第一篇：細胞骨架觀察實驗設計

細胞骨架觀察實驗設計

I、實驗內容

一、正常細胞

二、秋水仙素處理 三、VP16處理 四、低溫處理 II、實驗流程

一、細胞傳代

二、細胞爬片

1~2d

三、細胞處理

6h

四、細胞固定、免染、觀察

1d III、實驗過程

一、細胞傳代

1、實驗材料

VEC

2、實驗器材

超凈臺、CO2培養箱、普通冰箱、倒置顯微鏡、離心機、離心管、微量加液器、吸管、細胞培養瓶（皿）、鑷子、酒精燈、消毒酒精、廢液缸

3、試劑

胰酶、PBS、培養液（牛血清、雙抗）

二、細胞爬片

已處理蓋片

三、細胞處理

細胞爬片、秋水仙素、VP16、普通冰箱

四、細胞固定、免染、觀察

1、實驗材料

已處理的爬片

2、實驗器材

離心機、離心管、玻璃培養皿、載玻片、濾紙、封口膜、溫箱、熒光顯微鏡、微量加液器、鑷子

3、試劑

PBS、BSA封閉液、一抗、二抗、蒸餾水、DAPI

4、步驟

固定

爬片置于玻璃培養皿中，PBS（500uL）洗3次，每次2min 吸棄PBS，加-20℃預冷甲醇，固定5min 吸棄甲醇，PBS洗3次，每次2min 免染

吸棄PBS，加100uL 2﹪BSA封閉液，蓋上培養皿蓋，室溫固定15min 濾紙吸去片子上封閉液，加30uL（1:500）稀釋一抗，蓋上封口膜（勿大于蓋片），37℃孵育30min ,邊上滴一滴PBS PBS洗3次，每次5min 在邊緣吸棄PBS（濾紙），滴加30uL（1:200）稀釋二抗，避光，蓋封口膜，37℃,30min 揭去封口膜，PBS洗3次，每次5min 吸棄PBS，蒸餾水清涮，迅速，片子正面朝上，晾干

干凈載玻片上，滴加3uLDAPI，將爬片鑷子夾上，反蓋于防淬滅劑上 熒光鏡觀察

IV、注意事項

1、區分蓋片正反面

2、保持樣品濕潤

3、一抗二抗孵育后，封口膜輕輕沖起

4、二抗孵育后，避光操作，以免熒光淬滅

5、標本染色后立即觀察，不看時4℃保存

第二篇：細胞骨架的觀察

細胞生物學實驗

細胞骨架的觀察

姓名：鄧燕玲 學號：201011202912 專業：生命科學生物科學 實驗時間：20121030 指導老師：張偉 同組同學：張麗華

細胞生物學實驗

實驗目的

1.了解細胞骨架的組成、結構和功能。2.學習細胞骨架標記的原理和方法。3.學習用鬼筆環肽標記微絲的方法步驟。

4.觀察小鼠胚胎成纖維細胞和中國倉鼠卵巢細胞的細胞微絲骨架。5.討論細胞骨架在中學中教學的重點與難點。

實驗原理

1.細胞骨架一般是指真核細胞質內的蛋白質纖維網架系統。廣義大的細胞骨架包括細胞膜骨架、細胞核骨架和細胞質骨架。直至1963年，科學家用戊二醛在室溫下固定成功后，人們才廣泛地觀察到各類細胞骨架纖維的存在。細胞骨架包括微管、微絲和中間纖維。不同成分有不同的結構和功能。細胞骨架處于不斷地動態平衡中，并且有極性。2.微絲的標記方法可分為在固定細胞中標記和在活體中標記。本實驗采用的是固定細胞標記，主要運用帶熒光探針的抗體或鬼筆環肽標記，這需要對樣品進行化學固定和膜的通透。

3.熒光探針是一種標記物，其中包含的熒光物質在從外界吸收能量后變成激發態，在回到基態時以電磁波的形式釋放能量，從而產生熒光。熒光物質在受到長時間的照射后會淬滅。

4.鬼筆環肽（phalloidin）是一種劇毒生物堿，能結合F-actin，而不與G-actin結合，并且在結合后可以抑制微絲的解聚，破壞微絲聚合和解聚的動態平衡。鬼筆環肽對細胞有毒害作用，因此不利于活體細胞的研究。

5.熒光顯微鏡是用于觀察和分析樣品中產生的熒光物質的成分和定位的一種光學顯微鏡，熒光物質在受到激發光的激發下，會發出比激發光波長更長的光，從而在顯微鏡下觀察。

實驗器材

1.材料：小鼠胚胎成纖維細胞、CHO中國倉鼠卵巢細胞

2.試劑：PEM緩沖液（50 mM pipes,5 mM EGTA, 5 mM MgSO4, 0.225M 山梨醇），0.5 % Triton X-100（溶于PEM緩沖液），4%多聚甲醛（溶于PEM緩沖液），55nM Alex-phalloidin 3.器械：熒光顯微鏡 實驗步驟

1.將小培養皿中的培養液用移液槍吸掉，加入預熱的1mlPEM清洗，注意不要打在蓋玻片

細胞生物學實驗

上，洗三次。

2.加入1ml37°C預熱的0.5 % Triton X-100，放置10min。3.加入預熱的1mlPEM清洗，洗三次。4.加入預熱的4%多聚甲醛1ml，放置15min。5.加入預熱的1mlPEM清洗，洗三次。

6.剪下一段與載玻片寬度一樣的封口膜，將封口膜包在在玻片上，在玻片上的封口膜上加10?L的 55nM Alex –phalloidin，將載玻片有細胞的一面朝下蓋片，在暗盒中靜置25min。7.用37°預熱的PEM洗三次，將載玻片有細胞的一面朝上轉移到一個新的載玻片中，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

實驗結果 思考題

1.PEM緩沖液的作用是什么？

答：促進微管中肌動蛋白的聚合，抑制其解聚，使微管形態固定，便于觀察。2.1％Triton X-100處理細胞的作用是什么？

答：能溶解膜上的脂類和蛋白質，使細胞膜穿孔，便于標記物質進入細胞。3.如何在中學教學中推進細胞骨架的教學？

第三篇：植物細胞骨架的觀察

實驗六 植物細胞骨架的光學顯微鏡觀察

一、實驗目的：掌握植物細胞骨架處理及染色方法。

二、實驗原理：用適當濃度的TritonX-100處理時，可將細胞內蛋白質破壞，但細胞骨架系統的蛋白質卻被保存，后者用考馬斯亮蘭R250染色，可在光學顯微鏡下觀察到細胞骨架的網狀結構。

三、實驗試劑：

1、M-緩沖液；

2、pH6.8磷酸緩沖液； 3、1% TritonX-100，用M-緩沖液配制； 4、0.2%考馬斯亮蘭R250； 5、3%戊二醛，用pH6.8磷酸緩沖液；

四、實驗步驟：

1、撕取洋蔥鱗莖內表皮細胞（約1cm2大小若干片）置于裝有pH6.8磷酸緩沖液的50ml燒杯中，使其下沉；

2、吸去pH6.8磷酸緩沖液，用1% TritonX-100處理20min；

3、吸去1% TritonX-100，用M-緩沖液洗三次，每次8min；

4、3%戊二醛固定30min；

5、pH6.8磷酸緩沖液洗三次，每次8min；

6、0.2%考馬斯亮蘭R250染色20min；

7、用蒸餾水洗1-2次，將內表皮細胞平鋪子載玻片上，加蓋玻片，于顯微鏡下觀察。

五、實驗作業：

1、繪制你所觀察到的植物細胞骨架圖象；

2、戊二醛、考馬斯亮蘭R250、TritonX-100是什么？在本實驗中各起什么作用？

第四篇：實驗二、植物細胞骨架的觀察

實驗

二、植物細胞骨架的觀察

一、實驗目的

觀察植物細胞內網狀的骨架結構。

二、實驗原理

在真核細胞的細胞質中，存在著由蛋白質纖維構成的網狀骨架系統。Triton X-100是非離子去垢劑，用適當濃度的Triton X-100處理細胞，可將細胞的膜成分抽提掉，由于失去膜的保護和維系作用，細胞內其他可溶性成分也隨之流失，這樣一來水不溶性的細胞骨架系統蛋白質卻被保留下來，而這被保留下來的蛋白質用考馬斯亮藍R250染色，便可在光學顯微鏡下觀察它們——細胞骨架的網狀結構。為了更好地觀察微絲束的結構，采用了戊二醛對細胞進行固定。戊二醛是一種雙交聯劑，滲透快，交聯能力強，對蛋白質的固定效果好，且不破壞細胞骨架的結構。M-緩沖液洗滌細胞,可以提高細胞骨架的穩定性。M－緩沖液和磷酸緩沖液作用都是維持細胞的滲透壓

三、實驗用品

顯微鏡、50ml燒杯、蓋玻片、載玻片、濾紙、M-緩沖液、磷酸緩沖液（PBS）、1% Triton X-100、0.2%考馬斯亮藍R250、3%戊二醛、洋蔥鱗莖。

四、實驗方法與步驟

1、撕取洋蔥鱗莖內表皮若干片，大小約1平方厘米，置于裝有PH6.8的磷酸緩沖液（PBS）的50ml燒杯中，使其下沉。

2、用濾紙吸去磷酸緩沖液（PBS），用1% Triton X-100處理20-30分鐘。

3、吸去Triton X-100，用M-緩沖液洗3次，每次10分鐘。

4、用3%戊二醛固定10-15分鐘。

5、用磷酸緩沖液（PBS）洗3次，用濾紙吸干。

6、用0.2%考馬斯亮藍R250染色20-30分鐘。

7、用蒸餾水洗1-2次，將洋蔥細胞置于載玻片上，加上蓋片。

8、在光學顯微鏡下鏡檢。

五、作業

寫出你的實驗結果并繪成圖。

附：藥品配置

1、M—緩沖液（10×原液）

咪唑（50m mol）34.04g MgCl.6H2O 1.02g EGTA（1m mol）3.80g EDTA（0.1m mol）0.29g 巰基乙醇 0.78（0.7ml）蒸餾水 加至1000ml 用時稀釋，取50ml（10×原液）加450ml蒸餾水。

2、磷酸緩沖液（PBS）

配方①：

NaCl 8.0g Na2HPO4.2H2O 1.42g KCl 0.20g KH2PO4 0.20g MgCl2.6H2O 0.10g CaCl2（無水）0.10g 0.5%酚紅 4ml 雙蒸水 加至100ml 用 5%NaHCO3調PH值至6.8。也可先配成10被濃縮液，使用時再稀釋。配方②：

6m mol/L PH6.5磷酸鹽緩沖液

A液：NaH2PO4.2H2O 938mg/1000ml B液：Na2HPO4.12H2O 2150mg/1000ml 取A液68.5ml，B液31.5ml，加蒸餾水100ml即為工作液。加入0.5%酚紅4ml。3、1% Triton X-100 用M-緩沖液配制。

取1mlTriton X-100液加M-緩沖液至100ml。4、0.2%考馬斯亮藍R250配制

考馬斯亮藍R250 0.2g 甲醇 46.5ml 冰醋酸 7ml 蒸餾水 46.5ml 5、3%戊二醛的配制

用磷酸緩沖液（PBS）配制。取3ml戊二醛加PH7.0、（1/15）磷酸鹽緩沖液至100ml。

第五篇：細胞骨架組分的熒光染色觀察

細胞生物學實驗報告

細胞骨架組分的熒光染色觀察

姓名：

學號：

班級：

專業：

同組成員：

一、實驗原理

鬼筆環肽(phalloidin)是從一種毒性菇類中分離的劇毒生物堿，它同細胞松弛素的作用相反, 只與聚合的微絲結合, 而不與肌動蛋白單體分子結合。它同聚合的微絲結合后, 抑制了微絲的解體, 因而破壞了微絲的聚合和解聚的動態平衡。

由于鬼筆環肽非常特異地結合并穩定聚合態肌動蛋白,因而對肌動蛋白的動態平衡造成嚴重影響.此外, 較高濃度的鬼筆環肽對細胞有毒害作用。因此,用鬼筆環肽標記微絲并不是用于研究活體細胞的理想方法。

二、實驗目的

1．掌握細胞骨架的顯示方法 2.掌握熒光顯微鏡的使用方法

3.了解熒光顯微鏡下細胞骨架的基本形態結構

三、實驗器材 1.材料：

CHO（中國倉鼠卵巢細胞）、雞胚成纖維細胞 2.試劑：

PEM：50mM pipes(pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 0.5% Triton X-100溶于PEM緩沖液。4%多聚甲醛溶于PEM緩沖液。3.儀 器

超凈工作臺、CO2培養箱、熒光顯微鏡 4.其它用品：

蓋玻片（無菌）、35mm細胞培養皿、試管、移液管，滴管，酒精燈、75％酒精棉球、廢液缸。

四、方法與步驟

由于上節課雞胚成纖維細胞被污染，本次實驗所用細胞為CHO細胞（1）準備好實驗器材。（本次實驗無需在超凈臺中進行）

（2）將上節課進行細胞爬片的培養皿從培養箱中取出，取出蓋片，于小平皿中。（3）37℃預溫 PEM洗3次(每次 1mL)（4）Triton X-100處理約10min(1mL)（5）37℃預溫 PEM洗3次(每次 1mL)（6）37℃預溫 4%多聚甲醛固定細胞15min(1mL)（7）37℃預溫 PEM洗3次

（8）55nM Alex-phalloidin 10μL濕盒中室溫染色30min。（避光）（9）在parafilm 膜上加PEM，待蓋玻片被沖起后，再輕輕揭下蓋玻片。（10）37℃預溫 PEM洗數3次，滴加10μL Ho.33342復染色。（11）熒光顯微鏡下觀察并拍照。

五、注意事項

1.蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時動作要輕。2.注意不要弄碎蓋片，分清細胞所在面； 3.各步洗細胞要輕，勿使細胞脫落； 4.熒光觀察注意避光操作，防止熒光淬滅。5.節約試劑。

六、實驗結果

本次實驗我們對CHO細胞爬片結果進行了熒光染色，在熒光顯鏡下用不同波長的激發光對細胞骨架微絲結構及細胞核進行了觀察、拍攝照片并將結果疊加。得到以下的實驗現象：

圖1.CHO細胞微絲熒光染色圖

圖2.CHO細胞核熒光染色圖

圖3.CHO細胞微絲及細胞核熒光染色合成圖

從拍攝的照片可以較為清晰的看到CHO細胞骨架的微絲被染成了綠色，細胞核被染成藍色；微絲的形狀為長條的紡錘狀細絲，遍布整個細胞，在細胞中起到了類似骨架般的支撐作用；細胞核為橢圓形，之后再將兩圖合成，可觀察到細胞核被遍布的微絲結構包圍。實驗較為成功。在實驗時要注意熒光染料均存在淬滅問題，所以要盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。每步洗滌要充分，并吸去水分(但也不要干透)，以免稀釋下一步的抗體或試劑，這樣才能得到清晰的熒光圖像。

【參考文獻】

[1] 桑建利, 譚信.細胞生物學實驗指導.北京:科學出版社, 2010.[2] 北京師范大學生命科學學院.細胞生物學實驗.北京:北京師范大學生命科學學院,2015.9.