附件7

液體乳中三聚氰胺的快速檢測(cè)

膠體金免疫層析法

(KJ201907)

范圍

本方法規(guī)定了液體乳中三聚氰胺的膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法。

本方法適用于巴氏殺菌乳、滅菌乳、調(diào)制乳和發(fā)酵乳中三聚氰胺的快速測(cè)定。

原理

本方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。樣品中的三聚氰胺與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條或檢測(cè)卡中檢測(cè)線（T線）上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測(cè)線顏色深淺的變化。通過檢測(cè)線與控制線（C線）顏色深淺比較，對(duì)樣品中三聚氰胺進(jìn)行定性判定。

試劑和材料

除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T

6682規(guī)定的二級(jí)水。

3.1

試劑

3.1.1

甲醇。

3.1.2

三羥甲基氨基甲烷（Tris）。

3.1.3

1mol/L鹽酸：移取83

mL濃鹽酸，加入900mL水中，定容至1

L。

3.1.4

甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取50

mL甲醇和50

mL水，混勻后備用。

3.1.5

稀釋液：準(zhǔn)確稱取6.05

g

Tris（3.1.2）和8.5

g

1mol/L鹽酸（3.1.3），加水定容至1

L，混勻后備用。

3.2

參考物質(zhì)

參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量見表1，純度≥99%。

表1

三聚氰胺參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量

中文名稱

英文名稱

CAS登錄號(hào)

分子式

相對(duì)分子質(zhì)量

三聚氰胺

Melamine

108-78-1

C3H6N6

126.12

注：或等同可溯源物質(zhì)。

3.3

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1000

μg/mL）：精密稱取適量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（3.2），置于10

mL容量瓶中，用甲醇水溶液（3.1.4）溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1000

μg/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；或可直接購(gòu)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。4℃避光保存?zhèn)溆茫行?個(gè)月。

3.4

三聚氰胺膠體金免疫層析試劑盒

3.4.1

金標(biāo)微孔（含膠體金標(biāo)記的特異性抗體）。

3.4.2

試紙條或檢測(cè)卡。

儀器和設(shè)備

4.1

移液器：200

μL、1000

μL和5

mL。

4.2

渦旋混合器。

4.3

電子天平：感量為

0.01

g。

4.4

環(huán)境條件：溫度15℃~35℃，濕度≤80%。

分析步驟

5.1

試樣制備

取適量有代表性樣品充分混勻。

5.2

試樣提取

準(zhǔn)確稱取樣品0.5

g于離心管中，加入5

mL稀釋液（3.1.5），渦旋混勻提取5

min，即得待測(cè)液。

注：試樣提取過程可按照試劑盒說明書，不做限定。

5.3

測(cè)定步驟

5.3.1

試紙條與金標(biāo)微孔測(cè)定步驟

吸取150~200

μL樣品待測(cè)液于金標(biāo)微孔（3.4.1）中，抽吸5~10次使混合均勻，不要有氣泡，40℃溫育3

min，將檢測(cè)試紙條（3.4.2）樣品端垂直向下插入金標(biāo)微孔中，40℃溫育5

min，從微孔中取出試紙條，進(jìn)行結(jié)果判定。

5.3.2

檢測(cè)卡測(cè)定步驟

吸取150-200

μL樣品待測(cè)液于檢測(cè)卡加樣孔（3.4.2）中，室溫反應(yīng)3-5

min，進(jìn)行結(jié)果判定。

5.4

質(zhì)控試驗(yàn)

每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)。

5.4.1

空白試驗(yàn)

稱取空白試樣，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。

5.4.2

加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取空白試樣100

g（精確至0.01

g）置于100

mL玻璃溶液瓶中，加入250

μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000

μg/mL）（3.3），使試樣中三聚氰胺濃度為2.5

mg/kg，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。

注：可參考標(biāo)準(zhǔn)品的說明書配置操作。

結(jié)果判定要求

通過對(duì)比控制線（C線）和檢測(cè)線（T線）的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。目視結(jié)果判讀如圖1。

6.1

無效

控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試紙條/檢測(cè)卡無效。

6.2

陽(yáng)性結(jié)果

6.2.1

消線法

檢測(cè)線（T線）不顯色，控制線（C線）顯色，表明樣品中三聚氰胺含量高于方法檢測(cè)限，判定為陽(yáng)性（如圖1試紙條/檢測(cè)卡目視判定示意圖）。

6.2.2

比色法

檢測(cè)線（T線）顏色比控制線（C線）顏色淺或幾乎不顯色，表明樣品中三聚氰胺含量高于方法檢測(cè)限，判定為陽(yáng)性（如圖1試紙條/檢測(cè)卡目視判定示意圖）。

6.3

陰性結(jié)果

6.3.1

消線法

檢測(cè)線（T線）、控制線（C線）均顯色，表明樣品中三聚氰胺含量低于方法檢測(cè)限，判定為陰性（如圖1試紙條/檢測(cè)卡目視判定示意圖）。

6.3.2

比色法

檢測(cè)線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或者檢測(cè)線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相當(dāng)，表明樣品中三聚氰胺含量低于方法檢測(cè)限，判定為陰性（如圖1試紙條/檢測(cè)卡目視判定示意圖）。

試紙條

手持端

C線

T線

樣品端

檢測(cè)卡

加樣孔

T線

C線

C線

T線

T線

T線

C線

C線

陰性

陽(yáng)性

陽(yáng)性

陰性

消線法

比色法

結(jié)果無效

檢測(cè)裝置示意圖

圖1

試紙條/檢測(cè)卡目視判定示意圖

6.4

質(zhì)控試驗(yàn)要求

空白試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。

6.5

讀數(shù)儀測(cè)定法

按讀數(shù)儀說明書要求操作直接讀取并進(jìn)行結(jié)果判定。

結(jié)論

三聚氰胺與滅蠅胺有交叉反應(yīng)，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)對(duì)三聚氰胺結(jié)果進(jìn)行確證。

性能指標(biāo)

8.1

檢測(cè)限

2.5mg/kg。

8.2

靈敏度

靈敏度應(yīng)≥99%

8.3

特異性

特異性應(yīng)≥85%。

8.4

假陰性率

假陰性率應(yīng)≤1%。

8.5

假陽(yáng)性率

假陽(yáng)性率應(yīng)≤15%。

注：性能指標(biāo)計(jì)算方法參見附錄A。

其他

本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)不做限定，可根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。方法使用者應(yīng)使用經(jīng)過驗(yàn)證的滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)的試劑、試劑盒。

本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》（GB/T

22388-2008）。

本方法使用試劑盒可能與滅蠅胺存在交叉反應(yīng)，當(dāng)結(jié)果判定為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)采用實(shí)驗(yàn)室儀器方法《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》（GB/T

22388-2008）對(duì)三聚氰胺結(jié)果進(jìn)行確證。

附錄A

快速檢測(cè)方法性能指標(biāo)計(jì)算表

表A.1性能指標(biāo)計(jì)算方法

樣品情況a

檢測(cè)結(jié)果b

總數(shù)

陽(yáng)性

陰性

陽(yáng)性

N11

N12

N1.=N11+N12

陰性

N21

N22

N2.=N21+N22

總數(shù)

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

顯著性差異（χ2）

χ2=（|N12-N21|-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1

靈敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特異性（p-，%）

p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-靈敏度

假陽(yáng)性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特異性

相對(duì)準(zhǔn)確度，%c

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：

a由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果或者樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果；

b由待確認(rèn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。

N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C為方法的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測(cè)趨勢(shì)情況綜合評(píng)價(jià)。

本方法負(fù)責(zé)起草單位：北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心（北京市食品檢驗(yàn)所）

驗(yàn)證單位：山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院、四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院、江南大學(xué)

主要起草人：史娜、吳燕濤、孫蕊、王麗、潘攀、張麗華