、膀胱癌等的早期診斷研究中。應用該技術可協助診斷多種遺傳性代謝紊亂疾病，如各種氨基酸代謝失常血癥，包括胱氨酸尿癥、瓜氨酸血癥、酪氨酸血癥、超苯丙氨酸血癥、精氨酸缺乏癥、精氨琥珀酸尿癥和各種超甲硫氨酸血癥；短鏈核長鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥、異戊酸血癥、丙酸血癥、甲基丙二酸血癥、戊二酸血癥和其他各種有機酸代謝失常疾病等。由于液體芯片飛行時間質譜技術具有準確度高、快速、高通量、靈敏度高、重復性好、分辨率高、檢測費用低等特點，是極具潛力的臨床腫瘤早期診斷工具。

三．分子生物芯片技術在醫學檢驗中的應用

隨著人類基因組計劃(HGP)的完成，蛋白質組計劃也已經啟動，基因序列數據、蛋白序列和功能數據以驚人的速度增長，而傳統的生物技術已經不能滿足數據倍增的要求，生命科學需要更快捷、更準確的自動化的生物技術，而生物芯片在這種情況下應運而生。生物芯片(biochip)的概念雖源于計算機芯片但不同于計算機芯片。狹義的生物芯片即微陣列芯片，主要包括cDNA微陣列、寡核昔酸微陣列、蛋白質微陣列和小分子化合物微陣列。分析的基本單位是在一定尺寸的基片(如硅片、玻璃、塑料等)表面以點陣方式固定的一系列可尋找的識別分子，點陣中每一個點都可視為一個傳感器的探頭。芯片表面固定的分子在一定的條件下與被檢測物進行反應，其結果利用化學熒光法、酶標法、同位素法或電化學法顯示，再用掃描儀等儀器記錄，最后通過專門的計算機軟件進行分析。而廣義的生物芯片是指能對生物成分或生物分子進行快速并行處理和分析的厘米見方的固體薄型器件。生物芯片技術是融微電子學、生物學、物理學、化學、計算機科學為一體的高度交叉的新技術，具有重大的基礎研究價值，又具有明顯的產業化前景。經過十多年發展，生物芯片技術已日臻完善，其應用前景非常廣闊，因其具有技術操作簡易、自動化程度高、檢測目的分子數量多、高通量等特點，為“基因組計劃”時期基因功能的研究及科學及醫學診斷學的發展提供了強有力的工具。在臨床檢驗醫學方面，生物芯片技術已經被應用于病毒、細茵的檢測自身兔疫性疾病的兔疫標志物的檢測。遺傳性疾病的檢測及腫瘤免疫標志物的單一檢測及其聯檢等方面。甘志遠等[3]通過呼吸道斑點試驗芯片法檢測呼吸道病毒抗體具有簡便快速、靈敏度和特異度高等優點，是臨床呼吸道病毒感染輔助診斷的有效方法。值得推廣使用生物芯片具有操作簡單、信息量大、節約試劑、減少誤差、診斷快速的特點。在臨床診斷、科學研究和流行病學篩選中具有廣泛的應用前景，它的的誕生也為人們提供了一種高通量、高效率的腫瘤學研究手段[4-6]。五．分子生物納米技術在醫學檢驗中的應用

1.納米科學技術是20世紀末期剛剛誕生并正在崛起的新科技。通過直接操縱和安排原子、分子創制新物質，納米技術與醫學相結合，促進了基礎醫學研究技術的完善、臨床診斷技術的革新及治療水平的提高[7]。通過應用納米技術，在DNA檢測時，檢測方法更加簡便、快速、準確。美國NASA Ames Center for Nanote Chnology與中南大學衛生部納米生物技術重點實驗室合作，將碳納米管用于基因芯片，樣本需要量低于1000個NDA分子（傳統DNA檢測的樣本需要量超過106個DNA分子）；需要的樣品量更少，可免去傳統的PcR擴增步驟；結果可靠、重復性好、操作簡單、易實現檢測自動化[8]。免疫分析加上磁性修飾已成功地用于各種生物活性物質和異生質，如藥物、致癌物等的檢測。將特異性抗體或抗原固定到納米磁球表面，并以酶、放射性同位素熒光染料或化學發光物質為基礎所產生的檢測與傳統微量滴定板技術相比具有簡單、快速和靈敏的特點。霍美俊等[9]利用抗體偶聯的靶向磁性納米顆粒，同時具有可在病毒感染的細胞周圍特異性富集和磁顆粒可在交變磁場下感應升溫的雙重功能，將其作為磁感應熱療的靶向介質，有望研制出病毒感染性疾病磁感應熱療的靶向介質。為尋求一條快速診斷EV71病毒感染的新方法，納米細胞分離技術的出現有助于解決生物醫學中快速獲取細胞標本的難題。應用納米免疫磁珠檢測早期肺癌患者循環血液中的腫瘤細胞，可監測肺癌的轉移情況。2.六．分子生物學技術在臨床檢測應用中的問題

疾病的發生是由于人體受內外因素的影響，導致機體細胞、組織或器官功能紊亂，歸根到底是核酸、蛋白等分子水平表達異常，由此可見，利用分子生物學技術進行臨床檢測是協助臨床診斷和治療的必不可少的工具。但由于分子生物學技術不僅對臨床樣品的處理有較高要求，而且對檢測人員的技術水平也有要求，這就涉及到從標本收集、處理、檢測和分析等多個環節的系統化和規范化，為此，我國已制定了臨床實驗室定量測定室內質量控制指南。

利用分子生物學技術進行臨床監測，在某些情況下可能存在一定困難，例如與核酸相比，蛋白和多肽作為生物標志的一個優勢是它們能夠很容易的在血液、尿液和其他生物體液中找到。這些類型的樣品很容易獲得，并代表了含有豐富的具有潛在信息的生物學信息分子。但從研究手段方面來說，蛋白質研究技術比核酸技術相對要復雜和困難，不僅氨基酸殘基數量多于核甘酸殘基，而且在蛋白質組研究中沒有一種方法象PCR那樣能迅速擴增目的片段，這樣對于豐度低但功能重要的蛋白質很難進行大規模的研究。miRNA雖然是新興的研究領域，但它們與疾病的相關性日益受到人們的重視，相信隨著基礎研究對miRNA不斷深入的認識，miRNA必將成為臨床檢測中的手段之一。七．參考文獻

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第二篇：分子生物學技術在醫學檢驗中的應用進展

分子生物學技術在醫學檢驗中的應用進展

[摘要] 分子生物學技術是醫學檢驗的重要診療手段。本文概述醫學檢驗中常用的分子生物學技術，列舉其在臨床病原微生物檢驗、腫瘤診斷及評估、遺傳病診斷、免疫系統疾病診斷中的具體應用，分析分子生物學技術應用中應注意的問題，并對發展趨勢進行預測。

[關鍵詞] 分子生物學技術；醫學檢驗；應用；

進展分子生物學是以核酸、蛋白質等生物大分子為研究對象的學科，分子生物學技術即建立在核酸生化基礎上的一類研究手段，現已廣泛應用于醫學檢驗中。研究內容也從DNA鑒定、擴展到核酸及表達產物分析，技術不斷進步為原微生物檢驗、腫瘤診斷及評估、遺傳病診斷、免疫系統疾病診斷提供重要依據和創新思路。現就分子生物學技術在醫學檢驗中的應用進展進行綜述，試分析應注意的問題及預測發展趨勢。

醫學檢驗中常用的分子生物學技術概述

分子生物學技術的核心是聚合酶鏈反應(PCR)，能在最短的時間內擴增。由此衍生出新PCR技術，如原位PCR技術、實時定量PCR、鏈置換擴增技術、LCR、NASBA、TAS等。此外，生物芯片技術、核酸探針技術、生物傳感器、SELEX技術、循環核酸分析技術都極大的完善了檢驗技術，直接解釋生命規律，在臨床診斷和治療中意義重大。

分子生物學技術在臨床中的具體應用

2.1 病原微生物檢驗 PCR和生物芯片技術用于病原微生物檢驗術與傳統的培養鑒定、免疫測定相比，其具有高的敏感性，較短的耗時和更廣的適用范圍[1]。PCR通過向反應管中加入特異性引物可同時鑒定出單種或多種病原體，即便存在大量死菌也能得到準確結果，不受混合標本和微生物生長時間的限制。生物芯片技術則以其更高的靈敏性和高效率，同時檢測出上百種病原微生物，可用于快速查找樣本的耐藥基因指導臨床用藥。

2.2 腫瘤及遺傳病診斷 研究證實腫瘤及遺傳病幾乎都存在著一定的基因缺陷，只要找到人體中與基因相互作用的結合點，從基因水平診斷就能準確診斷。通過基因芯片判定靶基因P53抑癌基因的突變，通過分子蛋白質組學、生物傳感器和流式細胞術診斷腫瘤特異性標志物。在遺傳病中，分子生物技術能識別患病家族基因存在的特定多態性，常用技術有DNA限制性片段長度多態性分析，單鏈構象多態性分析，熒光原位雜交染色體分析，酶基因調控和微陣列技術。

2.3 免疫系統疾病診斷 免疫系統疾病診斷關鍵是確定基因水平上的調控表達。如在人類免疫缺陷病毒的研究中，分子生物納米技術即以抗體為基礎，用免疫分析和磁性修飾的方法來檢測免疫物質，通過酶、熒光劑、同位素把特異的抗體抗原與納米磁性微球固定，既能自動檢測人免疫缺陷病毒1型和2型抗體，為人類防治病毒性疾病提供了有力的武器。

分子生物學技術在檢驗應用的新進展

現階段分子生物學新技術的發展方興未艾，給人們提供了探索人類生命科學的工具，推動了檢驗學發展。分子生物技術最顯著的醫學成就是對遺產病中的致病基因的準確定位及克隆，早在1998年就完成了遺傳性耳聾的基因克隆；2003年SARS肆虐時，科學家就研制出專門診斷該病的基因芯片；2004年后實現了用多重PCR技術對我國新生兒多發的地中海貧血、苯丙酮尿癥、G6DP缺乏癥的產前和病例診斷；近年來，遺傳標記技術的進步，結合現有分子學研究技術，加速了遺傳基因圖譜的制作和相關疾病的基因檢測和鑒定，從而為醫學檢驗的加速發展提供了有效的載體。

存在問題及發展趨勢

現階段面臨的問題主要是技術相對復雜和儀器要求太高、藥品和反應盒昂貴等[2]，限制了臨床推廣。首先，合理選用檢驗項目的問題，分子生物學方法具有高特異性和高靈敏性，但臨床中仍要根據實際需要選用經濟合理的檢驗項目，如結核菌培養和涂片鏡檢就能達到目的，不必舍廉選貴，增加患者負擔。其次，疾病診斷過度依賴檢驗結果問題，應將臨床資料綜合考慮，不能僅靠分子生物學技術檢驗結果就妄下診斷，忽略標本取樣和檢驗過程中的操作不當及病程發展規律造成的假陽性或是假陰性，貽誤病情。再者，上級部門管理不足問題，國家相關部門要擔任監管的職責，參考國際慣例，制定符合我國醫學檢驗現狀的實驗操作管理規章制度，嚴格培訓檢驗人員，規范試劑的準入和儀器的管理，最大程度保證檢驗結果的可信度。

雖然分子生物技術在臨床推廣應用中存在著許多尚待解決的問題，但是它仍然顯現出了快速發展的趨勢。未來其發展會傾向于：①現有、僅停留在實驗室的分子生物學技術逐步向臨床實用型改進，降低實驗投入、簡化操作步驟，推進實驗過程全自動化的實施降低人為因素對結果的影響，根據臨床實際修正技術，提高檢驗的特異性和敏感性。②積極推進實驗室建設，加大儀器和檢驗人員的培訓投入，為分子生物學的臨床應用提供必要的基礎保障，以先進的、可持續性的實驗檢驗手段為臨床提供可靠的依據。

參考文獻

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王耿新 劉德亮 王志群 陳獻業

山東省青島市腫瘤醫院 青島 266042

聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）又稱體外基因擴增技術或 DNA 擴增技術。自 1985 年美國 PE-Cetus 公司的 K.B Mullis 等人首創了 PCR 技術之后，它以相當驚人的速度被廣泛地應用于醫學及分子生物學等各個領域。現今，PCR 技術已成為一種對標本中特定的 DNA 片段進行分析研究和檢測鑒定的重要方法。近20 年來 PCR 技術在生物醫學等各個研究領域和臨床應用中發揮了重大的作用，在病原體鑒定、遺傳病診斷、免疫學研究、癌基因探索及治療等方面都作出了相應的貢獻。

1.PCR 技術的基本原理與特點 [1-2]

PCR 技術的基本原理是模仿 DNA 體內復制的機制，在體外進行擴增特異的 DNA 片段。它主要是由三個基本步驟組成的循環反應。首先是變性，用加熱的方法使雙鏈 DNA 解鏈成兩股單鏈；其次是復性，用降溫的辦法使這兩股單鏈按堿基互補的原則分別與加入的兩條人工合成的寡聚核苷酸鏈（引物）結合成雙鏈；最后是延伸，在合適的緩沖液、鎂離子及脫氧核苷酸存在的條件下，用 DNA 聚合酶進行催化，按堿基配對的原則合成互補鏈。引物從 3 '端進行延伸，合成的方向為 5 '端（一條人工合成的引物）至 3 '端，從而合成與模板 DNA 結構相同的片段。重復上述三步驟，變性→復性→引物延伸的過程，經過約 30 個周期的循環（每三個步驟為一周期，約需 2-3 分鐘），1-2 小時就能將所需基因擴增幾百萬倍，使極微量的所需 DNA 達到極易檢測的水平。其擴增效率公式為： Y=（1+X）n，式中 Y 為擴增數目，X 為放大效率，n 為循環次數。

PCR 技術具有敏感性高、特異性強、操作簡便、快速省時等特點。其靈敏度可達到 Pg 級，甚至達到 fg 級 [3] 水平，而被擴增的基因片段能與原基因片段保持不變。PCR 技術操作簡便、快速而易掌握，并且對標本要求不高。用過去的方法完成一項試驗少則幾周，多則幾個月。應用全自動 DNA 擴增儀，整個 PCR 過程均由電腦控制，只需數小時即可完成整個試驗過程，用極微量的粗制標本就可獲取目的產物。

2.常用的幾種 PCR 及主要用途 [4-5]

2.1 定量 PCR ：用于 mRNA 定量及轉錄水平的研究。

2.2 抗原捕獲 PCR（AC-PCR）：用于病毒感染的檢測。

2.3 不對稱 PCR（Asymmetric PCR）：用于制備探針或測序。

2.4 彩色 PCR（CCA-PCR）“用于檢測某些多型別病毒的混合感染。

2.5 原位逆轉錄 PCR（In Situ RT-PCR）：定位檢測細胞中 RNA 病毒感染。

2.6 逆轉錄 PCR（RT-PCR）：用于克隆 cDNA、檢測 RNA 病毒、cDNA 探針。

2.7 反向 PCR（inverted PCR）：用于擴增已知基因片段兩側的未知序列。

2.8 膜 PCR（membrane-bound PCR）：可去除污染的雜質或 PCR 產物殘留，檢測低豐度靶 DNA。

2.9 間接原位 PCR（Indirect In Situ PCR）：定位檢測細胞中 DNA 病毒感染，是目前應用較廣泛的一種原位 PCR 技術，其特異性比直接 PCR 強。

3.PCR 技術在醫學檢驗中的地位

現代醫學研究證明，人類疾病多數是直接或間接與基因有關 [6]，如腫瘤、糖尿病和心血管疾病等。在醫學實驗診斷中我們經歷了生化和免疫診斷的發展過程，由于各類擴增技術的出現使我們進入了基因診斷的新時代并成就了現代意義基因診斷的崛起。這將改變以往對疾病的表型認識和表型診斷，從本質上認識疾病和診斷疾病。在各類擴增技術中，PCR 的地位尤為突出。目前，全世界利用 PCR 技術診斷感染性疾病每年達幾千萬人次，其費用早已大幅下降，說明 PCR 有著巨大的潛在市場。美國臨床檢驗標準化委員會于 1995 年頒布了關于感染性疾病分子診斷應用范圍、條件和質量控制細則等準則文件 [7]。而國際臨床化學學會于 1998 年又發布了關于分子擴增在臨床診斷中應用的質量評估基礎的文件并對 PCR 操作的各個環節進行了詳細論述 [8]。由此可見，兩個權威性文件也都肯定了 PCR 技術在醫學檢驗方面的重要性。基因診斷可能將是以后的發展方向并作為疾病的常規診斷技術。

4.PCR 技術在醫學檢驗中的應用

4.1 PCR 技術在腫瘤方面的應用

目前，腫瘤發病的分子機制尚不完全清楚。研究表明，人類許多常見的腫瘤疾病與某些病毒病因及腫瘤相關基因的遺傳學改變有著密切的關系。PCR 技術的腫瘤病毒病因、腫瘤相關基因、腫瘤相關抑癌基因等研究方面已取得可喜成果。

據有關資料表明 [1，4] 前列腺癌、結腸癌和 Kaposi 肉瘤等與人巨細胞病毒（CMV）有關；鼻咽癌和 Burkitt 淋巴瘤與 EB 病毒有關；原發性肝癌與乙型肝炎病毒（HBV）有關；泌尿道腫瘤和食道腫瘤等與人乳頭瘤病毒（HPV）有關。人類腫瘤病毒病因中較為重要的一類病毒是 HPV，其中大部分只與良性增生有關，只有 16、18、31、35、39 等十余型與惡性腫瘤關系密切。PCR 在檢測 HPV，尤其是第 16、18 型有無感染，對子宮頸癌的早期診斷及預防有著顯著的意義。

目前，已知腫瘤相關基因有上百多種，但較常見的是 ras 家族的 H-ras、K-ras 和 N-ras 三種癌基因。它們的結構相似，其表達產物是 P21 蛋白。在不同腫瘤中 ras 家族癌基因的 H-ras、K-ras 點突變多集中在第 12 和 61 號密碼子上，而 N-ras 在第 13 號密碼子上多發生突變。PCR 在癌基因的研究方面主要是 ras 基因與腫瘤的關系。現已查明與 ras 基因突變有關 [1，2，4，9，10] 的腫瘤有幾十種。如：各種急性慢性白血病、精原細胞癌、惡性黑色素瘤、神經母細胞瘤、卵巢癌、胰腺病、肺癌、膀胱癌、結腸癌、子宮瘤等。Rb 基因 [11] 是人類最早（1986 年）發現的抑癌基因，其后又相繼發現了 P53、WT1、NF1、DCC、MCC、APC、P16 和 P21 等抑癌基因。在遺傳性視網膜母細胞瘤研究中發現位于 13 號染色體上 Rb 基因的缺失與癌變有關。在許多常見腫瘤，如骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等惡性腫瘤中，常發現該基因失活 [11]。在對 P53 基因的研究中 [12-14] 發現該基因的突變和缺失是許多腫瘤發生的原因，這些腫瘤主要有子宮頸癌、肝癌、成骨肉瘤等。遺傳學改變主要是引起癌基因激活和抑癌基因的失活，使基因發生突變、缺失、增加和易位等而導致了細胞癌變。PCR 不但能有效地檢測基因的突變、重排、易位等，而且能準確檢測癌基因表達量，可據此進行腫瘤早期診斷、鑒別、分型、分期、治療及預后評估等。

近年，剛興起的熒光定量逆轉錄（RT）-PCR [10] 在腫瘤診斷、治療和微轉移以及微小殘留病灶檢測等方面具有廣泛的應用價值。研究表明，癌細胞或癌前期細胞在進入血液循環以后，通過定量 RT-PCR 檢測外周血腫瘤特異性標志物 mRNA，可進行實體腫瘤的篩查，檢測腫瘤術后及淋巴轉移陰性的病人外周血腫瘤細胞的數量，以便估計腫瘤的復發和轉移，制訂合理的治療方案。另外，定量 RT-PCR 還可用于腫瘤耐藥基因（MDR1）[10] 表達水平檢測，為臨床篩選化療藥物及治療方法提供依據。

4.2 PCR 技術在遺傳病方面的應用

PCR 技術首次臨床應用 [10] 就是從檢測鐮狀細胞和 β-地中海貧血的基因突變開始的。十幾年來，該技術在遺傳病診斷的臨床應用方面獲得了極大的成功。它能用于檢測已知基因序列的任何遺傳病基因的突變，如倒位、缺失 / 插入、動態突變、部分高發的點突變及表達量的異常等都可通過基因分析直接檢測用于臨床進行診斷，像地中海貧血、血友病、杜氏肌營養不良癥、脆 X 綜合征、苯丙酮尿癥等這些遺傳性疾病。PCR 在遺傳病診斷及遺傳病預防與產前基因診斷方面具有明顯的應用價值，PCR 產物直接測序已成為檢測遺傳病基因突變的常用方法。另外，PCR 在鑒定編碼抗生素耐藥性基因 [10]，尤其是在細菌不攜帶同源性序列且取單個菌落進行 PCR 擴增時，具有較高的特異性和敏感性。

4.3 PCR 技術在感染性疾病方面的應用 目前 PCR 在醫學檢驗中對感染性疾病的診斷 [10，15] 極具突出，只要核酸序列是清楚的，就可以檢測到任何有限的病原體。一般實驗室可檢出 10-100 個基因拷貝，而目前，病原體抗原檢測方法一般需要 10 5 ～ 10 7 個病原體才能檢測到。PCR 技術的運用解決了免疫學檢測的“窗口期”問題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態。再者，抗體檢測不能判定是現癥感染還是既往感染時，也需要用 PCR 方法來確定。另外，病原體感染后的發病時間和病情輕重均與病原體數量有關。如艾滋病（AIDS）由人免疫缺陷病毒（HIV）感染后，可根據 HIV 檢測的含量預知發病的時間。因為 AIDS 潛伏期的長短和臨床癥狀的輕重與血液中的病毒量呈顯著相關。在其它病毒性疾病中也多半存在類似情況，這均需 PCR 來定量說明。

PCR 在 HBV 定量研究中表明，HBV 載量與肝炎的發生、發展、預后以及與藥物療效有關，并證明定量 PCR 是鑒別 HBV 感染各期的良好工具。該技術能有效地確定血清 HBeAg 轉陰和非活動性攜帶者病人的 HBV DNA 水平，而常規雜交法則對這些低病毒血癥的 HBV DNA 探測不到。在抗病毒治療中，通過定量 PCR 檢測 HBV 的載量，來觀察拉咪呋啶及多種聯合用藥治療慢性乙型肝炎的療效具有指導意義。

PCR 對某些傳染性疾病疫苗接種后感染的鑒別也是極為重要的。例如：腮腺炎病毒疫苗接種后感染的病例時有發生，是疫苗引起的還是野生型腮腺炎病毒引起的，這就需要一種行之有效的方法來進行鑒別，以往的血清學、病毒培養及探針雜交等方法都很難做到。

過去，對結核病等其他分支桿菌病的診斷方法雖然很多，但均不夠理想。簡便易行的方法經常查不到抗酸桿菌，也無法鑒別結核桿菌與其他分支桿菌。用分支桿菌培養的方法且陽性率較低又耗時，而麻風桿菌在體外又不能培養，主要靠感染組織的涂片或切片鏡檢。其他方法，如血清學、氣相色譜等方法的敏感性及特異性都不夠理想，PCR 技術的運用使上述問題得到了解決。還有 PCR 技術在技術性病監控和性病病原體的檢測方面也正在擴大，并列為監控手段和作為檢測的金標準。

5.PCR 技術在醫學檢驗應用中的問題 5.1 假陽性

通常 PCR 在醫學檢驗應用中所面臨的問題之一是擴增產物污染帶來的假陽性，而實驗室污染又是假陽性的主要因素。只要實驗室被擴增產物污染，擴增片段隨時都可能污染新的樣本并又被同一 PCR 反應體系擴增出來而產生假陽性。解決的根本措施就是在封閉狀態下進行擴增和產物分析。近年發展了一種熒光定量 PCR 技術，從根本上解決了 PCR 擴增產物污染和不能定量的問題。該技術把基因擴增 PCR、分子雜交和光化學融為一體，實現了對 PCR 擴增產物進行全過程的封閉，并進行實時動態檢測和自動分析結果，進一步提高了其特異性。由于造成假陽性的因素相對單一，因此假陽性并不是困惑檢驗工作的主要原因。

5.2 假陰性

PCR 假陰性的原因相對較為復雜，主要包括有儀器設備的質量、試劑開殼劑和操作問題、PCR 產物的電泳檢測時間及有關 PCR 反應的關鍵環節等。PCR 儀本身的質量問題能使擴增效率下降或造成非特異性擴增而出現假陰性或假陽性。離心機的質量問題或使用不正確，可造成離心標本模板不能分離而產生假陰性。試劑開殼劑和操作問題造成標本 DNA 沒有暴露出來，致使擴增無法進行而導致假陰性。PCR 產物的電泳檢測時間一般為 48h 以內，大于 48h 后帶型不規則甚致消失不出現擴增條帶而程現假陰性。PCR 反應的關鍵環節有模板核酸的制備、引物的質量與特異性、酶的質量及 PCR 循環條件等，在這些環節中操作不當都可引起假陰性。另外，Mg 2+ 濃度和物理因素變性等對 PCR 擴增效率影響也很大。Mg 2+ 濃度過高可降低 PCR 擴增的特異性，濃度過低則影響 PCR 擴增產量。而變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低異性擴增效率；退火溫度過高，影響引物與模板的結合而降低 PCR 擴增效率，最終都可導致 PCR 擴增失敗。還有靶序列變異使引物與模板失去互補序列，其 PCR 擴增也不會成功。

6.PCR 技術的應用前景 自從 PCR 技術誕生以來，隨著其深入不斷的發展與完善，許多與其相關的新類型及改良的新方法在不斷的涌現，這些派生出的新類型和新方法解決了以往傳統 PCR 的瓶頸問題。雖然，PCR 可對基因分析直接檢測用于臨床進行診斷，但大部分基因突變還是難以直接檢測。近年來，分子診斷技術最大突破就是集擴增、檢測和靶定量于一體的實時熒光 PCR 技術的問世。該技術的出現，對基因檢測和基因分型的應用范圍將進一步擴大，為 PCR 的臨床應用帶來曙光。因此，PCR 技術將有極大的發展空間和廣泛的應用前景，它將對腫瘤學、遺傳學、免疫學、微生物學、寄生蟲學和基因治療等進一步研究及臨床應用起著積極重要的作用。在現代醫學檢驗中，PCR 的應用將更加廣泛和深入。相信在不久的將來，隨著 PCR 技術的更進一步完善，它將作為常規檢驗方法進行全面普及，發揮更大的作用，為全人類健康做出更大的貢獻。

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第三篇：分子生物學在微生物檢驗中的應用(精)

分子生物學在微生物檢驗中的應用

南京軍區福州總醫院全軍臨床檢驗研究所

蘭小鵬 世紀是以分子生物學為代表的生命科學的時代，近年來,隨著現代生物技術的快速發展,人類基因組計劃的完成,尤其是生物化學、免疫學、生物儀器及計算機理論與技術的進步，分子生物學技術在醫學、遺傳學、法醫學、生物學等各個領域廣泛應用, 新的診斷技術和方法不斷涌現并被廣泛應用于微生物檢測，為傳染病的流行病學調查、基因的多樣性、微生物的生物學特性、微生物的致病性和藥物的耐受性、微生物的生物降解能力等各個方面提供了重要的信息。一．核酸雜交法

最初應用于微生物檢測的分子生物學技術是基因探針方法,它是用帶有同位素標記或非同位素標記的DNA 或RNA 片段來檢測樣本中某一特定微生物核苷酸的方法。核酸雜交有原位雜交、打點雜交、斑點雜交、Sorthern雜交、Northern雜交等,核酸分子探針又可根據它們的來源和性質分為DNA探針、cDNA探針、RNA探針及人工合成的寡聚核苷酸探針等。其原理是通過標記根據病原體核酸片段制備的探針與病原體核酸片段雜交,觀察是否產生特異的雜交信號。核酸探針技術具有特異性好、敏感性高、診斷速度快、操作較為簡便等特點。目前,已建立了多種病原體的核酸雜交檢測方法,尤其是近年來發展起來的熒光原位雜交技術(FISH)更為常用。二．質粒DNA圖譜分型技術

細菌質粒分析是較早被使用的對病原微生物流行病學進行調查的分子分型技術。這種技術包括萃取質粒DNA ,通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA。由于不同菌株質粒DNA序列和大小不同,通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到的DNA質粒圖譜也將不同,因此,與流行病相關的分離株能夠被分類分型。質粒圖譜分析的再現性和分辨力可通過限制性內切酶消化質粒而提高。雖然2個不相關質粒有相同的分子量, 但性內切酶位點的位置和頻率是不同的。但質粒是可移動的非染色體遺傳物質,細菌能自發的失去或很容易的獲得,結果流行病相關的菌株可以展示不同質粒指紋圖譜。許多質粒帶有抗性決定因子的基因,存在于轉位子上,而轉位子很容易丟失或獲得,這同樣可以迅速改變質粒DNA組成。產生圖譜的再現性也會由于質粒空間存在的不一致性(超螺旋的、斷口的和線形的)而被影響,而凝膠電泳時具有不同遷移速度。大多數病原微生物有質粒,但沒有質粒的就不能用此技術分型。此外,由于有些分離株中含有1個或2個質粒,會使菌株間的分辨力降低。三染色體DNA 限制性內切酶分析技術

染色體DNA經限制性核酸內切酶消化,消化后的片段再通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離。用限制性內切核酸酶BglⅡ和EcoRI等消化病原微生物基因組DNA可以產生大量短的片段。電泳后,將獲得一系列被分離的DNA圖譜。通過比較圖譜,就可以進行菌相似性研究。幾乎所有的病原微生物分離株都可以通過這種方法分型,但由于基因組DNA巨大,酶切后產生的片段眾多,且含有大量的重疊片段,這將導致菌株間圖譜一致性分析產生困難。但若細菌只含一個或少量核糖體操縱子, 則只產生1～ 2條帶, 這限制區分密切相關菌株的能力。RFLP分析分辨力低于脈沖場凝膠電泳分型技術（PFGE）, 且比較復雜圖譜(數百條帶)的難度較大。四．DNA 的脈沖場凝膠電泳分型技術

脈沖場凝膠電泳分型技術（PFGE）是使用對染色體有很少酶切位點的限制性核酸內切酶消化細菌DNA ,產生大的DNA片段(10～800 kb),這些大片段不能通過常規電泳方法進行有效分離。在電場方向周期改變(脈沖)的凝膠電泳條件下,DNA片段根據大小有效分離。PFGE產生的染色體DNA圖譜比用那些高頻率切割的限制性內切酶產生的圖譜更為簡單清晰。理論上,所有的細菌都能使用PFGE 進行分型分類,結果具有極高的再現性和分辨率, 常作為分子生物學分型方法的“金標準”使用。PFGE 也有一些局限,例如所需時間長,使用的試劑非常昂貴,要求專門的儀器等。另外,很小的電泳條件的不同就可以改變每條光譜帶間距離,使用不同凝膠進行電泳得到的結果也比較復雜,這為不同實驗室間的結果比較帶來一定麻煩。五．聚合酶鏈反應技術

聚合酶鏈反應(PCR)技術自1985年發明以來,因其高度靈敏性和良好的特異性受到了人們的高度重視,各種各樣以PCR 為基礎的DNA序列的擴增和檢測方法得到了迅猛發展,幾乎已應用于基礎研究的各個領域。各種衍生技術如反轉錄PCR(RTR)、多重PCR、巢式PCR、PCR單鏈構象多態性(PCRSSCP)、限制性片段長度多態性（RFLP）、隨機擴增的多態性DNA 技術(RAPD)和重復序列PCR技術(Rep-PCR)、熒光定量PCR等。其中定量PCR 既可以用于臨床感染性疾病的診斷,又可用于監測其療效，PCR及其衍生的技術近年來在病原微生物分型研究上得到了廣泛應用。

1.隨機擴增的多態性DNA 技術

隨機擴增的多態性DNA 技術（RAPD）是一種典型PCR衍生技術, 在低復性溫度下用短任意序列引物(10～15m ers)擴增有密切同源性的基因組DNA序列, 模板上任意引物雜交點的數目和位置因種的不同株而異, 理論上特定株形成特定圖譜。基因組在這些雜交區段如發生了DNA片段缺失、插入或堿基突變,就可能導致這些特定結合位點分布發生相應的變化。通過電泳對擴增產物DNA片段的多態性進行檢測、分析就可以反應出不同菌株基因組的DNA特點,從而對他們進行分型，RAPD是目前最簡單的DNA分型方法, 分辨力高于RFLP, 但低于Rep－PCR，RAPD技術的使用范圍也非常廣,分辨結果也有較好的實驗室再現性。雖然RAPD技術簡單、快速, 但由于其對引物和DNA濃度、DNA模板質量、凝膠電泳和DNA聚合酶類型的變化高度敏感, 故RAPD的重復性不夠理想。雖然RAPD的分型結果在不同實驗室間變化較大,分辨力不如PFGE技術,但在疾病暴發流行時,PAPD仍是一種分析相關菌株和排除不相關菌株的良好技術。2.重復序列PCR技術

重復序列PCR技術（Rep－PCR是利用細菌基因組中廣泛分布的短重復序列為引物靶序列,進行PCR擴增,通過對PCR產物電泳結果的比較,分析菌株間基因組存在的差異。這些重復序列在原核生物界廣泛存在,在一些細菌屬和種中是保守的。在這種方式獲得的圖譜中,光譜帶的大小和數量的不同代表著不同菌株重復序列間的距離和重復序列的數量。已成功地用于分型的細菌重復DNA序列有腸道菌重復基因間共有(ERIC)序列、重復基因外回紋序列(REP)和BOX序列的分析，與其他分類技術相比,這種技術有更高的分辨力。研究表明,雖然有時Rep-PCR分辨力稍低,但與PFGE獲得的結果卻有很好的相關性。3.免疫PCR 免疫PCR(immuno polymerase chain reaction ,IM PCR)是1992 年Sano 等建立的一種檢測微量抗原的高靈敏度技術。該技術把抗原抗體反應的高特異性和聚合酶鏈反應的高敏感性有機結合在一起,它的基本原理是用一段已知DNA分子標記抗體作為探針,用此探針與待測抗原反應, 用PCR擴增粘附在抗原抗體復合物上的這段DNA分子,電泳定性,根據特異性PCR產物的有無,來判斷待測抗原是否存在。目前,國內外報道的免疫PCR的敏感性一般比現行的ELISA 法高102 ～105 倍。由于PCR產物在抗原量未達到飽和前與抗原抗體復合物的量成正比,因此免疫PCR 還可用于抗原的半定量試驗。

PCR－ELISA是PCR與ELISA技術結合的檢測方法，其綜合了PCR、分子雜交和ELISA三種技術的優點，主要用于檢測樣品中的特定基因。它引入地高辛(或生物素)標記的dNTP或引物進行PCR擴增,利用酶標抗地高辛抗體(或酶標記親和素)進行ELISA檢測,代替了用于常規PCR產物檢測的電泳方法,方便快捷,易于處理大量樣品,且其靈敏度比使用瓊脂糖凝膠電泳檢測方法高100倍,當有適當的標準品時,還可進行定量測定。六．DNA 序列測定

與檢測全染色體的PFGE、Rep－PCR和RAPD分析相比,DNA測序只檢測細菌或真菌株間潛在變化序列的很小一部分。用于辨別菌株的被測序DNA區域必須滿足以下條件:DNA區的結構必須是可變序列，兩側為高度保守區;DNA序列的可變性必須能足以區分特定種的不同株;DNA序列不能水平轉移到其它株。對細菌和真菌, 極少序列滿足這些條件。相反,DNA測序被認為是病毒分型的 “金標準”。DNA測序費用高、需要很高的技術條件, 而且自動化DNA 測序儀十分昂貴。

七．基于16SrRNA的檢測技術

自Woese 等于1987年首次運用rRNA分析以來,rRNA數據庫快速擴大起來,成為研究細菌多樣性、進化、系統發育中被廣泛采用的序列。16SrRNA存在于所有原核生物細胞中,它們相對穩定且有較高的拷貝數(每個細胞幾千個拷貝),其序列中含可變區及高度保守區,因此可設計群、屬、種特異性的探針。現階段各種常見細菌的16SrRNA基因幾乎全部測序完成,16S rRNA編碼基因的這些特點使之成為較理想的細菌基因分類的靶序列,逐漸成為細菌鑒定、分類的“金標準”。目前, 16SrRNA 檢測技術已在醫學界得到廣泛應用,可以用現有病原菌標準菌株制作DGGE(變性梯度凝膠電泳)標準marker , 然后對疑似“病原菌”擴增16SrRNA進行DGGE分析,這樣可以做到快速檢測。八．生物芯片

生物芯片技術是將生物大分子,如寡核苷酸、cDNA、基因組DNA、肽、抗原以及抗體等固定在諸如硅片、玻璃片、塑料片、凝膠和尼龍膜等固相介質上形成生物分子點陣,當待測樣品中的生物分子與生物芯片的探針分子發生雜交或相互作用后,利用激光共聚焦顯微掃描儀對雜交信號進行檢測和分析。微生物檢測基因芯片是指用來檢測樣品中是否含有微生物目的核酸片段的芯片。基于高通量、微型化和平行分析的特點,微生物檢測基因芯片在微生物病原體檢測、種類鑒定、功能基因檢測、基因分型、突變檢測、基因組監測等研究領域中發揮著越來越重要的作用。目前,許多細菌、病毒等病原體的基因組測序已經完成,將許多代表各種微生物的特殊基因制成1張芯片,經反轉錄就可檢測樣本中有無病原體基因的表達及表達水平,由此判斷病人感染病原、感染進程以及宿主反應等。這樣就大大提高了檢測效率。基因芯片診斷病原菌的原理基于細菌的16SrRNA基因的高度保守性,由于RNA易于降解,因此多采用檢測16SrRNA 所對應染色體上的16SrDNA序列。對16SrDNA而言,如果出現3 個堿基以上的差異就可以斷定細菌不屬于同一種屬,因此可用于細菌的分類和鑒別。對病毒和耐藥性病原菌的檢測是通過將待測的特定基因(病毒特異性基因和耐藥基因)經體外轉錄、PCR、逆轉錄、末端標記等處理成標記有熒光分子的核酸分子,然后與芯片上的探針進行雜交,用計算機對雜交信號進行處理,依信號和強度即可得出核酸含量。

液態芯片（Suspension Array Technology，SAT），又稱微球蛋白芯片（Protein Bead arrays，PBA），是近年來出現的一種新的芯片技術，也是唯一被美國食品和藥品監督管理局（FDA）批準的用于臨床診斷的生物芯片。其原理是用兩種熒光染料按照不同比例將直徑為5.6um的微球（beads/microfluorospheres）染成100種染色，每種顏色的微球共價結合一種生物探針，可以是抗原、抗體、配體，也可以是核酸或酶，分別針對一種待檢物。混合載有100種不同顏色的微球，就可以在一個反應孔里同時完成100種不同的生物反應。隨后微球成單列通過兩束激光照射的管道，計算機采集并處理每種顏色微球的熒光強度變化就可以分別對每個待測物進行定性或定量的檢測，該系統可用于多種微生物抗原、抗體和特定基因的聯合檢測，與固態芯片相比，液態芯片在反應動力學、反應速度、檢測敏感性、穩定性以及自動化程度方面都有較大的優越性，因此不少學者看好液態芯片的應用前景。九．生物傳感器

生物傳感器是將新興的傳感器技術和分子診斷技術相結合而成的一種新技術,是現代臨床檢驗診斷發展的一個新方向。由于生物傳感器檢測準確、操作簡便等特點,近年來已經在許多領域取得了很大的進展,在生物分子相互作用、藥物篩選、臨床診斷、食物檢測等領域獲得了廣泛的應用，其中臨床中用于病原體檢測的以DNA生物傳感器最為常見。盡管生物傳感器作為一種新的傳感元件近年來得到了很大的發展,許多光化學、電化學以及壓電晶體都相繼在生物傳感器中得到應用。與常規的核酸和蛋白質檢測相比,具有檢測準確、操作簡單等特點,但由于它存在靈敏度不夠、容易受雜質干擾等缺點,隨著研究的進一步深化和技術方法的改進,這些問題將會得到解決。

十.蛋白質指紋圖譜技術 蛋白質指紋圖譜技術是隨著蛋白質組學興起的一種新技術，其中表面增強激光解吸電離飛行時間質譜蛋白芯片技術(SELDI-TOF-MS，下稱SELDI-TOF-MS)是由T.William Hutchens 和 Tai-Tung Yip等科學家在上世紀90年代早期所創立的一種蛋白指紋圖譜分析技術，并獲得了2002年諾貝爾化學獎，為研究蛋白質的結構、屬性、功能提供了高效而可靠的技術平臺。其原理是利用各種方法（共價鍵、電荷等）將蛋白“富集”到芯片表面，在激光的轟擊下，蛋白解吸附并電離成帶電粒子，并在電場作用下飛行，其飛行單位距離的時間取決于其所帶電荷數量和其分子量之比（質荷比），從而達到分離和分析蛋白質的目的。該技術是目前最有前途的比較蛋白質組分析方法，為蛋白質組學研究提供了一個利器，具有獨特的優勢和能力：可直接用粗生物樣品（血清、尿、體液）進行分析、可同時快速發現多個生物標記物、具有高通量的驗證能力、能發現低豐度蛋白質（靈敏度高達fmol/ml），與“雙相電泳加飛行質譜”相比，除了有相似功能外，并可增加測定疏水蛋白質，可在同一系統中集發現和檢測為一體，SELDI在微生物檢驗方面將發揮重要的作用。十一.適體技術

1990年,Tuerk和Gold[1]分別獨立研制了一種新型的體外篩選技術,即指數富集的配體系統進化技術(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment, SELEX),用于研究小分子核酸與靶物質相結合的部位、序列及空間構像。適體（aptamer），又稱適配分子或適配子，實質是運用SELEX技術從人工體外合成的隨機寡核苷酸序列庫中反復篩選得到的能以極高的親和力和特異性與靶分子結合的一段寡核苷酸序列。

由于適體分子可用酶、放射性核素、熒光物質及生物素等標記以作為檢測分子，它協同傳統的單克隆抗體在流式細胞技術、生物傳感器、熒光偏振、分子燈塔和毛細管電泳等檢測技術上得到了廣泛的運用。

適體與抗體相比，具有針對靶分子的范圍廣、親和力和特異性高、性能穩定、便于修飾等諸多優點。利用針對微生物的特定蛋白和基因的適體對微生物進行鑒定和分型以及耐藥基因的檢測方面，適體將具有良好的前景，有的學者認為，未來適體有可能取代抗體。

十二.結語

長期以來,人們試圖找到一種既簡便又快速、又有足夠分辨力的技術來鑒別和區分各種病原微生物，各種新方法和新技術不斷涌現，但每一種方法都有其局限性，為了彌補各自的不足，使用一種以上的技術即采用多種方法聯合使用的策略,一種技術的缺點會被其他技術的優點所代替。選擇檢測方法應考慮到自身所擁有的條件,檢測所要求達到的靈敏度,而提高靈敏度和去除假陽性是檢測方法發展的趨勢。近年來,隨著計算機技術的不斷發展,臨床病原菌檢測將向著簡便、快速、高通量、自動化的方向發展。分子生物學技術通過自動化儀器的使用,將在病原菌診斷、鑒定和耐藥基因檢測方面越來越廣泛地應用于臨床。

第四篇：醫學檢驗前景

醫學檢驗就業前景

2011年，中國藥業人才網聯合國內多家機構，針對醫學檢驗行業就業做出了分析。

醫學檢驗近年來在我國得到了快速發展，隨著我國不斷建立的新的檢驗技術，如生化檢驗中的酶促速率法分析技術、臨床檢驗中的干化學試紙條法檢測、免疫檢驗中的放射免疫、酶免疫及化學發光、微生物檢驗中的全自動鑒定技術和最近發展起來的以聚合酶鏈反應為代表的分子生物學新技術，使檢測方法的靈敏度不斷提高，特異性越來越好，檢測結果也更加準確可靠。

檢驗儀器的迅速發展在醫學檢驗領域更是惹人注目，生化、臨床檢驗、免疫學和微生物學檢驗中的部分項目已實現了全自動或半自動化。醫學檢驗技術的進步和設備的更新換代，對許多疾病的診斷、治療監測和預后評估都起著越來越重要的作用。過去臨床檢驗科室一直被看作是醫院的“輔助科室”，只對臨床部門起“輔助”作用。而目前檢驗科室已經成為各醫院很重要的一個部門。衡量一個醫院整體水平的高低，其中很重要的一方面就是這個醫院的檢驗部門可以檢測多少項目、檢測的水平如何，以及所應用的技術手段是否先進。另外，隨著檢測技術的不斷發展，檢測項目的逐步增多，臨床疾病的診斷對醫學檢驗項目的依賴愈加明顯。因此，檢驗學科及其相關部門在現代醫學中的地位和作用已經越來越受到重視。

醫學檢驗技術的快速發展對醫學檢驗人才提出了更高的要求，使得醫學檢驗專業成為當今醫學教育中發展最快的專業之一。

90年代起，一些醫科大學相繼建立了醫學檢驗專業，目前許多大、中型醫院的檢驗科室都已有醫科大學檢驗專業畢業的大學生及研究生。

但目前一些市級、縣級和縣級以下的醫院，中專學歷的檢驗專業人員，仍然是檢驗科室的主力軍，這些檢驗人員為我省的醫學檢驗事業作出了很大的貢獻，但由于知識陳舊，跟不上檢驗醫學的自動化、規范化、信息化的發展，因此基層醫院需要實踐能力強、綜合素質高、基礎理論知識夠用、能夠迅速適應崗位工作的應用型醫學檢驗人才。此外，疾病控制中心、血站、計劃生育指導站以及相繼成立的各種形式的專科醫院、私立醫院對醫學檢驗人才也有較大的需求，這就使得醫學檢驗專業的學生具有很大的發展空間和市場需求。本專業為國家控制布點的一個熱門專業：

具體分析：本專業學生具有基礎醫學、臨床醫學、醫學檢驗等方面的基本理論知識和基本能力，將是隨著醫學事業的發展而愈來愈受到重視的醫學高級專門人才。

考生類別：理工類。

醫學檢驗技術專業主要的課程簡介：

（1）公修課 ：

1：政治理論課

主要包括毛澤東思想、鄧小平理論和“三個代表重要思想”概論，思想道德修養與法律基礎。通過學習使學生把握毛澤東思想、鄧小平理論要點，樹立正確的思想道德觀念和法律法規觀念。

2：大學英語

主要開設大學英語課程，通過教學，培養學生英語聽、說、讀、寫、譯和查閱資料的能力，能熟練閱讀本專業外文書刊。

3：計算機應用基礎

包括計算機基礎知識，windows操作系統，漢字輸入、word及電子表格等內容。通過教學，使學生掌握計算機使用基本知識，具有一定的計算機應用能力。

（2）專業基礎課：

4．醫用生物學

本門課程介紹生命的本質、細胞、繁殖、遺傳與變異、生物與環境的關系等內容，使學生認識生命現象的本質和生物發生發展的規律，為進一步學習醫學基礎課和專業課打基礎。

5．醫用物理學

主要內容包括力學和聲學、電學和磁學、物理光學、幾何光學、原子物理學以及物理學新技術在專業方面的應用，為學生了解生命現象的本質、學習醫學檢驗基礎課和專業課打下必不可少的基礎

6．無機化學;

本課程是醫學檢驗專業的一門專業基礎課，它是研究無機化合物的組成、結構、性質及其變化規律的一門學科。通過無機化學的學習，使學生獲得醫學檢驗專業所必需的無機化學的基本理論、基本知識、基本操作技能。為學生學習專業知識和職業技能等方面提高全面的素質，并為將來的學習打下扎實的基礎。

7．有機化學

主要講授有機化學基本理論和烴類化合物、烴類衍生物和雜環類化合物等的結構、性質、制備及應用，使學生通過學習學會用化學知識解決實際問題的能力。

8．分析化學

本課程的主要內容有常見陽離子、陰離子的定性分析，酸堿滴定法、氧化還原滴定法、沉淀滴定法、重量分析及比色分析等定量化學分析法。使學生掌握分析化學的基本原理、基本知識和基本操作技能，培養嚴謹的科學態度和解決實際問題的能力。

9．醫學統計學

學生通過本門課程的學習應達到理解醫學統計學的基本原理與基本概念，學會搜集、整理與分析資料的基本知識與技能、學會常用統計指標與基本統計方法的正確使用，同時培養科學的統計思維方法和嚴肅、認真和實事求是的科學態度。

10．正常人體學 :

介紹人體各系統的組成、人體重要器官的位置、形態結構和功能；人體基本組織和器官系統的微細結構及其相關功能，個體發生與生長發育及其發育機制；正常人體各器官系統的主要生理功能及其功能的調節。使學生掌握正常人體形態、結構和生理功能的基本知識、基本理論，理解人體是一個統一的有機整體。

11．生物化學

主要內容包括大分子（蛋白質、糖、脂）的組成、結構、生化性質、生物活性功能；三大物質代謝與三大物質生物合成；遺傳信息的傳遞；酶的概念、結構、作用原理、酶反應動力學；生物氧化、水與電解質代謝、酸堿平衡、腎和肝膽生化等。使學生通過學習初步掌握體內重要的有機物和無機鹽的基本代謝過程、變化規律及其與臨床的關系，初步運用生物化學的基礎理論知識，解釋臨床醫學中的一些基本現象。

12．病理學

本課程闡述疾病的一些共同性病理變化和各系統常見疾病的病理改變及其演變規律，使學生掌握疾病過程一般的共同規律及各系統主要疾病和臟器功能衰竭的基本病理知識，加深對人、環境、健康、疾病關系的理解，并學會病理學的觀察方法。

13．儀器分析

本課程主要介紹光化學分析法、電化學分析法、色譜分析法等儀器分析方法，并對質量控制、自動分析技術、生物樣品前處理、計算機在儀器分析中的應用、常用儀器調試與常見故障等內容進行了闡述。

（3）專業課 ：

14．臨床醫學概論

主要包括問診與體格檢查、特殊檢查、各系統常見病的病因、發病機制、臨床表現、診斷和有關的檢驗項目等。通過學習使學生獲得臨床醫學的基本知識和診斷常見疾病的基本方法，為學習專業課程奠定必要的基礎。

15．生物化學檢驗

本門課程主要介紹臨床普通生化檢驗如肝功能試驗、腎功能試驗、腫瘤標記物測定、血脂檢驗、血糖檢驗、電解質分析和常用生化分析儀器的使用以及臨床生化檢驗的質量控制，通過學習使學生掌握臨床普通生化檢驗方法、結果的正確解釋、常用儀器參數的設置和操作，了解和控制影響生化檢驗質量的控制因素。

16．微生物學檢驗

本課程闡述微生物的種類、主要病原微生物的生物學特性、致病性與免疫原性、微生物學檢驗程序及檢查方法，常用試劑的配置、培養基的制備和消毒滅菌等內容，使學生通過學習能夠正確使用微生物學檢驗儀器、配制常用染色

液，并能常見病原生物作出正確的鑒定。

17．寄生蟲學檢驗

本課程的主要內容有醫學蠕蟲、醫學原蟲、醫學節肢動物的形態結構、生活史、致病性及其實驗診斷技術。要求學生通過學習，學會常見寄生蟲病的實驗室診斷方法，并能聯系實際，分析有關流行因素，為制定有效防治措施提供依據。

18：免疫學檢驗技術

主要內容包括免疫學基礎知識、免疫檢驗技術、免疫檢驗質量控制和臨床免疫學的基礎知識。要求學生在掌握免疫學基本知識的基礎上，掌握主要免疫學技術的基本操作技能及其儀器的正確使用。

19：臨床檢驗基礎

主要內容有血液、尿液、糞便、腦脊液、漿膜腔積液、精液、前列腺液、脫落細胞等的檢驗。要求學生掌握人體血液、體液、分泌物和排泄物檢驗的操作方法、診斷指標及其臨床意義。

20：血液學檢驗

本課程主要包括了血液生理、血細胞學基礎、造血器官穿刺檢驗、白細胞系統疾病及其實驗診斷、紅細胞疾病及其實驗診斷、出血與凝血系統疾病及其實驗診斷。要求學生學會識別各種血細胞、掌握血液學檢驗的基本方法，協助臨床診斷。

畢業生能力測試：醫學檢驗專業學生通過在校期間的學習能熟練掌握醫用化學和計算機應用的基本知識和基本技能；掌握基礎醫學和臨床醫學的基本理論知識和臨床疾病診療基本知識；掌握免疫學、病原診斷學、血液學、輸血學、分子生物學等專業基本理論和操作技術，了解常用檢驗儀器的基本構造和性能；

熟悉國家衛生工作及臨床實驗室管理有關的方針、政策和法規；掌握文獻檢索、資料調查的基本方法，具有一定的科學研究和實際工作能力。具有臨床醫學檢驗及衛生檢驗的基本能力。

就業前景，該專業主要培養具有基礎醫學、臨床醫學、醫學檢驗等方面基本理論知識和基本能力，能在各級醫院、血站及防疫等部門從事醫學檢驗及醫學類實驗室工作的醫學專業人才。學生畢業后的去向呈現多元化，基本的就業方向有以下幾種：各級醫院檢驗科、防疫站、血站等部門從事工作；商品檢驗、環境保護、海關檢疫等部門從事工作；也可從事管理，醫檢設備維修、試劑研制及營銷工作，也就是說能適應于社會主義市場經濟多樣化的需要。

這些專業就業主要分布最多五省市分別為：湖南、浙江、山東、北京、廣東。

醫學檢驗畢業生就業分布統計分別為國有企業：17.7%；錄取研究生：2.2%；部隊：4.2%；高等學校：2.22%；醫療衛生單位：60%

第五篇：PCR技術在臨床檢驗中的應用

PCR技術在臨床檢驗中的應用

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醫學檢驗大致可分為形態學、生物化學、血清免疫學和分子生物學幾大類，其分別代表幾代實驗診斷技術。60年代DNA雙螺旋結構及半保留復制模式的出現，70年代基因重組及體外基因克隆技術、分子雜交技術的應用使分子生物學在疾病診斷中得到了長足的發展。特別是1985年Mullis發明了聚合酶鏈式反應（PCR）技術，使醫學界真正興起了基因診斷技術熱，成為現代醫學發展的又一里程碑。用于臨床檢驗的PCR技術與經典的PCR反應在操作上稍有區別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對DNA純化有限，但適應臨床微量、快速的特點。另外PCR反應體系中各組成成份往往都預分裝到反應管中，既減少操作者的工作強度而且也減少了污染的機會，具有極高的使用價值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創性意義。這些改進都不影響PCR效果，同樣表現出高特異性、高敏感性、簡便快捷等PCR最優秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優生優育、法醫學等廣泛領域中有相當高的實際應用價值。

常見的傳染性疾病有細菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環、泌尿生殖等不同系統相應的病變。消化系統感染性疾病在我國具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國是乙肝高發區，乙肝病人為世界乙肝病人總數的50％。乙肝病毒經血液傳播，病毒主要在肝細胞中增殖，也可以長期存留在骨髓細胞或外周血白細胞中。通常用PCR法檢測血清中的乙肝病毒。有報道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細胞中檢出乙肝病毒，這些發現提示其它傳染途經存在的可能。PCR法檢測乙肝的優勢表現在：①早期診斷，因為PCR擴增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。②對低持續感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內的病毒長期低復制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。③療效跟蹤及病程判斷，因為PCR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數量多少的最直接指標。在治療過程中通過監測血清或白細胞中病毒基因存在與否及其動態變化即能準確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗的方法主要是ELISA法測定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時血清中抗體的出現及動態變化與病人病情無線性相關關系。RT－PCR技術使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉錄為cDNA（RT）后再進行PCR擴增，這種技術稱之為逆轉錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內復制的動態狀況。RNA純化要求嚴格，是RT－PCR的技術關鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對樣本中的RNA進行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉錄酶，如AMV/MLV逆轉錄酶，高溫逆轉錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實現單管單酶單人份的擴增要求，這樣就在不降低擴增敏感性的條件下，一步完成擴增，不僅簡化操作，而且又減少污染，提高檢測的準確性。國內本公司已采用這種技術推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長期存在于血清中。在PCR檢測時，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經口－口途經傳播并定位于胃粘膜上皮細胞，早期表現為淺表性胃炎，可發展成為胃潰瘍。我國胃炎發病率之高估計比乙型肝炎更嚴重，對HP的檢測應受到廣大醫務工作者的重視。對HP的檢測可以用生化法測試尿素酶或用免疫法測試血清中對HP特異性抗體，也可對胃液、胃粘膜樣本進行細菌培養及菌種鑒定。PCR法檢測HP非常敏感且特異性高，有研究發現可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系統感染性疾病主要的有肺結核、非典型性肺炎等。結核桿菌感染曾給人類健康帶來很大威脅，一度是較嚴重的致死性疾病之一。解放以后由于對結核病的預防的重視，特別是特效抗癆藥物的出現，使結核病流行基本被控制。近來結核病有抬頭的趨勢，基原因可能有兩方面，其一是耐藥株的不斷出現，其二是對結核預防重視不足。結核菌痰涂片鏡檢陽性率太低，酶標法又因抗原交叉反應易出現假陽性，結核檢測的金標準是結核菌培養法。但培養法費時昂貴并且受到用藥的影響，在實際應用中受到限制。PCR在結核菌檢測方面有簡便、敏感、特異的優點。一般認為樣本中內要有100個左右的結核菌即可被檢出。目前用于結核菌PCR診斷的試劑，其引物主要來源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色體重復插入序列IS986、IS960、IS6110、染色體質粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色體重復插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介紹并使用了IS986基因設計的引物擴增產物為245BP，研究表明這一基因對人型結核菌有特異性。而后Thierry又介紹了插入序列IS6110基因，并認為這一基因對人型結核菌具有比IS986更高的特異性及敏感性，最適合M.TB的檢測。結核菌痰標本的PCR檢測應注意以下幾種常見的問題。其一，多條帶。即擴增產物電泳后有三條或三條以上的螢光除最前面的引物以外有兩條產物帶，這與插入序列本身各片段長度有差異、結核菌在治療過程中染色體畸變、斷裂、缺欠及不等位交換有關。這種擴增結果的判斷應特別注意，凡在陽性對照相應位置有明顯條帶的判陽性，否則應為陰性，或建議病人過一些時間后再復檢一次；其二，結核痰樣本PCR檢測時，要使樣本充分液化，否則痰液中的粘液成份將影響擴增效果，甚至會導致嚴重非特異性擴增，電泳結果呈霧狀；基三，結核痰樣本PCR檢測結果可能表現為陽性、陰性交替出現，這與結核病灶的不規律排菌有關。

循環系統以腸道小RNA病毒感染最具代表意義，如柯薩奇病毒等。這些病毒經腸道粘膜、淋巴結進入血液，最終可定位于心肌細胞中導致心肌炎。目前對這些病毒的血液樣本檢測往往比較困難。PCR用于柯薩奇病毒檢測時因其是RNA病毒所以應注意樣本的保存。外在環境中存在大量RNA酶，病毒脫殼后RNA將被迅速降解。一般用于RNA檢測的血清常溫下不應超過24小時，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR檢測在性傳播性疾病(STD)的診斷中有較廣泛的應用。經典的性傳播疾病有梅毒、淋病、腹股溝淋巴肉芽腫、軟銳濕癘、硬下疳等。而在現代STD中、解尿支原體及沙眼衣原體引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意義。梅毒是由梅毒螺旋體感染布致，首先在局部形成硬軟下疳，布后經血行播散到全身，最嚴重的是波及中樞神經系統。感染早期，梅毒螺旋體大量存在于硬下疳中，可以用生理鹽水濕棉簽擦去皮疹表面污物再用鈍刀片輕輕刮去上皮及結痂，用潔凈棉簽取滲出液樣本作PCR檢測，其敏感性及特異性極高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺體其取樣方法同埂下疳，三期梅毒皮疹中一般無螺旋體存在，因此III病人及部分無皮疹的I、II期梅毒病人可以取EDTA抗凝全血檢測。淋病是目前發病率最高的性傳播性疾病之一，由淋病雙球菌引起。淋病雙球菌一般為胞內寄生，常見的感染部位為外生殖器、尿道粘膜最常見。在尿道及外生殖器分泌物中有許多非致病的雙菌存在，對分泌物拭子進行涂片鏡檢時，常導致誤診。另外目前非淋球菌性尿道炎的發病率不斷增加，鑒別診斷特要，培養法準確但費時且費用高，受用藥的影響。PCR法簡便、快捷、準確非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隱性質粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因設計的引物特異性高但其敏感性低；隱性質粒設計的引物敏感性高但偶爾出現多條帶的擴增產物，判斷結果時應以陽性對照為標準，凡在陽性對照相應部位有明顯條帶的為陽性，其余均為陰性。以往對沙眼衣原體及解脲支原體的檢測主要靠培養法，費時且昂貴，簡便快速的PCR檢測對其有極高的使用價值。沙眼衣原體、解脲支原體樣本來源主要是尿道及宮頸分泌物拭子，由于分泌物中有許多污物含有PCR擴增的抑制劑，因此每次采樣時盡量避免采集過多膿性分泌物，如果宮頸分泌物太多可以先用濕棉簽將表面的分泌物擦去，再用潔凈的濕棉簽輕壓旋轉采集宮頸脫落細胞送檢，其準確性更高。PCR也可以用檢測單純皰疹病毒、EB病毒、乳頭瘤病毒等。引物尖銳濕疣的病毒是人類乳頭瘤（HPV）,可致生殖系統感染的乳頭瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究結果表明，在乳頭瘤病毒引起的良、惡性生殖器病變中，與血清型的關系并不密切，經常有交叉或多型民時感染。為簡化操作，對其基因對比分析尋找共同序列設計的簡并引物可以同時檢出這幾種型別的病毒既簡化操作又減少費用是一種極理想的方法。

我國惡性腫瘤為人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的發病率最高，占惡性腫瘤死亡總數的60％以上。引起腫瘤的原因非常復雜包括外界環境因素及遺傳背景。外界因此可分為三大類即化學、物理及生物因素。腫瘤與遺傳有關的證據越來越多，除已知的單基因遺傳腫瘤如視網膜細胞瘤、腎母細胞瘤等以外，還在幾乎所有的腫瘤細胞中觀察到原癌基因的重排，這些基因的變化常導致細胞增殖調控失調終形成腫瘤。癌基因是指在自然或實驗條件下具有潛在誘導細胞惡性轉化的基因，它們是在研究逆轉錄病毒時發現的。目前已知的腫瘤基因有60多種，1969年Hubner根據Rous(1911)的實驗，在小雞肉瘤濾液中發現一種能誘導宿主細胞轉化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后來又在其它哺乳動物基因中發現與病毒癌基因同源序列，這種正常的細胞基因表達產物與細胞生長、增殖、分化有關。但若被某種因素激活就會轉化為有活力的癌基因，通常稱之為原癌基因（Proto Oncogene）。為了與病毒癌基因區分，分別用V-Onc及C-Onc基因來代表。目前了解較多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常細胞中，并表達生物功能，只有在原癌基因被激活后才能誘導細胞轉化，可能的原癌基因活化機理有：①點突變，受到射線、化學因素、生物因素的誘導，這樣微小的變化，就會活化癌基因，活化的基因產物僅有極微的結構差異，但在功能在卻有很大的區別。②獲得啟動子，原癌基因從病毒基因中獲得啟動子而活化。③基因易位，內外界因素能導致染色體的某些基因易位、重排使原來無活性的原癌基因移至某些強的啟動因子或增強子附近而被活化。④原癌基因的過量擴增，原癌基因產物一般與生長因子、生長因子受體、跨膜信息蛋白有關或功能相近，過度表達時，會因調控失常而引起細胞癌變。另一類與腫瘤相關的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因較復雜，作用機理不太清楚。癌基因檢測中常用的分子生物學技術有：雜交、DNA分子克隆、PCR擴增及序列分析。PCR擴增簡便、快捷有較強的實用性，甚至可從病人體液樣本中檢測活化的癌基因而不需取活組織，對癌癥的早期診斷有極重要的意義。Ras基因是1964年首次從大鼠肉瘤的急性逆轉錄病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分離出來取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首命名。1982年首次在人膀胱細胞細胞癌中檢出有轉化能力的ras基因與Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性稱C-H-ras基因，后從肺細胞癌中發現了與Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，從神經母細胞中又發現了N-ras基因。Ras基因激活的最常見方式是點突變。人類原發腫瘤時點突變主要發生在密碼子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行滅活，根據其點突變的情況可以基因診斷、療效觀察。用PCR擴增樣本ras原癌基因，再使用雜交法、限制性內切酶消化或產物測序法檢測基因的突變情況即可用診斷。P53是抑制癌基因的代表，位于17號染色體短臂上，其產物為53KD分子量的蛋白從此而得名，可分為突變型和野生型，前者為癌基因，后者為抗癌基因。1979年Cane發現了P53蛋白Eliyahu發現了p53基因有抑癌作用。P53突變后其產物突變蛋白穩定性增加，半衰期較野生型基因產物長，在細胞內堆積，可以用免疫組化法測出。PCR-RELP、PCR-SSCP則因方法簡單、快速、特異性高，更具有實用價值。在SSCP分析中，單鏈DNA因堿基序列的變異，導致構型改變，在進行凝膠電泳時，其泳動速率發生改變，從布將變異的DNA與正常DNA區分開，統計表明100-300bp分子大小的ssDNA突變檢出率可達97％，300-450bp標出率可達69％，因此大于400bp的片段多態性應采用其它方法檢測。

遺傳病是由于遺傳基礎異常而引起的疾病，人類遺傳病約有3000多種，患者占總人口數的10％。遺傳病大概可分為單基因、多基因及染色體遺傳病。常用診斷方法有家系譜分析、染色體檢查（特別是顯帶法）、生物化分析等。隨分子生物學發展，基因診斷愈來愈表現出其優越性，PCR技術是基因診斷的主要技術之一，為快速、準確地檢測人類遺傳病開辟了一個新的途徑，預計與遺傳相關的疾病的檢測有80％將在3-5年內被PCR法所取代。PCR在遺傳病診斷應用中，可以利用引物直接擴增變化的基因產物，也可以結合應用限制內切酶，分子雜交及電泳圖譜分析進行診斷。應用較為廣泛的有PCR法檢測中海貧血、苯丙酮尿癥、血友病、脆性X綜合癥及性別鑒定等。地中海貧血（Thalassmia）是世界上最常見的單基因遺傳病，不有同類型，以a地中海貧血及在中海貧血最常見。a珠蛋白基因位于11號染色體短臂上，a珠蛋白基因突變致血紅蛋白的全成減少或缺失，表現溶血性貧血，肝脾腫大，在我國發病率為0.66％，貴州、四川等地高發可達2.2％。應用PCR技術可以直接檢測突變的基因診斷此病。苯丙酮尿癥（Phenylketouria,PKU）是一種常染色體隱性遺傳病。病人肝臟苯丙氨酸羥化酶嚴重缺乏使苯丙氨酸不能轉化為酷氨酸血癥，出現腦組織損傷，智力障礙。此病患者出生時正常，出生后一經確診立即停止母乳喂養，采用低苯丙氨酸飲食治療8-10年不致影響患者智力，但低苯丙氨酸飲食代價之昂貴是一般家庭所不能承受的，關鍵在于避免患兒出生。因此本病的早期診斷有極其重要的意義。PCR結合斑點雜交能有效診斷PKU。遺傳性疾病的基因變化很復雜，單基因固定位點變異布致病的情況很少，因此基因診斷過程中往往需要PCR技術與限制性內切酶、斑點雜交、聚丙烯酰胺膠電泳圖譜分析及擴增產物序列分析結合，作綜合判斷。

優生學包括基礎優生學、社會優生學、臨床優生學及環境優生學。孕期檢查及產前診斷是臨床優生學的最重要內容之一。孕期檢查除一般項目外還能及時了解孕婦是患有某些對胎兒發育有嚴重影響的疾病如風疹病毒感染、沙眼衣原體、解脲支原體、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、弓體感染等，及時發現及時治療并采取有效措施預防發展成為宮內感染。PCR技術對這些病原體的檢測簡便而確實，另外利用PCR技術可以對地中海貧血、血友病、苯丙酮尿癥、脆性X綜合癥等遺傳性疾病進行宮內診斷。可見PCR在優生優育方面有很高的應用價值。

PCR技術的出現對法醫學的發展也有不可低估的作用。在法醫物證如血斑、毛發、組織碎片等的確證，DAN多態性分析遠比血清學或等方法確實可靠。早期DNA多態性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個內含子中的串聯重復序列作探針，從人的基因庫中篩選出小衛量DNA，使用阿交法產生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術成功地應用于個人識別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當樣本DNA數量不足時或DAN嚴重降解則不能正常檢出。且雜交技術常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護措施。PCR技術的出現，可以對極少量物證如一根毛發、一滴血液、極小精斑都可以進行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構成的串聯重復DNA序列，具有單位點特征的稱為VNTR結構，多位點串聯成為衛星DNA。由于VNTR在等位基因中的多態性便構成了遺傳標記。使用PCR技術對其進行擴增結合對擴增產物凝膠電泳圖譜分析即可進行個人識別及親子鑒定。由2-6核苷組成的重復串聯序列稱為微衛星。在人類基因組中，微衛星更加豐富。微衛星的重復序列比VNTR短，擴增分型簡便，易于自動化，在VNTR或微衛星不僅重復片段的數量不同而且重復片段的核苷酸也具有多態性。在VNTR或微衛星多態性分析時，如再結合堿基配對分析可以藜得更大量的信息，這一種更有希望的標志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理論上其對嫌疑人的排除率為99.999％。PCR技術可以完成替代早期的Southern印跡法進行多態性分析而且操作簡便，敏感性及準確性都有大幅度的提高。當然PCR技術在法醫中的應用仍在起步階段有許多技術問題等待解決，如樣本中的抑制劑、檢村中DNA的損報告傷、PCR擴增污染等。想念隨著PCR技術的不斷完善它將在法醫學領域中有更加廣泛的應用。