第一篇：基于核酸檢測方法金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測試劑注冊技術審查指導原則

附件3 基于核酸檢測方法的金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測試劑注冊技術審查 指導原則 本指導原則旨在指導注冊申請人對基于核酸檢測方法進行耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌鑒別檢測的體外診斷試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門審評注冊申報資料提供參考。

本指導原則是針對基于核酸檢測方法進行耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌鑒別檢測的體外診斷試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是供申請人和審查人員使用的指導性文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規強制執行，如有能夠滿足法規要求的其他方法，也可以采用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規、標準的不斷完善和科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、適用范圍 （一）臨床背景 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）為革蘭陽性球菌，是葡萄球菌屬的一種，分布廣泛，多種動物和人均有易感性，是臨床上常見的致病菌。隨著抗菌藥物的使用，逐漸出現耐藥型金黃色葡萄球菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA）。MRSA具有多重耐藥性，不僅對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥，也對氨基糖苷類、大環內酯類、四環素類和喹諾酮類藥物都表現出不同程度的耐藥，其對不同抗菌藥物的耐藥率存在較大的地域差異，并有不同的變化趨勢。

MRSA分為醫療機構相關性MRSA（healthcare-associated MRSA，HA-MRSA)、社區相關性MRSA(community-associated MRSA，CA-MRSA)和家畜相關性（Livestock-associated MRSA，LA-MRSA）。CA-MRSA 和HA-MRSA、LA-MRSA在微生物學、細菌耐藥（如HA-MRSA相較于CA-MRSA表現出更多多重耐藥）及臨床特點方面（如感染部位）有較大差異，根據這些特點可以將兩者進行區分。但由于人員在醫院和社區間不斷流動，CA-MRSA 和HA-MRSA 的差異日漸縮小。MRSA的分型有多種方式，如SCCmec、spa基因分型、多位點序列分型（MLST）、基于脈沖場凝膠電泳（PFGE）的分型等。

MRSA的耐藥機制可能是由于MRSA受到外界刺激后本身固有耐藥基因被激活或是引入了外來的耐藥基因并激活。目前臨床分離的MRSA菌株對大多數β-內酰胺抗菌藥物耐藥（新型頭孢菌素類除外），大部分耐藥是由mecA、mecC基因介導，但是小部分MRSA不攜帶mecA基因，存在其它耐藥機制。

目前SA的臨床檢測方法包括：分離培養后，經染色觀察、血漿凝固酶試驗、生化鑒定，質譜鑒定及聚合酶鏈反應（PCR）檢測耐熱核酸酶（nuc）基因、SA保守基因16S rRNA和SA多種毒素基因。

MRSA的檢測方法包括頭孢西丁紙片擴散法、苯唑西林微量肉湯/瓊脂稀釋法（MIC）、苯唑西林瓊脂篩選法、青霉素結合蛋白（PBP2a）乳膠凝集法、顯色培養基法、自動化藥敏檢測以及聚合酶鏈反應（PCR）檢測mecA等基因方法。

美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）推薦用于MRSA的檢測方法有：紙片擴散法、2%NaCl肉湯/瓊脂稀釋法和苯唑西林瓊脂篩選法，這些檢測方法均需要在33-35℃條件下孵育24小時。

目前臨床推薦選擇頭孢西丁篩查試驗進行MRSA的檢測，還可以選擇苯唑西林微量肉湯/瓊脂稀釋法（MIC）。

MRSA/SA的臨床檢測樣本類型包括但不限于鼻拭子、痰液、皮膚及軟組織感染樣本、血培養陽性并革蘭染色法陽性球菌的樣品等人體樣本和培養物。不同樣本類型可能適用于不同的臨床預期用途：如用于醫療機構對住院病人包括重癥監護病人、手術病人及長期護理病人等MRSA院內感染的預防和控制的監測，用于結合其他實驗室檢測如微生物培養等輔助診斷MRSA/SA的感染，用于臨床需進行培養檢測的患者MRSA/SA感染的輔助診斷等。

（二）本指導原則適用范圍 本指導原則適用于基于核酸檢測方法進行耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌鑒別檢測的體外診斷試劑。常見方法包括熒光聚合酶鏈反應（PCR）方法、基因芯片法等。本指導原則的相關內容基于熒光聚合酶鏈反應（PCR）方法對產品相關申報資料提出要求，其他方法的相關產品可依據方法學的具體特點參照執行。

二、注冊申報資料要求 （一）綜述資料 綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、有關產品主要研究結果的總結和評價以及其他內容，其中，與預期用途相關的臨床適應癥應重點描述申報產品所檢測的金黃色葡萄球菌鑒定基因的選擇依據、耐藥突變位點與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的相關性、基因選擇的依據及覆蓋的耐藥菌的情況、產品驗證覆蓋的耐藥菌株及其在我國的流行特征；

產品描述應明確申報產品所有可檢出的耐藥基因型（可包含不同分型方式下的分型，如SCCmec型、spa型以及PFGE分型）、尚未驗證的耐藥菌株型別；

同類產品在國內外批準上市的情況，應著重從所檢菌株覆蓋情況、檢測的最低檢出限及不同菌株和型別間的交叉反應等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區別。綜述資料的撰寫應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第5號）和《體外診斷試劑注冊申報資料要求及說明》（國家食品藥品監督管理總局公告2014年第44號）的相關要求。

（二）主要原材料研究資料 此類產品主要為PCR方法，主要原材料包括引物、探針、DNA聚合酶、dNTP、尿嘧啶糖基化酶（如有）、核酸分離/純化組分（如有）、試劑盒質控品及企業參考品等。應提供主要原材料的選擇與來源、制備及質量標準等的研究資料、質控品的確認試驗資料；

生產企業還應提供企業參考品的原材料選擇、來源、質量指標、參考品的制備及陰陽性的確認過程等。

1.引物和探針：包括申報產品檢測靶序列的引物和探針以及內對照的引物和探針。應詳述引物和探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應情況。針對檢測靶序列的引物和探針，建議設計兩套或多套引物、探針以供篩選，針對預期適用的型別進行檢出準確性和特異性（如交叉反應）的評價，可采用擴增靶序列與SA和MRSA基因組比對研究的方法，最終確認最佳組合，并提交篩選的研究數據。引物、探針的質量標準應至少包括序列準確性、純度檢查、濃度檢查及功能性實驗等。

2.酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶，其質量標準如下：

2.1DNA聚合酶應包括DNA聚合酶活性、無核酸內切酶活性、熱啟動能力（如適用）、熱穩定性等。

2.2如申報產品中包含尿嘧啶DNA糖基化酶，應對其酶活性及熱穩定性等質量控制標準進行規定。

3.dNTP：質量標準應至少包括純度檢查及功能性實驗等。

4.核酸分離/純化組分（如有）的原理介紹、主要組成、主要原材料的質量控制標準及相關驗證資料。

5.試劑盒質控品 試劑盒的質控體系通過設置各種試劑盒質控品來實現，針對陽性質控品和陰性質控品，申請人應明確質控品的來源、質量標準、質控品陰陽性的確認方法及相關驗證資料。質控品應參與樣本處理和檢測的全過程，如核酸的平行提取等步驟。申報產品的質控體系應考慮以下幾個方面：

5.1陽性質控品中應含有包含試劑盒所檢靶序列的DNA，優先使用MRSA/SA分離滅活菌株，也可以采用工程菌株、克隆菌株等。企業應對質控品的檢測結果做出明確的范圍要求（如Ct值）。

5.2陰性質控品應不含試劑盒所檢靶序列的基因，陰性質控的基質應與實際樣本基質一致或接近，以對可能存在的交叉污染產生的假陽性結果進行質量控制。

5.3對照（內標）可以對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，申請人應對內對照（內標）的引物、探針設計和模板濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。對內對照的檢測結果亦應做出明確的范圍要求（如Ct值）。

6.企業參考品：應詳細說明有關企業參考品的原料選擇、制備過程、提供陰陽性確認等試驗資料。

企業參考品應充分考慮產品檢測靶物質的各種基因型別和耐藥菌株，考慮產品驗證的性能需求進行設置。具體要求如下：

6.1陽性參考品 陽性參考品應采用經鑒定確認的多個臨床流行分離菌株、含有菌株純化的基因組DNA等，包含申報產品聲稱的應檢出的MRSA/SA基因型。應覆蓋我國主要的流行耐藥菌株，可包含不同分型方式下的分型，如SCCmec型、spa型以及PFGE分型等。

6.2陰性參考品（特異性參考品）陰性參考品應考慮檢測MRSA和SA的特異性分別進行評價的要求，應納入不在試劑盒檢測范圍內的其他葡萄球菌、革蘭陽性菌菌株和其他病原體樣品，特別是可能存在潛在競爭抑制的甲氧西林敏感凝固酶陰性葡萄球菌。

6.3檢測限參考品 檢測限參考品應分別針對MRSA和SA每個分析物靶基因和不同樣本類型設定檢測限附近連續稀釋的參考品，應使用處于對數增長期的菌進行制備，明確每個參考品的活菌數，以CFU/mL表示。應明確CFU的確定方法。

6.4精密度參考品 精密度參考品應使用菌株針對每個檢測目標物設定一組參考品，包括陰性、弱陽性（略高于臨界值，預期重復檢測95%陽性）、中等陽性（高于臨界值，預期檢測結果100%陽性）三個水平。

如產品適用于不同的樣本類型，建議針對不同樣本類型設定不同的參考品基質，應與實際樣本類型基質一致或相似，模擬基質應經證實與天然基質無顯著差異。

若主要原材料為企業自己生產，其生產工藝必須相對穩定，并提交主要原材料制備過程；

如主要原材料購自其他供應商，則需針對供應商的選擇提供評價數據，并提供供應商出具的質量標準、出廠檢定報告，以及申請人對該原材料進行的質量檢驗資料。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料 1.介紹產品主要生產工藝，可以圖表方式表示，并說明主要生產工藝的確定依據。

2.反應原理介紹。

3.詳述樣本采集、樣本處理方式的選擇和設置，提供相關的研究資料。

4.確定最佳反應體系的研究資料，包括樣本用量、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應各階段溫度、時間、循環數等。

5.不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述，并提交驗證資料。

6.如申報產品包含核酸分離/純化試劑，應提交對核酸分離/純化過程進行選擇的研究資料。

（四）分析性能評估資料 申請人應提交產品研制階段對試劑盒進行的所有性能評價的研究資料，對于每項分析性能的評價都應包括具體研究目的、試驗方法、可接受標準、試驗數據、統計方法等詳細資料。有關分析性能驗證的背景信息也應在申報資料中有所體現，包括實驗地點、適用儀器、試劑規格、批號和臨床樣本來源等。

針對不同的樣本類型如鼻拭子、痰液、皮膚和軟組織感染拭子樣本、血培養分離樣本等，申請人應分別完成性能評估，包括陰陽性符合率、最低檢測限、精密度評價、干擾驗證等。

分析性能評價的試驗方法可以參考相關的國外或國內有關體外診斷試劑性能評估的指導原則進行。各項性能評價應符合以下要求。

1.核酸分離/純化性能（如適用）在進行靶核酸檢測前，應有適當的核酸分離/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的核酸外，還應有相應的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有核酸分離/純化的組分，企業都應結合檢測試劑的特性，對配合使用的核酸分離/純化試劑針對聲稱樣本類型的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗證，提供詳細的驗證資料。

2.最低檢測限 申報產品最低檢出限的性能評估資料應包含最低檢出限的確定及驗證過程。

應使用臨床分離獲得的特征良好的MRSA/SA分離菌株進行最低檢測限研究。所選菌株建議包含來自不同地區的MRSA/SA，以涵蓋金黃色葡萄球菌的遺傳多樣性，應覆蓋不同分型方式下的不同分型，如SCCmec型、spa型、PFGE分型，涵蓋我國不同地區臨床常見型別。最低檢測限的確定研究試驗應使用上述選定的多種有代表性的MRSA/SA分離菌株進行連續稀釋，以CFU/mL為檢測單位，如引入DNA拷貝數作為單位，應確定兩者之間的換算關系。稀釋基質應根據產品聲稱的樣本類型分別配合相應的基質。如樣本類型為鼻拭子、痰液或皮膚及軟組織感染拭子，建議使用陰性鼻拭子或陰性皮膚及軟組織拭子洗液或模擬基質進行稀釋，如可使用含生理鹽水、粘蛋白及人類基因組DNA的基質作為鼻拭子、痰液樣本替代基質，使用含白細胞、紅細胞、血漿的基質作為皮膚及軟組織拭子樣本的替代基質；

如樣本類型為經血培養并確定含革蘭陽性球菌（GPC）的樣本，應使用含人血液和適配的血液培養基作為模擬基質，并應添加高濃度的常見感染菌。可將模擬樣本稀釋液培養一段時間。無論使用何種模擬或替代基質，應進行基質比對性試驗證明替代基質與臨床實際樣本的等效性。

將各稀釋液重復檢測3-5次，預估檢測限范圍后制備至少20份檢測限濃度樣本，證實MRSA/SA檢出率達到95%的濃度作為最低檢測限。針對不同的血培養瓶或血培養系統，應分別驗證檢測限是否一致。

3.包容性 應通過實驗證實產品能夠檢出的金黃色葡萄球菌中存在的基因多態性的MRSA/SA。在實驗驗證菌株納入時考慮金黃色葡萄球菌的進化結構，常見克隆系和型別，并納入不同SCCmec型、spa型、PFGE類型的菌株。建議檢索近年國內相關文獻報道并收集各地區、不同菌株（社區和醫院內感染，鼻腔、皮膚和軟組織感染等）進行菌株驗證。被驗證細菌的濃度應接近檢測限水平，所有菌株應進行鑒定和濃度測定。并應在預期可能存在高濃度（高于106CFU/mL）的其他感染菌如甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）和耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌情況下進行試驗。

4．申請人應對申報產品精密度指標做出合理要求。精密度評價使用菌株配制的企業參考品或相應臨床樣本進行，且精密度評價試驗應包含核酸分離/純化步驟。針對本類產品的精密度評價主要包括以下要求。

4.1對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除檢測試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應對分析儀、操作者、地點、檢測批次等要素進行相關的驗證。

4.2設定合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。

4.3用于精密度評價的參考品或臨床樣本均應至少包含3個水平：陰性、弱陽性（略高于臨界值，預期重復檢測95%陽性）、中等陽性（高于臨界值，預期檢測結果100%陽性），并根據產品特性設定適當的精密度要求，臨床樣本精密度評價中的每一次檢測均應從核酸提取開始。

5.分析特異性 5.1交叉反應 交叉反應的驗證應結合樣本來源進行，針對不同樣本類型考慮可能共生的潛在的交叉反應病原體。應使用高濃度交叉反應病原體（如高于106CFU/mL的細菌和酵母，高于105PFU/mL的病毒）進行交叉反應驗證，以明確是否存在交叉反應所致的假陽性。

針對鼻拭子、痰液樣本，應考慮在鼻中及呼吸道的致病菌和共生菌，如甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）、凝固酶陰性葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE），以及革蘭陰性桿菌、革蘭陰性球菌、奈瑟菌、莫拉菌、酵母菌、革蘭陽性桿菌、革蘭陽性球菌等臨床常見菌種，凝固酶陽性葡萄球菌代表菌株。

針對皮膚和軟組織感染樣本或檢測來自血培養測定為陽性微生物生長并經革蘭染色證實為革蘭陽性球菌的樣本，應納入更多微生物，包括皮膚菌群。對于血培瓶來源的樣本無必要進行病毒交叉反應驗證。

5.2微生物干擾 同樣采用上述潛在交叉反應微生物，評價潛在微生物干擾，即是否對MRSA/SA臨界水平樣本檢測產生干擾。建議采用存在于各標本類型的（鼻拭子、痰液、皮膚和軟組織感染、血培養樣本）和代表不同MRSA基因型的至少兩個MRSA菌株在臨界水平進行微生物干擾試驗。

5.3干擾物質 評價各樣本類型中可能存在的干擾物質是否對檢測造成干擾。建議采用存在于各標本類型的（鼻拭子、痰液、皮膚和軟組織感染、血培養樣本）和代表不同MRSA基因型的至少兩個MRSA菌株的臨界濃度對干擾物質（潛在最高濃度）進行驗證。鼻拭子樣本的干擾物質應考慮血液、鼻腔分泌物或黏液、鼻腔用藥。痰液樣本的干擾物應考慮如血液、粘液、人細胞等。皮膚和軟組織感染樣本的潛在干擾物應考慮血液、膿液、血漿、常用外用抗菌藥、抗生素等皮膚用藥。血培養樣本的潛在干擾物質應考慮血培養基、樹脂及活性炭等，具體結合培養瓶類型確定。

6.陽性/陰性參考品符合率 陽性參考品的檢測旨在驗證試劑盒檢測范圍內的MRSA/SA均可以在適當的濃度被檢測到，陽性參考品檢測結果應為陽性。陰性參考品旨在評價試劑特異性，陰性參考品檢測結果應為陰性。

7.方法學比對研究 為驗證擬申報產品靶核酸檢測的準確性，應選擇部分臨床樣本將擬申報產品與已上市核酸檢測試劑進行比較研究。所選對比試劑檢測靶基因應與擬申報試劑一致，方法性能可比，且臨床公認質量較好；

對于無已上市核酸檢測試劑的目的基因，可與病毒核酸序列測定方法進行比對。用于核酸序列測定的引物序列應不同于考核試劑中用于檢測目的基因的引物序列。建議對擴增子進行雙向測序。方法學比對研究的具體方式可參考相關的國外或國內有關的指導文件進行，臨床樣本數量及其特性應具有代表性，能夠充分驗證擬申報產品靶核酸檢測的準確性。

8.其他性能研究（如涉及）如攜帶污染的驗證，使用高陽性樣本和陰性樣本交叉檢測多次運行，考察設備多樣本檢驗是否存在攜帶污染。

（五）陽性判斷值確定資料 對于此類試劑，陽性判斷值即為針對每個目標物能夠獲得理想的臨床靈敏度和臨床特異性的臨界值（Cutoff），對于熒光探針PCR方法即為Ct值的確定資料。建議采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進行相關研究。申請人應選取適當的足夠數量的臨床樣本進行試驗以確定陽性判斷值。

（六）穩定性研究資料 穩定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩定性和適用樣本的穩定性研究。前者主要包括實時穩定性（有效期）、開瓶穩定性及凍融次數限制等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對于實時穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

樣本穩定性進行研究，可以在合理的溫度范圍內，每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認不同類型樣本的效期穩定性。冷凍保存的樣本還應對凍融次數進行評價。

對于樣本提取后不能立即進行檢測的，應明確核酸儲存條件、儲存時間等內容，同時應提供相應的核酸穩定性研究資料。

試劑穩定性和樣本穩定性兩部分內容的研究結果均應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（七）產品風險分析資料 申請人應參考YY/T 0316《醫療器械 風險管理對醫療器械的應用》規定的過程和方法，在產品生命周期內對申報產品可能造成的危害進行判定（可重點參考YY/T 0316的附錄H），對每一危害處境的風險進行判定和評價，形成風險管理報告，控制這些風險并監視控制的有效性，充分保證產品的安全性和有效性。

該試劑的主要危害大致可包括三個方面，即：生物學和化學危害、操作危害、信息危害。

1.生物學和化學危害 生物學：如細菌、病毒引起的交叉感染、檢測完成后剩余樣本、試劑和廢棄物處理不當引起的交叉感染。

化學：如使用的清潔劑、消毒劑殘留引發的危害。

2.操作危害 不正確的測量：

如未按使用說明書中的要求進行測量，造成的測量失敗、測量誤差過大。

使用未經驗證的不同廠家的分析儀或使用未經正確保養或校準的儀器，造成的測量失敗、測量誤差過大。

在制造商規定的使用環境條件外使用產品，可能造成測量誤差過大。

3.信息危害 如說明書或標簽缺少或不正確，標記的位置不正確，不能被正確的識別，不能清楚易認。

不符合法規及標準規定的產品說明書，包括產品說明書中未對限制充分告知，未對不正確的操作、與其他設備共同使用時易產生的危害進行警告，未正確標示儲存條件、消毒方法、維護信息，未對因長期使用產生功能喪失而可能引發的危害進行警告，未對合理可預見的誤用進行警告等引發的危害。

（八）臨床評價資料 臨床試驗的開展、方案的制定以及報告的撰寫等均應符合相關法規及《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）的要求。

1.研究方法 建議采用前瞻性臨床試驗對擬申報產品進行臨床評價，以SA和MRSA鑒定和藥敏檢測臨床參考方法作為對照方法，金黃色葡萄球菌鑒定應結合形態學、凝固酶試驗和生化鑒定、質譜方法等方法，藥敏方法建議使用頭孢西丁紙片法或苯唑西林微量肉湯/瓊脂稀釋法（MIC），也可以應用相應的全自動鑒定藥敏方法，證明擬上市產品的臨床性能和預期用途。針對不同樣本類型對應的不同預期用途，分別設計臨床試驗進行研究。

2.臨床試驗病例數 臨床試驗樣本量應滿足統計學要求，可采用適當的統計學方法進行估算。本臨床試驗的主要評價指標為擬申報產品相對于臨床參考方法的靈敏度和特異性。

臨床總體樣本量應分別考慮SA和MRSA陽性和陰性樣本量的統計需求，綜合估算。SA和MRSA的臨床試驗陽性樣本例數的估算建議采用單組目標值法，考核試劑的SA鑒定和MRSA藥敏檢測靈敏度目標值建議針對不同樣本類型設置，建議鼻拭子、痰液、皮膚軟組織拭子等直接樣本的目標值不低于90%，血培養樣本目標值不低于95%。通過參數估計（含相應可信區間估計）的方法證明產品針對SA鑒定和MRSA藥敏檢測的靈敏度不低于目標值，可參考如下樣本量公式計算。

n=Z1-α/2P01-P0+Z1-βPT1-PT2PT-P02 公式中，n為樣本量；

Z1-α/2、Z1-β為標準正態分布的分數位，P0為評價指標的目標值，PT為試驗用體外診斷試劑評價指標預期值。

SA和MRSA的陰性樣本量的估算可不采用目標值法，建議根據預實驗獲得的特異度的預期值采用如下公式計算：

n=Z1-α/22P(1-P)Δ2 公式中n為樣本量，Z1-α/2為標準正態分布的分位數，P為評價指標預期值，Δ為P的允許誤差大小，一般取P的95%可信區間寬度的一半，常用的取值為0.05-0.1。

同時總體樣本確定時應考慮到培養鑒定的成功率、其他可能造成樣本脫落的情況以及可能需要納入的干擾等適當增加樣本量。如不同樣本類型適用不同預期用途，針對每一種預期用途臨床試驗總病例數均應分別滿足統計學要求。

3.臨床研究單位的選擇 應選擇不少于3家（含3家）臨床試驗機構，按照相關法規、指導原則的要求開展臨床試驗。臨床試驗機構的選擇應盡量考慮擬申報產品的特點和預期用途，綜合流行病學背景，鑒于不同地區及醫療機構中SA/MRSA流行情況的差異，應選擇不同地區的臨床試驗機構開展臨床試驗，不得選擇同一地區地域相近的醫療機構進行臨床試驗。且臨床試驗機構應具有分子生物學方法檢測的優勢，實驗操作人員應有足夠的時間熟悉檢測系統的各環節，熟悉評價方案。

4.病例選擇及樣本類型 臨床試驗病例選擇應根據產品聲稱預期用途中使用的樣本類型及適用人群進行選擇，如臨床背景內容中所述，該產品適用不同樣本類型時對應不同的臨床預期用途，采用鼻拭子樣本的試劑用于MRSA院內感染的預防和控制時，應采用醫療機構中的住院病人包括重癥監護病人、手術病人及長期護理病人等病例進行臨床研究；

皮膚及軟組織感染拭子用于結合其他實驗室檢測如微生物培養等輔助診斷MRSA/SA的皮膚和軟組織感染時，應采用臨床皮膚和軟組織感染病例進行臨床研究；

血培養測定為陽性微生物生長并顯示包含由革蘭染色法產生的革陽性球菌（GPC）的樣本用于臨床需進行血培養檢測的患者MRSA/SA感染的輔助診斷時，應采用臨床需進行血培養檢測的患者，且血培養測定為陽性微生物生長并顯示包含由革蘭染色法產生的革蘭陽性球菌的患者作為病例進行臨床研究。同時適用于上述不同樣本類型時，應分別進行相關病例的臨床研究。

申請人在建立病例納入標準時，應綜合考慮到試劑所適用的各類人群的潛在差異，如年齡、性別、病情等。

同時應關注樣本中其他病原體的存在情況、內源和外源干擾因素。

5.倫理學要求 臨床試驗必須符合赫爾辛基宣言的倫理學準則，必須獲得臨床試驗機構倫理委員會的同意。研究者應考慮臨床試驗用樣本的獲得和試驗結果對受試者的風險性，應提交倫理委員會的審查意見。

6.臨床試驗方案 臨床試驗實施前，研究人員應從流行病學、統計學、臨床醫學、檢驗醫學等多方面考慮，設計科學合理的臨床研究方案。各臨床研究機構的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床研究機構的實驗室內并由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數據收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經入選的病例再被排除出臨床研究都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應采用盲法以保證試驗結果的客觀性。各研究單位選用的參比試劑應一致，以便進行合理的統計學分析。

7.統計學分析 對臨床試驗結果的統計應選擇合適的統計方法，如檢測結果一致性分析、臨床靈敏度、特異度等。常選擇2×2表的形式總結兩種方法的定性檢測結果。在臨床研究方案中應明確統計檢驗假設，即評價考核試劑與參比方法是否等效的標準。靈敏度結果的95%置信區間下限應高于目標值。特異性結果與預期值差異應有明確可接受標準，如差異較大，應有合理的解釋或繼續擴大樣本量。應分別對SA和MRSA的檢測結果進行比較統計和分析。

對于不一致樣本，應在方案中明確是否需進一步復測或確認，并對不一致原因進行分析。

8.質量控制 臨床試驗開始前，建議進行臨床試驗的預試驗，以熟悉并掌握相關試驗方法的操作、儀器、技術性能等，最大限度控制試驗誤差。整個試驗過程都應處于有效的質量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可精密度精密度。

9.臨床試驗總結報告撰寫 根據《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數據和統計分析方法。建議在臨床總結報告中對以下內容進行詳述。

9.1臨床試驗總體設計及方案描述 9.1.1臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

9.1.2病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預期選擇例數及標準、盲態檢測要求等。

9.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

9.1.4統計學方法、統計軟件、評價統計結果的標準。

9.2 具體的臨床試驗情況 9.2.1臨床試驗所用體外診斷試劑及儀器的名稱、批號、機型等信息。

9.2.2對各研究單位的病例數、年齡分布情況分布情況進行綜合，建議以列表或圖示方式列出各年齡組的樣本例數。

9.2.3質量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、儀器校準、質控品運行情況。

9.2.4具體試驗過程，樣本收集、樣本保存、樣本檢測、結果處理、結果不一致樣本的確認等。

9.3統計學分析 9.3.1數據預處理、差異數據的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數據統計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改；

9.3.2結果的一致性分析 計算陽性符合率、陰性符合率、總體符合率，采用適當的統計學方法，如四格表卡方檢驗或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結果的一致性。

9.4討論和結論 對總體結果進行總結性描述并簡要分析試驗結果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結論。

9.5其他 臨床試驗中如涉及核酸序列測定方法，應在臨床研究報告中對選用的測序方法做詳細介紹，并提供以下關于測序試驗的詳細信息及資料。

9.5.1測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關信息。

9.5.2測序方法所用引物相關信息，如基因區段選擇，分子量、純度、功能性試驗等資料。

9.5.3對所選測序方法的分析性能進行合理驗證，尤其是最低檢測限的確認，建議將所選測序方法與擬申報產品的相關性能進行適當比對分析。

9.5.4測序方法應建立合理的陽性質控品和陰性質控品對臨床樣本的檢測結果進行質量控制。

9.5.5提交有代表性的樣本測序圖譜及結果分析資料。

（九）產品技術要求 申請人應當在原材料質量和生產工藝穩定的前提下，根據申請人產品研制、前期臨床評價等結果，依據國家標準、行業標準及有關文獻，按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號）的有關要求，編寫產品技術要求。

該試劑的產品性能指標應主要包括：物理性狀、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限等。性能指標應依據分析性能評估試驗結果確定，檢驗方法應明確具體操作方法和使用的樣本及參考品情況。

該產品為第三類體外診斷試劑，申請人應按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》的要求，以附錄形式明確主要原材料、生產工藝及半成品要求，附錄的編制應符合相關編寫規范的要求。

（十）產品檢驗報告 應提供該產品符合產品技術要求的，在具有相應醫療器械檢驗資質和承檢范圍的醫療器械檢驗機構進行的產品檢驗報告；

應提供連續3個生產批次樣品的檢驗合格報告。

（十一）產品說明書 說明書承載了產品預期用途、標本采集及處理、檢驗方法、檢驗結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學解釋的重要依據，因此，產品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）的要求，進口體外診斷試劑的中文說明書除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產品說明書中相關技術內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規范格式對此內容進行標注，并單獨列明文獻的相關信息。

結合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌鑒別和檢測的體外診斷試劑說明書的重點內容進行詳細說明，以指導注冊申報人員更合理地完成說明書編制。

1.【預期用途】 1.1試劑盒用于定性檢測人鼻拭子、痰液、皮膚及軟組織感染拭子、血培養測定為陽性微生物生長并顯示包含由革蘭染色法產生的革蘭陽性球菌的樣品等樣本的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌，適用樣本類型應結合實際的臨床研究完成情況進行確認。

1.2明確試劑不同樣本類型的臨床意義，如鼻拭子樣本用于醫療機構對住院病人包括重癥監護病人、手術病人及長期護理病人等MRSA院內感染的預防和控制；

皮膚及軟組織感染拭子用于結合其他實驗室檢測如微生物培養等輔助診斷MRSA/SA的皮膚和軟組織感染；

血培養測定為陽性微生物生長并顯示包含由革蘭染色法產生的革蘭陽性球菌的樣本用于臨床需進行血培養檢測的患者MRSA/SA感染的輔助診斷等。

1.3SA和MRSA流行特征介紹。

1.4簡單介紹待測目標的特征，如待測靶基因特征及與SA和MRSA的關系等。

2.【檢驗原理】 詳細說明試劑盒技術原理，即核酸分離/純化方法、原理。說明檢測的靶基因座位、序列長度等；

介紹引物及探針設計、不同樣品反應體系（管）組合、對照品（質控品）設置及熒光信號標記等。如添加了相關的防污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等），也應對其作用機理作適當介紹。

3.【主要組成成分】 詳細說明試劑盒內各組分的名稱、數量、成分、濃度等信息，如含有生物源性物質，應說明其生物學來源、活性及其他特性；

說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，應列出相關試劑的生產企業、產品名稱、貨號以及醫療器械注冊證號/備案號（如有）等詳細信息。當試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分時，應在此注明經驗證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的如上信息。

4.【儲存條件及有效期】 試劑盒的效期穩定性、開瓶穩定性、復溶穩定性、凍融次數要求等，應與相應的穩定性研究結論一致。

5.【適用儀器】 所有適用的儀器型號，提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

6.【樣本要求】? 明確適用的樣本類型。并詳細描述樣本采集及預處理要求、運輸要求、保存條件及期限等。特別是樣本采集所需設備及保存液，需特別明確供應商、貨號及注冊證號（如有）。有關描述均應建立在相關性能評價及穩定性研究的基礎上。

樣本的取材及處理方式等若有通用的技術規范或指南，則應遵循，并在此處引用。

7.【檢驗方法】 詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1試劑配制方法、注意事項。

7.2核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項。對照品（質控品）參與樣本核酸的平行提取的要求等。

7.3擴增反應前準備：各組分加樣體積、順序、相關注意事項等。

7.4 PCR各階段的溫度、時間設置、循環數設置及相關注意事項。

7.5儀器設置：特殊參數，待測基因、內標的熒光通道選擇等。

7.6質量控制：說明對照品（質控品）的檢測要求。

8.【陽性判斷值】 簡要總結陽性判斷值研究方法及結論。明確說明樣本的陽性判斷值。

9.【檢驗結果的解釋】 說明對照品、內標的正確結果要求，結合對照品（質控品）以及樣本管中靶基因和內標的檢測結果，對所有可能出現的結果組合及相應的解釋進行詳述。檢驗結果的解釋應以陽性判斷值的研究結論為依據。

10.【檢驗方法的局限性】 應至少包括如下描述：

10.1本試劑檢測結果應結合患者臨床癥狀及其他相關醫學檢查結果進行綜合分析，不得單獨作為患者管理的依據。

10.2基因檢測結果僅能覆蓋耐藥機制為相應基因（如mecA基因和或mecC）的耐藥結果，但是小部分MRSA不攜帶mecA和/或mecC基因，存在其它耐藥機制，可能出現漏檢。

10.3不合理的樣本采集、轉運及處理以及不當的實驗操作和實驗環境均有可能導致假陰性或假陽性結果。

11.【產品性能指標】 詳述分析性能評估的試驗結果并簡要描述臨床試驗的基本信息、試驗方法和結論。

12.【注意事項】 應至少包括以下內容：

12.1如該產品含有人源或動物源性物質，應給出生物安全性的警告。

12.2臨床實驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》（衛辦醫政發〔2010〕194號或現行有效版本）等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規范執行。

12.3強調產品性能僅針對聲稱的適用樣本類型及【樣本要求】項下說明的樣本采集和處理方法（包括樣本采集液等）進行了驗證，其他樣本類型或樣本采集、處理方法不能保證產品性能。

12.4強調實驗操作人員應接受過基因擴增或分子生物學方法檢測的專業培訓，具備相關的實驗操作資格，實驗室應具備合理的生物安全防備設施及防護程序。

四、編寫單位 國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心。

第二篇：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的預防與控制措施

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的預防與控制措施

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是一種流行范圍廣、致病力強、發病率和死亡率高的病原菌。人體一旦感染，特別是抵抗力降低的患者如住重癥監護室的患者、應用免疫抑制劑者、較長時間應用光譜抗菌藥物的患者和老年人，可引起敗血癥、肺炎和毒血癥等，延長患者住院時間，如治療不及時，可危及患者的生命。

一、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染的臨床表現

發熱，精神差，局部感染癥狀，而最常見的是肺部感染，其他如皮膚、泌尿道、產婦生殖道感染，重者為敗血癥。

二、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的監測和報告

1、微生物實驗室發現耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）時應按危急值報告要求向所在臨床科室、院感科報告。做到早發現、早診治、早隔離、早治療。

2、經管醫生如確診為醫院感染病例，必須在24 小時內填卡上報院感科。

三、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）預防

①合理使用抗生素。認真落實《抗菌藥物臨床應用的基本原則》和《衛生部辦公廳關于進一步加強抗菌藥物臨床應用管理的知識》要求，嚴格執行抗菌藥物臨床應用的基本原則，正確、合理的實施抗菌藥物的給藥方案，加強抗菌藥物臨床合理應用的管理，減少或者延緩耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的產生。

②早期檢出帶菌者。加強對從其他醫院轉入者及MRSA易感者的檢查，重點篩查高危人群，提高病原學監測送檢率。同時微生物室應選用準確的檢測手段，發現MRSA，及時向臨床和院感科報告，以便控制感染和隔離治療。

③加強消毒與環境保潔。醫護人員檢查病人前后要嚴格洗手消毒，應用一次性口罩、帽子、手套，醫療用品要固定，以防交叉感染。每天按要求對環境及物體表面進行清潔與消毒。

四、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的控制措施

1、微生物實驗室負責耐甲氧西林金葡菌（MRSA）的監測，一旦發現MRSA耐藥模式，立即通知患者所在臨床科室和院感科。

2、臨床科室接到檢驗科報告后，立即報告科主任、護士長，并采取相應的預防控制措施。

⑴立即將感染或定植患者隔離于單間或同種病原同室隔離。

⑵在患者病床床頭、病歷夾、病人一欄表上張貼隔離標識（藍色為接觸隔離）。⑶盡量減少與MRSA感染或定植者接觸的醫務人員數量；最好限制每班診療患者為醫生、護士各一人，所有診療盡可能由他們完成，包括標本的采集。

⑷嚴格執行手衛生，有可能接觸患者的傷口、潰爛面、黏膜、體液、引流液、分泌物、排泄物時，應當戴手套。

⑸近距離操作如吸痰、插管等戴防護鏡。可能污染工作服時穿隔離衣。⑹對于非急診用儀器（如血壓計、聽診器、體溫表、輸液架）等應盡量專用。不能專人專用的物品（如輪椅、擔架）每次使用后應進行消毒。接觸患者后的儀器設備（如拍片、心電圖）檢查完成后應進行消毒。

⑺MRSA感染或定植患者的病室，其清潔、消毒用品（抹布、拖布等）應專室專用；對患者經常接觸的物體、設施設備表面，每天清潔消毒不少于2次，被患者血液、體液污染時應當立即消毒。使用過的抹布、拖布必須消毒處理（500mg/L含氯消毒劑作用30分鐘）。

⑻加強醫療廢物管理，分類收集醫療廢物，利器放入利器盒，密閉運送。⑼嚴格執行抗菌藥物臨床使用的基本原則，切實落實抗菌藥物的分級管理等。

⑽患者在轉科、轉院之前要通知接診的科室和醫院，或開具放射、B超檢查單時，要注明多重耐藥菌感染，以便檢查科室采取防控措施。

⑾此類病人如去其他科室檢查，應有工作人員陪同并向接收方說明使用接觸傳播預防控制措施，用后器械設備需清潔消毒。

⑿盡量限制探視人員，并囑探視者嚴格執行洗手或衛生手消毒。⒀選用密閉容器運送患者標本。⒁生活物品無特殊處理。

⒂感染者或攜帶者應隔離至癥狀好轉、治愈或連續兩次標本（每次間隔>24小時）培養均陰性，方可解除隔離。并對床單位消毒。

3、攜帶MRSA的手術醫生不得進行手術，直至檢測轉為陰性。

4、院感科需及時到相關科室檢查督導耐甲氧西林金葡菌控制措施的落實情況，發現問題及時反饋、整改，保證耐甲氧西林金葡菌控制措施的有效落實。

五、參考文件

①衛生部辦公廳關于加強多重耐藥菌醫院感染控制工作的通知 衛生部（2008）30號

②多重耐藥菌醫院感染預防與控制技術指南（試行）衛生部（2011）5號 ③醫院隔離技術規范 WS/T 311-2009

第三篇：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌醫院感染防控措施

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌醫院感染防控措施

一、微生物室負責對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐萬古霉素腸球菌（VRE）的監測，一旦發現MRSA或VRE耐藥模式，立即通知相應患者所在臨床科室和醫院感染管理科。

二、臨床科室立即把該患者隔離于單間病房，進行隔離診治、護理操作，并盡可能盡量集中進行，減少與病人接觸次數。

三、在病床床頭和病歷本第一頁上夾上藍底版黃色MRSA或VRE字樣的卡片標識。

四、醫務人員手衛生、消毒隔離、保潔與環境消毒同多重耐藥菌醫院感染防控措施中的手衛生、消毒隔離、保潔與環境消毒措施。避免MRSA或VRE在科內爆發流行。

五、主管醫生應根據藥敏結果及時使用MRSA或VRE的相應最有效的抗菌藥物。

六、醫務處和藥學部要加強對抗菌藥物臨床合理應用的督導管理，提高抗菌藥物臨床應用管理質量。

七、醫院感染管理科及時到相應臨床科室督導檢查耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）或耐萬古霉素腸球菌（VRE）的控制措施的落實情況。發現問題及時發出整改通知，并及時進行效果評價。保證耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）或耐萬古霉素腸球菌（VRE）的控制措施的落實。

八、嚴格執行手衛生、環境清潔消毒、醫療廢物管理和職業防護、抗菌藥物合理使用等措施同多重耐藥菌防控措施。

第四篇：核酸擴增法檢測試劑注冊技術審查指導原則3

附件3

核酸擴增法檢測試劑注冊技術審查指導原則

一、前言

本指導原則主要針對核酸擴增類檢測試劑的主要原材料、生產工藝及反應體系、產品質量控制等環節提出指導性技術要求。

本指導原則系對核酸擴增法檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品特性確定其中的具體內容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應的科學依據。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著法規和標準的不斷完善、科學技術的不斷發展，其相關內容也將進行適時的調整。

二、適用范圍

本指導原則適用于核酸擴增法檢測試劑的注冊技術審查，其他類核酸檢測試劑可參照相關內容。

三、基本要求

（一）基本原則

1.核酸擴增類檢測試劑的生產企業應獲得《醫療器械生產許可證》。研制、生產用的各種原料、輔料等應制定其相應的質量標準，并應符合有關法規的要求。

2．試劑生產企業應具有與其技術要求相適應的人員、廠房、設施和

— 23 — 儀器設備以及適宜的生產環境，配備滿足核酸提取和擴增檢測以及操作人員防護所需的設備。建立專用實驗室，實驗室應當嚴格分區，人員和物品應當單向流動，以最大限度地防止實驗過程中樣品之間的污染和避免擴增產物的污染。生產用于病原微生物核酸檢測的生產企業應建立符合生物安全要求的設施和措施。

3.試劑生產企業應按照《體外診斷試劑生產實施細則（試行）》的要求，建立相應的質量管理體系，并應通過《體外診斷試劑生產企業質量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。

4.核酸擴增類檢測試劑的引物設計應當符合核酸檢測設計的要求，擴增體系應設定合理的內標和外標，試劑需設置抗污染的特定措施，擴增產物須進行確證研究。

5.企業使用新型原材料時，應提供與通行原材料比對研究結果及相關資料。使用未列入上述標準的化學試劑，應不低于分析純。

（二）原材料

應提供主要原材料如引物、探針、企業參考品或標準品等的選擇與來源、制備過程、質量分析和質量標準等的相關研究資料。若主要原材料為企業自己生產，其生產工藝必須相對穩定；如主要原材料來自市場（從其他單位購買），應提供的資料包括：對物料供應商審核的相關資料、購買合同、供貨方提供的質量標準、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質量檢驗資料。主要原材料（包括生產工藝）或其供應商發生變更，應依據國家相關法規的要求進行變更申請。

核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應無脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

1.脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。應為高效液相色譜（HPLC）純、PCR級，無DNase和RNase污染。—20℃保存。— 24 — 2.引物

由一定數量的dNTP構成的特定序列，通常采用脫氧核糖核酸（DNA）合成儀人工合成，合成后經聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化。

凍干粉，序列正確，合成量應達到試劑生產要求。純度應達到電泳級（PAGE）或HPLC級，不含雜帶。應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如PAGE電泳結果或HPLC分析圖譜。

應作HPLC分析和紫外光吸收分析。以紫外分光光度計測定OD260nm/OD280nm的比值在1.6—2.0之間，可視為合格引物。-20℃保存。

3.探針

是指特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，在5'-端(和/或3'-端)進行標記，如熒光素報告基團或其他發光標記物，在3'-端標記熒光素淬滅基團，并經HPLC或其他適宜方法純化。

凍干粉，純度應達到HPLC純。應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如HPLC分析圖譜；應對探針的核酸序列及標記的熒光素或化學發光物進行核實，并作HPLC分析。應以可見—紫外分光光度計進行200—800nm掃描，在260nm處應有吸收峰。另外，根據標記熒光素的不同，還應該在熒光素的激發波長處有吸收峰，如FAM熒光素在494nm、TET熒光素在521nm、TAMRA熒光素在560nm處有特異的吸收峰，雜交探針在493nm、625nm、685nm處有特異的吸收峰，檢定合格后入庫。避光、-20℃保存。

4.DNA聚合酶

如Taq DNA聚合酶。應具有DNA聚合酶活性，無核酸內切酶活性；具熱穩定性，94℃保溫1小時后仍保持50%活性。-20℃保存。

5.尿嘧啶糖基化酶（UNG）

具有尿嘧啶糖基化酶活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性，IU UNG

— 25 — 在 37℃處理3分鐘后，103拷貝以下含U模板應完全降解，不能產生擴增產物。-20℃保存。

6.逆轉錄酶

具逆轉錄酶活性，無核酸內切酶活性。—20℃保存。

（三）生產工藝

核酸擴增類檢測試劑的基本生產工藝通常包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應符合要求，原材料應混合均勻，配制過程應對電導率pH、等關鍵參數進行有效控制。

工藝研究的資料應能對反應體系涉及到的基本內容，如樣本類型、樣本用量、試劑用量、反應條件、校準方法、質控方法、臨界值的確定、穩定性和有效期，提供確切的依據。

（四）質量控制 1.半成品質量控制

（1）按批號抽取規定數量的半成品。

（2）以參考品/對照品進行半成品質量控制。如果產品具有國家標準品或參考品，應以其進行檢定。如果產品不具有國家標準品或參考品，應根據規定制備相應的企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

（3）半成品檢定內容包括：陰/陽性參考品符合率、靈敏度、特異性、精密度。檢測結果應符合質量標準的要求。

（4）半成品檢定合格后，按試劑盒組成及時進行分裝和包裝。2.成品質量控制

（1）每一批核酸擴增法檢測試劑的試生產量應滿足工藝研究、分析性能驗證、穩定性研究、臨床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求。— 26 —（2）產品完成包裝后，應根據生產量進行抽樣和生產記錄審核。（3）以參考品/對照品進行成品質量檢驗。結果應符合要求。（4）成品檢驗的內容應包括：陰/陽性參考品符合率、靈敏度、特異性、精密度、線性范圍（定量產品）和穩定性。

5．試劑批放行前，應對需要進行穩定性考核的試劑成分，在特定溫度或條件下進行穩定性試驗。穩定性試驗可采用加速破壞試驗。

四、名詞解釋

核酸擴增法檢測試劑：核酸擴增技術泛指以擴增脫氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）為手段，檢測特定核酸序列或篩查特定基因的檢測技術，如聚合酶鏈反應（PCR）、連接酶鏈反應（LCR）、轉錄依賴的擴增反應（TMA）等。核酸擴增法檢測試劑是基于核酸擴增檢測技術的體外診斷試劑，目前已經用于病原體檢測、特定疾病的早期診斷和體內物質的型別鑒定等不同領域。

五、參考文獻

1.《中國生物制品規程》（2000年版），化學工業出版社

第五篇：地中海貧血相關基因檢測試劑注冊技術審查指導原則（2020年）

附件3

地中海貧血相關基因檢測試劑

注冊技術審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對地中海貧血相關基因檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是對地中海貧血相關基因檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，也不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究和驗證資料，相關人員應在遵循法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規和標準的不斷完善以及科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、適用范圍

地中海貧血（簡稱地貧）是一種常染色體隱性遺傳病，是由于珠蛋白基因發生突變（包括點突變和缺失等），致使珠蛋白肽鏈合成減少或完全不能合成而導致的一組單基因遺傳性溶血性疾病，輕者可無臨床表現，重者以進行性溶血性貧血為主要特征。根據珠蛋白肽鏈合成受到抑制的類型，地貧分為α-，β-和γ-地貧等，臨床上最常見的是α-和β-地貧。地貧主要分布在地中海沿岸、東南亞和少數非洲地區，具有明顯的種族特性和地域分布差異。地貧是我國南方地區最常見、危害最大的遺傳病之一，尤以廣西、云南、廣東、海南、四川和貴州等省份為甚，云南、海南和廣東的地貧基因人群攜帶率可達10%以上，廣西更是達到了20%以上。

α-地貧主要是由于α-珠蛋白基因發生突變而引起。α-珠蛋白基因簇位于16p13.3，包括胎兒期和成人期表達的2個基因（α2和α1），基因的排列順序為5’-α2-α1-3’。根據單倍型的情況，可將α地貧分為3類：（1）缺失型α+地貧（-α/），缺失1個α基因；（2）缺失型α0地貧（--/），2個α基因同時缺失；（3）非缺失型α+地貧（αTα/或ααT/），1個α1或α2基因發生點突變或少數幾個堿基的缺失。中國現已發現至少19種α-珠蛋白基因大片段缺失和38種α-珠蛋白基因點突變。其中，6

種α-珠蛋白基因的突變：--SEA/、-α3.7/、-α4.2/、αWSα/（HBA2：c.369C>G）、αQSα/（HBA2：c.377

T>C）；αCSα/（HBA2：c.427T>C）占患病人群總數的98%。

α-地貧基因型和臨床分型的關系已經基本闡明。α-地貧的表型嚴重程度隨著功能性α-珠蛋白基因的減少而加重：（1）1個α-基因缺失或點突變（-α/αα或ααT/αα或αTα/αα），稱為靜止型α-地貧，通常不貧血，血液學表現為小細胞低色素；（2）2個α-基因缺失或復合-α基因點突變，或點突變，其基因型為--/αα或-α/-α或-α/ααT或αTα/-α或αTα/αTα，稱為輕型α-地貧，臨床表現為不貧血或輕度貧血，血液學檢查有小細胞低色素特征；（3）3個α-基因缺失或復合α基因點突變，基因型為--/-α或--/αTα，稱為中間型α-地貧，又稱Hb

H病，患者有輕至重度貧血。某些基因型為αTα/αTα的病例（如αCSα/αCSα、αQSα/αQSα和αCSα/αQSα）也表現為Hb

H病。通常，--/αTα的非缺失型

Hb

H病較單純缺失型Hb

H病（--/-α）的臨床表現更為嚴重，特別是基因型為--/αCSα或--/αQSα的Hb

H病患者，貧血程度較為嚴重；（4）4個α-基因缺失，其基因型為--/--，稱為重型α-地貧，又稱Hb

Bart’s胎兒水腫綜合征，此類個體一般無法存活到出生或分娩后半小時內死亡。

β-地貧是由于β-珠蛋白基因發生突變而引起，以點突變為主，少數為缺失型。β-珠蛋白基因簇位于11p15.3，包括2個成人期表達基因（β和δ），基因的排列順序為5’-δ-β-3’。根據β-珠蛋白鏈合成量的程度，可將β-地貧分為3類：（1）β0地貧，β-珠蛋白鏈完全不能合成，其所在的等位基因稱為β0地貧等位基因；（2）β+地貧，β-珠蛋白鏈合成減少，其所在的等位基因稱為β+地貧等位基因；（3）β++地貧，又稱沉默型β-地貧，β-珠蛋白鏈合成輕微減少。中國已至少報道84種β-珠蛋白基因點突變和11種β-珠蛋白基因缺失。其中，6種點突變：HBB：c.126_129delCTTT，HBB：c.52A>T，HBB：c.-78A>G，HBB：

c.79G>A，HBB：

c.316-197C>T和HBB：

c.216_217insA占了全部突變類型的90%以上。

β-地貧的臨床表型可分為4種：（1）靜止型β-地貧，基因型為β++/βN，血液學表型正常或臨界，一般只能通過分子診斷識別；（2）輕型β-地貧，基因型為β0/βN或β+/βN，臨床表現為小細胞低色素和HbA2值升高；（3）中間型β-地貧，基因型為β+/β+或β+/β0，表型變異范圍大，可從輕度貧血到中度貧血，多于幼兒期出現中度貧血；（4）重型β-地貧，基因型為β+/β0或β0/β0，通常伴有嚴重貧血，需要定期輸血才能存活。患兒出生時無癥狀，常于嬰兒期（3-12月齡）發病。如不治療，患兒多于5歲前死亡。此外，中間型的分子基礎較為復雜，顯性β-地貧突變的雜合子（βD/βN），合并α-地貧突變的β-地貧突變純合子（β0/β0），或合并α-珠蛋白三聯體的β-地貧突變雜合子（β0/βN或β+/βN），也會顯示中間型的表型。

2018年發布的《重型β-地中海貧血的診斷和治療指南》明確規定：對于重型β-地中海貧血的診斷，有條件者均應進行基因診斷，基因型為純合子或雙重雜合子為確診本病的指標。2018年發布的《兒童非輸血依賴型地中海貧血的診治和管理專家共識》也明確規定：地貧基因檢測為非輸血依賴型地貧的診斷依據之一。

另外，國家衛生健康委員會發布的相關文件要求：為減少重型地貧患兒出生，在我國地貧高發省份實施地貧防控試點項目。主要流程包括：（1）對新婚夫婦和計劃懷孕夫婦在懷孕前或孕期進行血常規初篩；（2）對夫婦一方或雙方血常規檢查結果陽性的夫婦進行血紅蛋白分析復篩；（3）對血紅蛋白分析復篩結果均為陽性的夫婦，取其抗凝靜脈全血進行相應的α+β地貧基因檢測；（4）綜合夫婦雙方病史詢問、地貧篩查和基因檢測結果，判定為高風險夫婦。對高風險夫婦進行追蹤，及時了解受檢婦女懷孕情況，指導女方在懷孕后適宜時期接受產前診斷。產前診斷的對象為胎兒，樣本類型為胎兒的絨毛、羊水和臍帶血，檢測項目為相應的地貧基因檢測。

綜上，結合該類產品臨床使用的實際情況，本指導原則的預期用途可為：用于體外定性檢測人外周靜脈全血或胎兒羊水等樣本中基因組DNA的α-和/或β-地貧相關基因，用于α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷），地貧高風險夫婦的評估，或胎兒的產前遺傳診斷等。

結合該類產品在中國注冊的實際情況以及當前的認知，本指導原則僅對“α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷）”預期用途的相關內容進行了詳細闡述。針對其他預期用途，本指導原則僅對部分內容進行了闡述，申請人應根據產品特性，對本指導原則未涉及的內容進行補充并做出相應評價。

本指導原則的技術要求是基于PCR探針法方法建立的，對于其他分子生物學檢測技術（如：PCR-反向點雜交法和gap-PCR法等），可能部分要求不完全適用或本文所述技術指標不夠全面，申請人可以根據產品特性對不適用部分進行或補充其他的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學合理性。

本指導原則適用于進行首次注冊申報和相關許可事項變更的產品。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、研究結果的總結評價以及國內外同類產品上市情況介紹等內容。其中，同類產品上市情況介紹部分應著重從方法學、檢驗原理、檢測的突變類型以及臨床意義等方面詳細說明申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區別。

綜述資料應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（原總局令第5號，以下簡稱《辦法》）和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（原總局公告2014年第44號），以下簡稱《44號公告》的要求。

（二）主要原材料的研究資料

主要原材料研究資料包括主要反應成分、對照品（質控品）及企業參考品的研究資料。

1.此類產品的主要反應成分一般包括人基因組核酸提取/純化試劑、檢測所需引物、探針、酶、dNTPs、反應緩沖液等。申請人應提交相關原材料的選擇、制備和質量標準等的研究資料。如為申請人自制，應提交詳細的工藝穩定性研究資料；如為外購，還應提交供應商篩選資料以及供應商提供的原材料質量檢定報告。

1.1

核酸提取/純化試劑（如有）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。

1.2

引物、探針

申請人應詳述引物、探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應情況。建議設計多套引物探針以供篩選，針對待測位點的特異性等進行評價，選擇最佳設計，并提交詳細的篩選研究數據。

申請人應針對選定的引物、探針原材料進行質量評價，一般包括：分子量、純度（HPLC等）、濃度、探針熒光標記基團的激發波長和發射波長，以及功能性試驗等，并依據評價結果建立合理的質量標準。

1.3酶

酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申請人應針對各種酶的活性進行驗證，提交功能性試驗資料，并確定酶的質量標準。

DNA聚合酶應具有DNA聚合酶活性，無核酸內切酶活性，具熱穩定性。UDG/UNG應具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性。

1.4脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應提交對其純度、濃度、保存穩定性等的驗證資料，以及功能性試驗資料，并確定質量標準。

2.對照品（質控品）

試劑盒的質控體系通過設置各種試劑盒對照品（質控品）來實現。陽性對照應至少包括代表性的突變位點和突變類型。陰性對照可以是含有野生型序列的核酸溶液。空白對照為不含核酸的溶液。

如該類產品所采用的方法學和檢驗原理顯示：無論檢測何種樣本（野生型、雜合突變和純合突變），其反應體系均可報出核酸序列結果，均可對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，則無需另外設置內標；否則，試劑盒應另外設置內標。

對照品可采用人基因組DNA、細胞系或質粒等。空白對照應參與樣本核酸的平行提取。申請人應提供對照品原料選擇、制備、定值過程等的詳細研究數據，并對其檢測結果做出明確的范圍要求。

3.企業參考品

企業參考品主要包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品和精密度參考品等。申請人應提交企業參考品的原料選擇、制備方法、基因序列確認及檢驗標準的詳細研究資料等。

3.1

陽性參考品：可采用臨床樣本或其核酸溶液，如采用臨床樣本，則樣本類型應與待測樣本一致。應至少包含所有檢測位點的雜合型樣本，同時盡量納入純合突變型樣本。對于某些稀有基因型，也可采用細胞系或質粒。

3.2

陰性參考品：應包括野生型臨床樣本或其核酸溶液，以及易產生交叉反應的同源序列樣本，同時應盡量包含檢測范圍外其他檢測位點的樣本等。

3.3檢測限參考品可選擇最低檢測限濃度（例如：95%檢出率水平）或接近最低檢測限濃度（例如100%檢出率水平）的臨床樣本或其核酸溶液，至少包含所有檢測位點的雜合型樣本。

3.4

精密度參考品應至少包括低濃度雜合突變型臨床樣本或其核酸溶液，應至少包括代表性的突變位點和突變類型，且在每一反應體系均有分布。

目前，該類產品已有國家參考品，對于申報產品所聲稱的檢測位點，企業參考品的要求應不低于國家參考品。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料

主要生產工藝研究資料包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTPs濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標記（如有）等工藝過程的描述及確定依據。生產過程應對關鍵參數進行有效控制，可采用流程圖方式描述生產工藝，標明關鍵工藝質控步驟，并詳細說明該步驟的質控方法及質控標準。

反應體系研究指反應條件的選擇確定過程，包括樣本采集、預處理（如有）、樣本用量、試劑用量、核酸提取純化步驟、PCR反應條件、閾值循環數（Ct值）等的確定。

不同適用機型的反應條件如有差異應分別提交。

（四）分析性能評估資料

申請人應針對下述各項分析性能提交詳細的評估資料，包括試驗地點、適用儀器、試劑規格、批號、試驗方法、試驗樣本（類型、來源、數量、處理方法、基因型和濃度確認等）、可接受標準、統計方法、試驗數據及結論等。分析性能評估的實驗方法可以參考國內外有關體外診斷產品性能評估的指導原則。

每項性能評估應盡量采用與適用樣本類型一致的臨床樣本，對于某些稀有基因型，也可采用細胞系等。

1.核酸提取/純化性能（如有）

在進行靶核酸檢測前，應有適當的核酸提取/純化步驟。該步驟應最大量分離和純化目的核酸并盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有核酸提取/純化組分，申請人都應對配套使用的核酸提取/純化方法的提取效率和提取核酸純度、濃度等做充分的驗證，并評價該方法能否滿足該類產品的要求。

2.檢測準確性

建議采用若干份臨床樣本驗證該類產品的檢測準確性，樣本類型與說明書聲稱的樣本類型一致。樣本應涵蓋野生型、所有檢測位點的雜合突變型，同時盡量納入純合突變型。對于某些稀有基因型，也可采用細胞系或質粒。

3.最低檢測限

該類產品的最低檢測限可定義為：在滿足一定的檢測準確性和精密度的條件下，能夠檢出目標序列的最低人基因組DNA的濃度。可采用梯度濃度的人基因組DNA樣本進行多次重復檢測，確定適當檢出率水平（如：95%）下的最低人基因組DNA濃度。檢測限評價建議采用臨床樣本或細胞系，并至少包含所有檢測位點的雜合突變型。應明確臨床樣本或細胞系與人基因組DNA濃度的對應關系。

4.分析特異性

4.1

應針對同源序列或檢測范圍外基因和位點進行交叉反應驗證，說明交叉反應樣本的制備方法、核酸序列確認方法，提交詳細的驗證資料。

4.2

應針對可能的內源和外源性干擾物進行干擾試驗研究。內源干擾物主要涉及血脂、膽紅素、血紅蛋白和白蛋白、母體細胞的干擾等，外源干擾物主要包括血液樣本采集可能用到的抗凝劑和常用藥物等。

干擾試驗可通過在臨床樣本中人工添加干擾物質的方式，評價干擾物質對目標序列檢測的影響，也可直接采集暴露于干擾因素后的受試者樣本，進行干擾試驗評價。建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價；如有干擾，應確定不產生干擾的最高濃度。

5.精密度

精密度評價應采用臨床樣本進行試驗，試驗操作完全按照說明書執行，包含核酸提取/純化等步驟（如有）。應對每一反應體系進行精密度評價，并至少覆蓋代表性的突變位點和突變類型。

精密度評價需滿足如下要求：

5.1對可能影響檢測精密度的主要因素進行驗證，除檢測試劑本身外，還包括分析儀器、操作者、地點、時間、檢測輪次和試劑批次等。

5.2設定合理的精密度評價周期，對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間重復性進行評價。

5.3用于精密度評價的臨床樣本至少設置低濃度和中/高濃度水平。

5.4精密度指標可設置為CV等（如有），申請人應對精密度指標評價標準做出合理要求。

（五）陽性判斷值確定資料

建議納入一定數量的臨床樣本，應包括所有檢測位點的各種基因型（野生型、雜合突變型，同時盡量納入純合突變型），采用受試者工作特征（ROC）曲線或其他合理方法確定陽性判斷值。

如試劑判讀存在灰區，應解釋說明灰區范圍的確定方法。

對于某些檢測方法學，陽性判斷值研究可能不適用，申請人應說明理由。

（六）穩定性研究資料

穩定性研究資料主要包括申報產品的穩定性研究和適用樣本的穩定性研究兩部分。前者主要包括申報產品的實時穩定性、開瓶/復溶穩定性、運輸穩定性及凍融次數限制的研究等；后者則是指適用樣本的保存條件和保存時間等的研究。

實時穩定性研究應采用至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后，選取多個時間點進行產品性能評價，從而確定產品保存條件和有效期。

如核酸提取液可保存，還需對核酸提取液的保存條件和保存時間進行研究。

（七）臨床試驗

應滿足《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（原國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）的要求，如相關法規、文件有更新，臨床試驗應符合更新后的要求。下面僅說明該類產品臨床試驗中應關注的重點問題。

1．針對“α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷）”預期用途

1.1

臨床試驗機構及人員

申請人應根據產品特點及預期用途，綜合不同地區人種和流行病學背景等因素，選擇不少于3家（含3家）符合法規要求的臨床試驗機構開展臨床試驗。

1.2

臨床試驗適用人群和臨床樣本

具有地貧癥狀和/或體征，或血液學表現為小細胞低色素的疑似地貧患者和攜帶者；需與地貧進行鑒別診斷的其他疾病患者，如：缺鐵性貧血、鐵粒細胞性貧血或先天性紅細胞生成異常性貧血等。

臨床試驗所用樣本應為抗凝外周血樣本（基因組DNA非臨床樣本）。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應分別滿足申報產品說明書、對比試劑說明書（如適用）及第三方試劑說明書（如適用）的相關要求。

1.3臨床試驗方法

1.3.1已有同類產品上市的申報產品

對于已批準的α-地貧突變和β-地貧突變，原則上選擇已上市同類產品作為對比試劑，評價申報產品的臨床檢測性能。

1.3.2無同類產品上市的申報產品

1.3.2.1

如新突變位點的臨床意義已獲行業認可（如：國內相關指南或專家共識），且上述認可基于充分的中國人群的臨床數據，則臨床試驗可選擇Sanger基因測序（針對新的點突變）或臨床普遍使用的其他公認方法（針對其他類型的新突變位點，如缺失）作為對比方法，評價新突變位點的臨床檢測性能。除此之外，還應提交新位點臨床意義已獲行業認可的相關證據，該部分資料可不納入臨床方案和報告。

1.3.2.2

如新突變位點的臨床意義未獲行業認可，則臨床試驗應包括兩個目的，新突變位點的臨床檢測性能評價和臨床意義評價。新突變位點的臨床檢測性能評價可參考1.3.2.1；新突變位點的臨床意義評價應提交基于中國人群的充分的臨床證據，證明基因型與表型的關系，如：隨訪或其他可證明基因型與表型關系的臨床驗證資料。

1.4最低樣本量和陽性例數

臨床試驗樣本量應采用適當的統計學方法進行估算，并詳細描述所使用統計方法及各參數的確定依據。

1.4.1

臨床檢測性能評價的樣本量估算

臨床檢測性能評價的樣本量估算可分為以下幾種情況。

對于常見突變位點，建議采用單組目標值法分別估算每個突變位點臨床試驗的最低樣本量，通過陽性符合率計算所需陽性樣本的例數，通過陰性符合率計算所需陰性樣本的例數，同時考慮脫落情況，估算最低樣本總量。陽性符合率和陰性符合率的目標值（臨床可接受的最低標準）建議均不低于95%。

對于罕見突變位點，陰性樣本的例數可根據上述方法進行估算，陽性樣本則應保證一定的例數。

對于極其罕見的、且有確切臨床證據證明其臨床意義的突變位點，陰性樣本的例數可根據上述方法進行估算，陽性樣本的例數則應結合臨床證據確定。

1.4.2

新位點臨床意義評價的樣本量估算

新位點臨床意義評價的樣本量估算，建議采用抽樣調查公式或其他合理方法進行估算。

2.針對“地貧高風險夫婦的評估”和“胎兒的產前遺傳診斷”預期用途

針對上述兩個預期用途，本指導原則僅對部分內容進行了闡述，申請人應根據產品特性，充分考慮本指導原則未涉及的內容，設計科學合理的臨床試驗并進行評價。

2.1臨床試驗機構和人員

如申報產品的預期用途為胎兒的產前遺傳診斷，除滿足法規要求外，臨床試驗機構還應取得產前診斷技術服務資質。臨床試驗人員應為經過專門培訓的取得資質的人員。機構和人員應遵循《產前診斷技術管理辦法》《母嬰保健專項技術服務許可及人員資格管理辦法》，機構應取得《母嬰保健技術服務執業許可證》，人員應取得《母嬰保健技術考核合格證書》。

2.2

臨床試驗適用人群和臨床樣本

如預期用途為地貧高風險夫婦的評估，則適用人群為：地貧表型篩查陽性的育齡人群。地貧表型篩查陽性的育齡人群可根據國家衛生健康委員會和地貧高發地區相關政策確定。

如預期用途為胎兒的產前遺傳診斷，則適用人群為：地貧高風險夫婦的胎兒。地貧高風險夫婦的確定可參考國家衛生健康委員會等相關文件。

臨床試驗所用樣本應為胎兒羊水等臨床樣本（基因組DNA非臨床樣本）。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應符合國家衛生健康委員會等相關文件的要求，并滿足產品說明書的要求。

2.3

最低樣本量和陽性例數

針對每種不同的預期用途，應分別采用合理方法估算最低樣本量。同一預期用途的不同樣本類型（羊水和臍帶血等），也應分別采用合理方法估算最低樣本量。

3.如有其他預期用途，也應設計科學的臨床試驗，提供充分的證據，證明其預期用途。

4.不同預期用途的通用要求

4.1

臨床試驗方法、數據及統計分析

4.1.1應在臨床試驗方案或報告中明確申報產品、對比試劑和第三方試劑的試驗方法。

4.1.2臨床試驗病例總結表應以列表方式表示，包括申報產品的結果、對比試劑的結果、第三方試劑的檢測結果（如有）、臨床診斷、年齡和性別等。

4.1.3以交叉表分別總結兩種試劑的定性檢測結果，選擇合適的統計方法進行統計分析，以驗證兩種試劑檢測結果的一致性。

4.1.4

結果差異樣本的驗證

在數據收集過程中，對于兩種試劑檢測結果不一致的樣本，采用合理方法進行復核，并對差異原因進行分析。如無需復核，應說明理由。

4.2

臨床試驗方案

各臨床試驗機構的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床試驗機構的實驗室內并由該實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程。

試驗方案應確定嚴格的入選/排除標準，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程和結果判定時，應采用盲法以保證試驗結果的客觀性。各臨床試驗機構選用的對比試劑/方法應保持一致，以便進行合理的統計學分析。另外，申報產品的樣本類型不應超越對比試劑/方法對樣本類型的要求。

4.3臨床試驗報告

應對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的數據和統計分析方法。

（八）產品技術要求

產品技術要求應符合《辦法》、《44號公告》和《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》（原國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號）的相關要求。該類產品作為三類體外診斷試劑，應將主要原材料、生產工藝及半成品要求等內容作為附錄附于技術要求正文后。

目前，該類產品已有行業標準，產品技術要求的相關要求應不低于行業標準的要求。

（九）產品檢驗報告

根據《辦法》的要求，第三類體外診斷試劑申請注冊時應提交連續三個生產批次樣品的檢驗報告。目前，該產品已有國家參考品，產品檢驗應滿足國家參考品的要求。

（十）產品說明書

產品說明書應滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（原國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）的要求，產品說明書的所有內容均應與申請人提交的注冊申報資料的相關研究結果保持一致。下面對該類產品說明書的重點內容進行闡述。

1.【預期用途】應至少包括以下幾部分內容：

1.1本產品用于定性檢測人xx樣本基因組DNA中的α-和/或β-地貧xx突變，用于：α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷），地貧高風險夫婦的評估，或胎兒的產前遺傳診斷。

1.2介紹地貧相關的臨床背景信息及實驗室診斷方法等，介紹被測靶標（突變位點）的相關情況。

2.【主要組成成分】

2.1說明試劑盒包含組分的名稱或數量等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，企業應列出相關試劑/耗材的名稱及其他相關信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組分，則應在此注明經過驗證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產企業、產品名稱以和醫療器械備案號（如有）等詳細信息。

3.【檢驗原理】

3.1對試劑盒的被測靶標進行詳細描述（基因位置、突變位點及相關特征等），對試劑盒所用探針、引物或突變的判定等進行詳細介紹；對不同樣本反應管組合、對照品設置及熒光信號檢測原理等進行介紹。

3.2試劑盒技術原理的詳細介紹，建議結合適當圖示進行說明。如反應體系中添加了相關的防污染組分（如UNG酶），也應對其作用機理進行適當介紹。

4.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩定性等，應明確具體的儲存條件及有效期等信息。

5.【樣本要求】

樣本的采集、處理、運送和保存：明確樣本采集、核酸提取純化前的處理（如離心和洗滌等）、保存條件及期限以及運送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需要恢復至室溫，凍融次數的限制等。

6.【適用儀器】

所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

7.【檢驗方法】

詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1實驗條件：實驗室分區、實驗環境的溫度、濕度和空調氣流方向控制等注意事項。

7.2試劑配制方法和注意事項。

7.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項（如適用），對核酸提取純化環節進行合理質控，明確提取核酸的濃度純度等質量要求。

7.4擴增反應前準備：加樣體積、順序等。

7.5

PCR各階段的溫度、時間設置、循環數設置或相應的自動化檢測程序及相關注意事項。

7.6儀器設置（如適用）：特殊參數、探針的熒光素標記情況、對待測樣本及其他對照品的熒光通道選擇等。

8.【檢驗結果的解釋】

結合對照品、樣本管檢測結果以及檢測類型，以列表形式詳述所有可能出現的結果及相應的解釋。如存在檢測灰區，應詳述對于灰區結果的處理方式。

9.【檢驗方法的局限性】

9.1申報產品僅對下述檢測類型xx進行了驗證。

9.2有關假陰性結果的可能性分析

9.2.1不合理的樣本采集、運送及處理或核酸過度降解均有可能導致假陰性結果。

9.2.2未經驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導致假陰性結果（如有）。

10.【產品性能指標】簡述以下性能指標：

10.1最低檢測限：簡單介紹最低檢測限的確定方法，并明確最低檢測限結果。

10.2陽性/陰性參考品符合率。

10.3精密度：簡單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結果。

10.4分析特異性

10.4.1交叉反應驗證：同源性序列等交叉反應驗證。

10.4.2干擾物質驗證：樣本中常見干擾物質對檢測結果的影響。

10.5對比試驗研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統計學方法及統計分析結果。

11.【注意事項】應至少包括以下內容：

11.1如該產品含有人源或動物源性物質，應給出具有潛在感染性的警告。

11.2臨床實驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》現行有效版本等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規范執行。

三、起草單位

國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心。