第一篇：HE組織切片制備標準操作程序

HE染色標準化操作程序

一、目的

保證病理切片質量，以達到準確的病理診斷。

二、范圍

石蠟包埋組織

三、試劑，儀器

酒精、二甲苯、蘇木素、伊紅、鹽酸酒精、脫水機、包埋機、切片機、漂烘儀、染色機。

四、工作流程

（一）制片前

制片前過程從標本送到實驗室至包埋結束為止。包括： 1.標本的交接編號記錄及檢查

（1）實驗室人員收檢標本時人必須認真執行查對制度，包括：送檢標本種類和數量與送檢單上填寫的是否一致；容器上的聯號或姓名與送檢單上是否符合；固定液的種類（通常要求為10％中性緩沖甲醛液）和量是否符合要求；送檢單是否按規定用墨水筆逐項填寫清楚。若發現有錯誤、疑問或不符合要求時，應立即查詢清楚和適當處理，在合格后方可簽名接收。如標本已干涸、腐敗或其它明顯不符則不應接收。接收標本應在初級人員接收后，再由中級人員和主檢或具體負責人員復核，以確保沒有差錯發生。

（2）收到標本后應按標本順序逐一在申請單上編上病理檢查號，并在標本容器外壁貼上相應的號碼，然后按號碼先后順序排列放好，再在申請單上打上收到日期。將收檢的標本，按申請單逐一向負責處理的醫師交代清楚，包括標本種類、數量、臨床診斷及有無特殊注意事項等。

（3）取檢過程中，實驗室人員應認真記錄填寫好工作單，包括標本號、塊（包）數、有無特殊處理、標本名稱，如標本全取、標本過小等均應記錄在案以備日后查對。對一些易碎、小而少的標本應用尼龍絲小袋或擦鏡紙包裹好后再做上機處理，以防丟失。標本的取材塊通常控制在2cm×2cm×0.3cm左右。標本取檢多于一個包埋塊者，在標本病理檢查號后綴寫-1或-2等，以便于查找校對。取好的標本應及時浸泡在指定的固定液中，來不及取完的標本特別是大標本應縫上號碼投入固定池內以備次日再取。標本取檢完后，自報告發出之日起，通常規定小標本保留1月以上，大標本保留6月以上。

（4）標本在上機處理之前，必須由初級和中級實驗技術人員共同檢查標本總數與申請單和工作單是否一致，確定無疑后方可上機處理。

2.標本的處理

利用全自動脫水機處理。（根據組織的大小、分類分別設置程序）

所有試劑由專人負責定時檢測定期更換，并做好詳細記錄。3.標本的包埋

首先清點檢查標本，確認完好無缺后方可開始包埋操作，操作時應注意核對標本與工作單記錄是否吻合。包埋的石蠟溫度應盡量與標本浸蠟溫度一致，大約控制在65℃～70℃之間，溫度太低會造成包埋平面凹凸不平，尤其是內鏡活檢等小塊標本，易出現切片不完整而發生漏診現象。包埋時，先取大小合適的不銹鋼模型，注入蠟液置于熱臺上，液面剛好與模型的上緣平齊，不得低于或高于此限。取出包埋盒內的組織，校對正確后用干凈的熱鑷子將所有組織悉數放入模型的底部，待組織與模型內的蠟液充分融合后，按要求排列后迅速移動模型至冷臺，至底部石蠟剛開始凝固，用鑷子輕壓組織數秒，待組織埋平后，迅速蓋上包埋盒注上蠟液，約過10s ～15s，包埋盒與模型周邊的蠟液凝固后，再次補充注入少許蠟液，以增加包埋盒的穩固性，注意液面高度不得高于包埋盒上緣，加蓋包埋盒時一定要保持與模型底部平面平行，無前后左右傾斜的現象。待蠟塊在冷凍臺徹底冷卻后，從模型內取出修去包埋盒周邊多余的石蠟。清點包埋好的蠟塊總數，按大小類別放好，冷凍備切。

（二）切片

1、將切片刀安裝在持刀座上；

2、將蠟塊固定于支持器上；

3.、細心移動刀座或蠟塊支持器，使蠟塊與刀刃接近，旋緊刀座，觀察蠟塊面是否與刀座相平，如不平須調節支持器，使蠟塊面與刀面平行；

4、修塊（粗切）：用右手勻速旋轉切片機輪，修切蠟塊表面至包埋其中的組織塊全部切到。修塊粗切片的厚度為15-20微米（注意：對于醫囑再次深切片特別是在原切片中發現了有意義病變而進行的深切片應盡量少修塊，以盡量好地獲得有關病變的連續性）；

5、調節切片厚度調節器（一般為2-4 微米），進行切片。切出的蠟片應連續成帶狀，完整無缺，厚度適宜（3-5 微米）、均勻，無刀痕、顫痕、皺褶、開裂、缺損、松解等；

6、以專用鑷子輕輕夾取完整、無刀痕、厚薄均勻、干凈的蠟片，放入漂片機的溫水中（40-50℃左右），使切片全面展開；每切完一個蠟塊后必須認真清理水面，不得遺留其它病例的組織碎片以免污染。

7、將蠟片附貼于處理過的載玻片上，蠟片應放在載玻片右2/3處的中央，留出載玻片左1/3的位置用于貼附標簽；蠟片與載玻片之間無氣泡；為防止蠟片滑落，蠟片的一角（遠離組織的）可粘在載玻片邊緣上；若一片載玻片上撈兩片以上的蠟片，必須把蠟片均勻貼附在載玻片上，保持制片的美觀。

8、必須立即在置放了蠟片的載玻片一端（待貼標簽處），用鉛筆準確清楚地標記其相應的病理號（包括次級號），外借白片，需在每張白片上注明對應的病理號。

9、將置放了蠟片的載玻片呈45度斜置片刻；待載玻上的水分流下后，將其插入專用的染色架中，最后置于恒溫箱中烘烤（72℃左右，15分鐘），然后即可進行染色。

10、切片注意事項

（1）切片前蠟塊要冷凍，這樣容易切片（甲狀腺、淋巴結及胃鏡等特殊組織，必須控制冰凍時間）。

（2）如遇難切的蠟片時，可用與蠟塊切面差不多大小的薄紙潮濕后貼在蠟塊上切片，然后將附有蠟片的一面朝上放入水中漂片。

（3）如遇易脫片組織（如血凝塊、腦組織）時，可用多聚賴氨酸或APES 處理過的玻片來撈片。

（4）總是切不出完整的蠟片，或皺縮或卷片，可能是刀不利。

（5）切出的蠟片總是皺縮，可能是蠟塊冷凍時間不夠，或是組織脫水、浸蠟效果不好。

（6）切片厚薄不勻或空片，可能是刀未固定緊或蠟塊未夾緊，也可能是切片機有問題。

（7）烤片時間與溫度有關，一般時間寧長勿短，否則會造成脫片。一般烤片溫度控制在62℃，時間為30min左右。

（8）連續切片放入熱水漂片時，不要撈取第一、二張蠟片，因為前2 張蠟片厚、組織有空洞（鏡下可見）。

（9）用于展片漂片儀的溫水必須認真清理水面，不得遺留其它病例的組織碎片以免污染。

（三）HE染色

1、自動染色：見《染色機使用及維護標準操作程序》

2、手工染色（1）脫蠟

①二甲苯Ⅰ 5分鐘 ②二甲苯Ⅱ 5分鐘 ③100%酒精Ⅰ 1分鐘 ④100%酒精Ⅱ 1分鐘 ⑤95%酒精 1分鐘 ⑥80%酒精 1分鐘 ⑦自來水浸洗 1分鐘(2)染色

①蘇木素染液 6分鐘 ②水冼 1分鐘

③0.5-1%鹽酸酒精分化片刻（顏色由藍變紅即可）④自來水沖冼10分鐘左右（顏色由紅變藍）。（然后95%酒精片刻，主要是避免所帶的水份稀釋以下的伊紅酒精，此步可免）

⑤伊紅染液浸染

（3）脫水、透明、封固 ①75%酒精 0.5分鐘 ②85%酒精Ⅰ 1分鐘 ③95%酒精Ⅱ 1分鐘 ④100%酒精Ⅰ 1分鐘 ⑤100%酒精Ⅱ 1分鐘

⑥石炭酸二甲苯(1:3)10秒鐘 ⑦二甲苯Ⅰ 透明 1分鐘 ⑧二甲苯Ⅱ 透明 1分鐘 ⑨取出后用中性樹膠封固。

3、H&E染色注意事項

（1）二甲苯脫蠟時間冬季長些，夏季可短些，為防止脫蠟不凈影響染色，脫蠟時間寧長勿短。

（2）鹽酸酒精分化時間靈活掌握，可以在切片藍化后鏡下觀察。

（3）染色后的脫水透明也很重要，若脫水不完全，切片會模糊不清，脫水的乙醇要保持純度，切片在進入脫水乙醇前盡量把水份去掉。

（4）結束染色的切片用中性樹膠封固。操作時用濾紙輕輕吸去組織周圍的液體，保持組織切片的輕度濕潤，滴少許樹膠，用鑷子取蓋玻片輕輕蓋上。注意封片時不能讓組織切片干涸，否則會出現人為色素即“中性樹膠色素”。封片動作要輕，以防產生氣泡或溢膠。樹膠濃度要適當，預先可用二甲苯調試好備用。太稠不宜操作，太稀易出現氣泡或溢膠。

（四）制片后

制片后過程由封固切片結束到上交切片為止。

1.封固好的切片，由初級實驗技術人員按號碼順序排放在切片夾內，與相應的蠟塊進行校對，檢查切片與蠟塊的號碼是否一致，有無錯號。檢查切片與蠟塊中組織的形狀是否一致，是否切全。仔細粘貼標簽后交上級人員復查。

2.上級人員根據申請單或工作單上的記錄全面仔細檢查切片，評分內容、標準及其分值如下。

外觀（5分）：清潔，無溢膠。載玻片及蓋玻片完整。

標簽（5分）：清潔，號碼清晰，粘貼牢固，貼在指定位置。

裱片（5分）：組織裱貼在適當位置上，方向合適。

厚薄（5分）：切片厚薄均勻一致。

平整（7分）：切片平整無皺折。

切痕（8分）：切片完整，無破裂或劃痕。

透明（10分）：切片透明，無云霧狀，組織固定脫水徹底。

顏色（18分）：核漿著色正，對比度清晰明顯。

層次、氣泡（5分）：染色有層次，深淺分明，無氣泡。

細胞形態（12分）：無擠壓、皺縮及膨脹變形。

污染（15分）：無異物或其它組織混入切片。

潔凈度（5分）：玻片內無殘留染料。如有上述不合格項目，按評分表格標準扣分，總分為100分，90分以上為甲級片，90分～80分為乙級片，80分以下為丙級片。

3.切片檢查完畢后登記交接給負責診斷的醫師。

五、相關文件

（一）《染色機使用及維護標準操作程序》

（二）《切片設備使用及維護標準操作程序》

（三）中華醫學會《臨床技術操作規范-病理學分冊》

（四）浙江省醫療機構管理與診療技術規范叢書《病理診斷與技術規范》

六、相關記錄

（一）《組織切片機使用及維護記錄表》

（二）《染色機使用與維護記錄表》

（三）《病理實驗室恒溫箱溫度記錄表》

第二篇：組織切片技術

南京農大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 組織切片技術注意事項

程序步驟

1、取材

2、固定（固定24h—1W）

3、包埋

石蠟切片：流水沖洗組織塊>>75%酒精1h>>85%酒精1h>>95%酒精1h>>100%酒精（1）1h>>100酒精（2）1h>>二甲苯8-20min>>石蠟2h>>包埋

冰凍切片：固定后的組織>>OCT包埋>>切片或-20度保存；

液氮中的組織>>轉入-20度>>OCT包埋>>切片或保存

4、切片

切片>>展片（40~50度）>>貼片>>干燥（37度過夜或者50~60度2h）

5、HE染色

干燥后的切片>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精(2)1min>>95%酒精1min>>85%酒精1min>>75%酒精1min>>蒸餾水3min>>蘇木精染色30s—5min>>自來水涮洗>>蒸餾水>>75%酒精1min>>85%酒精1min>>伊紅染色>>85%酒精涮洗>>95%酒精1min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精（2）1min>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>中性樹膠封片

6、免疫組化（ABC法）

（1）干燥后的石蠟或冰凍切片（冰凍切片需要緩慢復溫）脫蠟至水；

（2）雙氧水（1%濃度左右）封閉內源性過氧化物酶；

（3）PBS洗滌3×5min；

（4）5%BSA封閉非特異性結合位點，不洗；

（5）滴加適當稀釋度的一抗；4度孵育過夜或37度2h；（6）同上洗滌；滴加二抗，37度1h；

（7）同上洗滌；滴加ABC復合物，37度1h；（8）洗滌5遍，每次5min；

（9）配制顯色液（DAB顯色試劑盒），顯微鏡下觀察顯色；（10）切片浸泡于蒸餾水中終止顯色；（11）蘇木精復染，脫水，封片。

南京農大康海泓整理，Email:snai1621@126.com

注意事項

取材

1.組織越新鮮越好，最好于動物處死后10~20min完成取材，時間過久后組織自溶和腐敗會影響組織形態。

2.取材組織塊不宜過大，一般為5nm以下，2~3nm為宜。如果試驗要求采取大塊組織，最好采樣前注射固定液預固定或采取灌流固定（比如取腦時需灌流固定）。

3.取材使動作輕柔，避免用力夾、捏和拉扯組織，盡可能保持組織原有形態。操作時可用鑷子夾取組織的一個邊角，避免主要組織損傷。

4.如果是大批量取材，取材時沒有時間對組織塊大小進行修正，可將組織（可稍大，但不宜過大）先放在固定液中固定，2~4h后進行修塊，即用鋒利的刀片（刮胡刀片）把組織切至適宜大小。注意不能用剪刀等進行鈍性分離。5.如果對不同處理或不同動物的組織進行比較研究，應對所有動物在同一解剖學位置取材（比如十二指腸距胃3cm處，或空腸距胃10cm處）。

6.取材時注意組織的不同斷面，可將組織的一面用刀片切平作為標示，以便包埋和切片時選取的斷面正確（比如肌肉組織，應區分好橫斷面和縱斷面）。7.一般情況下宰殺動物應放血干凈，取材時除去組織周圍的附屬物，比如筋膜、脂肪等。

8.取得的組織立即固定。冰凍切片組織可先固定后凍存，也可直接凍存，直接凍存一般采取液氮中速凍，然后轉入-20度保存，凍存組織應避免反復凍融，且盡快進行切片或用OCT包埋（包埋后可放置較長時間）。未包埋的組織在-20度長期保存的組織會逐漸脫水（比如肌肉），影響形態學觀察。

9.理論上免疫組化的組織采取冰凍切片，一般運用4%多聚甲醛固定24~48h后用OCT包埋凍存。但對于抗原表達量大且較易檢測的免疫組化，可以采取石蠟切片，但固定時間不能過長，控制在1周以內，長時間固定會引起抗原表位的醛基化和抗原表位構象變化，導致免疫組化檢測靈敏度降低。

固定與包埋

1.選擇合適的固定液，原則是在良好固定組織并保持形態的前提下盡可能的減小對組織的影響。常用固定液為福爾馬林、4%多聚甲醛和Bouin氏液，其中后兩者最為常用，效果也較好。

南京農大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 2.固定液需新鮮配制，新配的固定液固定效果較好。3.固定液體積理論上應為組織體積的20倍以上。

4.一般組織理論固定時間為4~24h，即以固定液完全滲透進入組織的最短時間為宜，實際操作中可延長至數天，但一般控制在1周以內。

5.如果是冰凍切片，固定后的組織最好及時用OCT包埋，能更好的維持組織形態，包埋后的組織可于-20度保存數月。固定后的組織可用蔗糖溶液脫水，方法為直接將組織置于30%蔗糖溶液中，每天換新鮮蔗糖溶液，2-3天組織在蔗糖中沉底即可。一般來說，先固定，然后脫水，再用OCT包埋效果比較理想。6.冰凍切片可以采取后固定的方法。即采得的組織經液氮速凍后直接放入-20度保存，OCT包埋，冰凍切片后用丙酮等對切片上的組織進行固定。但丙酮固定較為強烈，容易發生掉片。

7.石蠟切片時，固定后的組織包埋前一般對組織進行洗滌，通常用自來水沖洗，洗掉組織中的固定液，因為殘留在組織中的固定液可能對染色產生影響。洗滌為可選步驟，我們實驗室通常不洗滌，將固定后的組織直接包埋，并不影響HE染色效果。

8.二甲苯透明時間是影響包埋效果的最關鍵因素，需根據組織種類、組織大小、室溫以及二甲苯的新舊程度綜合考量，必要的時候需要設置時間梯度進行摸索。此外，組織是否脫水完全、是否浸蠟完全也直接影響包埋效果，原則上在能夠完全脫水和浸蠟的前提下，組織在各溶劑中的浸泡時間越短越好。

切片

1.切片成功與否很大程度上取決于組織固定和包埋的好壞。

2.切片厚度：HE等組織學染色一般4~5微米（4微米差不多是石蠟切片的極限），如果切片困難，可適當增加切片厚度（20微米以內越厚越好切），但切片厚度的增加會使得細胞層數增多，影響觀察和美觀。免疫組化中石蠟切片一般切片5~10微米，冰凍切片大約8~14微米，特別是在檢測表達量較少的抗原時，較厚的切片可以增加陽性物質的出現概率。

3.較好的石蠟切片呈均勻連續狀，沒有空洞和破損，組織完整不碎裂。4.切片角度和刀片新舊程度對切片效果的影響較大，切片角度視切片機型號而異；新刀片容易切出完好的切片。刀片應從一段開始使用，發現刀痕時逐漸移動，以最大限度使用刀片。

5.冰凍切片的主要影響因素有：切片機箱體溫度（一般為-25度左右），防卷器位置（太往前切不動，太往后起不到防卷效果）。

6.對免疫組化切片而言，需對玻片進行包被（一般為使其帶正電荷，組織帶負

南京農大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 電荷，通過靜電吸附增加粘附力），增加其粘附性。包被太淺起不到粘附效果，包被太深會導致免疫組化非特異性染色。

展片和貼片（撈片）：

1.燒杯中裝蒸餾水，置于水浴鍋中，溫度一般40~45度，溫度太低片子展不開，溫度太高石蠟會融化。

2.冰凍切片不需要展片，直接將玻片輕靠在組織上，組織便會自動吸附到玻片上。

3.撈片時選取完全展平的片子撈起，寧缺毋濫。一張玻片上可以貼多個組織，最后選染色效果好的封片，增加成功率。

4.未包被過的玻片可重復使用，包被過的玻片貼片后組織很難掉下，不可重復使用。

干燥：

1.干燥可以讓組織貼的更結實。石蠟切片37度干燥過夜，或者45~60度干燥數小時。冰凍切片室溫晾干（夏天一般5~10min），但不可涼太干，太干也容易掉片，判定標準為組織表面沒有明顯的液體為宜，如果組織變白說明干燥時間過長。

2.干燥后的石蠟切片可放切片盒中室溫保存，如果天氣炎熱可以放置4度保存；冰凍切片于切片盒中密封后置-20度保存，短期內試驗可以放4度保存。

染色（以HE染色為例）：

1.液體置換要徹底，特別是脫蠟和脫水步驟。

2.伊紅一般用醇溶性配方，蘇木精配方有很多種，如果用氧化汞方法配制使用前要過濾，因為液體表面容易聚集一層金屬離子薄膜，對染色產生影響。3.新鮮配制的伊紅染色時間1秒即可，存放時間長的染液可以適當增加染色時間。

4.封片時中性樹膠的量要適度。根據組織的大小選擇大小合適的蓋玻片，蓋玻片以能覆蓋住組織為前提，越小越好，太大的蓋玻片溶液不平整，顯微鏡觀察時組織可能不在一個平面，需要反復調整焦距。

5.蘇木精和伊紅染色時，最好摸索染色時間，以尋求最合適和漂亮的顏色搭配，不同的組織染色能力有所差異，比如淋巴組織內淋巴細胞較多，細胞核比較大，染出來可能藍色居多，肌肉組織中肌顯微和細胞質比例高，染出來紅色

南京農大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 居多。

6.總體原則是染色寧愿偏淺不要偏深，偏深的染色難以判別細胞形態和結構。

免疫組化注意事項：

1.免疫組化一般以冰凍切片為主，但石蠟切片也可以做免疫組化。

2.冰凍切片一般采取先固定（4%多聚甲醛），然后用OCT包埋（冰凍包埋）。3.免疫組化步驟繁瑣，時間較長，因此用包被過的切片來防止掉片。常用的包埋劑有APES，多聚賴氨酸和明膠等。包被過程相對簡單，可購公司的商品包被試劑盒，按照說明書操作。

4.石蠟切片的免疫組化有時需要抗原修復。原因：固定液會對組織的抗原性產生影響，示抗原表位發生構象變化，可以通過化學處理和熱處理來還原組織的抗原性。常用的修復液為枸櫞酸鈉緩沖液，一般采取熱修復，即把切片放置在緩沖液中然后加熱至沸騰。

5.免疫組化切片厚度一般為8~12微米。6.選擇合適的抗體（單抗、多抗）。

7.預實驗確定合適的H2O2、封閉液和抗體作用濃度和時間。8.選用包被過的玻片，動作輕柔，防止掉片。9.設置陽性、陰性和空白對照。

10.顯微鏡下控制顯色，放置顯色過淺或過深。

11.復染時蘇木精濃度可稀釋，時間縮短，避免染色過深。

12.遇到問題逐項排除，尋找原因。詳細的問題解決和相關技術貼可參照丁香園論壇或生物秀論壇，搜素“免疫組化”可以找到相關資料。

南京農大康海泓整理，Email:snai1621@126.com

溶液配制

固定液

4%多聚甲醛：4g多聚甲醛粉末加入100ml 0.1M PBS，邊加入邊加熱攪拌，滴加0.2M NaOH溶液并60度水浴促進粉末溶解，完全溶解后HCl調PH至7.4，4度保存。

Bouin氏液：75ml 飽和苦味酸溶液，25ml多聚甲醛，5ml冰醋酸；使用前三者混在一起，混勻。

染液

伊紅染液：1%醇溶性伊紅配方為1g伊紅加入到100ml 80%酒精中，溶解。

蘇木精染液：

1.哈里新（Harris）蘇木紫液：甲液：蘇木紫Ig，無水乙醇10ml。乙液：硫酸鋁鉀（或銨）20g，蒸餾水200ml，加溫溶解。甲、乙二液分別溶解后混合，加熱煮佛，沸后去火，待溶液不翻騰時即加入氧化汞0.5g（此時有大量氣泡生成，故容器宜大，以免液體溢出）。然后染液迅速冷卻，冷卻后過濾，即可位應用。用時每100ml加冰醋酸4ml；

2.邁爾（Mayer）蘇木紫液：將蘇木柴0.1g放入蒸餾水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸鋁鉀5g，和碘酸鈉0.02g，攪動直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g，加煮沸5min，冷卻、過濾，放置過夜，即可應用。染色時間約10~20min；

3.歐立區（Ehrlich）蘇木紫：將蘇木紫2g溶于無水乙醇100ml中；將硫酸鋁鉀15g溶于蒸餾水100ml中，加入甘油100ml，將二液混合，最后加入冰醋酸10ml，充分混勻后，盛于無色小口瓶內，暴露于日光下，使其自然成熟，約需3個月。染色時間約5~20min。此液貯存愈久，染色力愈強。若在其中加入碘酸鈉300mg，使人工成熟，配成后即可應用；

4.卡拉茲（Carrazzi）蘇木紫：將蘇木紫0.5g溶解于甘油100ml中，將硫酸鋁鉀25g溶解于蒸餾水350ml中溶解后將二液慢慢混合，并充分搖勻。將碘化鉀0.1g放于蒸餾水50ml中，加微溫溶解，然后加入蘇木紫液中，充分搖勻，翌日可用。

南京農大康海泓整理，Email:snai1621@126.com

免疫組化

0.3%~1%雙氧水：

商品化30%雙氧水溶甲醇稀釋到適當濃度。

1~5%BSA（羊血清、脫脂乳）： 0.01M PBS配制。

Triton-PBS：

100微升Triton-100加入到100ml 0.01PBS中，混勻。

第三篇：組織切片必看

1.組織的取材

取材時要注意及時快速固定，避免剪刀鑷子損傷組織，組織要取全。全盤考慮進行病理切片的組織類型，病變可能累及的部位，組織包埋需要的剖面。2.組織的固定

在組織病理學中，不管是組織切片乃至電鏡還是大體標本的保存，都必須進行及時的適當的和有效的固定。組織只有經過固定，才能完成隨后的一系列的制作，直至切片的最后完成。

固定的作用：從組織學的角度其簡單的定義是，保持細胞、組織的固有形態和結構，使之盡量保持細胞、組織的固有形態和結構，而從免疫組化技術的角度，固定的作用不僅是使細胞內蛋白質凝固，盡量減少或終止外源性酶和內源性酶的反應；防止細胞的自溶，以免使抗原擴散至組織間質；以保持組織的固有形態和結構；更重要的是保持組織或細胞的抗原性，不但要使抗原不導致失活，而且不使抗原發生彌散的現象，才能在免疫組化染色時，不產生過深的背景，影響對陽性物的判斷。

固定的目的

①能防止細菌的腐蝕和組織的自溶。細菌無處不存在，它們隨時都可污染腐蝕未經處理的組織。固定液可以固定任何蛋白質，凡有生命的東西，都由蛋白質組成，蛋白質被固定，生命就停止，細菌也就失去了活力。另者，在日常生活中，人們常可碰到這樣的問題，一塊肉不經處理放了幾天后就會變質，這是為什么呢？除了細菌參與外，其本身也是很重要的。因為組織離體后，供應這此組織的血液隨之消失，細胞缺氧，細胞內溶酶體膜的結構受到破壞，破壞后釋放出溶酶體酶，日常生活中常碰到的肉變質，就是細菌污染加組織自溶的結果。

②保存細胞固有的物質，能凝固或沉淀細胞內或組織液，糖元等，使細胞或組織基本上保持與生活時的物質一樣。細胞的固有物質，即細胞核、內質網、線粒體、高爾基器、溶酶體、過氧體，細胞骨架，組織液，抗原、糖元等。這些物質，如果不將其及時固定，是很容易喪失的，尤其是溶酶體，很容易受到破壞，因此應特別小心。

③使組織硬化，便于切塊。剛離體的組織，除了胃組織以外，都是柔軟的組織，尤其是胃腸道的組織，如果在沒有固定時就取材，效果就很差，不是取材不規整，就是厚薄不均，粘膜和肌層很容易分開，因此，要取得規整標致的材料，就必須將組織徹底固定，再行取材。

④對某些具有傳染性的標本，能防止疾病的擴散。病理標本、種類繁多，成份復雜，各種病例都有，具有傳染性的病種也不少，如結核、肝炎、麻風、性病等等。對于此類標本，應進行徹底的固定后，再行取材，如結核球，固定時間應在3-5天。

⑤可增強染色的作用。組織經過及時的固定，最終可見到切片有鮮艷的染色，而些時如果有一批未經及時固定的組織，將看到最終的結果是，核染色不清楚，灰淡色，由此可得結論，固定可以增強染色的作用。

固定的注意事項：

①組織固定越新鮮越好。組織一經離體，就能及時地固定，這是最好的。根據實驗，如果要獲得某些酶的染色，固定最好在組織離體后30秒至1分鐘。對于其它達不到些要求是越快越好。原則上動物死亡后半個小時內取完并及時固定組織。

②組織固定，組織塊不宜過大。凡是需要固定的組織，都不應該太大太厚，這是因為所有的固定液穿透力不夠強，浸透度不夠快的緣故。如果較大厚的組織，不經處理就進行固定，那么待固定液進入至中間對可能這些組織早就發生自溶了。因此，對于較大的組織，必須先進行處理，切成制片材料再行固定，這是最佳的處理方法，如遇到胃腸的器官，則應將其剪開，放平后，再行固定，若非特急病例，最好在固定后才取材，因這類組織、粘膜和肌層容易分開，沒固定時，難以取得最佳制片材料，對于產酶類的器官如肝、腎、脾等，更要處理好，否則更容易出現自溶現象。

③對不同類型的組織應適當合理地選擇固定液。固定劑的種類繁多，成份復雜，對組織的作用不盡相同。在我們的日常工作科研中，對于組織的固定，應有針對性的選擇，方能獲得滿意的效果。對于腎，睪丸等泌尿系統和新生仔鼠應選擇Bouin氏固定液。免疫組化可以選擇多聚甲醛和中性緩沖甲醛；我病理室一般選擇中性緩沖甲醛，它可以兼顧常規染色和免疫組織化學。

④組織固定，時間不宜太短，也不宜太長。固定時間應根據取材大小、性質以及類型有關，視具體情況而定；時間太短，就不能很多的固定組織，因為不管組織大小，固定液浸入組織之中，都需要有一定的時間，時間太短，就會影響組織固定的效果，對以后一系列關系的處理都有影響，切片質量難以保證，固定時間太長，也不好。組織長時間的固定，福爾馬林會產生一種酸，影響核的染色。對于固定很長時間的陳列性標本制片后切片染色不鮮艷，顯得非常陳舊。另外，長時間的固定往往會出現福爾馬林色素，尤其是造血器官的標本，更應注意。固定時間過長，可降低抗原的活性。一般小鼠組織固定24h即可。

⑤固定液的量要充分。固定液量的足夠與否決定著組織固定的成敗。一般固定液和組織體積比為10：1~20：1之間。

⑥特殊病例或特殊物質應選擇特殊的固定液。一般的病例標本，如沒特殊的要求，都可以應用甲醛配成的各種固定液來固定。但是，如果要顯示狂犬病毒的包含體時，應用上述的的固定液就不行了，必須采用丙酮來固定，顯示糖元，可選擇無水酒精或丙酮來固定組織。

3.常規石蠟切片制片過程

組織經系列酒精的脫水，經透明劑的作用，經熔化的石蠟的浸漬，包埋后所切成的切片稱為石蠟切片。制片過程的每一步每一環節處理不好都會影響切片質量。

組織脫水：

把含于組織內或細胞內的水份用脫水劑把其置換出來的過程稱組織脫水。不管是正常的組織，還是有病變的組織，都含有不同程度量的水分。據測定，人體的物質組成約含水55~67%，蛋白質15~18%，脂類10~15%，無機鹽3~4%及糖類1~2%[14]。如果不把這些水分脫去，石蠟切片將無法進行，因為石蠟和水不能混合在一起，所以除去組織中的水分成為制片中的關鍵，至今為止，國內常用的都是酒精。因它不管在什么樣比例的情況下都能和水混合，所以它可以慢慢地將水從組織中置換出來。酒精脫水力強，對組織又有硬化和易脆的不良影響。在使用時，通常是從低濃度至高濃度，濃度系列通常是70%、80%、90%、95%和100%，組織經過這一系列處理后，基本可達到脫水的目的。

每一步的組織脫水都需要控制好脫水時間，一般根據組織塊大小和組織類型而定。短了脫水不干凈，長了會使組織切片時易脆。組織的透明：

組織脫水后，要經過一個浸蠟前的中間溶劑透明過程；才能進行浸蠟。透明的目的：組織經脫水后、浸蠟前必須經過某些既能與脫水劑相混合又能溶解石蠟的中間溶劑處理。組織在中間溶劑時，組織間隙內存留的脫水劑完全為中間溶劑所取代時，組織就呈現透明狀態，此時即可進行浸蠟。透明液多采用二甲苯，組織經無水乙醇脫水后轉入二甲苯透明，組織的大小、厚薄不同，透明時間也不同。透明時間短了，透明不完全，導致切不了片，透明時間長了，透明過度，導致切片易粉易碎。組織浸蠟：

用于浸蠟的石蠟最好是熔點稍低（56～58℃），低溫浸蠟對保存組織細胞內的抗原免疫活性，避免組織收縮和變硬變脆有幫助，以盡量清除二甲苯蠟滲透到組織中起支撐作用，切片時才能把完整的組織和蠟一起完整切下來。不同大小和厚薄的組織浸蠟時間有所不同，一般為1～3小時。浸蠟溫度過高，浸蠟時間過長或不夠均可導致組織收縮，變硬變脆，難以切出理想切片。組織包埋：

組織經浸蠟后即可進行包埋。包埋時，包埋石蠟的溫度要比組織高（約3~5℃），否則包埋冷凝后組織與包埋石蠟分離，特別是在冷天包埋時，動作更要迅速，否則容易導致組織與石蠟融合不好，影響切片。包埋時把組織最大最平切面或所需的病灶切面向下，對皮膚、腸管和囊壁等層次清楚的組織其切面應包含有各層組織。組織包埋要選擇所需要的組織切面。組織切片：

組織切片厚薄要適宜，薄的切片細胞不會重疊，易于觀察。切片的厚度應為3～4μ，組織蠟塊過硬，切片刀或蠟塊沒固定好，會出現跳刀、切片成一截厚一截薄的現象。優質的組織切片要求切片較薄，平整，無刀痕，皺褶。切片太厚或呈波浪狀厚薄不勻。貼片烤片：

烤片時間短，會造成染色時切片從載玻片上脫落或脫蠟不凈，染的切片會著色淺、不上色或灰染；烤片時間長，會造成對組織的損傷。染色：

染色染色的程度包括脫蠟、浸水、染色、分化、促藍、脫水、透明等過程。切片經過脫蠟至水，HE染色后，要徹底脫水透明，才能用中性樹膠封蓋。如果脫水不徹底，封片后呈白色霧狀，鏡下觀察模糊不清，且容易褪色。要求組織結構清晰，色彩鮮艷，細胞核/細胞質對比分明。

組織病理切片質量的影響因素

2009-08-19 編輯： 【打印】 【關閉】

第四篇：組織切片課程設計

生物制片技術課程論文—

—鯉魚脾臟組織結構

摘要：組織切片方法是教學、科研、病理檢驗工作中廣泛應用的一種實驗技術,所謂組織切片，即取動物某一實體器官上的組織塊用包埋劑包埋，然后進行切片及染色的制片過程。在整個制片過程中，包括有取材與固定，脫水與透明，浸蠟與包埋，切片與粘片，染色與封固五大步驟。石蠟切片是組織切片方法中最為簡單和常用的切片方法，本實驗選擇石蠟切片法制作鯉魚肝臟組織切片。制作時需對每一步都必須認真對待，否則將達不到預期效果，甚至導致制片工作的徹底失敗。本文就傳統的石蠟組織切片方法進行了全面地改進試驗研究，使組織固定完全，脫水徹底，透明適度，浸蠟充分，切片較薄，染色良好；不僅縮短時間，簡化程序，節省藥液，而且提高了組織切片的質量。

關鍵詞：動物組織；HE染色；石蠟切片

Production and observation of the spleen tissue of fish Abstract: Tissue slice method is a kind of experimental technology.which widely used in teaching, scientific research and pathological examination.So called tissue slices, that is, the body of a solid organ on the tissue piece with paraffin embedded, and then slice and dyeing of the production process.In the entire production process, including the material and the fixation, dehydration and the transparency, the immersion wax and the embedding, the slicing and the sticky piece, the dye and the seal five big steps.Production, every step must be taken seriously, otherwise it will not achieve the desired results, and even lead to the failure of the production work.In this paper, the traditional method of tissue slicing has been comprehensively improved, which makes the tissue fixed, dehydrated, transparent and appropriate, the dip wax is sufficient, the slice is thin, and the dyeing is good.Key words: animal tissue;HE staining;Paraffin slice

一、實驗目的

1,、通過對鯉魚的結構觀察，了解魚類的主要特征以及魚類適應于水生生活的形態特征。

2、了解生物制片主要方法；

3、掌握石蠟切片和H·E染色技術。基本設備及常用試劑

二、基本設備

1、顯微鏡：光學顯微鏡

2、切片機：輪轉式、滑動式（平推式）、冰凍式、振動式。均有三組部件安裝在牢固穩定的切片機身上：①刀架。②組織塊夾具。③微動調節器。

3、恒溫箱或干燥箱

恒溫箱是切片不可缺少的設備，主要供浸蠟、烤片、烘烤清洗后的玻璃器皿及某些需要加溫60℃以上時應用

4、冰箱 用于保存染液、試劑和藥品并提供切片用冰

5、離心機

可供脫落細胞及染色體技術用

6、切片刀、天平、酸度計、定時鐘、一般手術器械、染色缸、染色架、載玻片、蓋玻片、常用玻璃器皿、毛筆、酒精燈等。

三、常用試劑

1、洗液

重鉻酸鉀300g 濃硫酸 300ml 自來水 3000ml，即重鉻酸鉀、硫酸與自來水之比為1：1：10。

先將重鉻酸鉀溶于水，如加熱須待冷后，再緩緩加入濃硫酸，邊加邊攪。不準將水倒入濃硫酸內！另外，清潔液只能用于玻璃儀器的清洗，不能浸泡金屬器械。

2、蛋白甘油：蛋清打泡，靜置、過慮，加入等量甘油，充分混合，加入1%麝香草酚或樟腦防腐。

3、鹽酸-酒精：作分色用，100ml的70%酒精加入0.5或1ml濃鹽酸。

4、酒精稀釋液：用95%酒精稀釋使用。如將95%酒精稀為70%酒精時，可取70ml的95%酒精加水至95ml即成，依次類推。

5、堿性水：0.1%氨水或1%碳酸鋰水溶液6、10%福爾馬林：

商品甲醛 10ml

水 90ml

7、蘇木精溶液： 甲液：蘇木精2g

無水酒精20ml 乙液：甲礬40g

蒸餾水400ml 丙液：高錳酸鉀1g

蒸餾水16ml 三液分別溶化，然后將甲液注入乙液，再加丙液6ml，時時攪拌，加溫至煮沸0.5-1 min，使速冷卻后即可使用。

四、實驗步驟

實驗材料：新鮮的鯉魚一條

1.殺死與取材：用手術刀和鑷子按要求迅速找到魚的脾臟，然后取出，要求動作迅速。

2.固定：使用小塊組織固定法，取下的小塊組織，立即置入10%福爾馬林固定液中進行固定。

3.洗滌：因為小組織可不沖洗，所以本實驗需要多次換水浸泡即可。4.脫水：先放入70%酒精中30min，然后80%酒精30min，95%酒精30min, 95%酒精30min, 無水酒精30min, 無水酒精30min，5.透明：比例為1:1的無水酒精和二甲苯混合（30min），二甲苯20min, 二甲苯10min.6.浸蠟與包埋：比例比1:1二甲苯和石蠟（30min）,石蠟30min，石蠟30min，包埋。

7.切片：將熔化好的石蠟倒入包埋框或包埋盒，用加溫的鑷子將組織塊切面朝下放入，做好標記，冷卻。完全凝固后，修整蠟塊。將切片機準備好，調整好角度，固定好刀架、刀片和蠟塊，切片厚度：6-8μm；轉速：40至50次/min。8.染色：二甲苯（5 '）→1:1二甲苯+無水酒精（5'）→無水酒精（2'）→95%酒精（2'）→80%酒精（2'）→70%酒精（2'）→蘇木精（15'）→自來水洗（2'）→1%鹽酸酒精（30''）→自來水藍化（15'）→蒸餾水（2'）→70%酒精（2'）→80%酒精（2'）→伊紅（1'）→95%酒精（2'）→95%酒精（2'）→無水酒精（2'）→無水酒精（2'）→二甲苯（2'）→二甲苯（2'）

9.封固：切片經染色透明后，取出切片，滴一滴中性樹膠，將蓋玻片蓋于切片上。貼上標簽注明名稱、編號。10.觀察

五、總結與討論

石蠟切片實驗是細胞生物學實驗的重要部分，迄今為止石蠟切片仍然是疾病診斷，尤其是病變性質判斷的重要手段。石蠟切片過程中，最易受到操作人員實驗技術影響的步驟是浸蠟、包埋，而且包埋效果直接影響到實驗結果的好壞。正確應用動物組織切片技術與完成動物組織切片染色標本的制作好壞關系重大。

六、參考文獻

[1] 劉育艷.制作優質實驗動物組織切片的有效方法.山西醫科大學學報.2001，21（3）：275-276.[2] 任成林，田勇，梁淑珍.動物組織HE染色石蠟切片技術的改進, 河北北方學院學報.2007，23（1）:41-45.[3] 袁廣明，胡黎平，李燕，陳大堤，謝富康.成年斑馬魚石蠟連續切片的制作和蘇木精-伊紅染色.解剖學研究, 2006，28（1）:73-74.[4] 李華.淺談制作實驗動物組織石蠟切片的方法和體會.2011年全國病理技術新進展研討會論文匯編.2011:171-173.[5] 何書海，陳宏智，焦鳳超.動物病理組織切片制作方法的改良.動物醫學進展 2011,32（11）:130-132.[6] 高書堂.在教學和科研中應用動物組織切片技術的體會.湖北教育學院學報.1992，(2).[7] 彎雪燕．常規石蠟切片中浸蠟包埋方法的改進[J]．診斷病理學雜志，2000，7(4)：303-304．

[8] 楊捷頻．常規石蠟切片方法的改良[J]．生物學雜志，2006，23(1)：4546．

第五篇：組織切片技術

組織切片技術

姓名：許莎

班級：生技1學號：12772018

組織切片技術是研究生物組織或細胞形態和結構的重要技術，對于促進細胞生物學和遺傳學等研究的發展起著重要作用。最早的制片技術是徒手切片技術，以后發展了利用石蠟進行包埋和切片的制片技術，即石蠟切片技術，該技術由于成本低，操作簡單，目前仍在應用，該技術被越來越多的研究工作者應用于發育學、植物細胞學、胚胎學、解剖學等研究領域。

1組織切片技術原理

1.1原理

組織切片技術是研究組織形態學最常用的一項基本技術，在制作胚胎或組織切片時，由于細胞或組織是柔軟的或局部的軟硬不均，這樣制作厚薄均勻的切片很困難。為了能清晰地觀察到組織結構及細胞形態，必須先經過一系列步驟將組織內滲入某些支持物質，使組織變硬然后利用切片機將組織切成薄片。根據所用支持劑的種類不同，主要分為石蠟切片、冰凍切片、振動切片、火棉膠切片、塑料切片、碳蠟切片等。

1.2分類

1.2.1石蠟切片

該技術是最重要、最常用的組織切片技術之一，起始于18世紀。此法是用石蠟作為包埋劑，將材料經過固定、脫水、透明后包埋在石蠟中，然后連同石蠟用切片機一同進行切片。石蠟切片的主要優點是不僅可以把材料制成薄的切片，而且還能制成連續切片，這是其他制片技術難以做到的。它的缺點是操作步驟比較復雜，而且材料在脫水、透明過程中會收縮、[1]變硬、變脆，以致不易切片。1.2.2冰凍切片

冰凍切片是利用干冰或液氮等速凍劑使組織迅速冷凍硬化，將組織在冷凍狀態下直接用切片機切片的一項技術。它實際上是以水為包埋劑，將組織進行冰凍至堅硬后切片的。由于此法不需要經過各級乙醇的脫水、二甲苯的透明和浸蠟等步驟，因而較適合子脂肪、神經組織和一些組織化學的制片，并作為快速切片的方法應用在臨床診斷冰凍切片是酶組織化學和免疫組織化學染色中最常用的一種切片方法。此種切片的優點是能較好的保存組織的RNA穩定性、較完好地保存細胞膜表面和細胞內多種酶活性以及抗原的免疫活性，缺點是需要較高的設備要求;切片較厚，導致組織結構顯示欠佳;通常不能進行連續切片。其主要操作技術和方法與石蠟切片過程和類似。1.2.3振動切片

是用振動切片機把新鮮的組織切成厚20-100pm的切片。此類切片的優缺點類似于冰凍切片。通常在切片后進行免疫染色然后再進行電鏡切片,以此來彌補結構顯示不清的不足。振動切片機主要用于新鮮或經過固定的動、植物標本的制片，切片時組織標本不需冰凍或包埋。因此.樣品片既避免了冰晶破壞，又能保持其活性和細胞良好形態為免疫細胞化學研究以及脊髓和腦薄片的神經生物學研究提供了良好條件。振動式切片機可以對不同的材料進行切片，在應用范圍上補充了使用傳統切片機的不足，是當代電鏡、解剖、組胚、生理、醫院化工等實驗系統最理想的快速制樣切片儀器。1.2.4火棉膠切片

是以火棉膠為包埋劑浸入包埋組織。優點是可以切較硬的組織，缺點是操作比較麻煩費時,切片較厚,不能連續切片。1.2.5塑料切片

用干硬度大的組織標本的包埋。由于塑料包埋組織細胞收縮程度小，切片薄，有利于組織細胞細微結構的觀察，加之新型塑料包埋劑的出現和聚合方法的改進使塑料包埋技術得到了更為廣泛的應用。塑料包埋使用的包埋劑是各種樹脂，未聚合的樹脂為勤稠的液體.通過標本組織塊的沒潤，樹脂可滲透到組織間隙中。自發或在催化劑和加速劑的作用下，發生分子回的連接形成支架，支撐組織細胞結構，聚合完成后形成固體硬塊。其優點是可以切出薄至0.5-2nm的切片，適用于同時作光鏡和電鏡檢測。缺點是處理程序繁多,抗原活性易丟失。1.2.6碳蠟切片

以碳蠟為包埋劑，優點是組織固定水洗后不需脫水透明,可以直接浸碳蠟包埋,切片方法于石蠟切片相同，缺點是夏季溫度較高時切片困難。

1.3制備方法

以石蠟切片為例，介紹切片標本的制備方法。

1.取材：根據科研和教學目的選擇新鮮材料，然后進行適當的切取、分割。樣品塊要盡量小，以便于下一步固定。

2.固定：將選取的新鮮材料立即投人到固定液中，迅速殺死細胞以保持組織及細胞的原有結構。一般固定液的最少用量為所固定材料總體積的20倍。固定液的選擇視材料的性質及制片的目的而定，一般要求盡快殺死并固定細胞和組織。石蠟切片常用的固定液有FAA固定液、卡諾固定液，此外，還有多聚甲醛、戊二醛、乙醇、乙酸等。

3.洗滌：材料固定后，用洗滌劑將材料中的固定液洗掉，以便進行切片的染色或制片，常用的洗滌劑有水或乙醇。

4.脫水：因為固定和洗滌后的材料含有大量的水分，而水和透明劑、包埋劑(石蠟)不相溶，所以必須經過脫水逐步、徹底除去材料中的水分，才能進行透明和包埋。常用的脫水劑是乙醇，另外還有乙醇、正丁醇、丙酮、環氧丙烷等。脫水過程應由低濃度到高濃度逐級進行，不可太快。否則會使細胞收縮或材料損壞。

5.透明：透明是脫水與浸蠟、脫水與封藏之間的橋梁。材料經脫水后，組織內部已沒有水分，但脫水劑不能與石蠟相溶，致使石蠟不能進人細胞與組織。因此，需要一種既能與脫水劑混合又能與包埋劉石蠟相混合的溶劑來處理。透明在制片中很重要。如果組織不透明，表明脫水不徹底，必須重新返工，但返工效果往往不好，常用的透明劑有二甲苯、氯仿、冬青油等。

6.浸蠟：浸蠟是將石蠟包埋劑慢慢溶于浸有材料的透明劑中，溶解在透明劑中的石蠟逐漸滲人到材料的組織細胞中，最后使透明劑被石蠟取代。進人組織細胞中的石蠟，在熔點以下很快凝固成固體，凝固后的石蠟起支撐作用，使切片后的細胞組織固定在原位。

7.包埋:將透蠟的組織連同熔化的石蠟，一起倒入包埋盒內，然后包埋盒底部接觸冷水中，使其立刻降溫凝固成蠟塊。操作過程：包埋時，將紙盒放在已經加熱的溫臺上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯，迅速輕輕地用鑷子夾取材料平放于紙盒底部（注意切面朝下放置），再用溫鑷子輕輕撥動材料，使之排列整齊。待石蠟完全凝固（約30min）后即可取出備用。

8.切片:已包埋好的石蠟材料，在進行切片之前需先進行修快、固著。修塊：切片前需修整蠟塊，即將包埋好的一大塊蠟塊切開，使每一小塊都含有一塊組織，從切面看組織周圍的石蠟相等。固著：將修好的蠟塊粘在大小適宜的樣品臺上，以便于固定在切片機上。切片：一手持毛筆，一手轉動切片機，切片的蠟片連成一長條蠟帶。切下的蠟帶放在干凈黑紙上。切片操作時應注意隨時關好停刀軋，不能對著蠟帶講話以免吹散蠟帶;切片完畢，將刀取下擦凈。涂上潤滑油，放人盒內保存。9.粘片、展片：通過粘貼劑把合格蠟帶貼在載玻片上，在貼的同時，借助水的張力使蠟帶完全伸展、平貼在載玻片上，粘片和展片是在載玻片上同時完成的步驟。常用的粘貼劑有蛋白粘貼劑和明膠甘油粘貼劑兩種

10.脫蠟、透明：在染色之前，需要用脫蠟劑溶去組織和細胞的石蠟，進一步清洗脫掉的石蠟，使細胞、組織透明清晰，用于脫蠟和透明的試劑是二甲苯。

11.染色：為了使植物組織和細胞各部分顯像清楚，必須進行染色。運用不同的染色方法和選用不同的染色劑，使組織或細胞某一部分染上顏色，另一部分不染上顏色成為背景;或將不同部分染成不同的顏色，可使組織細胞在光學顯微鏡中顯像清晰，便于觀察。

12封片：切片染色后用膠類物質將其封固，以利于長期保存。

2切片技術的應用

2.1石蠟切片技術的應用

石蠟切片雖然是經典的方法但隨著新的儀器和研究技術的不斷問世，出現了與其他新的[2]技術方法相結合，從而開辟了許多新領域，增加了許多新的研究、觀察內容，使組織學的觀察研究從簡單的形態結構深入到各種成分的定性觀察，定量計測，使細胞組織的形態、功能及代謝三結合，從而達到定性可靠、定位準確及定量可測，最終闡述了生命活動的最基本規律。

2.1.1三維重建

重建技術在闡明生物體組織結構與生理功能之間的關系以及在形態學、比較解剖學、細胞化學定位等領域的研究中有著重要的意義。早在1958年，Sjostrand就論證了這種方法的[3]可行性和可靠性，是最早報道利用組織切片進行骨二維重建的學者，隨后LUCZ也用同樣的方法進行了嘗試，但是，由于當時的切片技術和計算機技術都較落后，故效果不如人意。4]直到2000年Mason[再次用同樣的方法進行了三維重建。隨著計算機技術的不斷發展，這項技術在國際上正在繼續進行廣泛深入的研究，在國內也引起了廣泛的研究興趣，例如對血

[5]管大鼠松質骨、中國虛擬人行切片后三維重建，同時也對方法進行了很多研究。特別是目前正在研究的“中國虛擬人1號”，表明我國是繼美、韓之后世界上第三個用人體切片合成虛擬人的國家。2.1.2免疫組化

組織制片技術與免疫學技術結合構成免疫組織化學技術，利用抗原與抗體的特異性結合原理，檢測組織切片中細胞組織的多肽及蛋白質等大分子物質的定性和定位觀察研究。冰凍切片手續簡便，制片過程中抗原活性丟失少，但組織細胞形態較差;石蠟切片步驟繁多。一般石蠟包埋的組織切片用于檢測胞漿或核內的抗原，不宜做表面抗原染色，乙醇、丙酮等固定劑對抗原破壞較輕，但結構保存較差。2.1.3原位雜交

隨著分子生物學的發展，在Southern blot, Northern blot等分子雜交技術基礎上建立了原位雜交技術。原位雜交技術具有高度的準確性和敏感性，它能在細胞甚至亞細胞的水平上定位特異性核酸分子序列。因而，這一技術是目前研究分子細胞生物學、發育學等方面的重要[6][7]手段。例如，在心肌石蠟切片中檢測克山病(KSD)RNA ,在乳腺癌石蠟切片中檢測ER mRNA, [8][9][10] PR mRNA，在骨組織石蠟切片中檢測整合素R 1-mRNA，在肝組織中檢測丙型肝炎病毒RNA2.1.4原位PCR

原位PCR技術是直接在細胞或組織標本上原位擴增目的DNA或RNA片斷，并在原位檢測其擴增產物的技術，它兼有PCR的敏感性和原位雜交的特異性。2.1.5組織芯片

組織芯片是將成百上千的小組織整齊排列在某一載件上從而組成的微縮組織切片。該技術利用并行化處理原則、微量化檢測的優點，結合分子生物學和形態學原理，具有經濟、簡便快捷、信息量大的特點，能夠在DNA,RNA和蛋白質水平檢測基因表達。2.1.6檢測凋亡

檢測凋亡的方法很多，形態學觀察是判斷細胞凋亡的基本方法。可用于體內外細胞凋亡的研究，既可用于組織切片的原位檢測，也可對培養細胞通過細胞涂片或切片的檢測，特別是在常規石蠟組織切片中，可對凋亡細胞進行原位檢測，監測某一或某些處理因素引起體內組織細胞凋亡的動態變化。

2.1.7石蠟包埋組織流式細胞儀DNA含量分析

石蠟包理組織切片與流式細胞術結合使用來測量DNA含量及倍體分析。由于制備樣品技術的原因，過去許多流式分析資料僅限于采用鮮組織標本，Hedley等1983年首先報導了FCM分析石蠟包埋組織切片制備分散細胞懸液技術來進行DNA含量的檢測，從組織切片中能獲得足夠數量的單個細胞，且與新鮮組織分離獲得的單個細胞在形態及DNA含量組方圖上均極為相似，目前國內也在逐步開展這方面的研究。

2.2塑料切片技術的應用

2.2.1塑料切片技術在水稻生殖發育研究中的應用

利用塑料切片技術對水稻花粉、胚囊發育、受精和胚胎發生、胚乳發育以及突變體等進行深人研究，例如，以7022LR為包埋劑，塑料切片技術觀察水稻IR36的胚胎發育過程。

參考文獻：

[1] 梁化印，郭瑞峪.杜雙存 等塑料切片技術介紹[1]臨床與實臉病理學雜志.2004.20(5).[2] 劉能保，王西明.現代實用組織學與組織化學技術[M1湖北:湖北科學技術出版壯.[3] 王伯法，李玉松.黃高升等病理學技術 北京:人昆衛生出版社,2000

[4] 北京未來新世紀教育科學研究所主編,生物知識探討,遠方出版社,2006.01,第10頁 [5] 李希平,夏寅,韓德民,等.基于虛擬中國人數據集的鼻部及顆骨解剖結構三維重建.中 國臨床解剖學雜志,2004,22(4)[6] Delellis RA，etal.New teehoique singene Produetanalysis.ArehPatholLabMed 1987 [7] 任立群,趙志濤,孫波,等.石蠟包埋組織切片原位核酸雜交研究.白求恩醫科大學學報, 2001 27(3)[8] 陸良勇,黃偉達,劉尚廉,等.應用RNA原位核酸雜交檢測乳腺癌石蠟切片中ER rnRNA、PR1llRNA表達.中國組織化學與細胞化學雜志,2002,3,11(1):92, 97 [9] 劉少華,程剛,李聲偉,等.石蠟包埋骨組織切片核酸原位雜交研究.臨床口腔醫學雜志, 2002,10,18(5)[10] 王春杰,胡沛臻,王文亮,等.原位雜交檢測石蠟包埋組織中丙型肝炎病毒RNA.中國組 織化學與細胞化學雜志,1995,9,4(3)