第一篇：水中大腸桿菌的檢測(多管發酵法)

水中大腸桿菌群書的檢測（發酵法）

一、試驗目的：

1.了解和學習水中大腸桿菌的測定原理和測定意義。

2.學習和掌握水中大腸桿菌的檢測方法。

二、試驗原理：

水的微生物學的檢驗，特別是大腸桿菌的檢驗，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時也是評價水質狀況的重要指標。國家飲用水的標準規定飲用水中大腸桿菌群書每升中不超過3個，細菌總數每毫升不超過100個。

水中大腸桿菌的檢驗方法，常用多管發酵發和濾膜法。多管發酵發可運用于各種水樣的檢驗，但操作繁瑣，需要時間長。濾膜法僅用于自來水和深井水。操作簡潔快速，但不適用于雜質較多，易于阻塞濾孔的水樣。

三、實驗器材：

1.水樣：自來水

2.試劑 ：乳糖蛋白胨發酵管內有倒置小套管三倍濃縮乳糖蛋白胨發酵管瓶內有倒置小套管

伊紅美藍或復紅亞硫酸鈉瓊脂平板革蘭氏染液。3.儀器及其它用品：載玻片滅菌帶玻璃塞空瓶滅菌吸管滅菌試管革蘭氏染液顯微鏡香柏油二甲苯擦鏡紙吸水紙滅菌三角瓶等

四、實驗步驟：

第一步：

1.水樣的采集

自來水洗將自來水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌，在開放水龍頭取水流5ｍｈ，以滅菌山角瓶接水取樣以備分析。

2.用發酵法檢查大腸桿菌

（1）生活飲用水的檢驗

①初步發酵試驗：在2個各裝有50ｍｈ的3倍乳糖蛋白胨培養液的三角瓶中，以無菌操作各自加水樣10ｍｈ。搖勻后，37℃培養24ｈ

第二步：

②平板分離：經24ｈ培養后。特產酸產氣及只產酸的發酵管，分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板（EMD培養基上），37℃培養18～24ｈ。大腸桿菌群在EMD平板上，菌落呈紫黑色，具有或略帶或不帶有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深，挑取符合上述特征的菌落進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

第三步 ：

③復發酵試驗：將革蘭氏陰性無芽孢桿菌的菌落的剩余部分接于單倍乳糖發酵管中，為防止遺漏，每管可接種來自同一初發酵管的平板上同一類型菌群1～3個，37℃培養24ｈ，如果產酸又產氣者，即證實有大腸菌群存在。

第四步 ：

④報告：根據證實有大腸菌群存在的復發酵管的陽性管，查表，報告每升水樣品中大腸菌群數（MPN）.

第二篇：5.水中大腸桿菌的檢測(多管發酵法)

水中大腸桿菌群書的監測（發酵法）

一、試驗目的：

1.了解和學習水中大腸桿菌的測定原理和測定意義。

2.學習和掌握水中大腸桿菌的監測方法。

二、試驗原理：

水的微生物學的檢驗，特別是大腸桿菌的檢驗，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時也是評價水質狀況的重要指標。國家飲用水的標準規定飲用水中大腸桿菌群書每升中不超過3個，細菌總數每毫升不超過100個。

水中大腸桿菌的檢驗方法，常用多管發酵發和濾膜法。多管發酵發可運用于各種水樣的檢驗，但操作繁瑣，需要時間長。濾膜法僅用于自來水和深井水。操作簡潔快速，但不適用于雜質較多，易于阻塞濾孔的水樣。

三、試驗材料：

1.培養基：乳糖蛋白胨培養基，伊紅美藍培養基

2.器材：滅菌三角瓶、無菌平皿、無菌吸管、無菌試管等。

四、試驗內容

第一天 ：

1.水樣的采集

自來水洗將自來水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌，在開放水龍頭取水流5ｍｈ，以滅菌山角瓶接水取樣以備分析。

2.用發酵法檢查大腸桿菌

（1）生活飲用水的檢驗

①初步發酵試驗：在2個各裝有50ｍｈ的3倍乳糖蛋白胨培養液的三角瓶中，以無菌操作各自加水樣10ｍｈ。搖勻后，37℃培養24ｈ

第二天 ：

②平板分離：經24ｈ培養后。特產酸產氣及只產酸的發酵管，分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板（EMD培養基上），37℃培養18～24ｈ。大腸桿菌群在EMD平板上，菌落呈紫黑色，具有或略帶或不帶有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深，挑取符合上述特征的菌落進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

第三天 ：

③復發酵試驗：將革蘭氏陰性無芽孢桿菌的菌落的剩余部分接于單倍乳糖發酵管中，為防止遺漏，每管可接種來自同一初發酵管的平板上同一類型菌群1～3個，37℃培養24ｈ，如果產酸又產氣者，即證實有大腸菌群存在。第四天 ：

④報告：根據證實有大腸菌群存在的復發酵管的陽性管，查附錄1或2，報告每升水樣品中大腸菌群數（MPN）

五、思考題

記錄試驗結果，并對所測樣品作出評價。

第三篇：實驗十四水中總大腸桿菌的測定

實驗十四水中總大腸桿菌的測定

1原理

總大腸桿菌群可用多管發酵法或濾膜法檢測。多管發酵法的原理是根據大腸菌群細菌能發酵乳糖，產酸產氣以及具備革蘭氏染色陰性，無芽孢，呈桿狀等有關特性，通過三個步驟進行檢驗，求得水樣中的總大腸菌群數，實驗結果以最可能數（most probable number），簡稱MPN表示。儀器

2.1 高壓蒸汽滅菌器。

2.2 恒溫培養箱，冰箱。

2.3 生物顯微鏡，載玻片。

2.4 酒精燈，鎳鉻絲接種棒。

2.5 培養皿(直徑100mm)，試管(5×150mm)，小倒管，吸管(1，5，10ml)，燒杯(200，500，2000ml)，錐形瓶(500，1000ml)，采樣瓶。

3培養基及染色劑的制備

3.1乳糖蛋白胨培養液：

將10g蛋白胨、3g牛肉浸膏、3g乳糖和5g氯化鈉加熱溶于1000mL蒸餾水中，調節pH為7.2－7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混勻，分裝于試管（內有倒管）中，于121℃高壓滅菌器中滅菌15min，貯存于冷暗處備用。

3.2三倍濃縮蛋白胨溶液：

按上述乳糖蛋白胨培養液的制備方法制備。除蒸餾水外，各組分用量增加至三倍。

3.3品紅亞硫酸鈉培養基

3.3.1貯備培養基的制備

于2000mL燒杯中，先將20-30g瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入

3.5g磷酸氫二鉀及10g蛋白胨，混勻，使其溶解，再用蒸餾水補充到1000mL調節溶液pH至7.2-7.4。趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加10g乳糖，混勻，定量分裝于250或500mL

錐形瓶內，置于高壓滅菌器中，在121℃滅菌15min，貯存與冷暗處備用。

3.3.2平皿培養基的制備

將上法制備的貯備培養基加熱融化。根據錐形瓶內培養基的容量，用滅菌吸管按1：50比例吸取5%堿性品紅乙醇溶液，置于滅菌空試管中；再按1：200比例稱取無水亞硫酸鈉，置于另一滅菌空試管內，加滅菌水少許使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（滅菌）。用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液內至深紅色再褪至淡紅色為止（不宜加多）。將此混合液全部加入已融化的貯備培養基內，并充分混勻（防止產生氣泡）。立即將此培養基適量（約15mL）傾入已滅菌的平皿內，再冷卻凝固后置于冰箱內備用，但保存時間不宜超過2周。如培養基由淡紅色變成深紅色則不能再用。

3.4伊紅美藍培養基制備

于2000mL燒杯中，先將20g瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，再加入2g磷酸二氫鉀及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸餾水補充至1000mL，調節溶液pH值至7.2-7.4，趁熱用脫脂棉或絨布過濾，加入2%伊紅水溶液（0.4g伊紅溶于20mL水中）20ml和0.5%美藍水溶液（0.065g美藍溶于13mL水中）13ml，再加入10g乳糖，混勻后定量分裝于250或500mL錐形瓶內，于121℃高壓滅菌15min，放冷至45℃左右，無菌操作下將此培養基適量傾入已滅菌的空平皿內，待冷卻凝固后，置于冰箱內備用。

3.5革蘭氏染色劑 3.5.1結晶紫染色液：

將20mL結晶紫乙醇飽和溶液（稱取4-8g結晶紫溶于100mL95%乙醇中）和80mL1%草酸銨溶液混合并過濾。該溶液放置過久會產生沉淀，不能再用。

3.5.2助染劑：

將1g碘與2g碘化鉀混合后，加入少許蒸餾水，充分振蕩，待完全溶解后，用蒸餾水補充至300mL。此溶液2周內有效。當溶液由棕黃色變為淡黃色時應棄去。為易于貯備，可將上述碘與碘化鉀溶于30mL蒸餾水中，臨用前再加水稀釋。

3.5.3脫色劑：95%乙醇。

3.5.4復染劑：將0.25g沙黃加到10mL95%乙醇中待完全溶解后，加90mL蒸餾水。4 測定步驟

4.1生活飲用水

4.1.1初發酵實驗：在兩個裝有已滅菌的50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養液的大試管或燒瓶中（內有倒管），以無菌操作加入充分混勻的水樣10mL，混勻后置于37℃恒溫箱內培養24h。

4.1.2平板分離：上述各發酵管經培養24h后，將產酸，產氣及只產酸的發酵管分別接種于伊紅美藍培養基或品紅亞硫酸鈉培養基上，置于37℃培養箱內培養24h，挑選符合下列特征的菌落。

a.伊紅美藍培養基上：深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落：淡紫紅色，中心色較深的菌落。

b.品紅亞硫酸鈉培養基上：紫紅色，具有金屬光澤的菌落；深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紅色，中心顏色較深的菌落。

4.1.3取有上述特特征的群落進行革蘭氏染色 a、用已培養18－24h的培養物涂片，涂層要薄。

b、將涂片在火焰上加溫固定，待冷卻后滴加結晶紫溶液，1min后用水洗去。c、滴加助染劑，1min后用水洗去。

d、滴加脫色劑，搖動玻片，直至無紫色脫落為止（約20－30s），用水洗去。e、滴加復染劑，1min后用水洗去，晾干、鏡檢，呈紫色者為革蘭氏陽性菌，呈紅

色者為陰性菌。

4、復發酵實驗：上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，則挑選該菌落的另一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養液的試管中（內有倒管），每管可接種分離自同一初發酵管（瓶）的最典型菌落1－3個，然后置于37℃恒溫箱中培養24h，有產酸、產氣者（不論倒管內氣體多少皆作為產氣論），即證實有大腸菌群存在。根據證實有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數查表2-5“大腸菌群檢數表”，報告每升水樣中的大腸菌群數。

4.2 水源水

4.2.1 于各裝有5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養液的5個試管中（內有倒管），分別加入10ml水樣；于各裝有10ml乳糖蛋白胨培養液的5個試管中（內有倒管），分別加入

1ml水樣；再于各裝有10ml乳糖蛋白胨培養液的5個試管中（內有倒管），分別加入1ml 1：10稀釋的水樣。共計15管，三個稀釋度。將各管充分混勻，置于37℃恒溫箱內培養24h。

4.2.2平板分離和復發酵試驗的檢驗步驟同“生活飲用水檢驗方法”。

4.2.3根據證實總大腸菌群存在的陽性管數，查附表2-6“最可能數（MPN）表”，即求得每100ml水樣中存在的總大腸菌群數。我國目前系以1L為報告單位，故MPN值再乘以10，即為1L水樣中的總大腸菌群數。

對污染嚴重的地表水和廢水，初發酵試驗的接種水樣應作1：

10、1：100、1：1000或更高倍數的稀釋，檢驗步驟同“水源水”檢驗方法。

如果接種水的水樣量不是10ml、1ml和0.1ml，而是較低或較高的三個濃度的水樣量，也可查表求得MPN指數，再經下面公式換算成每100ml的MPN值。

MPN值＝MPN指數×10（ml）/接種量最大的一管（ml）

表2-5大腸菌群檢數表

接種水樣總量300ml（100ml 2份，10ml 2份）

100mL水量的陽性瓶數

10mL水量的陽性管數

1L水樣中大腸菌群數

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 103 7 11 14 18 22 27 31 36 40

1L水樣中大腸菌群數8 13 18 24 30 36 43 51 60 69

1L水樣中大腸菌群數18 27 38 52 70 92 120 161 230 230

表2-6 最可能數（MPN）表

（接種5份10ml水樣、5份0.1ml水樣時，不同陽性及陰性情況下100ml水樣中細

菌數的最可能數和95％可信限值）

出現陽性份數 10ml 1ml 0.1ml 管 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4

管 0 0 1 2 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 3 0 0 1 1 2 2 3 0 0 1 1 1 2

管 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 2 0

每100ml水樣中 95％可信

細菌數的 最可能數 <2 2 2 4 2 4 4 6 6 5 7 7 9 9 12 8 11 11 14 14 17 17 13 17 17 21 26 22

<0.5 <0.5 <0.57 7

出現陽性份數 管 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

管 2 3 3 4 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5

管 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5

每100ml水樣中 95％可信限值

細菌數的 最可能數 26 27 33 34 23 34 43 33 46 63 49 70 94 79 110 140 180 130 170 220 280 350 240 350 540 920 1600 ≥2400

下限9 9 11 12 7 11 15 11 16 21 17 23 28 25 31 37 44 35 43 57 90 120 68 120 180 300 640

上限78 80 93 93 70 89 110 93 120 150 130 170 220 190 250 310 500 300 190 700 850 1000 750 1000 1400 3200 5800

下限 上限 10ml 1ml 0.1ml

<0.5 11 <0.5 11 <0.5 11 <0.5 15 <0.5 15 <0.5 13 1 1 2 2 3 1 2 2 4 4 5 5 3 5 5 7 9 717 21 21 28 19 25 25 34 34 46 46 31 46 46 63 78 67

第四篇：生物化學實驗報告：Western blotting檢測大腸桿菌重組蛋白

實驗三 Western blotting檢測大腸桿菌重組蛋白

一、實驗目的

利用Western Blotting技術，定性（或定量）檢測苦蕎黃酮醇合酶基因（Flavonol synthase gene, FtFLS）在大腸桿菌表達宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的誘導表達。

二、實驗原理

黃酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）屬于2-ODD家族，催化黃酮醇合成支路中最后一步氧化反應，也是直接合成黃酮醇的反應。FLS可以使二氫黃酮醇在C3鏈中C2和C3之間氧化形成雙鍵，從而生成黃酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate + O2 a Flavonol + succinate + CO2 + H2O。

本實驗采用PCR的方法，在苦蕎黃酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密碼子前引入Kpn ?酶切位點，去掉終止密碼并引入BamH ?酶切位點。克隆引入酶切位點后的FtFLS到表達載體pET-30b(+)質粒中，其表達產物分別在N-末端和C-末端各含有6 × His標簽。重組質粒（pET-30b(+)-FtFLS）經鑒定后轉化表達宿主菌E.coli BL21(DE3)并使用IPTG進行誘導表達。收集誘導0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的產物，經SDS-PAGE后用于考馬斯亮藍R-250染色或Western blotting分析。

Western blotting的標準流程如下：蛋白質首先通過SDS-PAGE胺凝膠電泳分離，通過電泳轉移到固相支持物上（硝酸纖維素膜、PVDF膜和尼龍膜）；將膜上未反應的位點封閉起來，以抑制抗體的非特異性吸附，固定的蛋白質即可與特異性的多克隆或單克隆抗體相互作用并通過放射、生色或化學發光的方法進行定位。

本實驗采用小鼠抗聚組氨酸單克隆抗體（Anti-His tag IgG，一抗）與重組FtFLS蛋白的N-末端和C-末端6 × His發生抗原-抗體特異反應，再利用辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG（peroxidase-Goat Anti-Mouse IgG，二抗）與一抗發生特異結合，最后使用DAB進行顯色。DAB即：二氨基聯苯胺（3, 3'-diaminobenzidine），是過氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB在過氧化氫的存在下失去電子而呈現出顏色變化和積累，形成淺棕色不溶性產物。該方法常用于檢測過氧化物酶的活性，它靈敏度高，特異性好，在免疫組化，原位雜交，Western blotting等膜顯色中 1

應用廣泛。

三、操作步驟 3.1 樣品的制備

原始樣品可為細胞、組織、培養上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測大腸桿菌重組蛋白時細胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關文獻。

材料與試劑：

重組pET-30b(+)-FtFLS質粒、表達宿主菌E.coli BL21(DE3)、LB固體培養基（Kan 50μg/mL）、LB 液體培養基（10mL、50mL）、Kan（50 mg/mL）、IPTG（24 mg/mL）、PBS緩沖液、5 X SDS上樣緩沖液。儀器與設備：

恒溫培養箱、恒溫搖床、超凈工作臺、酒精燈、消毒酒精（75%）、棉球、接種環、臺式離心機、冰盤、Tip（10 μL、200 μL、1 mL）、微量加樣器（10 μL、200 μL、1 mL）、離心管（1.5 mL、10 mL）。操作步驟：

①含重組質粒pET-30b(+)-FtFLS的表達宿主菌E.coli BL21(DE3)劃線于LB 固體培養基（Kan抗性），37℃培養16 h。

②挑選單菌落，接種至10 mL LB培養基（按0.1%加入Kan，10 μL）于37 ℃過夜培養，即為種子液。

③按2 %的接種量（1 mL）將種子液接種到50 mL LB Kan培養基中（按0.1%加入Kan，50 μL），于37 ℃培養OD600至0.5（約2.5 h）。

④加入IPTG至終濃度為1 mmol/L（100 μL），置于25℃連續誘導表達8 h，分別取誘導前0 h，誘導后2 h、4 h、6 h和8 h的培養液5 mL于10 mL離心管中，置于冰水混合物上備用。

⑤誘導完畢后，各樣品于8000 rpm（12000 rpm易爆管）離心5 min收集沉淀，用等體積PBS（5 mL）重懸漂洗細胞2次，收集菌體。

⑥各管分別加入400 μL PBS重懸細胞，加入100 μL 5 X SDS上樣緩沖液，置于沸水浴中10 min（注意防止爆管）。注意事項：

①重組蛋白的誘導表達應進行正確的無菌操作并加入適宜濃度的抗生素，避免可能的污染。

②在合適的鹽濃度下，應保持蛋白質的最大溶解性。

③選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結合的蛋白質復合物和共價鍵二硫鍵。盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。

④制備過程應在低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾。

⑤樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出20ul檢測蛋白質定量用），然后保存與-20°或-80℃中長期保存，但要注意不要反復凍融，因為會使蛋白的抗原特性發生改變。3.2 SDS-PAGE SDS-PAGE（SDS變性不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳）的分離原理則僅根據蛋白質的分子量的差異。因為SDS-PAGE上樣緩沖液含有SDS和巰基乙醇（2-ME）或二巰基赤蘚醇（DTT），其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵、分子內氫鍵、破壞蛋白質的高級結構、形成SDS-蛋白質復合物。該復合物形成榛狀結構，平均每兩個氨基酸殘基結合一個SDS分子，使其帶有大量的負電荷（蛋白質分子本身的電荷完全被SDS掩蓋），從而消除了不同分子之間原有的電荷差別。材料與試劑：

① 分離膠緩沖液（1.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 8.8）。② 濃縮膠緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 6.8）。

③ 30%丙烯酰胺/N, N'-亞甲基雙丙烯酰胺（Arc/Bis）：29.2 g Acr，0.8 g Bis，定容至100 mL。

④ 10%過硫酸銨（W/V），需新鮮配制。

⑤ 2 X 上樣緩沖液（pH 8.0）：含0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）2 mL，甘油2 mL，20% SDS 2 mL（W/V），0.1%溴酚藍 0.5 mL，2-β-巰基乙醇（2-ME）1.0 mL，定容至10 mL。

⑥ 電極緩沖液（pH 8.3）：3.03 g Tris，14.41 g Gly，1.0 g SDS，調整pH后定容至1000 mL。

⑦ 染色液：45%甲醇，10%乙酸，0.25%考馬斯亮藍R-250。⑧ 脫色液：10%（V/V）乙酸，5%（V/V）乙醇。⑨ 封底膠：1g瓊脂糖溶于100 mL電極緩沖液。⑩ 預染標準分子量蛋白質Marker。儀器與設備：

垂直板電泳槽及其附件，電爐，電泳儀，微量加樣器（10 μL），Tip（10 μL）。操作步驟：

① 電泳槽的安裝：將成套的兩塊玻璃板正確放入硅膠條中，夾在電泳槽里，按對角線順序旋緊螺絲（注意分辨上下槽）。用1%的瓊脂糖封底（封于下槽底部），待瓊脂糖凝固后即可制膠。

② 制膠：選擇合適的膠濃度，按下表配制分離膠，灌入兩玻璃板之間，加至距短玻璃板頂端3 cm處，立即覆蓋5 mm左右水層，靜置等待聚合，當分離膠與水層之間的界面重新出現時表明膠已聚合。小心倒掉分離膠上水層，配制濃縮膠后加入玻璃板中，插入梳子并及時補充由于濃縮膠聚合產生的空隙（該過程避免氣泡的產生）。

本實驗選用12.5%的SDS-PAGE膠對重組FtFLS進行分離。

試劑 濃度 分離膠緩沖液 mL 濃縮膠緩沖液 mL Acr/Bis mL

分離膠

7.5% 10% 12.5% 15% 4.05.3

4.08.0

30% 4.01.25 0.75 4

H2O mL 10% AP mL TEMED mL

8.0 0.3

6.7 0.3

5.3 0.3

4.0 0.3

1.3 0.3

3.0 0.15 0.005

0.008 0.008 0.008 0.008 0.008 ③ 點樣：分別在上下電泳槽中倒入電極緩沖液，上槽淹沒短玻璃板，下槽淹沒電極即可。此時，小心拔出梳子，用微量加樣器調整點樣孔之間的濃縮膠（此步驟應檢查電泳槽是否漏液）。使用微量進樣器分別在樣品槽內分別加入預染的標準分子量蛋白質、誘導前0 h，誘導2 h、4 h、6 h和8 h后處理好的樣品18 μL（上樣總體積一般不超過15 μL，加樣孔的最大限度可加20 μL樣品）。

④ 電泳：接通電源，調節電壓至100 V，恒壓電泳；待指示劑進入分離膠后，調節電壓至200 V恒壓電泳。待指示劑在分離膠中遷移5-6 cm左右時，停止電泳。剝膠：小心剝膠，將濃縮膠（濃縮膠影響操作）和分離膠上不用的部分切去（便于識別），見圖3和圖4.⑤ 染色：凝膠經蒸餾水漂洗1次后加入染色液，電爐加熱處理10-20 min染色。⑥ 脫色：使用蒸餾水漂洗取出染色液，加入脫色液，電爐加熱脫色至出現清晰的蛋白條帶。注意事項：

①上樣總體積一般不超過15?L，膠孔的最大限度可加20?L樣品。

②微量加樣器應貼壁吸取樣品，避免吸進氣泡；將微量加樣器Tip頭插至加樣孔中緩慢加入樣品，避免樣品溢出。

③電泳設備應注意檢查正負極、是否短路或接觸不良、是否漏液、電流電壓大小（電流強度會隨電泳的進行有所降低）。

④電極緩沖液和AP應新鮮配制，上下槽緩沖液不可混用（電泳完畢分別收集）。3.3 轉膜與雜交

雜交膜的選擇是決定Western blotting成敗的重要環節。應根據雜交方案、被轉移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質、孔徑和規格的雜交膜。

用于Western blot 的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜（NC）和聚偏氟乙烯（PVDF）膜。NC膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物，在低離子轉移緩沖液的環境下，大多數帶負電荷的蛋白質會與膜發生疏水作用而高親和力的結合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結合的蛋白還可以被洗脫下來。根據被轉移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的NC膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結合就越牢固。通常用0.45 μm和0.2 μm兩種規格的NC膜。大于20 kDa的蛋白可用0.45 μm 的膜，小于20 kDa的蛋白用0.2 μm的膜。PVDF 膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和1-5 sec。蛋白質常用的轉移方法主要有兩種：槽式濕轉和半干轉移。前者操作容易，轉移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉移，所用緩沖液少。以下為槽式濕轉的操作步驟。材料與試劑：

材料：PVDF膜，Whatman 濾紙，搪瓷盤，一次性PE手套，鑷子，玻棒，試劑：轉移緩沖液 pH 8.3（25 mmol/L Tris，0.2 M 甘氨酸，20%甲醇），1000 mL 10 X TBS緩沖液pH 7.6（24.2 g Tris base，80 g NaCl，用1N HCl調pH=7.6），脫脂奶粉、BSA或試劑盒自帶的蛋白質干粉，洗滌緩沖液（1 X TBS，0.1% Tween-20），封閉緩沖液（1×TBS，0.1% Tween-20，5% w/v脫脂奶粉或BSA），抗體稀釋液[1×TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA（多抗）或5%脫脂奶粉（單抗）]。儀器與設備：

轉膜電泳儀及其附件，雜交儀，培養皿，凝膠成像系統。操作步驟： 轉膜

① 準備轉移緩沖液，依據膠的大小剪取膜和濾紙6片，將凝膠和PVDF膜和濾紙放入轉移緩沖液中平衡10min。

② 裝配轉移三明治（海綿→3層濾紙→膠→膜→3層濾紙→海綿）：在加有轉移液的搪瓷盤里放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜；將夾子打開使一面保持水平（規定為正極）。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回搟幾遍以

搟走里面的氣泡。在墊子上墊三層濾紙，一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。依次加膜、加膠，再在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡，見圖5。

③ 將轉移槽置于冰浴中，放入三明治，加轉移緩沖液，插上電極，100V電泳1h（電流約為0.3 A）。

④ 電泳結束，觀察預染的蛋白質Marker是否轉移到膜上。雜交

① 用25-50 mL洗滌緩沖液洗滌硝酸纖維素膜5 min, 1 次。

② 封閉硝酸纖維膜：加封閉緩沖液25 mL，37℃封閉2 h。用量以浸沒整張膜為準，圖6。

③ 抗體的稀釋（已依稀）：小鼠抗聚組氨酸單克隆抗體使用100 μL抗體稀釋液進行溶解稀釋，儲存與4℃。（一般特異性抗體濃度1 μg/mL）

④ 硝酸纖維膜孵育一抗：加入20 mL抗體稀釋液，將25 μL一抗加入培養皿中（已完全覆蓋膜為準），37℃孵育2 h左右，見圖7和圖8。（視實驗時間，也可以4℃孵育過夜）

⑤ 用25 mL洗滌緩沖液振蕩洗滌硝酸纖維素膜3 次, 每次5 min。

⑥ 硝酸纖維膜孵育二抗：加入25 mL抗體稀釋液，將25μL二抗全部加入培養皿中（以完全覆蓋膜為準），37 ℃孵育2 h，見圖7和圖8。

⑦ 用30 mL洗滌緩沖液振蕩洗滌硝酸纖維膜4 次, 每次5 min。

⑧ DAB 顯色：按每2 mL蒸餾水加顯色劑A，B，C 各１滴，混勻。混勻后加至膜上。室溫顯色。一般顯色1－30 分鐘。若無背景出現則可繼續顯色。顯色后用蒸餾水洗滌以終止反應。注意事項：

①操作中戴手套，不要用手觸膜。

②如檢測小于20 kDa的蛋白應用0.2μm的膜，并可省略轉移時的平衡步驟。③某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時可用1.0% BSA代替Tween-20。④關于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩蓋抗體結合能力；0.3~3% BSA in PBS：低的內源性交叉反應性。

⑤如用0.1% Tween 20、0.02% NaN3 in PBS or TBS作封閉劑和抗體稀釋液，抗體檢測后可進行蛋白染色。

⑥如要同時檢測大分子量和小分子蛋白，最好用梯度膠分離蛋白。

四、實驗結果

4.1 考馬斯亮藍顯色結果

4.2 DAB顯色結果

五、討論與分析

1.考馬斯亮藍顯色結果

由圖可知，其變化趨勢是目的條帶顏色越來越深，條帶寬度也逐漸變寬。說明隨著培養時間推移，產生的目的蛋白越來越多，也就意味著轉入的基因得到表達。而目的條帶寬度在6h以后變化已經不明顯，說明此時目的蛋白的表達已達到接近峰值。實驗結果的背景色偏深，但還不影響結果的判定。2.DAB顯色結果

由于顯色結果并不理想，不能清晰反映我們實驗設計所需要的結果。上圖顯色結果為繪制的示意圖。主要可能是因為一抗孵育時間較短導致，也可能是由于蛋白樣品本身上樣量不足或蛋白濃度較低，以及轉膜轉印效率不夠高。另外，也可能由于以下這些方面沒有嚴格做到影響了實驗結果：

A制作凝膠時，嚴格按照配方制作，倒膠時做到既快又穩，防止產生氣泡。同時，制膠前應洗凈玻板并使其完全干燥，否則會影響實驗結果。

B進入雜交階段，重要的是控制溫度和孵育時間，在孵育之前，封閉也是必不可少的步驟。顯色效果與各個步驟都是密不可分的，但一抗、二抗品質與用量尤為重要。這一步必須尤為仔細。

C 當進入轉膜階段時，注意轉移三明治的順序，海綿、濾紙、膠、膜，濾紙，海綿。還需要注意的是一定要驅趕完海綿里的氣泡，不然會造成短路。

D為提高實驗準確度樣品應按照以下標準：樣品不能反復凍融，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程，提高抗濃度。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

第五篇：藍點檢測法

藍點檢測法

藍點檢測液的配制：

取1克鐵氰化鉀 【分子式：K3Fe(CN)6】（赤血鹽）+10ml水溶解 再加5ml硝酸混合，然后加水到100ml即可。

取滴管滴幾點藍點檢測液到檢測物表面，若半分鐘內沒有藍點出現既為合格。{0.2克鐵氰化鉀 【分子式：K3Fe(CN)6】（赤血鹽）+2ml水溶解 再加1ml硝酸混合，然后加水到20ml即可。}

藍點檢測液

不銹鋼清洗鈍化膏

藍點檢測技術要求及方法

一． 技術指標：

1.外觀：橘黃色。

2.藍點試驗：合格。

二． 檢測方法：

1.試片：不銹鋼試片（40cmⅹ40cmⅹ0.2cm）

2.試驗方法：將鈍化膏品涂于不銹鋼試片表面，涂層厚度約1-2mm,放置通風處8-12小時后，取出試片用凈水沖洗﹑晾干。將一滴藍點試劑滴于試片表面，開始計時，規定的時間內滴液點不出現藍點，即為藍點試驗合格。

GB150-1998第10.4.6、TCED41002-2000《化工設備圖樣技術要求》一書中2.2.3的第6條中提到"有防腐蝕要求的不銹鋼容器，在壓力試驗及氣密性試驗合格后，表面需清除油污做酸洗鈍化處理；必要時，應對所形成的的鈍化膜進行藍點檢驗，無藍點為合格。”2005.06.22