第一篇：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報告格式

《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》

實(shí)驗(yàn)報告本

專業(yè)

班級

姓名

學(xué)號

目錄

實(shí)驗(yàn)一 基本操作

實(shí)驗(yàn)二 血糖測定

實(shí)驗(yàn)三 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的測定 實(shí)驗(yàn)四 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 實(shí)驗(yàn)五 凝膠層析（分子篩層析）

實(shí)驗(yàn)六 飽食和饑餓對白鼠肝糖原含量的比較 實(shí)驗(yàn)七 血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳 實(shí)驗(yàn)八 分離純化基因組DNA

（一）實(shí)驗(yàn)九 分離純化基因組DNA

（二）實(shí)驗(yàn)十 PCR

實(shí)驗(yàn)十一 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物

實(shí)驗(yàn)題目

1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.實(shí)驗(yàn)原理

3.實(shí)驗(yàn)步驟

4.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理（或?qū)嶒?yàn)現(xiàn)象及分析）

5.結(jié)論

6.討論

《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》

預(yù)習(xí)與原始記錄本

專業(yè)

班級

姓名

學(xué)號

目錄

實(shí)驗(yàn)一 基本操作

實(shí)驗(yàn)二 血糖測定

實(shí)驗(yàn)三 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的測定

實(shí)驗(yàn)四 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 實(shí)驗(yàn)五 凝膠層析（分子篩層析）

實(shí)驗(yàn)六 飽食和饑餓對白鼠肝糖原含量的比較 實(shí)驗(yàn)七 血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳 實(shí)驗(yàn)八 分離純化基因組DNA

（一）實(shí)驗(yàn)九 分離純化基因組DNA

（二）實(shí)驗(yàn)十 PCR

實(shí)驗(yàn)十一 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物

實(shí)驗(yàn)題目

1.預(yù)習(xí)報告

1.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.2實(shí)驗(yàn)流程

1.3 預(yù)計結(jié)果

1.4注意事項(xiàng)

2.實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)記錄（或?qū)嶒?yàn)現(xiàn)象）

第二篇：彭文豪運(yùn)動生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報告

用pH試紙檢測晨尿的酸堿度實(shí)驗(yàn)報告

課程：運(yùn)動生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)名稱：用pH試紙檢測晨尿的酸堿度實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)時間：2013年4月18日實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：長江大學(xué)新體育館

姓名：彭文豪班級：體教11001班

學(xué)號：201000290得分：

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)并掌握如何用pH試紙檢測晨尿的酸堿度，討論尿液的成分以及24訓(xùn)小時練對尿液成分的影響。

實(shí)驗(yàn)原理： pH試紙是用來檢測液體或氣體酸堿度的工具,pH 英文全名hydrogen ion concentration，氫離子濃度指數(shù)。這是一種現(xiàn)成的試紙，想要使用時，撕下一條，放在平整的玻璃器上。然后用一支干燥的玻璃棒或滴管從玻璃容器中蘸取一滴溶液滴到pH試紙的中部,從它的顏色變化中可以知道溶液的酸堿度。pH試紙遇酸變紅，遇堿變藍(lán)。通過試紙變化的顏色與標(biāo)準(zhǔn)的比色卡的顏色進(jìn)行對照，我們大致可以知道溶液的的pH值了。想要檢測尿液的酸堿度，我們可以采用早晨起床的第一次的尿液，這樣我們檢測的值會相對比較準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)器材：1個玻璃杯、玻璃棒、pH試紙、標(biāo)準(zhǔn)比色卡、記錄的工具、清潔劑、干抹布、手機(jī)上的秒表

實(shí)驗(yàn)對象： 測試者：彭文豪（網(wǎng)球?qū)ｍ?xiàng)）記錄員：彭文豪

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、清晨起床后開始收集自己未進(jìn)食的尿液，盛放在玻璃杯中，并放在可測量的桌面上。

2、取出保存好的pH試紙，撕下一片，并將其他的pH試紙繼續(xù)放在容器中好好保存同時把標(biāo)準(zhǔn)的比色卡平整的放在便于自己觀察的桌面上。

3、取出干燥的玻璃棒，從玻璃杯中蘸取一滴尿液，滴到pH試紙的中部。14、過了半分鐘，觀察pH試紙的顏色變化，與標(biāo)準(zhǔn)的比色卡進(jìn)行對照，觀察出自己的尿液pH值，記錄下各自的數(shù)據(jù)。

5、大約過2分鐘之后進(jìn)行第二次實(shí)驗(yàn)，重復(fù)第一次的實(shí)驗(yàn)步驟。并記錄結(jié)果。倒掉剩余的盛放在玻璃杯中的尿液，清洗干凈玻璃杯玻璃棒。并及時歸還儀器。

6、通過檢測出來的pH值，分析尿液是否正常，或者是造成尿液過酸或過堿的原因。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1，第一次測得彭文豪同學(xué)晨尿的pH值為6，第二次測得的結(jié)果為7。正常的尿液的pH值在5.5到7.4之間，所以,彭文豪同學(xué)晨尿的pH值在正常的范圍內(nèi)。

2，尿液的成分有水：95 %蛋白質(zhì)，0%葡萄糖，0%尿素，1.8 %尿酸，0.05%無機(jī)鹽1.1%。

3，兩次測得的結(jié)果不一樣是由于我們生活的大氣中到處都是有細(xì)菌的。尿液放置一段時間后，會被細(xì)菌分解，自然產(chǎn)生了氨氣，氨氣成弱堿性，所以在第二次測試的結(jié)果上，尿液的pH值有所升高。

4，作為羽毛球?qū)ｍ?xiàng)蒲濤同學(xué)第一次的測試結(jié)果是5，第二次的測試的結(jié)果是6.而尿液的酸堿度的不同也是有許多方面的因素構(gòu)成的，經(jīng)調(diào)查蒲濤同學(xué)在前一天在激烈的網(wǎng)球運(yùn)動過程中，機(jī)體處于缺氧狀態(tài)，導(dǎo)致大量氧化不全，產(chǎn)物如乳酸、酮體和丙酮酸等酸性物質(zhì)堆積，從而使尿PH值明顯下降，尿液PH值可達(dá)5—6程度。而彭文豪同學(xué)進(jìn)食正常，運(yùn)動量也不大，所以尿液檢測結(jié)果基本正常。而蒲濤同學(xué)檢測結(jié)果相對呈酸性尿液。5，結(jié)論：飲食和運(yùn)動的劇烈性可以影響人的尿液的酸堿度。

測試者：彭文豪被測試者：彭文豪記錄員：彭文豪評分人：彭文豪

第三篇：生物化學(xué)

生化題目：1.糖是如何分解和合成的？

2.脂肪是如何分解和合成的？

3.何謂三羧酸循壞？為什么說三羧酸循環(huán)是代謝的中心？

4.在氨基酸生物合成中，哪些氨基酸與三羧酸循壞中間物有關(guān)？哪些氨基酸與脂酵解有關(guān)？（必考）

5.在正常情況下，生物體內(nèi)三大物質(zhì)在代謝過程中，既不會引起某些產(chǎn)物的不足或過剩，也不會造成某些材料的缺乏和積累，為什么？

第四篇：生物化學(xué)

《生物化學(xué)》校級精品課程建設(shè)總結(jié)報告

《生物化學(xué)》是醫(yī)學(xué)類各個專業(yè)和與生命學(xué)科相關(guān)的專業(yè)最重要的公共基礎(chǔ)課，主要研究生物體內(nèi)化學(xué)分子與化學(xué)反應(yīng)的科學(xué)，從分子水平探討生命現(xiàn)象的本質(zhì)。生物化學(xué)與生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和免疫學(xué)等眾多學(xué)科有著廣泛的聯(lián)系和交叉。該課程2006年被評為校級精品課程建設(shè)課程，課程組立即制定了精品課程建設(shè)規(guī)劃，包括總體建設(shè)目標(biāo)、實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的措施、課程的特色與優(yōu)勢分析、課程的不足之處、建設(shè)小組、建設(shè)計劃、建設(shè)經(jīng)費(fèi)預(yù)算等內(nèi)容。三年來，在學(xué)校和醫(yī)學(xué)院的領(lǐng)導(dǎo)的支持下，通過本課程組全體人員的積極參與和共同努力，在教學(xué)隊(duì)伍建設(shè)、教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)條件、教學(xué)方法與手段等課程建設(shè)方面都取得了顯著的成績，形成了自己的特色和優(yōu)勢，標(biāo)志性成果顯著，超額完成協(xié)議書規(guī)定的任務(wù)。現(xiàn)將有關(guān)情況總結(jié)如下。

1.教學(xué)隊(duì)伍

1－1 課程負(fù)責(zé)人與主講教師

課程負(fù)責(zé)人與主講教師師德好，學(xué)術(shù)造詣高，教學(xué)能力強(qiáng)，教學(xué)經(jīng)驗(yàn)豐富，教學(xué)特色鮮明。

課程負(fù)責(zé)人唐冬生，教授、博士，醫(yī)學(xué)院院長。具有高尚的職業(yè)道德，為人師表，2008年被評為學(xué)校“三育人”優(yōu)秀獎。廣東省“千百十工程”省級學(xué)術(shù)帶頭人，動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)學(xué)科的學(xué)科帶頭人。近三年獲國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目共2項(xiàng)、粵港關(guān)鍵領(lǐng)域重點(diǎn)突破項(xiàng)目1項(xiàng)、廣東省科技攻關(guān)計劃項(xiàng)目1 項(xiàng)。現(xiàn)為全國醫(yī)學(xué)高職高專教育研究會常務(wù)理事、全國高協(xié)組織教材研究與編寫委員會委員、全國動物生物技術(shù)學(xué)會理事會理事、廣東省生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會常務(wù)理事、廣東省遺傳學(xué)會常務(wù)理事、廣東省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會委員兼秘書。原湖南醫(yī)科大學(xué)、現(xiàn)暨南大學(xué)、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士生導(dǎo)師。理論教學(xué)講解條理清晰，課堂氣氛生動活躍，技術(shù)技能指導(dǎo)實(shí)效實(shí)用，并且每一個重點(diǎn)內(nèi)容都會給學(xué)生總結(jié)一些適用的記憶方法與學(xué)習(xí)技巧，這常常使學(xué)生的學(xué)習(xí)事半功倍，深受學(xué)生好評。2006、2007年教學(xué)質(zhì)量評估為優(yōu)秀或優(yōu)秀獎。

張曉林副教授，生物化學(xué)碩士研究生，現(xiàn)擔(dān)任醫(yī)學(xué)院副院長，《檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育》編委，承擔(dān)和參與多項(xiàng)省市科研課題，近三年獲廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目1項(xiàng)，學(xué)術(shù)水平較高，教學(xué)工作認(rèn)真負(fù)責(zé)，深入淺出，精益求精,理論聯(lián)系實(shí)際，教學(xué)效果好。2008獲佛山市教育系統(tǒng)優(yōu)秀教師, 2006年獲學(xué)校“三育人”優(yōu)秀獎。

龔道元副教授，生物化學(xué)碩士研究生，檢驗(yàn)藥學(xué)系副主任，《檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育》編委，是學(xué)院教學(xué)督導(dǎo)小組成員和系教學(xué)督導(dǎo)小組負(fù)責(zé)人，佛山市檢驗(yàn)學(xué)會委員，臨床檢驗(yàn)學(xué)組組長，佛山市醫(yī)療事故鑒定專家?guī)斐蓡T，佛山市教育科研項(xiàng)目評審專家成員，在全國高校檢驗(yàn)界和廣東省、佛山市醫(yī)院檢驗(yàn)界有較大的影響力。承擔(dān)和參與多項(xiàng)省市科研課題，學(xué)術(shù)水平較高，主編、參編檢驗(yàn)專業(yè)全國規(guī)劃教材和專著10多部。2008年教學(xué)質(zhì)評為優(yōu)秀獎，教學(xué)效果好。2007年“醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專

第五篇：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報告：Western blotting檢測大腸桿菌重組蛋白

實(shí)驗(yàn)三 Western blotting檢測大腸桿菌重組蛋白

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

利用Western Blotting技術(shù)，定性（或定量）檢測苦蕎黃酮醇合酶基因（Flavonol synthase gene, FtFLS）在大腸桿菌表達(dá)宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

黃酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）屬于2-ODD家族，催化黃酮醇合成支路中最后一步氧化反應(yīng)，也是直接合成黃酮醇的反應(yīng)。FLS可以使二氫黃酮醇在C3鏈中C2和C3之間氧化形成雙鍵，從而生成黃酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate + O2 a Flavonol + succinate + CO2 + H2O。

本實(shí)驗(yàn)采用PCR的方法，在苦蕎黃酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密碼子前引入Kpn ?酶切位點(diǎn)，去掉終止密碼并引入BamH ?酶切位點(diǎn)。克隆引入酶切位點(diǎn)后的FtFLS到表達(dá)載體pET-30b(+)質(zhì)粒中，其表達(dá)產(chǎn)物分別在N-末端和C-末端各含有6 × His標(biāo)簽。重組質(zhì)粒（pET-30b(+)-FtFLS）經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)并使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。收集誘導(dǎo)0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的產(chǎn)物，經(jīng)SDS-PAGE后用于考馬斯亮藍(lán)R-250染色或Western blotting分析。

Western blotting的標(biāo)準(zhǔn)流程如下：蛋白質(zhì)首先通過SDS-PAGE胺凝膠電泳分離，通過電泳轉(zhuǎn)移到固相支持物上（硝酸纖維素膜、PVDF膜和尼龍膜）；將膜上未反應(yīng)的位點(diǎn)封閉起來，以抑制抗體的非特異性吸附，固定的蛋白質(zhì)即可與特異性的多克隆或單克隆抗體相互作用并通過放射、生色或化學(xué)發(fā)光的方法進(jìn)行定位。

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠抗聚組氨酸單克隆抗體（Anti-His tag IgG，一抗）與重組FtFLS蛋白的N-末端和C-末端6 × His發(fā)生抗原-抗體特異反應(yīng)，再利用辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG（peroxidase-Goat Anti-Mouse IgG，二抗）與一抗發(fā)生特異結(jié)合，最后使用DAB進(jìn)行顯色。DAB即：二氨基聯(lián)苯胺（3, 3'-diaminobenzidine），是過氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB在過氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化和積累，形成淺棕色不溶性產(chǎn)物。該方法常用于檢測過氧化物酶的活性，它靈敏度高，特異性好，在免疫組化，原位雜交，Western blotting等膜顯色中 1

應(yīng)用廣泛。

三、操作步驟 3.1 樣品的制備

原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測大腸桿菌重組蛋白時細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。

材料與試劑：

重組pET-30b(+)-FtFLS質(zhì)粒、表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)、LB固體培養(yǎng)基（Kan 50μg/mL）、LB 液體培養(yǎng)基（10mL、50mL）、Kan（50 mg/mL）、IPTG（24 mg/mL）、PBS緩沖液、5 X SDS上樣緩沖液。儀器與設(shè)備：

恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺、酒精燈、消毒酒精（75%）、棉球、接種環(huán)、臺式離心機(jī)、冰盤、Tip（10 μL、200 μL、1 mL）、微量加樣器（10 μL、200 μL、1 mL）、離心管（1.5 mL、10 mL）。操作步驟：

①含重組質(zhì)粒pET-30b(+)-FtFLS的表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)劃線于LB 固體培養(yǎng)基（Kan抗性），37℃培養(yǎng)16 h。

②挑選單菌落，接種至10 mL LB培養(yǎng)基（按0.1%加入Kan，10 μL）于37 ℃過夜培養(yǎng)，即為種子液。

③按2 %的接種量（1 mL）將種子液接種到50 mL LB Kan培養(yǎng)基中（按0.1%加入Kan，50 μL），于37 ℃培養(yǎng)OD600至0.5（約2.5 h）。

④加入IPTG至終濃度為1 mmol/L（100 μL），置于25℃連續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)8 h，分別取誘導(dǎo)前0 h，誘導(dǎo)后2 h、4 h、6 h和8 h的培養(yǎng)液5 mL于10 mL離心管中，置于冰水混合物上備用。

⑤誘導(dǎo)完畢后，各樣品于8000 rpm（12000 rpm易爆管）離心5 min收集沉淀，用等體積PBS（5 mL）重懸漂洗細(xì)胞2次，收集菌體。

⑥各管分別加入400 μL PBS重懸細(xì)胞，加入100 μL 5 X SDS上樣緩沖液，置于沸水浴中10 min（注意防止爆管）。注意事項(xiàng)：

①重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)應(yīng)進(jìn)行正確的無菌操作并加入適宜濃度的抗生素，避免可能的污染。

②在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性。

③選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價鍵二硫鍵。盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。

④制備過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾。

⑤樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出20ul檢測蛋白質(zhì)定量用），然后保存與-20°或-80℃中長期保存，但要注意不要反復(fù)凍融，因?yàn)闀沟鞍椎目乖匦园l(fā)生改變。3.2 SDS-PAGE SDS-PAGE（SDS變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳）的分離原理則僅根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的差異。因?yàn)镾DS-PAGE上樣緩沖液含有SDS和巰基乙醇（2-ME）或二巰基赤蘚醇（DTT），其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵、分子內(nèi)氫鍵、破壞蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)、形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物形成榛狀結(jié)構(gòu)，平均每兩個氨基酸殘基結(jié)合一個SDS分子，使其帶有大量的負(fù)電荷（蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋），從而消除了不同分子之間原有的電荷差別。材料與試劑：

① 分離膠緩沖液（1.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 8.8）。② 濃縮膠緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 6.8）。

③ 30%丙烯酰胺/N, N'-亞甲基雙丙烯酰胺（Arc/Bis）：29.2 g Acr，0.8 g Bis，定容至100 mL。

④ 10%過硫酸銨（W/V），需新鮮配制。

⑤ 2 X 上樣緩沖液（pH 8.0）：含0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）2 mL，甘油2 mL，20% SDS 2 mL（W/V），0.1%溴酚藍(lán) 0.5 mL，2-β-巰基乙醇（2-ME）1.0 mL，定容至10 mL。

⑥ 電極緩沖液（pH 8.3）：3.03 g Tris，14.41 g Gly，1.0 g SDS，調(diào)整pH后定容至1000 mL。

⑦ 染色液：45%甲醇，10%乙酸，0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250。⑧ 脫色液：10%（V/V）乙酸，5%（V/V）乙醇。⑨ 封底膠：1g瓊脂糖溶于100 mL電極緩沖液。⑩ 預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)Marker。儀器與設(shè)備：

垂直板電泳槽及其附件，電爐，電泳儀，微量加樣器（10 μL），Tip（10 μL）。操作步驟：

① 電泳槽的安裝：將成套的兩塊玻璃板正確放入硅膠條中，夾在電泳槽里，按對角線順序旋緊螺絲（注意分辨上下槽）。用1%的瓊脂糖封底（封于下槽底部），待瓊脂糖凝固后即可制膠。

② 制膠：選擇合適的膠濃度，按下表配制分離膠，灌入兩玻璃板之間，加至距短玻璃板頂端3 cm處，立即覆蓋5 mm左右水層，靜置等待聚合，當(dāng)分離膠與水層之間的界面重新出現(xiàn)時表明膠已聚合。小心倒掉分離膠上水層，配制濃縮膠后加入玻璃板中，插入梳子并及時補(bǔ)充由于濃縮膠聚合產(chǎn)生的空隙（該過程避免氣泡的產(chǎn)生）。

本實(shí)驗(yàn)選用12.5%的SDS-PAGE膠對重組FtFLS進(jìn)行分離。

試劑 濃度 分離膠緩沖液 mL 濃縮膠緩沖液 mL Acr/Bis mL

分離膠

7.5% 10% 12.5% 15% 4.05.3

4.08.0

30% 4.01.25 0.75 4

H2O mL 10% AP mL TEMED mL

8.0 0.3

6.7 0.3

5.3 0.3

4.0 0.3

1.3 0.3

3.0 0.15 0.005

0.008 0.008 0.008 0.008 0.008 ③ 點(diǎn)樣：分別在上下電泳槽中倒入電極緩沖液，上槽淹沒短玻璃板，下槽淹沒電極即可。此時，小心拔出梳子，用微量加樣器調(diào)整點(diǎn)樣孔之間的濃縮膠（此步驟應(yīng)檢查電泳槽是否漏液）。使用微量進(jìn)樣器分別在樣品槽內(nèi)分別加入預(yù)染的標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)、誘導(dǎo)前0 h，誘導(dǎo)2 h、4 h、6 h和8 h后處理好的樣品18 μL（上樣總體積一般不超過15 μL，加樣孔的最大限度可加20 μL樣品）。

④ 電泳：接通電源，調(diào)節(jié)電壓至100 V，恒壓電泳；待指示劑進(jìn)入分離膠后，調(diào)節(jié)電壓至200 V恒壓電泳。待指示劑在分離膠中遷移5-6 cm左右時，停止電泳。剝膠：小心剝膠，將濃縮膠（濃縮膠影響操作）和分離膠上不用的部分切去（便于識別），見圖3和圖4.⑤ 染色：凝膠經(jīng)蒸餾水漂洗1次后加入染色液，電爐加熱處理10-20 min染色。⑥ 脫色：使用蒸餾水漂洗取出染色液，加入脫色液，電爐加熱脫色至出現(xiàn)清晰的蛋白條帶。注意事項(xiàng)：

①上樣總體積一般不超過15?L，膠孔的最大限度可加20?L樣品。

②微量加樣器應(yīng)貼壁吸取樣品，避免吸進(jìn)氣泡；將微量加樣器Tip頭插至加樣孔中緩慢加入樣品，避免樣品溢出。

③電泳設(shè)備應(yīng)注意檢查正負(fù)極、是否短路或接觸不良、是否漏液、電流電壓大小（電流強(qiáng)度會隨電泳的進(jìn)行有所降低）。

④電極緩沖液和AP應(yīng)新鮮配制，上下槽緩沖液不可混用（電泳完畢分別收集）。3.3 轉(zhuǎn)膜與雜交

雜交膜的選擇是決定Western blotting成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。

用于Western blot 的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜（NC）和聚偏氟乙烯（PVDF）膜。NC膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的NC膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。通常用0.45 μm和0.2 μm兩種規(guī)格的NC膜。大于20 kDa的蛋白可用0.45 μm 的膜，小于20 kDa的蛋白用0.2 μm的膜。PVDF 膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和1-5 sec。蛋白質(zhì)常用的轉(zhuǎn)移方法主要有兩種：槽式濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)移。前者操作容易，轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。以下為槽式濕轉(zhuǎn)的操作步驟。材料與試劑：

材料：PVDF膜，Whatman 濾紙，搪瓷盤，一次性PE手套，鑷子，玻棒，試劑：轉(zhuǎn)移緩沖液 pH 8.3（25 mmol/L Tris，0.2 M 甘氨酸，20%甲醇），1000 mL 10 X TBS緩沖液pH 7.6（24.2 g Tris base，80 g NaCl，用1N HCl調(diào)pH=7.6），脫脂奶粉、BSA或試劑盒自帶的蛋白質(zhì)干粉，洗滌緩沖液（1 X TBS，0.1% Tween-20），封閉緩沖液（1×TBS，0.1% Tween-20，5% w/v脫脂奶粉或BSA），抗體稀釋液[1×TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA（多抗）或5%脫脂奶粉（單抗）]。儀器與設(shè)備：

轉(zhuǎn)膜電泳儀及其附件，雜交儀，培養(yǎng)皿，凝膠成像系統(tǒng)。操作步驟： 轉(zhuǎn)膜

① 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移緩沖液，依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，將凝膠和PVDF膜和濾紙放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。

② 裝配轉(zhuǎn)移三明治（海綿→3層濾紙→膠→膜→3層濾紙→海綿）：在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜；將夾子打開使一面保持水平（規(guī)定為正極）。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以

搟走里面的氣泡。在墊子上墊三層濾紙，一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。依次加膜、加膠，再在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡，見圖5。

③ 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V電泳1h（電流約為0.3 A）。

④ 電泳結(jié)束，觀察預(yù)染的蛋白質(zhì)Marker是否轉(zhuǎn)移到膜上。雜交

① 用25-50 mL洗滌緩沖液洗滌硝酸纖維素膜5 min, 1 次。

② 封閉硝酸纖維膜：加封閉緩沖液25 mL，37℃封閉2 h。用量以浸沒整張膜為準(zhǔn)，圖6。

③ 抗體的稀釋（已依稀）：小鼠抗聚組氨酸單克隆抗體使用100 μL抗體稀釋液進(jìn)行溶解稀釋，儲存與4℃。（一般特異性抗體濃度1 μg/mL）

④ 硝酸纖維膜孵育一抗：加入20 mL抗體稀釋液，將25 μL一抗加入培養(yǎng)皿中（已完全覆蓋膜為準(zhǔn)），37℃孵育2 h左右，見圖7和圖8。（視實(shí)驗(yàn)時間，也可以4℃孵育過夜）

⑤ 用25 mL洗滌緩沖液振蕩洗滌硝酸纖維素膜3 次, 每次5 min。

⑥ 硝酸纖維膜孵育二抗：加入25 mL抗體稀釋液，將25μL二抗全部加入培養(yǎng)皿中（以完全覆蓋膜為準(zhǔn)），37 ℃孵育2 h，見圖7和圖8。

⑦ 用30 mL洗滌緩沖液振蕩洗滌硝酸纖維膜4 次, 每次5 min。

⑧ DAB 顯色：按每2 mL蒸餾水加顯色劑A，B，C 各１滴，混勻。混勻后加至膜上。室溫顯色。一般顯色1－30 分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。顯色后用蒸餾水洗滌以終止反應(yīng)。注意事項(xiàng)：

①操作中戴手套，不要用手觸膜。

②如檢測小于20 kDa的蛋白應(yīng)用0.2μm的膜，并可省略轉(zhuǎn)移時的平衡步驟。③某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時可用1.0% BSA代替Tween-20。④關(guān)于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩蓋抗體結(jié)合能力；0.3~3% BSA in PBS：低的內(nèi)源性交叉反應(yīng)性。

⑤如用0.1% Tween 20、0.02% NaN3 in PBS or TBS作封閉劑和抗體稀釋液，抗體檢測后可進(jìn)行蛋白染色。

⑥如要同時檢測大分子量和小分子蛋白，最好用梯度膠分離蛋白。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 考馬斯亮藍(lán)顯色結(jié)果

4.2 DAB顯色結(jié)果

五、討論與分析

1.考馬斯亮藍(lán)顯色結(jié)果

由圖可知，其變化趨勢是目的條帶顏色越來越深，條帶寬度也逐漸變寬。說明隨著培養(yǎng)時間推移，產(chǎn)生的目的蛋白越來越多，也就意味著轉(zhuǎn)入的基因得到表達(dá)。而目的條帶寬度在6h以后變化已經(jīng)不明顯，說明此時目的蛋白的表達(dá)已達(dá)到接近峰值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的背景色偏深，但還不影響結(jié)果的判定。2.DAB顯色結(jié)果

由于顯色結(jié)果并不理想，不能清晰反映我們實(shí)驗(yàn)設(shè)計所需要的結(jié)果。上圖顯色結(jié)果為繪制的示意圖。主要可能是因?yàn)橐豢狗跤龝r間較短導(dǎo)致，也可能是由于蛋白樣品本身上樣量不足或蛋白濃度較低，以及轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)印效率不夠高。另外，也可能由于以下這些方面沒有嚴(yán)格做到影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

A制作凝膠時，嚴(yán)格按照配方制作，倒膠時做到既快又穩(wěn)，防止產(chǎn)生氣泡。同時，制膠前應(yīng)洗凈玻板并使其完全干燥，否則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

B進(jìn)入雜交階段，重要的是控制溫度和孵育時間，在孵育之前，封閉也是必不可少的步驟。顯色效果與各個步驟都是密不可分的，但一抗、二抗品質(zhì)與用量尤為重要。這一步必須尤為仔細(xì)。

C 當(dāng)進(jìn)入轉(zhuǎn)膜階段時，注意轉(zhuǎn)移三明治的順序，海綿、濾紙、膠、膜，濾紙，海綿。還需要注意的是一定要驅(qū)趕完海綿里的氣泡，不然會造成短路。

D為提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度樣品應(yīng)按照以下標(biāo)準(zhǔn)：樣品不能反復(fù)凍融，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程，提高抗?jié)舛取τ诩拥鞍酌敢种苿﹣碚f，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。