第一篇：酶聯免疫法檢測試劑注冊技術審查指導原則

附件1

酶聯免疫法檢測試劑注冊技術審查指導原則

一、前言

本指導原則主要針對酶聯免疫類檢測試劑的主要原材料、生產工藝及反應體系、產品質量控制等環節提出指導性技術要求。

本指導原則系對酶聯免疫法檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品特性確定其中的具體內容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應的科學依據。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著法規和標準的不斷完善、科學技術的不斷發展，其相關內容也將進行適時的調整。

二、適用范圍

本指導原則適用于有關病原微生物檢測的第三類體外診斷試劑的注冊技術審查。其他酶聯免疫法檢測試劑（如作為二類管理的體外診斷試劑）可參考本指導原則執行。

三、基本要求

（一）基本原則

1.研制、生產用的各種原料、輔料等應制定其相應的質量標準，并應符合有關法規的要求?！? 2 — 2.試劑生產企業應具備相應的專業技術人員、儀器設備以及適宜的生產環境，獲得《醫療器械生產許可證》；同時，應按照《體外診斷試劑生產實施細則（試行）》的要求建立相應的質量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行；還應通過《體外診斷試劑生產企業質量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。企業應對試劑的使用范圍做出明確規定，并經國家藥品監督管理部門批準。

3.診斷試劑的研制應當按照科學、規范的原則，各反應條件的選擇和確定應符合基本的科學原理。

4.試劑在研制、生產過程中所用的各種材料及工藝，應充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生產和質量控制的總體目標：保證試劑使用安全、質量穩定、工藝可控、檢測有效。

（二）原材料質量控制 1.主要生物原料

與產品質量最密切相關的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標反應板、標記相關酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應用抗原或抗體、制備校準品（標準品）等。使用前應按照工藝要求對這類生物原料進行質量檢驗，以保證其達到規定的質量標準。主要生物原料若為企業自己生產，其工藝必須相對穩定；若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，應依據國家相關法規的要求進行變更申請。

主要生物原料的常規檢驗項目一般包括：（1）外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒；或者為白色粉末，不含其他顏色的雜質；特殊生

— 3 — 物原料應具備相應外觀標準。

（2）純度和分子量

主要經SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進行電泳，一般每個電泳道加樣量為5μg，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應達到相應的質量標準，分子量大小應在正確的條帶位臵。

（3）蛋白濃度

蛋白濃度可通過Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲法或其他適宜的方法進行檢測。

（4）效價

效價的測定一般根據蛋白含量測定結果，通過倍比稀釋法進行。效價應達到規定的要求。

（5）功能性實驗

功能性實驗是指生物原料用于試劑盒實際生產中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩定性等，并比較其與上批次原料的相關性。

2.生物輔料

生物輔料一般指在生產過程中作為蛋白保護劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料的質量標準應符合2000年版的《中國生物制品主要原輔材料質控標準》規定的標準要求，并且要適合于本企業的生產。建議作以下檢驗：

（1）牛血清或羊血清

外 觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無溶血或異物。無菌試驗：將血清直接37℃放臵7天，明亮處觀察，不得出現混濁或— 4 — 沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，蛋白含量≥32mg/ml。

球蛋白含量：取待測血清1ml，采用飽和硫酸銨法進行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化鈉溶液，至1ml，用Lowry方法測定，蛋白含量應≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外 觀：應為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無吸潮，無結塊，無肉眼可見的其它雜質顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，在18?26℃時，溶解時間應≤15分鐘，pH值應為6.5?7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲法，其標準為≥95％。

總蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標準為≥95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的BSA含量，其標準為≥90%。（3）酪蛋白：

應符合生產所需的質量標準。（4）標記用酶

應在產品的質量標準中明示所使用的標記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應根據不同生產廠家的檢驗方法和質量標準進行檢驗，酶的純度RZ值（OD403nm/OD280nm）應大于3.0。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應進行功能性實驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進行酶聯免疫測定，均不能出現非特異性反應。

生物輔料的供應商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應商。3.化學原材料

化學原材料的質量標準，包括外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等，均應符合《中國生物制品主要原輔材

— 5 — 料質控標準（2000年版）》分析純級別的要求，并且要適合于本企業的生產。

主要化學原材料的供應商要求相對固定，不得隨意發生變更?；瘜W原材料在購入時，原材料的生產商必須提供該批次化學原材料的質量保證材料和質量檢驗報告。

4.其他物料（1）酶標板 ①外觀

明亮處用肉眼觀察板條的外觀質量，如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差，底部有波紋及劃傷等應剔除。②吸附能力和精密性 采用合適的方法進行檢驗。

一般用一定濃度的正常人免疫球蛋白G(IgG)包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結合物吸附，通過顯色反應，使用酶標儀讀數，計算CV值。CV值結果應符合相關產品的功能性質量標準，一般批內CV≤5％，批間CV≤10％。

（2）液體試劑裝量瓶

包括陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應有相應的裝量瓶，并建立相應的質量控制標準，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。

（3）其他材料

包括試劑瓶標簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應參照國家食品藥品監督管理局發布的《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》和《醫療器械說明書、標簽和包裝標識管理規定》建立相應質量控制標準。— 6 — 5.企業質控品

企業質控品一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性、鉤狀效應（hook效應）等質控樣品，對于定量檢測試劑，還包括線性質控品樣品。如該產品具有國家標準品或參考品，應使用國家標準品（參考品）進行標化；若該診斷試劑沒有國家標準品（參考品），則企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

企業質控品的基質應與診斷試劑的待測樣品的基質基本一致，如待測樣品為血清/血漿，質控品基質也應為血清/血漿。

（三）試劑盒各組分的生產

酶聯免疫法檢測試劑主要組分的生產包括酶標記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標反應板、分裝及包裝等步驟；并通過產品的半成品檢驗和成品檢驗兩個質控過程來保證其質量符合規定。

1.各種工作液的配制

酶聯免疫診斷試劑研制生產過程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰性陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等，對定量檢測試劑，還包括標準品（或校準品）溶液。若陰性、陽性對照或其他液體組分涉及生物安全性問題，制備時應在相應的生物安全實驗室完成。

各種工作液在配制過程中應嚴格按質量標準中的配方進行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻，同時進行相應的質量檢驗并達到質量標準后，方可使用或分裝。對于定量檢測試劑，其標準品（或校準品）溶液應具有量值溯源性。

應對配制過程及配制的液體進行的質量控制，主要包括酶結合物的

— 7 — 功能性實驗及穩定性；各種溶液的外觀、pH值等；酶作用底物應測定在無相應酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標；終止液應對其終止酶促反應的能力進行測定。

2.包被酶標反應板

包被前應對酶標反應板進行質量檢驗，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標反應板的批號、數量、標識。酶標反應板經檢驗合格后方能用于包被。不同批號的板條不能混用。

選擇經檢驗合格的包被原料（如抗原、抗體等），經一定的方法確定最佳包被濃度和酶結合物工作濃度，按照診斷試劑的生產規程，配制包被緩沖液、封閉液，經檢驗合格后，包被酶標反應板，經干燥后，已包被的酶標反應板用鋁箔紙封閉（內臵干燥劑），保存于2?8℃。

應對包被過程進行相應的質量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質量檢驗、包被液和封閉液的質控（如配方、外觀、pH值）、包被過程的監控（包括包被和封閉的體積、溫度、時間等）、包被均一性檢驗、干燥過程的監控等。

3.分裝和包裝

樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應嚴格按照質量標準中的量進行過濾后再分裝，分裝量的誤差應小于5%。

分裝及包裝均應按照相應的標準操作規程要求進行。包裝前，應嚴格檢查試劑盒的品名、批號等，核對各試劑盒各組分的數量，并在關盒前進行復核。

（四）質量控制 1.半成品質量控制（1）半成品抽樣

檢驗人員按試劑的批號，根據抽樣申請單抽取規定數量的半成品各— 8 — 組分，作號標記、待檢。

（2）半成品檢驗

根據試劑盒的企業標準或者制檢規程進行半成品的檢驗。半成品檢驗，一般使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化后的企業參考品。若某類試劑沒有國家標準品（參考品），則使用企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

檢驗指標一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應達到相應的質量標準要求。對于精密性，一般情況下CV不得高于15％（采用競爭抑制法的診斷試劑CV不得高于20％）。對定量檢測試劑，同時應分析其線性相關系數和定量質控品檢測結果的準確性。

企業應該對每一批試劑的半成品進行穩定性研究。試劑盒各組分應留樣，2?8℃定期作穩定性考核，同時作37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產品的質量標準。

2.成品質量控制

產品包裝完成后，質檢人員根據試劑的批號、實際包裝量、抽樣申請單的要求進行抽樣，同時填寫抽樣數量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數量應包括檢驗用數量和留樣數量。質檢人員同時應檢查相關原始記錄。

每一批酶聯免疫類檢測試劑的試生產量應滿足工藝研究、分析性能驗證、穩定性研究、臨床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求。

（1）成品檢驗

成品檢驗時，一般使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化后的企業參考品，并達到相應質量要求。若該診斷試劑沒有國家

— 9 — 標準品（參考品），則使用企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

（2）穩定性試驗

在批放行前，每一批試劑應完成37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產品的質量標準。

四、名詞解釋

酶聯免疫法：是指在酶標板上包被特定的抗原（和/或抗體）后，利用直接或間接的方法與待測樣品中的相關抗體（和/或抗原）反應，形成的抗原抗體復合物再與相應的酶標記的抗體和/或抗原進一步反應，經過酶催化底物發生顯色反應，由形成的顏色的強弱來判斷樣本中相應的抗體和/或抗原的存在。

五、參考文獻：

1.《中國生物制品規程》（2000年版），化學工業出版社

— 10 —

第二篇：酶聯免疫法檢測試劑主要原材料、生產工藝及質量控制注冊技術審查指導原則(報批稿)

酶聯免疫法檢測試劑主要原材料、生產工藝及質量控制注冊技術審查指導原則（報批稿）

2010-11-09 01:27

酶聯免疫法檢測試劑主要原材料、生產工藝及 質量控制注冊技術審查指導原則（報批稿）

一、前言

本指導原則的主要目的是規范申請人對酶聯免疫類檢測試劑的主要原材料研究資料、生產工藝及反應體系研究資料的準備，并對產品質量控制提出指導性技術要求。

本指導原則系對酶聯免疫法檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品特性確定其中的具體內容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應的科學依據。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其它方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將進行適時的調整。

二、適用范圍 本指導原則適用于有關病原微生物檢測的第三類體外診斷試劑的注冊技術審查，其它酶聯免疫法檢測試劑（如作為二類管理的體外診斷試劑）可參考本指導原則執行。

三、基本要求

（一）基本原則

1.研制、生產用的各種原料、輔料等應制定其相應的質量標準，并應符合有關法規的要求。

2.試劑生產企業應具備相應的專業技術人員、儀器設備以及適宜的生產環境，獲得《醫療器械生產許可證》；同時，應按照《體外診斷試劑生產實施細則（試行）》的要求建立相應的質量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行；還應通過《體外診斷試劑生產企業質量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。企業應對試劑的使用范圍做出明確規定，并經國家藥品監督管理部門批準。

3.診斷試劑的研制應當按照科學、規范的原則，各反應條件的選擇和確定應符合基本的科學原理。

4.試劑在研制、生產過程中所用的各種材料及工藝，應充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生產和質量控制的總體目標：保證試劑使用安全、質量穩定、工藝可控、檢測有效。

（二）原材料質量控制 1.主要生物原料 與產品質量最密切相關的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標反應板、標記相關酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應用抗原或抗體、制備校準品（標準品）等。使用前應按照工藝要求對這類生物原料進行質量檢驗，以保證其達到規定的質量標準。主要生物原料若為企業自己生產，其工藝必須相對穩定；若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，應依據國家相關法規的要求進行變更申請。

主要生物原料的常規檢驗項目一般包括：（1）外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒；或者為白色粉末，不含其他顏色的雜質；特殊生物原料應具備相應外觀標準。

（2）純度和分子量

主要經SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進行電泳，一般每個電泳道加樣量為5μg，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應達到相應的質量標準，分子量大小應在正確的條帶位臵。

（3）蛋白濃度 蛋白濃度可通過Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲法或其他適宜的方法進行檢測。

（4）效價

效價的測定一般根據蛋白含量測定結果，通過倍比稀釋法進行。效價應達到規定的要求。

（5）功能性實驗

功能性實驗是指生物原料用于試劑盒實際生產中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩定性等，并比較其與上批次原料的相關性。

2.生物輔料

生物輔料一般指在生產過程中作為蛋白保護劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料的質量標準應符合2000年版的《中國生物制品主要原輔材料質控標準》規定的標準要求，并且要適合于本企業的生產。建議作以下檢驗：

（1）牛血清或羊血清

外 觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無溶血或異物 無菌試驗：將血清直接37℃放臵7天，明亮處觀察，不得出現混濁或沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，蛋白含量≥32mg/ml。球蛋白含量：取待測血清1ml，采用飽和硫酸銨法進行沉淀，沉淀溶于0.85%NaCl溶液，至1ml，用Lowry方法測定，蛋白含量應≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外 觀：應為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無吸潮，無結塊，無肉眼可見的其它雜質顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，在18?26℃時，溶解時間應≤15分鐘，pH值應為6.5?7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲法，其標準為≥95％。

總蛋白中的BSA含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標準為≥95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的BSA含量，其標準為≥90%。

（3）酪蛋白：

應符合生產所需的質量標準。（4）標記用酶

應在產品的質量標準中明示所使用的標記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應根據不同生產廠家的檢驗方法和質量標準進行檢驗，酶的純度RZ值（OD403nm/OD280nm）應大于3.0。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應進行功能性實驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進行酶聯免疫測定，均不能出現非特異性反應。

生物輔料的供應商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應商。3.化學原材料

化學原材料的質量標準，包括外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等，均應符合《中國生物制品主要原輔材料質控標準（2000年版）》分析純級別的要求，并且要適合于本企業的生產。

主要化學原材料的供應商要求相對固定，不得隨意發生變更?；瘜W原材料在購入時，原材料的生產商必須提供該批次化學原材料的質量保證材料和質量檢驗報告。

4.其他物料（1）酶標板 ①外觀

明亮處用肉眼觀察板條的外觀質量，如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差，底部有波紋及劃傷等應剔除。

②吸附能力和精密性 采用合適的方法進行檢驗。

一般用一定濃度的正常人IgG包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結合物吸附，通過顯色反應，使用酶標儀讀數，計算CV值。CV值結果應符合相關產品的功能性質量標準，一般批內CV≤5％，批間CV≤10％。

（2）液體試劑裝量瓶

包括陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應有相應的裝量瓶，并建立相應的質量控制標準，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。

（3）其他材料

包括試劑瓶標簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應參照國家食品藥品監督管理局頒布的《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》和《醫療器械說明書、標簽和包裝標識管理規定》建立相應質量控制標準。

5.企業質控品

企業質控品一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性、hook效應等質控樣品，對于定量檢測試劑，還包括線性質控品樣品。如該產品具有國家標準品或參考品，應使用國家標準品（參考品）進行標化；若該診斷試劑沒有國家標準品（參考品），則企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

企業質控品的基質應與診斷試劑的待測樣品的基質基本一致，如待測樣品為血清/血漿，質控品基質也應為血清/血漿。

（三）試劑盒各組分的生產

酶聯免疫法檢測試劑主要組分的生產包括酶標記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標反應板、分裝及包裝等步驟；并通過產品的半成品檢驗和成品檢驗兩個質控過程來保證其質量符合規定。1.各種工作液的配制

酶聯免疫診斷試劑研制生產過程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰性陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等，對定量檢測試劑，還包括標準品（或校準品）溶液。若陰性、陽性對照或其他液體組分涉及生物安全性問題，制備時應在相應的生物安全實驗室完成。

各種工作液在配制過程中應嚴格按質量標準中的配方進行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻，同時進行相應的質量檢驗并達到質量標準后，方可使用或分裝。對于定量檢測試劑，其標準品（或校準品）溶液應具有量值溯源性。

應對配制過程及配制的液體進行的質量控制，主要包括酶結合物的功能性實驗及穩定性；各種溶液的外觀、pH值等；酶作用底物應測定在無相應酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標；終止液應對其終止酶促反應的能力進行測定。

2.包被酶標反應板

包被前應對酶標反應板進行質量檢驗，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標反應板的批號、數量、標識。酶標反應板經檢驗合格后方能用于包被。不同批號的板條不能混用。

選擇經檢驗合格的包被原料（如抗原、抗體等），經一定的方法確定最佳包被濃度和酶結合物工作濃度，按照診斷試劑的生產規程，配制包被緩沖液、封閉液，經檢驗合格后，包被酶標反應板，經干燥后，已包被的酶標反應板用鋁箔紙封閉（內臵干燥劑），保存于2?8℃。

應對包被過程進行相應的質量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質量檢驗、包被液和封閉液的質控（如配方、外觀、pH值）、包被過程的監控（包括包被和封閉的體積、溫度、時間等）、包被均一性檢驗、干燥過程的監控等。

3.分裝和包裝

樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應嚴格按照質量標準中的量進行過濾后再分裝，分裝量的誤差應小于5%。

分裝及包裝均應按照相應的SOP要求進行。包裝前，應嚴格檢查試劑盒的品名、批號等，核對各試劑盒各組分的數量，并在關盒前進行復核。

（四）質量控制 1.半成品質量控制（1）半成品抽樣

檢驗人員按試劑的批號，根據抽樣申請單抽取規定數量的半成品各組分，作號標記、待檢。

（2）半成品檢驗

根據試劑盒的企業標準或者制檢規程進行半成品的檢驗。半成品檢驗，一般使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化后的企業參考品。若某類試劑沒有國家標準品（參考品），則使用企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

檢驗指標一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應達到相應的質量標準要求。對于精密性，一般情況下CV不得高于15％（采用競爭抑制法的診斷試劑CV不得高于20％）。對定量檢測試劑，同時應分析其線性相關系數和校準品檢測結果的準確性。

企業應該對每一批試劑的半成品進行穩定性研究。試劑盒各組分應留樣，2?8℃定期作穩定性考核，同時作37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產品的質量標準。

2.成品質量控制

產品包裝完成后，質檢人員根據試劑的批號、實際包裝量、抽樣申請單的要求進行抽樣，同時填寫抽樣數量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數量應包括檢驗用數量和留樣數量。質檢人員同時應檢查相關原始記錄。

每一批酶聯免疫診斷試劑報批批量應至少為10000人份。（1）成品檢驗

成品檢驗時，一般使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化后的企業參考品，并達到相應質量要求。若該診斷試劑沒有國家標準品（參考品），則使用企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

（2）穩定性試驗

在批放行前，每一批試劑應完成37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產品的質量標準。

四、名詞解釋

酶聯免疫法：是指在酶標板上包被特定的抗原（和/或抗體）后，利用直接或間接的方法與待測樣品中的相關抗體（和/或抗原）反應，形成的抗原抗體復合物再與相應的酶標記的抗體和/或抗原進一步反應，經過酶催化底物發生顯色反應，由形成的顏色的強弱來判斷樣本中相應的抗體和/或抗原的存在。

五、參考文獻：

1.《中國生物制品規程》（2000年版），化學工業出版社

第三篇：核酸擴增法檢測試劑注冊技術審查指導原則3

附件3

核酸擴增法檢測試劑注冊技術審查指導原則

一、前言

本指導原則主要針對核酸擴增類檢測試劑的主要原材料、生產工藝及反應體系、產品質量控制等環節提出指導性技術要求。

本指導原則系對核酸擴增法檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品特性確定其中的具體內容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應的科學依據。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著法規和標準的不斷完善、科學技術的不斷發展，其相關內容也將進行適時的調整。

二、適用范圍

本指導原則適用于核酸擴增法檢測試劑的注冊技術審查，其他類核酸檢測試劑可參照相關內容。

三、基本要求

（一）基本原則

1.核酸擴增類檢測試劑的生產企業應獲得《醫療器械生產許可證》。研制、生產用的各種原料、輔料等應制定其相應的質量標準，并應符合有關法規的要求。

2．試劑生產企業應具有與其技術要求相適應的人員、廠房、設施和

— 23 — 儀器設備以及適宜的生產環境，配備滿足核酸提取和擴增檢測以及操作人員防護所需的設備。建立專用實驗室，實驗室應當嚴格分區，人員和物品應當單向流動，以最大限度地防止實驗過程中樣品之間的污染和避免擴增產物的污染。生產用于病原微生物核酸檢測的生產企業應建立符合生物安全要求的設施和措施。

3.試劑生產企業應按照《體外診斷試劑生產實施細則（試行）》的要求，建立相應的質量管理體系，并應通過《體外診斷試劑生產企業質量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。

4.核酸擴增類檢測試劑的引物設計應當符合核酸檢測設計的要求，擴增體系應設定合理的內標和外標，試劑需設置抗污染的特定措施，擴增產物須進行確證研究。

5.企業使用新型原材料時，應提供與通行原材料比對研究結果及相關資料。使用未列入上述標準的化學試劑，應不低于分析純。

（二）原材料

應提供主要原材料如引物、探針、企業參考品或標準品等的選擇與來源、制備過程、質量分析和質量標準等的相關研究資料。若主要原材料為企業自己生產，其生產工藝必須相對穩定；如主要原材料來自市場（從其他單位購買），應提供的資料包括：對物料供應商審核的相關資料、購買合同、供貨方提供的質量標準、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質量檢驗資料。主要原材料（包括生產工藝）或其供應商發生變更，應依據國家相關法規的要求進行變更申請。

核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應無脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

1.脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。應為高效液相色譜（HPLC）純、PCR級，無DNase和RNase污染?！?0℃保存?！? 24 — 2.引物

由一定數量的dNTP構成的特定序列，通常采用脫氧核糖核酸（DNA）合成儀人工合成，合成后經聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化。

凍干粉，序列正確，合成量應達到試劑生產要求。純度應達到電泳級（PAGE）或HPLC級，不含雜帶。應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如PAGE電泳結果或HPLC分析圖譜。

應作HPLC分析和紫外光吸收分析。以紫外分光光度計測定OD260nm/OD280nm的比值在1.6—2.0之間，可視為合格引物。-20℃保存。

3.探針

是指特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，在5'-端(和/或3'-端)進行標記，如熒光素報告基團或其他發光標記物，在3'-端標記熒光素淬滅基團，并經HPLC或其他適宜方法純化。

凍干粉，純度應達到HPLC純。應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如HPLC分析圖譜；應對探針的核酸序列及標記的熒光素或化學發光物進行核實，并作HPLC分析。應以可見—紫外分光光度計進行200—800nm掃描，在260nm處應有吸收峰。另外，根據標記熒光素的不同，還應該在熒光素的激發波長處有吸收峰，如FAM熒光素在494nm、TET熒光素在521nm、TAMRA熒光素在560nm處有特異的吸收峰，雜交探針在493nm、625nm、685nm處有特異的吸收峰，檢定合格后入庫。避光、-20℃保存。

4.DNA聚合酶

如Taq DNA聚合酶。應具有DNA聚合酶活性，無核酸內切酶活性；具熱穩定性，94℃保溫1小時后仍保持50%活性。-20℃保存。

5.尿嘧啶糖基化酶（UNG）

具有尿嘧啶糖基化酶活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性，IU UNG

— 25 — 在 37℃處理3分鐘后，103拷貝以下含U模板應完全降解，不能產生擴增產物。-20℃保存。

6.逆轉錄酶

具逆轉錄酶活性，無核酸內切酶活性?！?0℃保存。

（三）生產工藝

核酸擴增類檢測試劑的基本生產工藝通常包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應符合要求，原材料應混合均勻，配制過程應對電導率pH、等關鍵參數進行有效控制。

工藝研究的資料應能對反應體系涉及到的基本內容，如樣本類型、樣本用量、試劑用量、反應條件、校準方法、質控方法、臨界值的確定、穩定性和有效期，提供確切的依據。

（四）質量控制 1.半成品質量控制

（1）按批號抽取規定數量的半成品。

（2）以參考品/對照品進行半成品質量控制。如果產品具有國家標準品或參考品，應以其進行檢定。如果產品不具有國家標準品或參考品，應根據規定制備相應的企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

（3）半成品檢定內容包括：陰/陽性參考品符合率、靈敏度、特異性、精密度。檢測結果應符合質量標準的要求。

（4）半成品檢定合格后，按試劑盒組成及時進行分裝和包裝。2.成品質量控制

（1）每一批核酸擴增法檢測試劑的試生產量應滿足工藝研究、分析性能驗證、穩定性研究、臨床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求?！? 26 —（2）產品完成包裝后，應根據生產量進行抽樣和生產記錄審核。（3）以參考品/對照品進行成品質量檢驗。結果應符合要求。（4）成品檢驗的內容應包括：陰/陽性參考品符合率、靈敏度、特異性、精密度、線性范圍（定量產品）和穩定性。

5．試劑批放行前，應對需要進行穩定性考核的試劑成分，在特定溫度或條件下進行穩定性試驗。穩定性試驗可采用加速破壞試驗。

四、名詞解釋

核酸擴增法檢測試劑：核酸擴增技術泛指以擴增脫氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）為手段，檢測特定核酸序列或篩查特定基因的檢測技術，如聚合酶鏈反應（PCR）、連接酶鏈反應（LCR）、轉錄依賴的擴增反應（TMA）等。核酸擴增法檢測試劑是基于核酸擴增檢測技術的體外診斷試劑，目前已經用于病原體檢測、特定疾病的早期診斷和體內物質的型別鑒定等不同領域。

五、參考文獻

1.《中國生物制品規程》（2000年版），化學工業出版社

第四篇：孕酮檢測試劑注冊技術審查指導原則

附件3 孕酮檢測試劑注冊技術審查指導原則 本指導原則旨在指導注冊申請人對孕酮檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門審評注冊申報資料提供參考。

本指導原則是對孕酮檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是供申請人和審查人員使用的指導文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規強制執行，如有能夠滿足法規要求的其他方法，也可以采用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規、標準體系的不斷完善和科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、適用范圍 從方法學考慮，在本文中孕酮檢測試劑是指采用化學發光免疫分析技術，以競爭法為基本原理，利用全自動、半自動化學發光免疫分析儀，在醫學實驗室對人體樣本中孕酮的含量進行體外定量分析的試劑。依據《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第5號）、《體外診斷試劑注冊管理辦法修正案》（國家食品藥品監督管理總局令第30號）和《食品藥品監管總局關于印發體外診斷試劑分類子目錄的通知》（食藥監械管〔2013〕242號），孕酮檢測試劑管理類別為Ⅱ類醫療器械，分類編碼為6840。

本指導原則不適用于：

（一）單獨申請注冊的孕酮校準品和質控品。

（二）化學發光免疫分析法原理之外的其他孕酮檢測試劑。

二、注冊申報材料要求 （一）綜述資料 孕酮是一種重要的孕激素，屬于類固醇激素，相對分子量 314.5，主要由卵巢黃體和妊娠期胎盤生成，是睪酮、雌激素及腎上腺皮質激素的前體。正常男性和女性卵泡期產生的孕酮水平很低，分泌入血后主要結合于白蛋白和性激素結合蛋白在體內進行循環。孕酮水平與黃體的發育和萎縮有關。

孕酮的主要功能是使子宮為受精卵的著床做好準備，并維持妊娠。在月經周期的卵泡期，孕酮水平很低。排卵之后，由黃體產生的孕酮迅速升高，并在排卵后5—7天達到濃度最大值10ng/mL—20ng/mL，使子宮內膜從增生狀態轉為分泌狀態。若未受孕，在月經周期的最后4天黃體萎縮，孕酮濃度降低。若受孕，黃體不會凋落，繼續分泌孕酮，使孕酮保持在相當于黃體中期的水平，并一直持續到妊娠的第六周。在懷孕期間，胎盤逐漸成為孕酮的主要來源，濃度從懷孕前3個月的10ng/mL—50ng/mL升高到7—9個月的50ng/mL—280ng/mL。臨床研究證明孕酮在非孕期女性體內發揮著促進排卵和維持黃體的正常功能。如果黃體產生的孕酮不足，可能說明黃體功能不足，而黃體功能不足與不孕及早期流產有關。

血中孕酮升高可見于以下情況：（1）觀察婦女排卵的時間及黃體酮的生成情況：在排卵的－1、0、+1天，孕酮含量成倍增加，提示為有排卵。（2）正常妊娠、雙胎和多胎妊娠時孕酮合成量明顯增加，血液中孕酮水平相對升高。（3）妊娠毒血癥、先兆子癇、葡萄胎及原發性高血壓時，孕酮含量也會升高。

血中孕酮含量降低見于以下情況：（1）先兆流產、宮外孕、早產、閉經、不孕癥。（2）黃體功能不全、卵巢黃體發育不全時，孕酮含量相應降低。（3）腎上腺、甲狀腺功能嚴重失調也可影響卵巢功能，使排卵發生障礙，孕酮含量也會相應降低。

孕酮的檢測方法主要為酶聯免疫法、化學發光免疫分析法，化學發光免疫分析法是目前臨床檢測孕酮應用較多的檢測方法。

綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、生物安全性方面的說明、產品主要研究結果的總結和評價以及同類產品上市情況介紹等內容，其中同類產品上市情況介紹部分應著重從方法學、臨床應用情況、申報注冊產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的異同方面進行介紹，應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（國家食品藥品監督管理總局公告2014年第44號）的相關要求。

（二）主要原材料研究資料（如需提供）1.主要原材料的選擇、制備、質量標準及實驗驗證研究資料 檢測試劑所用抗體的制備、篩選、純化以及鑒定等詳細試驗資料。如抗體為申請人自制，則應詳述抗體的名稱及生物學來源，申請人對該抗體技術指標的要求（如外觀、純度、蛋白濃度、效價等），且其生產工藝必須相對穩定，并對其工藝有相關的驗證。同時確定該抗體作為主要原材料的依據和質量標準；

如為申請人外購，則應詳述其名稱及生物學來源，外購方名稱，提交外購方出具的抗體性能指標及檢驗報告，詳述申請人對該抗體技術指標的要求以及申請人確定該抗體作為主要原材料的依據。供貨商應相對固定。

其他主要原材料的選擇及驗證資料，申請人應詳述每一原材料技術指標的要求以及確定該原材料作為主要原材料的依據，確定質量標準。若為外購，應提供外購方名稱并提交外購方出具的檢驗報告。

2.質控品、校準品的原料選擇、制備、定值過程及實驗資料 3.校準品的溯源性文件，包括具體溯源鏈、實驗方法、數據及統計分析等詳細資料。申請人應根據GB/T21415—2008/ ISO17511:2003《體外診斷醫療器械生物樣品中量的測量 校準品和控制物質賦值的計量學溯源性》提供所用校準品的來源、賦值過程和相應指標，以及不確定度等內容。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料（如需提供）1.主要生產工藝介紹，可以圖表方式表示；

2.反應原理介紹；

3.檢測方法的介紹：含樣本采集、標準品和質控品、測試步驟、結果計算等；

4.反應體系研究：含樣本采集及處理、樣本要求、樣本用量、試劑用量、反應條件、校準方法（如有）、質控方法等的研究資料；

5.不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述。

（四）分析性能評估資料 申請人應提交在產品研制階段對試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體研究方法、試驗數據、統計方法等詳細資料。應當對多批（至少3批）產品進行性能評估。對于孕酮檢測試劑，建議著重對以下分析性能進行研究。

1.通過重復性和批間差考察精密度 1.1重復性 在重復性條件下，對濃度（2—14）nmol/L和（46—85）nmol/L的樣品分別重復測定10次，計算10次測定結果的平均值（）和標準差（SD），根據公式（1）得出變異系數（CV），其測量結果的變異系數（CV）應不大于10%（儀器自動操作法）或不大于15%（手工操作法）。

CV=SD/×100%........................................（1）1.2批間差 使用3個批次試劑盒對濃度在（2—14）nmol/L和（46—85）nmol/L范圍內的樣本各重復測定10次，計算30個測量值的平均值（）和標準差（SD）。按公式（1）計算變異系數（CV）。其測量結果的變異系數（CV）應不大于15%。

2.準確度性能評估 按以下優先順序選擇準確度性能評估方法：

2.1相對偏差 2.1.1用可用于評價常規方法的參考物質/有證參考物質（CRM）對試劑（盒）進行測試，重復檢測3次，取測試結果記為（Xi），按公式（2）計算相對偏差（Bi）。如果3次結果都符合要求，即判為合格。如果大于等于2次的結果不合格，即判為不合格。如果有1次結果不符合要求，則應重新連續測試20次，并分別按照公式（2）計算相對偏差，如果大于等于19次測試的結果符合要求，則準確度符合企業規定要求。

Bi =（Xi －T）/T………………………（2）式中：Xi—單次測試結果；

T—有證參考物質標示值或各濃度人源樣本定值；

Bi—單次相對偏差。

注：首選國家參考物質，如無國家參考物質可選用國際參考物質。

2.1.2對企業參考品進行檢測 用參考方法定值的企業參考品對試劑（盒）進行測試，重復檢測3次，取測試結果記為（Xi），按公式（2）計算相對偏差（Bi）。如果大于等于2次的結果不合格，即判為不合格。如果有1次結果不符合要求，則應重新連續測試20次，并分別按照公式（2）計算相對偏差，如果大于等于19次測試的結果符合要求，則準確度符合企業規定要求。

2.2回收實驗 選擇接近參考區間的常規檢測樣本，分為體積相同的3—4份，在其中2—3份樣本中加入不同濃度相同體積的待測物標液制備待回收分析樣本，加入體積不大于原體積的10%，制成2—3個不同濃度的待回收分析樣本，計算加入的待測物的濃度。在另一份樣本中加入同樣體積的無待測物的溶劑，制成基礎樣本。用待評價系統對待回收分析樣本和基礎樣本進行測定，通常對樣本進行3次重復測定，計算均值，取其均值進行下述計算。

回收率應在85%—115%范圍內。用公式（3）計算回收率：

…………………………………（3）式中：R-回收率；

V-加入待測物標準液的體積；

V0-基礎樣本的體積 C-樣本加入待測標準物質后的檢測濃度；

C0-基礎樣本的檢測濃度；

Cs-待測物標準液的濃度。

2.3比對實驗 參考相關國際或國內有關體外診斷產品性能評估的文件進行準確度評估。

用不少于40個覆蓋檢測濃度范圍內不同濃度的人源樣品，以申請人指定的試劑（盒）作為比對方法，每份樣品按待測試劑（盒）及比對試劑（盒）的操作方法分別檢測。線性回歸計算兩組結果的相關系數（r）、斜率及偏差，結果應符合企業規定要求。

3.檢出限性能評估 申請人需提供試劑盒的空白限、檢出限及參考區間等相關信息。根據提供信息，對5份濃度近似檢出限的低值樣本進行測定，每份樣本測定5次。對測量結果按照大小進行排序，符合如下條件，即可認為所提供的空白限和檢出限的設置基本合理。

3.1低于申請人提供的空白限數值的檢測結果數量應小于等于3個；

3.2無高于3.18nmol/L的測量結果。

4.線性范圍性能評估 將接近線性范圍上限的高值樣本按一定比例稀釋為至少5個濃度。其中，低值濃度的樣本須接近線性范圍的下限。將每一濃度的樣本重復測定最少2次，計算平均值，將結果平均值和稀釋比例用最小二乘法進行直線擬合，并計算線性相關系數（r）。

5.特異性性能評估 推薦參考《WS/T416-2013 干擾實驗指南》或相關國際、國內有關體外診斷產品性能評估的文件進行特異性評估。孕酮的干擾物質選取可參見表1，企業可在不低于行業標準的前提下根據實際情況選擇適用的干擾物質進行評估干擾程度。

5.1溶血（血紅蛋白）、脂血（甘油三酯）、黃疸（膽紅素）等干擾因素對檢測結果的影響；

5.2樣本中其他可能干擾試劑反應的物質對檢測結果的影響；

5.3資料中所提到的干擾物質，其干擾程度均不應使用模糊的描述方式，而應細化到干擾量，并提供相應的實驗數據予以支持。

表 1 孕酮干擾物參考表 序號 干擾物質 序號 干擾物質 序號 干擾物質 1 11-去氧皮質酮 6 17β-雌二醇 11 克羅米酚 2 孕烯醇酮 7 雌酮 12 11-脫氧皮質醇 3 皮質醇 8 雌三醇 13 保泰松 4 皮質酮 9 醛甾酮 14 睪酮 5 17a-羥基孕酮 10 丹那唑 15 強的松龍 評估方法：設置對照樣本組，使孕酮目標濃度為64nmol/L（允許相對偏差為±15%），重復測定（n≥7）并計算平均值（M）與標準差（SD）。設置待測樣本組，分別添加潛在干擾物于含有孕酮的樣本中，獲得待測樣本中孕酮的目標濃度為64nmol/L（允許相對偏差為±15%），待測樣本測量結果的平均值（n≥2）應在對照樣本組孕酮目標濃度M±2SD范圍內。其中，所添加潛在干擾物與含有孕酮的樣本之間體積比例為不大于1：9，對照樣本組的基質盡可能與待測樣本組樣本的基質一致。

6.校準品及質控品 參照GB/T 21415—2008《體外診斷醫療器械生物樣品中量的測量校準品和控制物質賦值的計量學溯源性》的要求，提供企業（工作）校準品及試劑盒配套校準品溯源相關資料，提供質控品賦值及其質控范圍確定的相關資料。同時，應對校準品、質控品的瓶間均勻性進行評價。

7.其他需注意問題 7.1對于適用多個機型的產品，應提供如產品說明書【適用機型】項中所列的所有適用機型的性能評估資料。

7.2如注冊申請中包含不同的包裝規格，需要對不同包裝規格之間的差異進行分析或驗證。如不同的包裝規格產品間存在性能差異，需要提交采用每個包裝規格產品進行的上述項目評估的試驗資料及總結。如不同包裝規格之間不存在性能差異，需要提交包裝規格之間不存在性能差異的詳細說明，具體說明不同包裝規格之間的差別及可能產生的影響。

（五）參考區間確定資料 應提交驗證參考值（區間）所采用樣本來源及詳細的試驗資料。參考區間可參考文獻資料，應明確參考人群的篩選標準，樣本來源應考慮不同性別、生理周期等因素，盡可能考慮樣本來源的多樣性、代表性。建議參考相關國際、國內有關體外診斷產品性能評估文件開展評估。

孕酮參考區間的確定可以按性別（男性、女性）及女性的不同生理周期。如：非孕正常女性卵泡期、黃體期、絕經后 ；

孕早期、中期、晚期等，以下列舉具有代表性的國內外廠家參考區間僅供參考（見表2）。參考值研究結果應在說明書【參考區間】項中進行相應說明。

表2 各廠家參考區間篩選分組示例 廠家 篩選分組 A ng/mL B ng/mL C ng/mL D ng/mL 男性 0.27—1.22 0.2—1.4 0.026—2.75 0.1—2.0 卵泡期 0.15—1.39 0.2—1.5 0.4—2.3 0.2—2.40 排卵期 / 0.8—3.0 1.2—18.8 0.5—3.60 黃體期 3.33—25.55 1.7—27 / 6.0—20.5 絕經期 ND—0.73 0.1—0.8 0.4—1.4 0.1—1.8 早期妊娠 0—12周 / / 15.8—46 / 中期妊娠13—28周 / / 15.6—74 / 晚期妊娠 29—40 周 / / 45—143 /（六）穩定性研究資料 穩定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩定性和適用樣本的穩定性研究。

試劑穩定性研究主要包括注冊單元中所有組成部分的效期穩定性及開瓶（復溶）穩定性等，如有需要可增加運輸穩定性、機載穩定性研究等。如試劑需要配制，還應對配制后試劑的穩定性進行研究。企業可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。常用的穩定性研究方案為證實試劑在經過被作用于指定條件后仍能證明主要性能指標要求與未被作用于指定條件的試劑性能一致。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體方法及過程。對于效期穩定性和開瓶（復溶）穩定性研究，應提供至少3批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期/開封效期后的研究資料。

適用樣本的穩定性主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗證，可以在合理溫度范圍內選擇溫度點（溫度范圍），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行穩定性驗證，從而確認不同類型樣本的保存穩定性。適于冷凍保存的樣本還應對凍融次數進行評價。試劑穩定性和樣本穩定性兩部分內容的研究結果分別在說明書《儲存條件及有效期》和《樣本要求》兩項中進行詳細說明。樣本在不同儲存條件下的穩定性期限若有相關文獻中已明確說明，亦可作為依據。

（七）臨床評價資料 此項目已經列入《關于新修訂免于進行臨床試驗醫療器械目錄的通告》（國家藥品監督管理局通告2018年第94號）中免于進行臨床試驗的體外診斷試劑目錄。根據體外診斷試劑臨床評價的相關要求，申請人可按照《免于進行臨床試驗的體外診斷試劑臨床評價資料基本要求（試行）》（國家食品藥品監督管理總局通告2017年第179號）要求進行臨床評價。如無法按要求進行臨床評價，應進行臨床試驗。

對于通過臨床試驗方式進行臨床評價時，臨床試驗資料應符合《關于發布體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則的通告》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）的要求，同時研究資料的形式應符合《體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式》中臨床研究資料有關的規定。臨床試驗中的基本要求如下：

1.研究方法 選擇境內已批準上市的性能相近的同類產品作為對比試劑，采用試驗用體外診斷試劑與之進行對比試驗研究，證明本品與已上市產品等效或優于已上市產品。建議企業盡量選擇方法學相同、線性范圍及精密度等性能接近的同類試劑作為對比試劑。

2.臨床試驗機構的選擇 應選擇不少于兩家（含兩家）已經在備案系統備案的醫療器械臨床試驗機構，臨床試驗機構實驗操作人員應充分熟悉檢測系統的各環節（試劑、質控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個實驗中，考核試劑和參比試劑都應處于有效的質量控制下，定期對儀器進行校準、保養，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。

3.臨床試驗方案 臨床試驗實施前，研究人員應從流行病學、統計學、臨床醫學、檢驗醫學等多方面考慮，設計科學合理的臨床研究方案。各臨床研究機構的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床研究機構的實驗室內并由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數據收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經入選的病例再被排除出臨床研究都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應采用盲法以保證試驗結果的客觀性。臨床試驗中所涉及的樣本類型應與產品說明書一致，且不應超越參比試劑對樣本類型的檢測要求，如果選擇了參比試劑適用樣本類型以外的樣本，則應采用其他合理方法對額外的樣本類型進行驗證。

開展體外診斷試劑臨床試驗，申請人應當按照試驗用體外診斷試劑的類別、風險、預期用途等特性，組織制定科學、合理的臨床試驗方案。一般應當包括以下內容：

3.1一般信息（包括產品信息、臨床試驗開展的時間和人員等相關信息、申請人相關信息等）；

3.2臨床試驗的背景資料；

3.3試驗目的；

3.4試驗設計；

3.5評價方法；

3.6統計方法；

3.7對臨床試驗方案修正的規定；

3.8臨床試驗涉及的倫理問題和說明、《知情同意書》文本（如有）；

3.9數據處理與記錄保存; 3.10其他需要說明的內容。

4.研究對象的選擇 4.1總體要求 選擇具有特定癥狀/體征人群作為研究對象。企業在建立病例納入標準時，應考慮到不同人群的差異，盡量覆蓋各類適用人群/在進行結果統計分析時，建議對各類人群分別進行數據統計分析，孕酮檢測樣本通常為血清，總體樣本數不少于200例，參考區間范圍外的樣本數不少于30%。樣本中待測物濃度應覆蓋待評試劑線性范圍。如果樣本類型包含血漿樣本，在上述樣本例數基礎上再增加100例與血清樣本的同源樣本比對，參考區間范圍外的樣本數不少于30%。建議在臨床試驗中選擇部分含干擾物質的樣本，包括高脂、溶血、黃疸的樣本、類風濕因子陽性樣本及其他可能產生交叉反應的樣本等。

4.2非孕女性不同生理周期的考慮 非懷孕正常女性在不同的生理期，其孕酮的含量也不同，樣本選擇時，應含有一定數量的各生理周期的樣本。如:卵泡期、排卵期、黃體期、絕經期。

4.3懷孕女性不同孕期的考慮 選取一定數量的各孕期樣本，如：孕0—12周、孕13—28周、孕29—40周。

4.4樣本數量的考慮 申報的樣本類型均應在臨床試驗中進行驗證。如產品發生涉及檢測條件優化、增加與原樣本類型具有可比性的其他樣本類型等變更事項，臨床樣本總數至少為100例，并在至少2家（含2家）臨床試驗機構開展臨床試驗；

變更抗體等主要原材料的供應商、參考區間的變化及增加臨床適應癥等變更事項，應根據產品具體變更情況，酌情增加臨床試驗總樣本數。

4.5樣本類型的考慮 血清應明確存貯條件、可否凍融等。

血漿應明確抗凝劑的要求、離心速度及時間要求、存貯條件、可否凍融等要求及避免使用的樣本。試驗中，盡可能使用新鮮樣本，避免貯存。

5.統計學分析 對臨床試驗結果的統計應選擇合適的統計方法，如相關分析、Bland-Altman分析、線性回歸、配對t檢驗等。建議統計學負責人選擇合理的統計學方法進行分析，統計分析應可以證明兩種方法的檢測結果無統計學差異。在臨床研究方案中應明確統計檢驗假設，即評價考核試劑與參比試劑是否等效的標準。

6.結果差異樣本的驗證 對于比較研究試驗中測定結果不符的樣本，應采用“金標準”或其他合理的方法進行復核，以便對臨床試驗結果進行分析。如無需復核，應詳細說明理由。

7.臨床試驗總結報告撰寫 根據《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數據和統計分析方法。建議在臨床總結報告中對以下內容進行詳述。

申請人或臨床試驗牽頭單位應對各臨床試驗機構的報告進行匯總，并完成臨床試驗總結報告。臨床試驗報告的格式及內容如下：

7.1首篇 首篇是每份臨床試驗報告的第一部分，所有臨床試驗報告均應包含該部分內容。

7.1.1封面標題 包括試驗用體外診斷試劑的通用名稱、試驗開始日期、試驗完成日期、主要研究者（簽名）、臨床試驗機構（蓋章）、統計學負責人簽名及單位蓋章、申請人（蓋章）、申請人的聯系人及聯系方式、報告日期、原始資料保存地點。

7.1.2目錄 列出整個臨床試驗報告的內容目錄和對應頁碼。

7.1.3研究摘要 對臨床試驗情況進行簡單的介紹。

7.1.4試驗研究人員 列出臨床試驗主要研究人員的姓名、單位、在研究中的職責及其簡歷（列于附件中），主要研究人員包括主要研究者及各單位的主要參加人員、統計學負責人、臨床試驗報告的撰寫人。

7.1.5縮略語 臨床試驗報告中所用的縮略語的全稱。

7.2正文內容和報告格式 7.2.1基本內容 介紹與臨床試驗產品有關的背景情況，包括：

7.2.1.1被測物的來源、生物及理化性質；

7.2.1.2臨床預期使用目的，所針對的目標適應癥人群，目前針對該適應癥所采用的臨床或實驗室診斷方法等；

7.2.1.3所采用的方法、原理、技術要求等；

7.2.1.4國內外已批準上市產品的應用現狀等。說明申請人和臨床試驗機構間的合作關系。

7.2.2研究目的 說明本臨床試驗所要達到的目的。

7.2.3試驗管理 對試驗管理結構的描述。

管理結構包括主要研究者、主要參加人員、實驗室質量控制情況、統計/數據管理情況以及試驗中發生的問題及其處理措施等。

7.2.4試驗設計 7.2.4.1試驗總體設計及方案的描述 試驗的總體設計和方案的描述應清晰、簡潔，必要時采用圖表等直觀的方式。試驗進行時方案修改的情況和任何方案以外的信息來源也應詳細敘述。應包括：

7.2.4.1.1臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹；

7.2.4.1.2病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預期選擇例數及標準；

7.2.4.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存等；

7.2.4.1.4統計學方法、統計軟件、評價統計結果的標準 7.2.4.2試驗設計及試驗方法選擇 試驗設計中應包括以下內容：

7.2.4.2.1樣本量及樣本量確定的依據。

7.2.4.2.2樣本選擇依據、入選標準、排除標準和剔除標準。

7.2.4.2.3樣本采集、保存、運輸方法等。

7.2.4.2.4對比試劑的確立。

7.2.4.2.5臨床試驗用所有產品的名稱、規格、來源、批號、效期及保存條件，對比試劑的注冊情況。考核試劑和參比試劑的名稱、批號、有效期及所用機型等信息。

7.2.4.2.6質量控制方法。對質量控制方法進行簡要的闡述。試驗人員培訓、儀器日常維護、儀器校準、質控品運行情況，對檢測精密度、質控品回收（或測量值）、抽查結果評估；

7.2.4.2.7臨床試驗數據的統計分析方法。對各研究單位的病例數、病種分布情況進行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數及百分比。

數據預處理、差異數據的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數據統計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

定量值相關性和一致性分析：用相關分析、Bland-Altman分析、線性分析、配對t檢驗等進行定量值相關性和一致性分析，應給出相關系數、95%一致性界限、回歸分析的擬合方程y=ax+b和R2、t值、p值、95%（99%）置信區間等統計結果，定量值結果應無明顯統計學差異。

7.2.4.2.8具體試驗過程，樣本檢測、數據收集、樣本長期保存、結果不一致樣本的校驗等。

7.2.4.2.9試驗過程中方案的修改 一般情況下，臨床試驗方案不宜更改。試驗過程中對方案的任何修改均應說明，對更改的時間、理由、更改過程及有無備案進行詳細闡述并論證其對整個研究結果評價的影響。

7.2.5臨床試驗結果及分析 7.2.6討論和結論。對總體結果進行總結性描述并簡要分析試驗結果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結論。

7.3有關臨床試驗中特別情況的說明 7.4附件 7.4.1臨床試驗中所采用的其他試驗方法或其他診斷試劑產品的基本信息，如試驗方法、診斷試劑產品來源、產品說明書及注冊批準情況。

7.4.2臨床試驗中的所有試驗數據，需由臨床試驗操作者、復核者簽字，臨床試驗機構蓋章（封面蓋章和騎縫章）。

7.4.3主要參考文獻 7.4.4主要研究者簡歷 7.4.5申請人需要說明的其他情況等。

（八）產品風險分析資料 申請人應考慮產品壽命周期的各個環節，從預期用途、可能的使用錯誤、與安全性有關的特征、已知及可預見的危害等方面的判定以及對患者風險的估計進行風險分析，應符合YY/T 0316—2016《醫療器械風險管理對醫療器械的應用》的要求。

（九）產品技術要求 產品技術要求應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》和《體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式》及《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》的相關規定。產品注冊單元劃分應符合《醫療器械注冊單元劃分指導原則》的要求。如已有相應的國家/行業標準發布，則技術要求中不得低于其相關要求。

作為定量檢測試劑，孕酮檢測試劑的注冊檢測應主要包括以下性能指標：外觀、裝量、溯源性、準確度、檢出限、線性范圍、重復性、批間差、特異性、穩定性。各性能指標的檢驗方法應清晰明了且具可操作性。

下面就技術要求中涉及的相關內容作簡要敘述。

1.產品型號/規格及其劃分說明 明確試劑的組成、組成成分及規格。

注1：如不同包裝規格適用不同的儀器型號，則應在劃分說明中標明。

注2：如試劑盒注冊單元中包含校準品、質控品，校準品質控品可選購，但不能單獨銷售。包裝規格中可分別設計含校準品/質控品和不含校準品/質控品的兩種包裝規格。

2.性能指標 2.1外觀 外觀應做如下要求：

2.1.1試劑盒各組分組成、性狀；

2.1.2試劑盒內外包裝完整，文字符號標識清晰。

2.2溯源性 應根據GB/T21415及有關規定提供試劑盒校準品的來源、賦值過程以及不確定度等內容。

2.3檢出限 應符合企業規定要求。

2.4線性范圍 應規定線性范圍，在所規定的線性范圍內，試劑盒相關系數（r）應≥0.9900.2.5 重復性 使用同一批試劑盒測試同一份樣本，其測試結果的變異系數（CV）應不大于10%。

2.6批間差 用三批試劑盒測試同一份樣本，其測試結果的變異系數（CV）應不大于15%。

2.7 準確度 應規定準確度要求。

注：按相對偏差、比對實驗、回收實驗優先順序。

2.8特異性 分別添加潛在干擾物于含有孕酮的樣本中，獲得待測樣本中孕酮目標濃度為64nmol/L（允許相對偏差為±15%，潛在干擾物濃度符合企業規定要求），各個樣本測量結果的均值應在目標濃度平均值（M）±2標準差（SD）范圍內。

2.9穩定性 根據產品特性，選擇以下方法進行驗證。

2.9.1應規定產品有效期，取到效期后一定時間內的樣品檢測試劑檢出限、線性、重復性、準確性、特異性應符合規定要求。

2.9.2根據所聲稱的熱穩定性條件取有效期內的試劑盒進行熱加速后，測定其檢出限、線性、重復性、準確性，特異性，結果應符合要求。

3.檢驗方法 3.1外觀 目測檢查，應符合2.1的要求。

3.2溯源性 應根據GB/T21415—2008《體外診斷醫療器械 生物樣品中量的測量及有校準品和控制物質賦值的計量學溯源性》要求提供試劑盒校準品的來源及溯源的賦值過程和不確定度的內容2.2的要求。

3.3檢出限 需提供試劑盒的空白限、檢出限及參考區間等相關信息。根據所提供信息，對5份濃度近似檢出限的低值樣本進行測定，每份樣本測定5次。對測量結果按照大小進行排序，符合如下條件，即可認為提供的空白限和檢出限的設置基本合理。

3.3.1低于提供的空白限數值的檢測結果數量應小于等于3個；

3.3.2無高于3.18nmol/L的測量結果。

3.4線性范圍 將接近線性范圍上限的高值樣本按一定比例稀釋為至少5個濃度，其中低值濃度的樣本須接近線性范圍的下限。將每一濃度的樣本重復測定最少2次，計算平均值，將結果平均值和稀釋比例用最小二乘法進行直線擬合，并計算線性相關系數（r），所得結果應符合2.4的要求。

3.5重復性 使用同一批號試劑盒對濃度在（2—14）nmol/L和（46—85）nmol/L范圍內的樣本各重復測定10次，計算10次測量濃度結果的平均值（）和標準差（SD）。按公式（1）計算變異系數（CV）。所得結果應符合2.5的要求。

3.6批間差 使用3個批次試劑盒對濃度在（2—14）nmol/L和（46—85）nmol/L范圍內的樣本各重復測定10次，計算30個測量值的平均值（）和標準差（SD）。按公式（1）計算變異系數（CV）。所得結果應符合2.6的要求。

3.7準確度 方法見（四）分析性能評估資料部分，結果符合2.7的要求。

3.8特異性 方法見（四）分析性能評估資料部分，結果符合2.8的要求。

3.9穩定性 3.9.1取到效期后一定時間內的產品，按照檢出限、線性、重復性、準確性、特異性檢測方法進行檢測，應符合2.9.1的要求。

3.9.2熱穩定性 根據所聲稱的熱穩定性條件取有效期內的試劑盒進行熱加速后，測定其檢出限、線性、重復性、準確性，特異性，應符合2.9.2的要求。

如注冊單元中包含校準品或質控品，其性能指標的檢驗方法應在技術要求中予以描述。應當包括準確度、均勻性檢驗方法的詳細描述。

（十）產品注冊檢驗報告 根據《體外診斷試劑注冊管理辦法》要求，首次申請注冊的第二類產品應該在具有相應醫療器械檢驗資質和承檢范圍的醫療器械檢測機構進行注冊檢測。承接注冊檢測的機構在出具檢測報告的同時，應出具相應的預評價意見，預評價意見在提交注冊資料時應隨注冊檢測資料時一并提交。

（十一）產品說明書 產品說明書承載了產品預期用途、試驗方法、檢測結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學解釋的重要依據。因此，產品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。

應符合《醫療器械說明書和標簽管理規定》（國家食品藥品監督管理總局令第6號）和《關于發布體外診斷試劑說明書編寫指導原則的通告》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）的要求，以申報產品為基礎，以研究結果為依據，對孕酮測定試劑說明書的重點內容進行詳細說明，以指導注冊申報人員更合理地完成說明書編制。

1.【產品名稱】 1.1通用名稱：試劑（盒）名稱由三部分組成：被測物名稱、用途、方法或原理。例如：孕酮測定試劑盒（化學發光免疫分析法）。名稱中不應當出現定性/定量等內容。

1.2英文名稱（適用進口產品）。如不適用，可刪除。

2．【包裝規格】 2.1應與產品技術要求包裝規格一致；

2.2應能清晰地描述出試劑盒的構成，不得出現試劑盒的組成成分與包裝規格中描述不一致的情況。

2.3應注明可測試的樣本數或裝量，如××測試/盒、××mL。

2.4如不同包裝規格有與之特定對應的機型，則應同時明確適用機型。

2.5單一包裝規格，可以不加標點符號；

多個包裝規格，按照分隔層次分別適用頓號、逗號、分號進行區分，以句號結束。不得采用列表形式進行描述。

3.【預期用途】 3.1第一段說明試劑盒用于體外定量測定血清或血漿中的孕酮的含量。

3.2第二段應強調臨床適應癥（可使用不同的描述方式），參考（一）綜述資料部分。

4.【檢驗原理】 應詳細闡明試劑的工作原理，例如采用基于磁微?；瘜W發光免疫分析技術的競爭法反應原理為：樣本中的孕酮和磁微粒包被的孕酮抗原競爭與吖啶酯標記的抗體結合，樣本中的孕酮越多，吖啶酯標記的抗體與固相磁珠包被的孕酮抗原結合的越少，樣本中的孕酮含量與光量子數成反比。

5.【主要組成成分】 5.1說明試劑盒包含組分的名稱信息，如果對于正確的操作或使用者理解其用途很重要，應詳細說明。對于多組分試劑盒，明確說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

5.2如注冊單元含校準品或質控品也應對主要組成成分及生物學來源進行相應說明，校準品需注明其定值及溯源性。溯源性應寫明溯源的最高級別，包括標準物質或參考物的發布單位及編號。

如：校準品：校準品具有批特異性，每批定值，定值見瓶簽標示，量值可溯源至國家標準物質GBW09199。

質控品需注明靶值范圍，如靶值范圍為批特異，可注明批特異，并附單獨的靶值單。

6．【儲存條件及有效期】 6.1對試劑盒的效期穩定性、開瓶穩定性等信息做詳細介紹，包括環境溫濕度、避光條件等。如注冊單元含校準品或質控品且其形態為干粉（包含試劑為凍干粉狀態），則應對復溶后的儲存條件、穩定性做詳細介紹。如試劑需要配制，則應對配制后的試劑的儲存條件、穩定性做詳細介紹。

6.2保存溫度不應有模糊表述，如“常溫”“室溫”，應直接以℃為單位。小于3個月的穩定期限應以日或小時為單位，大于或等于3個月的穩定期限應以月為單位。

6.3如試劑盒各組分的穩定性不一致，則應對各組分的儲存條件和有效期分別進行描述。

6.4對于可以冷凍的試劑應注明凍融次數限制。

6.5生產日期、使用期限或失效日期（可見標簽）。

7.【適用機型】 注明所適用的儀器類型，應細化到型號。如需要可提供與儀器有關的信息以指導用戶操作。

如適用儀器為酶標儀則需給出對酶標儀配置的要求，如適用儀器為非通用的儀器則需寫明其具體型號，避免“系列”。

8.【樣本要求】 　 應在以下幾方面進行說明：

8.1適用的樣本類型。

8.2在樣本收集過程中的特別注意事項。

8.3為保證樣本各組分穩定所必需的抗凝劑或保護劑等。

8.4已知的干擾物。

8.5能夠保證樣本穩定的儲存、處理和運輸方法。

9.【檢驗方法】 詳細說明試驗操作的各個步驟，包括：

9.1試劑配制：各試劑組分的稀釋、混合及其他必要的程序。

9.2校準程序（如有）：應說明校準品的使用方法、注意事項、推薦的校準周期，以及何種情況須重新校準。

9.3質量控制程序：應說明質控品的使用方法、注意事項、對質控結果的必要解釋以及推薦的質控周期等。

9.4試驗結果的計算或讀取，包括對每個系數及對每個計算步驟的解釋。如果可能，應舉例說明。

10.【參考區間】 簡要參考區間的確定方法。

建議注明以下字樣“由于地理、人種、性別及孕期等差異，建議各實驗室建立自己的參考區間”。

應與資料（五）參考區間確定性資料數據一致。

11．【檢驗結果的解釋】 應根據其臨床意義對可能出現的結果進行合理的解釋。

說明試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應結合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查等情況綜合考慮。

說明在何種情況下應對樣本進行重復測試，以及在重復測試時需要采取的樣本處理方式。

12.【檢驗方法的局限性】 明確常見干擾物質對檢測結果的影響，企業可根據自身情況對特殊干擾物進行說明，并注明可接受的最高限值，不應使用模糊的描述方式。不建議使用存在明顯干擾物如乳糜、黃疸等樣本。

試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，不能單獨作為確診或排除病例的依據，為達到診斷目的，此檢測結果要與臨床檢查、病史和其他的檢查結果結合適用。

13.【產品性能指標】 與技術要求中主要性能指標保持一致，孕酮產品主要性能指標可包含：

13.1檢出限；

13.2線性范圍；

13.3重復性；

13.4準確度；

13.5特異性。

14.【注意事項】 14.1必要內容，如：“本品僅用于體外診斷”。

14.2如該產品含有人源或動物源性物質，應給出具有潛在感染性的警告。說明不同分析系統間的檢測結果可能存在的差異。

說明對所有樣本和反應廢棄物都應視為傳染源對待。

14.3說明檢測過程中應嚴格按照說明書提供的操作步驟及相關實驗室規范要求進行操作，否則可能對結果造成的影響。

14.4其他需要說明的注意事項。

15.【標識的解釋】如有圖形或符號，請解釋其代表的意義。可參考相關標準：YY/T0466.1—2016。

16.【參考文獻】 注明引用參考文獻，其書寫應清楚、易查詢且格式規范統一，符合相關標準要求。

17.【基本信息】 17.1境內體外診斷試劑 17.1.1注冊人與生產企業為同一企業的，按以下格式標注基本信息：注冊人/生產企業名稱，住所，聯系方式，售后服務單位名稱，聯系方式，生產地址，生產許可證編號。

17.1.2委托生產的按照以下格式標注基本信息：注冊人名稱，住所，聯系方式，售后服務單位名稱，聯系方式，受托企業的名稱，住所，生產地址，生產許可證編號。

17.2進口體外診斷試劑 按照以下格式標注基本信息：注冊人/生產企業名稱，住所，生產地址，聯系方式，售后服務單位名稱，聯系方式，代理人的名稱，住所，聯系方式。

18.【醫療器械注冊證編號/產品技術要求編號】 應當寫明醫療器械注冊證編號/產品技術要求編號。

19.【說明書核準日期及修改日期】 應注明該產品說明書的核準日期。如曾進行過說明書的變更申請，還應該同時注明說明書的修改日期。

三、審查關注點 （一）關注檢驗報告中檢測結果的報告單位，孕酮的結果報告單位分為兩種：ng/mL和nmol/L兩個單位的轉換公式為。ng/mL×3.18=nmol/L。

（二）關注產品技術要求及說明書中性能指標的一致性。

（三）關注臨床試驗所采用的樣本類型、樣本量及臨床研究單位的選擇、對比試劑的選擇、統計方法及研究結果、臨床方案及報告撰寫的格式等是否符合《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》對相關內容的規定。

（四）由于孕酮在不同時期的參考范圍不同，因此需關注臨床評價資料中是否涵蓋了不同時期的臨床數據，并重點關注參考范圍研究資料。

（五）說明書中預期用途、儲存條件及有效期、檢驗方法、參考區間、產品性能指標、抗干擾能力等描述應分別與臨床評價資料、穩定性研究資料、主要生產工藝和反應體系研究資料、參考范圍研究資料、分析性能評估資料的研究結論相一致。

四、名詞解釋 （一）化學發光免疫分析法。化學發光分析是根據化學反應產生的輻射光的強度來確定物質含量的分析方法?；瘜W發光免疫分析是將化學發光系統與免疫反應相結合，用化學發光相關的物質標記抗體或抗原，與待測的抗原或抗體反應后，經過分離游離態的化學發光標記物，加入化學發光系統的其他相關物產生化學發光，進行抗原或抗體的定量或定性檢測。

（二）準確度（Accuracy）。一個測量值與可接受的參考值間的一致程度。

（三）分析特異性（Analytical Specificity）。測量程序只測量被測量物的能力。分析特異性用于描述檢測程序在樣本中有其他物質存在時只測量被測量物的能力。通常以一個被評估的潛在干擾物清單來描述，并給出在特定醫學相關濃度值水平的分析干擾程度。

（四）線性（Linearity）。在給定測量范圍內，給出的測量結果與樣品中實際存在的被測量物的值成比例的能力。線性是描述一個測量系統的測量示值或測量結果相關于樣本的賦值符合直線的屬性。

（五）精密度（Precision）。在規定條件下，相互獨立的測試結果之間的一致程度。精密度的程度是用統計學方法得到的測量精密度的數字形式表示，如標準差（SD）和變異系數（CV）。

（六）參考物質（Reference Material）。具有一種或多種足夠均勻和很好地確定了特性，用于校準測量裝置、評價測量方法或給材料賦值的一種材料或物質。對于該項目，指國家標準物質、可溯源至IFCC糖化血紅蛋白參考方法或標準品的標準物質、可溯源至NGSP參考方法或標準品的標準物質。

五、指導原則編寫單位和人員 吉林省食品藥品監督管理局。

第五篇：CYP2C19藥物代謝酶基因多態性檢測試劑注冊技術審查指導原則（2019年）

附件2

CYP2C19藥物代謝酶基因多態性檢測試劑

注冊技術審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對CYP2C19藥物代謝酶基因多態性檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是對CYP2C19藥物代謝酶基因多態性檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，也不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料，相關人員應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、適用范圍

藥物代謝酶在藥物體內代謝過程中起著重要作用，其活性強弱是藥物代謝速率的重要影響因素，直接決定了藥物作用的強度和持久性。人體內的藥物代謝酶主要有細胞色素P450（CYP450）同工酶和N-乙酰轉移酶（NAT）等。CYP2C19酶是一種重要的CYP450同工酶，臨床以CYP2C19酶為主要代謝酶的藥物包括抗血小板藥物（如：氯吡格雷）和質子泵抑制劑等。氯吡格雷是一種抗血小板藥物，廣泛用于：急性冠脈綜合征（ACS）患者，包括非ST段抬高性ACS（不穩定性心絞痛UA或非Q波心肌梗死）和ST段抬高性心肌梗死（NSTEMI）患者，其中，非ST段抬高性ACS包括經皮冠狀動脈介入術后置入支架的患者；外周動脈性疾病患者；近期心肌梗死或近期缺血性卒中患者。氯吡格雷作為一種前體藥物，本身并無藥理活性，主要經CYP2C19酶代謝活化，產生活性代謝產物，后者與血小板表面的P2Y12受體不可逆結合，抑制血小板聚集，干擾ADP介導的血小板活化，發揮抗血小板效應。

CYP2C19酶的編碼基因為CYP2C19基因，位于人類10號染色體上。CYP2C19基因含有42個等位基因，CYP2C19*1為野生型等位基因，其編碼的酶具有正常活性。CYP2C19*2（rs4244285，c.681G>A）和CYP2C19*3（rs4986893，c.636G>A）編碼的CYP2C19酶活性降低，是中國人群中存在的2種主要的等位基因，在中國人群的發生頻率分別為23.1%～35%和2%～7%。CYP2C19*17（rs12248560,c.-806C>T）編碼的CYP2C19酶活性增強，在中國人群的發生頻率約為0.5%～4%。除CYP2C19*2/*3/*17之外，可能影響CYP2C19酶活性的CYP2C19等位基因還包括CYP2C19*4～CYP2C19*8等，但這些等位基因在中國人群的發生頻率低，其功能與臨床意義有待進一步研究。

CYP2C19基因的遺傳變異導致CYP2C19酶活性的個體差異，使人群出現超快代謝者（UM）、快代謝者（EM）、中間代謝者（IM）和慢代謝者（PM）4種表型。CYP2C19

UM患者應用常規劑量的氯吡格雷后體內生成的活性代謝產物增多，對血小板的抑制作用升高，抗血小板功能增強，出血風險增大。而CYP2C19

PM患者應用常規劑量的氯吡格雷后體內生成的活性代謝產物減少，對血小板的抑制作用下降，抗血小板功能減弱，血栓風險增大。UM個體的基因型可為CYP2C19*17/*17純合型或CYP2C19*1/*17雜合型；EM個體的基因型可為CYP2C19*1/*1純合型；IM個體的基因型可為CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3、CYP2C19*2/*17或CYP2C19*3/*17雜合型；PM個體的基因型可為CYP2C19*2/*3、CYP2C19*2/*2和CYP2C19*3/*3雜合型或純合型。

通過CYP2C19藥物代謝酶基因多態性檢測，可將服藥人群分為上述4類氯吡格雷代謝患者，從而用于氯吡格雷的用藥指導。美國FDA在氯吡格雷藥物說明書中建議：對于CYP2C19

PM患者，可考慮使用其他血小板P2Y12抑制劑。遺傳藥理學知識庫以及臨床遺傳藥理學實施聯盟（CPIC）發布的CYP2C19基因型和氯吡格雷用藥指導文件建議：對于CYP2C19

PM患者和IM患者，可選用其它抗血小板藥物（如：普拉格雷或替格瑞洛）進行治療。2015年，原國家衛生計生委發布的《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南（試行）》也建議：對于CYP2C19

PM患者的抗血小板治療，可增加氯吡格雷的劑量或選用其他不經CYP2C19代謝的抗血小板藥物（如替格瑞洛）等。

然而，對于哪些氯吡格雷服藥人群需進行CYP2C19基因型檢測，國內外尚無統一意見。2013年發布的《抗血小板治療中國專家共識》建議：CYP2C19基因型檢測臨床應用價值有限，不推薦常規進行。CPIC在隨后發布的CYP2C19基因型和氯吡格雷用藥指導文件中建議：基于CYP2C19基因型的氯吡格雷抗血小板治療主要用于進行經皮冠狀動脈介入治療的急性冠脈綜合征患者（簡稱為ACS/PCI患者），尚無證據表明CYP2C19基因型可用于指導氯吡格雷在其他患者中的抗血小板治療。2014年發布的《抗血小板藥物治療反應多樣性臨床檢測和處理的中國專家建議》建議：不推薦常規進行CYP2C19基因型檢測，僅對PCI術后血栓高危、且計劃調整P2Y12抑制劑治療方案的患者，推薦進行血小板功能檢測和CYP2C19基因型檢測。2017年發布的《基因多態性與抗栓藥物臨床應用專家建議》建議：CYP2C19基因型檢測主要對缺血高風險/出血高風險患者選用P2Y12抑制劑有參考價值。綜合考慮上述意見并結合中國實際情況，建議將本指導原則的預期適用人群限定為：

正在服用或將要服用氯吡格雷進行抗血小板治療的冠心病患者，主要為急性冠脈綜合征（ACS）且進行經皮冠狀動脈介入治療（PCI）的患者（ACS/PCI患者）、PCI術后血栓高危且計劃調整P2Y12抑制劑治療方案的患者、缺血高風險或出血高風險患者等。其中，PCI術后血栓高危患者以及缺血高風險/出血高風險患者的人群限定可參考相關指南。

本指導原則所述CYP2C19藥物代謝酶基因多態性檢測試劑是指：利用分子生物學檢測技術，如聚合酶鏈反應（PCR）等，以CYP2C19基因特定序列為檢測靶標，對接受氯吡格雷治療患者的外周靜脈全血或口腔拭子等樣本基因組DNA中的CYP2C19基因多態性進行體外定性檢測的試劑，用于氯吡格雷的用藥指導。

本指導原則的技術要求是基于熒光探針PCR方法建立的，對于其他分子生物學檢測技術，可能部分要求不完全適用或本文所述技術指標不夠全面，申請人可以根據產品特性對不適用部分進行或補充其他的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學合理性。

本指導原則僅對用于氯吡格雷用藥指導的CYP2C19藥物代謝酶基因多態性檢測試劑的相關要求進行了說明，由于CYP2C19參與了多種不同藥物的代謝，對用于其他藥物用藥指導的CYP2C19藥物代謝酶基因多態性檢測試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述技術指標不夠全面，申請人可以根據產品特性對不適用部分進行修訂或補充其他的評價和驗證。

本指導原則適用于進行首次注冊申報和相關許可事項變更的產品。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、研究結果的總結評價以及國內外同類產品上市情況介紹等內容。其中，同類產品上市情況介紹部分應著重從方法學、檢驗原理、最低檢測限及被測靶標（基因多態性位點）等方面詳細說明申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區別。除此之外，還應說明被測靶標純合型和雜合型在中國人群的發生頻率。

若被測靶標為新的多態性位點，申請人還應提交支持資料，以證明：1.攜帶新位點等位基因所編碼的CYP2C19酶對氯吡格雷具有預期的代謝活性；2.攜帶新位點等位基因的患者，其血小板功能具有預期的差異；3.接受氯吡格雷治療且攜帶新位點等位基因的患者表現出預期的主要不良心血管事件；4.根據基因型調整抗血小板治療方案后，攜帶新位點等位基因的患者預后獲得改善。上述資料應為體內臨床試驗數據，如：在預期適用人群體內進行的酶速率研究試驗，基因型與預期適用人群的主要不良心血管事件關聯試驗，基因型導向的抗血小板治療試驗等。上述資料必須包括基于中國人群的充分的臨床數據。如新位點可用于氯吡格雷用藥指導的結論已獲得行業認可，應同時提交證明其獲得行業認可的支持資料。

綜述資料應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（原國家食品藥品監督管理總局令第5號，以下簡稱《辦法》）和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（原國家食品藥品監督管理總局公告2014年第44號），以下簡稱《44號公告》的要求。

（二）主要原材料的研究資料

CYP2C19基因多態性檢測試劑主要原材料研究資料包括主要反應成分、質控品及企業參考品的研究資料。

1.此類產品的主要反應成分一般包括人基因組核酸提取/純化試劑、檢測所需引物、探針、酶、dNTP、反應緩沖液等。申請人應提交相關原材料的選擇、制備和質量標準研究資料。如為申請人自制，應提交詳細的工藝穩定性研究資料；如為外購，還應提交供應商篩選資料以及供應商提供的原材料質量檢定報告。

1.1

核酸提取/純化試劑（如有）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。

1.2

引物、探針

本文所述CYP2C19基因多態性檢測一般針對等位基因CYP2C19*1、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17。申請人應詳述引物、探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應情況。建議設計兩套或多套引物探針以供篩選，針對待測位點的檢測靈敏度和特異性等進行評價，選擇最佳設計，并提交詳細的篩選研究數據。同時應針對引物、探針核酸序列及檢測靶序列進行同源性比對，如有同源序列應著重評價是否會有交叉反應。

申請人應針對選定的引物、探針原材料進行質量評價，一般包括：分子量、純度（HPLC等）、濃度、探針熒光標記基團的激發波長和發射波長，以及功能性試驗等，并依據評價結果建立合理的質量標準。

1.3酶

CYP2C19基因多態性檢測試劑可能涉及到的酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）。申請人應針對各種酶的活性進行驗證，提交功能性試驗資料，并確定酶的質量標準。

DNA聚合酶應具有DNA聚合酶活性，無核酸內切酶活性，具熱穩定性。UDG/UNG應具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性。

1.4脫氧三磷酸核苷（dNTP）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應提交對其純度、濃度、保存穩定性等的驗證資料，以及功能性試驗資料，并確定質量標準。

2.質控品

試劑盒的質控體系通過設置各種試劑盒質控品來實現。

CYP2C19基因多態性檢測試劑的質控品可分別設置野生型、雜合型及純合突變型DNA樣品（至少包含常見的多態性位點），同時設置不含待測靶序列的空白質控品用于交叉污染的質控；亦可直接采用常見多態性位點的雜合型樣品及空白質控品進行質量控制。

對于此類產品，一般情況下，反應體系中野生型序列和突變型序列均有陽性反應，可以對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，則試劑盒中可不另外設置內標對照；否則，應另外設置內標對照。

質控體系應能夠對檢測全過程進行有效的質量控制，包括試劑及儀器性能、可能的擴增反應抑制物（管內抑制）、交叉污染等因素造成的假陰性或假陽性結果。質控品可采用質粒或臨床樣本的核酸提取液等?？瞻踪|控品應參與樣本核酸的平行提取。申請人應針對質控品原料選擇、制備、定值過程等提供詳細的研究數據，并對質控品的檢測結果做出明確的范圍要求。

3.企業參考品

企業參考品主要包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品、精密度參考品等。申請人應提交有關企業參考品原料選擇、制備方法、基因序列確認及檢驗標準的研究資料，包括所用到的參考方法等。

3.1陽性參考品：可采用臨床樣本或其核酸提取液，樣本類型與待測樣本一致。應至少包含野生型和所有多態性位點的雜合型樣本，同時盡量納入純合突變型樣本。對于某些稀有基因型，需要時也可采用細胞系代替。

3.2陰性參考品：應考慮檢測特異性的評價，納入同源序列交叉反應樣本、干擾樣本等。

3.3檢測限參考品可選擇最低檢測限濃度（例如：95%檢出率水平）或接近最低檢測限濃度（例如100%檢出率水平）的臨床樣本或其核酸提取液，至少包含所有多態性位點的雜合型樣本。

3.4精密度參考品應至少包括所有多態性位點的低濃度雜合突變型臨床樣本或其核酸提取液。

如CYP2C19基因多態性檢測試劑已有國家參考品，企業參考品的要求應不低于國家參考品要求。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料

主要生產工藝研究資料包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTP濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標記等工藝過程的描述及確定依據。生產過程應對關鍵參數進行有效控制，可采用流程圖方式描述生產工藝，標明關鍵工藝質控步驟，并詳細說明該步驟的質控方法及質控標準。

反應體系研究指最佳反應條件的選擇確定過程，包括樣本采集預處理、樣本保存、樣本用量、試劑用量、核酸提取純化步驟（如有）、PCR反應條件、閾值循環數（Ct值）等的確定。

不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述。

（四）分析性能評估資料

申請人應針對下述各項分析性能提交詳細的評估資料，包括試驗方法、試驗樣本（類型、來源、數量、處理方法、基因型和濃度確認）、試驗可接受標準、統計方法、試驗數據及結論等。有關背景信息也應在資料中有所體現，包括實驗地點、適用儀器、試劑規格、批號等。分析性能評估的實驗方法可以參考相關國內或國外有關體外診斷產品性能評估的指導原則進行。

每項性能評估應盡量采用與適用樣本類型一致的臨床樣本，對于某些稀有基因型也可采用細胞系等。

如產品適用樣本類型不止一種，申請人應針對不同樣本類型分別完成性能評估。

1.核酸提取/純化性能（如有）

在進行靶核酸檢測前，應有適當的核酸提取/純化步驟。該步驟除最大量分離出目的核酸外，還應有相應的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有核酸提取/純化的組分，企業都應結合檢測試劑的特性，對配合使用的核酸提取/純化方法的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗證，并評價該方法能否滿足CYP2C19基因多態性檢測試劑的要求，提供詳細的評價資料。

2.檢測準確性

建議采用若干份臨床樣本驗證CYP2C19基因多態性試劑的檢測準確性，樣本類型與產品適用范圍一致；樣本應涵蓋野生型和所有多態性位點的雜合突變、純合突變情況，并包含不同基因組DNA濃度。對于某些基因型樣本較為稀有的情況，亦可采用細胞系代替。

3.檢測限和可報告范圍

CYP2C19基因多態性檢測試劑的最低檢測限可定義為：在滿足一定的檢測準確性和精密度的條件下，能夠檢出目標基因的最低人基因組DNA濃度。檢測限評價建議采用臨床樣本或細胞系，并至少包含所有多態性位點的雜合突變型。

可采用梯度濃度的人基因組DNA樣本進行多次重復檢測，確定適當檢出率水平（如：95%）下的最低人基因組DNA濃度，即為最低檢測限。系列稀釋度應能夠覆蓋大部分檢出概率區間（0～100%），可根據各濃度梯度檢測結果直接判定，也可通過概率計算或其他適當方法進行測算。

同時，申請人亦應評價CYP2C19基因多態性試劑可準確檢出的人基因組DNA濃度上限，即適當檢出率水平下的最高人基因組DNA濃度。

4.分析特異性

4.1

應針對同源性序列（例如CYP2C19的其他突變序列、CYP2C9基因序列等）進行交叉反應驗證，說明交叉反應樣本的制備方法、核酸序列確認方法，提交詳細的驗證資料。

4.2

應針對可能的內源和外源性干擾物進行干擾試驗研究。干擾物的選擇與所用樣本類型有關，例如：全血樣本，內源干擾物主要涉及血脂、膽紅素、血紅蛋白和白蛋白等，外源干擾物主要包括血液樣本采集可能用到的抗凝劑、常用藥物等；對于口腔拭子樣本，干擾物需考慮全血、口腔定植菌以及口腔可能接觸到的抗菌漱口液、牙膏、食物、藥物、煙草等。

干擾試驗可通過在臨床樣本中人工添加干擾物質的方式，評價干擾物質對目標基因檢測的影響，也可直接采集暴露于干擾因素后的受試者樣本，進行干擾試驗評價。建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價；如有干擾，應確定不產生干擾的最高濃度。

5.精密度

精密度評價應采用臨床樣本進行試驗，試驗操作完全按照說明書執行，包含核酸提取/純化等樣本處理步驟。樣本應至少涵蓋所有多態性位點的雜合突變型。

精密度評價需滿足如下要求：

5.1對可能影響檢測精密度的主要因素進行驗證，除檢測試劑（包括核酸提取/純化組分）本身外，還包括分析儀、操作者、地點、時間、檢測輪次、試劑批次等。

5.2設定合理的精密度評價周期，對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間重復性進行評價。

5.3用于精密度評價的臨床樣本應根據可報告范圍的基因組DNA濃度至少設置低濃度和中/高濃度水平。

5.4精密度指標可設置為檢測成功率等，申請人應對精密度指標評價標準做出合理要求。

精密度評價資料應詳述試驗設計、試驗數據、統計分析及試驗結果，列出有關試劑、儀器、實驗室、人員、樣本的相關信息。

（五）陽性判斷值確定資料

對于此類試劑，陽性判斷值即為能夠獲得理想的檢測準確性的臨界值（Cut-off）。建議納入一定數量的臨床樣本，涵蓋野生型和所有多態性位點的突變型，采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進行研究。相關資料中應詳述試驗方案、樣本來源、樣本量、樣本入組標準及試驗結果等。

應針對不同樣本類型（如有）分別進行陽性判斷值研究，明確是否有差異。

如果試劑判讀存在灰區，應解釋說明灰區范圍的確定方法。

對于某些檢測方法學，陽性判斷值研究可能不適用，申請人應說明理由。

（六）穩定性研究資料

穩定性研究資料主要包括申報產品的穩定性研究和適用樣本的穩定性研究兩部分。前者主要包括申報產品的實時穩定性、開瓶穩定性、復溶穩定性、運輸穩定性及凍融次數限制的研究等；后者則是指適用樣本的保存條件、保存時間等方面的研究，如果包括多種樣本類型，則需分別完成相關研究。

申報產品實時穩定性研究中，應采用至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后，選取多個時間點進行產品性能評價，從而確定產品保存條件和有效期。

樣本穩定性研究中，如核酸提取液不一定立即進行檢測，則還需對核酸提取液的保存條件和穩定性進行研究。

申請人應提交有關穩定性研究方案的確定依據、具體的試驗方法及詳細的研究數據、結論。

（七）臨床試驗

應滿足《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（原國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）的要求，下面僅說明本類試劑臨床試驗中應關注的重點問題。

1.臨床試驗機構

申請人應當選定不少于3家（含3家）臨床試驗機構，按照相關規定開展臨床試驗。申請人應根據產品特點及預期用途，綜合不同地區人種和流行病學背景等因素選擇臨床試驗機構。

2.臨床試驗人群

正在服用或將要服用氯吡格雷進行抗血小板治療的冠心病患者，主要為急性冠脈綜合征（ACS）且進行經皮冠狀動脈介入治療（PCI）的患者（ACS/PCI患者）、PCI術后血栓高危且計劃調整P2Y12抑制劑治療方案的患者、缺血高風險或出血高風險患者等。其中，PCI術后血栓高?；颊咭约叭毖唢L險/出血高風險患者的人群限定可參考相關指南。

3.臨床樣本

應為臨床原始樣本，如靜脈抗凝全血等，不應直接采用提取的基因組DNA進行試驗。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應同時滿足申報產品說明書以及對比試劑說明書（如適用）的相關要求。

4.臨床試驗樣本量

如申報產品同時適用于靜脈全血或口腔拭子等不同基質的樣本類型，則每種樣本類型的例數應分別滿足法規要求。

5.臨床檢測準確性驗證

5.1

對比試劑

5.1.1已有同類產品上市的申報產品

對于已批準的CYP2C19*2（rs4244285，c.681G>A）、CYP2C19*3（rs4986893，c.636G>A）以及CYP2C19*17（rs12248560,c.-806C>T）多態性位點，可選擇已上市同類試劑作為對比試劑。

5.1.2

無同類產品上市的申報產品

對于新的多態性位點，可選擇基因測序作為對比方法。

5.1.3基因測序

應提交臨床試驗機構和測序機構簽章的委托測序協議。應對選用的測序方法做詳細介紹，應提供以下關于測序的詳細試驗資料，該部分資料需由臨床試驗機構簽章。

5.1.3.1測序原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關信息。

5.1.3.2測序方法所用引物信息，如核酸序列、分子量、純度、功能性實驗等資料。引物設計應涵蓋申報產品擴增的被測靶標。

5.1.3.3

測序方法的性能驗證，尤其是最低檢測限的確認，建議將所選測序方法與申報產品的性能進行比對分析。

5.1.3.4

測序方法應建立合理的陽性和陰性質控，以對臨床樣本的檢測結果進行質量控制。

5.1.3.5

提交有代表性的樣本測序圖譜及結果分析資料。

6.氯吡格雷指導用藥臨床有效性的驗證

6.1

已有同類產品上市的申報產品

已批準的CYP2C19*2（rs4244285，c.681G>A）、CYP2C19*3（rs4986893，c.636G>A）以及CYP2C19*17（rs12248560,c.-806C>T）多態性位點，無需進行該部分驗證。

6.2

無同類產品上市的申報產品

6.2.1如新多態性位點用于氯吡格雷用藥指導已獲行業認可（包括：CPIC、國內相關指南或專家共識、相關藥物說明書以及臨床應用等的認可），且有充分的中國人群的體內臨床數據，無需進行該部分驗證。

6.2.2如新多態性位點用于氯吡格雷用藥指導未獲行業認可，應提交基于中國人群的充分的體內臨床數據，包括但不限于：

6.2.2.1新的多態性位點等位基因編碼的CYP2C19酶對氯吡格雷的代謝動力學驗證資料。

6.2.2.2血小板功能檢測。比較不同基因型患者血小板功能的差異。

6.2.2.3基因型與主要不良心血管事件關聯性的體內臨床試驗。

6.2.2.4基因型可指導氯吡格雷用藥的有效性證據。

6.2.3

需要強調的是，對于6.2所述申報產品（包括6.2.1和6.2.2），申請人應在臨床試驗資料部分提交聲稱的新多態性位點已獲行業認可的相關資料以及基于中國人群的充分的體內臨床數據等，以證明申報產品可指導氯吡格雷用藥。

7.臨床試驗方法、數據及統計分析

7.1應在臨床試驗方案或報告中描述申報產品和對比試劑/方法的試驗方法。

7.2臨床試驗原始數據應以列表方式表示，包括申報產品的結果、對比試劑/方法的結果、臨床診斷、年齡、性別以及是否進行PCI等。

7.3應總結野生型、各多態性位點雜合型和純合突變型的例數，以交叉四格表分別總結兩種試劑對各多態性位點的定性檢測結果，并分別計算各多態性位點基因型的陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%置信區間，對定性結果分別進行四格表卡方或kappa檢驗，以驗證兩種試劑檢測結果的一致性。

7.4

結果差異樣本的驗證

在數據收集過程中，對于兩種試劑檢測結果不一致的樣本，應采用合理方法進行復核，并對差異原因進行分析。如無需復核，應說明理由。

8.臨床試驗方案

各臨床試驗機構的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床試驗機構的實驗室內并由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程。

試驗方案應確定嚴格的入選/排除標準，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程和結果判定時應采用盲法以保證試驗結果的客觀性。各臨床試驗機構選用的對比試劑/方法應保持一致，以便進行合理的統計學分析。另外，申報產品的樣本類型不應超越對比試劑/方法對樣本類型的要求。

9.臨床試驗報告

應對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的數據和統計分析方法。

（八）產品技術要求

產品技術要求應符合《辦法》《44號公告》和《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》（原國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號）的相關要求。該類產品作為三類體外診斷試劑，應將主要原材料、生產工藝及半成品要求等內容作為附錄附于技術要求正文后。

如果申報產品已有相應的國家/行業標準發布，則企業標準的要求不得低于上述標準要求。

（九）產品檢驗報告

根據《辦法》的要求，第三類體外診斷試劑申請注冊時應提交連續三個生產批次樣品的檢驗報告。如有國家標準品/參考品的檢驗項目，應在產品檢驗時采用。

（十）產品說明書

產品說明書應滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（原國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）的要求，產品說明書的所有內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結果保持一致。下面對CYP2C19藥物代謝酶基因多態性檢測試劑說明書的重點內容進行闡述。

1.【預期用途】

應至少包括以下幾部分內容：

1.1本產品用于體外定性檢測人體xx樣本中的yy基因多態性，可檢測的多態性類型包括aa，本產品用于氯吡格雷的用藥指導。本產品不能預測患者對氯吡格雷的應答情況，僅能輔助醫生確定氯吡格雷治療策略。本產品檢測結果僅供臨床參考，不應作為患者是否用藥的唯一依據，臨床醫生應結合患者病情、療效及其他實驗室檢測指標等對本產品的檢測結果進行綜合判斷。

1.2介紹被測靶標（基因多態性位點），明確各多態性雜合型和純合型的臨床發生頻率，明確可進行氯吡格雷用藥指導的適用人群，明確不同基因型與氯吡格雷的關系。

2.【主要組成成分】

2.1說明試劑盒包含組分的名稱、數量、比例或濃度等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，企業應列出相關試劑/耗材的名稱、貨號及其他相關信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組分，則應在此注明經過驗證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產企業、產品名稱以及產品貨號和醫療器械備案號（如有）等詳細信息。

3.【檢驗原理】

3.1對試劑盒的被測靶標進行詳細描述（基因位置、多態性位點及相關特征等），對試劑盒所用探針、引物、多態性的判定終點等進行詳細的介紹；對不同樣本反應管組合、質控品設置及熒光信號檢測原理等進行介紹。

3.2試劑盒技術原理的詳細介紹，建議結合適當圖示進行說明。如反應體系中添加了相關的防污染組分（如UNG酶），也應對其作用機理進行適當介紹。

4.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩定性等，應明確具體的儲存條件及有效期等信息。

5.【樣本要求】

樣本的采集、處理、運送和保存：明確樣本采集、核酸提取純化前的處理（如離心和洗滌等）、保存條件及期限（短期和長期）以及運送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需要恢復至室溫，凍融次數的限制等。

6.【適用儀器】

所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

7.【檢驗方法】

詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1實驗條件：實驗室分區、實驗環境的溫度、濕度和空調氣流方向控制等注意事項。

7.2試劑配制方法和注意事項。

7.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項（如適用），對核酸提取純化環節進行合理的質量控制，明確提取核酸的濃度純度等質量要求。

7.4擴增反應前準備：加樣體積、順序等。

7.5

PCR各階段的溫度、時間設置、循環數設置或相應的自動化檢測程序及相關注意事項。

7.6儀器設置（如適用）：特殊參數、探針的熒光素標記情況、對待測多態性及其他質控品的熒光通道選擇等。

8.【檢驗結果的解釋】

結合質控品、樣本管檢測結果以及多態性類型與氯吡格雷表型之間的關系，以列表形式詳述所有可能出現的結果及相應的解釋。如存在檢測灰區，應詳述對于灰區結果的處理方式。

9.【檢驗方法的局限性】

9.1申報產品僅對下述多態性類型xx進行了驗證。

9.2有關假陰性結果的可能性分析

9.2.1不合理的樣本采集、運送及處理或核酸過度降解均有可能導致假陰性結果。

9.2.2未經驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導致假陰性結果（如有）。

10.【產品性能指標】簡述以下性能指標：

10.1最低檢測限：簡單介紹最低檢測限的確定方法，并明確最低檢測限結果。

10.2陽性/陰性參考品符合率。

10.3精密度：簡單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結果。

10.4分析特異性

10.4.1交叉反應驗證：同源性序列等交叉反應驗證。

10.4.2干擾物質驗證：樣本中常見干擾物質對檢測結果的影響。

10.5對比試驗研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統計學方法及統計分析結果。

11.【注意事項】應至少包括以下內容：

11.1如該產品含有人源或動物源性物質，應給出具有潛在感染性的警告。

11.2臨床實驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》（衛辦醫政發〔2010〕194號或現行有效版本）等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規范執行。

三、起草單位

國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心。