附件1

保健食品中西地那非和他達拉非的快速檢測

膠體金免疫層析法

（KJ201901）

范圍

本方法規定了保健食品中西地那非和他達拉非的膠體金免疫層析快速篩查方法。

本方法適用于聲稱具有抗疲勞、調節免疫等功能的保健食品中西地那非和他達拉非成分的快速篩查。

原理

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的西地那非和他達拉非等物質經提取后與膠體金標記的特異性抗體結合，抑制抗體和試紙條或檢測卡中檢測線（T線）上抗原的結合，從而導致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線（C線）顏色深淺比較，對樣品中西地那非和他達拉非成分進行定性判定。

試劑材料

3.1

試劑

除另有規定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T

6682規定的二級水。

3.1.1

甲醇：色譜純。

3.1.2

三羥甲基氨基甲烷，Tris堿。

3.1.3

濃鹽酸。

3.1.4

吐溫-20。

3.1.5

鹽酸溶液：量取濃鹽酸（3.1.3）16.7

mL，用水溶解并稀釋至100

mL。

3.1.6

緩沖液：稱取12.1

g

Tris堿（3.1.2），加適量水溶解，混勻，用鹽酸溶液（3.1.5）調節pH至8.0，加入5.0

g吐溫-20（3.1.4）攪拌均勻，定容至1000

mL。

3.2

參考物質

參考物質的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見表1，純度均≥99%。

表1

參考物質信息表

序號

中文名稱

英文名稱

CAS登錄號

分子式

相對分子量

西地那非

Sildenafil

139755-83-2

C22H30N6O4S

474.58

序號

中文名稱

英文名稱

CAS登錄號

分子式

相對分子量

他達拉非

Tadalafil

171596-29-5

C22H19N3O4

389.40

注：或等同可溯源物質。

3.3

標準溶液配制

3.3.1

西地那非標準儲備液（1.0

mg/mL）：精密稱取適量西地那非參考物質（3.2），用甲醇（3.1.1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1.0

mg/mL的標準儲備液。-20℃避光保存，有效期1年。

3.3.2

西地那非標準工作液（10?μg/mL）：精密移取適量西地那非標準儲備液（1.0

mg/mL）（3.3.1）分別置于10?mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為10?μg/mL的標準工作液。-20℃避光保存，有效期3個月。

3.3.3

他達拉非標準儲備液（0.5

mg/mL）：精密稱取適量他達拉非參考物質（3.2），用甲醇（3.1.1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為0.5?mg/mL的標準儲備液。-20℃避光保存，有效期1年。

3.3.4

他達拉非標準工作液（10?μg/mL）：精密移取適量他達拉非標準儲備液（0.5mg/mL）（3.3.3）分別置于10?mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為10?μg/mL的標準工作液。-20℃避光保存，有效期3個月。

3.4

材料

西地那非膠體金免疫層析試劑盒及配套的試劑（可選），適用基質為保健食品。

他達拉非膠體金免疫層析試劑盒及配套的試劑（可選），適用基質為保健食品。

設備與儀器

4.1

設備

4.1.1

天平：感量為0.1

mg和0.01

g。

4.1.2

渦旋混合器。

4.1.3

移液器：20-200

μL，100-1000

μL，5

mL。

4.1.4

離心機：轉速可達4000

r/min以上。

4.2

儀器

4.2.1

讀數儀：產品配套可使用的檢測儀器（可選）。

4.2.2

環境條件：溫度10-40℃，相對濕度≤80%。

分析步驟

5.1

試樣制備

液體樣品充分混勻，固體樣品充分粉碎混勻。

5.2

試樣提取和凈化

5.2.1

液體基質

量取0.5

mL±0.02

mL試樣于15

mL離心管中，加入4

mL緩沖液（3.1.6），渦旋混合30

s，作為待測液。

5.2.2

固體基質

5.2.2.1

檢測西地那非

準確稱取試樣0.5

g±0.01

g于15

mL離心管中，加1

mL甲醇（3.1.1），渦旋30

s，4000

rpm離心2

min或靜置2

min。取250

μL上清液于2

mL離心管中，加入750

μL緩沖液（3.1.6），渦旋混合30s，作為待測液。

5.2.2.2

檢測他達拉非

準確稱取試樣0.5

g±0.01

g于15

mL離心管中，加1

mL甲醇（3.1.1），渦旋30

s，4000

rpm離心2

min或靜置2

min。取200

μL上清液于15

mL離心管中，加入3

mL緩沖液（3.1.6），渦旋混合30

s，作為待測液。

注：試樣提取和凈化（5.2）過程可按照試劑盒說明書操作，不做限定。

5.3

測定步驟

5.3.1

試紙條與金標微孔測定步驟

吸取200

μL樣品待測液于金標微孔中，抽吸5~10次使混合均勻，室溫溫育5

min；溫育結束后，將試紙條吸水海綿端垂直向下插入金標微孔中，室溫溫育5

min，從微孔中取出試紙條，去掉試紙條下端的吸水海綿，進行結果判定。

注：測定步驟建議按照試劑盒說明書。

5.3.2

檢測卡與金標微孔測定步驟

吸取200

μL上述待測液于金標微孔中，上下抽吸5~10次使混合均勻。室溫溫育5

min，將反應液全部加入到檢測卡的加樣孔中，將金標微孔中全部溶液滴加到檢測卡上的加樣孔中，溫育5

min，進行結果判定。

注：測定步驟建議按照試劑盒說明書。

5.4

質控試驗

每批樣品應同時進行空白試驗和加標質控試驗。

5.4.1

空白試驗

準確稱取固體空白試樣0.5

g±0.01

g或量取液體空白試樣0.5

mL±0.02

mL于15

mL離心管中，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。

5.4.2

加標質控試驗

準確稱取固體空白試樣0.5

g±0.01

g或量取液體空白試樣0.5

mL±0.02

mL于15

mL離心管中，加入適量標準工作液（3.3.2），使西地那非參考物質濃度為1.0

μg/g或1.0

μg/mL，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。

準確稱取固體空白試樣0.5

g±0.01

g或液體空白試樣0.5

mL±0.02

mL于15

mL離心管中，加入適量標準工作液（3.3.4），使他達拉非參考物質濃度為1.0

μg/g或1.0

μg/mL，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。

結果判定

通過對比控制線（C線）和檢測線（T線）的顏色深淺進行結果判定。目視判定示意圖見圖1。結果判定也可根據產品說明書進行。

6.1

無效

控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試紙條無效。

6.2

陰性結果

控制線（C線）顯色，檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或檢測線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相當，均表示樣品中不含待測組分或含量低于方法檢測限，判為陰性。

6.3

陽性結果

控制線（C線）顯色，檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色明顯淺或檢測線（T線）不顯色，均表示樣品中待測組分含量高于方法檢測限，判為陽性。

6.4

質控試驗要求

空白試驗測定結果應為陰性，加標質控試驗測定結果應為陽性。

圖1

目視判定示意圖

結論

當檢測結果為陽性時，應對結果進行確證。

性能指標

8.1

檢出限

固體樣品1.0

μg/g，液體樣品1.0

μg/mL。

8.2

靈敏度

靈敏度≥95%。

8.3

特異性

特異性≥90%。

8.4

假陰性率

假陰性率≤5%。

8.5

假陽性率

假陽性率≤10%。

注：性能指標計算方法見附錄A。

其他

本方法分析步驟和結果判定可以根據廠家試劑盒的說明書進行，但應符合或優于本方法規定的性能指標。

本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做限定。但方法使用者應使用經過驗證的滿足本方法規定的各項性能指標的試劑、試劑盒。

本方法參比標準為食品補充檢驗方法BJS201710《保健食品中75種非法添加化學藥物的檢測》、藥品檢驗補充檢驗方法2009030《補腎壯陽類中成藥中PDE-5型抑制劑的快速檢測方法》。

本方法使用西地那非試劑盒可能與那莫西地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、偽伐地那非、伐地那非、硫代艾地那非存在交叉反應；他達拉非試劑盒可能與氨基他達拉非、去甲基他達拉非存在交叉反應；當結果判定為陽性應對結果進行確證。

附錄A

定性方法性能指標計算表

表A.1性能指標計算方法

樣品情況a

檢測結果b

總數

陽性

陰性

陽性

N11

N12

N1.=N11+N12

陰性

N21

N22

N2.=N21+N22

總數

N.1=N11+N12

N.2=N21+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

顯著性差異（c2）

c2=（?N12-N21?-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1

靈敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特異性（p-，%）

p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-靈敏度

假陽性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特異性

相對準確度，%c

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：

a由參比方法檢驗得到的結果或者樣品中實際的公議值結果；

b由待確認方法檢驗得到的結果。靈敏度的計算使用確認后的結果。

N：任何特定單元的結果數，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C為方法的檢測結果相對準確性的結果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價。

本方法負責起草單位：廣東省食品檢驗所。

驗證單位：江蘇省南通市食品藥品監督檢測中心、南京工業大學。

主要起草人：劉海虹、申超群、鄧皇翼、雷毅。