第一篇：WB03 酶聯免疫法快速檢測牛乳中的三聚氰胺操作視頻配音稿概要

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酶聯免疫法快速檢測牛乳中的三聚氰胺操作視頻配音稿

準備好物品后即可進行檢測操作，首先進行樣品處理。取1mL純牛奶樣本，加入一根小試管，再加1mL去離子水，渦動1min混勻；取出40μL牛奶溶液，加入另一根小試管，再加入960μL樣本稀釋液稀釋，渦動1min混勻。

接下來，吸取50μL牛奶樣本到微孔中，做2孔平行，并記錄所在位置。再取三聚氰胺標準品各50μL到微孔中，也做2孔平行，并記錄所在位置。然后，每孔各加50μL酶標物，每孔再加入抗試劑50μL，輕輕振蕩均勻，用蓋板膜蓋板，置25℃避光環境中反應30min。

取出微孔板，小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，每孔加入洗滌液250μL，充分洗滌4次，每次間隔10s，用吸水紙拍干。接下來各孔加入底物液A液50μL，再每孔加入底物液B液50μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，置25℃避光環境反應15～20min。取出微孔板，每孔加入終止液50μL，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值。

測定完成后我們得到了三聚氰胺標品和樣本的吸光度平均值，如表格所示。首先進行三聚氰胺的定性分析，根據樣本的吸光度值1.870，可以得出它的三聚氰胺濃度范圍為1ppb-3ppb，再乘以稀釋倍數50得出此純牛奶中三聚氰胺的濃度為50ppb-150ppb。

接著我們進行三聚氰胺的定量分析，先計算百分吸光率和三聚氰胺濃度的對數，如表格中所示。

然后，以標準品百分吸光率為縱坐標，三聚氰胺標準品濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準曲線，如圖所示。將樣本的百分吸光率帶入標準曲線的公式中，計算出樣本所對應的濃度為1.77ppb，乘以稀釋倍數50得到樣本中三聚氰胺實際殘留量為88.5ppb。

第二篇：液體乳中三聚氰胺的快速檢測 膠體金免疫層析法（KJ201907）

附件7

液體乳中三聚氰胺的快速檢測

膠體金免疫層析法

(KJ201907)

范圍

本方法規定了液體乳中三聚氰胺的膠體金免疫層析快速檢測方法。

本方法適用于巴氏殺菌乳、滅菌乳、調制乳和發酵乳中三聚氰胺的快速測定。

原理

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的三聚氰胺與膠體金標記的特異性抗體結合，抑制抗體和試紙條或檢測卡中檢測線（T線）上抗原的結合，從而導致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線（C線）顏色深淺比較，對樣品中三聚氰胺進行定性判定。

試劑和材料

除另有規定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T

6682規定的二級水。

3.1

試劑

3.1.1

甲醇。

3.1.2

三羥甲基氨基甲烷（Tris）。

3.1.3

1mol/L鹽酸：移取83

mL濃鹽酸，加入900mL水中，定容至1

L。

3.1.4

甲醇水溶液：準確量取50

mL甲醇和50

mL水，混勻后備用。

3.1.5

稀釋液：準確稱取6.05

g

Tris（3.1.2）和8.5

g

1mol/L鹽酸（3.1.3），加水定容至1

L，混勻后備用。

3.2

參考物質

參考物質的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質量見表1，純度≥99%。

表1

三聚氰胺參考物質中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質量

中文名稱

英文名稱

CAS登錄號

分子式

相對分子質量

三聚氰胺

Melamine

108-78-1

C3H6N6

126.12

注：或等同可溯源物質。

3.3

標準溶液的配制

三聚氰胺標準儲備液（1000

μg/mL）：精密稱取適量三聚氰胺標準品（3.2），置于10

mL容量瓶中，用甲醇水溶液（3.1.4）溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1000

μg/mL的三聚氰胺標準儲備液；或可直接購三聚氰胺標準儲備液。4℃避光保存備用，有效期3個月。

3.4

三聚氰胺膠體金免疫層析試劑盒

3.4.1

金標微孔（含膠體金標記的特異性抗體）。

3.4.2

試紙條或檢測卡。

儀器和設備

4.1

移液器：200

μL、1000

μL和5

mL。

4.2

渦旋混合器。

4.3

電子天平：感量為

0.01

g。

4.4

環境條件：溫度15℃~35℃，濕度≤80%。

分析步驟

5.1

試樣制備

取適量有代表性樣品充分混勻。

5.2

試樣提取

準確稱取樣品0.5

g于離心管中，加入5

mL稀釋液（3.1.5），渦旋混勻提取5

min，即得待測液。

注：試樣提取過程可按照試劑盒說明書，不做限定。

5.3

測定步驟

5.3.1

試紙條與金標微孔測定步驟

吸取150~200

μL樣品待測液于金標微孔（3.4.1）中，抽吸5~10次使混合均勻，不要有氣泡，40℃溫育3

min，將檢測試紙條（3.4.2）樣品端垂直向下插入金標微孔中，40℃溫育5

min，從微孔中取出試紙條，進行結果判定。

5.3.2

檢測卡測定步驟

吸取150-200

μL樣品待測液于檢測卡加樣孔（3.4.2）中，室溫反應3-5

min，進行結果判定。

5.4

質控試驗

每批樣品應同時進行空白試驗和加標質控試驗。

5.4.1

空白試驗

稱取空白試樣，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。

5.4.2

加標質控試驗

準確稱取空白試樣100

g（精確至0.01

g）置于100

mL玻璃溶液瓶中，加入250

μL三聚氰胺標準溶液（1000

μg/mL）（3.3），使試樣中三聚氰胺濃度為2.5

mg/kg，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。

注：可參考標準品的說明書配置操作。

結果判定要求

通過對比控制線（C線）和檢測線（T線）的顏色深淺進行結果判定。目視結果判讀如圖1。

6.1

無效

控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試紙條/檢測卡無效。

6.2

陽性結果

6.2.1

消線法

檢測線（T線）不顯色，控制線（C線）顯色，表明樣品中三聚氰胺含量高于方法檢測限，判定為陽性（如圖1試紙條/檢測卡目視判定示意圖）。

6.2.2

比色法

檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色淺或幾乎不顯色，表明樣品中三聚氰胺含量高于方法檢測限，判定為陽性（如圖1試紙條/檢測卡目視判定示意圖）。

6.3

陰性結果

6.3.1

消線法

檢測線（T線）、控制線（C線）均顯色，表明樣品中三聚氰胺含量低于方法檢測限，判定為陰性（如圖1試紙條/檢測卡目視判定示意圖）。

6.3.2

比色法

檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或者檢測線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相當，表明樣品中三聚氰胺含量低于方法檢測限，判定為陰性（如圖1試紙條/檢測卡目視判定示意圖）。

試紙條

手持端

C線

T線

樣品端

檢測卡

加樣孔

T線

C線

C線

T線

T線

T線

C線

C線

陰性

陽性

陽性

陰性

消線法

比色法

結果無效

檢測裝置示意圖

圖1

試紙條/檢測卡目視判定示意圖

6.4

質控試驗要求

空白試驗測定結果應為陰性，加標質控試驗測定結果應為陽性。

6.5

讀數儀測定法

按讀數儀說明書要求操作直接讀取并進行結果判定。

結論

三聚氰胺與滅蠅胺有交叉反應，當檢測結果為陽性時，應對三聚氰胺結果進行確證。

性能指標

8.1

檢測限

2.5mg/kg。

8.2

靈敏度

靈敏度應≥99%

8.3

特異性

特異性應≥85%。

8.4

假陰性率

假陰性率應≤1%。

8.5

假陽性率

假陽性率應≤15%。

注：性能指標計算方法參見附錄A。

其他

本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做限定，可根據試劑盒說明書進行操作。方法使用者應使用經過驗證的滿足本方法規定的各項性能指標的試劑、試劑盒。

本方法參比標準為《食品安全國家標準原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》（GB/T

22388-2008）。

本方法使用試劑盒可能與滅蠅胺存在交叉反應，當結果判定為陽性時，應采用實驗室儀器方法《食品安全國家標準原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》（GB/T

22388-2008）對三聚氰胺結果進行確證。

附錄A

快速檢測方法性能指標計算表

表A.1性能指標計算方法

樣品情況a

檢測結果b

總數

陽性

陰性

陽性

N11

N12

N1.=N11+N12

陰性

N21

N22

N2.=N21+N22

總數

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

顯著性差異（χ2）

χ2=（|N12-N21|-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1

靈敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特異性（p-，%）

p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-靈敏度

假陽性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特異性

相對準確度，%c

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：

a由參比方法檢驗得到的結果或者樣品中實際的公議值結果；

b由待確認方法檢驗得到的結果。靈敏度的計算使用確認后的結果。

N：任何特定單元的結果數，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C為方法的檢測結果相對準確性的結果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價。

本方法負責起草單位：北京市食品安全監控和風險評估中心（北京市食品檢驗所）

驗證單位：山東省食品藥品檢驗研究院、四川省食品藥品檢驗檢測院、江南大學

主要起草人：史娜、吳燕濤、孫蕊、王麗、潘攀、張麗華

第三篇：WB03 腐竹中二氧化硫的快速檢測操作視頻配音稿概要

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腐竹中二氧化硫的快速檢測操作視頻配音稿

首先，進行樣品處理，將腐竹剪碎，混合均勻備用。打開電子秤，取一樣品杯，稱取1.0g腐竹。取量筒，量取49mL蒸餾水，加入樣品杯，混勻。再往樣品杯中加入0.5mL亞硫酸鹽提取液，超聲浸泡10min，期間振蕩數次。

接下來進行檢測，浸泡液中取上清液2.5mL加入比色皿，再加入3滴檢測液A，吹吸混勻。打開速測儀，設置好項目參數，將比色皿放入儀器內調零。取出比色皿，加入3滴檢測液B，吹吸混勻，靜置5min，放入儀器進行檢測。

經速測儀檢測，此樣品中亞硫酸鹽的含量＞250.0mg/kg，超出亞硫酸鹽的標準限量200.0mg/kg，因此，結果判斷為超標。可以將腐竹樣品留存，送相關部門作進一步檢測。

第四篇：WB03 肉串中亞硝酸鹽的快速檢測操作視頻配音稿概要

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肉串中亞硝酸鹽的快速檢測操作視頻配音稿

首先，進行樣品處理，將肉串剪碎，混合均勻備用。打開電子秤，取一樣品杯，調零，稱取1.0g肉串。取一量筒，吸取49mL蒸餾水，加入樣品杯，混勻，放入超聲波提取儀超聲10-15min。

吸取超聲后的浸泡液20mL加入小樣品杯，加入0.5mL亞硝酸鹽提取液1號，再加入0.5mL亞硝酸鹽提取液2號，吹吸混勻，靜置1min。之后進行過濾操作，將浸泡液緩慢倒入濾紙中，濾液備用。

接下來進行檢測，取比色皿，加入1.0mL濾液，1.0mL蒸餾水，再加3滴檢測液A，吹吸混勻。打開速測儀，設置好項目參數，將比色皿放入儀器內調零。取出，加入3滴檢測液B，吹吸混勻，靜置3min，放入儀器進行檢測。

經速測儀檢測，此樣品中亞硝酸鹽的含量＞200.0mg/kg，超出亞硝酸鹽的標準限量30.0mg/kg，因此，結果判斷為超標。可以將肉串樣品留存，送相關部門作進一步檢測。

第五篇：酶聯免疫法檢測蝦中的呋喃唑酮

酶聯免疫法檢測蝦中的呋喃唑酮代謝物

摘要建立養殖蝦類中 AOZ殘留 ELISA篩選方法。方法: 酸性條件下利用 2-硝基苯甲醛衍生化, 乙酸乙酯提取, 正己烷去雜質后進行 ELISA分析。結果: 方法最低檢測限為 013 Lg/kg, 向樣品中添加濃度為 015、110和 310Lg/kg3個梯度標準品溶液時,平均回收率范圍為 9017% ~ 9519%, RSD 為 4124% ~ 5142%。結論: 實驗證明該方法適合養殖蝦類中 AOZ殘留篩選。

關鍵詞：蝦肉;呋喃唑酮代謝物;ELISA

一、前言

呋喃唑酮（FZD）,又名痢特靈,是一種廣譜抗菌藥物，屬于硝基呋喃類藥物，是人工合成的化學藥。常被摻放在飼料中，用于水產品養殖傳染病的預防與治療[1]。藥代動力學研究表明，呋喃唑酮在動物體內的代謝非常快，現已明確此類抗生素的原型在體內 4 d 后，就已完全分解成其代謝物，所以分析呋喃唑酮時，只能分析其代謝物[2]。經研究表明，呋喃唑酮的代謝物中有相當數量是以其完整側鏈 3-氨基-2-惡唑烷酮即 AOZ 與蛋白結合的殘留物形式存在, AOZ 進一步代謝可產生具致癌、致突變作用的羥乙基肼[3]，因此檢測呋喃唑酮代謝物(AOZ)的殘留更具有現實意義。呋喃唑酮在畜產品和水產品中的殘留，通過食物鏈傳遞給人類,會使人體受到損害。另外,其作為人畜共用藥，長期微量攝入易使人體產生抗藥性，導致呋喃唑酮藥物失去醫療功效[4]。

1990 年 7 月歐盟頒布 2377/90/EEC 條例，將硝基呋喃類藥物及其代謝產物列為 A 類禁用藥物，規定其在動物源性食品中的殘留檢測限為 1.0 μg/kg。由于對呋喃唑酮蛋白結合態殘留物的安全性產生懷疑，自1995 年起歐盟、日本、美國等都開始禁止這類抗菌劑在食用的畜禽及水產動物中使用，并嚴格執行對輸入的食用魚，蝦及禽類進行殘留檢測[5]。同許多國家一樣，我國農業部制訂的 NY5070-2002《無公害食品水產品中魚藥殘留限量》及 GB18406.4-2001《無公害水產品安全要求》規定，水產品中不得檢出呋喃唑酮，同時禁 止在飼料中添加[6]。目前呋喃唑酮在食品中殘留的監測方法主要有高效液相色譜法[7-8]、酶聯免疫法[9]、分光光度法、原子吸收法[10]等，酶聯免疫法已受到廣泛重視。本試驗主要 使用酶聯免疫法對出口蝦中呋喃唑酮代謝物AOZ 的殘留做快速檢測。

福建省詔安縣海利水產有限公司，是一家集水產品加工、銷售、研究、開發和養殖于一體的大型出口企業。該公司于2005年引進投建，廠房和生產布局按照《出口食品生產企業衛生注冊登記管理規定》和美國FDA法規及歐盟指令進行設計建造，廠區占地面積八萬平方米，全封閉配套中央空調的水產加工車間二萬平方米，生產車間配套高效臭氧殺菌設施，制冷水機和大型制冰機等各種先進加工設備，凍庫儲存能力達6000噸，同時配套建設大型對蝦養殖場及蝦苗孵化場，擁有一支高素質員工隊伍，年加工生產水產品15000噸以上，產品近二十種，主要有凍生蝦、凍熟蝦、凍面包蝦、壽司蝦、凍魷魚、凍羅非魚等。公司秉承共同發展的目標，不斷完善質量管理體系，執著追求品質,先后獲得了《衛生注冊證書》、《輸美水產品HACCP驗證證書》，2005年11月通過了BRC認證，2006年1月通過了ISO9001認證，2008年通過了歐盟相關質量認證，產品獲得了國外消費者的肯定和喜歡，遠銷日本、美國、加拿大、墨西哥和香港等國家和地區，在國外贏得了市場。公司自建成投產以來，企業迅速發展壯大。

1材料與方法

1.1

樣品

均來自福建省海利水產有限公司。

1.2

主要儀器及設備

MK3 型酶標儀: Thermo 公司；Scientz-10 型均質機：寧波新芝生物科技股份有限公司；ALC.210.4 電子天平:ACCULAB；DRP-9082 型恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；4K15 型高速冷凍離心機：Sigma公司；HH-w600s 恒溫水箱：山東鄄城新科教學儀器廠；MS1 Minishaker:IKA；1 000、200、20 μL 微量移液器：GILSON。

1.3

試劑與溶液

呋喃唑酮代謝產物-AOZ 試劑盒：北京望爾生物技術有限公司；靈敏度為 0.125 μg/kg，包括：AOZ 標準溶液（0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05 ng/mL）、濃縮緩沖液、濃縮提取/洗滌液、衍生試劑、濃縮酶標記物、底物溶液、反應終止液。正己烷，乙酸乙脂，1 mol/L NaOH，1 mol/L HCl。

1.4方法

1.4.1

樣品處理

蝦去頭去殼，取可食用部分，制成均質物。

1.4.2

樣品制備

1）稱取 1 g 已均質的樣品于 50 mL 離心管中，依次加入 4 mL 超純水、1.5 mL 1 mol/L HCl，100 μL 衍生試劑，漩渦振蕩 1 min。置 37 ℃的恒溫培養箱中溫育，靜置過夜（約 16 h）。

2）加入 5 mL 原倍緩沖液，0.4 mL 1 mol/L NaOH，5 mL 乙酸乙酯，振蕩混合約 1 min。

3）離心 10 min（3 000 r/min），取 2 mL 上清（乙酸乙酯層）至 10 mL 玻璃管中，于 50 ℃下氮氣吹干。

4）于此玻璃管加入正己烷 1 mL，先將殘留物完全溶解后（若未能完全溶解，可能會導致回收率降低），再加入 2 mL 原倍萃取/清洗液，振蕩 1 min。

5）將玻璃試管置于 80℃～100℃熱水浴中約 3min，以減少水相與有機相間的乳化現象。6）離心 10 min（3 000 r/min），吸去上層液（正己烷），棄掉，再吸取下層液（水層）備用。

1.4.3測定

1）將 AOZ 試劑盒從冰箱中拿出，回溫至室溫。

2）取出相應數量的微孔，各個標準液和待測樣品各做 2 個平行樣，做好記錄。

3）于適當的微孔中分別加入 50 μL 標準溶液（0，0.05，0.15，0.45，1.35，4.05 ng/mL）。

4）于另外微孔中加入 50 μL 已完成前處理的樣品溶液。

5）再于每一微孔中另再加入 100 μL 已稀釋的酶標記物。

6）輕敲盤子四周，使其充分混合后于室溫（25 ℃）下避光靜置溫育 50 min。

7）微孔中的反應液甩掉，再將洗液加滿每一微孔后甩掉，重復洗 3 次。

8）最后一次甩掉后，在吸水紙上拍干。

9）于每一微孔中加入底物溶液 100 μL 后，輕敲盤子四周，使其充分混合。

10）于室溫（25 ℃）下避光靜置溫育 30 min。

11）于每一微孔中加入 100 μL 反應終止液。

12）用酶標儀于波長 450 nm 下判讀。

1.5

數據處理

1）計算（B/B0）×100 值。用樣品和標準溶液吸光度值（B）除以零標準吸光度值（B0）再乘以 100。

2）以（B/B0）×100 值為縱坐標，以樣品濃度的對數值為橫坐標，做標準對數曲線。

3）根據每個樣品的 B/B0值就可以從曲線上讀出相對應樣品的濃度

2結果

2.1

標準曲線的繪制

AOZ 標準品的 ELISA 檢測結果見表 1。

2.4

試驗過程中的注意事項

1）A回溫試劑（20℃-24℃）。B恒溫孵育，避免光線照射。

2）、將足夠標準和樣品所用數量的孔條插入微孔架，標準和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準和樣品的位置。

3）加入50ul標準或處理好的樣品液到各自的微孔中，每個孔加入樣品或標準時注意更換移液器的吸頭。

4)加入50ul酶標記物溶液（紅帽）到每一個微孔底部，充分混合。

5)加入50ul抗體溶液（黑帽）到每一個微孔底部充分混合，在室溫孵育1小時，覆蓋上薄膜。

6)倒出孔中的流體將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體。用250ul樣品洗滌緩沖液充入孔中，重復兩次。

7)加入100ul基質/發色劑到每一微孔中，充分混合并在室溫暗處孵育15分鐘。

8）加入100ul反應終止液到每一微孔中，混合好在450nm處測量吸光值以空氣為空白，必須在加入停止液后60分鐘內讀取吸光值。

9）試劑盒內容物要完全回穩后再進行操作，否則，會出現吸光值偏低或沒有吸光值。

10）溫浴時若室溫太低或太高，請適當延長或縮短溫浴時間，或直接在恒溫培養箱中進行。

11）加樣品或試劑時，吸頭請勿接觸微孔。

12）加樣和洗板過程中，要避免微孔間的相互污染。

13）整個試驗過程中，勿使微孔干燥。

結論

本試驗用酶聯免疫法檢測了海利水產有限公司中呋喃唑酮代謝物 AOZ 的殘留狀況，結果表明絕大多數的水產品符合規定，只有極少數部分有殘留。用酶聯免疫法對蝦肉呋喃唑酮代謝物 AOZ 殘留進行測定，操作簡易，不需要復雜的儀器設備，樣品預處理簡單，作為一種快速篩選手段，在食品工業中有著廣闊的推廣應用前景，尤其在水產品出口企業中，但酶聯免疫試劑盒的價格將是最大的制約因素。

參考文獻：

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