第一篇：臨床檢驗實驗室自動化流水線的應用

臨床檢驗實驗室自動化流水線的應用

起來，在信息流的主導控制下，構成流水線作業的組合，形成大規模的全實驗室常規檢驗過程的自動化，國內也有稱自動化臨床實驗室流水線。

一、生化免疫流水線引進的效益

首先，流水線的引進推進了數字化醫院的建沒。配合流水線的需求，實現了標本管理的條碼化及檢驗申請的無紙化，實現了資源整合，流程的優化。降低了運行成本，提高了服務質量、工作效率和管理水平。

其次，醫學實驗室生物安全的現狀是對分析前和分析后處理過程中的生物安全缺少有效的控制手段，而流水線的引進改善了生化、免疫檢驗T作的生物安全狀況，實現了檢驗分析全過程的生物安全控制，減少了職業暴露。

最后，流水線的引進促進了檢驗科檢測設備的自動化、品牌化和集約化，減少了人為差錯，優化了人力資源配置，增加了檢驗人員的自信心，增強了臨床和患者的滿意度；同時改進了實驗定工作流程，免去了生化、免疫檢驗工作中的人工離心，分杯，樣本裝載、卸載和復檢等環節，減少了人工環節出錯的可能，二、拓展流水線模式的應用，優化與再造門診檢驗流程

1．標本管理條碼化：構建門診條碼生成系統，增加患者登記和標本簽收環節，增設檢驗助理崗位，整合門診抽血站工作。門診條碼生成系統的應用，優化了門診檢驗流程，提高了工作效率，保證了檢驗結果的準確性和可靠性；標本窗口簽收，檢測后臺操作，減輕了員工壓力，降低了醫療隱患；解決了窗口及取單處排隊擁擠狀況，改善了就診環境，對縮短患者等候時間、提高患者滿意度有較大作用。

2．檢驗分析模塊化：臨床實驗室自動化管理系統也稱模塊化，臨床實驗室檢驗流水線化，每個步驟進行模塊化，形成一個完整系統。通過改進工作流程，重新調整實驗室布局，使檢驗工作人員明確自己所處的流水線位置，檢驗技術人員只從事標本的檢驗工作，實現了臨床實驗室設備及人力資源效益最大化。

3．標本傳輸自動化：設計開發了標本運輸機械軌道和標本點對點識別系統，使標本能夠分門別類的自動、及時、準確傳送，各類標本在軌道上運行后分別進入不同的分析領域，避免交叉感染，使整個工作流變得快速和穩定。標本傳輸自動化使患者就診環境與檢驗工作環境得到了有序分隔。

4．數據管理網絡化：實驗室信息系統和醫院信息系統，涉及各個分析儀工作站、采樣工作站、流水線控制工作站甚至醫生臨床工作站與實驗室信息系統和醫院信息系統的通訊和管理，改造實驗室信息系統，應用條形碼技術，讓分析儀與實驗室自動化系統雙向對話，使患者樣品登記、實驗數據存取、報告審核、打印分發、實驗數據統計分析等繁雜的操作過程實現智能化、自動化和規范化；通過設計報告發放系統，增設終端顯示屏和語音呼叫系統，將門診報告的發放工作整合到發單處。

三、流水線引進后的管理 1．檢驗質量管理：重點是盡量控制誤差和使檢測工作具備可追溯性。充分發揮條形碼技術及實驗室信息系統的優勢，實驗室自動化系統可同時在自動化流水線上任何一臺電腦對流水線工作進行控制，隨時對流水線里的標本發出工作指令，實現了檢驗標本自動處理和分析．集中管理，實現了全而網絡化管理，減少了臨床樣品準備和處理產生的誤差。

2．檢驗醫學技術人員的管理：實驗室自動化系統應用后所節省的人員進行了人力資源重組和利用，增設專職的管理人員，加強了質量管理體系建設和科研；加強了血、尿、便、體液、骨髓、微生物等形態學檢驗診斷；加強了檢驗科與臨床的溝通與交流，真正發揮臨床檢驗在疾病診斷、鑒別診斷、療效評價、預后判斷、治療監測中的作用，并可參與健康體檢或疾病監測以及更多地從事科研活動等。

全實驗室自動化使不同亞學科進行互相交叉與融合，對每一個臨床實驗室工作人員都提出了更高的綜合素質要求。實驗室自動化系統的引入不僅是設備的換代和更新，更重要的是工作理念和管理理念的更新。而對自動化流水線拓展式的應用更推動了檢驗流程的再造，工作環境的改善，檢驗等待時間的縮短及服務質量的提升，將給患者帶來更多便利。

第二篇：流水線檢驗控制程序

流水線檢驗控制程序

1、領貨程序：

由縫制生產經理下發生產任務單后，車間組長憑領貨單到倉庫領取輔料，同時將領料單交搬運工到裁床領取裁片。

2、產前會的召開：

由車間主任負責聯合工藝員組織生產該訂單的小組的組長、組檢、進行產前的講解，列出所要注明的重點事項，并有針對性地對該款提出明確的質量要求。

3、產前樣的確認：

大貨投產前一天或當天，由車間組長必須先做一件產前板出來，工藝員、生產經理批復后才能生產，否則，一律不準生產。批復的首件樣掛在醒目處，供員工參考。

4、投產前工作：

1）每張新訂單投產前，組長必須召集員工進行投產前的講解，以及示范指導，并做一件當道工序標準樣供員工參考，同時要求員工必須生產出來的第一件工序產品交組長認可后才能批量投產。

2）投產第二天就新開款發現的問題進行總結，提醒員工在生產過程中容易產生的錯誤，并采取防范措施。同時將犯錯誤的員工錯誤的過程講解出來，以引起其他員工的警示。

5、初期檢查：

1）組長必須每天不定期地對生產的流水工序進行抽檢，對不合格的應要求員工立即改正，并找出產生不合格品的原因。

2）組檢投產初期應到車位上進行工序的巡視檢查，特別是對重點工序更是要深入細致地檢查，將存在的問題及時檢查出來，避免批量的返工。

3）對重點工序生產完畢后，組檢必須先對工序進行100%檢查合格后才能轉入下一道工序生產，不合格的流水工序不能進入下一道（如貼后袋、裝拉鏈、裝前袋、埋夾等）。

6、工藝員首十件控制：

在不缺少物料的情況下，首十件產品一般應在第二天就下流水線，首十件產品下線后工藝員應進行洗水前的檢查，包括所用的物料是否正確，工藝有無差錯以及洗水前的尺寸是否吻合，并記錄好所有的數據，等洗水回來后再進行重復測量。

7、根據首十件洗水尺寸的情況，再對出現問題的工序進行整改，以確保整張訂單的產品質量。

8、中期檢查：

在生產到一定的成品后，工藝員再對車間的流水工序進行抽檢，看是否有生產走樣；生產出來的批量成品是否符合要求，并按一定的比例進行抽檢。

9、車間的尾期檢查：

1）由組檢對重要工序進行專業的檢查合格后才能轉入下一工序。

2）尾檢成品檢查：所有的工序生產完畢后，由車間尾檢對洗水前的成品進行全方位的檢查，檢查項目包括產品的外觀、線跡、工藝的正確否、套結、鳳眼、前袋、后袋、腰頭的高低、拉鏈等。

3）、工藝員的成品抽查：工藝員按一定的比例（約占5%）對總檢后的成品進行抽查，符合工藝要求的，簽放行報告予以放行，發現返工率較大或認為需要重新返查的，下達書面通知要求返查。

第三篇：臨床基因擴增檢驗實驗室規章制度

臨床基因擴增檢驗實驗室規章制度

一、臨床基因擴增檢驗實驗室的規范化設置及其管理

臨床基因擴增檢驗實驗室四個隔開的工作區域中每一區域都須有專用的儀器設備。各區域都必須有明確的標記，以避免設備物品如加樣器或試劑等從其各自的區域內移出從而造成不同的工作區域間設備物品發生混淆。進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物配制和擴增區(簡稱擴增區)至產物分析區，避免發生交叉污染。在不同的工作區域應使用不同顏色或有明顯區別標志的工作服，以便于鑒別。此外，當工作者離開工作區時，不得將各區特定的工作服帶出。

清潔方法不當也是污染發生的一個主要原因，因此實驗室的清潔應按試劑貯存和準備區至擴增產物分析區的方向進行。不同的實驗區域應有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

(一)試劑貯存和準備區

下述操作在該區進行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。

(二)標本制備區

在該區進行下述操作：臨床標本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。

(三)擴增區

下述工作在本區內進行：DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區)的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區)制備成反應混合液等也可在本區內進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區內進行。

不能從本區再進入任何“上游”區域，可降低本區的氣壓以避免氣溶膠從本區漏出。

(四)擴增產物分析區

下述操作在本區內進行：擴增片段的測定

二、臨床基因擴增檢驗實驗室質量保證

臨床基因擴增檢驗實驗室質量保證涉及到整個基因擴增檢驗的所有階段，即測定分析前的標本采集處理、測定中的核酸提取、擴增和產物分析以及測定后的結果報告等。

第四篇：臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收報告

(一)實驗室所屬法人單位名稱:

地址:

郵編:

法定代表人:實驗室負責人:聯系人:email:

電話:傳真:

(二)接受現場技術驗收的實驗室代表姓名及職務:

二.驗收依據:衛生部下發文《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》和《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規范》

三.驗收時間:

四.驗收評審地點:

五.技術驗收結論:

合格,建議授予驗收合格證書;

基本合格,尚存在部份缺陷,缺陷為項,限期改進,改進后授予驗收合格證書;

不合格,停止驗收,實驗室改進后需重新申請.(一)驗收中發現的問題及意見:

附件1:臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收表;

附件2:臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收意見匯總表;

附件3:整改要求.(二)需要說明的其它問題:□如果有的話見附件4;□無.(三)驗收評審員姓名及簽名:

主評審員姓名:簽名:

評審員姓名:簽名:

簽名:

簽名:

協調員姓名:簽名:

簽字時間:

(四)簽字地點:

驗收評審組意見:

附件1臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收表

序號

驗收內容

驗收意見

符合基但本有

符缺

合陷

不符合缺此項

暫不需考核

評論與說明

實驗室設置和設備

1.1

實驗室的規范化分區:原則上應分為四個區,但如使用全自動擴增檢測儀,區域可適當合并

1.2

各工作區的明確標記

1.3

實驗室應配備開展臨床基因擴增檢測所需的所有儀器設備(包括質控物).保證《臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》和《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規范》的有關要求得到滿足.1.4

試劑貯存和準備區

冰箱;

混勻器;

微量加樣器;

可移動紫外燈;

專用工作服和工作鞋;

消耗品(帶濾心吸頭,一次性手套等);

專用實驗記錄本,記號筆等.1.5

標本制備區

(a)冰箱(2~8℃和-20℃或-80℃);

高速臺式冷凍離心機

(c)水浴箱和/或加熱模塊

(d)超凈工作臺或防污染罩

混勻器;

注:請在驗收所選項打“

臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收表

序號

驗收內容

驗收意見

符合基但本有

符缺

合陷

不符合缺此項

暫不需考核

評論與說明

微量加樣器;

可移動紫外燈;

專用工作服和工作鞋;

消耗品(帶濾心吸頭,一次性手套等);

專用實驗記錄本,記號筆等.1.6

擴增區

(a)核酸擴增儀;

微量加樣器;

可移動紫外燈;

專用工作服和工作鞋;

消耗品(帶濾心吸頭,一次性手套等);

專用實驗記錄本,記號筆等.1.7

擴增產物分析區

微量加樣器;

可移動紫外燈;

專用工作服和工作鞋;

消耗品(帶濾心吸頭,一次性手套等);

專用實驗記錄本,記號筆等.2.設施和環境

2.1

實驗室的設施,工作區域,能源,照明,采暖,通風等

應便于檢測工作的正常進行.2.2

實驗室應配備溫度濕度計,穩壓電源等.2.3

進入和使用實驗室各區域應有明確的限制和控制.注:請在驗收所選項打”“.臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收表

序號

驗收內容

驗收意見

符合基但本有

符缺

合陷

不符合缺此項

暫不需考核

評論與說明

2.4

應有實驗室”內務管理"(如人員流動,清潔等)制度;

2.5

實驗室應有關化學試劑管理,廢棄血清處理,生物防護等的措施

3.人員

3.1

實驗室應配備足夠數量的人員;這些人員必須經過培訓,并取得上崗證.3.2

實驗室應有培訓計劃和措施,保證其技術人員得到及時培訓.3.3

實驗室應保存其技術人員有關資格證書(如上崗證),培訓,技能和經歷,發表論文,科研成果等技術業績檔案.4.設備管理和質控物

4.1

所有設備應有維護程序文件;

*

如

第五篇：臨床基因擴增檢驗實驗室工作規范

為使基因擴增檢驗技術有效地應用于臨床，更好地為疾病的預防、診斷和治療服務，保證檢驗質量，特制定本規范。

一、臨床基因擴增檢驗實驗室的規范化設置及其管理

臨床基因擴增檢驗實驗室的規范化設置詳見《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》(衛醫發

[2002]10號文)附件《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》。為避免污染，必須嚴格遵循《臨床基因擴增檢驗實驗室設置標準》設置臨床基因擴增檢驗實驗室。

臨床基因擴增檢驗實驗室四個隔開的工作區域中每一區域都須有專用的儀器設備。各區域都必須有明確的標記，以避免設備物品如加樣器或試劑等從其各自的區域內移出從而造成不同的工作區域間設備物品發生混淆。進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物配制和擴增區(簡稱擴增區)至產物分析區，避免發生交叉污染。在不同的工作區域應使用不同顏色或有明顯區別標志的工作服，以便于鑒別。此外，當工作者離開工作區時，不得將各區特定的工作服帶出。

清潔方法不當也是污染發生的一個主要原因，因此實驗室的清潔應按試劑貯存和準備區至擴增產物分析區的方向進行。不同的實驗區域應有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

(一)試劑貯存和準備區

下述操作在該區進行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。

貯存試劑和用于標本制備的材料應直接運送至試劑貯存和準備區，不能經過產物分析區。在打開含有反應混合液的離心管或試管前，應將其快速離心數秒。試劑原材料必須貯存在本區內，并在本區內制備成所需的貯存試劑。當貯存試劑溶液經檢查可用后，應將其分裝貯存備用，避免由于經常打開反應管吸液而造成污染。

含反應混合液的離心管或試管在冰凍前都應快速離心數秒。大多數用于擴增的試劑都應冰凍貯存。為避免因單次反應取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據通常在實驗室內一次測定所需的擴增反應數來決定。

主反應混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩定性通過預試驗來檢查，評價結果必須有書面報告。對于“熱啟動”技術(在第一個高溫變性步驟后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反應混合液中。

在整個本區的實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。

嚴禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經高壓處理。

工作結束后必須立即對工作區進行清潔。本工作區的實驗臺表面應可耐受諸如次氯酸鈉的化學物質的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關鍵，因此可使用可移動紫外燈(254nm波長)，在工作完成后調至實驗臺上60~90cm內照射。由于擴增產物僅幾百bp，對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間，最好是照射過夜。實驗室及其設備的使用必須有日常記錄。

(二)標本制備區

下述操作在該區進行：臨床標本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。

要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發生氣溶膠所致的污染，所以應避免在本區內不必要的走動。可通過在本區內設立正壓條件避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加 1

入待測核酸后，必須蓋好含反應混合液的反應管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。

用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒(例如含次氯酸鈉溶液)容器內。實驗室桌椅表面每次工作后都要清潔，實驗材料(原始血標本、血清標本、提取中的標本與試劑的混合液等)如出現外濺，則必須分別處理并作出記錄。

對實驗臺適當的紫外照射(254nm波長，與工作臺面近距離)適合于滅活去污染。可移動紫外線管燈可用來確保工作后對實驗臺面的充分照射。

樣本處理對核酸擴增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法，可在開展臨床標本檢測前對提取方法進行評價。

用于RNA擴增檢測的樣本制備好以后，應立即進行cDNA合成，因為cDNA鏈較RNA穩定，保存相對容易。為保證逆轉錄反應的需要，應在標本制備區設置一個以上的溫育裝置。

cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴增反應緩沖液條件下具有逆轉錄活性的熱穩定的DNA聚合酶進行逆轉錄，其較cDNA合成后再開蓋以調節緩沖液或加入聚合酶進行擴增發生污染的可能性降低。

待測RNA的cDNA拷貝須保存在標本制備區，不得在本區對樣本進行PCR擴增。

(三)擴增區

下述工作在本區內進行：DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區)的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區)制備成反應混合液等也可在本區內進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區內進行。

不能從本區再進入任何“上游”區域，可降低本區的氣壓以避免氣溶膠從本區漏出。

為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區內的走動。如有加樣則應在超凈臺內進行。打開預處理過的反應混合液時必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴增步驟之間。一個簡單的方法是在打開反應管前快速離心數秒。可使用體積較小的離心機，因其所占實驗臺面小，易于用一只手操作，適合于大多數超凈臺。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續性的污染源。用過的加樣器必須注意清潔消毒。

完成操作及每天工作后都必須對實驗室臺面進行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。

(四)擴增產物分析區

下述操作在本區內進行：擴增片段的測定。

核酸擴增后產物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標記或非同位素標記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉移、核酸測序方法等。目前國內的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標記的微孔板上探針雜交方法，即PCR-ELISA方法，也有膜上探針雜交方法。

本區是最主要的擴增產物污染來源，因此必須注意避免通過本區的物品及工作服將擴增產物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴增產物時，必須使用洗板機洗板，廢液必須收集至1mol/L HC1中，并且不能在實驗室內傾倒，而應至遠離PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。

由于本區有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應注意實驗人員的安全防護。

本區的清潔消毒和紫外照射方法同前面區域。本區如采用負壓條件或減壓情況下(如安裝排風扇)可減少擴增產物從本區擴散至前面區域的可能性。

二、臨床基因擴增檢驗實驗室質量保證

臨床基因擴增檢驗實驗室質量保證涉及到整個基因擴增檢驗的所有階段，即測定分析前的標本采集處理、測定中的核酸提取、擴增和產物分析以及測定后的結果報告等。

(一)標本的采集

常用于基因擴增檢測的臨床標本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時，應使用一次性密閉容器，如真空采血管。當使用非密閉采樣系統時，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時必須戴一次性手套。玻璃器皿在使用前應高壓處理，因為玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是熱滅菌，250℃烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。

全血和骨髓標本必須進行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因為肝素是Taq酶的強抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。

臨床用于RNA(如HCV RNA)擴增檢測的血標本建議進行抗凝處理，并盡快(3小時以內)分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時內分離血清。

(二)標本的穩定化處理

用于DNA擴增檢測的標本，采集后一般不需要特殊的穩定化處理，但標本應及時送至實驗室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA測定的標本有時必須進行穩定化處理，如流行病學調查的現場采樣。異硫氰酸胍鹽(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標本時，可將標本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的試管中，從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。經上述穩定化處理后，標本一般不需要冷藏即可郵寄。對于特定的檢測項目，上述穩定化處理方法的效果究竟如何，要使用相應的逆轉錄PCR測定方法來評價。

(三)標本的運送

標本采集后必須盡快送至實驗室。經過適當穩定化處理的標本可在常溫下通過郵寄運送。如用于DNA擴增檢測的EDTA抗凝全血標本及用于RNA擴增檢測的經GITC穩定化處理的標本。通常在運送時，應采用不易破碎的容器裝載標本。用于RNA檢測的標本，如果未經穩定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運送。

(四)標本的貯存

臨床體液標本如血清/血漿等可于-70℃下長時間貯存。用于DNA測定的已純化核酸樣本可在10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA緩沖液(pH 7.5-8.0)中4℃保存。用于RNA測定的已純化核酸樣本應在緩沖液中-80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20℃即可。用GITC處理的RNA標本在室溫可保存7天。

(五)標本的處理(核酸提取)

標本處理即核酸提取純化是決定擴增檢測成敗的關鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標本中的核酸模板前，應對其進行充分評價以驗證其提取的有效性。通常，核酸制備質量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來源于標本本身(如血紅素及其前體或降解產物)或核酸提取過程中殘留的有機

溶劑(如酚、氯仿等)，這些物質對其后的Taq酶擴增反應步驟具有強烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴增測定。當標本為痰時，則必須先進行液化處理，再提取核酸。需注意的是，液化時不能加熱，液化時間不能過長。此外，當靶核酸為RNA時，逆轉錄PCR測定失敗的常見原因是標本在運送前未經充分的穩定化處理及核酸提取試劑的RNA酶的污染。對于前者，要核查測定分析前的步驟，如果發現有RNA降解的證據，實驗室則應拒絕接受標本，要求重新采取標本，并對運送者給以詳細的指導。對于后者，建議使用高質量的商品核酸提取試劑。

(六)靶核酸的逆轉錄(RT)和擴增

1、靶RNA的逆轉錄

cDNA合成為逆轉錄PCR中的第一個酶反應步驟，所產生的cDNA為靶RNA的反向互補鏈，為后面擴增的模板。下述因素通常影響cDNA合成的效率：(1)逆轉錄效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆轉錄酶質量不高、試劑降解變質或加樣錯誤等；(2)用于逆轉錄的標本中存在逆轉錄或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血紅素等)；(3)RNA酶的存在導致RNA的降解。

2、核酸的擴增

有多種因素可引起核酸擴增檢測的假陽性或假陰性結果，如擴增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對、Mg++濃度不佳、患者標本或試劑受污染等。擴增儀孔中熱傳導的均一性極為重要，必須定期對擴增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導的一致性進行檢查，以避免假陰性結果。

(七)污染

在實際工作中，常見有以下幾種污染類型：擴增片段的污染(產物污染)；天然基因組DNA的污染、試劑污染(貯存液或工作液)以及標本間交叉污染(如氣溶膠從一個陽性標本擴散到原本陰性的標本)。臨床基因擴增檢驗實驗室中污染的最主要來源是擴增產物的污染。

由于一旦發生污染后，再圍繞實驗室來尋找污染源不僅耗時而且還很繁瑣，所以防止污染重在預防。但如果發生了污染，實驗就必須停止，直到發現了污染源為止，并且實驗結果必須作廢。

1、測定分析前的污染源

測定分析前實驗材料的污染主要來自非病人標本來源的核酸。

2、測定分析階段的污染源

通常，測定分析階段的每一步都可能發生對樣本的污染。反應混合液的任何成分及核酸的制備和反應建立階段所涉及到的實驗設備的任何部位都是可能的污染源。如受污染的試劑(例如牛血清白蛋白，明膠或礦物油)、商品酶制劑、消耗品(如反應管，吸頭)和實驗設備(如加樣器、離心機)等。

在前面三個工作區中，不當的實驗操作會引起所使用的試劑、消耗品或實驗設備的污染。而在產物分析區，當吸取擴增產物用于檢測時，非常容易引起污染，因此必須制定標準操作程序(SOP)，并嚴格執行。

3、污染的避免

要避免污染，首先應是預防而不是排除污染，前面所述對工作區的嚴格劃分的目的即是為了預防污染。為避免以前測定中所產生的擴增產物的污染，可設法將其破壞掉。如在擴增反應中用dUTP取代部分dTTP，使得產生的特異擴增片段含有尿嘧啶，這樣擴增前在反應混合液中加入尿嘧啶糖苷酶(UNG)，可破壞來自以前測定的擴增產物，從而避免其對以后要進行的擴增測定的污染。另外一種方法是持續的長波紫外燈照射，通過異補骨脂素光化學產生DNA加合物，由于DNA加合物對擴增沒有反應但又不妨礙PCR后雜交過程，所以這種方法也能防止污染。

上述防污染方法只在一定程度上有效，所以不能用其來替代嚴格的實驗室設置和管理，尤其是這些方法不能防止外來非擴增的天然DNA的污染。

4、去除污染的措施

工作完后必須定期對實驗室采取有效的去污染措施，結合各種不同的方法可達到最佳效果。去污染措施包括但不僅限下面幾種：(1)用10%(v/v)次氯酸鈉清潔表面；(2)試驗后長時間的紫外照射實驗操作臺面和其他表面；(3)實驗設備如加樣器的高壓消毒。

(八)擴增產物的分析

擴增產物的測定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等，但臨床PCR檢驗項目基本上都使用探針雜交方法。

雜交結果不充分的原因可能是基因探針不合適、標記方法不對、對探針的標記不夠、雜交或洗滌方法不合適等。

最常使用的基因探針有：DNA片段、合成的寡核苷酸和體外轉錄的反義RNA探針。探針的標記物常用的有生物素、地高辛、熒光素和同位素等。

在擴增后的雜交檢測中, 應該嚴格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交條件。溫度太低或離子強度太高都會降低雜交的嚴格性，還會給檢測信號的特異性帶來負面影響。相反，提高溫度和/或降低離子強度會增加雜交的嚴格性。因此，嚴密控制溫度和試劑的離子強度是避免假陽性和假陰性結果的先決條件。要注意的是，溫度和離子強度不能同時改變。

(九)質量控制

質量控制包括兩個方面，即室內質量控制(以下簡稱質控)和室間質量評價。

1、室內質量控制

必須對DNA和RNA分析的各步進行質量控制，以避免假陽性和假陰性，保證測定結果的準確性和重復性。由于核酸擴增測定的高敏感性，所以標本制備、逆轉錄、擴增本身和產物分析中的每一步都要求有質控措施。

(1)標本制備：

常用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA提取效果，以判斷所提取的DNA是否發生降解。用常規的手工提取方法制備的DNA的平均長度一般為~100kb，用適合PCR的DNA提取試劑盒制備的DNA的長度平均范圍為30-40kb。明顯出現降解的DNA(在1和10kb的低分子量范圍內)在經瓊脂糖凝膠電泳分離和用溴化乙錠染色后也可見強的熒光信號。用對甲基化不敏感的限制性內切酶(如EcoRI)消化DNA，然后電泳分離，能夠對酶活性的抑制劑進行質控(在抑制劑存在的情況下，高分子量的片段不被酶切)。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測定來估計，質量好的DNA提取物，A260/A280比值應該在1.75~2.0之間;否則,殘留的蛋白或酚可能會很高。僅用光度計比色方法不能對DNA的完整性下結論。

最快的對總RNA提取質量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電泳,這一點跟DNA分離相同。但如果對結果有疑問,就應該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。在理想情況下,三種主要的核糖體RNA(28S、18S和5S)在凝膠上出現的帶相對較窄。如發生RNA的降解，則出現大量低分子量帶或出現帶的消失。測定核糖體RNA帶的密度指數可作為對RNA制備的質量評價的實驗室內的標準；對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評估也是RNA完整性的合適的指標。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些原因，單獨的光度計比色方法也不能對RNA的完整性下結論。

對于血清（漿）中病毒的測定，則要評價標本出現溶血、脂血和黃膽情況下標本處理方法對擴增檢測的影響，避免由于標本處理方法的不當而出現假陰性結果。此外，還可采用已知濃度標本評價核酸提取方法的效果。

(2)逆轉錄和擴增：本部份包括陽性質控和陰性質控。

對逆轉錄和核酸擴增的質控既可使用內標質控方法也可采用外標質控方法。逆轉錄-擴增檢測的內標通常為在整個細胞周期中均勻表達的mRNA，如HLA、β肌動蛋白和組蛋白H3.3的mRNA或14S rRNA等。此外，也可在標本制備時將外來內標加入到樣本中共同提取、逆轉錄及擴增。當標本中存在逆轉錄抑制物，或核酸提取中發生RNA降解，或逆轉錄酶失活，內標即會表現為陰性結果。

對于DNA測定內標可使用對有機體存活所必須的靶基因，如維生素D血漿結合蛋白的基因。對于病原體的基因檢測，內標多采用人工制備的競爭性內標。內標可以監控每一擴增孔中假陰性的產生情況。

目前的商品試劑盒大部分沒采用內標方法質控。因此在測定血清/血漿病原體核酸如HBV DNA、HCV RNA等時，應使用已知的弱陽性血清/血漿作為質控樣本，與待測臨床標本等同處理提取核酸及擴增，以判斷逆轉錄及擴增檢測的效果。

使用這些外加弱陽性質控不但可檢測擴增反應液的質量，還可獲得有關PCR試劑的檢測下限和特異性的信息。這些質控樣本在擴增檢測時必須使用與患者的標本相同的主反應混合液。

每一個PCR實驗中都必須設有外加陰性質控(污染監測質控)，為判斷擴增過程中污染出現的階段，陰性質控可包括如下幾種，即在樣品制備的整個過程中所帶的空白管、僅有擴增反應液但不含擴增模板的反應管、陰性標本等。陰性標本可以評估PCR實驗的綜合質量。

在擴增靶RNA的RT-PCR實驗中，可做省略逆轉錄的污染質控，通過這種方法，可發現以前擴增的DNA片段所引起的污染。

(3)板上雜交和膜上斑點印跡雜交的質控：在板上雜交和斑點雜交時，陽性和陰性質控應該在同一板或膜上與病人標本平行進行分析，這可排除不同反應中因使用不同雜交條件所致的對結果的錯誤解釋。

(4)測定結果的評價與報告：采用實時熒光定量PCR檢測方法，在判斷結果時，應先對擴增的熒光信號作出定性判斷，然后再進行定量分析，避免一些非特異熒光信號對結果分析的干擾。

結果的報告必須簡單清楚。定性測定報告“陽性”或“陰性”即可。定量測定則必須報告量的多少，如結果高于測定方法線性范圍上限，則對樣本稀釋后再測，結果乘上稀釋倍數；如結果低于方法的測定范圍下限，則報?lt;多少即可，不能報告為“0”或“陰性”。

2、室間質量評價

所有開展臨床基因擴增檢驗的實驗室都必須參加由衛生部臨床檢驗中心組織的全國臨床基因擴增檢驗項目的室間質量評價，評價結果將作為其開展臨床基因擴增檢驗的依據之一。

本工作規范自公布之日起實施。