第一篇：氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測試劑注冊技術審查指導原則

附件5 氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測試劑注冊 技術審查指導原則 本指導原則旨在指導注冊申請人對氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測試劑（串聯質譜法）注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是針對該類試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是供申請人和審查人員使用的指導性文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。相關人員應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、適用范圍 本指導原則提及的氨基酸、肉堿（包括游離肉堿和酰基肉堿）和琥珀酰丙酮分別是指針對遺傳代謝病的疾病標記物。相關的遺傳代謝病主要包括氨基酸代謝障礙（Disorders of amino acid metabolism）、脂肪酸氧化障礙（Fatty Acid Oxidation disorders）和有機酸代謝障礙（Organic academia disorders）等。一般來說，氨基酸是氨基酸代謝障礙的疾病標記物，游離肉堿與酰基肉堿是脂肪酸氧化障礙和有機酸代謝障礙的標記物，琥珀酰丙酮是酪氨酸血癥I型的主要標記物。

遺傳代謝病的發病機理為維持機體正常代謝所必需的酶類、受體和載體等蛋白質缺陷，導致機體的生化反應和代謝異常，從而引起一系列臨床表現。其臨床表現主要包括神經系統損害、代謝紊亂、相關器官功能異常、生長遲緩、皮膚及毛發異常、特殊氣味等。我國相對常見的遺傳代謝病如下表所示：

表1我國相對常見的遺傳代謝病 序號 疾病名稱 1 高苯丙氨酸血癥（HPA）2 甲基丙二酸血癥（MMA）3 原發性肉堿缺乏癥（PCD）4 中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥（MCAD）5 極長鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥（VLCAD）6 異戊酸血癥（IVA）7 戊二酸血癥I型（GAI）8 楓糖尿病（MSUD）9 瓜氨酸血癥II型(希特林蛋白缺乏癥)（CIT-II）10 瓜氨酸血癥I型（CIT-Ⅰ）11 丙酸血癥（PA）12 同型半胱氨酸血癥I型（HCY）遺傳代謝病的臨床檢測方法一般包括實驗室生化檢測、影像學檢測、負荷試驗、酶學檢測、氣相色譜-質譜（GC-MS）分析、串聯質譜（MS-MS）分析、基因檢測等。其中串聯質譜法是臨床檢測的常用方法，其優點包括：具有高分析效率和高靈敏度，能同時分析多種代謝物，涵蓋多種遺傳代謝病；

可重復性好；

操作相對簡單；

干血斑采集和保存方便等。

氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測試劑（串聯質譜法）的預期用途為利用串聯質譜分析方法，對全血干血斑樣本中氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮的含量進行測量，相關待測分析物濃度及分析物之間相互比例的異常，可能提示某種遺傳代謝病。其原理是使用含有內標準品的溶液對干血斑進行萃取并采用串聯質譜分析，每種待測分析物對于內標準品的響應程度與它的濃度成比例，根據內標準品的濃度即可計算分析物的濃度。

該類試劑使用的串聯質譜主要為三重四極桿串聯質譜和四極桿離子阱串聯質譜（Q-trap）。掃描模式主要包括以下四種：前體離子（precursor ion, PI）掃描、中性丟失（NL）掃描、多反應監測（MRM）掃描和產物離子（product ion,PI）掃描。前體離子掃描通常用于酰基肉堿的分析檢測，在第二級質量分析器中選擇特定質荷比的產物離子，測定在第一級質量分析器中一定質量范圍內所有能產生該碎片的前體離子。中性丟失掃描通常用于氨基酸的分析檢測，以恒定的質量差異，在一定質量范圍內同時測定第一級、第二級質量分析器中所有的前體離子和產物離子，檢測能產生特定中性碎片丟失的前體離子。多反應監測掃描是將第一級質譜設定為用于篩選特定的前體離子，在第二級質譜中指定所需的產物離子，同時監測前體離子-產物離子。產物離子掃描是在第一級質量分析器中選擇特定質荷比的前體離子，測定該前體離子在第二級質量分析器中，一定質量范圍內的所產生的特定產物離子。四種掃描模式各有優缺點，在實際中應根據產品特性選擇適合的掃描模式。

本指導原則適用于進行注冊申報和相關許可事項變更的產品。

本指導原則主要適用于利用串聯質譜法，對干血斑樣本中相關物質進行檢測的試劑，包括采用衍生法處理后對氨基酸和肉堿進行檢測的試劑和采用非衍生法對氨基酸、琥珀酰丙酮和肉堿進行檢測的試劑。對于遺傳代謝病相關的其他特征分析物或采用其他檢測方法（如基于抗原抗體反應原理方法）、其他樣本類型進行的檢測，有利之處可參照執行。本指導原則不適用于對相關疾病的確證和產前篩查項目。

二、注冊申報資料要求 （一）綜述資料 綜述資料主要包括臨床適應癥背景情況、產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、有關產品主要研究結果的總結和評價以及其他內容。其中，其他內容包括同類產品在國內外批準上市的情況，應著重從檢驗方法及臨床適用范圍等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區別。綜述資料應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第5號，以下簡稱《辦法》）和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（國家食品藥品監督管理總局公告2014年第44號，以下簡稱《公告》）的相關要求。

另外，建議申請人對以下幾方面內容進行著重介紹：

1.相關遺傳代謝病的發病機理、臨床癥狀、臨床發病率、檢測方法、治療方法等。

2.待測分析物的名稱、種類、相應的內標準品和質控品、經臨床驗證的遺傳代謝病與分析物間的對應關系等。

3.串聯質譜法的檢測原理、樣品前處理方法、掃描模式及選擇依據、數據采集及處理方法等。

（二）主要原材料的研究資料 應提供主要原材料的選擇與來源、制備及質量標準等的研究資料。

1.氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮內標準品：一般為經過同位素標記的待測分析物。每種待測分析物應對應其標記后的內標準品，如有特殊情況無法對應其自身標記的內標準品，應說明理由，并提交使用替代內標準品是否會對產品性能產生影響的評價資料。應提交內標準品的化學式、對應的待測分析物、賦值資料以及質量控制資料（一般包括分子量、化學純度、同位素純度等）。

2.氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮標準品：應提供標準品的來源、選擇依據、性能指標和溯源資料。

3.質控品：質控品為包含所有待測分析物的干血斑。質控品使用的濾紙應明確型號。應至少設置高、低兩個濃度水平的質控品。質控品中的質控物質應與待測分析物相同，如使用與待測分析物特性相似的其他物質作為其質控物，應說明理由，并提交使用替代質控物是否會對產品性能產生影響的評價資料。應提供質控品的選擇、制備和賦值資料。

4.企業參考品：應提供企業內部參考品的原料選擇、制備、定值、統計學分析及相關的實驗驗證資料。企業參考品應盡量使用實際待測樣本即全血干血斑，如需采用向全血基質中模擬添加被測物的形式制備干血斑（即模擬干血斑），則應說明理由。企業應根據產品特性建立穩定的參考品體系，至少應包括：

4.1檢測限參考品 應建立能夠覆蓋所有待測分析物的檢測限參考品。參考品中的待測分析物濃度應為檢測限濃度，或略高于檢測限濃度。檢測限參考品應盡量使用全血干血斑，考慮到檢測限濃度的樣本難以獲得的情況，可采用內標準品替代待測分析物的方式，來模擬制備檢測限參考品，例如將檢測限水平的內標準品加入人全血基質中制備模擬干血斑等。

如需使用待測分析物/內標準品的替代物質制備參考品，應提交相應的評估資料。

4.2精密度參考品 應選擇能夠代表所有待測分析物結構及性能評估要求的分析物建立精密度參考品。

精密度參考品應設置多個具有代表性意義的濃度水平，一般包括正常內源性水平、醫學決定水平、異常值（異常高值/異常低值）水平等，各待測分析物可根據臨床實際情況和指標設置的臨床意義，選擇不同的濃度水平設定參考品，并提交選擇設定的依據。

4.3線性參考品 應建立能夠覆蓋所有待測分析物的線性參考品。線性參考品應選擇多個梯度濃度水平進行設置并覆蓋整個線性范圍。如需使用待測分析物的替代物質制備參考品，應提交相應的評估資料。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料 主要生產工藝主要包括工作液的配制、分裝和包裝等，反應體系研究指完成檢測所涉及到的最佳反應條件的選擇確定過程。主要包括以下內容：

1.主要生產工藝及流程，可以圖表方式表示。應標明關鍵工藝質控步驟，并詳細說明該步驟的質控方法及質控標準。

2.樣本采集、處理的要求和質控品、企業參考品的干血斑制備的要求，具體可參照相關管理規范的內容。

3.各試劑（包括各級工作液、萃取試劑、衍生化試劑、流動相等）的選擇、配比、用量的確定和驗證過程。

4.分析條件，如萃取方法、衍生條件、進樣條件、質譜條件等。

（四）分析性能評估資料 申請人應提交對試劑盒的全部性能進行評估的資料，對于每項分析性能的評價都應包括研究目的、實驗設計、研究方法、可接受標準、實驗數據、統計方法等詳細資料。有關分析性能評估的背景信息也應在申報資料中有所體現，包括實驗地點（實驗室）、人員及數量、適用儀器、儀器掃描模式、試劑規格、批號、臨床樣本來源（如涉及）等。分析性能評估的實驗方法可以參考相關文件或國內有關體外診斷產品性能評估的指導原則進行。建議著重對以下分析性能進行研究：

1.檢測限 檢測限確定過程的研究方法有很多，因通常情況下不易獲得低于內源水平的樣本，申請人可自行設計合理的模擬方法進行研究。例如，將不同濃度的內標準品添加至人全血中制備成一系列干血斑，用空白萃取液萃取后進行檢測；

或者用含不同濃度內標準品的萃取液對干血斑萃取后進行檢測，等等。其目的是使基質中分析物濃度不變，內標準品的濃度遞減，最終通過檢測內標準品的濃度來模擬研究檢測限。測量的結果符合試劑偏差及精密度等要求的最低濃度水平作為檢測限。

研究過程中應對各物質濃度進行精確的確認，每一濃度樣本應平行檢測多次。根據該類試劑的預期用途，每個待測分析物的檢測限應等于或低于預期使用人群的內源性水平。應詳細說明檢測限的建立過程，明確使用的樣本類型、試驗方法、接受標準和研究結論等。

2.線性范圍 線性范圍的確定研究可使用含有梯度濃度待測分析物的模擬干血斑，分析至少9-11個濃度水平，每個水平重復多次，通過評價一定范圍內的線性關系及準確度等建立所有待測分析物的線性范圍。分析物濃度水平覆蓋范圍應具臨床意義，至少包含典型的內源水平、醫學決定水平等。應結合性能指標和臨床意義，設定合理的線性范圍。

3.準確度 準確度包括正確度和精密度，受系統誤差和隨機誤差共同影響，申請人應綜合考慮偏倚和不精密度的影響，對產品的準確度進行研究。

3.1正確度 建議采用回收實驗方法進行正確度的評價，同時可結合其他合理方法（如方法學比對等）進行研究。回收實驗方法一般為：向全血中添加不同濃度待測分析物，制備成干血斑，檢測后計算回收率，回收率的計算方法為在含有已知“理論”分析物含量的干血斑提取物中實際測得的該分析物含量，以百分比表示。回收率的結果應在可接受范圍內。干血斑中分析物各濃度水平應具臨床意義并盡量覆蓋檢測范圍。詳細描述評價方法中樣本制備過程、評價方案、試驗過程、試驗數據、統計方法、研究結論等內容。

3.2精密度 精密度的評價方法并無統一的標準可依，可根據不同產品特征或研究習慣進行，前提是必須保證研究的科學合理性，具體實驗方法可以參考相關指南或國內有關體外診斷產品性能評估的指導原則進行。應對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異系數的范圍等。針對本類產品的精密度評價主要包括以下要求：

3.2.1對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除檢測試劑本身的影響外，應對不同儀器、操作者、地點、精密度評價周期等要素進行相關的驗證。

例如：為期至少XX天的連續檢測，每天至少由X人完成不少于X次的完整檢測，從而對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。申請人還應選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間精密度進行評價。

3.2.2精密度的評價應選擇多個濃度水平進行，一般來說應包含正常內源性水平、醫學決定水平、異常值（異常高值/異常低值）水平等，各待測分析物可根據臨床實際情況和指標設置的臨床意義，選擇不同的濃度水平進行研究，并提交濃度選擇的依據。

4.特異性 應對樣本中常見的干擾物質和可能引起交叉反應的物質進行研究。特異性研究的樣本可為全血干血斑或模擬添加被研究物的模擬干血斑。

4.1干擾物質 干擾物質應至少包括血紅蛋白、脂類、膽紅素等。其他還可能包括潛在患者（如母親）引入的化合物、樣本采集過程中加入的化合物、血液中存在的其他化合物等，例如常用藥物、麻醉劑、消毒劑、服用的營養物質、機體其他代謝產物等。

建議申請人在干擾物質的潛在最大濃度（即“最差條件”）條件下進行評價。建議至少在內源性水平附近濃度對每種干擾物質的干擾影響進行評價。

4.2交叉反應 交叉反應物質一般是指在血液中存在的，在待測分析物掃描模式下，與待測分析物有相同質荷比的其他化合物。應研究血液中可能存在的交叉反應物質對待測分析物造成的干擾，對每一對交叉反應物質/分析物進行統計學和臨床意義上的分析，評估可能存在的風險。常見的交叉反應物質有天冬酰胺、羥脯氨酸、甲硫氨酸砜、甲硫氨酸硫氧化物、谷氨酸鹽和不完全丁基化的酰基肉堿等。應至少對上述幾種交叉反應物質進行研究，并結合申報試劑的臨床適應癥對其他可能存在交叉反應的物質進行評估。

5.殘留 對于該類試劑來說，還應考慮進樣器等分析系統的殘留對結果產生的影響。例如，設計高低兩個濃度樣本交叉連續進樣，并重復多次，較低濃度樣本的檢測結果應符合其準確性的要求。

6.在分析性能評估資料中還需注意以下幾點：

6.1應明確性能研究使用的儀器掃描模式，不同的掃描模式可能會導致不同的研究結果，必要時應分別描述不同模式下的性能指標。若不同的機型會導致不同的研究結果，也應分別進行詳述。

6.2進行性能研究所使用的樣本形式應為干血斑，且應從萃取溶解開始進行分析性能的評價。

6.3 以上性能研究原則上應包括所有的待測分析物，并應盡可能使用全血干血斑進行評估。由于某些待測分析物的特殊性質，可能無法采用上述常規方法進行實驗研究，需使用其他方法或替代物質進行研究的，應對具體情況進行說明，并提供相應的研究資料。

（五）陽性判斷值/參考區間確定資料 對于此類試劑，應對每種待測分析物設定陽性判斷值或參考區間。應盡量獲取足夠大的樣本量，設定合理的臨床靈敏度和臨床特異度預期值進行陽性判斷值/參考區間的研究。根據該類試劑的臨床用途，應盡量降低產品的假陰性率，并將假陽性率控制在一定范圍。應采用合理的方法進行相關研究，并明確方法的選擇依據。

應明確樣本入組標準（例如體重、年齡等），并說明試驗方案及其合理性。

另外，如存在灰區，應提交灰區設定的依據，并在說明書【陽性判斷值】和【檢驗結果的解釋】項進行解釋說明。如無灰區設置，也應提交相關的依據。

（六）穩定性研究資料 穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。主要涉及兩部分內容，申報產品的穩定性和適用樣本的穩定性研究。

1.申報產品的穩定性研究主要包括實時穩定性（有效期）、運輸穩定性、開瓶穩定性及凍融次數限制等研究。對于實時穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

2.適用樣本的穩定性研究：本類試劑的適用樣本類型為干血斑，可參考相關管理規范等文件對樣本的穩定性進行研究。主要包括冷藏和冷凍條件下的儲存條件研究、有效期驗證、運輸穩定性驗證以及干血斑萃取后儲存條件的驗證等。可以在合理的溫度范圍內選擇溫度點（溫度范圍），每間隔一定的時間段對儲存樣本進行檢測，從而確認樣本的穩定性。由于某些化合物在干血斑中不穩定，應對這些分析物的情況進行研究，提供其在干血斑中的儲存有效期數據。樣本保存時間對檢測結果的影響應在說明書中進行說明。

（七）臨床評價資料 1.研究方法 建議以前瞻性的臨床試驗方式為主，以試驗用體外診斷試劑（以下稱考核試劑）與臨床診斷結果進行比較研究的方法，評價考核試劑的臨床診斷性能相關指標，從而證明其臨床性能滿足預期用途的要求。臨床診斷結果中陽性病例的確認應有充分的依據，包括采用現有條件下公認的、可靠的、權威的疾病診斷標準，疾病診療指南中明確的疾病診斷方法，行業內的專家共識等。

申請人還應同時選擇已批準上市、臨床普遍認為質量較好的同類產品作為對比試劑，與考核試劑進行一定例數的比較研究試驗，以評價考核試劑的臨床準確性。

2.臨床試驗機構及人員 應選擇至少3家臨床試驗機構，按照相關法規、指導原則的要求開展臨床試驗。臨床試驗機構的選擇應盡量考慮擬申報產品的特點和預期用途。建議選擇不同地區的臨床試驗機構開展臨床試驗，且臨床試驗機構應具有相關檢測的優勢。操作人員應經過相應的培訓，并能熟練操作實驗。機構和人員應遵循《醫療機構臨床實驗室管理辦法》及其他相關規定。試驗應處于有效的質量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。

3.適用人群及樣本量 臨床試驗應選擇預期適用人群作為研究對象，樣本的采集、處理和保存應符合產品說明書及其他相關指導文件的要求。所有樣本均應可以溯源。若適用人群包含新生兒，應設定合理、明確的樣本入組標準（例如體重、年齡等）。

應根據疾病發病率和性能要求等估算合理的樣本量，并在臨床試驗方案中明確樣本量確定的依據。在與同類產品進行對比試驗時，試驗樣本應盡量覆蓋各分析物的線性范圍，樣本量應滿足統計學要求。

根據臨床發病率、臨床診治情況及其他因素綜合考慮，對于我國相對常見的遺傳代謝病如高苯丙氨酸血癥（HPA）、甲基丙二酸血癥（MMA）、原發性肉堿缺乏癥（PCD）等,應通過前瞻性臨床試驗檢出真陽性病例；

其他發病率相對更低的疾病也應盡可能在前瞻性臨床試驗中檢出所聲稱疾病病例。建議聲稱的遺傳代謝病種類應盡量覆蓋我國常見的病種，可參考表1中所列的疾病。同時，臨床試驗檢測結果應盡量覆蓋所有待測分析物指標異常情況。

若臨床試驗中使用部分已確診（回顧性）的陽性病例進行研究，應提供充分的理由，并在試驗方案和報告中對病例選擇的方式和原因進行明確的說明。在產品說明書中應根據臨床結果對檢出的遺傳代謝病和分析物指標異常情況進行描述，其中采用回顧性病例進行的研究應另行說明。

4.臨床試驗方案 開展臨床試驗前，申請人應與各臨床試驗機構協商制定統一的、科學合理的臨床試驗方案，并按照臨床試驗方案組織制定標準操作規程，并進行驗證，以確保臨床試驗操作在各個臨床試驗機構之間的一致性。在整個臨床試驗過程中均應遵循預定的方案，不可隨意改動。

臨床試驗應在臨床試驗機構的實驗室內進行，并由本實驗室的技術人員操作，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉試驗進程，尤其是數據收集過程。

試驗方案中應確定合理、嚴格的病例納入/排除標準，任何已經入選的病例再被排除出臨床試驗都應記錄在案并明確說明原因。方案中應明確樣本入組的要求，以及樣本的收集、處理及保存要求等。

在試驗操作過程中和判定試驗結果時應采用盲法，以保證試驗結果的客觀性，并在臨床試驗方案中明確。

方案中應明確，當對比試驗結果不一致時，應分析原因并給出解釋，必要時進行第三方復核。

5.臨床試驗報告 臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數據和統計分析方法。應對以下內容進行詳述：

5.1臨床試驗總體設計及方案描述 5.1.1 臨床試驗的整體管理情況、臨床試驗機構選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

5.1.2 病例納入/排除的情況、盲法操作流程等。

5.1.3 樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

5.1.4 統計學方法、統計軟件、評價統計結果的標準。

5.2 具體的臨床試驗情況 5.2.1 臨床試驗所用各體外診斷試劑及儀器的名稱、批號、機型等信息。

5.2.2 各試驗機構的病例數、陰性/陽性檢出例數、檢出的遺傳代謝病情況等。

5.2.3 質量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、儀器校準、質控品運行情況。

5.2.4 具體試驗過程，樣本檢測、數據收集、結果不一致樣本的校驗；

陽性病例后續操作方法、病例脫落情況，以及是否符合臨床試驗方案等。

5.2.5 具體試驗過程及試驗過程中需要說明的問題，是否涉及對方案的修改等。

5.3統計學分析 對臨床試驗數據的統計應選擇合適的統計方法。應對考核試劑與臨床診斷結果進行統計分析，建議分別對每種待測分析物和每種疾病的臨床性能相關指標（例如臨床靈敏度和臨床特異度、假陽性率和假陰性率、陰性似然比和陽性似然比、陰性預測值和陽性預測值等）進行統計。同時，應根據臨床診斷結果，統計并明確每種疾病與待測分析物指標之間的對應關系。

對于考核試劑與對比試劑的比對試驗結果，應采用回歸分析的方法分析其定量結果的相關性，同時也可選用特定的數據分析模型（如Bland-Altman 模型）對定量分析結果的一致性進行分析。亦可同時對二者的陰/陽性符合率和總符合率進行分析，對結果進行χ2檢驗或kappa檢驗以檢驗其定性結果的一致性。

應針對每一種待測分析物（或相關分析物間的比值）和每種疾病的對比試驗結果進行單獨統計分析，以列表的形式進行總結。

應明確樣本的納入與排除情況。說明其他情況，如數據預處理、差異數據的重新檢測以及最終是否納入數據統計、對異常值或缺失值的處理等。

5.4 討論和結論 對總體結果進行總結性描述并簡要分析試驗結果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結論。

6.批準上市條件 由于該類產品的特殊性，技術審評中可根據產品風險受益、產品預期臨床應用情況、上市前研究等因素，附帶條件批準上市。具體情況可參見《用于罕見病防治醫療器械注冊審查指導原則》的相關要求。

（八）產品技術要求 擬定產品技術要求應符合《辦法》和《公告》的相關規定。申請人應當在原材料質量和生產工藝穩定的前提下,根據申請人產品研制、前期臨床評價等結果，依據國家標準、行業標準及有關文獻，按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》（原國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號）的有關要求編寫。

第三類產品技術要求中還應當以附錄形式明確主要原材料、生產工藝及半成品要求。附錄中應將內標準品、標準品、質控品的設計及來源，參考品設置，生產工藝流程及質控關鍵點等重點內容予以明確。

（九）產品檢驗報告 應提供該產品在具有相應醫療器械檢驗資質和承檢范圍的醫療器械檢驗機構進行的、符合產品技術要求的產品檢驗報告。應提供連續3個生產批次樣品的檢驗合格報告。

（十）產品說明書 產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）的要求，進口產品的中文說明書除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產品說明書的所有內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，若某些內容引用自參考文獻，則應以規范格式對此內容進行標注，并單獨列明參考文獻的相關信息。

結合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對說明書的重點內容進行詳細說明。

1.【預期用途】 1.1第一自然段：描述預期用途，包括適用人群，樣本類型，被測物等。

舉例：該產品用于定量檢測XXX（適用人群）全血干血斑中的氨基酸、游離肉堿和酰基肉堿、琥珀酰丙酮的濃度。

1.2介紹臨床適應癥及背景，說明相關的臨床或實驗室診斷方法等。另外，需明確所有待測分析物名稱、對應的內標準品和質控品、經臨床驗證的遺傳代謝病與分析物之間的關系。建議聲稱的遺傳代謝病應盡量覆蓋我國相對常見的病種，可參考表1中所列的疾病。

1.3明確檢測結果僅能初步提示某種遺傳代謝病，其最終結果要由相應方法進行確認。

2.【檢驗原理】 詳細說明該產品檢測各類分析物的前處理方式（衍生/非衍生）、檢測原理及掃描模式（必要時可用圖示說明）。

3.【主要組成成分】 說明試劑盒所包含組分的名稱、數量、比例或濃度等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

試劑盒中不包含但該項檢測必需的組分，說明書中應列出相關試劑/耗材的名稱、生產企業、貨號、注冊證號/備案憑證編號（如有）及其他相關信息，質控品的濾紙應明確型號。

4.【儲存條件及有效期】 按照穩定性研究資料，說明試劑盒的效期穩定性，其他穩定性也應視情況明確，如開瓶穩定性、復溶穩定性、運輸穩定性、凍融次數要求等，應標明具體的儲存條件及有效期。

5.【適用儀器】 明確所有適用儀器的具體型號，并提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

6.【樣本要求】 樣本的收集、處理和保存：應參照相關文件的要求，并詳細描述采樣步驟和注意事項。明確采樣前處理、消毒、采樣量、保存條件及期限（短期、長期）、運送條件、凍融次數的限制等。另外應說明采樣過程中使用的濾紙型號應與質控品的濾紙型號一致。

上述內容均需在穩定性研究資料中詳述并進行性能評估驗證。

7.【檢驗方法】 應詳細描述完成完整檢測所需的全部步驟以指導用戶正確操作，包括：

7.1 干血斑的前處理、萃取、衍生化（如有）、復溶及上機檢測等。

7.2 內標準品溶液、各級工作液的配制方式。內標準品溶液和工作液的短期和長期保存方式、凍融次數等。

7.3 上機檢測：儀器準備、設置、儀器使用相關參數及結果處理。

7.4 質量控制：質控品的設置及檢測時的質量控制方法、要求等。

7.5 說明檢測時應特別注意的事項，如對精密度的控制措施、溶液的保存條件、其他影響檢測的因素等。

8.【陽性判斷值/參考區間】 明確設定及驗證陽性判斷值/參考區間所使用的樣本例數及類型、試驗方法、統計方法及計算結果。

9.【檢驗結果的解釋】 應對不同的檢驗結果進行解釋，并明確后續處理方法。如存在灰區，應對灰區結果的處理方式一并詳述。

10.【檢驗方法的局限性】 10.1 本試劑盒的檢測結果僅能初步提示某種遺傳代謝病，其結果僅供臨床參考，不能作為診斷。對患者的臨床診斷應采用相應方法并結合其癥狀/體征、病史等情況綜合進行。

10.2 本試劑盒適用于全血干血斑樣本檢測，不適用于其它樣本檢測。

10.3 異常的紅細胞比容、年齡、早產、疾病等因素可能會影響檢測結果。

10.4樣本采集、運輸及處理不當、未按說明書操作等均有可能導致假陽性或假陰性結果，例如：血液未均勻浸透血斑區域、濾紙干血片打孔時打得太靠近血斑的邊緣、樣品收集或樣品干燥有問題、由于樣品受熱受潮，不能洗脫血斑、血斑濾紙受排泄物污染等等。應描述在樣本采集，保存、運輸中需遵循的原則及注意事項。

10.5 說明可能影響檢測結果的干擾因素。

10.6 單一代謝產物往往無法提供足夠的遺傳代謝病信息，應建立代謝物模型來研究相關疾病。

10.7其他局限性。

11.【產品性能指標】 按照分析性能評估資料內容描述以下性能指標：檢測限、企業內部參考品符合率（如適用）、準確性、線性、特異性等。各項評估應包括評估方法、數據和結果。應描述臨床評價的試驗結果，包括臨床試驗機構數量、樣本情況、試驗結果等內容。

12.【注意事項】 應至少包括以下內容：

12.1 如該產品含有人源或動物源性物質，應給出具有潛在感染性的警告。

12.2 檢驗過程有關的有機溶劑的安全性要求，例如操作和廢棄的注意事項。

12.3 相關操作人員應經過專業的培訓，并嚴格按照說明書的方法來進行試驗。

三、名詞解釋 1.全血干血斑 本指導原則中指臨床檢驗過程中使用的實際待測樣本，即將人全血滴加至濾紙上，再經過打孔處理的樣本。

2.模擬干血斑 本指導原則中指在研究過程中，將添加了其他物質（例如待測物、干擾物質等）的人全血（或模擬血液基質）滴加至濾紙上，再經過打孔處理的樣本。

3.同位素純度 被同位素標記的分子的相對含量。

四、參考文獻 1.顧學范.《臨床遺傳代謝病》，人民衛生出版社，2015.2.《中國藥典》（2015年版），中國醫藥科技出版社.3.《新生兒疾病篩查技術規范》（2010年版），（衛婦社發〔2010〕96號）,2010年12月1日.4.《新生兒疾病篩查管理辦法》（中華人民共和國衛生部令第64號），2009年3月5日.5.Newborn Screening Test Systems for Amino Acids, Free Carnitine, and Acylcarnitines Using Tandem Mass Spectrometry，Guidance for Industry and FDA Staff，FDA，2004.6.CLSI.Newborn Screening by Tandem Mass Spectrometry；

Approved Guideline.CLSI document I/LA32-A.Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute;2010.五、起草單位 國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心。

第二篇：地中海貧血相關基因檢測試劑注冊技術審查指導原則（2020年）

附件3

地中海貧血相關基因檢測試劑

注冊技術審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對地中海貧血相關基因檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是對地中海貧血相關基因檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，也不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究和驗證資料，相關人員應在遵循法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規和標準的不斷完善以及科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、適用范圍

地中海貧血（簡稱地貧）是一種常染色體隱性遺傳病，是由于珠蛋白基因發生突變（包括點突變和缺失等），致使珠蛋白肽鏈合成減少或完全不能合成而導致的一組單基因遺傳性溶血性疾病，輕者可無臨床表現，重者以進行性溶血性貧血為主要特征。根據珠蛋白肽鏈合成受到抑制的類型，地貧分為α-，β-和γ-地貧等，臨床上最常見的是α-和β-地貧。地貧主要分布在地中海沿岸、東南亞和少數非洲地區，具有明顯的種族特性和地域分布差異。地貧是我國南方地區最常見、危害最大的遺傳病之一，尤以廣西、云南、廣東、海南、四川和貴州等省份為甚，云南、海南和廣東的地貧基因人群攜帶率可達10%以上，廣西更是達到了20%以上。

α-地貧主要是由于α-珠蛋白基因發生突變而引起。α-珠蛋白基因簇位于16p13.3，包括胎兒期和成人期表達的2個基因（α2和α1），基因的排列順序為5’-α2-α1-3’。根據單倍型的情況，可將α地貧分為3類：（1）缺失型α+地貧（-α/），缺失1個α基因；（2）缺失型α0地貧（--/），2個α基因同時缺失；（3）非缺失型α+地貧（αTα/或ααT/），1個α1或α2基因發生點突變或少數幾個堿基的缺失。中國現已發現至少19種α-珠蛋白基因大片段缺失和38種α-珠蛋白基因點突變。其中，6

種α-珠蛋白基因的突變：--SEA/、-α3.7/、-α4.2/、αWSα/（HBA2：c.369C>G）、αQSα/（HBA2：c.377

T>C）；αCSα/（HBA2：c.427T>C）占患病人群總數的98%。

α-地貧基因型和臨床分型的關系已經基本闡明。α-地貧的表型嚴重程度隨著功能性α-珠蛋白基因的減少而加重：（1）1個α-基因缺失或點突變（-α/αα或ααT/αα或αTα/αα），稱為靜止型α-地貧，通常不貧血，血液學表現為小細胞低色素；（2）2個α-基因缺失或復合-α基因點突變，或點突變，其基因型為--/αα或-α/-α或-α/ααT或αTα/-α或αTα/αTα，稱為輕型α-地貧，臨床表現為不貧血或輕度貧血，血液學檢查有小細胞低色素特征；（3）3個α-基因缺失或復合α基因點突變，基因型為--/-α或--/αTα，稱為中間型α-地貧，又稱Hb

H病，患者有輕至重度貧血。某些基因型為αTα/αTα的病例（如αCSα/αCSα、αQSα/αQSα和αCSα/αQSα）也表現為Hb

H病。通常，--/αTα的非缺失型

Hb

H病較單純缺失型Hb

H病（--/-α）的臨床表現更為嚴重，特別是基因型為--/αCSα或--/αQSα的Hb

H病患者，貧血程度較為嚴重；（4）4個α-基因缺失，其基因型為--/--，稱為重型α-地貧，又稱Hb

Bart’s胎兒水腫綜合征，此類個體一般無法存活到出生或分娩后半小時內死亡。

β-地貧是由于β-珠蛋白基因發生突變而引起，以點突變為主，少數為缺失型。β-珠蛋白基因簇位于11p15.3，包括2個成人期表達基因（β和δ），基因的排列順序為5’-δ-β-3’。根據β-珠蛋白鏈合成量的程度，可將β-地貧分為3類：（1）β0地貧，β-珠蛋白鏈完全不能合成，其所在的等位基因稱為β0地貧等位基因；（2）β+地貧，β-珠蛋白鏈合成減少，其所在的等位基因稱為β+地貧等位基因；（3）β++地貧，又稱沉默型β-地貧，β-珠蛋白鏈合成輕微減少。中國已至少報道84種β-珠蛋白基因點突變和11種β-珠蛋白基因缺失。其中，6種點突變：HBB：c.126_129delCTTT，HBB：c.52A>T，HBB：c.-78A>G，HBB：

c.79G>A，HBB：

c.316-197C>T和HBB：

c.216_217insA占了全部突變類型的90%以上。

β-地貧的臨床表型可分為4種：（1）靜止型β-地貧，基因型為β++/βN，血液學表型正常或臨界，一般只能通過分子診斷識別；（2）輕型β-地貧，基因型為β0/βN或β+/βN，臨床表現為小細胞低色素和HbA2值升高；（3）中間型β-地貧，基因型為β+/β+或β+/β0，表型變異范圍大，可從輕度貧血到中度貧血，多于幼兒期出現中度貧血；（4）重型β-地貧，基因型為β+/β0或β0/β0，通常伴有嚴重貧血，需要定期輸血才能存活。患兒出生時無癥狀，常于嬰兒期（3-12月齡）發病。如不治療，患兒多于5歲前死亡。此外，中間型的分子基礎較為復雜，顯性β-地貧突變的雜合子（βD/βN），合并α-地貧突變的β-地貧突變純合子（β0/β0），或合并α-珠蛋白三聯體的β-地貧突變雜合子（β0/βN或β+/βN），也會顯示中間型的表型。

2018年發布的《重型β-地中海貧血的診斷和治療指南》明確規定：對于重型β-地中海貧血的診斷，有條件者均應進行基因診斷，基因型為純合子或雙重雜合子為確診本病的指標。2018年發布的《兒童非輸血依賴型地中海貧血的診治和管理專家共識》也明確規定：地貧基因檢測為非輸血依賴型地貧的診斷依據之一。

另外，國家衛生健康委員會發布的相關文件要求：為減少重型地貧患兒出生，在我國地貧高發省份實施地貧防控試點項目。主要流程包括：（1）對新婚夫婦和計劃懷孕夫婦在懷孕前或孕期進行血常規初篩；（2）對夫婦一方或雙方血常規檢查結果陽性的夫婦進行血紅蛋白分析復篩；（3）對血紅蛋白分析復篩結果均為陽性的夫婦，取其抗凝靜脈全血進行相應的α+β地貧基因檢測；（4）綜合夫婦雙方病史詢問、地貧篩查和基因檢測結果，判定為高風險夫婦。對高風險夫婦進行追蹤，及時了解受檢婦女懷孕情況，指導女方在懷孕后適宜時期接受產前診斷。產前診斷的對象為胎兒，樣本類型為胎兒的絨毛、羊水和臍帶血，檢測項目為相應的地貧基因檢測。

綜上，結合該類產品臨床使用的實際情況，本指導原則的預期用途可為：用于體外定性檢測人外周靜脈全血或胎兒羊水等樣本中基因組DNA的α-和/或β-地貧相關基因，用于α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷），地貧高風險夫婦的評估，或胎兒的產前遺傳診斷等。

結合該類產品在中國注冊的實際情況以及當前的認知，本指導原則僅對“α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷）”預期用途的相關內容進行了詳細闡述。針對其他預期用途，本指導原則僅對部分內容進行了闡述，申請人應根據產品特性，對本指導原則未涉及的內容進行補充并做出相應評價。

本指導原則的技術要求是基于PCR探針法方法建立的，對于其他分子生物學檢測技術（如：PCR-反向點雜交法和gap-PCR法等），可能部分要求不完全適用或本文所述技術指標不夠全面，申請人可以根據產品特性對不適用部分進行或補充其他的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學合理性。

本指導原則適用于進行首次注冊申報和相關許可事項變更的產品。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、研究結果的總結評價以及國內外同類產品上市情況介紹等內容。其中，同類產品上市情況介紹部分應著重從方法學、檢驗原理、檢測的突變類型以及臨床意義等方面詳細說明申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區別。

綜述資料應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（原總局令第5號，以下簡稱《辦法》）和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（原總局公告2014年第44號），以下簡稱《44號公告》的要求。

（二）主要原材料的研究資料

主要原材料研究資料包括主要反應成分、對照品（質控品）及企業參考品的研究資料。

1.此類產品的主要反應成分一般包括人基因組核酸提取/純化試劑、檢測所需引物、探針、酶、dNTPs、反應緩沖液等。申請人應提交相關原材料的選擇、制備和質量標準等的研究資料。如為申請人自制，應提交詳細的工藝穩定性研究資料；如為外購，還應提交供應商篩選資料以及供應商提供的原材料質量檢定報告。

1.1

核酸提取/純化試劑（如有）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。

1.2

引物、探針

申請人應詳述引物、探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應情況。建議設計多套引物探針以供篩選，針對待測位點的特異性等進行評價，選擇最佳設計，并提交詳細的篩選研究數據。

申請人應針對選定的引物、探針原材料進行質量評價，一般包括：分子量、純度（HPLC等）、濃度、探針熒光標記基團的激發波長和發射波長，以及功能性試驗等，并依據評價結果建立合理的質量標準。

1.3酶

酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申請人應針對各種酶的活性進行驗證，提交功能性試驗資料，并確定酶的質量標準。

DNA聚合酶應具有DNA聚合酶活性，無核酸內切酶活性，具熱穩定性。UDG/UNG應具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性。

1.4脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應提交對其純度、濃度、保存穩定性等的驗證資料，以及功能性試驗資料，并確定質量標準。

2.對照品（質控品）

試劑盒的質控體系通過設置各種試劑盒對照品（質控品）來實現。陽性對照應至少包括代表性的突變位點和突變類型。陰性對照可以是含有野生型序列的核酸溶液。空白對照為不含核酸的溶液。

如該類產品所采用的方法學和檢驗原理顯示：無論檢測何種樣本（野生型、雜合突變和純合突變），其反應體系均可報出核酸序列結果，均可對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，則無需另外設置內標；否則，試劑盒應另外設置內標。

對照品可采用人基因組DNA、細胞系或質粒等。空白對照應參與樣本核酸的平行提取。申請人應提供對照品原料選擇、制備、定值過程等的詳細研究數據，并對其檢測結果做出明確的范圍要求。

3.企業參考品

企業參考品主要包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品和精密度參考品等。申請人應提交企業參考品的原料選擇、制備方法、基因序列確認及檢驗標準的詳細研究資料等。

3.1

陽性參考品：可采用臨床樣本或其核酸溶液，如采用臨床樣本，則樣本類型應與待測樣本一致。應至少包含所有檢測位點的雜合型樣本，同時盡量納入純合突變型樣本。對于某些稀有基因型，也可采用細胞系或質粒。

3.2

陰性參考品：應包括野生型臨床樣本或其核酸溶液，以及易產生交叉反應的同源序列樣本，同時應盡量包含檢測范圍外其他檢測位點的樣本等。

3.3檢測限參考品可選擇最低檢測限濃度（例如：95%檢出率水平）或接近最低檢測限濃度（例如100%檢出率水平）的臨床樣本或其核酸溶液，至少包含所有檢測位點的雜合型樣本。

3.4

精密度參考品應至少包括低濃度雜合突變型臨床樣本或其核酸溶液，應至少包括代表性的突變位點和突變類型，且在每一反應體系均有分布。

目前，該類產品已有國家參考品，對于申報產品所聲稱的檢測位點，企業參考品的要求應不低于國家參考品。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料

主要生產工藝研究資料包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTPs濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標記（如有）等工藝過程的描述及確定依據。生產過程應對關鍵參數進行有效控制，可采用流程圖方式描述生產工藝，標明關鍵工藝質控步驟，并詳細說明該步驟的質控方法及質控標準。

反應體系研究指反應條件的選擇確定過程，包括樣本采集、預處理（如有）、樣本用量、試劑用量、核酸提取純化步驟、PCR反應條件、閾值循環數（Ct值）等的確定。

不同適用機型的反應條件如有差異應分別提交。

（四）分析性能評估資料

申請人應針對下述各項分析性能提交詳細的評估資料，包括試驗地點、適用儀器、試劑規格、批號、試驗方法、試驗樣本（類型、來源、數量、處理方法、基因型和濃度確認等）、可接受標準、統計方法、試驗數據及結論等。分析性能評估的實驗方法可以參考國內外有關體外診斷產品性能評估的指導原則。

每項性能評估應盡量采用與適用樣本類型一致的臨床樣本，對于某些稀有基因型，也可采用細胞系等。

1.核酸提取/純化性能（如有）

在進行靶核酸檢測前，應有適當的核酸提取/純化步驟。該步驟應最大量分離和純化目的核酸并盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有核酸提取/純化組分，申請人都應對配套使用的核酸提取/純化方法的提取效率和提取核酸純度、濃度等做充分的驗證，并評價該方法能否滿足該類產品的要求。

2.檢測準確性

建議采用若干份臨床樣本驗證該類產品的檢測準確性，樣本類型與說明書聲稱的樣本類型一致。樣本應涵蓋野生型、所有檢測位點的雜合突變型，同時盡量納入純合突變型。對于某些稀有基因型，也可采用細胞系或質粒。

3.最低檢測限

該類產品的最低檢測限可定義為：在滿足一定的檢測準確性和精密度的條件下，能夠檢出目標序列的最低人基因組DNA的濃度。可采用梯度濃度的人基因組DNA樣本進行多次重復檢測，確定適當檢出率水平（如：95%）下的最低人基因組DNA濃度。檢測限評價建議采用臨床樣本或細胞系，并至少包含所有檢測位點的雜合突變型。應明確臨床樣本或細胞系與人基因組DNA濃度的對應關系。

4.分析特異性

4.1

應針對同源序列或檢測范圍外基因和位點進行交叉反應驗證，說明交叉反應樣本的制備方法、核酸序列確認方法，提交詳細的驗證資料。

4.2

應針對可能的內源和外源性干擾物進行干擾試驗研究。內源干擾物主要涉及血脂、膽紅素、血紅蛋白和白蛋白、母體細胞的干擾等，外源干擾物主要包括血液樣本采集可能用到的抗凝劑和常用藥物等。

干擾試驗可通過在臨床樣本中人工添加干擾物質的方式，評價干擾物質對目標序列檢測的影響，也可直接采集暴露于干擾因素后的受試者樣本，進行干擾試驗評價。建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價；如有干擾，應確定不產生干擾的最高濃度。

5.精密度

精密度評價應采用臨床樣本進行試驗，試驗操作完全按照說明書執行，包含核酸提取/純化等步驟（如有）。應對每一反應體系進行精密度評價，并至少覆蓋代表性的突變位點和突變類型。

精密度評價需滿足如下要求：

5.1對可能影響檢測精密度的主要因素進行驗證，除檢測試劑本身外，還包括分析儀器、操作者、地點、時間、檢測輪次和試劑批次等。

5.2設定合理的精密度評價周期，對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間重復性進行評價。

5.3用于精密度評價的臨床樣本至少設置低濃度和中/高濃度水平。

5.4精密度指標可設置為CV等（如有），申請人應對精密度指標評價標準做出合理要求。

（五）陽性判斷值確定資料

建議納入一定數量的臨床樣本，應包括所有檢測位點的各種基因型（野生型、雜合突變型，同時盡量納入純合突變型），采用受試者工作特征（ROC）曲線或其他合理方法確定陽性判斷值。

如試劑判讀存在灰區，應解釋說明灰區范圍的確定方法。

對于某些檢測方法學，陽性判斷值研究可能不適用，申請人應說明理由。

（六）穩定性研究資料

穩定性研究資料主要包括申報產品的穩定性研究和適用樣本的穩定性研究兩部分。前者主要包括申報產品的實時穩定性、開瓶/復溶穩定性、運輸穩定性及凍融次數限制的研究等；后者則是指適用樣本的保存條件和保存時間等的研究。

實時穩定性研究應采用至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后，選取多個時間點進行產品性能評價，從而確定產品保存條件和有效期。

如核酸提取液可保存，還需對核酸提取液的保存條件和保存時間進行研究。

（七）臨床試驗

應滿足《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（原國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）的要求，如相關法規、文件有更新，臨床試驗應符合更新后的要求。下面僅說明該類產品臨床試驗中應關注的重點問題。

1．針對“α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷）”預期用途

1.1

臨床試驗機構及人員

申請人應根據產品特點及預期用途，綜合不同地區人種和流行病學背景等因素，選擇不少于3家（含3家）符合法規要求的臨床試驗機構開展臨床試驗。

1.2

臨床試驗適用人群和臨床樣本

具有地貧癥狀和/或體征，或血液學表現為小細胞低色素的疑似地貧患者和攜帶者；需與地貧進行鑒別診斷的其他疾病患者，如：缺鐵性貧血、鐵粒細胞性貧血或先天性紅細胞生成異常性貧血等。

臨床試驗所用樣本應為抗凝外周血樣本（基因組DNA非臨床樣本）。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應分別滿足申報產品說明書、對比試劑說明書（如適用）及第三方試劑說明書（如適用）的相關要求。

1.3臨床試驗方法

1.3.1已有同類產品上市的申報產品

對于已批準的α-地貧突變和β-地貧突變，原則上選擇已上市同類產品作為對比試劑，評價申報產品的臨床檢測性能。

1.3.2無同類產品上市的申報產品

1.3.2.1

如新突變位點的臨床意義已獲行業認可（如：國內相關指南或專家共識），且上述認可基于充分的中國人群的臨床數據，則臨床試驗可選擇Sanger基因測序（針對新的點突變）或臨床普遍使用的其他公認方法（針對其他類型的新突變位點，如缺失）作為對比方法，評價新突變位點的臨床檢測性能。除此之外，還應提交新位點臨床意義已獲行業認可的相關證據，該部分資料可不納入臨床方案和報告。

1.3.2.2

如新突變位點的臨床意義未獲行業認可，則臨床試驗應包括兩個目的，新突變位點的臨床檢測性能評價和臨床意義評價。新突變位點的臨床檢測性能評價可參考1.3.2.1；新突變位點的臨床意義評價應提交基于中國人群的充分的臨床證據，證明基因型與表型的關系，如：隨訪或其他可證明基因型與表型關系的臨床驗證資料。

1.4最低樣本量和陽性例數

臨床試驗樣本量應采用適當的統計學方法進行估算，并詳細描述所使用統計方法及各參數的確定依據。

1.4.1

臨床檢測性能評價的樣本量估算

臨床檢測性能評價的樣本量估算可分為以下幾種情況。

對于常見突變位點，建議采用單組目標值法分別估算每個突變位點臨床試驗的最低樣本量，通過陽性符合率計算所需陽性樣本的例數，通過陰性符合率計算所需陰性樣本的例數，同時考慮脫落情況，估算最低樣本總量。陽性符合率和陰性符合率的目標值（臨床可接受的最低標準）建議均不低于95%。

對于罕見突變位點，陰性樣本的例數可根據上述方法進行估算，陽性樣本則應保證一定的例數。

對于極其罕見的、且有確切臨床證據證明其臨床意義的突變位點，陰性樣本的例數可根據上述方法進行估算，陽性樣本的例數則應結合臨床證據確定。

1.4.2

新位點臨床意義評價的樣本量估算

新位點臨床意義評價的樣本量估算，建議采用抽樣調查公式或其他合理方法進行估算。

2.針對“地貧高風險夫婦的評估”和“胎兒的產前遺傳診斷”預期用途

針對上述兩個預期用途，本指導原則僅對部分內容進行了闡述，申請人應根據產品特性，充分考慮本指導原則未涉及的內容，設計科學合理的臨床試驗并進行評價。

2.1臨床試驗機構和人員

如申報產品的預期用途為胎兒的產前遺傳診斷，除滿足法規要求外，臨床試驗機構還應取得產前診斷技術服務資質。臨床試驗人員應為經過專門培訓的取得資質的人員。機構和人員應遵循《產前診斷技術管理辦法》《母嬰保健專項技術服務許可及人員資格管理辦法》，機構應取得《母嬰保健技術服務執業許可證》，人員應取得《母嬰保健技術考核合格證書》。

2.2

臨床試驗適用人群和臨床樣本

如預期用途為地貧高風險夫婦的評估，則適用人群為：地貧表型篩查陽性的育齡人群。地貧表型篩查陽性的育齡人群可根據國家衛生健康委員會和地貧高發地區相關政策確定。

如預期用途為胎兒的產前遺傳診斷，則適用人群為：地貧高風險夫婦的胎兒。地貧高風險夫婦的確定可參考國家衛生健康委員會等相關文件。

臨床試驗所用樣本應為胎兒羊水等臨床樣本（基因組DNA非臨床樣本）。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應符合國家衛生健康委員會等相關文件的要求，并滿足產品說明書的要求。

2.3

最低樣本量和陽性例數

針對每種不同的預期用途，應分別采用合理方法估算最低樣本量。同一預期用途的不同樣本類型（羊水和臍帶血等），也應分別采用合理方法估算最低樣本量。

3.如有其他預期用途，也應設計科學的臨床試驗，提供充分的證據，證明其預期用途。

4.不同預期用途的通用要求

4.1

臨床試驗方法、數據及統計分析

4.1.1應在臨床試驗方案或報告中明確申報產品、對比試劑和第三方試劑的試驗方法。

4.1.2臨床試驗病例總結表應以列表方式表示，包括申報產品的結果、對比試劑的結果、第三方試劑的檢測結果（如有）、臨床診斷、年齡和性別等。

4.1.3以交叉表分別總結兩種試劑的定性檢測結果，選擇合適的統計方法進行統計分析，以驗證兩種試劑檢測結果的一致性。

4.1.4

結果差異樣本的驗證

在數據收集過程中，對于兩種試劑檢測結果不一致的樣本，采用合理方法進行復核，并對差異原因進行分析。如無需復核，應說明理由。

4.2

臨床試驗方案

各臨床試驗機構的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床試驗機構的實驗室內并由該實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程。

試驗方案應確定嚴格的入選/排除標準，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程和結果判定時，應采用盲法以保證試驗結果的客觀性。各臨床試驗機構選用的對比試劑/方法應保持一致，以便進行合理的統計學分析。另外，申報產品的樣本類型不應超越對比試劑/方法對樣本類型的要求。

4.3臨床試驗報告

應對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的數據和統計分析方法。

（八）產品技術要求

產品技術要求應符合《辦法》、《44號公告》和《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》（原國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號）的相關要求。該類產品作為三類體外診斷試劑，應將主要原材料、生產工藝及半成品要求等內容作為附錄附于技術要求正文后。

目前，該類產品已有行業標準，產品技術要求的相關要求應不低于行業標準的要求。

（九）產品檢驗報告

根據《辦法》的要求，第三類體外診斷試劑申請注冊時應提交連續三個生產批次樣品的檢驗報告。目前，該產品已有國家參考品，產品檢驗應滿足國家參考品的要求。

（十）產品說明書

產品說明書應滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（原國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）的要求，產品說明書的所有內容均應與申請人提交的注冊申報資料的相關研究結果保持一致。下面對該類產品說明書的重點內容進行闡述。

1.【預期用途】應至少包括以下幾部分內容：

1.1本產品用于定性檢測人xx樣本基因組DNA中的α-和/或β-地貧xx突變，用于：α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷），地貧高風險夫婦的評估，或胎兒的產前遺傳診斷。

1.2介紹地貧相關的臨床背景信息及實驗室診斷方法等，介紹被測靶標（突變位點）的相關情況。

2.【主要組成成分】

2.1說明試劑盒包含組分的名稱或數量等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，企業應列出相關試劑/耗材的名稱及其他相關信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組分，則應在此注明經過驗證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產企業、產品名稱以和醫療器械備案號（如有）等詳細信息。

3.【檢驗原理】

3.1對試劑盒的被測靶標進行詳細描述（基因位置、突變位點及相關特征等），對試劑盒所用探針、引物或突變的判定等進行詳細介紹；對不同樣本反應管組合、對照品設置及熒光信號檢測原理等進行介紹。

3.2試劑盒技術原理的詳細介紹，建議結合適當圖示進行說明。如反應體系中添加了相關的防污染組分（如UNG酶），也應對其作用機理進行適當介紹。

4.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩定性等，應明確具體的儲存條件及有效期等信息。

5.【樣本要求】

樣本的采集、處理、運送和保存：明確樣本采集、核酸提取純化前的處理（如離心和洗滌等）、保存條件及期限以及運送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需要恢復至室溫，凍融次數的限制等。

6.【適用儀器】

所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

7.【檢驗方法】

詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1實驗條件：實驗室分區、實驗環境的溫度、濕度和空調氣流方向控制等注意事項。

7.2試劑配制方法和注意事項。

7.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項（如適用），對核酸提取純化環節進行合理質控，明確提取核酸的濃度純度等質量要求。

7.4擴增反應前準備：加樣體積、順序等。

7.5

PCR各階段的溫度、時間設置、循環數設置或相應的自動化檢測程序及相關注意事項。

7.6儀器設置（如適用）：特殊參數、探針的熒光素標記情況、對待測樣本及其他對照品的熒光通道選擇等。

8.【檢驗結果的解釋】

結合對照品、樣本管檢測結果以及檢測類型，以列表形式詳述所有可能出現的結果及相應的解釋。如存在檢測灰區，應詳述對于灰區結果的處理方式。

9.【檢驗方法的局限性】

9.1申報產品僅對下述檢測類型xx進行了驗證。

9.2有關假陰性結果的可能性分析

9.2.1不合理的樣本采集、運送及處理或核酸過度降解均有可能導致假陰性結果。

9.2.2未經驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導致假陰性結果（如有）。

10.【產品性能指標】簡述以下性能指標：

10.1最低檢測限：簡單介紹最低檢測限的確定方法，并明確最低檢測限結果。

10.2陽性/陰性參考品符合率。

10.3精密度：簡單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結果。

10.4分析特異性

10.4.1交叉反應驗證：同源性序列等交叉反應驗證。

10.4.2干擾物質驗證：樣本中常見干擾物質對檢測結果的影響。

10.5對比試驗研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統計學方法及統計分析結果。

11.【注意事項】應至少包括以下內容：

11.1如該產品含有人源或動物源性物質，應給出具有潛在感染性的警告。

11.2臨床實驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》現行有效版本等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規范執行。

三、起草單位

國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心。

第三篇：酶聯免疫法檢測試劑注冊技術審查指導原則

附件1

酶聯免疫法檢測試劑注冊技術審查指導原則

一、前言

本指導原則主要針對酶聯免疫類檢測試劑的主要原材料、生產工藝及反應體系、產品質量控制等環節提出指導性技術要求。

本指導原則系對酶聯免疫法檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品特性確定其中的具體內容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應的科學依據。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著法規和標準的不斷完善、科學技術的不斷發展，其相關內容也將進行適時的調整。

二、適用范圍

本指導原則適用于有關病原微生物檢測的第三類體外診斷試劑的注冊技術審查。其他酶聯免疫法檢測試劑（如作為二類管理的體外診斷試劑）可參考本指導原則執行。

三、基本要求

（一）基本原則

1.研制、生產用的各種原料、輔料等應制定其相應的質量標準，并應符合有關法規的要求。— 2 — 2.試劑生產企業應具備相應的專業技術人員、儀器設備以及適宜的生產環境，獲得《醫療器械生產許可證》；同時，應按照《體外診斷試劑生產實施細則（試行）》的要求建立相應的質量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行；還應通過《體外診斷試劑生產企業質量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。企業應對試劑的使用范圍做出明確規定，并經國家藥品監督管理部門批準。

3.診斷試劑的研制應當按照科學、規范的原則，各反應條件的選擇和確定應符合基本的科學原理。

4.試劑在研制、生產過程中所用的各種材料及工藝，應充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生產和質量控制的總體目標：保證試劑使用安全、質量穩定、工藝可控、檢測有效。

（二）原材料質量控制 1.主要生物原料

與產品質量最密切相關的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標反應板、標記相關酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應用抗原或抗體、制備校準品（標準品）等。使用前應按照工藝要求對這類生物原料進行質量檢驗，以保證其達到規定的質量標準。主要生物原料若為企業自己生產，其工藝必須相對穩定；若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，應依據國家相關法規的要求進行變更申請。

主要生物原料的常規檢驗項目一般包括：（1）外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒；或者為白色粉末，不含其他顏色的雜質；特殊生

— 3 — 物原料應具備相應外觀標準。

（2）純度和分子量

主要經SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進行電泳，一般每個電泳道加樣量為5μg，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應達到相應的質量標準，分子量大小應在正確的條帶位臵。

（3）蛋白濃度

蛋白濃度可通過Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲法或其他適宜的方法進行檢測。

（4）效價

效價的測定一般根據蛋白含量測定結果，通過倍比稀釋法進行。效價應達到規定的要求。

（5）功能性實驗

功能性實驗是指生物原料用于試劑盒實際生產中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩定性等，并比較其與上批次原料的相關性。

2.生物輔料

生物輔料一般指在生產過程中作為蛋白保護劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料的質量標準應符合2000年版的《中國生物制品主要原輔材料質控標準》規定的標準要求，并且要適合于本企業的生產。建議作以下檢驗：

（1）牛血清或羊血清

外 觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無溶血或異物。無菌試驗：將血清直接37℃放臵7天，明亮處觀察，不得出現混濁或— 4 — 沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，蛋白含量≥32mg/ml。

球蛋白含量：取待測血清1ml，采用飽和硫酸銨法進行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化鈉溶液，至1ml，用Lowry方法測定，蛋白含量應≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外 觀：應為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無吸潮，無結塊，無肉眼可見的其它雜質顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，在18?26℃時，溶解時間應≤15分鐘，pH值應為6.5?7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲法，其標準為≥95％。

總蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標準為≥95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的BSA含量，其標準為≥90%。（3）酪蛋白：

應符合生產所需的質量標準。（4）標記用酶

應在產品的質量標準中明示所使用的標記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應根據不同生產廠家的檢驗方法和質量標準進行檢驗，酶的純度RZ值（OD403nm/OD280nm）應大于3.0。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應進行功能性實驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進行酶聯免疫測定，均不能出現非特異性反應。

生物輔料的供應商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應商。3.化學原材料

化學原材料的質量標準，包括外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等，均應符合《中國生物制品主要原輔材

— 5 — 料質控標準（2000年版）》分析純級別的要求，并且要適合于本企業的生產。

主要化學原材料的供應商要求相對固定，不得隨意發生變更。化學原材料在購入時，原材料的生產商必須提供該批次化學原材料的質量保證材料和質量檢驗報告。

4.其他物料（1）酶標板 ①外觀

明亮處用肉眼觀察板條的外觀質量，如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差，底部有波紋及劃傷等應剔除。②吸附能力和精密性 采用合適的方法進行檢驗。

一般用一定濃度的正常人免疫球蛋白G(IgG)包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結合物吸附，通過顯色反應，使用酶標儀讀數，計算CV值。CV值結果應符合相關產品的功能性質量標準，一般批內CV≤5％，批間CV≤10％。

（2）液體試劑裝量瓶

包括陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應有相應的裝量瓶，并建立相應的質量控制標準，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。

（3）其他材料

包括試劑瓶標簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應參照國家食品藥品監督管理局發布的《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》和《醫療器械說明書、標簽和包裝標識管理規定》建立相應質量控制標準。— 6 — 5.企業質控品

企業質控品一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性、鉤狀效應（hook效應）等質控樣品，對于定量檢測試劑，還包括線性質控品樣品。如該產品具有國家標準品或參考品，應使用國家標準品（參考品）進行標化；若該診斷試劑沒有國家標準品（參考品），則企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

企業質控品的基質應與診斷試劑的待測樣品的基質基本一致，如待測樣品為血清/血漿，質控品基質也應為血清/血漿。

（三）試劑盒各組分的生產

酶聯免疫法檢測試劑主要組分的生產包括酶標記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標反應板、分裝及包裝等步驟；并通過產品的半成品檢驗和成品檢驗兩個質控過程來保證其質量符合規定。

1.各種工作液的配制

酶聯免疫診斷試劑研制生產過程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰性陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等，對定量檢測試劑，還包括標準品（或校準品）溶液。若陰性、陽性對照或其他液體組分涉及生物安全性問題，制備時應在相應的生物安全實驗室完成。

各種工作液在配制過程中應嚴格按質量標準中的配方進行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻，同時進行相應的質量檢驗并達到質量標準后，方可使用或分裝。對于定量檢測試劑，其標準品（或校準品）溶液應具有量值溯源性。

應對配制過程及配制的液體進行的質量控制，主要包括酶結合物的

— 7 — 功能性實驗及穩定性；各種溶液的外觀、pH值等；酶作用底物應測定在無相應酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標；終止液應對其終止酶促反應的能力進行測定。

2.包被酶標反應板

包被前應對酶標反應板進行質量檢驗，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標反應板的批號、數量、標識。酶標反應板經檢驗合格后方能用于包被。不同批號的板條不能混用。

選擇經檢驗合格的包被原料（如抗原、抗體等），經一定的方法確定最佳包被濃度和酶結合物工作濃度，按照診斷試劑的生產規程，配制包被緩沖液、封閉液，經檢驗合格后，包被酶標反應板，經干燥后，已包被的酶標反應板用鋁箔紙封閉（內臵干燥劑），保存于2?8℃。

應對包被過程進行相應的質量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質量檢驗、包被液和封閉液的質控（如配方、外觀、pH值）、包被過程的監控（包括包被和封閉的體積、溫度、時間等）、包被均一性檢驗、干燥過程的監控等。

3.分裝和包裝

樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應嚴格按照質量標準中的量進行過濾后再分裝，分裝量的誤差應小于5%。

分裝及包裝均應按照相應的標準操作規程要求進行。包裝前，應嚴格檢查試劑盒的品名、批號等，核對各試劑盒各組分的數量，并在關盒前進行復核。

（四）質量控制 1.半成品質量控制（1）半成品抽樣

檢驗人員按試劑的批號，根據抽樣申請單抽取規定數量的半成品各— 8 — 組分，作號標記、待檢。

（2）半成品檢驗

根據試劑盒的企業標準或者制檢規程進行半成品的檢驗。半成品檢驗，一般使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化后的企業參考品。若某類試劑沒有國家標準品（參考品），則使用企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

檢驗指標一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應達到相應的質量標準要求。對于精密性，一般情況下CV不得高于15％（采用競爭抑制法的診斷試劑CV不得高于20％）。對定量檢測試劑，同時應分析其線性相關系數和定量質控品檢測結果的準確性。

企業應該對每一批試劑的半成品進行穩定性研究。試劑盒各組分應留樣，2?8℃定期作穩定性考核，同時作37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產品的質量標準。

2.成品質量控制

產品包裝完成后，質檢人員根據試劑的批號、實際包裝量、抽樣申請單的要求進行抽樣，同時填寫抽樣數量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數量應包括檢驗用數量和留樣數量。質檢人員同時應檢查相關原始記錄。

每一批酶聯免疫類檢測試劑的試生產量應滿足工藝研究、分析性能驗證、穩定性研究、臨床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求。

（1）成品檢驗

成品檢驗時，一般使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化后的企業參考品，并達到相應質量要求。若該診斷試劑沒有國家

— 9 — 標準品（參考品），則使用企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

（2）穩定性試驗

在批放行前，每一批試劑應完成37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產品的質量標準。

四、名詞解釋

酶聯免疫法：是指在酶標板上包被特定的抗原（和/或抗體）后，利用直接或間接的方法與待測樣品中的相關抗體（和/或抗原）反應，形成的抗原抗體復合物再與相應的酶標記的抗體和/或抗原進一步反應，經過酶催化底物發生顯色反應，由形成的顏色的強弱來判斷樣本中相應的抗體和/或抗原的存在。

五、參考文獻：

1.《中國生物制品規程》（2000年版），化學工業出版社

— 10 —

第四篇：抗人球蛋白檢測試劑注冊技術審查指導原則（2018年）

附件3

抗人球蛋白檢測試劑注冊技術審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對抗人球蛋白檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是對抗人球蛋白檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。如申請人認為有必要增加本指導原則不包含的研究內容，可自行補充。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料，相關人員應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、范圍

抗人球蛋白檢測試劑可進行直接抗人球蛋白試驗和間接抗人球蛋白試驗，主要用于不規則抗體篩查、交叉配血、抗體致敏紅細胞的檢測等。

本指導原則適用于抗人球蛋白檢測試劑，同時適用于不同的檢測方法，如試管法、柱凝集法等，但不適用于血源篩查用抗人球蛋白檢測試劑。

本指導原則僅包括對抗人球蛋白檢測試劑注冊申報資料中部分項目的要求，適用于進行產品注冊和相關許可事項變更的產品。其他未盡事宜，應當符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第5號）（以下簡稱《辦法》）等相關法規要求。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料的撰寫應符合《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（國家食品藥品監督管理總局公告2014年第44號）（以下簡稱“44號公告”）的相關要求。內容主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、有關產品主要研究結果的總結和評價以及同類產品在國內外批準上市的情況介紹等內容，其中同類產品上市情況介紹部分應著重從靈敏度、特異性、效價、重復性等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的異同。

（二）主要原材料研究資料

主要原材料研究資料應包括主要組成成分（抗體、凝膠、玻璃珠等）的選擇、制備及其質量標準的研究資料。

1.抗體的選擇及質量標準

明確抗體的來源，如為單克隆抗體應明確細胞株、克隆號等內容。提供抗體靈敏度、特異性、效價等基本性能的驗證資料。

抗體如為自行生產，提供抗體的詳細生產及鑒定過程。

1.1靈敏度：已知抗體效價的臨床有意義的血型系統至少7種血型抗體（IgG）的最高稀釋倍數的凝集強度不小于1+。

1.2特異性：臨床有意義的已知血型系統至少7種，每種選1個抗體（IgG），與對應的抗原陽性細胞均應檢測陽性。

與不規則抗體陰性樣本檢測結果應為陰性。

1.3效價：如采用倍比稀釋的方法驗證抗人球蛋白試劑的效價，分別采用IgG和/或C3d致敏的細胞或根據廠家確立的研究方法進行驗證。

2.填充物的選擇：說明填充物如凝膠、玻璃珠的特性，如組成、粒徑及其質量控制要求。應提交選擇比較過程，提交驗證試驗資料。

3.填充緩沖液：應說明組成成分，并對外觀、性狀、pH值等物理指標及功能性進行研究驗證。

4.液體試劑稀釋液：應說明組成成分，并對外觀、性狀、pH值等物理指標及功能性進行研究驗證。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料

1.主要生產工藝介紹，可用流程圖方式表示，并簡要說明主要生產工藝的確定依據。

2.產品基本反應原理介紹。

3.主要生產工藝過程的研究資料、每一步生產工藝的確認資料及試驗數據。如抗體濃度的選擇確定過程、凝膠溶脹條件的確定、填充量及填充過程的研究資料，填充應確保均勻無氣泡，以及質量控制的要求。

4.主要反應體系的研究資料、每一步反應體系的確認資料及試驗數據。

反應體系的設置應符合《全國臨床檢驗操作規程》等公認標準操作規范、指南或標準的要求。如紅細胞懸液制備要求及紅細胞濃度的確定、用量的要求、孵育時間等；應提交離心條件的研究資料，建議以離心力或固定離心機型號固定轉數和時間的方式設置離心條件。

（四）分析性能評估資料

申請人應提交在產品研制或成品驗證階段對試劑進行的所有性能驗證的研究資料，對于每項分析性能的評價都應包括具體研究目的、實驗設計、研究方法、可接受標準、實驗數據、統計方法等詳細資料。有關分析性能驗證的背景信息也應在申報資料中有所體現，包括實驗地點（實驗室）、適用儀器、試劑規格、批號、臨床樣本來源等。分析性能評估的實驗方法可以參考國內或國際有關體外診斷產品性能評估的指導原則進行。

產品性能研究所采用的各種儀器、試劑或其他物品如可能均應采用境內或境外已批準上市的產品，如抗體篩查紅細胞、血型抗體等。

分析性能評估試驗中應明確所有試驗每種試劑的用量、試劑紅細胞的濃度、采用的試驗方法（試管法、柱凝集法、微孔板法等）。所有試驗方法應符合配合使用的血型試劑的具體操作要求。

對于抗人球蛋白檢測試劑建議著重對以下分析性能進行研究：

1.間接抗人球蛋白試驗：

提供臨床有意義的血型系統至少7種不規則抗體（IgG）檢測靈敏度和特異性的驗證資料，明確所檢出抗體的抗體效價的具體要求，可參照以下要求進行實驗。

1.1靈敏度

與已知抗體效價的血型抗體的最高稀釋倍數的凝集強度不小于1+，并且抗體效價不低于試管間接抗人球蛋白法測定結果。

C3d凝集強度≥2+。

1.2特異性

與已知抗體類型的血型抗體對應的O型相應抗原陽性紅細胞的反應為陽性。

與已知抗體類型的血型抗體對應的O型相應抗原陰性紅細胞的反應為陰性。

與C3d陽性或陰性樣本反應為陽性或陰性。

1.3重復性

分別采用IgG性質抗D抗體，IgG性質抗Jka/Jkb抗體，IgG性質抗Fya/Fyb抗體進行重復性驗證。

批內重復性采用同一批次檢測卡重復進行檢測，重復次數不少于10次。

日間重復性采用同一批次檢測卡每日重復進行檢測，重復天數不少于10天。

批間重復性采用至少三批檢測卡進行重復檢測。

批內、日間、批間重復性檢測結果應基本一致，檢測結果凝集強度差異不超過1+。

采用陰性結果的血清重復10次檢測，均應出現陰性反應。

1.4干擾

提供溶血、脂血、黃疸干擾的評估資料，應至少采用強、中、弱性質的抗體進行評價。

1.5血清、血漿比對的評估資料。

1.6抗凝劑的適用性研究驗證。

1.7采用部分臨床樣本進行檢測靈敏度和特異性的評價，應考慮涵蓋腫瘤、血液病、自身免疫病和貧血患者、老人及兒童等病例來源，應包括陽性和陰性病例。

1.8分別進行每個預期用途的完整的性能評估資料，應至少包括50例陽性病例。

2.直接抗人球蛋白試驗

使用被不規則抗體和/或C3d致敏的紅細胞進行反應，評價產品性能，適用的性能評價內容可以參照間接抗人球蛋白試驗。

（五）陽性判斷值

給出不同凝集強度的研究方法，并明確不同凝集強度代表的具體意義，并應包含溶血、混合視野雙群等情況，明確具體的試驗方法、實驗步驟，提供不同凝集強度的圖例或相片。

（六）穩定性研究資料

穩定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩定性和適用樣本的穩定性研究。前者主要包括實時穩定性（有效期）、加熱穩定性、開瓶穩定性等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案，實驗項目應至少包括靈敏度、特異性、重復性等內容。

穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對于實時穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

應對樣本穩定性進行研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度范圍內選擇溫度點（溫度范圍），每間隔一定的時間段對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認不同類型樣本的穩定性。適于冷凍保存的樣本還應對凍融次數進行評價。

試劑穩定性和樣本穩定性兩部分內容的研究結果應分別在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（七）臨床試驗

臨床試驗總體要求及臨床試驗資料的內容應符合《辦法》、“44號公告”及《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）的規定，以下僅結合抗人球蛋白檢測試劑的具體特點對其臨床試驗中應重點關注的內容進行闡述。

1.研究方法

該類試劑已有同類產品上市，按照法規要求應選擇境內已批準上市、臨床普遍認為質量較好的同類產品作為對比試劑，采用試驗用體外診斷試劑（以下稱考核試劑）與之進行比較研究試驗，證明本品與已上市產品等效。

2.臨床試驗單位的選擇

應選擇符合相關法規要求的臨床試驗機構進行臨床試驗，不得選擇血站進行臨床試驗。

3.病例選擇

臨床總病例數應不少于3000例。應采用臨床患者樣本進行臨床研究，供血者樣本不得作為臨床病例納入。應包括對檢測易產生干擾的病例，盡量選擇多種疾病患者樣本（如腫瘤患者、自身免疫病患者、血液病患者）、老人、兒童（不同年齡段）等。

4.實驗過程

無論直接抗人球蛋白試驗還是間接抗人球蛋白試驗，均應根據產品的預期用途和適用人群分別進行臨床試驗。

在進行間接抗人球蛋白檢測試劑臨床試驗的過程中除與對比試劑進行比較外，陽性結果應給出不規則抗體的具體鑒定結果。

產品如適用于不同的預期用途（如不規則抗體篩查、抗體致敏紅細胞檢測、交叉配血等），每種預期用途均應分別進行至少3000例的臨床試驗，如適用于不規則抗體篩查或抗體致敏紅細胞檢測等，每種預期用途應分別包含不少于100例陽性病例，如適用于交叉配血相關用途，應包含不少于100例交叉配血不合病例。抗體致敏紅細胞檢測應根據疾病的種類，分別進行臨床試驗。

交叉配血使用的供血者樣本，最多只能使用兩次，交叉配血不得使用血型不合的樣本進行實驗。

同時應明確配合使用的試劑產品。

5.統計學分析

應進行考核試劑與對比試劑檢測結果的陽性符合率、陰性符合率、總符合率的計算，并以四格表的形式進行列表，并對定性結果進行Kappa檢驗以驗證檢測結果的一致性。

6.結果差異樣本的驗證

對于兩種試劑檢測結果不一致[考核試劑與對比試劑檢測結果不一致、與對比試劑凝集強度差異較大（差異2個凝集強度及以上）]的樣本，應采用臨床上公認較好的第三種同類試劑進行確認試驗，同時應給出最終的抗體鑒定結果。

7.臨床試驗數據記錄表應作為臨床試驗報告附件提交。臨床試驗數據記錄表應列明所有病例的具體臨床診斷信息、凝集強度和抗體鑒定結果，如有不符樣本應列明第三方確認的結果。

（八）產品風險分析資料

產品風險分析資料應符合“44號公告”的基本要求，并參照相應的行業標準進行風險分析。風險分析中應充分考慮到各種可能影響檢測結果的因素，如某些樣本（如腫瘤患者、自身免疫病患者、血液病患者等）在進行抗人球蛋白檢測時可能存在一定的干擾、實驗過程不規范、有些抗體較弱導致的檢測結果不穩定等，申請人應根據這些不確定的因素分析產品應用可能存在的風險。

（九）產品技術要求

申請人應當在原材料質量和生產工藝穩定的前提下，根據產品研制、性能評估等結果，依據國家標準、行業標準及有關文獻，按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號）的有關要求，編寫產品技術要求。產品技術要求應符合《辦法》和“44號公告”的相關規定。

如果擬申報試劑已有相應的國家/行業標準發布，則企業標準的要求不得低于上述標準要求。

產品技術要求的性能指標應至少包括靈敏度、特異性、重復性等。

產品技術要求的附錄應包括主要原材料、生產工藝及半成品檢定要求。主要原材料應明確抗體來源、克隆號、純度、效價、特異性以及功能性驗證要求，應明確填充物來源及主要特征、質量控制要求，緩沖液應明確組成、pH值等特性及質控要求。主要生產工藝應以流程圖形式描述主要生產工藝過程，并明確主要生產工藝的具體條件和質量控制點。半成品檢定應明確半成品的檢驗要求及方法。

（十）產品注冊檢驗報告

根據《辦法》要求，首次申請注冊的第三類體外診斷試劑產品應在國家食品藥品監督管理部門認可的、具有相應承檢范圍的醫療器械檢驗機構進行連續三個生產批次樣品的注冊檢驗。

（十一）產品說明書

說明書承載了產品預期用途、檢驗原理、試驗方法、檢測結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學解釋的重要依據，因此，產品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）的要求，境外產品的中文說明書除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產品說明書的所有內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規范格式對此內容進行標注，并單獨列明參考文獻的相關信息。

以下內容僅對抗人球蛋白檢測試劑說明書的重點內容進行詳細說明，說明書其他內容應根據《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》要求進行編寫。

1.【預期用途】

1.1寫明本試劑用于直接抗人球蛋白試驗和/或間接抗人球蛋白試驗，主要用于不規則抗體篩查、交叉配血、抗體致敏紅細胞的檢測（明確疾病類型）等，同時明確不用于血源篩查，僅用于臨床檢驗。

1.2說明與預期用途相關的臨床適應癥背景情況，說明相關的臨床或實驗室診斷方法。

2.【儲存條件及有效期】

說明試劑的儲存條件及有效期、加速穩定性、開瓶穩定性等。

3.【適用儀器】明確具體的離心機和/或孵育器型號（如適用）。

4.【樣本要求】

明確溶血、脂血、黃疸樣本是否可以使用，或提供使用此類樣本的最低要求。依據穩定性研究結果寫明樣本穩定性。

明確適用的抗凝劑的要求。

明確具體的樣本采集、處理方法及過程。

明確紅細胞配制使用的LISS液的生產廠家、規格、貨號等內容。

5.【陽性判斷值】

明確各種試驗方法的結果判斷方法及標準，并通過不同凝集強度的圖例或照片進行詳細解釋。

6.【檢驗方法】

明確配合使用的抗體篩查用紅細胞的生產廠家、規格、貨號等內容。

須明確具體的檢驗步驟，反應體系的描述應準確且應與研究資料一致，不同的預期用途應分別詳細描述實驗過程。如配合其他試劑進行試驗，需注明試驗方法應完全符合配合試劑的試驗操作要求。

7.【檢驗方法的局限性】

未被檢出的抗IgG抗體在某些病例中可能有臨床意義。

8.【注意事項】

8.1上腔部分或封口處有氣泡或液滴的卡，必須在使用前離心。

8.2濃度過高或過低的紅細胞懸液會引起異常結果。

8.3在不規則抗體篩查、交叉配血試驗中LISS液可以增強抗原抗體的反應，應嚴格按產品說明書規范使用低離子液。

三、參考文獻

1.國家食品藥品監督管理總局.體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）.2014年9月

2.國家食品藥品監督管理總局.體外診斷試劑說明書編寫指導原則（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）.2014年9月

3.中國生物制品規程（2000年版）.化學工業出版社

四、起草單位

國家食品藥品監督管理總局醫療器械技術審評中心。

第五篇：核酸擴增法檢測試劑注冊技術審查指導原則3

附件3

核酸擴增法檢測試劑注冊技術審查指導原則

一、前言

本指導原則主要針對核酸擴增類檢測試劑的主要原材料、生產工藝及反應體系、產品質量控制等環節提出指導性技術要求。

本指導原則系對核酸擴增法檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品特性確定其中的具體內容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應的科學依據。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著法規和標準的不斷完善、科學技術的不斷發展，其相關內容也將進行適時的調整。

二、適用范圍

本指導原則適用于核酸擴增法檢測試劑的注冊技術審查，其他類核酸檢測試劑可參照相關內容。

三、基本要求

（一）基本原則

1.核酸擴增類檢測試劑的生產企業應獲得《醫療器械生產許可證》。研制、生產用的各種原料、輔料等應制定其相應的質量標準，并應符合有關法規的要求。

2．試劑生產企業應具有與其技術要求相適應的人員、廠房、設施和

— 23 — 儀器設備以及適宜的生產環境，配備滿足核酸提取和擴增檢測以及操作人員防護所需的設備。建立專用實驗室，實驗室應當嚴格分區，人員和物品應當單向流動，以最大限度地防止實驗過程中樣品之間的污染和避免擴增產物的污染。生產用于病原微生物核酸檢測的生產企業應建立符合生物安全要求的設施和措施。

3.試劑生產企業應按照《體外診斷試劑生產實施細則（試行）》的要求，建立相應的質量管理體系，并應通過《體外診斷試劑生產企業質量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。

4.核酸擴增類檢測試劑的引物設計應當符合核酸檢測設計的要求，擴增體系應設定合理的內標和外標，試劑需設置抗污染的特定措施，擴增產物須進行確證研究。

5.企業使用新型原材料時，應提供與通行原材料比對研究結果及相關資料。使用未列入上述標準的化學試劑，應不低于分析純。

（二）原材料

應提供主要原材料如引物、探針、企業參考品或標準品等的選擇與來源、制備過程、質量分析和質量標準等的相關研究資料。若主要原材料為企業自己生產，其生產工藝必須相對穩定；如主要原材料來自市場（從其他單位購買），應提供的資料包括：對物料供應商審核的相關資料、購買合同、供貨方提供的質量標準、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質量檢驗資料。主要原材料（包括生產工藝）或其供應商發生變更，應依據國家相關法規的要求進行變更申請。

核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應無脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

1.脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。應為高效液相色譜（HPLC）純、PCR級，無DNase和RNase污染。—20℃保存。— 24 — 2.引物

由一定數量的dNTP構成的特定序列，通常采用脫氧核糖核酸（DNA）合成儀人工合成，合成后經聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化。

凍干粉，序列正確，合成量應達到試劑生產要求。純度應達到電泳級（PAGE）或HPLC級，不含雜帶。應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如PAGE電泳結果或HPLC分析圖譜。

應作HPLC分析和紫外光吸收分析。以紫外分光光度計測定OD260nm/OD280nm的比值在1.6—2.0之間，可視為合格引物。-20℃保存。

3.探針

是指特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，在5'-端(和/或3'-端)進行標記，如熒光素報告基團或其他發光標記物，在3'-端標記熒光素淬滅基團，并經HPLC或其他適宜方法純化。

凍干粉，純度應達到HPLC純。應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如HPLC分析圖譜；應對探針的核酸序列及標記的熒光素或化學發光物進行核實，并作HPLC分析。應以可見—紫外分光光度計進行200—800nm掃描，在260nm處應有吸收峰。另外，根據標記熒光素的不同，還應該在熒光素的激發波長處有吸收峰，如FAM熒光素在494nm、TET熒光素在521nm、TAMRA熒光素在560nm處有特異的吸收峰，雜交探針在493nm、625nm、685nm處有特異的吸收峰，檢定合格后入庫。避光、-20℃保存。

4.DNA聚合酶

如Taq DNA聚合酶。應具有DNA聚合酶活性，無核酸內切酶活性；具熱穩定性，94℃保溫1小時后仍保持50%活性。-20℃保存。

5.尿嘧啶糖基化酶（UNG）

具有尿嘧啶糖基化酶活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性，IU UNG

— 25 — 在 37℃處理3分鐘后，103拷貝以下含U模板應完全降解，不能產生擴增產物。-20℃保存。

6.逆轉錄酶

具逆轉錄酶活性，無核酸內切酶活性。—20℃保存。

（三）生產工藝

核酸擴增類檢測試劑的基本生產工藝通常包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應符合要求，原材料應混合均勻，配制過程應對電導率pH、等關鍵參數進行有效控制。

工藝研究的資料應能對反應體系涉及到的基本內容，如樣本類型、樣本用量、試劑用量、反應條件、校準方法、質控方法、臨界值的確定、穩定性和有效期，提供確切的依據。

（四）質量控制 1.半成品質量控制

（1）按批號抽取規定數量的半成品。

（2）以參考品/對照品進行半成品質量控制。如果產品具有國家標準品或參考品，應以其進行檢定。如果產品不具有國家標準品或參考品，應根據規定制備相應的企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

（3）半成品檢定內容包括：陰/陽性參考品符合率、靈敏度、特異性、精密度。檢測結果應符合質量標準的要求。

（4）半成品檢定合格后，按試劑盒組成及時進行分裝和包裝。2.成品質量控制

（1）每一批核酸擴增法檢測試劑的試生產量應滿足工藝研究、分析性能驗證、穩定性研究、臨床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求。— 26 —（2）產品完成包裝后，應根據生產量進行抽樣和生產記錄審核。（3）以參考品/對照品進行成品質量檢驗。結果應符合要求。（4）成品檢驗的內容應包括：陰/陽性參考品符合率、靈敏度、特異性、精密度、線性范圍（定量產品）和穩定性。

5．試劑批放行前，應對需要進行穩定性考核的試劑成分，在特定溫度或條件下進行穩定性試驗。穩定性試驗可采用加速破壞試驗。

四、名詞解釋

核酸擴增法檢測試劑：核酸擴增技術泛指以擴增脫氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）為手段，檢測特定核酸序列或篩查特定基因的檢測技術，如聚合酶鏈反應（PCR）、連接酶鏈反應（LCR）、轉錄依賴的擴增反應（TMA）等。核酸擴增法檢測試劑是基于核酸擴增檢測技術的體外診斷試劑，目前已經用于病原體檢測、特定疾病的早期診斷和體內物質的型別鑒定等不同領域。

五、參考文獻

1.《中國生物制品規程》（2000年版），化學工業出版社