第一篇：病理組織切片制作技術

病理組織切片制作技術

病理組織切片常用的制作方法有三種。即石蠟切片法，冰凍切片法和火棉膠切片法。以石蠟切片法為代表，切片的基本制作過程是：

組織取材→固定→沖洗→脫水→透明→浸蠟→組織包埋→組織切片→展片附貼→切片脫蠟→染色→脫水→染片透明→封固。

以上基本過程是互相聯(lián)系的，任何一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都將使整個切片制作歸于失敗。因此應細致、耐心、認真負責，并事先做好計劃安排。

一、取材

采取病料，要刀剪銳利，剪切時不可擠壓，扯拉病料，以防人為損傷。切取的工具要清潔。采取病料越新鮮越好，一般不超過死后24小時。應選擇病變部與可疑病變部切取，切取時要由表及里，有淺入深并包括周圍正常組織一部分。特殊病料應根據(jù)器官的結(jié)構(gòu)特點切取。管狀，囊狀和皮膚組織應注意垂直切取（橫切）。帶有薄膜的組織，要防止切時薄膜分離和脫落。

切取組織塊大小，以1.5×1.5×0.3厘米為宜，最厚不宜超過0.5厘米。組織塊病變一面應平整光滑，另一面可不平整，以便包埋時辨認。切取后，放入事先準備好的裝有固定液的磨口玻璃廣口瓶中，并做好標記。

二、固定

固定的目的是迅速將組織細胞殺死，使細胞中的蛋白質(zhì)，糖，脂肪等凝固，從而保持與活組織相似的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。材料取下后，應迅速固定。固定液數(shù)量應為病理組織塊的5到20倍。由于一般把組織塊浸入固定液后數(shù)小時，固定液滲入組織液的深度只達2到3厘米。因此，可以放置冰箱內(nèi)固定，使組織內(nèi)酶失去作用，細菌也能停止滋生。

最常用的固定液是10%的福爾馬林溶液：使用時，用40%的甲醛飽和水溶液10毫升，加水90毫升配成。

三、沖洗

固定后的組織塊，應將固定液洗去。一般均用流水（自來水）沖洗12到24小時左右。及時沖洗尚有停止固定的作用，防止固定過度，有利于制片染色。

沖洗時如不方便用流水沖洗，也可用較大容器盛裝水浸洗，每隔相當時間換水一次。整個浸洗時間比流水沖洗應稍長一些。酒精固定的組織材料不需沖洗。

四、脫水

經(jīng)過固定的組織，沖洗后要進行脫水。脫水的目的在于將組織內(nèi)的水分用酒精或其他溶劑置換出來，為石蠟等其他包埋劑浸入組織創(chuàng)造條件。常用的脫水劑為酒精。由于酒精可以任何比例與水結(jié)合，對組織穿透力強，又能使組織硬化，因而不能將組織從水中直接移入濃度高的酒精中，應從低濃度逐漸到高濃度。脫水必須充分，否則給浸蠟造成困難。

除用酒精作脫水劑外，還可以用正丁醇（N—Butyla alcohol）。正丁醇微溶于水，能與各種濃度酒精混合，也能直接溶解石蠟。故組織經(jīng)正丁醇脫水后，不須經(jīng)二甲苯透明。用正丁醇作脫水劑，組織塊收縮減低，也不會過硬，故比酒精優(yōu)越。

五、透明

透明的目的是將組織內(nèi)的酒精用礦物油或植物油置換出來，并溶解石蠟，幫助石蠟浸透組織。由于經(jīng)過透明劑處理的組織塊用肉眼觀察呈透明狀，故稱這一過程為透明。常用的透明劑為二甲苯（Xylol），因其穿透力較強，因而組織在二甲苯中停留時間不宜過長，一般透明時間在30分鐘左右即可。

六、浸蠟 浸蠟是指組織經(jīng)過透明作用以后，放入溶化的石蠟中浸滲，使石蠟浸入組織塊中，冷卻后，才能進行切片。

通常選擇熔點在52～56℃之間的石蠟，并視切片時環(huán)境的氣溫而選擇。室溫高則選用熔點稍高的石蠟，反之，則選用熔點較低的石蠟，這樣可防止切片時石蠟太軟或易碎裂。浸蠟的過程是：

二甲苯石蠟混合液（1：1）

1小時 二甲苯石蠟混合液（1：2）

1小時

石蠟（1）

1小時30分 石蠟（2）

1小時30分

上述過程可在56℃～58℃恒溫箱中進行，含二甲苯的混合液可用磨口小瓶盛裝。

七、包埋

包埋就是將已浸滲好的組織包埋于浸滲劑中。根據(jù)需要，包埋的方法常有石蠟包埋法和火棉膠包埋法。石蠟包埋法：

（1）先將熔化的石蠟倒入包埋框，用加熱的鑷子將欲包埋的組織塊在蠟液內(nèi)放置好。注意各組織塊之間的距離和每個組織塊的位置和方向。

（2）迅速第二次往平皿內(nèi)傾倒蠟液，淹沒組織塊。待蠟液出現(xiàn)凝固層后，即輕輕放入冷水盆中或冰箱中使其凝固。石蠟完全凝固后，倒出冷縮的蠟塊片，用加熱的外科刀，按組織塊位置修整蠟片待用。

對于實驗動物（狗和兔等）組織，一般的脫水透明和浸蠟時間如下： 處理步驟處理時間（min）處理步驟處理時間（min）① 75%酒精長短不定二甲苯Ⅰ、Ⅱ⑥ 30 ② 85%酒精 120－300 二甲苯Ⅲ⑦ 60

③ 95%酒精Ⅰ和Ⅱ 120－300 56－58℃石蠟⑧ 30 ④無水酒精Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 30 56－58℃石蠟⑨ 60－120 ⑤無水酒精Ⅲ 60－120 56－58℃石蠟⑩ 120－180

注：摘自病理學技術，人民衛(wèi)生出版社，王伯，李玉松，黃高，張遠強主編。

八、組織切片

不同的切片制備方法，其切片方法也有較大差別，組織切片法包括石蠟切片法、冰凍切片法、火棉膠切片法、石蠟包埋半薄切片法、樹脂包埋薄切片法和大組織石蠟切片法等。常用的切片工具包括組織切片機、切片刀和自動磨刀儀器等。以下分別加以敘述。

（一）石蠟切片法

組織經(jīng)石蠟包埋后制成的蠟塊，用切片機制成切片的過程稱為石蠟切片法。為現(xiàn)在病理診斷常用的制作切片的方法。在切片前應先切去標本周圍過多的石蠟（此過程稱為修塊）但也不能留得太少，否則易造成組織破壞，連續(xù)切片時分片困難。一般切4－6μm的切片，特殊情況可切1－2μm。要觀察病變的連續(xù)性，可制作連續(xù)切片。除此之外，石蠟包埋的組織便于長期保存，因此石蠟切片仍是目前各種切片制作方法中最常用，最普遍的一種方法。

1．切片前的準備

（1）固定后的標本經(jīng)脫水、透明、浸蠟和包埋后，制成蠟塊。高質(zhì)量的蠟塊和鋒利的切片刀是保證切片質(zhì)量的關鍵環(huán)節(jié)。檢查切片刀是否鋒利，簡便的方法是用頭發(fā)在刀鋒上碰一下，如一碰即斷，說明刀鋒鋒利。用顯微鏡觀察可確定刀口是否平整，有無缺口。

（2）準備充足的經(jīng)過處理的清潔載玻片和恒溫烤片裝置，大中號優(yōu)質(zhì)狼毫毛筆和鉛筆（用于在載玻片的粗糙端寫號），如用普通載玻片，可用碳素墨水和蛋白甘油按3：1體積混合后書寫。

2．切片制作過程

（1）將預先修好的組織塊先在冰箱中冷卻，而后裝在切片機固定裝置上。將切片刀裝在刀架上，刀刃與蠟塊表面呈5℃夾角。將蠟塊固定，調(diào)整蠟塊與刀至合適位置，并移動刀架或蠟塊固定裝置，使蠟塊與刀刃接觸。

（2）切片多使用輪轉(zhuǎn)式切片機，使用時左手執(zhí)毛筆，右手旋轉(zhuǎn)切片機轉(zhuǎn)輪。先修出標本，直到組織全部暴露于切面為止，但小標本注意不要修得太多，以免無法切出滿意的用于診斷的切片，標本應注意切全。切出蠟片后，用毛筆輕輕地托起，爾后用眼科鑷夾起，正面向上放入展片箱（展片溫度根據(jù)作用的石蠟熔點進行調(diào)整，一般低于蠟熔點10～12℃），待切片展平后，即可進行分片和撈片。切片經(jīng)30%的酒精初展后，再用載玻片撈起放入展片箱更易展平。為減少切片刀與組織塊在切片過程中產(chǎn)生的熱量，使石蠟保持合適的硬度，切片時可經(jīng)常用冰塊冷卻切片刀和組織塊，尤其在夏季高溫季節(jié)更為必要。（3）輪轉(zhuǎn)式切片機切取組織，是由下向上切，為得到完整的切片，防止組織出現(xiàn)刀紋裂縫，應將組織硬脆難切的部分放在上端（如皮膚組織，應將表皮部分向上。而胃腸等組織，應將漿膜面朝上）。

（4）撈片時注意位置，要留出貼標簽的空間，并注意整齊美觀。撈起切片后，立即寫上編號。

（5）切片撈起后，在空氣中略微干燥后即可烤片。一般在60℃左右烤箱內(nèi)烤30min即可，也可用烤片器烤片。血凝塊和皮膚組織應及時烤片。但對腦組織待完全晾干后，才能進行烤片。否則，可能產(chǎn)生氣泡影響染色。

3．注意事項

（1）組織的取材和固定 取材時，組織塊的大小厚薄應適當，過大、過厚的組織，固定液不易滲透，易引起固定不良。過小、過薄的組織，在固定和脫水的過程中易變硬或產(chǎn)生彎曲扭轉(zhuǎn)，同樣影響切片質(zhì)量。陳舊、腐敗和干枯的組織不宜制作切片。用陳腐組織制成的切片，往往核漿共染，染色模糊，組織結(jié)構(gòu)不清，無法進行觀察。固定不及時和固定不當?shù)慕M織，染色時常出現(xiàn)核質(zhì)著色較淺，輪廓不清，出現(xiàn)不同程度的片狀發(fā)白區(qū)。組織固定時，固定液的量應充足，至少要在4倍以上，同時注意組織塊不要與容器粘連。至于組織固定的時間，根據(jù)具體情況加以掌握。有關固定時應注意的事項，可參見有關章節(jié)。（2）組織脫水、透明和浸蠟組織脫水用的各級酒精，應保證相應濃度，以便組織脫水徹底。但無水酒精中，組織塊放置時間不宜過長，否則組織過硬，切片困難。遇到此情況，可將組織浸在香柏油中軟化，用二甲苯洗去香柏油后，再重新浸蠟和包埋。脫水酒精，尤其是無水酒精中混有水分，則組織脫水不干凈。經(jīng)二甲苯時，組織也無法透明，呈現(xiàn)渾濁。此時應將組織在新的酒精中重新脫水。二甲苯透明也應充分，否則不利于石蠟的浸透。但組織在二甲苯內(nèi)的時間應嚴格掌握，時間過長組織易碎，也無法切出好的切片。時間不足，則石蠟不易浸透。浸蠟的溫度也不宜過高，時間長短也應加以控制。總之，組織脫水、透明和浸蠟對于切片質(zhì)量都有一定影響，組織脫水、透明和浸蠟過度，組織塊變硬變脆，因此對于小塊組織或小動物標本應注意時間。但若時間不夠，組織塊硬化不夠，也不利于切片和染色，因此，應注意各具體環(huán)節(jié)的操作，并注意保證各種試劑的質(zhì)量。

（3）切片切片刀要求鋒利且無缺口，切片自行卷起多由切片刀不鋒利所致，切片刀有缺口時，易造成切片斷裂破碎和不完整。骨組織切片時，用重型刀較好。全鋼刀或單面鎢刀也適合石蠟或火棉膠包埋的骨組織。

（4）切片刀和切片機切片刀放置的傾角以20－30℃為好。傾角過大切片上卷，不能連在一起。過小則切片皺起。應注意維護切片機，防止因螺絲松動產(chǎn)生震動，切片時會造成切片厚薄不均。遇硬化過度的肝、腦、脾等組織時，應輕輕切削，防止由于震動產(chǎn)生空洞現(xiàn)象。（5）特殊要求切片的制作 石蠟切片雖然有很多優(yōu)點，但制片過程中要經(jīng)過酒精和二甲苯等有機溶劑處理，因此很易造成組織內(nèi)抗原性的喪失，在用于免疫組織化學染色時影響結(jié)果的準確性。因而有人采用冷凍干燥包埋法，即將新鮮組織低溫速凍，利用冷凍干燥機在真空和低溫條件下除去組織內(nèi)的水分，然后用甲醛蒸汽固定干燥后的組織，而后在進行浸蠟、包埋和切片。此法可保存組織內(nèi)的可溶性物質(zhì)，防止蛋白質(zhì)變性和酶的失活，減少抗原的丟失。用于免疫熒光標記、免疫酶標記和放射自顯影。

（二）冰凍切片法

冰凍切片在組織學技術中應用廣泛，對臨床快速病理診斷尤其具有重要意義。另外，因冰凍切片制作時不經(jīng)各級酒精的脫水，二甲苯的透明等過程，因此對脂肪和類脂的保存較好，在進行脂肪染色和神經(jīng)組織髓鞘的染色常用。冰凍切片多用于新鮮組織，甲醛固定的組織和低溫冰箱冷藏的組織塊等。組織不經(jīng)任何包埋劑而直接放在制冷臺上冷卻后進行切片。

1．恒冷箱切片 將組織塊在恒冷箱的切片機上切片。恒冷箱切片機的種類較多，可根據(jù)實際情況加以選用。一般調(diào)節(jié)溫度為－25℃左右。箱內(nèi)溫度下降后，打開觀察窗，將組織固著器放置到速凍臺上，先放少量OCT或羧甲基纖維素，待凍結(jié)后將組織塊放上，并在其周圍加適量包埋劑，將組織塊包埋。組織凍結(jié)后，將組織固著器裝到切片機上，調(diào)整組織的切面與刀刃平行并貼近刀刃，將厚度調(diào)至適當位置后，關閉觀察窗。初步修出組織切面后，放下抗卷板，開始切片。切出切片用載玻片貼附后，進行吹干或固定。這種切片用于科研和教學的連續(xù)切片，效果較好。在切片前，應預先啟動進行預冷，同時準備多個冷卻臺，用于多塊組織切片。

2．半導體制冷冰凍切片法 組織塊放置在半導體制冷臺上，加少許蒸餾水，調(diào)好切片的厚度。接通循環(huán)流水后，再接通電源，而且在使用的全過程中流水不能中斷，關閉電路后，才能停水。還應注意電源正負極不能接反，用整流電源控制溫度。冰凍組織周圍的水不宜過多，用手檢查組織塊的硬度，當可切成厚薄一致的切片時，即可切片。切片用毛筆展平后，立即用載玻片貼附，待切片剛要融化時，即刻入固定液內(nèi)固定1min。已固定的組織切片，收集于清水中。根據(jù)目的進行染色。暫時不染色的切片，用載玻片吸附。

3．甲醇制冷器 制冷箱為附有帶導管的制冷臺和制冷刀的甲醇循環(huán)裝置，其冷卻速度較快，屬開放式，做一般常規(guī)冰凍切片用。

4．二氧化碳冰凍法 將組織塊用蒸餾水洗后，放在冰凍切片機的冷凍臺上，加蒸餾水少許。打開冷凍臺的二氧化碳開關，二氧化碳氣體噴出，待組織出現(xiàn)冷霜時，關閉二氧化碳，即可切片。組織冷凍過硬易碎，若冷凍不夠，組織塊硬度不足，切片呈粥糜狀，無法成片，應用間歇冷卻法繼續(xù)冷卻。硬度一般在剛開始解凍時最適合，應迅速切片。

5．冰凍切片粘片法冰凍切片粘片法基本按石蠟切片的粘片處理，但烤片溫度不宜超過40℃。烤干后立即取出，溫度過高，時間過長，則切片易碎。烤干后用70%酒精和自來水略洗后即可染色。

九、蘇木精－伊紅染色方法

蘇木精-伊紅染色方法，簡稱HE染色方法，是生物學和醫(yī)學的細胞與組織學最廣泛應用的染色方法。在病理學實驗室中稱為常規(guī)染色方法。病理細胞和組織學的診斷，教學和研究都是用HE染色方法觀察正常和病變組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。因此病理學工作者必需學習和掌握這種染色方法。

（一）HE染色的基本原理

1．細胞核染色的原理

細胞核內(nèi)的染色質(zhì)主要是去氧核糖核酸（DNA），DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條鏈上的磷酸基向外，帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精鹼性染料以離子鍵或氫鍵結(jié)合而染色。蘇木精在堿性染料中呈藍色，所以細胞核被染成藍色。

2．細胞漿染色的原理

細胞漿內(nèi)主要成分是蛋白質(zhì)，在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷（陽離子），就可被帶負電荷（陰離子）的染料染色。伊紅Y是一種化學合成的酸性染料，在水中離解成帶負電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷（陽離子）結(jié)合而使細胞漿染色，細胞漿、紅細胞、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍色的細胞核形成鮮明的對比。伊紅是細胞漿的良好染料。

隨著科學技術快速發(fā)展和電子計算機的廣泛應用，染色自動儀器的出現(xiàn)，許多實驗室已用全自動染色機代替人工染色。

（二）人工操作蘇木精伊紅染色方法

1．染色步驟 二甲苯I脫蠟10min.二甲苯II脫蠟5min。

無水乙醇洗去二甲苯1min×2次。

95%酒精1min。

90%酒精1min。

85%酒精1min。自來水洗2min。

蘇木精染色1min至5min。自來水洗1min。

1%鹽酸酒精分化20s。自來水洗1min。

稀氨水（1%）反藍30s。自來水洗或蒸餾水洗1min。伊紅染色20s至5min。自來水洗30s。

85%酒精脫水20s。

90%酒精30s。

95%I酒精1min。

95%II酒精1min。無水乙醇I 2min。無水乙醇II 2min。二甲苯I 2min。二甲苯II 2min。二甲苯III 2min。

中性樹膠或加拿大樹膠封片。

2．染色結(jié)果

細胞核呈藍色，細胞漿、肌肉、結(jié)締組織、紅細胞和嗜伊紅顆粒呈不同程度的紅色。鈣鹽和各種微生物也可染成藍色或紫藍色。

（三）自動染色機蘇木精伊紅染色程序

1．二甲苯I 10min。

2．二甲苯II 10min。

3．無水乙醇1min。

4．無水乙醇1min。

5．95%酒精I 1min。

6．95%酒精II 1min。

7．90%酒精I 1min。

8．80%酒精1min。

9．自來水洗1min。

10．蘇木精染色1至5min。

11．自來水洗1min。

12．1%鹽酸酒精分化30s。

13．自來水洗5min。

14．伊紅染色30s至5min。

15．自來水洗30s。

16．85%酒精20s。

17．90%酒精30s。

18．95%酒精1min。

19．95%酒精1min。

20．無水乙醇I 2min。

21．無水乙醇II 2min。

22．二甲苯I 2min。

23．二甲苯II 2min。

24．二甲苯III 2min。

25．中性樹膠或加拿大樹膠封片。

（四）冰凍切片蘇木精伊紅染色

1．恒冷箱冰凍切片，粘貼在載玻片上，用95%酒精95ml和冰醋酸5ml的混合固定液固定1min。自來水洗。

2．蘇木精染色1～2min。

3．自來水洗30s。

4．1%鹽酸酒精分化20s。

5．自來水洗20s。

6．稀氨水30s。

7．自來水洗20s。

8．伊紅染色20s～1min。

9．自來水洗10s。

10．85%酒精20s。

11．90%酒精30s。

12．95%酒精1min。

13．無水乙醇I 1min。

14．無水乙醇II 2min。

15．二甲苯I 1min。

16．二甲苯II 2min。

17．二甲苯III 2min。

18．中性樹膠或加拿大樹膠封片。

（五）染色液的配制

1．蘇木精（素）

蘇木精是一種純天然染料，是從蘇木素樹提煉出來的，蘇木樹主產(chǎn)墨西哥的坎偑切，蘇木精的染色性能差，經(jīng)過一百多年精心加工配制，現(xiàn)用的蘇木精配方，染色性能好，保持時間長，是世界上唯一的常規(guī)細胞核染料，2．蘇木精的配制

蘇木精的配方很多，可根據(jù)不同需要選用，Harris配方最常用。（1）Harris蘇木精的配制 蘇木精1g 硫酸鋁鉀15g 無水乙醇10ml 蒸餾水200ml

先用蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀，用無水乙醇溶解蘇木精再倒入已溶解的硫酸鋁鉀蒸餾水中，煮沸1min后，稍冷卻，慢慢加入紅色氧化汞0.5g，繼續(xù)加熱至染液變?yōu)樽霞t色，用紗布蓋瓶口，用前濾紙過濾后每100ml加冰醋酸5ml。（2）Mayer蘇木精改良配法

A液 蘇木精2g

無水乙醇40ml

B液

硫酸鋁鉀100g 蒸餾水600ml

稍加熱使硫酸鋁鉀在水中溶解，將蘇木精溶于酒精中，再將A液與B液混合煮沸2min。用蒸餾水補足600ml，加入400mg碘酸鈉充分混勻，蘇木精染液呈紫紅色。（3）Gill改良蘇木精染液的配制 蘇木精2g

無水乙醇250ml 硫酸鋁鉀17g 蒸餾水750ml 碘酸鈉0.2g 冰醋酸20ml

先將蘇木精溶于無水乙醇，再將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水中。兩液溶解后將其混合，加入碘酸鈉待蘇木精氧化成紫紅色，再加入冰醋酸。

3．伊紅溶液的配制（1）水溶性伊紅 伊紅Y0.5－1g 蒸餾水100ml

先將水溶性伊紅加入蒸餾水中，用玻璃棒將伊紅攪起泡沫后過濾，每100ml加冰醋酸1滴。（2）乙醇性伊紅液的配制 伊紅Y 0.5～1g

90%酒精100ml

先將伊紅溶于酒精中，用玻璃棒研碎溶解后，每100ml加冰醋酸1滴。用乙醇性伊紅液染細胞漿后不可經(jīng)水洗直接用85%酒精脫水。

4．鹽酸酒精分化液的配制 濃鹽酸0.5～1ml

75%酒精99ml

此液用一段時間后需要延長或更換液體，新液分化時間要短。

5．染色中注意事項（1）脫蠟 石蠟切片必需經(jīng)過脫蠟后才能染色，脫蠟前切片要經(jīng)烘烤，這樣使組織與玻璃片粘貼牢固。組織切片脫蠟應徹底，脫蠟好壞主要取決于二甲苯的溫度和時間，所有的時間都是指新的二甲苯在室溫25℃以下時，如果二甲苯是用過一段時間，切片又比較厚，室溫低應增加脫蠟時間，脫蠟不凈是影響染色不良的重要原因之一。（2）染色

石蠟切片經(jīng)水洗后放入Harris蘇木精染色，一般情況下在新配的蘇木精溶液中只需要染1min左右，應根據(jù)染片的多少，逐步把染色時間延長。蘇木精染色后，不宜在水中和鹽酸酒精停留過長，切片分化程度應在鏡下觀察，分化過度，應水洗后重新在蘇木精中染色，再水洗分化和使切片在自來水或稀氨水中充分變藍。

新配的伊紅染色快，切片染色不宜過長，應根據(jù)染切片的多少逐步延長染色時間，切片經(jīng)伊紅染后，水洗時間要短。（3）脫水

切片經(jīng)過染色后，通過各級酒精脫水，首先從低濃度到高濃度，低濃度酒精對伊紅有分化作用，切片經(jīng)過低濃度時間要短，向高濃度時逐步延長脫水時間；脫水不徹底，使切片發(fā)霧，在顯微鏡下組織結(jié)構(gòu)模糊不清。（4）透明與封片

石蠟組織切片染色經(jīng)過脫水后必須經(jīng)二甲苯處理，使切片透明，才能用樹膠封片。常用切片封片膠有國產(chǎn)的中性樹膠，光學樹膠，加拿大樹膠和合成樹脂（DPX）。在封片時，樹膠不能太稀或太稠，不能滴加的太多或太少，太稀或太少切片容易空泡，樹膠也不可太多，不要使樹膠溢出玻片四周太多。標簽要附貼牢固。封片中不能對著切片呼氣。（5）常規(guī)石蠟切片和HE染色標本的質(zhì)量標準（全國統(tǒng)一評定標準）①切片完整，厚度4－6um，薄厚均勻，無褶無刀痕。②染色核漿分明，紅藍適度，透明潔凈，封裱美觀。

第二篇：組織切片技術

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 組織切片技術注意事項

程序步驟

1、取材

2、固定（固定24h—1W）

3、包埋

石蠟切片：流水沖洗組織塊>>75%酒精1h>>85%酒精1h>>95%酒精1h>>100%酒精（1）1h>>100酒精（2）1h>>二甲苯8-20min>>石蠟2h>>包埋

冰凍切片：固定后的組織>>OCT包埋>>切片或-20度保存；

液氮中的組織>>轉(zhuǎn)入-20度>>OCT包埋>>切片或保存

4、切片

切片>>展片（40~50度）>>貼片>>干燥（37度過夜或者50~60度2h）

5、HE染色

干燥后的切片>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精(2)1min>>95%酒精1min>>85%酒精1min>>75%酒精1min>>蒸餾水3min>>蘇木精染色30s—5min>>自來水涮洗>>蒸餾水>>75%酒精1min>>85%酒精1min>>伊紅染色>>85%酒精涮洗>>95%酒精1min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精（2）1min>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>中性樹膠封片

6、免疫組化（ABC法）

（1）干燥后的石蠟或冰凍切片（冰凍切片需要緩慢復溫）脫蠟至水；

（2）雙氧水（1%濃度左右）封閉內(nèi)源性過氧化物酶；

（3）PBS洗滌3×5min；

（4）5%BSA封閉非特異性結(jié)合位點，不洗；

（5）滴加適當稀釋度的一抗；4度孵育過夜或37度2h；（6）同上洗滌；滴加二抗，37度1h；

（7）同上洗滌；滴加ABC復合物，37度1h；（8）洗滌5遍，每次5min；

（9）配制顯色液（DAB顯色試劑盒），顯微鏡下觀察顯色；（10）切片浸泡于蒸餾水中終止顯色；（11）蘇木精復染，脫水，封片。

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注意事項

取材

1.組織越新鮮越好，最好于動物處死后10~20min完成取材，時間過久后組織自溶和腐敗會影響組織形態(tài)。

2.取材組織塊不宜過大，一般為5nm以下，2~3nm為宜。如果試驗要求采取大塊組織，最好采樣前注射固定液預固定或采取灌流固定（比如取腦時需灌流固定）。

3.取材使動作輕柔，避免用力夾、捏和拉扯組織，盡可能保持組織原有形態(tài)。操作時可用鑷子夾取組織的一個邊角，避免主要組織損傷。

4.如果是大批量取材，取材時沒有時間對組織塊大小進行修正，可將組織（可稍大，但不宜過大）先放在固定液中固定，2~4h后進行修塊，即用鋒利的刀片（刮胡刀片）把組織切至適宜大小。注意不能用剪刀等進行鈍性分離。5.如果對不同處理或不同動物的組織進行比較研究，應對所有動物在同一解剖學位置取材（比如十二指腸距胃3cm處，或空腸距胃10cm處）。

6.取材時注意組織的不同斷面，可將組織的一面用刀片切平作為標示，以便包埋和切片時選取的斷面正確（比如肌肉組織，應區(qū)分好橫斷面和縱斷面）。7.一般情況下宰殺動物應放血干凈，取材時除去組織周圍的附屬物，比如筋膜、脂肪等。

8.取得的組織立即固定。冰凍切片組織可先固定后凍存，也可直接凍存，直接凍存一般采取液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)入-20度保存，凍存組織應避免反復凍融，且盡快進行切片或用OCT包埋（包埋后可放置較長時間）。未包埋的組織在-20度長期保存的組織會逐漸脫水（比如肌肉），影響形態(tài)學觀察。

9.理論上免疫組化的組織采取冰凍切片，一般運用4%多聚甲醛固定24~48h后用OCT包埋凍存。但對于抗原表達量大且較易檢測的免疫組化，可以采取石蠟切片，但固定時間不能過長，控制在1周以內(nèi)，長時間固定會引起抗原表位的醛基化和抗原表位構(gòu)象變化，導致免疫組化檢測靈敏度降低。

固定與包埋

1.選擇合適的固定液，原則是在良好固定組織并保持形態(tài)的前提下盡可能的減小對組織的影響。常用固定液為福爾馬林、4%多聚甲醛和Bouin氏液，其中后兩者最為常用，效果也較好。

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 2.固定液需新鮮配制，新配的固定液固定效果較好。3.固定液體積理論上應為組織體積的20倍以上。

4.一般組織理論固定時間為4~24h，即以固定液完全滲透進入組織的最短時間為宜，實際操作中可延長至數(shù)天，但一般控制在1周以內(nèi)。

5.如果是冰凍切片，固定后的組織最好及時用OCT包埋，能更好的維持組織形態(tài)，包埋后的組織可于-20度保存數(shù)月。固定后的組織可用蔗糖溶液脫水，方法為直接將組織置于30%蔗糖溶液中，每天換新鮮蔗糖溶液，2-3天組織在蔗糖中沉底即可。一般來說，先固定，然后脫水，再用OCT包埋效果比較理想。6.冰凍切片可以采取后固定的方法。即采得的組織經(jīng)液氮速凍后直接放入-20度保存，OCT包埋，冰凍切片后用丙酮等對切片上的組織進行固定。但丙酮固定較為強烈，容易發(fā)生掉片。

7.石蠟切片時，固定后的組織包埋前一般對組織進行洗滌，通常用自來水沖洗，洗掉組織中的固定液，因為殘留在組織中的固定液可能對染色產(chǎn)生影響。洗滌為可選步驟，我們實驗室通常不洗滌，將固定后的組織直接包埋，并不影響HE染色效果。

8.二甲苯透明時間是影響包埋效果的最關鍵因素，需根據(jù)組織種類、組織大小、室溫以及二甲苯的新舊程度綜合考量，必要的時候需要設置時間梯度進行摸索。此外，組織是否脫水完全、是否浸蠟完全也直接影響包埋效果，原則上在能夠完全脫水和浸蠟的前提下，組織在各溶劑中的浸泡時間越短越好。

切片

1.切片成功與否很大程度上取決于組織固定和包埋的好壞。

2.切片厚度：HE等組織學染色一般4~5微米（4微米差不多是石蠟切片的極限），如果切片困難，可適當增加切片厚度（20微米以內(nèi)越厚越好切），但切片厚度的增加會使得細胞層數(shù)增多，影響觀察和美觀。免疫組化中石蠟切片一般切片5~10微米，冰凍切片大約8~14微米，特別是在檢測表達量較少的抗原時，較厚的切片可以增加陽性物質(zhì)的出現(xiàn)概率。

3.較好的石蠟切片呈均勻連續(xù)狀，沒有空洞和破損，組織完整不碎裂。4.切片角度和刀片新舊程度對切片效果的影響較大，切片角度視切片機型號而異；新刀片容易切出完好的切片。刀片應從一段開始使用，發(fā)現(xiàn)刀痕時逐漸移動，以最大限度使用刀片。

5.冰凍切片的主要影響因素有：切片機箱體溫度（一般為-25度左右），防卷器位置（太往前切不動，太往后起不到防卷效果）。

6.對免疫組化切片而言，需對玻片進行包被（一般為使其帶正電荷，組織帶負

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 電荷，通過靜電吸附增加粘附力），增加其粘附性。包被太淺起不到粘附效果，包被太深會導致免疫組化非特異性染色。

展片和貼片（撈片）：

1.燒杯中裝蒸餾水，置于水浴鍋中，溫度一般40~45度，溫度太低片子展不開，溫度太高石蠟會融化。

2.冰凍切片不需要展片，直接將玻片輕靠在組織上，組織便會自動吸附到玻片上。

3.撈片時選取完全展平的片子撈起，寧缺毋濫。一張玻片上可以貼多個組織，最后選染色效果好的封片，增加成功率。

4.未包被過的玻片可重復使用，包被過的玻片貼片后組織很難掉下，不可重復使用。

干燥：

1.干燥可以讓組織貼的更結(jié)實。石蠟切片37度干燥過夜，或者45~60度干燥數(shù)小時。冰凍切片室溫晾干（夏天一般5~10min），但不可涼太干，太干也容易掉片，判定標準為組織表面沒有明顯的液體為宜，如果組織變白說明干燥時間過長。

2.干燥后的石蠟切片可放切片盒中室溫保存，如果天氣炎熱可以放置4度保存；冰凍切片于切片盒中密封后置-20度保存，短期內(nèi)試驗可以放4度保存。

染色（以HE染色為例）：

1.液體置換要徹底，特別是脫蠟和脫水步驟。

2.伊紅一般用醇溶性配方，蘇木精配方有很多種，如果用氧化汞方法配制使用前要過濾，因為液體表面容易聚集一層金屬離子薄膜，對染色產(chǎn)生影響。3.新鮮配制的伊紅染色時間1秒即可，存放時間長的染液可以適當增加染色時間。

4.封片時中性樹膠的量要適度。根據(jù)組織的大小選擇大小合適的蓋玻片，蓋玻片以能覆蓋住組織為前提，越小越好，太大的蓋玻片溶液不平整，顯微鏡觀察時組織可能不在一個平面，需要反復調(diào)整焦距。

5.蘇木精和伊紅染色時，最好摸索染色時間，以尋求最合適和漂亮的顏色搭配，不同的組織染色能力有所差異，比如淋巴組織內(nèi)淋巴細胞較多，細胞核比較大，染出來可能藍色居多，肌肉組織中肌顯微和細胞質(zhì)比例高，染出來紅色

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6.總體原則是染色寧愿偏淺不要偏深，偏深的染色難以判別細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

免疫組化注意事項：

1.免疫組化一般以冰凍切片為主，但石蠟切片也可以做免疫組化。

2.冰凍切片一般采取先固定（4%多聚甲醛），然后用OCT包埋（冰凍包埋）。3.免疫組化步驟繁瑣，時間較長，因此用包被過的切片來防止掉片。常用的包埋劑有APES，多聚賴氨酸和明膠等。包被過程相對簡單，可購公司的商品包被試劑盒，按照說明書操作。

4.石蠟切片的免疫組化有時需要抗原修復。原因：固定液會對組織的抗原性產(chǎn)生影響，示抗原表位發(fā)生構(gòu)象變化，可以通過化學處理和熱處理來還原組織的抗原性。常用的修復液為枸櫞酸鈉緩沖液，一般采取熱修復，即把切片放置在緩沖液中然后加熱至沸騰。

5.免疫組化切片厚度一般為8~12微米。6.選擇合適的抗體（單抗、多抗）。

7.預實驗確定合適的H2O2、封閉液和抗體作用濃度和時間。8.選用包被過的玻片，動作輕柔，防止掉片。9.設置陽性、陰性和空白對照。

10.顯微鏡下控制顯色，放置顯色過淺或過深。

11.復染時蘇木精濃度可稀釋，時間縮短，避免染色過深。

12.遇到問題逐項排除，尋找原因。詳細的問題解決和相關技術貼可參照丁香園論壇或生物秀論壇，搜素“免疫組化”可以找到相關資料。

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溶液配制

固定液

4%多聚甲醛：4g多聚甲醛粉末加入100ml 0.1M PBS，邊加入邊加熱攪拌，滴加0.2M NaOH溶液并60度水浴促進粉末溶解，完全溶解后HCl調(diào)PH至7.4，4度保存。

Bouin氏液：75ml 飽和苦味酸溶液，25ml多聚甲醛，5ml冰醋酸；使用前三者混在一起，混勻。

染液

伊紅染液：1%醇溶性伊紅配方為1g伊紅加入到100ml 80%酒精中，溶解。

蘇木精染液：

1.哈里新（Harris）蘇木紫液：甲液：蘇木紫Ig，無水乙醇10ml。乙液：硫酸鋁鉀（或銨）20g，蒸餾水200ml，加溫溶解。甲、乙二液分別溶解后混合，加熱煮佛，沸后去火，待溶液不翻騰時即加入氧化汞0.5g（此時有大量氣泡生成，故容器宜大，以免液體溢出）。然后染液迅速冷卻，冷卻后過濾，即可位應用。用時每100ml加冰醋酸4ml；

2.邁爾（Mayer）蘇木紫液：將蘇木柴0.1g放入蒸餾水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸鋁鉀5g，和碘酸鈉0.02g，攪動直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g，加煮沸5min，冷卻、過濾，放置過夜，即可應用。染色時間約10~20min；

3.歐立區(qū)（Ehrlich）蘇木紫：將蘇木紫2g溶于無水乙醇100ml中；將硫酸鋁鉀15g溶于蒸餾水100ml中，加入甘油100ml，將二液混合，最后加入冰醋酸10ml，充分混勻后，盛于無色小口瓶內(nèi)，暴露于日光下，使其自然成熟，約需3個月。染色時間約5~20min。此液貯存愈久，染色力愈強。若在其中加入碘酸鈉300mg，使人工成熟，配成后即可應用；

4.卡拉茲（Carrazzi）蘇木紫：將蘇木紫0.5g溶解于甘油100ml中，將硫酸鋁鉀25g溶解于蒸餾水350ml中溶解后將二液慢慢混合，并充分搖勻。將碘化鉀0.1g放于蒸餾水50ml中，加微溫溶解，然后加入蘇木紫液中，充分搖勻，翌日可用。

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免疫組化

0.3%~1%雙氧水：

商品化30%雙氧水溶甲醇稀釋到適當濃度。

1~5%BSA（羊血清、脫脂乳）： 0.01M PBS配制。

Triton-PBS：

100微升Triton-100加入到100ml 0.01PBS中，混勻。

第三篇：組織切片技術

組織切片技術

姓名：許莎

班級：生技1學號：12772018

組織切片技術是研究生物組織或細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的重要技術，對于促進細胞生物學和遺傳學等研究的發(fā)展起著重要作用。最早的制片技術是徒手切片技術，以后發(fā)展了利用石蠟進行包埋和切片的制片技術，即石蠟切片技術，該技術由于成本低，操作簡單，目前仍在應用，該技術被越來越多的研究工作者應用于發(fā)育學、植物細胞學、胚胎學、解剖學等研究領域。

1組織切片技術原理

1.1原理

組織切片技術是研究組織形態(tài)學最常用的一項基本技術，在制作胚胎或組織切片時，由于細胞或組織是柔軟的或局部的軟硬不均，這樣制作厚薄均勻的切片很困難。為了能清晰地觀察到組織結(jié)構(gòu)及細胞形態(tài)，必須先經(jīng)過一系列步驟將組織內(nèi)滲入某些支持物質(zhì)，使組織變硬然后利用切片機將組織切成薄片。根據(jù)所用支持劑的種類不同，主要分為石蠟切片、冰凍切片、振動切片、火棉膠切片、塑料切片、碳蠟切片等。

1.2分類

1.2.1石蠟切片

該技術是最重要、最常用的組織切片技術之一，起始于18世紀。此法是用石蠟作為包埋劑，將材料經(jīng)過固定、脫水、透明后包埋在石蠟中，然后連同石蠟用切片機一同進行切片。石蠟切片的主要優(yōu)點是不僅可以把材料制成薄的切片，而且還能制成連續(xù)切片，這是其他制片技術難以做到的。它的缺點是操作步驟比較復雜，而且材料在脫水、透明過程中會收縮、[1]變硬、變脆，以致不易切片。1.2.2冰凍切片

冰凍切片是利用干冰或液氮等速凍劑使組織迅速冷凍硬化，將組織在冷凍狀態(tài)下直接用切片機切片的一項技術。它實際上是以水為包埋劑，將組織進行冰凍至堅硬后切片的。由于此法不需要經(jīng)過各級乙醇的脫水、二甲苯的透明和浸蠟等步驟，因而較適合子脂肪、神經(jīng)組織和一些組織化學的制片，并作為快速切片的方法應用在臨床診斷冰凍切片是酶組織化學和免疫組織化學染色中最常用的一種切片方法。此種切片的優(yōu)點是能較好的保存組織的RNA穩(wěn)定性、較完好地保存細胞膜表面和細胞內(nèi)多種酶活性以及抗原的免疫活性，缺點是需要較高的設備要求;切片較厚，導致組織結(jié)構(gòu)顯示欠佳;通常不能進行連續(xù)切片。其主要操作技術和方法與石蠟切片過程和類似。1.2.3振動切片

是用振動切片機把新鮮的組織切成厚20-100pm的切片。此類切片的優(yōu)缺點類似于冰凍切片。通常在切片后進行免疫染色然后再進行電鏡切片,以此來彌補結(jié)構(gòu)顯示不清的不足。振動切片機主要用于新鮮或經(jīng)過固定的動、植物標本的制片，切片時組織標本不需冰凍或包埋。因此.樣品片既避免了冰晶破壞，又能保持其活性和細胞良好形態(tài)為免疫細胞化學研究以及脊髓和腦薄片的神經(jīng)生物學研究提供了良好條件。振動式切片機可以對不同的材料進行切片，在應用范圍上補充了使用傳統(tǒng)切片機的不足，是當代電鏡、解剖、組胚、生理、醫(yī)院化工等實驗系統(tǒng)最理想的快速制樣切片儀器。1.2.4火棉膠切片

是以火棉膠為包埋劑浸入包埋組織。優(yōu)點是可以切較硬的組織，缺點是操作比較麻煩費時,切片較厚,不能連續(xù)切片。1.2.5塑料切片

用干硬度大的組織標本的包埋。由于塑料包埋組織細胞收縮程度小，切片薄，有利于組織細胞細微結(jié)構(gòu)的觀察，加之新型塑料包埋劑的出現(xiàn)和聚合方法的改進使塑料包埋技術得到了更為廣泛的應用。塑料包埋使用的包埋劑是各種樹脂，未聚合的樹脂為勤稠的液體.通過標本組織塊的沒潤，樹脂可滲透到組織間隙中。自發(fā)或在催化劑和加速劑的作用下，發(fā)生分子回的連接形成支架，支撐組織細胞結(jié)構(gòu)，聚合完成后形成固體硬塊。其優(yōu)點是可以切出薄至0.5-2nm的切片，適用于同時作光鏡和電鏡檢測。缺點是處理程序繁多,抗原活性易丟失。1.2.6碳蠟切片

以碳蠟為包埋劑，優(yōu)點是組織固定水洗后不需脫水透明,可以直接浸碳蠟包埋,切片方法于石蠟切片相同，缺點是夏季溫度較高時切片困難。

1.3制備方法

以石蠟切片為例，介紹切片標本的制備方法。

1.取材：根據(jù)科研和教學目的選擇新鮮材料，然后進行適當?shù)那腥　⒎指睢悠穳K要盡量小，以便于下一步固定。

2.固定：將選取的新鮮材料立即投人到固定液中，迅速殺死細胞以保持組織及細胞的原有結(jié)構(gòu)。一般固定液的最少用量為所固定材料總體積的20倍。固定液的選擇視材料的性質(zhì)及制片的目的而定，一般要求盡快殺死并固定細胞和組織。石蠟切片常用的固定液有FAA固定液、卡諾固定液，此外，還有多聚甲醛、戊二醛、乙醇、乙酸等。

3.洗滌：材料固定后，用洗滌劑將材料中的固定液洗掉，以便進行切片的染色或制片，常用的洗滌劑有水或乙醇。

4.脫水：因為固定和洗滌后的材料含有大量的水分，而水和透明劑、包埋劑(石蠟)不相溶，所以必須經(jīng)過脫水逐步、徹底除去材料中的水分，才能進行透明和包埋。常用的脫水劑是乙醇，另外還有乙醇、正丁醇、丙酮、環(huán)氧丙烷等。脫水過程應由低濃度到高濃度逐級進行，不可太快。否則會使細胞收縮或材料損壞。

5.透明：透明是脫水與浸蠟、脫水與封藏之間的橋梁。材料經(jīng)脫水后，組織內(nèi)部已沒有水分，但脫水劑不能與石蠟相溶，致使石蠟不能進人細胞與組織。因此，需要一種既能與脫水劑混合又能與包埋劉石蠟相混合的溶劑來處理。透明在制片中很重要。如果組織不透明，表明脫水不徹底，必須重新返工，但返工效果往往不好，常用的透明劑有二甲苯、氯仿、冬青油等。

6.浸蠟：浸蠟是將石蠟包埋劑慢慢溶于浸有材料的透明劑中，溶解在透明劑中的石蠟逐漸滲人到材料的組織細胞中，最后使透明劑被石蠟取代。進人組織細胞中的石蠟，在熔點以下很快凝固成固體，凝固后的石蠟起支撐作用，使切片后的細胞組織固定在原位。

7.包埋:將透蠟的組織連同熔化的石蠟，一起倒入包埋盒內(nèi)，然后包埋盒底部接觸冷水中，使其立刻降溫凝固成蠟塊。操作過程：包埋時，將紙盒放在已經(jīng)加熱的溫臺上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯，迅速輕輕地用鑷子夾取材料平放于紙盒底部（注意切面朝下放置），再用溫鑷子輕輕撥動材料，使之排列整齊。待石蠟完全凝固（約30min）后即可取出備用。

8.切片:已包埋好的石蠟材料，在進行切片之前需先進行修快、固著。修塊：切片前需修整蠟塊，即將包埋好的一大塊蠟塊切開，使每一小塊都含有一塊組織，從切面看組織周圍的石蠟相等。固著：將修好的蠟塊粘在大小適宜的樣品臺上，以便于固定在切片機上。切片：一手持毛筆，一手轉(zhuǎn)動切片機，切片的蠟片連成一長條蠟帶。切下的蠟帶放在干凈黑紙上。切片操作時應注意隨時關好停刀軋，不能對著蠟帶講話以免吹散蠟帶;切片完畢，將刀取下擦凈。涂上潤滑油，放人盒內(nèi)保存。9.粘片、展片：通過粘貼劑把合格蠟帶貼在載玻片上，在貼的同時，借助水的張力使蠟帶完全伸展、平貼在載玻片上，粘片和展片是在載玻片上同時完成的步驟。常用的粘貼劑有蛋白粘貼劑和明膠甘油粘貼劑兩種

10.脫蠟、透明：在染色之前，需要用脫蠟劑溶去組織和細胞的石蠟，進一步清洗脫掉的石蠟，使細胞、組織透明清晰，用于脫蠟和透明的試劑是二甲苯。

11.染色：為了使植物組織和細胞各部分顯像清楚，必須進行染色。運用不同的染色方法和選用不同的染色劑，使組織或細胞某一部分染上顏色，另一部分不染上顏色成為背景;或?qū)⒉煌糠秩境刹煌念伾墒菇M織細胞在光學顯微鏡中顯像清晰，便于觀察。

12封片：切片染色后用膠類物質(zhì)將其封固，以利于長期保存。

2切片技術的應用

2.1石蠟切片技術的應用

石蠟切片雖然是經(jīng)典的方法但隨著新的儀器和研究技術的不斷問世，出現(xiàn)了與其他新的[2]技術方法相結(jié)合，從而開辟了許多新領域，增加了許多新的研究、觀察內(nèi)容，使組織學的觀察研究從簡單的形態(tài)結(jié)構(gòu)深入到各種成分的定性觀察，定量計測，使細胞組織的形態(tài)、功能及代謝三結(jié)合，從而達到定性可靠、定位準確及定量可測，最終闡述了生命活動的最基本規(guī)律。

2.1.1三維重建

重建技術在闡明生物體組織結(jié)構(gòu)與生理功能之間的關系以及在形態(tài)學、比較解剖學、細胞化學定位等領域的研究中有著重要的意義。早在1958年，Sjostrand就論證了這種方法的[3]可行性和可靠性，是最早報道利用組織切片進行骨二維重建的學者，隨后LUCZ也用同樣的方法進行了嘗試，但是，由于當時的切片技術和計算機技術都較落后，故效果不如人意。4]直到2000年Mason[再次用同樣的方法進行了三維重建。隨著計算機技術的不斷發(fā)展，這項技術在國際上正在繼續(xù)進行廣泛深入的研究，在國內(nèi)也引起了廣泛的研究興趣，例如對血

[5]管大鼠松質(zhì)骨、中國虛擬人行切片后三維重建，同時也對方法進行了很多研究。特別是目前正在研究的“中國虛擬人1號”，表明我國是繼美、韓之后世界上第三個用人體切片合成虛擬人的國家。2.1.2免疫組化

組織制片技術與免疫學技術結(jié)合構(gòu)成免疫組織化學技術，利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理，檢測組織切片中細胞組織的多肽及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的定性和定位觀察研究。冰凍切片手續(xù)簡便，制片過程中抗原活性丟失少，但組織細胞形態(tài)較差;石蠟切片步驟繁多。一般石蠟包埋的組織切片用于檢測胞漿或核內(nèi)的抗原，不宜做表面抗原染色，乙醇、丙酮等固定劑對抗原破壞較輕，但結(jié)構(gòu)保存較差。2.1.3原位雜交

隨著分子生物學的發(fā)展，在Southern blot, Northern blot等分子雜交技術基礎上建立了原位雜交技術。原位雜交技術具有高度的準確性和敏感性，它能在細胞甚至亞細胞的水平上定位特異性核酸分子序列。因而，這一技術是目前研究分子細胞生物學、發(fā)育學等方面的重要[6][7]手段。例如，在心肌石蠟切片中檢測克山病(KSD)RNA ,在乳腺癌石蠟切片中檢測ER mRNA, [8][9][10] PR mRNA，在骨組織石蠟切片中檢測整合素R 1-mRNA，在肝組織中檢測丙型肝炎病毒RNA2.1.4原位PCR

原位PCR技術是直接在細胞或組織標本上原位擴增目的DNA或RNA片斷，并在原位檢測其擴增產(chǎn)物的技術，它兼有PCR的敏感性和原位雜交的特異性。2.1.5組織芯片

組織芯片是將成百上千的小組織整齊排列在某一載件上從而組成的微縮組織切片。該技術利用并行化處理原則、微量化檢測的優(yōu)點，結(jié)合分子生物學和形態(tài)學原理，具有經(jīng)濟、簡便快捷、信息量大的特點，能夠在DNA,RNA和蛋白質(zhì)水平檢測基因表達。2.1.6檢測凋亡

檢測凋亡的方法很多，形態(tài)學觀察是判斷細胞凋亡的基本方法。可用于體內(nèi)外細胞凋亡的研究，既可用于組織切片的原位檢測，也可對培養(yǎng)細胞通過細胞涂片或切片的檢測，特別是在常規(guī)石蠟組織切片中，可對凋亡細胞進行原位檢測，監(jiān)測某一或某些處理因素引起體內(nèi)組織細胞凋亡的動態(tài)變化。

2.1.7石蠟包埋組織流式細胞儀DNA含量分析

石蠟包理組織切片與流式細胞術結(jié)合使用來測量DNA含量及倍體分析。由于制備樣品技術的原因，過去許多流式分析資料僅限于采用鮮組織標本，Hedley等1983年首先報導了FCM分析石蠟包埋組織切片制備分散細胞懸液技術來進行DNA含量的檢測，從組織切片中能獲得足夠數(shù)量的單個細胞，且與新鮮組織分離獲得的單個細胞在形態(tài)及DNA含量組方圖上均極為相似，目前國內(nèi)也在逐步開展這方面的研究。

2.2塑料切片技術的應用

2.2.1塑料切片技術在水稻生殖發(fā)育研究中的應用

利用塑料切片技術對水稻花粉、胚囊發(fā)育、受精和胚胎發(fā)生、胚乳發(fā)育以及突變體等進行深人研究，例如，以7022LR為包埋劑，塑料切片技術觀察水稻IR36的胚胎發(fā)育過程。

參考文獻：

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第四篇：組織切片的制作

組織切片的制作

1．取材組織取材的方法是制作切片的一個重要程序，根據(jù)教學、科研及外檢的具體要求取自人體（外科手術切除標本、活檢標本、尸檢標本）或動物，并確定取材的部位和方法。取材者需要掌握解剖學、組織學、病理學的基本理論知識，還要掌握實際操作技術，每個組織器官的取材都有一定的部位和方法，不能任意切取組織作為制片材料，不然，無法達到教學、科研和臨床診斷的目的，具體要求如下：

(1)材料新鮮：取材組織愈新鮮愈好，人體組織一般在離體后，動物組織在處死后迅速固定，以保證原有的形態(tài)學結(jié)構(gòu)。

(2)組織塊的大小：所取組織塊較理想的體積為2.0cm×2.0cm×0.3cm，以使固定液能迅速而均勻地滲入組織內(nèi)部，但根據(jù)制片材料和目的不同，組織塊的較理想體積也不同，如制作病理外檢、科研切片，其組織塊可以薄取0.1～0.2cm即可，這樣可以縮短固定脫水透明的時間，若制作教學切片厚取0.3 ～0.5cm，這樣可以同一蠟塊制作出較多的教學切片。

(3)勿擠壓組織塊: 切取組織塊用的刀剪要鋒利，切割時不可來回銼動。夾取組織時切勿過緊，以免因擠壓而使組織、細胞變形。

(4)規(guī)范取材部位: 要準確地按解剖部位取材，病理標本取材按照各病變部位、性質(zhì)的不同，根據(jù)要求規(guī)范化取材。

(5)選好組織塊的切面:根據(jù)各器官的組織結(jié)構(gòu)，決定其切面的走向。縱切或橫切往往是顯示組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的關鍵，如長管狀器官以橫切為好。

(6)保持材料的清潔:組織塊上如有血液、污物、粘液、食物、糞便等，可用水沖洗干凈后再放入固定液中。(7)保持組織的原有形態(tài):新鮮組織固定后，或多或少會產(chǎn)生收縮現(xiàn)象，有時甚至完全變形。為此可將組織展平，以盡可能維持原形。

2．固定

(1)小塊組織固定法：這是最常用的方法，從人體或動物體取下的小塊組織，須立即置入液態(tài)固定劑中進行固定，通常，標本與固定液的比例為1:4～20，但組織塊不宜過大過厚，否則固定液不能迅速滲透。故取組織塊的大小一般為2.0cm×2.0cm×0.3cm。

(2)注射、灌注固定法：某些組織塊由于體積過大或固定液極難滲入內(nèi)部，或需要對整個臟器或整個動物體進行固定。這時宜采用注射固定或灌注固定法。將固定液注入血管，經(jīng)血管分支到達整個組織和全身，從而得到充分的固定。

(3)蒸汽固定法：比較小而厚的標本，可采用鋨酸或甲醛蒸汽固定法。如血液涂片，則應在血片未干燥前采用鋨酸或甲醛蒸汽接觸固定。

最常用的固定液有10%甲醛固定液和95%乙醇固定液。3．脫水透明標本經(jīng)過固定和沖洗后，組織中含有較多的水分，必須將組織塊內(nèi)的水分置換出來，這一過程叫做脫水。無論是用石蠟切片，還是用火棉膠切片，都必須除去組織中所含水分，因含水組織與石蠟、火棉膠等包埋材料不相容，常用的脫水劑為一系列不同濃度的乙醇。

脫水的步驟是：80%、90%、95%、100%各種濃度乙醇2小時，此過程可用脫水機自控完成。

丙酮也是一種脫水能力很強的脫水劑，但因其脫水能力很強，對組織有劇烈收縮作用，在制作科研、教學切片時一般不用該試劑。因乙醇、丙酮等不溶于石蠟，還要經(jīng)過一個能溶于石蠟的溶劑替代過程稱為透明。常用的透明劑有二甲苯、三氯甲烷、水楊酸甲酯等。

4．浸蠟、包埋

(1)使石蠟浸入組織中，取代組織中含有的透明劑。

(2)包埋：將浸蠟后的組織置于融化的固體石蠟中，石蠟凝固后，組織即被包在其中，稱蠟塊，此過程稱為包埋。5．切片和貼片

(1)修整蠟塊：可視其組織的大小，在組織邊緣約0.1～0.2cm處，切去余蠟部分，否則易造成組織皺縮不平。(2)準備好切片用具：切片刀、毛筆、眼科鑷子（彎）、漂烘溫控儀(3)安裝蠟塊：將修好的蠟塊安裝在金屬或木制持蠟器上。

(4)安裝切片刀：將切片刀安裝在切片機的刀臺上，把刀臺上的緊固螺絲旋緊，使切片時不產(chǎn)生振動，能保持一定的切片厚度。

(5)切片的厚度：切片機的厚度調(diào)節(jié)器上刻有0～50μm或0～25μm，可任意選擇其厚度，石蠟切片的厚度一般在4～6μm。

(6)切片

(7)鋪片：用眼科鑷子鑷起蠟帶輕輕平鋪在40～45℃的水面上，借水的張力和水的溫度，將略皺的蠟帶自然展平。(8)貼片、烘片：待切片在恒溫水面上充分展平后，將蠟片撈到載玻片的中段處傾去載玻片上的余水，置入60～65℃恒溫箱內(nèi)或切片漂烘溫控儀的烘箱內(nèi)烤片15～30分鐘，脫去溶化組織間隙的石蠟。

6．染色和封片常用的染色方法是蘇木素-伊紅（Hematoxylin-Eosin）染色法，簡稱H.E染色法。這種方法對任何固定液固定的組織和應用各種包埋法的切片均可使用。蘇木素是一種堿性染料,可使組織中的嗜堿性物質(zhì)染成藍色，如細胞核中的染色質(zhì)等；伊紅是一種酸性染料，可使組織中的嗜酸性物質(zhì)染成紅色，如多數(shù)細胞的胞質(zhì)、核仁等在H.E染色的切片中均呈紅色。

H.E染色程序如下:脫蠟、脫苯、復水、染色、脫水、透明、封固

常規(guī)蘇木素染色中的對比染色是用伊紅,近年來在英、美國家的一些實驗室則采用焰紅（phloxine）,此外也有用桔黃G（OrangeG）、比布里希猩紅(Biebrich scarlet)、波爾多紅(Bordeaux red)等作為對比染色。伊紅為染胞質(zhì)、膠原纖維、肌纖維、嗜酸性顆粒等常用的染料。

第五篇：病理石蠟切片心得體會

病理石蠟切片心得體會

石蠟切片是組織學常規(guī)制片技術中最為廣泛應用的方法。石蠟切片不僅用于觀察正常細胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也是病理學和法醫(yī)學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態(tài)變化的主要方法，而且也已相當廣泛地用于其他許多學科領域的研究中。

我從事病理技術工作剛剛一年多，細細回味自己在實際工作中的切片過程，有一點點心得體會，在這里向大家做一簡單匯報。

一、組織脫水：

要想切出一張好的石蠟切片，組織處理非常重要。經(jīng)典的脫水方法，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟浸蠟是最簡單、方便、容易掌握，也是最便宜效果最好的方法。但脫水過程中尤其要注意的是梯度酒精脫水。在實際工作中，有時為了省事，往往采取倒掉第一缸酒精，后面往前移，這樣會導致第一缸酒精濃度偏高，高濃度酒精，能使蛋白質(zhì)凝固，使組織表面發(fā)硬，酒精無法滲透到組織深處，造成組織脫水效果不佳，從而不能切出優(yōu)質(zhì)石蠟切片。我的做法是，在更換液體時，盡管是后邊液體往前邊倒，但一定要測量其濃度，不合適就要調(diào)整到合適為止。這樣像子宮平滑肌瘤這樣的硬組織也能切除很好的切片。

二、組織包埋：

組織包埋好壞同樣會影響石蠟切片質(zhì)量。有些小組織，特別是內(nèi)窺鏡活檢組織，如果組織沒切全，就有可能會影響診斷。因此。小組織切出優(yōu)質(zhì)切片的重要步驟是把好組織包埋這一關。首先，最好選用5x5mm或更小的包埋底模，這樣的底模即可將組織完全置于蠟塊切面的中心，又可連續(xù)切片并將蠟片撈在載撥片相對集中的區(qū)域而利于閱片診斷。另外，包埋時先把底模放入少許石蠟，將組織移放在底模里移至冰上，待石蠟略冷卻再用齒科鑷子將組織集中到一塊并按壓到一個平面后，再注滿石蠟，平移到冰臺上。

三、組織切片：

切片工藝上稍加講究，就可做到“多”、“快”、“好”、“省”。

1、先粗切所有蠟塊。用廢棄刀片將每個蠟塊粗切至組織全部暴露的最大切面，邊切邊排序，擺放在事先做好的冰盤中冷凍。

2、全部蠟塊粗切完成后，再更換新刀片細切。將冰凍好的蠟塊迅速按放固定好，先切2-3張，削去浮蠟后即可連續(xù)切片，切片時要求用力均勻柔和，搖速不宜過快或者過慢，切片厚度一般為3-5um，如為淋巴結(jié)，切片厚度應為3um，這樣鏡下細胞無重疊，清晰，透亮利于診斷。切出的蠟片先放在入40℃熱水中，在這種溫度下，蠟片迅速舒展得非常平整，再裱貼至載玻片上。采用這種方法切片，既有速度又節(jié)省刀片，最主要的是能切出高質(zhì)量的切片。

四、染色：

染色同樣會影響切片的整體質(zhì)量。染色過程中最重要的是蘇木素染色后經(jīng)鹽酸酒精分化，流水沖洗即反藍過程，時間一定要充分，否則切片再好，鏡下結(jié)構(gòu)也不夠清晰。

切片經(jīng)過染色后，通過各級酒精脫水，由低濃度到高濃度，低濃度酒精對伊紅有分化作用，時間要短，向高濃度時逐步延長脫水時間，染色經(jīng)過脫水后必須經(jīng)過二甲苯處理，這樣的切片看切來才晶瑩剔透，使閱片者賞心悅目。

以上是我在工作中得出的一點體會，不足之處請各位批評指正。