附件8

液體乳中三聚氰胺的快速檢測(cè)

拉曼光譜法

（KJ201908）

范圍

本方法規(guī)定了液體乳制品中三聚氰胺快速測(cè)定方法。

本方法適用于生鮮乳、滅菌乳、巴氏殺菌乳、調(diào)制乳和發(fā)酵乳等液態(tài)乳制品中三聚氰胺含量的快速測(cè)定。

原理

樣品經(jīng)沉淀、溶劑提取，加表面增強(qiáng)拉曼試劑對(duì)信號(hào)增強(qiáng)，進(jìn)行拉曼光譜掃描。以704±10cm-1處的拉曼特征峰作為三聚氰胺定量基準(zhǔn)峰，以925±10cm-1或類似基質(zhì)中穩(wěn)定存在的拉曼峰為參比峰，根據(jù)三聚氰胺峰與參比峰的相對(duì)強(qiáng)度對(duì)三聚氰胺的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)置儀器內(nèi)進(jìn)行判別。

試劑和材料

除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T

6682規(guī)定的二級(jí)水。

3.1

試劑

3.1.1

三氯乙酸。

3.1.2

三氯乙酸溶液（5%）：準(zhǔn)確稱取三氯乙酸（3.1.1）50

g于1

L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

3.1.3

表面增強(qiáng)試劑：金或銀納米粒子溶膠，或相當(dāng)者。

注：表面增強(qiáng)試劑的參考配制方法：

納米金溶膠：取100mL0.01%氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）水溶液加熱至沸，劇烈攪拌下準(zhǔn)確加入1.0mL

1%檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7）水溶液，金黃色的氯金酸水溶液在2min內(nèi)變?yōu)榧t色，繼續(xù)煮沸15min，冷卻后用蒸餾水補(bǔ)加到100mL。增強(qiáng)試劑配制用水為GB/T

6682規(guī)定的一級(jí)水。

納米銀溶膠：取200mL1.0mM硝酸銀（AgNO3）水溶液加熱沸騰，劇烈攪拌下逐滴準(zhǔn)確滴加5.0mL1%檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7）水溶液，持續(xù)煮沸1h，溶液變?yōu)榛揖G色，冷卻后用蒸餾水補(bǔ)加到200mL。增強(qiáng)試劑配制用水為GB/T

6682規(guī)定的一級(jí)水。

3.1.4

促凝劑：金溶膠的促凝劑：稱取5.85

g氯化鈉，溶于100

mL水中，搖勻，備用，或配制成其他相當(dāng)?shù)臒o機(jī)鹽溶液。銀溶膠的促凝劑：稱取5.85

g氯化鈉和2

g氫氧化鈉，溶于100

mL水中，搖勻，備用，或配制成其他相當(dāng)?shù)臒o機(jī)鹽溶液。

3.2

參考物質(zhì)

三聚氰胺參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CAS號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量見表1，純度≥99%。

表1

三聚氰胺中文名稱、英文名稱、CAS登記號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量

中文名稱

英文名稱

CAS登錄號(hào)

分子式

相對(duì)分子質(zhì)量

三聚氰胺

Melamine

108-78-1

C3H6N6

126.12

注：或等同可溯源物質(zhì)。

3.3

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液（500

μg/mL）：精密稱取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（3.2）適量，分別置于100

mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為500

μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。于4℃避光保存，有效期1個(gè)月。

儀器和設(shè)備

4.1

便攜式拉曼光譜儀

穩(wěn)頻激光光源：發(fā)射波長為785±1

nm，線寬<0.1

nm，能量≥250

mW；光譜分辨率≤15

cm-1；光譜響應(yīng)范圍500

cm-1~2000

cm-1，或大于該響應(yīng)范圍。

4.2

移液器：200

μL、1

mL和5

mL。

4.3

渦旋振蕩器。

4.4

離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥6000

r/min。

4.5

電子天平：感量為0.01

g。

4.6

塑料具塞離心管：2

mL。

分析步驟

5.1

試樣的提取

取0.5

g樣品加到2

mL離心管中，再加入1ml

5%三氯乙酸溶液，渦旋30

s混勻；放入離心機(jī)，以不低于6000

r/min轉(zhuǎn)速離心1

min；上清液備用。

5.2

測(cè)定步驟

5.2.1

拉曼光譜儀器參考條件

激光能量≥250

mW，數(shù)據(jù)采集時(shí)間≥2

s。

5.2.2

測(cè)定

在儀器樣品池中依次加入100

μL促凝劑，100

μL表面增強(qiáng)試劑，50

μL樣品（5.1），快速搖晃均勻，等待20

s檢測(cè)（檢測(cè)需在樣品加入后1

min內(nèi)完成）。

5.3

質(zhì)控試驗(yàn)

每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)。

5.3.1

空白試驗(yàn)

稱取空白試樣，按照5.1和5.2步驟與樣品同法操作。

5.3.2

加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取空白試樣10

g置于15

mL具塞離心管中，加入50

μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液（500

μg/mL）（3.3），使三聚氰胺濃度為2.5

mg/kg，按照5.1和5.2步驟與樣品同法操作。

結(jié)果判定要求

儀器軟件將測(cè)試結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫中的三聚氰胺進(jìn)行匹配計(jì)算，根據(jù)譜圖704

cm-1（±10

cm-1）處特征拉曼光譜及內(nèi)置校準(zhǔn)曲線，對(duì)樣品中的三聚氰胺進(jìn)行結(jié)果判定：顯示測(cè)試結(jié)果并判定陰性或陽性。陰性代表該樣品不含有三聚氰胺或低于2.5

mg/kg，陽性則代表該樣品含有三聚氰胺且大于等于2.5

mg/kg。液態(tài)乳表面增強(qiáng)拉曼光譜圖參見圖1。

圖1

液態(tài)乳表面增強(qiáng)拉曼光譜圖

6.1

質(zhì)控試驗(yàn)要求

空白試樣測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控樣品測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陽性。

性能指標(biāo)

7.1

檢測(cè)限

2.5mg/kg。

7.2

靈敏度

靈敏度應(yīng)≥99%。

7.3

特異性

特異性應(yīng)≥85%。

7.4

假陰性率

假陰性率應(yīng)≤1%。

7.5

假陽性率

假陽性率應(yīng)≤15%。

注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見附錄A。

確證

本方法為初篩方法，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽性時(shí)，應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證。

其他

本方法所述納米表面增強(qiáng)試劑及促凝劑信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)不做限定。方法使用者在使用替代試劑或操作步驟前，須對(duì)其進(jìn)行考察，應(yīng)滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)。

本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為GB/T

22388-2008

《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》。

附錄A

快速檢測(cè)方法性能計(jì)算表

表A.1

性能指標(biāo)計(jì)算方法

樣品情況a

檢測(cè)結(jié)果b

總數(shù)

陽性

陰性

陽性

N11

N12

N1.=N11+N12

陰性

N21

N22

N2.=N21+N22

總數(shù)

N.1=N11+N12

N.2=N21+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

顯著性差異(х2)

c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1

靈敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特異性（p-，%）

p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-靈敏度

假陽性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特異性

相對(duì)準(zhǔn)確度，%c

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：

a由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果或者樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果；

b由待確認(rèn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。

N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C為方法的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測(cè)趨勢(shì)情況綜合評(píng)價(jià)。

本方法負(fù)責(zé)起草單位：江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院。

驗(yàn)證單位：山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院、江南大學(xué)、四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院

主要起草人：徐春祥、張淵、張征、顏春榮、胡明燕、劉麗強(qiáng)、姚歡