第一篇：病理組織的免疫組織化學技術探討大全

病理組織的免疫組織化學技術探討

【摘要】目的：探討病理組織的免疫組織化學技術。方法：選取2013年1月-2015年1月我院收治的腫瘤患者50例，分別采用活檢穿刺和免疫組織化學技術進行檢驗，比較兩種方法的檢測陽性率。結果：經穿刺活檢，50例患者中AFP、Glypican-3陽性的有32例，陽性率為64.0%，經免疫組織化學技術檢驗，47例患者的細胞組織呈現變異性，陽性率為94.0%，免疫組織化學技術檢驗的陽性率明顯高于穿刺活檢的陽性率，比較差異具有統計學意義（P<0.05）。結論：病理組織中運用免疫組織化學技術進行診斷具有較高的準確性，將其和病理形態學診斷結合使用可以為患者疾病的診斷和治療提供有效的依據，值得推廣使用?！娟P鍵詞】病理組織；免疫組織；化學技術

免疫組織化學染色技術是通過抗原和抗體的結合的反應來確定被檢測的細胞中是否存在特異性的抗體，從而對疾病進行診斷。將免疫組織化學技術運用到病理組織的診斷中，使我國的病理診斷水平又提高了一個層次，在診斷以及鑒別診斷方面都具有重要的意義[1]。我院以腫瘤患者50例為研究對象，采用免疫組織化學染色技術診斷，取得了滿意的效果，現報道如下。1.資料與方法 1.1一般資料

選取2013年1月-2015年1月我院收治的腫瘤患者50例，分別采用活檢穿刺和免疫組織化學技術進行檢驗，比較兩種方法的檢測陽性率。50例腫瘤患者中，其中女性有20例，男性有30例，年齡（24-61）歲，平均年齡（40.6±1.8）歲；其中轉移性腫瘤26例，肝細胞肝癌19例，血管瘤8例，子宮癌13例。1.2方法

活檢穿刺：經過CT掃面確認病變位置，囑咐患者在活檢穿刺前5個小時之內禁食，在CT引導下經皮穿刺取得病理標本進行檢驗。

免疫組織化學技術：取每例患者的一塊組織，采用10%的中性緩沖甲醛固定液固定兩小時，固定完成后用脫水也脫水1個小時，分別在透明液和浸蠟液中各放置一個小時，然后用石蠟包埋，采用常規的切片方法切片，切片的厚度為2um。將固定好的切片脫蠟，脫蠟后在室溫下用3%的雙氧水孵育10min，然后用蒸餾水洗滌3次，每次保持3min，之后用高壓鍋在110度環境下修復2min,用PBS洗液洗滌3次，每次5min，加入一滴一抗，在室溫下孵育2個小時，接著用PBS洗液洗滌3次，每次5min，加入UltarsensitiveTM試劑之后在室溫下孵育20分鐘，再用PBS液洗滌，洗滌之后用DAB顯色，采用蒸餾水沖洗，采用蘇木素復染1個小時，采用梯度乙醇脫水，使用二甲苯透明，用中性樹膠封固，再采用PBS作為陰性對照，染色呈現棕黃色為陽性。1.3統計學分析

兩組檢驗方法的統計方法為：采用 SPSS17.0 統計學軟件對數據進行統計分析；計數資料采用χ2檢驗進行統計學分析，P<0.05 表示差異具有統計學意義。2.結果

50例患者，經穿刺活檢，AFP、Glypican-3陽性的有32例，陽性率為64.0%，經免疫組織化學技術檢驗，47例患者的細胞組織呈現變異性，陽性率為94.0%，免疫組織化學技術檢驗的陽性率明顯高于穿刺活檢的陽性率，比較差異具有統計學意義（P<0.05）。3.討論

免疫組織化學染色是近年來發展起來的一種病理技術，是病理診斷中的一種常見方法，尤其在腫瘤的診斷中具有較高的實際價值。在免疫組織化學染色技術中，抗體是最基本也是最重要的材料，分為第一抗體和第二抗體，第一抗體是針對組織細胞中的靶細胞抗原或者目的抗原的抗體，與靶細胞中的抗原結合，而第二抗體是用來放大反應的，當第一抗體和抗原結合之后，再與第二抗體結合，第二抗體是可見的，方便檢驗。免疫組織化學顯色是一種酶促反應，抗原抗體的復合物的堿性磷酸酶和過氧化物與底物反應，就生產了一種由顏色的復合物，沉淀在組織或者細胞中的抗原位置。免疫組織化學染色主要包括固定、染色、切片、脫色等過程，整個過程的操作雖然比較簡單，但是卻容易受到外界環境因素的影響，導致病理診斷中出現一定的誤診現象，所以這就要求操作人員在操作過程中應該嚴格按照標準操作規程進行操作[2]。值得注意的是，在整個染色過程中，切片應該一直保持濕潤，在孵育的過程中，孵育盒中的蒸餾水量要合理的放置，孵育盒要放平，保證抗體液體在組織上的均勻性，避免抗體流到組織的一旁造成假陰性的結果。在加抗體的時候，應該選擇單克隆的抗體，因為所有組織標本的來源基本不同，抗原的含量不一樣，細胞分化程度也是不一樣的，所以顯色反應的時間也是不一樣的[3]。

免疫組織化學技術是一門新興的技術，還存在著一些不完善的地方，例如在檢查瘤細胞的時候，瘤細胞內可能含有多種抗原，而抗體只會對特異性的抗原反應表達，所以很多時候會受到交叉反應的干擾，所以免疫組織化學技術在病理診斷中也具有一定的局限性，但是由于技術人員在操作上的失誤導致的誤診是可以避免的。但是不可否認的是，這并不影響免疫組織化學技術的發展。免疫組織化學技術在腫瘤患者的預后中也發揮著非常重要的作用，可以提供很多有效的預后信息[4]。例如，增生細胞核是否呈現陽性以及陽性細胞的多少都可以指示著腫瘤細胞的增長速度，為患者的預后提供依據。而突變型P21、P53的表達的蛋白如果在多種腫瘤過度表達則說明腫瘤細胞的生長速度非?？?，并且發生了轉移，惡性程度較高。Ⅳ型膠原是基膜中的重要組成成分，完整的基膜更是良性上皮細胞的標志，如果基膜斷裂或者消失的話則說明腫瘤已經發展成為了惡性腫瘤[5]。免疫組織化學技術通過觀察抗體對特異性抗原的顏色反應來對組織的抗原進行診斷，與傳統的病理診斷相比具有優越性。本研究結果顯示，50例患者，經穿刺活檢，AFP、Glypican-3陽性的有32例，陽性率為64.0%，經免疫組織化學技術檢驗，47例患者的細胞組織呈現變異性，陽性率為94.0%，免疫組織化學技術檢驗的陽性率明顯高于穿刺活檢的陽性率，與穿刺活檢相比，免疫組織化學技術在腫瘤診斷中具有優越性，比較差異具有統計學意義（P<0.05）。本研究結果與郭晉關于病理組織的免疫組織化學技術分析的研究報道數據吻合[6]。說明免疫組織化學技術在病理組織中具有重要的診斷意義。

綜上所述，在病理組織診斷中運用免疫組織化學技術具有良好的效果，準確性高，在不同類型的腫瘤疾病中也可以比較準確的判斷，從而為患者的疾病治療提供有效的依據，值得臨床推廣使用?！緟⒖嘉墨I】

[1]徐松,李海,陳芳,張陽,陳金珍.免疫組化在肝臟穿刺組織病理診斷中的應用[J].中國實用醫刊,2013,40(2):114-115.[2]蘭蕾,常小榮,張國山,石佳.艾煙對大鼠病理組織切片和肺HSP.7O及Caspase-9表達的影響[J].中華中醫藥雜志,2012,27(4):1042-047.[3]何春燕.免疫組化在肝臟穿刺組織病理診斷中的應用研究[J].中國衛生產業,2013,36（51）：3-5.[4]趙亮,戴朝六,彭松林,薛今琦.雙重免疫組化染色檢測DLKI與PCNA在肝細胞癌組織中的表達及臨床意義[J].山東醫藥,2012,52(20):54-56.[5]]周猜瑋,張永樂,李冰茄,黃從想,吳曉星.慢性乙型肝炎患者肝組織免疫組化表達與血清HBVDNA、HBeAg的關系[J].中國衛生檢驗雜志,2011,2-1(5):207-1208.

第二篇：病理組織切片制作技術

病理組織切片制作技術

病理組織切片常用的制作方法有三種。即石蠟切片法，冰凍切片法和火棉膠切片法。以石蠟切片法為代表，切片的基本制作過程是：

組織取材→固定→沖洗→脫水→透明→浸蠟→組織包埋→組織切片→展片附貼→切片脫蠟→染色→脫水→染片透明→封固。

以上基本過程是互相聯系的，任何一環節出現問題，都將使整個切片制作歸于失敗。因此應細致、耐心、認真負責，并事先做好計劃安排。

一、取材

采取病料，要刀剪銳利，剪切時不可擠壓，扯拉病料，以防人為損傷。切取的工具要清潔。采取病料越新鮮越好，一般不超過死后24小時。應選擇病變部與可疑病變部切取，切取時要由表及里，有淺入深并包括周圍正常組織一部分。特殊病料應根據器官的結構特點切取。管狀，囊狀和皮膚組織應注意垂直切取（橫切）。帶有薄膜的組織，要防止切時薄膜分離和脫落。

切取組織塊大小，以1.5×1.5×0.3厘米為宜，最厚不宜超過0.5厘米。組織塊病變一面應平整光滑，另一面可不平整，以便包埋時辨認。切取后，放入事先準備好的裝有固定液的磨口玻璃廣口瓶中，并做好標記。

二、固定

固定的目的是迅速將組織細胞殺死，使細胞中的蛋白質，糖，脂肪等凝固，從而保持與活組織相似的結構狀態。材料取下后，應迅速固定。固定液數量應為病理組織塊的5到20倍。由于一般把組織塊浸入固定液后數小時，固定液滲入組織液的深度只達2到3厘米。因此，可以放置冰箱內固定，使組織內酶失去作用，細菌也能停止滋生。

最常用的固定液是10%的福爾馬林溶液：使用時，用40%的甲醛飽和水溶液10毫升，加水90毫升配成。

三、沖洗

固定后的組織塊，應將固定液洗去。一般均用流水（自來水）沖洗12到24小時左右。及時沖洗尚有停止固定的作用，防止固定過度，有利于制片染色。

沖洗時如不方便用流水沖洗，也可用較大容器盛裝水浸洗，每隔相當時間換水一次。整個浸洗時間比流水沖洗應稍長一些。酒精固定的組織材料不需沖洗。

四、脫水

經過固定的組織，沖洗后要進行脫水。脫水的目的在于將組織內的水分用酒精或其他溶劑置換出來，為石蠟等其他包埋劑浸入組織創造條件。常用的脫水劑為酒精。由于酒精可以任何比例與水結合，對組織穿透力強，又能使組織硬化，因而不能將組織從水中直接移入濃度高的酒精中，應從低濃度逐漸到高濃度。脫水必須充分，否則給浸蠟造成困難。

除用酒精作脫水劑外，還可以用正丁醇（N—Butyla alcohol）。正丁醇微溶于水，能與各種濃度酒精混合，也能直接溶解石蠟。故組織經正丁醇脫水后，不須經二甲苯透明。用正丁醇作脫水劑，組織塊收縮減低，也不會過硬，故比酒精優越。

五、透明

透明的目的是將組織內的酒精用礦物油或植物油置換出來，并溶解石蠟，幫助石蠟浸透組織。由于經過透明劑處理的組織塊用肉眼觀察呈透明狀，故稱這一過程為透明。常用的透明劑為二甲苯（Xylol），因其穿透力較強，因而組織在二甲苯中停留時間不宜過長，一般透明時間在30分鐘左右即可。

六、浸蠟 浸蠟是指組織經過透明作用以后，放入溶化的石蠟中浸滲，使石蠟浸入組織塊中，冷卻后，才能進行切片。

通常選擇熔點在52～56℃之間的石蠟，并視切片時環境的氣溫而選擇。室溫高則選用熔點稍高的石蠟，反之，則選用熔點較低的石蠟，這樣可防止切片時石蠟太軟或易碎裂。浸蠟的過程是：

二甲苯石蠟混合液（1：1）

1小時 二甲苯石蠟混合液（1：2）

1小時

石蠟（1）

1小時30分 石蠟（2）

1小時30分

上述過程可在56℃～58℃恒溫箱中進行，含二甲苯的混合液可用磨口小瓶盛裝。

七、包埋

包埋就是將已浸滲好的組織包埋于浸滲劑中。根據需要，包埋的方法常有石蠟包埋法和火棉膠包埋法。石蠟包埋法：

（1）先將熔化的石蠟倒入包埋框，用加熱的鑷子將欲包埋的組織塊在蠟液內放置好。注意各組織塊之間的距離和每個組織塊的位置和方向。

（2）迅速第二次往平皿內傾倒蠟液，淹沒組織塊。待蠟液出現凝固層后，即輕輕放入冷水盆中或冰箱中使其凝固。石蠟完全凝固后，倒出冷縮的蠟塊片，用加熱的外科刀，按組織塊位置修整蠟片待用。

對于實驗動物（狗和兔等）組織，一般的脫水透明和浸蠟時間如下： 處理步驟處理時間（min）處理步驟處理時間（min）① 75%酒精長短不定二甲苯Ⅰ、Ⅱ⑥ 30 ② 85%酒精 120－300 二甲苯Ⅲ⑦ 60

③ 95%酒精Ⅰ和Ⅱ 120－300 56－58℃石蠟⑧ 30 ④無水酒精Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 30 56－58℃石蠟⑨ 60－120 ⑤無水酒精Ⅲ 60－120 56－58℃石蠟⑩ 120－180

注：摘自病理學技術，人民衛生出版社，王伯，李玉松，黃高，張遠強主編。

八、組織切片

不同的切片制備方法，其切片方法也有較大差別，組織切片法包括石蠟切片法、冰凍切片法、火棉膠切片法、石蠟包埋半薄切片法、樹脂包埋薄切片法和大組織石蠟切片法等。常用的切片工具包括組織切片機、切片刀和自動磨刀儀器等。以下分別加以敘述。

（一）石蠟切片法

組織經石蠟包埋后制成的蠟塊，用切片機制成切片的過程稱為石蠟切片法。為現在病理診斷常用的制作切片的方法。在切片前應先切去標本周圍過多的石蠟（此過程稱為修塊）但也不能留得太少，否則易造成組織破壞，連續切片時分片困難。一般切4－6μm的切片，特殊情況可切1－2μm。要觀察病變的連續性，可制作連續切片。除此之外，石蠟包埋的組織便于長期保存，因此石蠟切片仍是目前各種切片制作方法中最常用，最普遍的一種方法。

1．切片前的準備

（1）固定后的標本經脫水、透明、浸蠟和包埋后，制成蠟塊。高質量的蠟塊和鋒利的切片刀是保證切片質量的關鍵環節。檢查切片刀是否鋒利，簡便的方法是用頭發在刀鋒上碰一下，如一碰即斷，說明刀鋒鋒利。用顯微鏡觀察可確定刀口是否平整，有無缺口。

（2）準備充足的經過處理的清潔載玻片和恒溫烤片裝置，大中號優質狼毫毛筆和鉛筆（用于在載玻片的粗糙端寫號），如用普通載玻片，可用碳素墨水和蛋白甘油按3：1體積混合后書寫。

2．切片制作過程

（1）將預先修好的組織塊先在冰箱中冷卻，而后裝在切片機固定裝置上。將切片刀裝在刀架上，刀刃與蠟塊表面呈5℃夾角。將蠟塊固定，調整蠟塊與刀至合適位置，并移動刀架或蠟塊固定裝置，使蠟塊與刀刃接觸。

（2）切片多使用輪轉式切片機，使用時左手執毛筆，右手旋轉切片機轉輪。先修出標本，直到組織全部暴露于切面為止，但小標本注意不要修得太多，以免無法切出滿意的用于診斷的切片，標本應注意切全。切出蠟片后，用毛筆輕輕地托起，爾后用眼科鑷夾起，正面向上放入展片箱（展片溫度根據作用的石蠟熔點進行調整，一般低于蠟熔點10～12℃），待切片展平后，即可進行分片和撈片。切片經30%的酒精初展后，再用載玻片撈起放入展片箱更易展平。為減少切片刀與組織塊在切片過程中產生的熱量，使石蠟保持合適的硬度，切片時可經常用冰塊冷卻切片刀和組織塊，尤其在夏季高溫季節更為必要。（3）輪轉式切片機切取組織，是由下向上切，為得到完整的切片，防止組織出現刀紋裂縫，應將組織硬脆難切的部分放在上端（如皮膚組織，應將表皮部分向上。而胃腸等組織，應將漿膜面朝上）。

（4）撈片時注意位置，要留出貼標簽的空間，并注意整齊美觀。撈起切片后，立即寫上編號。

（5）切片撈起后，在空氣中略微干燥后即可烤片。一般在60℃左右烤箱內烤30min即可，也可用烤片器烤片。血凝塊和皮膚組織應及時烤片。但對腦組織待完全晾干后，才能進行烤片。否則，可能產生氣泡影響染色。

3．注意事項

（1）組織的取材和固定 取材時，組織塊的大小厚薄應適當，過大、過厚的組織，固定液不易滲透，易引起固定不良。過小、過薄的組織，在固定和脫水的過程中易變硬或產生彎曲扭轉，同樣影響切片質量。陳舊、腐敗和干枯的組織不宜制作切片。用陳腐組織制成的切片，往往核漿共染，染色模糊，組織結構不清，無法進行觀察。固定不及時和固定不當的組織，染色時常出現核質著色較淺，輪廓不清，出現不同程度的片狀發白區。組織固定時，固定液的量應充足，至少要在4倍以上，同時注意組織塊不要與容器粘連。至于組織固定的時間，根據具體情況加以掌握。有關固定時應注意的事項，可參見有關章節。（2）組織脫水、透明和浸蠟組織脫水用的各級酒精，應保證相應濃度，以便組織脫水徹底。但無水酒精中，組織塊放置時間不宜過長，否則組織過硬，切片困難。遇到此情況，可將組織浸在香柏油中軟化，用二甲苯洗去香柏油后，再重新浸蠟和包埋。脫水酒精，尤其是無水酒精中混有水分，則組織脫水不干凈。經二甲苯時，組織也無法透明，呈現渾濁。此時應將組織在新的酒精中重新脫水。二甲苯透明也應充分，否則不利于石蠟的浸透。但組織在二甲苯內的時間應嚴格掌握，時間過長組織易碎，也無法切出好的切片。時間不足，則石蠟不易浸透。浸蠟的溫度也不宜過高，時間長短也應加以控制?？傊M織脫水、透明和浸蠟對于切片質量都有一定影響，組織脫水、透明和浸蠟過度，組織塊變硬變脆，因此對于小塊組織或小動物標本應注意時間。但若時間不夠，組織塊硬化不夠，也不利于切片和染色，因此，應注意各具體環節的操作，并注意保證各種試劑的質量。

（3）切片切片刀要求鋒利且無缺口，切片自行卷起多由切片刀不鋒利所致，切片刀有缺口時，易造成切片斷裂破碎和不完整。骨組織切片時，用重型刀較好。全鋼刀或單面鎢刀也適合石蠟或火棉膠包埋的骨組織。

（4）切片刀和切片機切片刀放置的傾角以20－30℃為好。傾角過大切片上卷，不能連在一起。過小則切片皺起。應注意維護切片機，防止因螺絲松動產生震動，切片時會造成切片厚薄不均。遇硬化過度的肝、腦、脾等組織時，應輕輕切削，防止由于震動產生空洞現象。（5）特殊要求切片的制作 石蠟切片雖然有很多優點，但制片過程中要經過酒精和二甲苯等有機溶劑處理，因此很易造成組織內抗原性的喪失，在用于免疫組織化學染色時影響結果的準確性。因而有人采用冷凍干燥包埋法，即將新鮮組織低溫速凍，利用冷凍干燥機在真空和低溫條件下除去組織內的水分，然后用甲醛蒸汽固定干燥后的組織，而后在進行浸蠟、包埋和切片。此法可保存組織內的可溶性物質，防止蛋白質變性和酶的失活，減少抗原的丟失。用于免疫熒光標記、免疫酶標記和放射自顯影。

（二）冰凍切片法

冰凍切片在組織學技術中應用廣泛，對臨床快速病理診斷尤其具有重要意義。另外，因冰凍切片制作時不經各級酒精的脫水，二甲苯的透明等過程，因此對脂肪和類脂的保存較好，在進行脂肪染色和神經組織髓鞘的染色常用。冰凍切片多用于新鮮組織，甲醛固定的組織和低溫冰箱冷藏的組織塊等。組織不經任何包埋劑而直接放在制冷臺上冷卻后進行切片。

1．恒冷箱切片 將組織塊在恒冷箱的切片機上切片。恒冷箱切片機的種類較多，可根據實際情況加以選用。一般調節溫度為－25℃左右。箱內溫度下降后，打開觀察窗，將組織固著器放置到速凍臺上，先放少量OCT或羧甲基纖維素，待凍結后將組織塊放上，并在其周圍加適量包埋劑，將組織塊包埋。組織凍結后，將組織固著器裝到切片機上，調整組織的切面與刀刃平行并貼近刀刃，將厚度調至適當位置后，關閉觀察窗。初步修出組織切面后，放下抗卷板，開始切片。切出切片用載玻片貼附后，進行吹干或固定。這種切片用于科研和教學的連續切片，效果較好。在切片前，應預先啟動進行預冷，同時準備多個冷卻臺，用于多塊組織切片。

2．半導體制冷冰凍切片法 組織塊放置在半導體制冷臺上，加少許蒸餾水，調好切片的厚度。接通循環流水后，再接通電源，而且在使用的全過程中流水不能中斷，關閉電路后，才能停水。還應注意電源正負極不能接反，用整流電源控制溫度。冰凍組織周圍的水不宜過多，用手檢查組織塊的硬度，當可切成厚薄一致的切片時，即可切片。切片用毛筆展平后，立即用載玻片貼附，待切片剛要融化時，即刻入固定液內固定1min。已固定的組織切片，收集于清水中。根據目的進行染色。暫時不染色的切片，用載玻片吸附。

3．甲醇制冷器 制冷箱為附有帶導管的制冷臺和制冷刀的甲醇循環裝置，其冷卻速度較快，屬開放式，做一般常規冰凍切片用。

4．二氧化碳冰凍法 將組織塊用蒸餾水洗后，放在冰凍切片機的冷凍臺上，加蒸餾水少許。打開冷凍臺的二氧化碳開關，二氧化碳氣體噴出，待組織出現冷霜時，關閉二氧化碳，即可切片。組織冷凍過硬易碎，若冷凍不夠，組織塊硬度不足，切片呈粥糜狀，無法成片，應用間歇冷卻法繼續冷卻。硬度一般在剛開始解凍時最適合，應迅速切片。

5．冰凍切片粘片法冰凍切片粘片法基本按石蠟切片的粘片處理，但烤片溫度不宜超過40℃?？靖珊罅⒓慈〕觯瑴囟冗^高，時間過長，則切片易碎?？靖珊笥?0%酒精和自來水略洗后即可染色。

九、蘇木精－伊紅染色方法

蘇木精-伊紅染色方法，簡稱HE染色方法，是生物學和醫學的細胞與組織學最廣泛應用的染色方法。在病理學實驗室中稱為常規染色方法。病理細胞和組織學的診斷，教學和研究都是用HE染色方法觀察正常和病變組織的形態結構。因此病理學工作者必需學習和掌握這種染色方法。

（一）HE染色的基本原理

1．細胞核染色的原理

細胞核內的染色質主要是去氧核糖核酸（DNA），DNA的雙螺旋結構中，兩條鏈上的磷酸基向外，帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精鹼性染料以離子鍵或氫鍵結合而染色。蘇木精在堿性染料中呈藍色，所以細胞核被染成藍色。

2．細胞漿染色的原理

細胞漿內主要成分是蛋白質，在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷（陽離子），就可被帶負電荷（陰離子）的染料染色。伊紅Y是一種化學合成的酸性染料，在水中離解成帶負電荷的陰離子，與蛋白質的氨基正電荷（陽離子）結合而使細胞漿染色，細胞漿、紅細胞、肌肉、結締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍色的細胞核形成鮮明的對比。伊紅是細胞漿的良好染料。

隨著科學技術快速發展和電子計算機的廣泛應用，染色自動儀器的出現，許多實驗室已用全自動染色機代替人工染色。

（二）人工操作蘇木精伊紅染色方法

1．染色步驟 二甲苯I脫蠟10min.二甲苯II脫蠟5min。

無水乙醇洗去二甲苯1min×2次。

95%酒精1min。

90%酒精1min。

85%酒精1min。自來水洗2min。

蘇木精染色1min至5min。自來水洗1min。

1%鹽酸酒精分化20s。自來水洗1min。

稀氨水（1%）反藍30s。自來水洗或蒸餾水洗1min。伊紅染色20s至5min。自來水洗30s。

85%酒精脫水20s。

90%酒精30s。

95%I酒精1min。

95%II酒精1min。無水乙醇I 2min。無水乙醇II 2min。二甲苯I 2min。二甲苯II 2min。二甲苯III 2min。

中性樹膠或加拿大樹膠封片。

2．染色結果

細胞核呈藍色，細胞漿、肌肉、結締組織、紅細胞和嗜伊紅顆粒呈不同程度的紅色。鈣鹽和各種微生物也可染成藍色或紫藍色。

（三）自動染色機蘇木精伊紅染色程序

1．二甲苯I 10min。

2．二甲苯II 10min。

3．無水乙醇1min。

4．無水乙醇1min。

5．95%酒精I 1min。

6．95%酒精II 1min。

7．90%酒精I 1min。

8．80%酒精1min。

9．自來水洗1min。

10．蘇木精染色1至5min。

11．自來水洗1min。

12．1%鹽酸酒精分化30s。

13．自來水洗5min。

14．伊紅染色30s至5min。

15．自來水洗30s。

16．85%酒精20s。

17．90%酒精30s。

18．95%酒精1min。

19．95%酒精1min。

20．無水乙醇I 2min。

21．無水乙醇II 2min。

22．二甲苯I 2min。

23．二甲苯II 2min。

24．二甲苯III 2min。

25．中性樹膠或加拿大樹膠封片。

（四）冰凍切片蘇木精伊紅染色

1．恒冷箱冰凍切片，粘貼在載玻片上，用95%酒精95ml和冰醋酸5ml的混合固定液固定1min。自來水洗。

2．蘇木精染色1～2min。

3．自來水洗30s。

4．1%鹽酸酒精分化20s。

5．自來水洗20s。

6．稀氨水30s。

7．自來水洗20s。

8．伊紅染色20s～1min。

9．自來水洗10s。

10．85%酒精20s。

11．90%酒精30s。

12．95%酒精1min。

13．無水乙醇I 1min。

14．無水乙醇II 2min。

15．二甲苯I 1min。

16．二甲苯II 2min。

17．二甲苯III 2min。

18．中性樹膠或加拿大樹膠封片。

（五）染色液的配制

1．蘇木精（素）

蘇木精是一種純天然染料，是從蘇木素樹提煉出來的，蘇木樹主產墨西哥的坎偑切，蘇木精的染色性能差，經過一百多年精心加工配制，現用的蘇木精配方，染色性能好，保持時間長，是世界上唯一的常規細胞核染料，2．蘇木精的配制

蘇木精的配方很多，可根據不同需要選用，Harris配方最常用。（1）Harris蘇木精的配制 蘇木精1g 硫酸鋁鉀15g 無水乙醇10ml 蒸餾水200ml

先用蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀，用無水乙醇溶解蘇木精再倒入已溶解的硫酸鋁鉀蒸餾水中，煮沸1min后，稍冷卻，慢慢加入紅色氧化汞0.5g，繼續加熱至染液變為紫紅色，用紗布蓋瓶口，用前濾紙過濾后每100ml加冰醋酸5ml。（2）Mayer蘇木精改良配法

A液 蘇木精2g

無水乙醇40ml

B液

硫酸鋁鉀100g 蒸餾水600ml

稍加熱使硫酸鋁鉀在水中溶解，將蘇木精溶于酒精中，再將A液與B液混合煮沸2min。用蒸餾水補足600ml，加入400mg碘酸鈉充分混勻，蘇木精染液呈紫紅色。（3）Gill改良蘇木精染液的配制 蘇木精2g

無水乙醇250ml 硫酸鋁鉀17g 蒸餾水750ml 碘酸鈉0.2g 冰醋酸20ml

先將蘇木精溶于無水乙醇，再將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水中。兩液溶解后將其混合，加入碘酸鈉待蘇木精氧化成紫紅色，再加入冰醋酸。

3．伊紅溶液的配制（1）水溶性伊紅 伊紅Y0.5－1g 蒸餾水100ml

先將水溶性伊紅加入蒸餾水中，用玻璃棒將伊紅攪起泡沫后過濾，每100ml加冰醋酸1滴。（2）乙醇性伊紅液的配制 伊紅Y 0.5～1g

90%酒精100ml

先將伊紅溶于酒精中，用玻璃棒研碎溶解后，每100ml加冰醋酸1滴。用乙醇性伊紅液染細胞漿后不可經水洗直接用85%酒精脫水。

4．鹽酸酒精分化液的配制 濃鹽酸0.5～1ml

75%酒精99ml

此液用一段時間后需要延長或更換液體，新液分化時間要短。

5．染色中注意事項（1）脫蠟 石蠟切片必需經過脫蠟后才能染色，脫蠟前切片要經烘烤，這樣使組織與玻璃片粘貼牢固。組織切片脫蠟應徹底，脫蠟好壞主要取決于二甲苯的溫度和時間，所有的時間都是指新的二甲苯在室溫25℃以下時，如果二甲苯是用過一段時間，切片又比較厚，室溫低應增加脫蠟時間，脫蠟不凈是影響染色不良的重要原因之一。（2）染色

石蠟切片經水洗后放入Harris蘇木精染色，一般情況下在新配的蘇木精溶液中只需要染1min左右，應根據染片的多少，逐步把染色時間延長。蘇木精染色后，不宜在水中和鹽酸酒精停留過長，切片分化程度應在鏡下觀察，分化過度，應水洗后重新在蘇木精中染色，再水洗分化和使切片在自來水或稀氨水中充分變藍。

新配的伊紅染色快，切片染色不宜過長，應根據染切片的多少逐步延長染色時間，切片經伊紅染后，水洗時間要短。（3）脫水

切片經過染色后，通過各級酒精脫水，首先從低濃度到高濃度，低濃度酒精對伊紅有分化作用，切片經過低濃度時間要短，向高濃度時逐步延長脫水時間；脫水不徹底，使切片發霧，在顯微鏡下組織結構模糊不清。（4）透明與封片

石蠟組織切片染色經過脫水后必須經二甲苯處理，使切片透明，才能用樹膠封片。常用切片封片膠有國產的中性樹膠，光學樹膠，加拿大樹膠和合成樹脂（DPX）。在封片時，樹膠不能太稀或太稠，不能滴加的太多或太少，太稀或太少切片容易空泡，樹膠也不可太多，不要使樹膠溢出玻片四周太多。標簽要附貼牢固。封片中不能對著切片呼氣。（5）常規石蠟切片和HE染色標本的質量標準（全國統一評定標準）①切片完整，厚度4－6um，薄厚均勻，無褶無刀痕。②染色核漿分明，紅藍適度，透明潔凈，封裱美觀。

第三篇：組織病理技術名解

病理學：病理學是研究疾病發生發展規律的學科，主要的研究范圍是疾病發生發展過程中組織、細胞代謝、功能及結構的變化。

取材：組織標本的選擇即取材，取材的目的是正確的獲取所需要的標本或標本的某一部位。

組織的固定：將各種組織浸入某些化學試劑內，使細胞內的物質能盡量保持其生活狀態的形態結構和位置，叫做固定。

Carnoy液：固定胞漿和胞核,對染色體固定佳,顯示DNA和RNA效果好.也常用于糖原和尼氏體的固定.不能保存脂質有防止酒精的硬化收縮作用,穿透力強,適用于外膜致密的組織

脫水：某些溶劑置換組織內水分的過程，能夠使組織脫水的化學物質稱為脫水劑。

透明：組織經酒精脫水后，還必須經過一個媒劑透明過程

浸蠟：經過透明的組織塊，進一步移入熔化的石蠟內浸漬，稱為浸蠟。用其他浸透劑（火棉膠，碳蠟，明膠等）滲入組織內部的過程稱為浸透或透入

包埋：使用包埋劑將處理過的組織包于其中，使組織達到一定韌度和硬度，有利于切片。

組織芯片：又稱組織微列陣，是將數十個、數百個、乃至上千個小的組織片整齊的排列在某一載體上（通常是載波片）而成的微縮組織切片。

石蠟切片：組織經石蠟包埋后制成的蠟塊，用切片機制成切片的過程稱為石蠟切片法。

HE染色（常規染色）：使用蘇木精hematoxlin和伊紅eosin染色，主要用以顯示各種組織、細胞的一般形態結構以及疾病過程中病變的發生、發展及修復的過程。

封固劑：使染色后的組織封固于載玻片與蓋玻片 之間而不與空氣直接接觸，避免氧化褪色；折光率與玻片的折光率相似。

抗原修復：組織在制作過程中，由于化學試劑的作用封閉了抗原，又由于熱的作用致使部分抗原的肽鏈發生扭曲，致使在免疫組化的染色過程中不能將其顯示出來，為了解決上述的問題，利用化學試劑和熱的作用將這些抗原重新暴露出來或修正過來的過程稱為抗原修復。

抗原修復(Antigen retrieval，AR)技術：是指石蠟、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、微波緩沖液和金屬鹽等，通過機械的方法斷開因福 爾馬林固定的導致的抗原表位和不相關蛋白間的交聯鍵，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復，使抗體更好的滲透，與表位結 合。抗原修復能最大程度地恢復在制片等過程中損失的抗原性，使原來認為不能在石蠟切片上進行IHC的許多抗體獲得了良好的染色結果，成為一種有效的補救措 施，AR-IHC已廣泛應用于臨床的研究中。

抗原：刺激機體發生免疫應答產生相應抗體或致敏淋巴細胞并能與之特異性結合的物質。

抗體：受抗原刺激后B淋巴細胞產生的與相應抗原反應的球蛋白

Envision法：EnVision法又稱為ELPS法(enhance labeled polymer system)，抗原—抗體反應結合后，第二抗體上標記有多聚化合物(葡聚糖)酶復合物(EnVision復合物)，與第一抗體結合，進而由酶作用底物進行顯色定位。EnVision復合物是利用一種多聚化合物將HRP或AKP和第二抗體(抗鼠或抗兔IgG)同時標記在一個多聚化合物上，即形成酶—多聚化合物—第二抗體巨大復合物。

PAP法(Peroxidase-Antiperoxidase Method)：

一抗 + 二抗 + PAP復合物（HRP + 抗HRP抗體[與一抗統一種屬]）+ HRP底物顯色

LAB法(Labelled Avidin-Biotin Method)：

一抗 + 生物素標記二抗 + HRP標記抗生物素 + HRP底物顯色

SP法(Streptavidin-Peroxidase Methed)：

一抗 + 生物素標記二抗 + HRP標記鏈霉親和素 + HRP底物顯色

ABC法(Avidin-Biotin-peroxidase Complex Method)：

一抗 + 生物素標記二抗 + ABC復合物（抗生物素 + HRP標記生物素）+ HRP底物顯色

SABC法(Streptavidin-Biotin-peroxidase Complex Methed)：

一抗 + 生物素標記二抗 + SABC復合物（鏈霉親和素+ HRP標記生物素）+ HRP底物顯色

非特異性染色non-specific staining：染色過程中出現的不屬于特異性抗原抗體反應的著色（假陽性，背景著色）。

襯染（復染）：免疫組化染色后加用其他染料復染，襯托組織形態結構，使形態與功能密切相關，利于結果分析。

陽性對照 positive control

用已知抗原陽性的標本與待檢測標本同時免疫組化染色，結果陽性者。

陰性對照 negative control 用確認不含已知抗原的標本作對照，免疫組化染色結果陰性者。陰性對照還有

空白對照，替代對照，吸收對照，抑制實驗等

自身對照：在同一標本切片上，靶抗原的陽性反應與其他無關結構或成分的陰性結果形成鮮明對照。

空白或替代對照：以緩沖液（如PBS）或與第一抗體同源的正常動物血清取代第一抗體，結果應為陰性。

吸收對照：用相應的純化抗原（過量）中和吸收特異性第一抗體，使其結合點全部被外源性抗原結合，不能再與組織內的靶抗原反應，用這種吸收后的第一抗體作免疫組化染色，結果應為陰性。

抑制實驗：待檢標本因與未標記的特異性抗體反應而影響了與標記的特異性抗體結合，使染色結果明顯減弱或轉陰。

熱修復：消除甲醛固定形成的蛋白分子的交聯（共價鍵分子引力），削弱或打斷鈣離子化學鍵，恢復抗原分子的自然構象和抗原性。

第四篇：病理組織工作站

快速石蠟切片病理診斷

我院病理科引進的鈞鎰超聲組織處理儀（病理組織工作站），病理常規石蠟切片診斷報告一般需時3～5天，在病人病情危急或者是腫瘤病人的診斷中，臨床活檢，用常規石蠟制片法制作，病理報告如沒特殊情況，一般都需要三天才能發出。其程序基本是活檢當天下午取材，晚上組織脫水及浸蠟，第二天上午包埋切片及染色，當切片送達醫生手里時，已是第二天的上午，下午看閱切片，至復檢醫生手里時，已是第三天的時間了。這是一般的工作時間，可這對于急需獲得病理結果的患者來說，三天時間確實太長，尤其是門診病人，遠道求醫的患者，或者外地的患者，三天的時間就意味著等待，住宿及消費。為了解決上述的問題，減少患者的經濟負擔，為患者蠃來保貴的治療時間，超聲波快速石蠟制片法可勝任此項工作。最新超聲波快速石蠟制片機，開展了快速石蠟切片病理檢查。

超聲波快速石蠟制片機能提高組織內分子和溶劑分子的運動速度，它能使組織的蛋白質迅速發生凝固并保持細胞原結構，因而能快速固定組織并保持組織的外形和柔韌性，有利于切片。超聲波快速石蠟制片具有操作簡便，時間短不易誤診，病理切片資料可長期保存等優點，目前病理科經過一段時間的前期準備及試驗工作，該項目質量可靠，結果穩定，制片質量近似于常規石蠟切片技術，完全符合病理診斷的要求，大大地提高了工作效率。

應用超聲波快速石蠟制片機，一般可以在6小時工作時間內發出常規病理診斷報告（上午11點前送檢標本，當天下午5點前發出報告；下午4點前送檢標本，次日上午12點前發出報告）。該項目按淄博市物價收費標準收費，如科室病人有需要做快速石蠟病理檢查，請醫生及時將其標本送到病理科。

開展快速石蠟切片病理診斷技術，既能使患者得到盡早診斷，從而得到及時治療，減輕痛苦，同時又能使病人縮短就診時間及住院天數，減輕醫療費用，方便了病人，實為一種優質、簡便、安全、快速的好方法。

醫生申請快速石蠟切片病理檢查的注意事項：

1、如需做快速石蠟病理檢查，請在申請單上注明快速石蠟病理檢查。

2、如送檢標本為少見疑難病例，需要進一步做免疫組化檢查，在6小時內發出初檢報告，免疫組化報告3工作日內發出。

3、為保證工作順利進行，請需做快速石蠟病理切片的標本，離體后立即用福爾馬林固定，并由專人快速送到病理科檢查。

4、骨組織及淋巴結組織建議做常規石蠟病理切片檢查。

5、周六、日不做快速石蠟切片檢查。

計劃首先開放科室：胃腸鏡活檢，耳鼻喉活檢，宮頸活檢，子宮內膜刮出組織。

第五篇：病理技術試卷

病理技術期末考試試題

一、名詞解釋（每題3分，共15分）1.固定2.染色3.分化4.藍化5.免疫組化

二、填空題

（每空1分，共15分）1.普通切取的組織塊厚約＿＿厘米。2.一般用于固定的甲醛液濃度為＿＿。3.浸蠟的溫度應高于蠟熔點＿＿度。4.切片貼附于載玻片左側＿＿與＿＿交界處。

5.切片前將包埋組織周圍過多的石蠟切去的過程為＿＿。6.展片溫度一般為＿，烤片溫度一般為＿＿。7.我們常用的鹽酸乙醇分化液濃度為＿＿。8.顯示堿性磷酸酶常用＿＿和＿＿顯示法。

9.免疫酶組化技術標記的酶中，最常用的標記抗體的酶為＿＿。10.在免疫組化染色過程中，使用＿＿去除大部分內源性酶。11.在免疫組化染色過程中，常用的抗原修復方法有＿＿、＿＿、＿＿。

三、選擇題（每題2分，共20分）1.絕大多數酶組織化學技術屬于（）

A.類化學方法

B.物理學方法

C.化學方法 D.顯微燒灰法 2.大多數酶在下列（）溫度時活性最強。A.35℃ B.8℃ C.27℃ D.48℃

＿ 3.大多數酶反應最適宜的PH值（）A.5.5 B.8.0 C.4.0 D.7.0 4.顯示酶組織化學中，金屬離子沉淀反應常用的底物有（）A．萘酚 B.甘油磷酸酯 C.吲哚酚酯 D.吲胺

5.顯示酶組織化學中，（）酶用偶氮鹽偶聯反應法顯示 A.酸性磷酸酶 B.ATP酶 C.糖苷酶

D.堿性磷酸酶 6.切片時蠟塊切成的厚度為（）

A.0.2-0.3厘米

B.3-5厘米

C.3-5微米

D.2-3厘米 7.浸蠟時蠟溫溫度為（）

A.5-6℃ B.2-4℃ C.56-58℃ D.60-70℃ 8.常用的透明劑是（）

A.甲醛 B.酒精 C.二甲苯 D.汞

9.固定液的量不能少于組織塊總體積的（）倍。A.4 B.2 C.6 D.1 10.脫蠟后我們將切片放入乙醇中，此時乙醇濃度由（）A.低到高 B.高到低 C.不變 D.無

四、簡答題

（共50分）1.固定的目的（5分）

2.常規染色從切片到封固的過程（8分）3.固定的注意事項（8分）

4.光鏡酶組織化學技術的基本步驟（9分）5.離心沉淀法的步驟（10分）6.免疫組化的標準化染色程序（10分）