第一篇：細胞轉染成功與否的八大要素

細胞轉染成功與否的八大要素

摘要 : 轉染是否成功的影響因素很多，如需要轉染的細胞類型(對于困難的細胞系尤其如此)，需要被轉染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白質)，轉染試劑等。但無論在何種情況下，轉染的成功均取決于

知己知彼，方能百戰不殆。做細胞轉染也一樣道理。細胞轉染實驗的影響因素很多，如需要轉染的細胞類型(對于困難的細胞系尤其如此)，需要被轉染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白質)，轉染試劑等。但無論在何種情況下，以下八個要素都不容忽視。

要素一：細胞

分裂細胞相比較非分裂細胞——分裂細胞往往要比靜止細胞更易于攝取并表達外源DNA。因此對大多數轉染操作而言，細胞都在轉染當天或前一天種板。同樣重要的是細胞在種板進行轉染時不應處于過度生長的狀態;此外，還常用促有絲分裂刺激物(如，病毒轉化，生長因子，條件培養基，以及滋養細胞)來活化原代培養細胞。

貼壁細胞相比較懸浮細胞——在轉染效率方面貼壁細胞和懸浮細胞之間的差異顯著。相對于貼壁細胞(如HEK，CHO)，懸浮細胞(如HL 60，Jurkat)非常難以轉染，可能是因為細胞間膜結構的差異，但目前還沒有分子水平上合理機制的解釋。

分板方案——在對培養細胞進行分板傳代培養之前，必須把貼壁細胞用胰蛋白酶消化使之脫離培養基質。這個常規操作可導致正常細胞功能受到嚴重損害。因此分批方案的不同(如，胰蛋白酶消化時間的長短，胰蛋白酶的滅活等)需要優化。

傳代次數——傳代次數是指對一個細胞系進行分批傳代的頻度(通常在一個實驗室范圍內)。某些細胞系相比較其他細胞系而言較不穩定，可能會隨著培養時間的延長而改變，視不同的細胞系和培養條件而定。因此名稱相同的同一細胞系在生理學和形態學(以及轉染能力)性質也可能會有很大的差異。一般而言，細胞在凍存復蘇后的一兩代之內或直到它們完全復蘇之前都很難轉染。

細胞數量(融合率)——只要培養基質(組織培養皿)尚有空間，細胞就會按指數規律分裂。對于正常細胞而言，細胞生長的速度受細胞密度大小的抑制(接觸抑制)，但癌細胞則不受此限制而會繼續生長并可互相疊加。營養物質的耗竭以及代謝廢物的積聚會影響所有的細胞生長。細胞會因受到營養物質匱乏的壓力而不適于轉染。報告基因的表達率與轉染開始時的細胞數量和細胞健康以及細胞溶解之前的生長情況相關。

培養物污染——培養物可被細菌、酵母、真菌、病毒、支原體、甚至其他細胞種類所污染。各種污染都會導致產生錯誤的結果。支原體污染——支原體污染在所有培養細胞中的比例為5-35%，它可改變細胞生長特性，酶的作用途徑，細胞膜的組成，染色體結構，以及轉染效率。特別是，支原體對采用脂質、DEAE-右旋糖酐、磷酸鈣或腺病毒介導的轉染技術有所干擾，其結果致使非典型轉染或轉染效率偏低。這些影響會導致實驗結果的不可靠以及時間和珍貴細胞系的損失。和細菌及真菌不同，支原體污染無法通過視覺檢查發現。它們非常小甚至能夠通過大多數的無菌濾膜;它們還對常用抗生素有抗藥性。所以必需進行支原體污染的常規篩查。

要素二：載體DNA

一般原則：對純化所得的載體進行質量鑒定。確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細胞體系。在測定細胞體系的參數時，一定要選用一種已知具有功能的載體做對照。

載體的完整性——載體是否具有功能取決于它結構的完整性。轉染效率受到質粒制備物的超螺旋結構和舒展結構之間比例、雙螺旋斷裂、核酸酶的降解，以及來自于儲存和處理過程中的物理壓力的影響。

載體制備物——各種載體是按照不同的方案在細菌體系中制備并純化。制備產物中殘余的污染物(如CsCl，內毒素)可能會影響轉染效率。

載體構造(啟動子/增強子/ORI)—轉染體系通常用帶有強病毒調節元件(如，RSV，CMV，和SV40)的對照載體進行優化和比較。然而，病毒啟動子/增強子體系的相對有效性在不同細胞系間的差異可大到兩個數量級。例如，在某些細胞系中，由于自發的質粒擴增，SV40體系可高效表達large T抗原(如，COS);而在其他許多細胞系中，則是CMV啟動子更為有效。

除此之外，各種CMV載體的表達率也會有超過一個數量級的差異，這部分是由于載體中其他調節元件所引起的。要素三：組織培養試劑

一般原則：優化您的細胞生長條件。只使用新鮮配制的培養基和添加劑，并盡可能減少所用試劑的變更。基礎培養基——培養基的成分包括營養物質(氨基酸，葡萄糖)，維生素，無機鹽，和緩沖物質。有些成分非常不穩定，因此如果在使用時不是新鮮，加入就可能會產生問題。配置時要使培養基務必避光保存;因為已知有一些組分和緩沖物質，如HEPES，當暴露于光照下就會分解產生細胞毒性物質。

胎牛血清——血清是一種含有白蛋白、球蛋白、生長促進因子和生長抑制因子的極為復雜的混和物。采集血清所用動物的年齡、營養水平和健康狀況可影響到血清中這些成分的數量和質量，從而引起顯著生物學變化。

添加劑——某些細胞的生長依賴于一些對生命力或細胞分裂必不可少的物質(如，生長因子，微量元素，必需代謝物和蛋白等)。CO2培養箱——細胞生長所需環境為37℃、相對濕度為95%的CO2培養箱。用CO2是為了控制pH值，細胞生理對pH的變化非常敏感，因此多數細胞培養基都含有碳酸氫鹽緩沖體系。有些培養基需要CO2 濃度為5%來有效控制pH值，而另一些則需要10%的CO2。需要向您的培養基供應者核對一下適當的CO2濃度。如果培養箱內培養條件與所需條件不一致(溫度、濕度和CO2)則會導致實驗結果的板間變異。來自于培養箱內的污染物、化學物質，或真菌/細胞的污染也都可能影響到細胞生理。

要素四：使用瞬時轉染來生產蛋白瞬時轉染表達蛋白

以往為了獲得蛋白質的高表達產量，必須先轉染細胞，然后挑選一個穩定的轉染細胞系進行蛋白的擴增和富集。而挑選這樣一個細胞系往往需要花費數周甚至數月的時間，這既可能是由于試劑的細胞毒性也可能是由于轉染的低效率。如果是因為轉染試劑具有細胞毒性，那么只有少數細胞能夠存活，從而導致蛋白質的產量很低。而如果是因為轉染成功的細胞太少，那么那些未轉染的細胞生長速度大大超過轉染成功的細胞，其結果同樣也只能產生少量的目標蛋白。使用一種溫和的可以轉染大多數細胞的轉染試劑，就可獲得蛋白質的高表達。

現將一些影響蛋白高效表達的關鍵因素分列如下： 細胞系(有些類型的細胞比其他細胞產量高)質粒骨架(例如：增強子，啟動子，轉錄調控元件)目的蛋白(有些蛋白很難獲得高表達量)目的蛋白的cDNA序列(例如：密碼子的優化)培養條件(營養物，代謝廢物，轉染抑制物)當這些因素都得到優化，并加入合適配比和數量的轉染復合物(轉染試劑-質粒)后，就可獲得至少達到平均表達水平的穩定表達克隆。

要素五：瞬時轉染和穩定轉染

制備一種穩定細胞系的第一步是選擇一種同時含有選擇性標記物和目的基因的載體。選擇性標記物通常是可以產生一種蛋白質或者酶來幫助細胞在某些毒性物質存在下存活的基因。

一旦選好了質粒載體，無論瞬時或者穩定表達都采用一樣的轉染方法。在加入選擇性試劑之前，被轉染的細胞至少要在標準培養基中培養過夜。這樣就使細胞有時間表達足量的蛋白使之能夠耐受選擇性試劑的作用。細胞于是在加有選擇性試劑的培養基中生長。那些未成功轉染質粒的細胞即被殺死。而只有那些成功轉染的細胞能夠生長。有的時候，還可以將選擇性試劑持續加入到培養基中，以維持對細胞的選擇壓力。

要素六：轉染方案

一般原則：建立一套適當的轉染方案;首先從一種標準方案開始，然后通過改變試劑/DNA的配比和復合物的劑量進行優化。轉染復合物的制備——諸如轉染試劑/DNA配比，離子強度，緩沖液pH值，以及溫度等變量都會影響到轉染復合物的組成和功能。質粒可用無菌水或TE緩沖液稀釋。如果您要使用一種市售的轉染試劑，就應當仔細閱讀該試劑所提供的使用說明。在不含血清或其他蛋白的培養基中制備轉染復合物;如果制備復合物所使用的培養基含有血清，它就會對轉染產生抑制。制備轉染復合物的最佳孵育時間是一個非常關鍵的環節，對于不同的轉染試劑而言可能差別很大。

轉染試劑/DNA配比(負載比)——所有的轉染試劑都會在某一個試劑/DNA配比時最為有效。有時候這種最佳配比的所在范圍非常狹窄;而且對于每種實驗體系都必須進行優化才能得到最佳配比。形成轉染復合物所用的稀釋劑——對于多數試劑而言，很關鍵的一點是要使轉染復合物能在普通基礎培養基或鹽溶液中形成。轉染復合物的加入——有兩種替換方法可用來將轉染復合物加入轉染細胞：1.將復合物濃縮液逐滴加入培養基，或者2.將轉染復合物先用培養基稀釋，然后進行培養基更換操作。第一種方法更簡便，而第二種方法則更因為避免了試劑在局部濃聚而產生毒性，所以會使結果的一致性更好。

要素七：時間進度

一般原則提示：要確保最終結果的成功;建立一個合適的時間進度進行轉染實驗以保證您所需要的目的蛋白能得到最佳表達。轉染的開始——在轉染前12小時，將細胞分種于培養板中。在細胞達到50-80%的融合率時開始轉染，這樣就可以使它們在實驗結束時達到接近100%的融合。細胞對轉染復合物的攝取通常在0.5-6小時的時間內完成。在這段時間后，就不會再發現轉染效率有所增長。

培養基更換——某些轉染試劑在攝取階段之后需要更換培養基。如果轉染必須在沒有胎牛血清存在的條件下進行，那么這一步驟就必不可少。而對于可在血清存在的情況下使用的無毒性轉染試劑時，如果有足夠的培養基用于后續表達階段，就可以省略這一步。如果將轉染復合物留在培養基中直到進行檢測，那么對有些細胞系而言轉染效率會有所提高，而另外一些細胞在轉染開始幾個小時之后其轉染效率就不會再有升高。雖然在轉染步驟之后轉染試劑/DNA復合物通常不一定要從培養體系中清除，但在此后的長期生長階段換用新鮮的培養基卻是必須的。如果轉染細胞需要生長3-7天，換培養基就尤其重要，這樣一來就使它們有時間達到最高的蛋白表達量。

時間測定——轉染開始后的24-48小時內，報告基因產物的濃度逐漸增加;而這種增加取決于增強子的強度、表達外源蛋白中所涉及的細胞反應，存活細胞的健康狀態，以及營養因素等。在轉染后等待3-7天收集蛋白進行純化較為常見了。

最后就是平時可能會忽略的轉染試劑本身的脫靶效應off-target effect，轉染試劑本身對基因表達水平(高表達或低表達)的影響，有時候可能會造成假陽性的結果。

我自己的體會是，一般的細胞，用脂質體2000和fugeneHD轉染效率相差不大，雖然最近有文獻說脂質體2000脫靶效應很高，但國內在乎的人貌似不多;但是干細胞，原代細胞和腫瘤細胞等一些比較難轉的細胞系，Fugene HD比較溫和，細胞毒性很低，轉染效率明顯要好;懸浮細胞，各有千秋，不敢說一定可以，重在嘗試，要是都不行，就電轉吧。

要素八：交叉污染

如果同一個實驗室同時培養不同種類的細胞，那就有可能發生交叉污染，即使遵循最嚴格的分離操作規程這種情況也有可能發生。如有許多細胞系被HeLa細胞所污染。和其他細胞系之間的交叉污染不總是能通過鏡檢發現。如果有少量某種生長快速的細胞摻入到培養細胞種，幾個月過后它們就會完全取代目標培養物。

作者：keeii 點擊：1087次

第二篇：細胞轉染及克隆篩選

篩選之前確定G418濃度： 1，由于每種細胞對G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉劑中有效的G418含量大約為0.722g。

2，G418 是新霉素的類似物，兩者都是通過抑制核糖體的功能和蛋白質的合成而殺死細胞的。但是新霉素對真核細胞無作用而G418對細菌和真核細胞都起作用。neo就是編碼3‘磷酸轉移酶的基因，它表達的蛋白能夠分解新霉素和G418。在進行轉染時細胞膜受到影響，抗生素可能對細胞產生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉轉染時不加其它抗生素。

3，匯合度對G418篩選結果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜超過50% 4，G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細胞稀釋到1000個細胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的 G418濃度范圍內進行篩選，選擇出在10~14天內使細胞全部死亡的最低G418濃度來進行下一步的篩選試驗。一個具體試驗：3*106個細胞電轉后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細胞到24孔板中，48h后加藥篩選，此時1/300細胞孔內大約50%匯合度。理論上1/4000孔內應有4%的匯合度。篩選9天后，觀察1/4000孔內有兩三個克隆，按比例1/300孔內應該有幾十個克隆，事實上，它們幾乎全死光了，只有幾個克隆。加藥時間和維持濃度

1，由于基因轉染到細胞內之后要一段時間才能表達出蛋白質。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉入的細胞所淹沒，最終導致篩選不出陽性克隆，一般要在轉染24小時之后才開始加G418篩選。隨著細胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時藥物濃度可以降至200ug/ml。

2，加抗生素的時機，主要是考慮插入到細胞基因組的抗性基因是否已經得到表達。一般是轉染48小時后加入抗生素。挑出單克隆后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2。關于維持濃度，有人說細胞會出現對抗生素的抗性，應不斷提高其濃度。而且，如果你要挑選到幾個陽性克隆中較高表達的克隆的話，可以調整抗生素的濃度。當然，抗性基因高表達，目的基因不一定就跟著高表達。

篩選時的培養液

加藥篩選約6天左右，細胞會大量死亡，孔中只剩下的細胞寥寥無幾。這時會出現兩個問題： 1，死亡的細胞會裂解釋放出有害物質，導致那些有neo表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時換液，孔中細胞數目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導致陽性細胞的狀態不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養液：假如你要轉染3T3細胞，在3T3 細胞匯合度達到80%的時候，換液，培養過夜之后收集培養液，通過濾器消毒，和新鮮的培養液按1：1混合備用。再轉染后篩選過程中就可以應用這種培養基。3，適當增加血清濃度。

篩選時出現的問題及其解決辦法：

1，問題1。做hela細胞的篩選，現在已經篩選3周，在6孔板中已經長出一些細胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化過程中，胰酶擴散，細胞已經四散開，和周圍的其它細胞簇融合在一起（我的細胞簇離的很近），就是說幾個細胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去了，該怎么辦？

a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度溫箱預熱，并且PBS潤洗細胞層，以減少可能殘存的血清的影響；

b、加入胰酶后，稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續作用1MIN，這時，消化酶可以繼續作用的，又可避免胰酶擴散；

c、顯微鏡下觀察細胞完全松散開，就可以在你感興趣的局部加培養基，并吸走你的可隆了呀

d、具體消化的時間，你注意摸索一下，如果 步驟2中顯微鏡下見細胞尚未完全松散開，可以再重復的，直到松散開，能夠被吸走為止。

我的建議：

1、在100mm dish中挑克隆，細胞分的稀一點。

2、把細胞全部消化下來，在96孔板中逐步稀釋獲得單克隆

2，問題2。篩選成功的概率：只要有抗性加壓篩選，挑選到的機率還是比較大的。一般能挑到穩定表達的概率我認為大概有70－80％，但是想挑到表

達量高且能穩定表達的，不大容易。這個可能是在染色體上，合適的整合位點太少的緣故。

3，問題3。細胞形態的改變：穩定轉染后陽性克隆均出現不同程度的細胞形態的改變。想請教各位有經驗的高手，你們做穩定轉染時有此發現嗎？我的也是，而且好象還有好幾種不同類型的細胞。不過，我轉的是一種抑癌基因。

4，問題4。單克隆化的時機和個數：加藥篩選時, 一般等到確認的轉染細胞長到70%以上時,再做有限稀釋法, 以克隆出陽性細胞, 同時要保持適當的藥物濃度,以防突變和污染。若細胞長好了,如有40%以上,就可以有限稀釋了一般，篩選5，6個克隆就有需要的克隆，但保險起見，篩10個吧。

5，從單克隆化時開始，就要加大營養，清和生長因子。單克隆化的操作方法；

1.方法1。單克隆細胞的培養就是這樣的,我現在作了15個96孔板的單克隆,總共才得到大約50株單克隆在做時候應保證每個孔中的細胞是一個,因此,我一般在200毫升的培養液中加入小于96個的細胞,這樣平均到每個孔中因該可以由滿意的結果你所說的現象我也遇到過,我也百思不得其解,只好做多一點的96孔板來補充。培養SPC-A1（人肺癌細胞），轉染了EGFP，然后進行了G418抗性篩選和96孔板單克隆篩選，最終獲得了成功將我的實驗步驟寫出來，希望對你有所幫助。

2.方法2。實驗步驟大致為：預先對96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的細胞培養液，0.1ml/孔，并放于細胞培養箱中溫育，然后胰酶消化穩定表達GFP的細胞，細胞液稀釋至密度為1000cell/ml的單細胞懸浮液，上述細胞液接種于96孔板的第一排，0.2ml /孔，從中吸取0.1ml細胞溶液接種于第二排，混合后，從第二排中吸取0.1ml接種于第三排……，一直到第八排，最后一排都丟棄0.1ml細胞液，操作示意圖見下圖。一般來說，每一列都會有某個孔中只有1~2個細胞。

3.方法3。我的改進之處：我在顯微鏡下觀察，標記孔中小于10個細胞的孔，然后在顯微鏡下用記號筆在皿底把單個熒光細胞圈住，然后在操凈臺里用滅過菌底牙簽將圈外的細胞戳死，這樣留在孔中的就是單克隆了，通過這樣的，我一共獲得了6株單克隆。但需注意的是：時間不能超過30min，否則細胞極容易死亡。解決操作時間長的方法：拿一個96板，在里面隨便種一些細胞，然后用牙簽練習，我練了5～6次后非常熟練了

培養液：最好是含15％的胎牛血清，加大營養，有利于細胞生長；另外一種方法是對還沒有變黃的細胞液進行過濾，過濾后的培養含有很多生長因子，可以作為單克隆的培養液。然后先在顯微鏡下把要挑的單克隆初看一遍，算一下大概要挑幾個，然后在96孔板內先加好培養基，再將6孔板內的培養基吸出，加入少量的胰酶，大概能蓋住板底即可，然后在顯微鏡下觀察細胞狀態，在有些變圓時，即用10ul槍在顯微鏡下直接吸克隆，放入事先準備好的加了培養基的96孔板內，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使細胞松散擴散開了時，已經吸了將近十個克隆了，動作快一些時能吸十幾個克隆，我做過幾次了效果很好，沒有出現污染。（在要進行操作時，用酒精將手好好擦擦，將顯微鏡用新潔爾滅也擦一下，一般不會有什么問題），你可以試試，只要小心一些就行了。

5.方法5。關于穩轉的方法，好像園子里很多xdjm都用的是有限稀釋法來作，但是我們實驗室基本上都不用九十六孔做有限稀釋來作單克隆的，一般的做法都是這樣： 1。3.5cm皿鋪細胞，長到大概80％以上的時候作轉染。

2。轉染后一天消化，傳到一個大皿（1：6）或者兩個大皿（1：12）。3。再過一天后加入帶G418的培養基。

4。依據細胞不同，大概從加入G418的第三天到第八天之間細胞開始出現大量死亡，活下來的細胞就形成單克隆。

5，單克隆長到相對較大的集落后，于顯微鏡下用200ul槍挑取細胞集落，一般挑上48個，種在兩塊24孔板上。

6。于24孔板上繼續培養，約4、5天后即可消化傳代，取部分作收蛋白western之用，根據western結果確定真陽性。

我們基本上都是這樣pick stable的，除非一些對細胞生長抑止作用強大或者apoptosis的inducer之類的基因比較難挑到stable外，一般還都能挑到 stable。當然，轉染效率不能太低，超過50％就相對比較容易了，10％以上的可能最后形成的細胞集落就少，而且真陽性也較少。對于那些轉染效率很低的細胞，我會連續轉染三次（中間如果細胞長滿了就傳代），好像比較有效。

除非是類似帶GFP這樣能直接觀察到是否真陽性的基因，我們才用有限稀釋法來作，要不好像也太麻煩了吧？耗時也多

單克隆化后細胞特點和處理：

1.單克隆后細胞生活習性改變：考慮質粒的表達對細胞的生長有一定的影響，查文獻確認一下。

2.單克隆后的培養需要多加些血清，再傳代時保證板子不影響細胞貼壁，避免出現傳代后細胞浮起來后死亡的現象。

3.篩選成單克隆后，不加藥培養2代，再加藥繼續篩選兩代，此時如果不出現死亡細胞則可以認為是穩定細胞系。復蘇后加G418傳代2次，然后按部就班。

4.過一段時間再篩選時，G418的濃度有人認為需要比穩轉時小寫，此外，加藥后對蛋白質的表達，細胞形態有影響，因此做功能時要停藥培養合適時間后再做。5.穩轉PA317細胞后再此篩選（需要隔一段時間再加壓篩一次），細胞也是死的厲害，不過還是可以篩到，不過需要用合適的濃度。可以在細胞傳幾代后，分出一小部分，不加G418培養一段時間，然后再加你維持細胞的抗性的G418濃度培養一天看細胞會不會死亡，如果死亡，說明外源基因還沒有丟失。

6.有人這樣做的：轉染加藥一段時間后，板子上出現了幾個克隆，如果有幾十個克隆，然后挑其中七八個克隆到24孔板里繼續加藥篩選，等24孔長滿后再轉到6孔板繼續加藥篩選，6孔板里長差不多滿后，每孔消化下來大概一半做WB鑒定目的基因表達，剩一半留著繼續加藥培養，等WB結果出來有陽性的孔就保留下來，陰性的丟掉。

單克隆化后鑒定：

1.穩定轉染細胞，通過PCR鑒定，發現目的基因并不上調，瞬時轉染表達是增高的。原因：瞬轉是在強啟動子下,穩轉時你得到的細胞株可能失去了此啟動子,或者是改變了細胞的生理特性!用WB和瞬轉對照鑒定一下。

2.轉染后質粒整合到基因組是隨機的，一般兩月后（傳代10代以上）還表達你想要蛋白的單克隆可以認為是整合了質粒的。

第三篇：一個人成功與否

一個人成功與否，關鍵在于他的心態。心態好了，會使人用積極的狀態去面對各種事情；心態不好，就會使人消極萎靡，萬事不成。所以說，心態會主宰人的成敗。

若想成功，就要有一個陽光的心態。這就需要在日常生活中不斷地讓自己變得積極起來，心靈之中有了陽光就會讓自己對各種事情都有一個積極的看法，會使自己的心靈的陰暗面變得更少。同時還會給別人一個非常好的印象，如果總是看生活中的消極方面，因為一點小事和別人大吵起來。那一定是一個不會生活的人，真正會生活的人。一定會讓自己變得開朗、熱情、豁達、大度，只有這樣才會成功。

雖然有了陽光的心靈，但是在生活中難免會遇到一些問題。這個時候一定要說“我能行”，不要說“我不行”。自己一定要學會在消極中找到積極的地方，每個人都可以做最好的自己，時刻要記住一句歌

著名的國學大師翟鴻燊說過：“積極地人走到哪里，人們都喜歡，消極的人總會因為他那張臉壞了風水，所以，不要做氣氛和情緒的污染者。”這就聯系到溝通了，一個消極的人總會把自己的壞情緒帶給別人，讓人很難接受。孔子的學生顏回有兩大優點：1。不二過2。不遷怒。不遷怒往往是一個人有修養的表現。可能是一個人惹了你生氣，但不要把氣撒在另一個人身上，否則，就會被別人看不起的。自己有不順心的事了，一定要讓自己冷靜下來，改變一下看問題的角度，轉移一下自己的不良情緒，然后，尋找解決問題的辦法。千萬不要像蒼蠅一樣到處傳播負面的情緒，讓別人去費心。一定要從積極的方面考慮，做出一個讓自己高興，也讓別人高興的事情。

第四篇：成功要素

成功與否

一個人成功與否，取決于五個因素：

1、學會控制情緒

2、健康的身體

3、良好的人際關系

4、時間管理

5、財務管理 如果你想成功，一定要學會管理好這五個因素，為什么把情緒放在第一位呢？把健康放在第二位呢？是因為如果你再強的身體，如果你情緒不好，就會影響到 你的身體。現在一個人要成功20%靠的是智商，80%靠的是情商，所以你要控制好你的情緒，情緒對人的影響是非常大的。人與人之間，不要為了一點點小事 情，就暴跳如雷，這樣是不好的。就像動作明星史泰龍說的：過去不等于現在，只是暫時停止成功。任何事情發生，必有目的，必有助于我！你要經常的對自己說，這只是我在風雨中磨練性格的一天。

所以在生活中，你要養成什么樣的心態呢？你要養成“三不”、“三多”(不批評、不抱怨、不指責；多鼓勵、多表揚、多贊美）。你就會成為一個受社會大眾歡迎的人。

如果你想讓你的伙伴更加的優秀，很簡單，永遠的激勵和贊美他們。即使他們的確有毛病，那應該怎么辦呢？這時是不是應該給他們建議？在生活中你會發現 有這樣一個現象：有人給別人建議的時候，別人能夠接受，但是有人給別人建議的時候，別人就會生氣。其實建議的方式是最重要的，就是“三明治”：贊美、建 議、再贊美！

想一想，你一天贊美了幾個人，有的人可能以為贊美就是吹捧，就是拍馬屁。贊美和吹捧是有區別的，贊美有四個特點：

1、是真誠的

2、是發自內心的

3、被大眾所接受的

4、無私的

如果你帶有很強的目的性去贊美，那就是拍馬屁。當你贊美別人時候，你要大聲的說出來，當你想批評別人的時候，一定要咬住你的舌頭！

第五篇：電子求職信的成功與否

求職信可以幫助你從其他應聘者中脫穎而出，它應該簡明地突出你的相關實力。一定要注明你所申請的具體職位，如果必要，還要留下聯系方法。通過電子郵件回復時，最好遵守招聘廣告的要求，但盡可能增加個性化。如果可以查到名字和地址，一些應聘者喜歡把個人資料打印出來寄給用人單位。

嘗試打電話和得到盡可能多的內部資料，這個方法有時并不奏效，因為許多人事部門不喜歡擅自提供姓名和另外的資料。最好記住，這些郵箱地址后面是活生生的人。由于兼容性的問題，最好把求職信和簡歷寫在郵件內，而不要做成附件，招聘者可能無法打開你的附件，如果打開了，也許不會再是你精心設計的式樣。瑪麗?納米克(MaryNemmich)和弗蘭德?喬特(FredJandt)認為”幾乎我們訪問過的所有簡歷網站和招聘者，都警告應聘者提交簡歷時，不要做成電子郵件的附件。”因為現在很多網站害怕那些隨著應聘信而來的病毒，有的網上招聘專家甚至建議某些公司把所有帶有附件的電子郵件全部刪除。所以，在求職信中，你應當突出的是你要申請的職位和你的資歷，這些是招聘者最為關心的問題了。

嚴謹一些是非常有必要的，你知道招聘經理們怎么評論那些通過E-mail發送有錯字的簡歷的人嗎?沒戲。找工作的規矩一點也不因為發送簡歷方式的更改而變得更為寬松了。正確地說，是比原來更嚴格了。

也有人問過，我想申請這個公司的兩個職位該怎么辦?這要取決于你發送簡歷的站的數據庫軟件的功能了，有一些軟件能自動過濾掉第二封信件，以免造成冗余;在另一種情況下，一些軟件可能會根據你的個人技能分類而把你的簡歷轉給合適的人。這都很難說。所以在這樣的簡歷上針對不同的職位進行修改實際上不算一個好主意。我們的建議是：在這種情況下，不妨針對申請職位的不同做兩份格式迥異的簡歷，分別申請不同的職位。各大公司的簡歷篩選機制都各不相同，這是一個很值得研究的問題。

很多在國際范圍找工作的人都有一種很強的失落感，他們往往制作一份比較通用的簡歷，然后給每個收簡歷的人發送一份，在這種情況下他們不可能充分了解每一個招聘者的情況，也不可能根據申請職位的不同而對簡歷進行修改，這些簡歷往往就是泥牛入海無消息了。這種求職戰略基本上是失敗的，對于國際化的求職者尤甚。除非你通過各種途徑或渠道確切地知道你具備招聘單位急需的某種特定的技術知識或專業技能，否則就不要這樣去求職。