第一篇：細胞研究論文

骨缺損(尤其是大型骨缺損)的治療，由局部傷情復雜和缺乏理想的修復材料，一直是困擾臨床醫生和基礎醫學工作者的一大難題，而尋找一種盡可能達到或接近自體骨移植效果的理想的骨替代材料更是無數學者熱切探索、孜孜以求的目標。近年來日趨活躍的骨組織工程(bone tissue engineering)技術為這一課題的研究帶來了新的亮點和希望。目前動物實驗已能從骨膜、骨髓等定向性骨祖細胞(determined osteogenic precursor cells, DOpC)密集處分離培養出成骨細胞，經體外擴增并與載體結合，回植體內骨缺損處取得骨缺損修復的成功［1］。與此同時，基于對患者易接受性、可操作性和更簡單易行性等方面的考慮，研究者又開始把目光投向誘導性骨祖細胞(inducible osteogenic precursor cells, IOpC)。其中，在體內分布廣泛、數量巨大、部位表淺、取材方便、培養傳代易行、分裂增殖迅速的成纖維細胞首先成為了研究的焦點。由于目前許多相關研究尚處于實驗階段，為此，本文著重就成纖維細胞的生物學特性及其成骨作用等作一綜述。

1　成纖維細胞的來源及其生物學特性

成纖維細胞(fibroblast)是結締組織中最常見的細胞，由胚胎時期的間充質細胞(mesenchymal cell)分化而來。在結締組織中，成纖維細胞還以其成熟狀態—纖維細胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定條件下可以互相轉變。

不同類型的結締組織含成纖維細胞的數量不同。通常，疏松結締組織中成纖維細胞的數量比同樣體積的致密結締組織中所含成纖維細胞的數量要少，故分離培養成纖維細胞多以真皮等致密結締組織為取材部位［2，3］。

成纖維細胞形態多樣，常見的有梭形、大多角形和扁平星形等，其形態尚可依細胞的功能變化及其附著處的物理性狀不同而發生改變。成纖維細胞胞體較大，胞質弱嗜堿性，胞核較大呈橢圓形，染色質疏松著色淺，核仁明顯。電鏡下，其胞質可見豐富的粗面內質網、游離核糖體和發達的高爾基復合體，表明它具有合成和分泌蛋白質的功能。成纖維細胞尚可合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、網狀纖維及有機基質。它合成的前膠原蛋白分子經內切酶作用，聚合和重排，可形成與成骨細胞合成分泌的膠原原纖維一樣具有64nm(640?)周期橫紋的膠原原纖維，膠原原纖維經互相粘合形成膠原纖維。經檢測，這兩種細胞合成分泌的膠原纖維均是Ⅰ型膠原纖維，在形態和生化結構上完全相同［4,5］。

處于成熟期或稱靜止狀態的成纖維細胞，胞體變小，呈長梭形，粗面內質網和高爾基復合體均不發達，被稱為纖維細胞。在外傷等因素刺激下，部分纖維細胞可重新轉變為幼稚的成纖維細胞，其功能活動也得以恢復，參與組織損傷后的修復。另外，在結締組織中，仍保留著少量具有分化潛能的間充質細胞，它們在創傷修復等情況下可增殖分化為成纖維細胞。

2　成纖維細胞在一般創傷修復中的表現

各種創傷均會造成不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損，必須通過細胞增生和細胞間基質的形成來進行組織修復。在此修復過程中，成纖維細胞起著十分重要的作用。以傷口愈合過程為例，成纖維細胞通過有絲分裂大量增殖，并從4～5天或6天開始合成和分泌大量的膠原纖維和基質成分，與新生毛細血管等共同形成肉芽組織，填補傷口組織缺損，為表皮細胞的覆蓋創造條件。在傷口愈合中，成纖維細胞主要來源于真皮乳頭層的局部成纖維細胞和未分化的間充質細胞，以及血管周圍的成纖維細胞和周細胞。內臟損傷時，參與修復過程的成纖維細胞多來自間質和包膜，以及粘膜下或漿膜下層的結締組織。有人認為創傷愈合過程中傷處聚集的大量成纖維細胞，一方面是由成纖維細胞通過分裂增殖而來，另一方面，更多地是由鄰近的間充質細胞、纖維細胞和毛細血管周細胞等演變或游走到傷處。在創傷修復的后期，成纖維細胞通過分泌膠原酶參與修復后組織的改建。在某些病理條件下，以成纖維細胞為主要細胞成分的肉芽組織或增生組織塊還可以在非骨組織內發生鈣化，引起異位骨化(ectopic ossification)。但對于異位骨化的參與細胞及其機制尚不十分清楚，未分化間充質細胞、成纖維細胞、內皮細胞和毛細血管周細胞等可劃歸為誘導性骨祖細胞的細胞都有可能參與這一過程［6，8］。

3　成纖維細胞在骨創傷修復過程中的表現

最簡單和常見的骨創傷即是骨折，其愈合過程須經過炎性反應、清掃、纖維骨痂和骨性骨痂4個階段［4］。不同階段參與的細胞主體不同。成纖維細胞從骨折第3天起就出現于骨折局部血腫中［6］，骨折后5天即在機化血腫及骨折斷端的間隙及其周圍大量存在，是參與纖維骨痂階段的主要細胞成分［4，5］。在此階段成纖維細胞一方面大量分裂增殖，一方面又合成和分泌大量Ⅰ型膠原，使肉芽組織逐步變成疏松的結締組織，將骨斷端包圍起來，形成接合兩骨折斷端的巨大的纖維骨痂。然而，這種由無數成纖維細胞和豐富的肉芽組織為主體構成的纖維結締組織卻不會演變為在其它組織創傷修復時常見的瘢痕組織，而是通過鈣鹽結晶在其內部不斷沉積，逐漸演變為骨性骨痂，使骨折局部的修復達到骨性愈合，恢復骨組織的結構。此時，骨折愈合部只有骨組織而不再存在成纖維細胞［4，5，9～11］。

4　成纖維細胞的成骨作用

成纖維細胞在骨折愈合過程中不同于其它組織創傷修復的表現，以及在某些病理條件下可以參與異位骨化［6，7］，使人們對成纖維細胞的分化能力、鈣化骨化能力以及在成骨過程中其成骨能力如何發揮、細胞演變的最終歸宿如何等等問題產生了濃厚的興趣。對成纖維細胞成骨能力的研究也正是開始于對骨折愈合過程中成纖維細胞表現的觀察。

對骨折局部骨形成區的電鏡觀察顯示，除了成骨細胞在此發揮成骨作用外，成纖維細胞確實也存在著類似的成骨表現［4，5，9～13］。例如，在其線粒體內可清晰見到鈣鹽顆粒，部分內質網腔內可見成熟的膠原纖維，分泌到其四周的膠原纖維內可見高密度的鈣鹽結晶沉積。不僅如此，成纖維細胞還能象成骨細胞一樣產生基質小泡并引起小泡內的鈣鹽沉積。鈣化的基質小泡形成叢毛球狀的鈣球，鈣球隨后合并、融合為骨組織。以上種種現象表明，成纖維細胞與成骨細胞一樣具備提供鈣鹽沉積及骨形成所必需的條件。在從纖維性骨痂到骨性骨痂的演變過程中，成纖維細胞也隨之演變為骨細胞，與成骨細胞的歸宿相一致。但二者在演變過程中的表現又不盡相同，主要有以下幾點可資鑒別［9，13］：①成纖維細胞及其細胞核均呈不規則的橢圓形或長方形，而成骨細胞及其細胞核則為邊緣比較光整的橢圓形；②成纖維細胞均單獨存在，細胞之間有眾多的膠原纖維相隔，成骨細胞則以連續排列的形式出現；③成纖維細胞的細胞質內溶酶體少見，而成骨細胞的細胞質內則常有溶酶體可見；④成纖維細胞四周的骨組織都由叢毛球狀鈣球或針狀鈣鹽結晶組成，成骨細胞則都有一面緊貼比較成熟與致密的骨組織；⑤成骨細胞是一個一個地被骨組織(類骨質)包圍變為骨細胞，而成纖維細胞則可以是兩個或兩個以上同時被骨組織包圍在一個陷窩內，然后再隨著細胞之間基質的鈣化而分隔為各占一個骨陷窩。

對成纖維細胞的成骨作用，有學者認為這是成纖維細胞的固有特性在骨折這一特定情況下得以表達的結果［9，11］。骨折局部活的和失活的骨組織及軟骨組織，以及骨基質中的某些大分子都有可能誘導成纖維細胞表達其成骨作用進而演變為骨細胞［14，15］。較早在骨基質中發現的骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMp)即對成纖維細胞有一定的誘導作用。對骨折愈合中BMp作用的研究［16，17］，表明創傷使內源性BMp呈階段性合成與釋放，并誘導周圍軟組織中的間充質細胞或/和成纖維細胞等向成骨方向轉化。應用pAp法發現［16］，骨折后第3、5天局部纖維肉芽組織中的成纖維細胞樣間充質細胞內以及第14天新生骨小梁間纖維組織中的成纖維細胞樣間充質細胞內，都與成骨細胞、軟骨細胞和骨基質一樣存在BMp，表明這些成纖維細胞樣間充質細胞已被誘導為可合成分泌BMp、具有成骨作用的細胞。而Sampath［15］從牛骨基質中分離提純得到的成骨素對成纖維細胞的骨誘導能力更是超過了BMp和當時已知的其它骨生長因子。

成纖維細胞在其成骨作用得以表達后，可能通過兩種方式成骨：①膜內成骨；②在環繞軟骨的纖維層內成骨。開始分泌膠原纖維后，參與成骨的成纖維細胞只有兩個歸宿［4，5，9，13］：①變性、死亡、碎裂直至消失，這種演變發生早、范圍廣，故從纖維性骨痂形成開始，就逐漸有基質成分發生鈣化，進而轉變為骨基質；②演變為骨細胞，這一過程出現較晚，并穿插在前一過程之中，故在形成骨組織的細胞成分的同時，還使豐富的纖維骨痂演變為骨性骨痂，形成骨組織。但這種由成纖維細胞演變成的骨細胞，其結局如何、其生物學特性與由成骨細胞演化而來的骨細胞是否相同仍不清楚。例如，骨細胞從骨陷窩脫離后，可恢復為功能活躍的成骨細胞，再次參與骨組織的形成；而由成纖維細胞演變成的骨細胞在脫離骨陷窩后，是成為成骨細胞還是恢復為成纖維細胞、此時是否還具備成骨作用等一系列問題尚缺乏研究。

5　成纖維細胞體外培養的生物學特性［18］

成纖維細胞的分離培養一開始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究細胞的老化、各種外來因子對細胞的損傷、細胞在體外條件下的惡性轉化、以及某些先天性代謝異常、酶缺陷等。由于皮膚成纖維細胞易于獲取，又易于在體外生長，故目前皮膚成纖維細胞培養已在基礎醫學和臨床醫學研究中得到較廣泛的運用，其分離培養技術已相對成熟，對其體外生長規律也有了較全面的認識。

成纖維細胞的原代培養可用酶消化法或組織塊法，其中組織塊法又因其操作簡便、條件易于控制而應用更為普遍。通常，以酶消化法獲得的成纖維細胞懸液在接種后5～10min即可見細胞以偽足初期附著，與底物形成一些接觸點；然后細胞逐漸呈放射狀伸展，胞體的中心部分亦隨之變扁平；最快者大約在接種后30min，細胞貼附底物即較為完全，呈現成纖維細胞的形態。采用組織塊法則大約在接種后2～3天［2，3］到1周左右，在接種的皮膚組織塊周圍長出細胞。待細胞融合成片，鋪滿培養容器底壁大部分時即可進行傳代。一般都采用胰蛋白酶(trypsin)，將成纖維細胞從底壁消化下來后分瓶作傳代培養。成纖維細胞在體外培養條件下能保持良好的分裂增殖能力。細胞分裂時變為球形；分裂后又平鋪在附著物的表面成為有突起的扁平細胞。體外培養的成纖維細胞，其生命期限與物種等因素有關。例如：人胚成纖維細胞約可培養50代；恒河猴皮膚成纖維細胞能傳代超過40代；雞胚成纖維細胞則只有少數能培養30代；而小鼠成纖維細胞多數只能生長8代左右。另外，從老年個體取得的成纖維細胞的壽命要比取自年輕者短。由于在細胞傳代和進行體外培養時，細胞的生物學特性會逐漸發生一些不同于體內的改變，故通常只將前10代視這正常細胞，可在此時將生長旺盛的成纖維細胞凍存起來，以備將來復蘇使用，這在將培養的細胞由動物實驗向人體實驗過渡的過程中必須給予足夠的重視。

6　成纖維細胞在體外培養中的成骨作用

徐榮輝［2］等通過體外培養家兔皮膚成纖維細胞發現，經傳代培養的成纖維細胞至第8天時，其細胞集落中有不透光的骨小結節形成；到37天時，小結節擴大、延伸，形成骨小梁樣結構。經活體四環素標記顯示，所形成的結構為新生骨組織。他們還注意到，成纖維細胞在參與骨形成的過程中并無分化為成軟骨細胞或成骨細胞的明確跡象，故推測并未發生此種分化，而成纖維細胞之所以能發揮成骨作用，很可能是受某些誘導因素作用的緣故。他們認為用以培養成纖維細胞的中厚皮片中混雜存在的上皮細胞(或/與內皮細胞)，可能是誘導成纖維細胞形成骨組織的一種誘導因素。而Friedenstein［6，19］較早的實驗則認為，屬于誘導性骨祖細胞之一種的成纖維細胞，在上皮細胞(如膀胱上皮)或脫鈣骨基質等誘導因子作用下，可以分化為成骨細胞進而形成骨組織。鄧廉夫［20］等分離培養取自關節內的損傷性和晚期骨關節炎性的滑膜細胞，發現其中的成纖維細胞樣細胞增殖迅速，呈束狀或交叉鋪展并可形成多層結構，細胞表面有其分泌物形成的不透光結節，經四環素標記、ARS(Alizarinred s)和甲苯胺藍(Toluidine blue)染色，顯示結節為新生骨組織。在缺乏常規的誘導因子——上皮細胞的作用下，取自滑膜的成纖維細胞樣細胞也能發生成骨作用，他們推測是在關節損傷后或骨關節炎的發生與發展過程中，改變的關節微環境(如TNF樣活性物質增多等)可能會觸發滑膜的成纖維細胞與骨形成相關的多基因表達，使其向成骨型細胞分化，這樣，滑膜成纖維細胞樣細胞在體內時即已具備成骨性能，故在培養條件下可發揮成骨作用。Dodda［21］等的研究則指出，變性滑膜細胞多種細胞因子和生長因子的表達、關節液內多種細胞因子的出現，可能是滑膜成纖維細胞樣細胞成骨表型表達的重要始動因素。這些相關的研究表明成纖維細胞成骨表型的表達可能存在著較復雜的調控機制，而其誘導因素也是多樣的。

為獲取大量具有成骨表型的成纖維細胞并了解其轉化機制，鄧廉夫［22］等將分離純化的人皮膚成纖維細胞置于加有不同濃度EGF、IL-

6、TNF-α、BMp-2的培養液中進行體外培養，采用生物化學、組織化學和電鏡觀察等方法檢測成纖維細胞成骨性標記物的形成狀況，發現TNF-α和BMp-2聯合應用，可使成纖維細胞分泌堿性磷酸酶、骨鈣素及膠原纖維的量增加；成纖維細胞可由梭形向圓形或多突形轉化，蛋白分泌旺盛；細胞外基質中，豐富的膠原纖維定向或雜亂排列，其間散在較多的鈣顆粒；細胞可重疊交織形成多層結構，其表面有分泌顆粒和鈣鹽結晶堆積，并不斷融合擴大成骨結節，表明TNF-α和BMp-2可以誘導成纖維細胞成骨。但這種完全由成纖維細胞經誘導而形成的骨組織，在缺乏典型的成骨細胞參與下是否能在體外或植入體內后經改建成為成熟的板層骨及其改建過程如何?仍有待進一步研究。

7　展望

盡管成纖維細胞受哪些因素誘導可以產生成骨作用、這些因素的誘導方式及其機制如何以及成纖維細胞在骨形成中是否分化為成骨細胞等等問題尚未完全解決，但成纖維細胞經誘導可以形成骨組織這一現象已逐漸為廣大科學工作者所接受。由于成纖維細胞直接參與了骨折愈合過程中纖維性骨痂的形成，其自身又具備被誘導成骨的能力，可以設想，利用成纖維細胞分布廣泛、取材方便、對機體損傷較小、體外培養容易成活、增生繁殖較快等較其它具有成骨作用的細胞(如骨膜成骨細胞、骨髓基質細胞等)優越之處，在體外大量培養擴增成纖維細胞，并施以有效的誘導因素(如上皮細胞、TNG-α和BMp等)使其具備成骨效能，然后與合適的生物材料載體復合，同時使該復合體在體外或體內保持良好的成骨能力并進行一定程度的成骨，則有望獲得具有一定的生物力學支撐強度而成骨作用又保持活躍的“活骨”復合體，用以替代自體骨或異體骨回植體內治療難以自身修復的較大的骨缺損，這無疑將為骨缺損的修復治療開辟一條新的有輝煌前景的道路。在組織工程技術和生物材料科學已有較大發展的今天，這一設想是極有可能實現的。當然，從目前所處的實驗階段過渡到臨床應用尚有很大一段距離，需要解決的問題還很多，而且隨著研究的展開和深入，問題可能還會越來越多，但這確實是一項很有臨床應用價值和社會、經濟效益的重大課題，值得廣大基礎醫學工作者和臨床科研人員為之而努力。

第二篇：皮腔血管細胞研究論文

經皮腔內血管成形術(pTA)是治療冠狀動脈及周圍動脈狹窄的有效手段,但約有25%～60%的病人術后發生再狹窄。金屬內支架的應用降低了pTA術后急性閉塞的發生率,但并未能徹底解決再狹窄的問題代寫論文。大量實驗研究及臨床觀察表明再狹窄與血栓形成、內膜增厚和血管重構有關,內皮細胞的損傷、修復及功能改變在其中扮演重要角色。

一、內皮損傷、血栓形成與再狹窄

pTA可造成血管損傷，內皮的剝脫造成內皮下組織的暴露,血小板立即通過Von Willebrand因子（VWF）黏附于內皮下的基質,隨后發生聚集并釋放α顆粒成分,其釋放的血小板衍生生長因子(pDGF)可能與中膜平滑肌細胞的激活和遷移有關［1］。最近的研究表明血小板減少可抑制已激活的平滑肌細胞從中膜向內膜遷移。由內皮損傷引發的凝血過程將形成附壁血栓,血栓的形成不僅可造成血管的急性閉塞,而且為平滑肌細胞內遷提供了框架,血栓的機化可直接引起內膜增厚,而且血栓中的凝血酶本身就是強力的平滑肌細胞致分裂原［2］。實驗證明損傷部位內皮的早期重建可抑制血小板附著和血栓形成［3］。

二、內皮細胞和內膜增厚

血管損傷后出現的組織愈合反應可造成不同程度的內膜增厚,其中包括3種主要成分:平滑肌細胞、內皮細胞及細胞外基質。損傷后30分鐘就可以檢測到平滑肌細胞早期激活的標記——核原癌基因的表達［4］, 活化的平滑肌細胞從收縮表型轉向合成表型，從而引發平滑肌細胞的增生遷移和基質的合成。平滑肌細胞增生后向內膜遷移，遷移到內膜的平滑肌細胞部分繼續增生。有作者認為平滑肌細胞的增生和分裂是兩個不同的機制［5］，一些因素只影響其中一個而不影響另一個，pDGF是平滑肌細胞向內膜遷移強力的趨化因子，成纖維細胞生長因子b（bFGF）則是平滑肌細胞的致分裂原。平滑肌細胞要穿過細胞外基質和彈力層才能到達內膜，其遷移過程與纖維蛋白溶解酶原激活物及金屬蛋白酶（MMp）的增加有關。

三、內皮細胞與血管重構

四、內皮細胞損傷、修復及功能異常

五、加快重內皮化、促進內皮細胞功能恢復

蛋白激酶C（pKC）是廣泛存在于細胞內的信號傳遞物質，是內皮細胞增殖所必需的,用12-豆蔻酸-13-乙酸佛波酯直接活化內皮細胞pKC，發現內皮細胞黏附、伸展及移行能力均增強，而用pKC抑制劑則降低了內皮細胞的再生能力，可見pKC激活劑可作為促進重內皮化的一種方法。

六、金屬內支架和血管內皮化

金屬內支架的應用大大減低了pTA術后的急性動脈閉塞，其形態穩定性限制了血管的回縮，從而防止了不利的血管重構，但金屬內支架本身具致凝性，置入血管后需長期抗凝治療，而且內支架置入并未徹底解決再狹窄的問題，目前認為pTA術后再狹窄是內膜增生和血管重構雙重作用的結果，而內支架置入后再狹窄則主要由內膜增生引起［26］。為阻止內膜增厚，許多學者用帶有滌綸被膜的內支紲進行實驗研究和臨床探索，但一直沒有肯定的結果，Schurmann等［27］的實驗研究發現，與普通支架相比，被膜式支架引起了更嚴重的內膜增生和炎癥反應；Maynar等［28］的一組股動脈臨床資料也表明被膜式支架的通暢率并不理想。支架置入部位的早期內皮化可能預防血栓形成和再狹窄。加速支架內皮化的方法目前主要有兩種,一是支架置入后局部灌注藥物或導入基因,常用的是VEGF；另一方法是支架置入前在體外先種上內皮細胞［29-31］，可選用轉基因內皮細胞進行種植［30，31］，此法最大的障礙是支架置入過程中內皮細胞的丟失［30，31］，但支架金屬絲側面往往有內皮細胞殘留，這些細胞可重新增殖并覆蓋支架［15,31］。

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第三篇：細胞免疫學論文

【摘要】 作為一種具有靶向性的生物大分子，單克隆抗體始終是人們關注的熱點之一，被廣泛用于治療腫瘤、病毒感染和抗移植排斥等。但鼠源單克隆抗體的臨床應用受限于誘導產生人抗鼠抗體、腫瘤滲入量低、親和力低和半衰期短等。隨著分子生物學技術的發展及其向各學科的滲透，通過基因操作技術對抗體進行改造，可使其適用于多種疾病的治療。抗體人源化已經成為治療性抗體的發展趨勢，同時各種抗體衍生物也不斷涌現，它們從不同角度克服了抗體本身的應用局限，也為治療人類疾病提供了利器。本文簡要介紹上述技術的基本原理、特點和治療性抗體的研究進展。

【關鍵詞】人--鼠嵌合抗體 生物導彈 人源化抗體 雙特異性抗體 【正文】

一、治療性抗體技術的研究背景 2000年前，人們將自白喉桿菌培養上清液中分離到的可溶性毒素注入馬體內，發現得到的抗血清可以治療白喉，這是第一個用抗體治療疾病的例子。隨著免疫學和分子生物學技術的發展，以及抗體基因結構的闡明，DNA 重組技術開始被用于抗體的改造，人們可以根據需要對以往的鼠抗體進行相應的改造，以消除抗體應用的不利性狀或增加新的生物學功能，還可用新的技術重新制備各種形式的重組抗體，標志著基因工程抗體時代的來臨。自第一個基因工程抗體———人--鼠嵌合抗體于1984 年誕生以來，新型基因工程抗體不斷出現，包括人源化抗體、單價小分子抗體（Fab、單鏈抗體、單域抗體等）、多價小分子抗體（雙鏈抗體、三鏈抗體、微型抗體等）、某些特殊類型的抗體（雙特異抗體、抗原化抗體、細胞內抗體等）及抗體融合蛋白（免疫毒素、免疫黏連素等）等。用于制備新型抗體的噬菌體抗體庫技術成為繼雜交瘤技術之后生命科學研究中又一突破性進展。在噬菌體抗體庫的基礎上，近年來又發展了核糖體展示抗體庫技術，利用核糖體展示技術篩選抗體的整個過程均在體外進行，不經過大腸桿菌轉化步驟，因此可以構建高容量、高質量的抗體庫，更易于篩選高親和力抗體和利用體外進行的方法對抗體性狀進行改造，核糖體展示抗體庫技術代表了抗體工程的未來發展趨勢。

二、各種抗體治療作用的機理與應用 2.1 抗體的基本組成

抗體的基本單位是由4 條肽鏈組成的對稱結構，包括2 條相同的重鏈和2 條相同的輕鏈。重鏈和輕鏈分別由可變區和恒定區組成。可變區中的互補決定區與抗體和抗原結合的多樣性直接有關，而恒定區的結構與抗體的生物學活性相關。在少數情況下，抗體與抗原結合后可以對機體直接起保護作用，如用抗體中和毒素的毒性，但在多數情況下需要通過效應功能滅活或清除外來抗原。抗體的效應功能有2 類，一類是通過激活補體，產生多種生物學效應，如細胞裂解、免疫黏附及調理作用，促進炎癥反應；另一類是通過抗體分子中的Fc 段與細胞表面Fc 受體的相互作用，通過其Fc段分別介導調理作用或抗體依賴性細胞毒作用。此外，治療性抗體的效應和作用機理直接取決于它所識別的抗原決定簇，例如治療非何杰金氏B細胞淋巴瘤的抗CD20 抗體能影響細胞膜上離子通道的功能，從而調節細胞的分化、增殖和凋亡。

由于多克隆抗體本身的局限性，所以直到單克隆抗體出現，抗體用于抗腫瘤治療才真正得以實現。自從1978 年成功制備出第一株抗黑色素瘤單抗以來，相繼出現了抗胃腸癌、肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、神經膠質瘤等的單克隆抗體。單克隆抗體殺傷腫瘤細胞的機制可能是抗體依賴性細胞介導的細胞效應（ADCC）及補體依賴性細胞溶解作用（CDC）。單克隆抗體與藥物、毒素或放射性物質偶聯，成為一種全新的“生物導彈”，可用于導向治療，已越來越受到重視。另外，用單抗給予T 細胞所必需的重要表面信號分子交聯的刺激信號和生長信號，體外誘導腫瘤特異性細胞毒T 淋巴細胞，可用于特異性、被動性的免疫治療。

自身免疫病多與單或寡克隆抗體的異常增多有關。利用基因工程技術可制備針對這些異常抗體獨特型的抗抗體或與自身抗體結合并抑制其作用，或制備能模擬抗原的內影像抗體用于中和體內的自身抗體。目前針對不同的發病機制，治療方法趨于多樣化。許多變態反應與IgE 有關。Fc 片段可與變應原特異性IgE競爭結合嗜堿性粒細胞，封閉變應原介導的組胺釋放。此外，還可生產出與患者IgE 競爭結合變應原的Fab 樣分子。

2.2 免疫毒素

免疫毒素是一種毒素肽和細胞選擇性靶向配體連接的融合蛋白，它能通過靶向結構域的特異結合功能使毒素傳遞到靶細胞并與之作用進而殺死腫瘤細胞。早期的免疫毒素是由無修飾生物毒素和鼠源抗體連接而成的，連接的方式常為化學偶聯法。由于非人源的毒素和鼠源抗體導致的免疫排斥反應，以及低親和力和無靶向特異性，使免疫毒素無法在臨床中得到運用。

新型免疫毒素是將毒素肽和細胞選擇性靶向配體都進行改造后，再用工程菌或工程細胞實現高效表達。細胞選擇性靶向配體使用了工程抗體、轉鐵蛋白、表皮生長因子以及IL-2等。抗體的改造主要集中在降低免疫原性、提高親和力和增強實體腫瘤滲入率等方面，包括改用小分子工程抗體、人源化抗體、人源抗體和突變的高親和力抗體等。

2.3 抗體－細胞因子融合蛋白

細胞因子能激活某些免疫細胞，包括單核細胞、巨噬細胞、NK細胞、T細胞和B細胞等。應用細胞因子治療癌癥能夠引起免疫應答，但這種免疫反應是非特異的，常產生全身毒性。有人嘗試使用抗體工程技術將細胞因子與抗體連接形成融合蛋白，通過靶向作用，細胞因子在腫瘤組織的靶細胞上聚集，在局部殺傷腫瘤細胞，而非特異性毒性將減少或消失。常用的細胞因子包括IL-

2、IL-12和GM-CSF 等，融合的部位可以是全長型抗體或ScFv的N端或C端。抗體－細胞因子融合蛋白作為一種新型的腫瘤免疫治療藥物，其抗體功能域可引導細胞因子濃集在腫瘤組織的微環境中，之后抗體部分直接抑制腫瘤細胞活性，并誘導二次免疫應答，多重作用的相加使抗體－細胞因子融合蛋白對腫瘤的抑制作用明顯強于單獨使用抗體或細胞因子。由于全長型抗體Fc上存在兩個效應細胞結合位點，功能更為強大，其中一個位點與細胞因子結合，激活效應細胞，另一個與FcγR結合，引發抗體依賴細胞的細胞毒作用(ADCC)。

三、治療性抗體的制備技術與研究意義

由識別一種抗原決定簇的細胞克隆所產生的均一性抗體稱為單克隆抗體，可視為第二代抗體。由于其具有特異性高、親和力強、效價高、血清交叉反應少等優點，已經在基礎研究、臨床診斷及治療、免疫預防等領域發揮了重要作用。在治療上，單克隆抗體主要用于抗腫瘤、抗器官移植排斥反應、抗感染、解毒等。近年來將單抗與核素、各種毒素（如白喉外毒素或蓖麻毒素）或藥物通過化學偶聯或基因重組制備成導向藥物，用于腫瘤的治療成為研究的重點。制備單克隆抗體的常規方法是免疫小鼠，雜交瘤可在實驗動物中產生無限量單克隆抗體。對大多數雜交瘤來說，現已可用體外方法生產單克隆抗體而無需應用動物。體外單克隆抗體生產系統已有多種，但大規模生產治療性單克隆抗體需用中空纖維系統，其成功與否取決于雜交瘤的固有特性，如細胞生長和單克隆抗體生產能力等。因此，大量生產以供臨床研究應用還有困難，但有幾種方法可以解決這些問題，如嵌合單克隆抗體、人源化單克隆抗體和全人單克隆抗體的產生。其中，人源化抗體是一個重要的里程碑，并伴隨著一系列重大的技術革新，如PCR技術、抗體庫技術、轉基因動物等。人源化抗體的形式也從最初的嵌合抗體、改型抗體等逐步發展為今天的人抗體。抗體人源化已經成為治療性抗體的發展趨勢，同時各種抗體衍生物也不斷涌現，它們從不同角度克服了抗體本身的應用局限，也為治療人類疾病提供了更多利器。

人源化抗體是從鼠源單抗到全人抗體的過渡形式，在鼠單抗的基礎上，用人抗體恒定區置換鼠抗體的相應部位，形成人鼠嵌合抗體。利用DNA重組技術將鼠單抗的輕、重鏈可變區基因插入含有人抗體恒定區的表達載體中，轉化哺乳動物細胞表達人鼠嵌合抗體，其人源化程度可達到70%左右。嵌合抗體完整地保留了異源單抗的可變區，最大限度地保持了其親和性，降低了免疫原性。美國食品藥品管理局（FDA）批準的抗體藥物中有4個是嵌合抗體。但由于其整個可變區都是異源的，所以嵌合抗體的異源性還很明顯，解決HAMA的效果并不理想。

由于天然抗體主要是通過調理作用、ADCC 或依賴補體的細胞毒效應起到殺傷靶細胞的作用，因此天然抗體的細胞毒效應有限。下列幾種途徑可以增加抗體對靶細胞的殺傷，如免疫結合物、抗體細胞因子融合蛋白、雙特異性抗體、細胞內抗體等。

雙特異性抗體亦稱雙功能抗體，是同一抗體的3 個抗原結合部位分別針對3 個不同的抗原，在結構上是雙價的，而與抗原結合的功能是單價的。雙特異性抗體可以用化學交聯、細胞融合和基因工程等方法獲得。由于它可以同時與3 種抗原發生反應，并使之交聯，因而可介導標記物與靶抗原的結合，或使某種效應分子定位于靶細胞；此外，又由于它與抗原結合的單價性，不易引起靶抗原的調變，從而可提高抗體的某些生物學效應。雙特異性抗體重鏈的異質性使其FC 片段與FC受體結合的能力明顯減弱，減少了該抗體在體內的非特異性分布。雙特異性抗體的這些特性使它在診斷和治療上有廣泛的應用前景。目前，作為治療腫瘤用的雙功能抗體常采用抗腫瘤相關抗原（TAA）及CD3 或抗TAA 及CD16，這類雙特異性抗體在

荷瘤動物模型中無論是抑瘤試驗還是殺傷試驗均獲得了良好結果。無論采用何種免疫活性細胞的效應分子，其殺傷均無MHC限制，這為臨床應用提供了許多方便，目前已有一些雙功能抗體正在進行臨床試驗。

一般的抗體在細胞內合成后分泌到胞外，如果在抗體的N端或C端加入引導序列，就能使抗體表達定位在亞細胞部位，如胞漿、線粒體、內質網或細胞核部位。這種在細胞內合成并作用于細胞內組分的抗體稱為細胞內抗體或內抗體。細胞內抗體可以提供一種獨有的研究分子功能的新方法，它可以在細胞內抑制病毒復制、抑制生長因子受體或癌蛋白表達，因此有用于基因治療的前景，研究較多的是用細胞內抗體抑制I型人類免疫缺損病毒I型（HIV-I）和抗腫瘤。

雙特異抗體是指具有兩種抗原結合特性的抗體，可同時結合兩個不同的抗原或抗原決定簇。與mAb相比，雙特異抗體具有以下優點：(1)較低濃度即可殺傷或溶解腫瘤細胞；(2)對低表達或不表達腫瘤相關抗原的腫瘤細胞有殺傷或抑制作用；(3)激活結合的細胞毒性T淋巴細胞，發揮多種生物學效應，協助殺傷腫瘤細胞。早期研制雙特異抗體的方法是采用細胞工程，即將兩株各自分泌不同特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞再融合得到四源雜交瘤，或將一株雜交瘤細胞與免疫的脾細胞融合得到三源雜交瘤，這兩種雜交瘤被稱為二次雜交瘤)。多倍雜交瘤細胞的穩定性差，BsAb的產量少且活性低，費時費力，臨床應用時存在人抗鼠抗體免疫反應(HAMA)，因此不適用于臨床。20世紀90年代起，基因工程和蛋白質工程在抗體生產和改造中得到了成功應用，由此產生了抗體工程。應用抗體工程生產BsAb，具有分子量小、方法穩定、可大量生產、成本顯著降低和操作簡便等優點。

四、治療性抗體的研究方向與存在問題

抗體應用于人類疾病的治療已有很長的歷史，但其發展歷程是曲折的，自單克隆抗體;雜交瘤技術宣告誕生以來，歷經多年反復。目前，FDA 已經批準21 個治療性單抗上市。近年來，科學界和醫藥產業界都對治療性抗體的研究表現出越來越多的關注。人源化抗體和人抗體的出現為治療性抗體的廣泛應用帶來了新的希望。但人抗體是否可以解決鼠抗體臨床應用中出現的所有問題，還有待大量臨床試驗的檢驗。影響抗體免疫原性的因素很多，如抗原呈遞方式、次級信號系統以及患者的個體差異性等，而抗體的人源化只能解決一個方面的問題。同樣，抗體衍生物也會面臨諸如免疫原性、毒副作用等自身固有的問題，所以可行的發展方向是在完善人抗體技術的同時，推進治療性小分子抗體衍生物的研究。根據臨床實際設計靈活的治療方案，使人源化抗體和抗體衍生物互為補充，達到最佳治療效果。從已上市的抗體藥物不難看出，未來的治療性抗體將朝著人源化和小型化發展，兩條途徑的結合將最大程度地克服鼠單抗的缺陷使抗體藥物得到更為深入和廣泛的應用。

五、治療性抗體的發展前景

單克隆抗體技術的問世,使研究和生產治療性單抗藥物成為現實。隨著基因工程技術的發展,新型的重組抗體技術也隨之而生。

人們可以利用DNA重組技術對鼠源抗體進行人源化改造、構建合成或半合成抗體庫及噬菌體抗體庫,從中篩選獲得人源抗體,甚至利用轉基因小鼠直接獲得人源抗體。抗體藥物發展的趨勢也從鼠源、人-鼠嵌合、人源化到全人源。近年獲得批準的抗體藥物以全人源為主。1996年至2008年間進入臨床研究的人源化單克隆抗體中45%用于治療腫瘤,28%個用于治療免疫紊亂。抗體藥物的發展進入研發、回報的良性循環,成了國際制藥業爭奪的焦點。文章就治療性抗體發展的歷史、現狀、市場及未來展望作了簡要綜述。利用抗體工程研制更有效的治療性抗體的前景非常光明盡管還存在很多問題。實踐已經證明，許多新型工程抗體可以在原核或真核細胞中實現高效表達，它們具有較長的半衰期和生物學效應，大多為ScFv、Fab或它們的多聚體，能夠有效進入腫瘤細胞，具有比較理想的治療效果。新型抗體工程技術的不斷出現，將為抗體改造提供了強有力的技術平臺。相信不久的將來，治療性抗體會在人類疾病的治療中扮演重要的角色。

【參考文獻】

[1] JM沃克,R.拉普勒, 編;譚天偉, 黃留云, 蘇國富, 等譯.分子生物學與生物技術[M] 北京: 化學工業出版社,2003.1 [2] 吳乃虎.基因工程原理（上冊）[M] 北京I 科學出版社,1998.3 [3] 盧圣棟，現代分子生物學實驗技術[M] 北京I 中國協和醫科大學出版社,1999.9

第四篇：細胞克隆培養論文

細胞克隆培養論文

摘要：隨著生命科學時代的帶來，基因研究已經取得了巨大的進展，克隆技術特別是人的克隆技術作為基因研究的重要組成部分，引起了社會各界的廣泛關注。克隆包含動物、植物等方面，動物克隆在畜牧業生產、醫藥生產、疾病治療、生物學基礎理論研究、以及動物轉基因工程等諸多領域蘊藏著巨大的應用潛力。通過科學研究者的努力，哺乳動物的克隆技術在農業和生物制藥等方面取得了進步，展示了克隆技術的應用價值和發展前景。

關鍵詞：動物克隆技術

1、克隆技術含義: “克隆”，即無性細胞繁殖系，又稱為一個細胞株或細胞系，細胞株與細胞系沒有本質的區別。也可以理解為復制，拷貝，就是從原型中產生出同樣的復制品，它的外表及遺傳基因與原型完全相同，但大多行為思想不同。無性繁殖的手段有很多種，包括孤雌生殖，胚胎切割和細胞核移植等等。而產生克隆動物的方法則稱為動物克隆技術。

在《中國大百科全書·生物學者》中，對“克隆”的解釋是：克隆又稱無性繁殖細胞系和無性繁殖系，是一個細胞或個體以無性繁殖重復分裂或繁殖所產生的一群細胞或一群個體，在不發生突變的情況下，具有完全相同的遺傳結構。克隆技術同整個生物界的進程一樣，是由低級到高級，有簡單的復雜不斷發展和進步的。它由單個細胞獲得2個以上細胞、生物體，發展到生物體內的生物大分子的自我復制，在DNA復制酶的作用下，復制生成倆個一模一樣的DNA分子。

2、動物克隆的進程：

1938年，國外就有人提出提出成年動物的細胞核入卵子法克隆哺乳動物的設想。

1978年，我國著名科學家童第周成功地進行看了克隆黑斑蛙的實驗，他將黑斑蛙的紅細胞核移入到事先去除了核的黑斑蛙卵中，這種換核卵發育成了黑斑蛙的蝌蚪。

1996年，用成年哺乳動物體細胞克隆出的哺乳動物個體克隆羊多莉出世，開創了體細胞繁殖哺乳動物的成功先例。

2003年，克隆馬出世，是世界上首例哺乳動物生下自己的克隆體。

2003年8月，中國科學家在世界上首次采用克隆技術培育出含人免DNA混合物胚胎。

2003年9月，沃斯宣布他已克隆出了含人，牛DNA的混合胚胎。

2008年1月7日，2頭具有綠色熒光遺傳特征的小豬在哈爾濱誕生。

3、動物克隆技術的應用：

動物克隆近幾年取得的一些突破性進展，為動物發育過程中基因表達的調控及發育生物學，遺產學等相關學科的發展必將產生深遠的影響。雖然目前這種方法尚不成熟，但它已顯示出誘人的應用前景。

動物克隆技術將首先應用于醫藥領域。利用體細胞供體經核移植生產轉基因動物，可望降低生產成本。到目前為止，產生轉基因動物的方法仍主要是1985年Hammer等建立的原核顯微注射法。但是，這種方法只能使大約5%的動物攜帶外源基因外源基因整合動物基因組是個隨機的過程，這導致外源基因在許多轉基因動物系中的表達量不夠高，而且因整合進生殖細胞的幾率低難以遺傳給下一代。Schnieke等發現，利用體細胞克隆技術生產含人凝血因子IX的轉基因羊比原核顯微注射法要有效得多。其中，兩者最顯著的差異是體細胞克隆的中的受體母羊全都攜帶外源基因，而原核顯微注射法會產生許多不帶外源基因的羊羔。這是由于，原核微注射法中所用胚胎在體外培養的時間較短，在此期間被檢測為陽性的轉基因可能會在以后的發育過程中丟失。用作核移植供體的細胞在體外培養的時間則較長，有較多的檢測機會。另外，顯微注射法制備的轉基因動物的性別只有等到動物出世后才能得知，而核移植可以通過鑒別核供體的核型而預先得知轉基因動物的性別，可選擇性的制備雌性的轉基因動物，有利于在母乳中表達外源基因。

克隆技術除了可以生產各種醫用人體蛋白外，對人類的細胞和組織治療也大有好處。利用克隆技術，可以用患者本人細胞培養出新組織，用來治療糖尿病、帕金森氏病、神經損傷等多種疾病。用這種方法培養出的組織具有與患者正常組織完全相同的基因構成，因此不會產生免疫排斥反應。但是這些都涉及到克隆人這個敏感話題，目前克隆人在許多國家是法律禁止的。隨著人類胚胎干細胞培養技術的完善。目前已有兩家美國公司開始研究利用克隆技術培育人胚胎，希望大批量生產治療疾病的干細胞。事實上，幾年前人們就曾把人胎兒神經組織用來治療帕金森氏癥。考慮到倫理上的原因，人們也可以用克隆動物的胚胎干細胞作異源移植，以解決人類移植器官供求矛盾。

動物克隆技術還有助于加速動物育種的進程。利用優良動物品種的體細胞作核供體克隆動物，可以避免自然條件下選種所受到的動物生育周期和生育效率的限制，從而大大縮短了育種年限，提高育種效率。動物克隆技術用于拯救瀕危動物也受到廣泛的關注。中國科學院動物研究所陳大元研究員提出用動物克隆技術拯救大熊貓的計劃，在國內外均引起一定的反響。

4、動物克隆技術的不足及未來發展方向

動物克隆技術然取得了一定的進展，在生物醫藥領域也得到了初步的應用。但是，該技術目前還很不完善。存活率低是當今核移植技術的最大缺陷。它突出表現為：孕期流產率高，圍產期死亡率高，新生兒體重較重及產生后對環境的適應性較差。以成體細胞核作核供體問題更為嚴重。最近，Shiels等報道克隆羊的端粒較同年羊短。Renard等報道，體細胞核移植可能影響克隆動物免疫系統的正常發育。他們用胚胎細胞克隆牛的耳細胞通過核移植克隆出一頭牛。牛犢看起來很健康，但出生一個半月后，它體內的淋巴細胞和紅血球急劇減少，不久就死于貧血。尸體解剖發現，該牛犢脾臟、胸腺和淋巴結等淋巴組織都沒有得到正常發育。

導致動物克隆存活率低和異常發育的原因很多，缺乏基礎理論支持是其中之一。動物克隆技術的不斷完善，還需要分子遺傳學、細胞學、發育生物學等相關基礎學科的進一步研究和發展。迄今為止，人們雖然在動物克隆過程中已經積累不少數據，但一些很基本的問題任亟需解決。

動物克隆技術條件的優化還沒有解決。如核供體和卵細胞的選材、核質比的選擇、重組胚胎的激活方式、是否需要做連續核移植等。

綜上所述，動物克隆研究已在理論基礎、技術優化及實際應用等方面取得很大的進步。但該技術目前還很不完善，相關理論研究還很薄弱，人們要提高動物克隆的成功率還需不懈的努力。另外克隆動物與正常胚胎的發育有何異同，也值得深入研究。這些問題的解決將有助于人們對動物胚胎發育過程中分子機制的認識。

5、結束語

要緊跟世界科技發展的潮流，充分利用克隆技術為人類帶來巨大的利益，又要嚴格控制可能造成混亂的克隆人出現。

參考文獻：

《生命倫理學》、《生命的化學》 學院：呼和浩特職業學院

專業：生物技術及應用 年級：12級

姓名：郝媛 學號：12305060023

第五篇：研究發現NK細胞新特征

研究發現NK細胞新特征

加州大學微生物免疫系與癌癥研究中心的研究人員發現自然殺傷細胞的一種新的特征，這一成果公布在1月11日Nature在線版上。

自然殺傷細胞(naturalkillercell，NK)是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節有關，而且在某些情況下參與超敏反應和自身免疫性疾病的發生。由于NK細胞的殺傷活性無MHC限制，不依賴抗體，因此稱為自然殺傷活性。NK細胞胞漿豐富，含有較大的嗜天青顆粒，顆粒的含量與NK細胞的殺傷活性呈正相關。NK細胞作用于靶細胞后殺傷作用出現早，在體外1小時、體內4小時即可見到殺傷效應。NK細胞的靶細胞主要有某些腫瘤細胞(包括部分細胞系)、病毒感染細胞、某些自身組織細胞(如血細胞)、寄生蟲等，因此NK細胞是機體抗腫瘤、抗感染的重要免疫因素，也參與第Ⅱ型超敏反應和移植物抗宿主反應。

在獲得性免疫應答機制中，感染發生后未致敏的T細胞會開始復制增殖，免疫系統會生成具有長期記憶性的細胞，在經歷第二次相同病毒的感染時候，免疫細胞就能迅速的調動起來，發揮免疫功能。

在現在的理論中，自然殺傷細胞被歸為天然免疫細胞，它與細胞毒性T細胞具有諸多相似的特點。研究者以小鼠為模型，讓其感染巨細胞病毒，與細胞毒性T細胞相似的特性出現了，脾臟中表達病毒特異性的Ly49H受體的自然殺傷細胞數量增高100倍，在肝臟中高達1000倍。經歷收縮期后，Ly49H陽性的自然殺傷細胞定居在淋巴組織或是非淋巴器官中長達數月之久。這些能自我更新的有記憶性的自然殺傷細胞再次遭遇相同的病原后能迅速的反應，脫顆粒，釋放細胞因子發揮免疫功能。如果將這些有記憶性的自然殺傷細胞轉移到年幼的動物體內，自然殺傷細胞能在年幼動物首次遭遇相應病原的時候發揮殺傷作用，也就是說這些記憶性的自然殺傷細胞能拿來即用。

這些研究結果證明，自然殺傷細胞其實不僅是天然免疫系統中的重要作用成分，它同樣具有獲得性免疫細胞的一些特征（有記憶性）。

研究者認為，在免疫系統中，NK細胞反應的速度比T細胞或B細胞要快，因此，NK細胞的這種記憶性能可能有助于設計更有效，反應更迅速的疫苗。日期：2009年1月16日-來自[免疫系統]欄目