第一篇：細胞實驗細胞骨架組分的熒光染色觀察

細胞生物學實驗

細胞骨架組分的熒光染色觀察

一、實驗目的

1、掌握細胞骨架的顯示方法

2、掌握熒光顯微鏡的使用方法

3、了解熒光顯微鏡下細胞骨架的基本形態結構

4、了解熒光探針Hoechst 33342（Ho.33324）與細胞成分的結合特性和光譜特性

二、實驗原理

1、微絲股價是一種高度動態的三維網狀結構，與細胞的多種生理活動如細胞運動、胞質分離、細胞器的定位、細胞內物質的運輸、吞噬作用、細胞極性生長等密切相關。

2、鬼筆環肽(phalloidin)是從一種毒性菇類中分離的劇毒生物堿，它同細胞松弛素的作用相反, 只與聚合的微絲結合, 而不與肌動蛋白單體分子結合。它同聚合的微絲結合后, 抑制了微絲的解體, 因而破壞了微絲的聚合和解聚的動態平衡。

3、由于鬼筆環肽非常特異地結合并穩定聚合態肌動蛋白, 因而對肌動蛋白的動態平衡造成嚴重影響.此外, 較高濃度的鬼筆環肽對細胞有毒害作用.因此, 用鬼筆環肽標記微絲并不是用于研究活體細胞的理想方法。

三、實驗材料

1、材料：CHO（中國倉鼠卵巢細胞）

2、試劑：

（1）PEM：50mM pipes(pH6.9), 5mM

EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇

（2）0.5% Triton X-100溶于PEM緩沖液中。

（3）4%多聚甲醛溶于PEM緩沖液中。

四、實驗步驟

1、取出上次實驗爬片于小蓋玻片上的CHO細胞；

2、取出培養有CHO細胞的蓋片，于小平皿中37℃預溫 PEM洗3次(每次 1mL)； 3、37℃預溫 4%多聚甲醛固定細胞15min(1mL)4、37℃預溫 PEM洗3次

5、加入0.5%Triton X-100處理約10min(1mL)；

6、取一潔凈的載玻片，按照其的大小在其上放置一條封口膜，在封口膜上滴加20μL 60nM Alex-phalloidin 10L濕盒中室溫染色30min；

7、在parafilm 膜上加PEM，待蓋玻片被沖起后，再輕輕揭下蓋玻片； 8、37℃預溫 PEM洗數3次；

9、滴加10L Ho.33342復染色；

10、熒光鏡下觀察。【注意事項】

1、注意不要弄碎蓋片，分清細胞所在面；

2、各步洗細胞要輕，勿使細胞脫落；

3、熒光觀察注意避光操作

4、節約試劑。

五、實驗結果

圖一：CHO細胞微絲熒光染色圖

圖二：CHO細胞細胞核熒光染色圖

圖三：CHO細胞微絲與細胞核熒光染色疊加圖

六、實驗結果分析

染色后微絲呈綠色，細胞核為藍色，染色較為清晰。但細胞數量較多，導致有些染色結果重疊。

七、思考題

1、PEM緩沖液的作用是什么？

細胞內的微絲在含有ATP和Ca2+及低濃度的Na+，K+等陽離子溶液中，趨于解聚成G-actin；而在Mg2+和高濃度的Na+，K+等陽離子溶液中，G-actin則裝配為F-actin。PEM緩沖液提供高Mg環境，讓單體肌動蛋白（G-actin）聚合成絲狀肌動蛋白（F-actin）。同時，EGTA能螯合Ca2+，使G-actin裝配成F-actin，微絲骨架保持聚合狀態且較為舒張。用PEM緩沖液處理細胞，能夠模擬體內環境并提高細胞骨架的穩定性。2、0.5%Triton X-100處理細胞的作用是什么？

0.5%Triton X-100處理細胞的作用是溶解細胞膜上的脂類和蛋白質，增加細胞膜的通透性，使熒光染料能夠更容易地透過細胞膜與F-actin特異性結合。

3、鬼筆環肽用于細胞骨架研究的優缺點是什么？

（1）鬼筆環肽用于細胞骨架研究的優點：鬼筆環肽的分子量小，很容易通過細胞，不需要對細胞進行冷丙酮和TRITON X-100處理。鬼筆環肽可以與聚合的微絲結合，通過讓這種毒素吸附于熒光染料上面，可以研究細胞的內部工作機制，窺視細胞如何分裂。（2）鬼筆環肽用于細胞骨架研究的缺點：對細胞有毒性，價格昂貴。

參考文獻：細胞生物學實驗(桑建利, 譚信)

第二篇：細胞骨架組分的熒光染色觀察

細胞生物學實驗報告

細胞骨架組分的熒光染色觀察

姓名：

學號：

班級：

專業：

同組成員：

一、實驗原理

鬼筆環肽(phalloidin)是從一種毒性菇類中分離的劇毒生物堿，它同細胞松弛素的作用相反, 只與聚合的微絲結合, 而不與肌動蛋白單體分子結合。它同聚合的微絲結合后, 抑制了微絲的解體, 因而破壞了微絲的聚合和解聚的動態平衡。

由于鬼筆環肽非常特異地結合并穩定聚合態肌動蛋白,因而對肌動蛋白的動態平衡造成嚴重影響.此外, 較高濃度的鬼筆環肽對細胞有毒害作用。因此,用鬼筆環肽標記微絲并不是用于研究活體細胞的理想方法。

二、實驗目的

1．掌握細胞骨架的顯示方法 2.掌握熒光顯微鏡的使用方法

3.了解熒光顯微鏡下細胞骨架的基本形態結構

三、實驗器材 1.材料：

CHO（中國倉鼠卵巢細胞）、雞胚成纖維細胞 2.試劑：

PEM：50mM pipes(pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 0.5% Triton X-100溶于PEM緩沖液。4%多聚甲醛溶于PEM緩沖液。3.儀 器

超凈工作臺、CO2培養箱、熒光顯微鏡 4.其它用品：

蓋玻片（無菌）、35mm細胞培養皿、試管、移液管，滴管，酒精燈、75％酒精棉球、廢液缸。

四、方法與步驟

由于上節課雞胚成纖維細胞被污染，本次實驗所用細胞為CHO細胞（1）準備好實驗器材。（本次實驗無需在超凈臺中進行）

（2）將上節課進行細胞爬片的培養皿從培養箱中取出，取出蓋片，于小平皿中。（3）37℃預溫 PEM洗3次(每次 1mL)（4）Triton X-100處理約10min(1mL)（5）37℃預溫 PEM洗3次(每次 1mL)（6）37℃預溫 4%多聚甲醛固定細胞15min(1mL)（7）37℃預溫 PEM洗3次

（8）55nM Alex-phalloidin 10μL濕盒中室溫染色30min。（避光）（9）在parafilm 膜上加PEM，待蓋玻片被沖起后，再輕輕揭下蓋玻片。（10）37℃預溫 PEM洗數3次，滴加10μL Ho.33342復染色。（11）熒光顯微鏡下觀察并拍照。

五、注意事項

1.蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時動作要輕。2.注意不要弄碎蓋片，分清細胞所在面； 3.各步洗細胞要輕，勿使細胞脫落； 4.熒光觀察注意避光操作，防止熒光淬滅。5.節約試劑。

六、實驗結果

本次實驗我們對CHO細胞爬片結果進行了熒光染色，在熒光顯鏡下用不同波長的激發光對細胞骨架微絲結構及細胞核進行了觀察、拍攝照片并將結果疊加。得到以下的實驗現象：

圖1.CHO細胞微絲熒光染色圖

圖2.CHO細胞核熒光染色圖

圖3.CHO細胞微絲及細胞核熒光染色合成圖

從拍攝的照片可以較為清晰的看到CHO細胞骨架的微絲被染成了綠色，細胞核被染成藍色；微絲的形狀為長條的紡錘狀細絲，遍布整個細胞，在細胞中起到了類似骨架般的支撐作用；細胞核為橢圓形，之后再將兩圖合成，可觀察到細胞核被遍布的微絲結構包圍。實驗較為成功。在實驗時要注意熒光染料均存在淬滅問題，所以要盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。每步洗滌要充分，并吸去水分(但也不要干透)，以免稀釋下一步的抗體或試劑，這樣才能得到清晰的熒光圖像。

【參考文獻】

[1] 桑建利, 譚信.細胞生物學實驗指導.北京:科學出版社, 2010.[2] 北京師范大學生命科學學院.細胞生物學實驗.北京:北京師范大學生命科學學院,2015.9.

第三篇：2014 細胞生物學實驗課內容(細胞形態觀察、細胞器活體染色、細胞骨架觀察)

實驗三 細胞形態的觀察

【實驗目的】

1.認識光學顯微鏡下細胞的形態結構； 2.掌握臨時制片和顯微繪圖的方法。

【材料、器材和試劑】

材料：人體口腔黏膜上皮細胞、洋蔥鱗莖；

器材：顯微鏡、剪刀、鑷子、載玻片、蓋玻片、牙簽、濾紙； 試劑：1%碘液。

【方法和步驟】

1.口腔黏膜上皮細胞的制片與觀察

口腔黏膜細胞涂片標本的制備：吸取一滴碘液滴在一張潔凈的載玻片中央，用一根事先滅菌的牙簽伸入自己的口腔內壁輕輕刮取黏膜上皮細胞，然后，將其放入載玻片上的染液中并來回攪動使細胞散開，染色1 min左右后小心加蓋玻片（盡量避免產生氣泡），用濾紙吸去蓋玻片周圍的液體。

觀察：將自制的口腔黏膜上皮細胞標本裝片置于顯微鏡下觀察，先用低倍鏡觀察較分散的、輪廓清晰的黏膜上皮細胞。由于該細胞體積較小、著色較淡，觀察時應稍降低視野亮度以便于較快找到目標（在低倍鏡下，用碘液染色的細胞呈黃色，成群或分散分布，形態大小多呈扁平橢圓形）。選擇輪廓清晰的細胞移至視野中央，轉換至高倍鏡下觀察。在高倍鏡下，可見口腔黏膜上皮細胞外圍有一層薄薄的細胞膜，扁圓形的細胞核呈深黃色，細胞質呈淺黃色或淺藍色，核中央致密的結構為核仁。

2.洋蔥鱗莖內表皮細胞的制片與觀察

表皮細胞裝片標本的制備：取一干凈載玻片，在其中央滴一滴碘液，將洋蔥鱗莖用小刀分為幾塊，取一塊肉質鱗葉，用剪刀在內表皮劃“田”字形小方格，每一小方格邊長3-4mm，然后用鑷子輕輕撕下一小方格的膜質表皮，置于載玻片的碘液滴中鋪平，取一干凈的蓋玻片，將其一側先接觸標本旁的碘液，再緩緩地蓋上蓋玻片，盡量避免產生氣泡，用濾紙吸去蓋玻片周圍的液體。

觀察：將制備好的裝片標本放到顯微鏡下，先用低倍鏡觀察，可見許多長柱狀、排列整齊、彼此相連的細胞，選擇其中一個典型的細胞移至視野中央，再轉換至高倍鏡下仔細觀察細胞壁、細胞核、細胞質和液泡等結構。

【實驗結果】

繪圖并進行適當標注：人口腔黏膜上皮細胞和洋蔥鱗莖內表皮細胞。【討論】

簡述觀察細胞形態時，制作臨時裝片和顯微鏡鏡檢時的注意事項。

實驗四 線粒體和液泡系的活體染色

【實驗目的】

1.掌握一些細胞器的超活性染色技術和原理。

2.觀察動物、植物細胞內線粒體和液泡系的形態、數量和分布。

【材料、器材和試劑】

材料：人體口腔黏膜上皮細胞、洋蔥；

器材：顯微鏡、牙簽、鑷子、剪刀、載玻片、蓋玻片；

試劑：Ringer溶液；1/5000詹納斯綠B溶液；1/3000中性紅溶液。

【方法和步驟】

1.線粒體的超活染色與觀察

（1）人體口腔黏膜上皮細胞線粒體的超活染色和觀察

① 取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴2滴1/5000詹納斯綠B染液； ② 用一根預先滅菌的牙簽伸入自己的口腔內壁輕輕刮取黏膜上皮細胞，將刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10-15min（注意不可使染液干燥，必要時可再加一滴染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置于顯微鏡下觀察；

③ 在低倍鏡下，選擇平展的口腔黏膜上皮細胞，轉換高倍鏡進行觀察。可見扁平狀上皮細胞的核周圍胞質中，分布著一些被染成藍綠色的顆粒狀或棍棒狀的線粒體。（2）洋蔥鱗莖內表皮細胞線粒體的超活染色和觀察

① 用吸管吸取1/5000詹納斯綠B染液，滴一滴在干凈的載玻片上，然后用鑷子撕取洋蔥鱗莖內表皮一小塊，置于染液中，染色10-15min；

② 吸去染液，加一滴Ringer液，注意使內表皮展平，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察。在高倍鏡下，可見表皮細胞中央被一大液泡所占據，細胞核被擠至旁邊，線粒體染成藍綠色，呈顆粒狀或線條狀。

2.液泡系的超活染色和觀察

① 洋蔥鱗莖內表皮一小塊，置于1/3000中性紅溶液中，染色5-10min；

② 吸去染液，加一滴Ringer液，注意使內表皮展平，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察，可見被染成磚紅色的中央大液泡。

【實驗結果】

1.根據實驗觀察，繪制洋蔥鱗莖內表皮細胞和人體口腔黏膜上皮細胞線粒體分布圖。2.根據實驗觀察，繪制洋蔥鱗莖表皮細胞指示液泡系的形態和分布。

【討論】

1.簡述線粒體詹納斯綠B活體染色和液泡系中性紅活體染色的原理； 2.分析線粒體和液泡系活體染色時需要注意的事項。3.細胞內線粒體的形態和分布有何特點？

實驗五 植物細胞骨架的光學顯微鏡觀察

【實驗目的】

了解細胞骨架的結構特征及其樣品制備技術。

【材料、器材和試劑】

材料：洋蔥鱗莖；

器材：普通光學顯微鏡、5Oml燒杯、玻璃滴管、容量瓶、試劑瓶、載玻片、蓋玻片、鑷子、小剪刀、吸水紙、擦鏡紙；

試劑：M 緩沖液；6mmol/L（pH 6.8）磷酸緩沖液；1% Triton X-100；0.2%考馬斯亮藍R250；3%戊二醛。

【方法和步驟】

1.撕取洋蔥鱗莖內表皮（約lcm大小若干片）置于裝有pH 6.8磷酸緩沖液的50ml燒杯中，使其下沉；

2.吸去磷酸緩沖液，用l% Triton X-100處理20-30min； 3.吸去Triton X-100，用M緩沖液洗3次，每次10min； 4.3%戊二醛固定O.5-lh；

5.pH 6.8磷酸緩沖液洗3次，每次10min； 6.0.2%考馬斯亮藍R250染色20-30min；

7.用蒸餾水洗1或2次，細胞置于載玻片上，加蓋玻片，于普通光學顯微鏡下觀察。

2【實驗結果】

繪制洋蔥鱗莖表皮細胞微絲束的分布圖。

【討論】

1.闡述采用考馬斯亮藍R250染色法顯示微絲的原理； 2.分析和論述在光學顯微鏡下觀察到的細胞骨架的形態特征。

第四篇：實驗二、植物細胞骨架的觀察

實驗

二、植物細胞骨架的觀察

一、實驗目的

觀察植物細胞內網狀的骨架結構。

二、實驗原理

在真核細胞的細胞質中，存在著由蛋白質纖維構成的網狀骨架系統。Triton X-100是非離子去垢劑，用適當濃度的Triton X-100處理細胞，可將細胞的膜成分抽提掉，由于失去膜的保護和維系作用，細胞內其他可溶性成分也隨之流失，這樣一來水不溶性的細胞骨架系統蛋白質卻被保留下來，而這被保留下來的蛋白質用考馬斯亮藍R250染色，便可在光學顯微鏡下觀察它們——細胞骨架的網狀結構。為了更好地觀察微絲束的結構，采用了戊二醛對細胞進行固定。戊二醛是一種雙交聯劑，滲透快，交聯能力強，對蛋白質的固定效果好，且不破壞細胞骨架的結構。M-緩沖液洗滌細胞,可以提高細胞骨架的穩定性。M－緩沖液和磷酸緩沖液作用都是維持細胞的滲透壓

三、實驗用品

顯微鏡、50ml燒杯、蓋玻片、載玻片、濾紙、M-緩沖液、磷酸緩沖液（PBS）、1% Triton X-100、0.2%考馬斯亮藍R250、3%戊二醛、洋蔥鱗莖。

四、實驗方法與步驟

1、撕取洋蔥鱗莖內表皮若干片，大小約1平方厘米，置于裝有PH6.8的磷酸緩沖液（PBS）的50ml燒杯中，使其下沉。

2、用濾紙吸去磷酸緩沖液（PBS），用1% Triton X-100處理20-30分鐘。

3、吸去Triton X-100，用M-緩沖液洗3次，每次10分鐘。

4、用3%戊二醛固定10-15分鐘。

5、用磷酸緩沖液（PBS）洗3次，用濾紙吸干。

6、用0.2%考馬斯亮藍R250染色20-30分鐘。

7、用蒸餾水洗1-2次，將洋蔥細胞置于載玻片上，加上蓋片。

8、在光學顯微鏡下鏡檢。

五、作業

寫出你的實驗結果并繪成圖。

附：藥品配置

1、M—緩沖液（10×原液）

咪唑（50m mol）34.04g MgCl.6H2O 1.02g EGTA（1m mol）3.80g EDTA（0.1m mol）0.29g 巰基乙醇 0.78（0.7ml）蒸餾水 加至1000ml 用時稀釋，取50ml（10×原液）加450ml蒸餾水。

2、磷酸緩沖液（PBS）

配方①：

NaCl 8.0g Na2HPO4.2H2O 1.42g KCl 0.20g KH2PO4 0.20g MgCl2.6H2O 0.10g CaCl2（無水）0.10g 0.5%酚紅 4ml 雙蒸水 加至100ml 用 5%NaHCO3調PH值至6.8。也可先配成10被濃縮液，使用時再稀釋。配方②：

6m mol/L PH6.5磷酸鹽緩沖液

A液：NaH2PO4.2H2O 938mg/1000ml B液：Na2HPO4.12H2O 2150mg/1000ml 取A液68.5ml，B液31.5ml，加蒸餾水100ml即為工作液。加入0.5%酚紅4ml。3、1% Triton X-100 用M-緩沖液配制。

取1mlTriton X-100液加M-緩沖液至100ml。4、0.2%考馬斯亮藍R250配制

考馬斯亮藍R250 0.2g 甲醇 46.5ml 冰醋酸 7ml 蒸餾水 46.5ml 5、3%戊二醛的配制

用磷酸緩沖液（PBS）配制。取3ml戊二醛加PH7.0、（1/15）磷酸鹽緩沖液至100ml。

第五篇：洋蔥鱗片葉表皮細胞的細胞骨架觀察實驗報告

洋蔥鱗片葉表皮細胞的細胞骨架觀察實驗報告

吳若自然科學大類 16307110316 單周四 119 2016/11/17

一、實驗目的: 1.掌握用光學顯微鏡觀察植物細胞骨架的原理及方法。2.認識細胞骨架的形態，聯系細胞骨架的功能。

二、實驗原理：

細胞骨架是指真核細胞中的蛋白纖維網架體系。廣義的細胞骨架包括細胞核骨架、細胞質骨架、細胞膜骨架和細胞外基質。根據蛋白質纖維的直徑、組成成分和組裝結構的不同可分為微絲、微管和中間纖維。細胞骨架對于維持細胞的形態結構及細胞運動、物質運輸、能量轉換、信號傳導和細胞分裂等有重要的作用。本試驗采用去垢劑TritonX-100 的緩沖液處理植物材料時，可將細胞的膜結構和大部分蛋白質抽提掉，但細胞骨架系統的蛋白卻被保存下來，后者用考馬斯亮藍R250 染色，在光學顯微鏡下可見一種網狀結構。

三、操作步驟：

1.取洋蔥內皮表層膜1cm2(可多取兩片)左右置于含2mlPBS液的小皿中濕潤5min后，吸去PBS 2.向小皿中加入1.5mlTritonX-100(1%)，浸沒20min后，吸走TritonX-100

3.向小皿中加入2mlMbuffer浸沒置于搖床上5min，重復兩次后，吸走Mbuffer 4.向小皿中加入105ml戊二醛（3%），浸沒30min后，吸走戊二醛 5.向小皿中加入2mlPBS，浸沒置于搖床上5min，重復兩次

6.取出表皮平鋪于載玻片上，滴加100微升，靜置100min后吸取染料 7.向表面滴加蒸餾水洗滌后用紙巾洗去液體，重復兩次

8.蓋上蓋玻片，擦去殘余液體，用光學顯微鏡觀察并拍照記錄

四、實驗結果：

如圖所示，洋蔥內表皮細胞輪廓清晰可見，細胞壁及其分界明顯可見。可觀察到線性纖維交織而成的網狀結構，同一細胞內各處骨架密集度不均勻，細胞核區域纖維較密集，藍色較重。調節顯微鏡焦距可觀察到細胞不同橫切面的網絡結構的變化，表明細胞骨架以三維立體結構的形式分布在整個細胞內。

五、思考題：

1.簡述細胞質骨架的基本類型及結構特征

答：微管：中空的圓筒狀結構，直徑為18nm～25nm，構成微管的主要成分是微管蛋白。這種蛋白有兩個亞基，即α，β亞基它們成螺旋形排列。進化高度保守。微絲：由肌動蛋白組成的直徑約為7nm的骨架纖維，單體形式的球形肌動蛋白聚合形成纖維形肌動蛋白，在微絲結合蛋白的輔助作用下形成微絲高級結構，行使功能。

中間纖維：中空的骨狀結構，直徑介于微管微絲之間，具有明顯的組織細胞特異性，基本結構為一個中央α螺旋桿狀區輔以兩側大小和化學組成不同的端區。2.本實驗觀察到的藍色纖維主要是哪種細胞骨架？

答：應為微絲和中間纖維。3.考馬斯亮藍染色方法的優缺點。

答：優點：反應相對迅速，其結合物在室溫下1h內保持穩定，試劑配置簡單，操作簡便。

缺點：用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，仍有一些物質干擾此法的測定。

六、實驗討論：

1.觀察和分析細胞骨架的意義？

答：細胞骨架是細胞結構的重要組成部分，也是細胞行為與功能的重要調節系統，觀察和分析細胞骨架的性質與變化將幫助我們更好地認識和研究細胞性質、功能與機制。

2.考馬斯亮藍是一個理想的細胞骨架染料嗎？本實驗的優點和缺點是什么？

答：不是，特異性熒光染料可能更好。本實驗優點是反應相對迅速，其結合物在室溫下1h內保持穩定，試劑配置簡單，操作簡便。缺點是無法直觀分辨微管，微絲和中間纖維等。