第一篇：考馬斯亮藍R250染色法觀察細胞骨架

考馬斯亮藍R250染色法觀察細胞骨架

高熹 1120152430（李安一）

（北京理工大學生命學院16121501班）

摘要：狹義的細胞骨架概念是指真核細胞中的蛋白纖維網架體系微管、微絲及中間纖維組成的體系?？捡R斯亮藍R250是通過范德瓦爾鍵與蛋白質結合的一種物質，用于微量蛋白質染色。該實驗通過植物和動物細胞的細胞骨架染色，觀察細胞骨架，使我們掌握了動植物細胞內微絲的染色方法。關鍵詞：細胞骨架；考馬斯亮藍；微絲；染色；實驗 引言

由微管、微絲和中間絲所組成的蛋白纖維網架結構體系稱為“細胞骨架系統”，與細胞內的遺傳系統、生物膜系統、并稱“細胞內的三大系統”。是真核細胞借以維持其基本形態的重要結構，被形象地稱為細胞骨架，它通常也被認為是廣義上細胞器的一種。廣義的細胞骨架概念是細胞核骨架、細胞質骨架、細胞膜骨架和胞外基質所形成的網絡體系。核骨架、核纖層與中間纖維在結構上相互連接，貫穿于細胞核和細胞質的網架體系。細胞骨架是指真核細胞中的蛋白纖維網絡結構。發現較晚，主要是因為一般電鏡制樣采用低溫（0-4℃）固定，而細胞骨架會在低溫下解聚。直到20世紀60年代后，采用戊二醛常溫固定，才逐漸認識到細胞骨架的客觀存在。真核細胞借以維持其基本形態的重要結構，被形象地稱為細胞骨架，它通常也被認為是廣義上細胞器的一種。細胞骨架不僅在維持細胞形態，承受外力、保持細胞內部結構的有序性方面起重要作用，而且還參與許多重要的生命活動，如：在細胞分裂中細胞骨架牽引染色體分離，在細胞物質運輸中，各類小泡和細胞器可沿著細胞骨架定向轉運；在肌肉細胞中，細胞骨架和它的結合蛋白組成動力系統；在白細胞(白血球)的遷移、精子的游動、神經細胞軸突和樹突的伸展等方面都與細胞骨架有關。另外，在植物細胞中細胞骨架指導細胞壁的合成。

微絲普遍存在于所有真核細胞中，是一個實心狀的纖維，直徑為4nm-7nm一般細胞中含量約占細胞內總蛋白質的1%-2%，但在活動較強的細胞中可占20%-30%。在一般細胞主要分布于細胞的表面，直接影響細胞的形狀。微絲具有多種功能，在不同細胞的表現不同，在肌細胞組成粗肌絲、細肌絲，可以收縮（收縮蛋白），在非肌細胞中主要起支撐作用、非肌性運動和信息傳導作用。微絲主要由肌動蛋白構成，和肌球蛋白一起作用，使細胞運動。它們參與細胞的變形蟲運動、植物細胞的細胞質流動與肌肉細胞的收縮。微絲是雙股肌動蛋白絲以螺旋的形式組成的纖維，直徑為7納米，螺距為36納米，兩股肌動蛋白絲是同方向的。肌動蛋白纖維也是一種極性分子，具有兩個不同的末端，一個是正端，另一個是負端。微絲與它的結合蛋白以及肌球蛋白三者構成化學機械系統，利用化學能產生機械運動。由微絲形成的微絲束稱為應力纖維，常橫貫于細胞長軸。脊椎動物肌動蛋白分為α、β和γ三種類型，α型分布于心肌和橫紋肌細胞中，α及γ型分布于平滑肌細胞中，β及γ型分布于非肌細胞中。聚合的及非聚合態的肌動蛋白能與其多種結合蛋白相互作用，這些結合蛋白對肌動蛋白的聚合及對微絲的穩定、長度及分布具有調節作用?？捡R斯亮藍R-250是通過范德瓦爾鍵與蛋白質結合，尤其適用于微量蛋白質染色。它與不同蛋白質結合呈現出基本相同的顏色，并且在比較寬的范圍內（15—20g），掃描峰的面積與蛋白量呈線性關系。一般當細胞充分鋪展時，經考馬斯亮藍R250染色，可看到沿細胞長軸伸展的粗大纖維束，即應力纖維。應力纖維上還周期性地分布著微絲結合蛋白，包括-輔肌動蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、類肌鈣蛋白等。應力纖維的端部連接著質膜上的粘著斑，與加強細胞對基質的附著、鋪展及維持細胞特定形狀有關?？捡R斯亮藍R250可以染各種蛋白，并非特異染色微絲，實驗中用1％Triton X－100抽提掉胞質中除骨架蛋白外的其他蛋白，能清晰地顯示微絲束。實驗器材及試劑

2.1 器材

光學顯微鏡、溫箱、細胞培養設備、平皿、直徑30mm小染缸、載波片、蓋玻片條（剪掉一角以區別細胞正反面）。2.2 材料

體外培養的貼壁生長的HeLa細胞、洋蔥鱗莖。2.3 試劑

細胞培養基（DMEM、RPMI－1640等）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH7.4）、0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH7.3）、M－緩沖液、1％Triton X-100（用M－緩沖液配制）、0.2%考馬斯亮藍R250、3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液配制）。實驗步驟

3.1 HeLa細胞染色

（1）細胞培養在平皿中的蓋玻片上，尚未致密時即可使用。取出蓋玻片，用PBS洗3次。

（2）用1％Triton X-100處理25～30min，室溫或37度均可。（3）立即用M-緩沖液輕輕洗細胞3次。

（4）略晾干后，用3.0%戊二醛固定細胞5～15min。（5）PBS洗數次，濾紙吸干。

（6）用0.2%考馬斯亮藍R250染色1小時，然后用水小心沖洗，蒸餾水沖洗，空氣中略干燥。

（7）普通光學顯微鏡下用40×物鏡或油鏡觀察。3.2 植物細胞染色

（1）取洋蔥鱗莖表皮，大小約1cm2，放入盛有0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（6.8）的小燒杯中。

（2）吸去緩沖液，用1％Triton X-100處理洋蔥表皮20～30min。（3）除去Triton X-100，用M-緩沖液充分洗3次，每次約10min。（4）加3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液配制，pH6.8）固定0.5~1h。（5）用PBS洗3次，濾紙吸去殘液。（6）0.2%考馬斯亮藍R250染色30min。（7）蒸餾水洗數遍。將樣品置于載玻片上，加蓋玻片，光學顯微鏡下觀察。實驗結果

圖1 Hela細胞骨架染色圖

圖2 洋蔥鱗莖細胞骨架染色圖

結果分析

由實驗結果來看，圖2洋蔥鱗莖細胞的細胞骨架染色較為成功，可以清楚地在圖中看到染成藍紫色的微絲細胞骨架。而Hela細胞骨架染色出現了一些問題，顯著觀察到的是細胞出現了破裂，造成細胞被染色的部分游離分散在了玻片上，由于分工不同，Hela是李安一同學做的，在與他交流后，分析可能是最后蒸餾水沖洗的時候操作不當，可能造成了細胞的吸水脹破，引發了細胞骨架的游離的現象。而這種現象在班里很多組里都有出現，因此，這里考慮實驗步驟的錯誤，改進方法為可以用緩沖液去洗滌脫色。實驗反思

本次實驗步驟無明顯錯誤，最后部分結果不太好，在排除自身操作的同時，對實驗步驟產生一定的質疑，未來的實驗不能按圖索驥，要勤于思考，對每一步加深了解并給出自己的見解。參考文獻

[1]趙孟蓮, 牛敏英, 范保榮,等.用考馬斯藍R250(Coomassie Blue R250)顯示人成纖維細胞內微絲的觀察[J].解剖學報, 1983(2).[2]劉宇煒, 文若劍, 向赟.熱療后Hela細胞微絲和形態改變關系的研究[J].江漢大學學報(社會科學版), 2003, 31(2):13-16.[3]王崇英, 高清祥.細胞生物學實驗[M].高等教育出版社, 2011.

第二篇：考馬斯亮藍染色總結

12.5％考馬斯亮藍染色液的配制（含30％甲醇，10％乙酸）考馬斯亮藍R250 0.125g 甲醇 30ml 冰乙酸 10ml 加ddH2O至 100ml 染膠1h~2h 脫色液配制（含30％甲醇，10％乙酸）甲醇 30ml 冰乙酸 10ml 加dd H2O至 100ml 注：1.染色液可回收利用；室溫保存即可；甲醇可以用乙醇代替。

2.其它脫色液：

（1）用水脫色，但效果非常不好，建議不要用。

（2）脫色液也可以用0.5％mol/l的氯化鈉，沒有氣味，脫色效果也不錯。但膠可能會脹的厲害!（3）20%的甲醇和0.1M的tis-磷酸（PH6.5）

先用tis-磷酸（PH6。5）漂洗2min，然后用20%的甲醇漂洗1min（最好不要超過1min），最后用20%的NH4SO4固定30min 3.dd H2O煮法脫色

PAGE膠染色完畢后，如果用一般的甲醇－乙酸脫色液進行脫色，一般至少需要2－3h，可利用蒸餾水煮的方法：（1）.先將500ml蒸餾水放在一個干凈的燒杯中，在電爐上煮沸。（2）.將染色好的膠用DD水沖凈后放入煮沸的蒸餾水中，煮3～5min。

（3）.將DD水倒掉，看膠是否已經脫凈，如果還不好，可以用少量水再煮一次。一般整個脫色過程最多15min即可搞定！還可以避免每次脫色時的醋酸味！4.重復利用

（1）染色液和脫色液重復次數不一定的,可以根據他們的著染能力和脫色能力考慮是否換新的.夏季甲醇揮發快,用3~5次應該可以用.當然,用時要加蓋.（2）脫色時注意防止揮發,脫色液可以用活性碳處理后反復用多次的.（3）脫色液反復使用，用兩三次后用活性炭“包被”的濾紙過濾，濾紙可反復使用。脫色液反復使用后，膠有點泛紅，但不影響觀察，如果要發表，建議用新配脫色液。

5.加快染色和脫色速度

（1）染色和脫色都可以在微波爐中加熱甚至煮沸，很省時間。但注意不要沸騰時間太長，否則容易把膠上煮出泡狀的破損。

（2）若為了提高考染及脫色速度，可在45℃左右的水浴中進行，染色時間只需幾分鐘（其間輕輕晃動一二次，整個膠變為較深的亮蘭色即可）。脫色也在水浴中（約需15分鐘），（3）膠放入用乙醇-乙酸配成的脫色液后微波加熱10秒鐘至微熱,上搖床,10分鐘后,倒掉,換新的脫色液重復一次,不超過半個小時也好了.（4）用乙醇和乙酸配脫色液,然后加熱脫色，很快的，可加熱到馬上要沸騰為止。不但脫色可以，染色也可加熱，速度也很快（5）用蒸餾水洗膠，并放在微波爐里加熱，效果很好。

只是要掌握好時間，時間太長而蛋白的含量又比較低的話，容易脫過了！

（6）加入甲醇－乙酸脫色液后，將其直接放到微波爐里加熱一分鐘，然后放幾張干凈的tissue進去（把它疊成條狀，沾在脫色皿邊上就OK啦!(不要和膠混在一起）)，能吸去很多染料，加快脫色，效果不錯。6.注意問題

（1）膠脫色不能脫的太久，雖然越脫越清楚，但脫的太久了，弱帶就看不見了，膠也會變的失真，這樣的膠照出的照片是很難被接受的。如果樣品條帶或點不是很濃，就不可以脫太久。但如果要拍照，最起碼要保證底色脫完全，要不然照片效果也不會好的。

（2）如果需要長時間脫色，注意要換脫色液,且量要足夠,否則甲醇揮發很快,膠容易干卷.把本底脫干凈后可以把膠放水中保存.半個月應該沒問題；《分子克隆》：長期保存可以在水中加20%的甘油。也有站友經驗：考染不能長時間保存，尤其是在水里，3天顏色就會溶到水里。具體情況要自己摸索了。7.膠一般應放20%的甘油中長久保存（見“分子克隆”）