第一篇：促卵泡生成素檢測試劑注冊技術審查指導原則

附件2 促卵泡生成素檢測試劑注冊技術審查 指導原則 本指導原則旨在指導注冊申請人對促卵泡生成素檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是對促卵泡生成素檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是供申請人和審查人員使用的指導文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規強制執行，如有能夠滿足法規要求的其他方法，也可以采用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規、標準體系的不斷完善和科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、適用范圍 促卵泡生成素檢測試劑用于體外定量檢測人血清、血漿、全血或其他體液樣本中促卵泡生成素（Follicle-stimulating hormone，FSH）的含量。本指導原則適用于以酶標記、（電）化學發光標記、（時間分辨）熒光標記等標記方法為捕獲抗體，以微孔板、管、磁顆粒、微珠和塑料珠等為載體包被抗體，定量檢測FSH的免疫分析試劑，不適用于以膠體金標記的FSH定量檢測試紙條、用放射性同位素標記的各類放射免疫或免疫放射檢測試劑。根據《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第5號）和《食品藥品監管總局關于印發體外診斷試劑分類子目錄的通知》（食藥監械管〔2013〕242號），促卵泡生成素檢測試劑應按照第二類醫療器械管理，分類代號為6840。

二、注冊申報資料要求 （一）綜述資料 促卵泡生成素是由垂體前葉嗜堿性細胞合成和分泌的一種糖蛋白類促性腺激素，可通過血液循環進入血液和尿液。像其它糖蛋白如促黃體生成素（LH）、促甲狀腺激素（TSH）和人絨毛膜促性腺激素（HCG）一樣，FSH由兩個以非共價鍵結合的亞單位α和β亞基組成，分子量為24 000～35 000，α-亞單位與LH、TSH和HCG結構相似，為垂體前葉激素所共有，β-亞單位是FSH所特異的，因此，這些激素的生物學和免疫學特性的區別取決于其獨特的β亞基。對于男性，其功能是促進睪丸曲細精管的成熟和精子的生成。對于女性，則可促進卵泡發育和成熟，促進顆粒細胞增殖，引起卵泡液分泌，并與LH協同調節和促使發育成熟的卵泡分泌雌激素和排卵，參與正常月經的形成。

FSH的增高多見于原發性睪丸衰竭、睪丸精原細胞瘤、先天性睪丸發育不全、先天性卵巢發育不全、原發性閉經、原發性性腺功能低下、更年期綜合征；

其降低常見于席漢綜合征及長期服用性激素等。

綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、產品主要研究結果的總結和評價以及同類產品上市情況介紹等內容，其中同類產品上市情況介紹部分應著重從方法學、檢出限、線性范圍、準確度、參考區間及臨床適用范圍等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區別。綜述資料作為注冊申報資料的重要組分之一，其內容應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第5號）和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（國家食品藥品監督管理總局公告2014年第44號）的相關要求。

（二）主要原材料研究資料（如需提供）應提供主要原材料如抗體、標記物、固相載體、校準品、質控品（如適用）等的選擇、制備及其質量標準等的研究資料。主要原材料的研究資料具體要求如下：

1.抗體的選擇及質量標準 明確抗體的來源，如為單克隆抗體應明確細胞株、克隆號等內容。提供抗體靈敏度、特異性、純度、效價等基本性能的驗證資料。

抗體如為自行生產，提供抗體的詳細生產及鑒定過程。

2.校準品（如適用）和質控品（如適用）的原料選擇、制備、定值過程及試驗資料。

3.申請人應根據 GB/T 21415-2008/ISO 17511:2003《體外診斷醫療器械生物樣品中量的測量 校準品和控制物質賦值的計量學溯源性》提供所用校準品的來源、明確校準品的質量標準、賦值過程和相應指標以及不確定度等內容，并提供校準品的溯源性文件（如適用）。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料（如需要提供）應包括以下內容（以下內容可根據具體的方法學特點進行編寫）：

1.主要生產工藝介紹，可以流程圖方式表示，并標明關鍵工藝質控步驟，簡要說明主要生產工藝的確定依據。

2.產品反應原理介紹。

3.抗體包被工藝研究：申請人應考慮如包被抗體濃度、包被緩沖液、表面活性劑等種類及添加量（如適用）、包被時間、干燥溫度及時間（如適用）等工藝參數對產品性能的影響，通過試驗確定上述指標的最佳組合。

4.抗體標記工藝研究：申請人應考慮標記抗體的濃度、標記比例等內容。

5.反應條件確定：申請人應考慮反應模式、反應時間、反應溫度、洗滌次數（如適用）等條件對產品性能的影響，通過試驗確定上述條件的最佳組合。

6.不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述。

7.體系中樣本及試劑的加樣方式及添加量確定：申請人應考慮樣本加樣方式、加樣量以及試劑添加順序、添加量對產品檢測結果的影響，通過實驗確定最佳的樣本及試劑的添加方式和添加量。如樣本需采取稀釋或其他必要的方法進行處理后方可用于最終檢測，申請人還應對可用于樣本稀釋的基質或處理方法進行研究，通過試驗確定樣本稀釋基質或處理方法。確定反應所需其他試劑用量（標準品、標記物、底物等）的研究資料。

8.固相載體、信號放大系統、顯色（發光）系統、酶作用底物等的介紹及研究資料。

（四）分析性能評估資料 申請人應提交在產品研制或成品驗證階段對試劑進行的所有性能驗證的研究資料，對于每項分析性能的評價都應包括具體研究方法、可接受標準、試驗數據、統計分析等詳細資料。有關分析性能驗證的背景信息也應在申報資料中有所體現，包括實驗地點、適用儀器、試劑規格、批號、臨床樣本來源等。建議選擇不少于3批產品對以下分析性能進行研究，性能評估時最好將試劑和所選用的校準品、質控品作為一個整體進行評價，評估整個系統的性能是否符合要求。具體研究方法建議參照國內外有關體外診斷產品性能評估的文件進行。

性能評估應至少包括檢出限、準確度、特異性、線性、精密度等。

對于本試劑，建議著重對以下分析性能進行研究：

1.檢出限 生產企業應提供促卵泡生成素試劑的空白限、檢出限及參考區間等相關信息，根據生產企業提供信息，對5份濃度近似LOD的低值樣本進行檢測，每份樣本檢測5次，對檢測結果按照大小進行排序，符合如下條件，即可認為生產企業提供的空白限和檢出限的設置基本合理：

1.1低于生產企業提供的空白限數值的檢測結果的數量應小于或等于3個；

1.2無高于生產企業提供的參考區間下限的檢測結果的數值。

2.準確度 對測量準確度的評價依次包括：與國家標準品（和/或國際標準品）的相對偏差、方法學比對、回收試驗等方法，申請人可根據實際情況選擇以下方法的一項或幾項進行研究。

準確度可選擇如下試驗方法之一：

2.1將促卵泡生成素國家（或國際）標準品配制成試劑盒線性范圍內高、低濃度的準確度樣品（至少2個）進行檢測，每個樣品測試3次，根據公式（1）計算相對偏差。如果3次結果都符合規定，即判為合格；

如果大于等于2次的結果不符合，即判為不合格；

如果有1次結果不符合規定，則應重新連續測試20次，分別計算相對偏差，如果大于等于19次測試的結果符合規定，即判為合格；

……………….........……（1）式中：

B —相對偏差；

Xi—樣本的實測濃度均值；

T —樣本的靶值。

2.2方法學比對 采用參考方法或國內/國際普遍認為質量較好的已上市同類試劑作為比對方法，與擬申報試劑同時檢測一批臨床樣品（至少40例樣本），從測定結果間的差異了解擬申報試劑與參比方法間的偏倚。

用線性回歸方法對兩組結果進行線性擬合，得到線性回歸方程的相關系數（r）和斜率。計算各個樣本的待測試劑（盒）測定值與對照系統測定值的絕對偏差或相對偏差。

在實施方法學比對前，應分別對擬申報試劑和比對試劑進行初步評估，只有在確認兩者都分別符合各自相關的質量標準后方可進行方法學比對。方法學比對時應注意質量控制、樣本類型、濃度分布范圍并對結果進行合理的統計學分析。

2.3將已知濃度的促卵泡生成素樣本（A）加入到正常人血清或其他等效基質（B）中，所加入促卵泡生成素樣本與正常人血清B之間的體積比例為1:9，根據公式（2）計算結果應符合要求。

…………………（2）式中：

R--回收率；

V--加入A樣本的體積；

V0--血清樣品B的體積；

C--血清樣品加入A樣本后的檢測濃度；

C0--血清樣品B的檢測濃度；

Cs—A樣本的濃度。

回收試驗應注意在保證總濃度在方法分析測量范圍內，盡量使加入已知濃度的促卵泡生成素樣本（A）后樣本中的被測物濃度接近醫學決定水平；

3.線性范圍 建立試劑線性范圍所用的樣本基質應與臨床實驗樣本相似，但不可采用含有對測定方法具有明確干擾作用物質的樣本。理想的樣本為分析物濃度接近預期測定上限的人血清（或其他等效基質），且應充分考慮多倍稀釋對樣本基質的影響。建立一種定量測定方法的線性范圍時，需在預期測定范圍內選擇7～11個濃度水平。例如，將預期測定范圍加寬至130%，在此范圍內選擇更多的濃度水平，然后依據實驗結果逐漸減少數據點直至表現出線性關系，可發現最寬的線性范圍。驗證線性范圍時可選擇5～7個濃度水平。所選用的濃度水平應可覆蓋整個預期測定范圍并包括與臨床有關的重要評價濃度，如最小測定濃度或線性范圍的最低限、不同的醫學決定水平、最大測定濃度或線性范圍的高限等。

4.精密度 對測量精密度的評估至少應包括2個濃度水平的質控品，建議質控品采用人源樣本或與人源樣本基質接近的樣本進行試驗，質控品濃度都應在試劑的測量范圍內，包括具有臨床代表意義的低濃度值和高濃度值。

一般包括批內精密度、批間精密度的評價。

4.1批內精密度：在試劑的劑量-反應曲線范圍內，設置2～3個不同濃度的質控品，用同一批號試劑，對不同濃度的質控品分別重復測定10次，計算測定結果的平均值（）和標準差（s），根據公式（3）得出變異系數（CV）。

CV=s/×100% ……………………（3）4.2批間精密度：在3個不同批次試劑之間，在試劑的劑量-反應曲線范圍內，設置2～3個不同濃度的質控品，對不同濃度的質控品分別重復測定10次，計算30次測定結果的平均值（）和標準差（s），根據公式（3）得出變異系數（CV）。

5.分析特異性 5.1交叉反應:易產生交叉反應的其他抗原、抗體等的驗證情況，應至少包括促黃體生成素樣本（LH）、促甲狀腺素樣本（TSH）、人絨毛膜促性腺激素樣本（HCG），交叉反應驗證物質的濃度應涵蓋人體生理及病理狀態下及臨床治療過程中可能出現的最高濃度值。

5.2干擾物質 5.2.1 內源性干擾物樣本中常見干擾物質對檢測結果的影響，如甘油三酯、膽紅素、血紅蛋白、類風濕因子（RF）及其干擾物質的研究。干擾物濃度的分布應覆蓋人體生理及病理狀態下可能出現的物質濃度。

5.2.2樣本添加劑的干擾 如果試劑（盒）適用樣本類型包括血漿（或全血）樣本，應采用各種適用抗凝劑抗凝的血漿（或全血）樣本分別與血清樣本進行對比實驗研究。方法為對比線性范圍內的同一病人的血清和血漿（或全血）樣本，以驗證申報試劑對于血清和血漿（或全血）樣本檢測結果的一致性。

5.2.3試劑組成成分的干擾（如適用）應考慮防腐劑對檢測結果的干擾，如氟化鈉、碘乙酸、鹽酸等。

6.HOOK效應（如適用）目前，促卵泡生成素檢測試劑大多采用夾心法的原理檢測樣本，考慮到方法學的缺陷，有必要對鉤狀（HOOK）效應進行考慮。建議采用高濃度的促卵泡生成素樣本進行梯度稀釋后由低濃度至高濃度開始檢測，每個梯度的抗原樣本重復3—5份，將響應值隨濃度升高反而變小時的濃度作為出現鉤狀效應時促卵泡生成素抗原的最低濃度，建議產品說明書上明示出現鉤狀效應時促卵泡生成素的最低濃度，或濃度達到一定數值時未發生鉤狀效應。

7.校準品和質控品的性能指標（如適用）參照GB/T 21415-2008《體外診斷醫療器械生物樣品中量的測量校準品和控制物質賦值的計量學溯源性》的要求，提供企業工作校準品及試劑盒配套校準品的來源、賦值過程以及測量不確定度相關資料，提供質控品賦值及其質控范圍確定的相關資料。同時，應對校準品、質控品的瓶內均勻性、瓶間均勻性（凍干品適用），以及其賦值結果的準確度進行評價。如校準品或質控品的基質不同于臨床常用樣本類型，還應提交基質效應的相關研究資料。凍干型校準品和質控品還應檢測批內瓶間差。

性能指標的評價方法并無統一的標準可依，可根據不同的試劑特征進行，前提是必須保證研究的科學合理性。

8.其它需注意問題 8.1對于適用多個機型的產品，應提供在所有適用型號儀器上進行的性能驗證資料。

8.2若產品涉及不同包裝規格且不同包裝規格間存在性能差異，則需要提供每個包裝規格在不同型號儀器上的評估資料；

如已驗證不同包裝規格之間不存在性能上的差異，需要提交包裝規格間不存在性能差異的說明。

8.3不具有可比性的樣本類型（血液、尿液）應分別進行分析性能評估。對于血漿樣本和全血樣本，確認最適的抗凝劑種類或明顯干擾檢測結果的抗凝劑，并在說明書樣本要求中明確。

（五）參考區間確定資料 應提交參考區間建立或驗證時所采用樣本來源及詳細的試驗資料。應明確參考人群的篩選標準，應對性別及女性卵泡期、排卵期、黃體期、絕經期進行分組研究，例數應符合統計學要求，女性樣本入組時生理周期的確定依據應科學合理。建議參考國際或國內有關體外診斷產品參考區間確定的文件。

（六）穩定性研究資料 穩定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩定性和適用樣本的穩定性研究。

前者主要包括長期穩定性、運輸穩定性、開瓶穩定性等研究，如組分為凍干粉，應有復溶穩定性研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對于實時穩定性研究，應提供至少3批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。如產品包含校準品和質控品，應提供相應穩定性試驗研究資料。

后者主要包括冷藏和冷凍條件下的有效性驗證，可以在合理的溫度范圍內選擇溫度點（溫度范圍），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行穩定性驗證，從而確認不同類型樣本的保存穩定性。適于冷凍保存的樣本還應對凍融次數進行評價。

試劑穩定性和樣本穩定性兩部分內容的研究結果均應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（七）臨床評價資料 根據《關于公布新修訂免于進行臨床試驗醫療器械目錄的通告》（國家藥品監督管理局通告2018年第94號），促卵泡生成素檢測試劑可免于進行臨床試驗，申請人可依照《免于進行臨床試驗的體外診斷試劑臨床評價資料基本要求（試行）》開展評價。申請人如無法或不適于按照上述要求對產品進行臨床評價，則應按照《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的要求開展臨床試驗。下面僅對臨床試驗中的基本問題進行闡述。

對于進行臨床試驗的產品，臨床試驗總體要求及臨床試驗資料的內容應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》、《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（國家食品藥品監督管理總局公告2014年第44號）和《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）臨床研究資料有關的規定。

以下僅根據促卵泡生成素檢測試劑的特點對其臨床試驗中應重點關注的內容進行闡述。

1.臨床試驗研究方法 選擇境內已批準上市、臨床普遍認為質量較好的同類產品作為參比試劑，采用擬申報產品（以下稱考核試劑）與之進行同步盲法對比試驗，證明本品與已上市產品等效或優于已上市產品。建議企業盡量選擇方法學、溯源性、參考區間、線性范圍等相同的同類試劑作為對比試劑。如方法學不同，則應首選方法學性能較高的對比試劑進行臨床試驗。

2.臨床試驗機構的選擇 2.1第二類產品申請人應當選定不少于2家（含2家）有資質的臨床試驗機構開展臨床試驗。

2.2臨床試驗機構應有能力提供臨床試驗所需的各類樣本，實驗操作人員有足夠的時間熟悉檢測系統的各環節（儀器、試劑、質控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個實驗中，考核試劑和對比試劑都應處于有效的質量控制下，定期對儀器進行校準，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。

3.臨床試驗方案 臨床試驗實施前，研究人員應從流行病學、統計學、臨床醫學、檢驗醫學等多方面考慮，設計科學合理的臨床研究方案。各臨床試驗機構的方案設置應一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床試驗機構的實驗室內并由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數據收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經入選的病例再被排除出臨床研究都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應采用盲法及樣本隨機分配以保證試驗結果的客觀性。試驗方案中還應明確兩種試劑檢測結果不一致的判定依據，以及結果不一致樣本復核的方法。各臨床試驗機構選用的對比試劑應一致，對比試劑的適用機型應評估一致性后選用，以便進行合理的統計學分析。另外，考核試劑的樣本類型不應超越對比試劑對樣本類型的檢測要求，如果選擇了對比試劑適用樣本類型以外的樣本，則應進行不同樣本類型之間的臨床對比驗證試驗。

4.研究對象選擇 4.1對于不具有可比性的樣本類型，每種樣本類型臨床試驗的總樣本數至少為200例。對于聲稱同時適用于血清、血漿、全血樣本，且樣本類型不超出對比試劑對樣本類型的檢測要求，除完成一個樣本類型不少于200例的臨床研究外，還應進行兩兩樣本類型相關性研究以確認其檢測結果是否完全一致或存在某種相關性（如系數關系），其例數應符合統計學要求。建議參考《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》中增加樣本類型的變更要求。

4.2應考慮樣本量的分布，各臨床試驗機構樣本量和樣本分布應相對均衡。

4.3樣本濃度應覆蓋考核試劑檢測范圍，盡可能均勻分布。盡可能使不少于30%樣本的測定值處于參考區間以外，但在檢測范圍內。

4.4應明確臨床樣本的采集要求。

4.4.1應明確抗凝劑的要求（如適用），對檢測結果有明顯干擾作用的樣本，如高脂、溶血、黃疸的樣本盡量避免使用。建議在臨床試驗中選擇部分易產生交叉反應的樣本，如早孕、甲減等相關疾病的樣本，以從臨床角度驗證試劑的特異性。

4.4.2試驗中，盡可能使用新鮮樣本，避免貯存。如無法避免使用貯存樣品時，注明貯存條件及時間，在數據分析時應考慮其影響。另外需要關注對比試劑說明書中對樣本的相關要求，臨床試驗用的樣本需同時滿足考核試劑和對比試劑的相關要求。

5.倫理學要求 臨床試驗必須符合赫爾辛基宣言的倫理學準則，必須獲得臨床試驗機構倫理委員會的同意。研究者應考慮臨床試驗用樣本的獲得和試驗結果對受試者的風險性，應提交倫理委員會的審查意見及受試者的知情同意書。對于例外情況，如客觀上不可能獲得受試者的知情同意或該臨床試驗對受試者幾乎沒有風險，可經倫理委員會審查和批準后免于受試者的知情同意。

6.統計學分析 對臨床試驗結果的統計應選擇合適的統計方法，對于比對試驗的等效性研究，最常用是對考核試劑和對比試劑兩組檢測結果的相關及回歸分析，用回歸分析驗證兩種試劑結果的相關性，以y=a+bx和R2的形式給出回歸分析的擬合方程，其中：y是考核試劑結果，x是對比試劑結果，b是方程斜率，a是y軸截距，R2是判定系數，同時應給出b的95%（或99%）置信區間，定量值結果應無明顯統計學差異。

結合臨床試驗數據的正/偏態分布情況，建議統計學負責人選擇合理的統計學方法進行分析，統計分析應可以證明兩種方法的檢測結果是否存在明顯統計學差異。

7.結果差異樣本的驗證 在數據收集過程中，對于兩種試劑的檢測結果有明顯差異的樣本，應采用“金標準”或其他合理的方法進行復核，以便對臨床試驗結果進行分析。如無需復核，應詳細說明理由。

8.臨床試驗總結報告撰寫 根據《關于發布體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則的通告》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數據和統計分析方法。

9.討論和結論 對總體結果進行總結性描述并簡要分析試驗結果，對本次臨床試驗有無特別說明，最后得出臨床試驗結論。

（八）產品風險分析資料 申請人應考慮產品生命周期的各個環節，從預期用途、可能的使用錯誤、與安全性有關的特征、已知及可預見的危害等方面的判定以及對患者風險的估計進行風險分析，應符合YY/T 0316-2016 《醫療器械風險管理對醫療器械的應用》的要求。

（九）產品技術要求 產品技術要求應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局局令第5號）和《國家食品藥品監督管理總局關于發布醫療器械產品技術要求編寫指導原則的通告》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號）的相關規定。

1.適用的產品標準 表1.產品適用的相關標準 GB/T 191-2008 《包裝儲運圖示標志》 GB/T 21415-2008 《體外診斷醫療器械 生物樣品中量的測量 校準品和控制物質賦值的計量學溯源性》 YY/T 0316-2016 《醫療器械 風險管理對醫療器械的應用》 YY/T 0466.1-2016 《醫療器械 用于醫療器械標簽、標記和提供信息的符號 第1部分：通用要求》 YY/T 1193-2011 促卵泡生成激素（FSH）定量測定試劑盒（化學發光免疫分析法）YY/T 1213-2013 促卵泡生成素定量標記免疫分析試劑盒 YY/T 1304.2-2015 時間分辨熒光免疫檢測系統 第2部分：時間分辨熒光免疫分析定量測定試劑（盒）GB/T 33411-2016 酶聯免疫分析試劑盒通則 YY/T 1183-2010 酶聯免疫吸附法檢測試劑（盒）注：以上標準如有修訂，以最新發布版本為準 2.主要性能指標 作為定量檢測試劑，應主要包括以下性能指標：外觀、檢出限、準確度、線性、精密度（批內精密度、批間精密度）、特異性、穩定性等。技術要求應不低于現行的國家/行業標準的相關要求。

（十）產品注冊檢驗報告 根據《體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式》的要求，應提供具有相應醫療器械檢驗資質和承檢范圍的醫療器械檢驗機構出具的產品注冊檢驗報告和產品技術要求預評價意見。應采用國家標準品進行注冊檢驗。如有相應的國家法規發布或更新，按其要求執行。

（十一）產品說明書 說明書承載了產品預期用途、檢驗原理、檢驗方法、檢驗結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學解釋的重要依據。因此，產品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產品說明書的格式應符合《醫療器械說明書和標簽管理規定》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第6號）、《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）的要求。產品說明書的所有內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規范格式對此內容進行標注，并單獨列明參考文獻的相關信息。

以下內容僅對促卵泡生成素檢測試劑說明書的重點內容進行詳細說明，說明書其他內容應根據《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》要求進行編寫。

產品說明書內容原則上應全部用中文進行表述；

如含有國際通用或行業內普遍認可的英文縮寫，可用括號在中文后標明；

對于確實無適當中文表述的詞語，可使用相應英文或其縮寫。

1.【產品名稱】 1.1試劑（盒）名稱由三部分組成：被測物名稱、用途、方法或原理。檢驗的方法或者原理應明確到細分的具體方法學，如：促卵泡生成素測定試劑（磁微粒化學發光法）。

2.【包裝規格】 如不同包裝規格有與之特定對應的機型，應同時明確適用機型 3.【預期用途】 3.1試劑盒用于定量檢測人×××樣本中的促卵泡生成素。其中，×××應寫明適用的樣本類型為血清、血漿全血還是尿液，上述內容均應有相應的分析性能評估資料和（或）臨床評價資料支持。

3.2與預期用途相關的臨床適應癥背景情況，說明相關的臨床或實驗室診斷方法等。

4.【檢驗原理】 應結合產品主要成分詳細說明檢驗原理、方法，必要時可采用圖示方法描述 5.【主要組成成分】 5.1說明試劑盒包含組成、數量、濃度或含量等信息。

5.2建議對所包被抗體的相關信息進行簡單介紹。

5.3對于校準品和質控品（如適用）：

5.3.1注明校準品的定值及其溯源性，溯源性資料應寫明溯源的最高級別（應包括標準物質或參考方法的發布單位及編號）。

5.3.2應明確說明質控品的生物學來源、活性及其他特性，應明確靶值范圍（如靶值范圍為批特異，可注明批特異，并附單獨的靶值單）。

5.4對于多組分試劑應明確說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換，如可互換，則需提供相應的性能驗證資料。

5.5對于產品中不包含，但對該試驗必需的試劑組分，說明書中應列出此類試劑的名稱、純度，提供稀釋或混合方法及其他相關信息。

6.【儲存條件及有效期】 6.1對試劑的實時穩定性、開瓶穩定性（如適用）、復溶穩定性（如適用）、凍融次數限制（如適用）等信息作詳細介紹。包括環境溫濕度、避光條件等。

6.2不同組分保存條件及有效期不同時，應分別說明，產品總有效期以其中效期最短的為準。

注：保存條件不應有模糊表述，如“常溫”、“室溫”。

6.3生產日期、使用期限或失效日期 7.【適用儀器】 7.1如適用儀器為通用型的酶標儀則需給出配置波長的要求。

7.2如適用儀器為非通用的儀器則需寫明具體適用儀器的型號，不能泛指某一系列儀器，并且與分析性能評估資料一致。

8.【樣本要求】重點明確以下內容：

8.1明確本產品適用的樣本類型，血液樣本應當說明對采血管及抗凝劑的要求，其他樣本應說明樣本采集、處理及保存方式。

8.2樣本采集：采集時間點是否受臨床癥狀、用藥情況等因素的影響，盡量減少由于樣本采集或處理不當對實驗造成的影響。

8.3樣本處理、運送及保存：明確樣本處理方法、樣本的保存條件及期限（短期、長期）等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否須恢復室溫，凍融次數的要求。

9.【檢驗方法】詳細說明試驗操作的各個步驟 9.1試驗環境：溫、濕度條件及樣本復溫等要求。

9.2試劑使用方法、注意事項，試劑開封后注意事項等。

9.3待測樣本的預處理方法、步驟及注意事項。

9.4明確樣本檢測的操作步驟。

9.5校準：校準品的使用方法、注意事項、校準曲線的繪制方法。對需專用儀器的產品，應注明推薦的儀器校準周期。

9.6質量控制：質控品的使用方法、對質控結果的必要解釋以及推薦的質控周期等。

9.7結果計算：對于手工/半自動儀器，說明校準曲線擬合方式及結果計算方法。

10.【參考區間】 應按照不同性別及女性生理周期，分別說明常用樣本類型的參考區間，并簡要說明參考區間的確定方法。建議注明“由于地理、人種、性別和年齡等差異，建議各實驗室建立自己的參考區間”。

11.【檢驗結果的解釋】 11.1應對所有可能出現的結果進行合理的解釋。

11.2明確有可能存在引起樣本濃度升高及降低因素，并說明在何種條件下需要進行確認試驗，以及在確認試驗時，對待測樣本可能采取的優化條件等進行詳述。

11.3如樣本濃度超出線性范圍后，若申請人聲稱樣本可可稀釋后檢測，應明確樣本最大可稀釋倍數及稀釋液種類。

12.【檢驗方法局限性】至少應包括以下內容：

12.1本試劑的檢測結果僅供參考，不能單獨作為確診或排除病例的依據，對患者的臨床管理應結合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

12.2干擾物質及鉤狀效應（如適用）對檢測結果的影響。明確干擾物對測定的影響，同時列出干擾物的具體濃度，不應使用模糊的描述方式。明示出現鉤狀效應時促卵泡生成素的最低濃度，或濃度達到一定數值時未發生鉤狀效應。

13.【產品性能指標】詳述以下性能指標：

至少應包括：檢出限、線性、準確度、精密度（批內精密度、批間精密度）、特異性。

14.【注意事項】應至少包括以下內容：

14.1如使用冰箱中冷藏保存的檢測試劑建議檢測前應從冰箱內取出，恢復至室溫再打開使用，否則會影響檢測結果。

14.2有關試驗操作、樣本保存及處理等其他注意事項。

14.3采用不同廠家及不同方法學的試劑檢測所得結果不應直接相互比較，以免造成錯誤的醫學解釋，建議實驗室在發給臨床醫生的檢測報告中注明所用試劑特征（如參考區間或方法學）。

14.4有關人源組分（如有）的警告，如：試劑內質控品或其他可能含有人源物質的組分，雖已經通過了HBsAg、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等項目的檢測，但截至目前，沒有任何一項檢測可以確保絕對安全，故仍應將這些組分作為潛在傳染源對待。提示對于潛在傳染源的處理方式。

14.5對所有樣本和反應廢棄物都視為傳染源進行處理。

14.6對于動物源性組分，應給出具有潛在感染性的警告。

三、審查關注點（一）技術要求中性能指標的設定及檢驗方法是否符合相關行業標準的要求；

技術要求的格式是否符合《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號）的相關規定。

（二）FSH預期值呈現性別、女性不同生理周期差異，在參考區間的確立/驗證過程中是否予以體現，樣本生理周期確定的依據是否科學合理。

（三）試劑（盒）的穩定性研究方法是否合理，穩定性結論是否和說明書聲稱一致。

（四）FSH被測物質在體內有同功異構結構，臨床試驗對比試劑盡可能選擇與考核試劑具有相同溯源性的。臨床試驗采用的樣本類型及病例是否滿足試劑（盒）聲稱的預期用途，樣本量及臨床研究單位的選擇、統計方法及研究結果、臨床方案及報告撰寫的格式等是否符合《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）對相關內容的規定。

（五）由于促卵泡生成素與促黃體生成素（LH）、促甲狀腺激素（TSH）、人絨毛膜促性腺激素（HCG）結構類似，建議臨床試驗過程中可適當入組一些早孕及甲減等疾病的樣本。

（六）說明書中預期用途、儲存條件及有效期、檢驗方法、參考區間、產品性能指標等描述應分別與臨床研究資料、穩定性研究資料、參考區間研究資料、分析性能評估資料的研究結論相一致。

（七）定量熒光免疫層析的產品可根據產品方法學特點選取適宜的試驗方法進行試驗。

四、參考文獻 （一）馮仁豐，《臨床檢驗質量管理技術基礎》，第二版，上海科學技術文獻出版社，2007年4月（二）尚紅，王毓三，申子瑜.《全國臨床檢驗操作規程》，第四版，人民衛生出版社，2015年3月第1版（三）How to Define and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory;Approved Guideline，Second Edition 2000，CLSI/NCCLS C28-A2（四）Method Comparison And Bias Estimation Using Patient Samples;Approved Guideline，Second Edition 2002，CLSI/NCCLS EP9-A2 五、編制單位 天津市醫療器械技術審評中心。

第二篇：地中海貧血相關基因檢測試劑注冊技術審查指導原則（2020年）

附件3

地中海貧血相關基因檢測試劑

注冊技術審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對地中海貧血相關基因檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是對地中海貧血相關基因檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，也不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究和驗證資料，相關人員應在遵循法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規和標準的不斷完善以及科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、適用范圍

地中海貧血（簡稱地貧）是一種常染色體隱性遺傳病，是由于珠蛋白基因發生突變（包括點突變和缺失等），致使珠蛋白肽鏈合成減少或完全不能合成而導致的一組單基因遺傳性溶血性疾病，輕者可無臨床表現，重者以進行性溶血性貧血為主要特征。根據珠蛋白肽鏈合成受到抑制的類型，地貧分為α-，β-和γ-地貧等，臨床上最常見的是α-和β-地貧。地貧主要分布在地中海沿岸、東南亞和少數非洲地區，具有明顯的種族特性和地域分布差異。地貧是我國南方地區最常見、危害最大的遺傳病之一，尤以廣西、云南、廣東、海南、四川和貴州等省份為甚，云南、海南和廣東的地貧基因人群攜帶率可達10%以上，廣西更是達到了20%以上。

α-地貧主要是由于α-珠蛋白基因發生突變而引起。α-珠蛋白基因簇位于16p13.3，包括胎兒期和成人期表達的2個基因（α2和α1），基因的排列順序為5’-α2-α1-3’。根據單倍型的情況，可將α地貧分為3類：（1）缺失型α+地貧（-α/），缺失1個α基因；（2）缺失型α0地貧（--/），2個α基因同時缺失；（3）非缺失型α+地貧（αTα/或ααT/），1個α1或α2基因發生點突變或少數幾個堿基的缺失。中國現已發現至少19種α-珠蛋白基因大片段缺失和38種α-珠蛋白基因點突變。其中，6

種α-珠蛋白基因的突變：--SEA/、-α3.7/、-α4.2/、αWSα/（HBA2：c.369C>G）、αQSα/（HBA2：c.377

T>C）；αCSα/（HBA2：c.427T>C）占患病人群總數的98%。

α-地貧基因型和臨床分型的關系已經基本闡明。α-地貧的表型嚴重程度隨著功能性α-珠蛋白基因的減少而加重：（1）1個α-基因缺失或點突變（-α/αα或ααT/αα或αTα/αα），稱為靜止型α-地貧，通常不貧血，血液學表現為小細胞低色素；（2）2個α-基因缺失或復合-α基因點突變，或點突變，其基因型為--/αα或-α/-α或-α/ααT或αTα/-α或αTα/αTα，稱為輕型α-地貧，臨床表現為不貧血或輕度貧血，血液學檢查有小細胞低色素特征；（3）3個α-基因缺失或復合α基因點突變，基因型為--/-α或--/αTα，稱為中間型α-地貧，又稱Hb

H病，患者有輕至重度貧血。某些基因型為αTα/αTα的病例（如αCSα/αCSα、αQSα/αQSα和αCSα/αQSα）也表現為Hb

H病。通常，--/αTα的非缺失型

Hb

H病較單純缺失型Hb

H病（--/-α）的臨床表現更為嚴重，特別是基因型為--/αCSα或--/αQSα的Hb

H病患者，貧血程度較為嚴重；（4）4個α-基因缺失，其基因型為--/--，稱為重型α-地貧，又稱Hb

Bart’s胎兒水腫綜合征，此類個體一般無法存活到出生或分娩后半小時內死亡。

β-地貧是由于β-珠蛋白基因發生突變而引起，以點突變為主，少數為缺失型。β-珠蛋白基因簇位于11p15.3，包括2個成人期表達基因（β和δ），基因的排列順序為5’-δ-β-3’。根據β-珠蛋白鏈合成量的程度，可將β-地貧分為3類：（1）β0地貧，β-珠蛋白鏈完全不能合成，其所在的等位基因稱為β0地貧等位基因；（2）β+地貧，β-珠蛋白鏈合成減少，其所在的等位基因稱為β+地貧等位基因；（3）β++地貧，又稱沉默型β-地貧，β-珠蛋白鏈合成輕微減少。中國已至少報道84種β-珠蛋白基因點突變和11種β-珠蛋白基因缺失。其中，6種點突變：HBB：c.126_129delCTTT，HBB：c.52A>T，HBB：c.-78A>G，HBB：

c.79G>A，HBB：

c.316-197C>T和HBB：

c.216_217insA占了全部突變類型的90%以上。

β-地貧的臨床表型可分為4種：（1）靜止型β-地貧，基因型為β++/βN，血液學表型正常或臨界，一般只能通過分子診斷識別；（2）輕型β-地貧，基因型為β0/βN或β+/βN，臨床表現為小細胞低色素和HbA2值升高；（3）中間型β-地貧，基因型為β+/β+或β+/β0，表型變異范圍大，可從輕度貧血到中度貧血，多于幼兒期出現中度貧血；（4）重型β-地貧，基因型為β+/β0或β0/β0，通常伴有嚴重貧血，需要定期輸血才能存活。患兒出生時無癥狀，常于嬰兒期（3-12月齡）發病。如不治療，患兒多于5歲前死亡。此外，中間型的分子基礎較為復雜，顯性β-地貧突變的雜合子（βD/βN），合并α-地貧突變的β-地貧突變純合子（β0/β0），或合并α-珠蛋白三聯體的β-地貧突變雜合子（β0/βN或β+/βN），也會顯示中間型的表型。

2018年發布的《重型β-地中海貧血的診斷和治療指南》明確規定：對于重型β-地中海貧血的診斷，有條件者均應進行基因診斷，基因型為純合子或雙重雜合子為確診本病的指標。2018年發布的《兒童非輸血依賴型地中海貧血的診治和管理專家共識》也明確規定：地貧基因檢測為非輸血依賴型地貧的診斷依據之一。

另外，國家衛生健康委員會發布的相關文件要求：為減少重型地貧患兒出生，在我國地貧高發省份實施地貧防控試點項目。主要流程包括：（1）對新婚夫婦和計劃懷孕夫婦在懷孕前或孕期進行血常規初篩；（2）對夫婦一方或雙方血常規檢查結果陽性的夫婦進行血紅蛋白分析復篩；（3）對血紅蛋白分析復篩結果均為陽性的夫婦，取其抗凝靜脈全血進行相應的α+β地貧基因檢測；（4）綜合夫婦雙方病史詢問、地貧篩查和基因檢測結果，判定為高風險夫婦。對高風險夫婦進行追蹤，及時了解受檢婦女懷孕情況，指導女方在懷孕后適宜時期接受產前診斷。產前診斷的對象為胎兒，樣本類型為胎兒的絨毛、羊水和臍帶血，檢測項目為相應的地貧基因檢測。

綜上，結合該類產品臨床使用的實際情況，本指導原則的預期用途可為：用于體外定性檢測人外周靜脈全血或胎兒羊水等樣本中基因組DNA的α-和/或β-地貧相關基因，用于α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷），地貧高風險夫婦的評估，或胎兒的產前遺傳診斷等。

結合該類產品在中國注冊的實際情況以及當前的認知，本指導原則僅對“α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷）”預期用途的相關內容進行了詳細闡述。針對其他預期用途，本指導原則僅對部分內容進行了闡述，申請人應根據產品特性，對本指導原則未涉及的內容進行補充并做出相應評價。

本指導原則的技術要求是基于PCR探針法方法建立的，對于其他分子生物學檢測技術（如：PCR-反向點雜交法和gap-PCR法等），可能部分要求不完全適用或本文所述技術指標不夠全面，申請人可以根據產品特性對不適用部分進行或補充其他的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學合理性。

本指導原則適用于進行首次注冊申報和相關許可事項變更的產品。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、研究結果的總結評價以及國內外同類產品上市情況介紹等內容。其中，同類產品上市情況介紹部分應著重從方法學、檢驗原理、檢測的突變類型以及臨床意義等方面詳細說明申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區別。

綜述資料應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（原總局令第5號，以下簡稱《辦法》）和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（原總局公告2014年第44號），以下簡稱《44號公告》的要求。

（二）主要原材料的研究資料

主要原材料研究資料包括主要反應成分、對照品（質控品）及企業參考品的研究資料。

1.此類產品的主要反應成分一般包括人基因組核酸提取/純化試劑、檢測所需引物、探針、酶、dNTPs、反應緩沖液等。申請人應提交相關原材料的選擇、制備和質量標準等的研究資料。如為申請人自制，應提交詳細的工藝穩定性研究資料；如為外購，還應提交供應商篩選資料以及供應商提供的原材料質量檢定報告。

1.1

核酸提取/純化試劑（如有）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。

1.2

引物、探針

申請人應詳述引物、探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應情況。建議設計多套引物探針以供篩選，針對待測位點的特異性等進行評價，選擇最佳設計，并提交詳細的篩選研究數據。

申請人應針對選定的引物、探針原材料進行質量評價，一般包括：分子量、純度（HPLC等）、濃度、探針熒光標記基團的激發波長和發射波長，以及功能性試驗等，并依據評價結果建立合理的質量標準。

1.3酶

酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申請人應針對各種酶的活性進行驗證，提交功能性試驗資料，并確定酶的質量標準。

DNA聚合酶應具有DNA聚合酶活性，無核酸內切酶活性，具熱穩定性。UDG/UNG應具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性。

1.4脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應提交對其純度、濃度、保存穩定性等的驗證資料，以及功能性試驗資料，并確定質量標準。

2.對照品（質控品）

試劑盒的質控體系通過設置各種試劑盒對照品（質控品）來實現。陽性對照應至少包括代表性的突變位點和突變類型。陰性對照可以是含有野生型序列的核酸溶液。空白對照為不含核酸的溶液。

如該類產品所采用的方法學和檢驗原理顯示：無論檢測何種樣本（野生型、雜合突變和純合突變），其反應體系均可報出核酸序列結果，均可對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，則無需另外設置內標；否則，試劑盒應另外設置內標。

對照品可采用人基因組DNA、細胞系或質粒等。空白對照應參與樣本核酸的平行提取。申請人應提供對照品原料選擇、制備、定值過程等的詳細研究數據，并對其檢測結果做出明確的范圍要求。

3.企業參考品

企業參考品主要包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品和精密度參考品等。申請人應提交企業參考品的原料選擇、制備方法、基因序列確認及檢驗標準的詳細研究資料等。

3.1

陽性參考品：可采用臨床樣本或其核酸溶液，如采用臨床樣本，則樣本類型應與待測樣本一致。應至少包含所有檢測位點的雜合型樣本，同時盡量納入純合突變型樣本。對于某些稀有基因型，也可采用細胞系或質粒。

3.2

陰性參考品：應包括野生型臨床樣本或其核酸溶液，以及易產生交叉反應的同源序列樣本，同時應盡量包含檢測范圍外其他檢測位點的樣本等。

3.3檢測限參考品可選擇最低檢測限濃度（例如：95%檢出率水平）或接近最低檢測限濃度（例如100%檢出率水平）的臨床樣本或其核酸溶液，至少包含所有檢測位點的雜合型樣本。

3.4

精密度參考品應至少包括低濃度雜合突變型臨床樣本或其核酸溶液，應至少包括代表性的突變位點和突變類型，且在每一反應體系均有分布。

目前，該類產品已有國家參考品，對于申報產品所聲稱的檢測位點，企業參考品的要求應不低于國家參考品。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料

主要生產工藝研究資料包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTPs濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標記（如有）等工藝過程的描述及確定依據。生產過程應對關鍵參數進行有效控制，可采用流程圖方式描述生產工藝，標明關鍵工藝質控步驟，并詳細說明該步驟的質控方法及質控標準。

反應體系研究指反應條件的選擇確定過程，包括樣本采集、預處理（如有）、樣本用量、試劑用量、核酸提取純化步驟、PCR反應條件、閾值循環數（Ct值）等的確定。

不同適用機型的反應條件如有差異應分別提交。

（四）分析性能評估資料

申請人應針對下述各項分析性能提交詳細的評估資料，包括試驗地點、適用儀器、試劑規格、批號、試驗方法、試驗樣本（類型、來源、數量、處理方法、基因型和濃度確認等）、可接受標準、統計方法、試驗數據及結論等。分析性能評估的實驗方法可以參考國內外有關體外診斷產品性能評估的指導原則。

每項性能評估應盡量采用與適用樣本類型一致的臨床樣本，對于某些稀有基因型，也可采用細胞系等。

1.核酸提取/純化性能（如有）

在進行靶核酸檢測前，應有適當的核酸提取/純化步驟。該步驟應最大量分離和純化目的核酸并盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有核酸提取/純化組分，申請人都應對配套使用的核酸提取/純化方法的提取效率和提取核酸純度、濃度等做充分的驗證，并評價該方法能否滿足該類產品的要求。

2.檢測準確性

建議采用若干份臨床樣本驗證該類產品的檢測準確性，樣本類型與說明書聲稱的樣本類型一致。樣本應涵蓋野生型、所有檢測位點的雜合突變型，同時盡量納入純合突變型。對于某些稀有基因型，也可采用細胞系或質粒。

3.最低檢測限

該類產品的最低檢測限可定義為：在滿足一定的檢測準確性和精密度的條件下，能夠檢出目標序列的最低人基因組DNA的濃度。可采用梯度濃度的人基因組DNA樣本進行多次重復檢測，確定適當檢出率水平（如：95%）下的最低人基因組DNA濃度。檢測限評價建議采用臨床樣本或細胞系，并至少包含所有檢測位點的雜合突變型。應明確臨床樣本或細胞系與人基因組DNA濃度的對應關系。

4.分析特異性

4.1

應針對同源序列或檢測范圍外基因和位點進行交叉反應驗證，說明交叉反應樣本的制備方法、核酸序列確認方法，提交詳細的驗證資料。

4.2

應針對可能的內源和外源性干擾物進行干擾試驗研究。內源干擾物主要涉及血脂、膽紅素、血紅蛋白和白蛋白、母體細胞的干擾等，外源干擾物主要包括血液樣本采集可能用到的抗凝劑和常用藥物等。

干擾試驗可通過在臨床樣本中人工添加干擾物質的方式，評價干擾物質對目標序列檢測的影響，也可直接采集暴露于干擾因素后的受試者樣本，進行干擾試驗評價。建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價；如有干擾，應確定不產生干擾的最高濃度。

5.精密度

精密度評價應采用臨床樣本進行試驗，試驗操作完全按照說明書執行，包含核酸提取/純化等步驟（如有）。應對每一反應體系進行精密度評價，并至少覆蓋代表性的突變位點和突變類型。

精密度評價需滿足如下要求：

5.1對可能影響檢測精密度的主要因素進行驗證，除檢測試劑本身外，還包括分析儀器、操作者、地點、時間、檢測輪次和試劑批次等。

5.2設定合理的精密度評價周期，對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間重復性進行評價。

5.3用于精密度評價的臨床樣本至少設置低濃度和中/高濃度水平。

5.4精密度指標可設置為CV等（如有），申請人應對精密度指標評價標準做出合理要求。

（五）陽性判斷值確定資料

建議納入一定數量的臨床樣本，應包括所有檢測位點的各種基因型（野生型、雜合突變型，同時盡量納入純合突變型），采用受試者工作特征（ROC）曲線或其他合理方法確定陽性判斷值。

如試劑判讀存在灰區，應解釋說明灰區范圍的確定方法。

對于某些檢測方法學，陽性判斷值研究可能不適用，申請人應說明理由。

（六）穩定性研究資料

穩定性研究資料主要包括申報產品的穩定性研究和適用樣本的穩定性研究兩部分。前者主要包括申報產品的實時穩定性、開瓶/復溶穩定性、運輸穩定性及凍融次數限制的研究等；后者則是指適用樣本的保存條件和保存時間等的研究。

實時穩定性研究應采用至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后，選取多個時間點進行產品性能評價，從而確定產品保存條件和有效期。

如核酸提取液可保存，還需對核酸提取液的保存條件和保存時間進行研究。

（七）臨床試驗

應滿足《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（原國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）的要求，如相關法規、文件有更新，臨床試驗應符合更新后的要求。下面僅說明該類產品臨床試驗中應關注的重點問題。

1．針對“α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷）”預期用途

1.1

臨床試驗機構及人員

申請人應根據產品特點及預期用途，綜合不同地區人種和流行病學背景等因素，選擇不少于3家（含3家）符合法規要求的臨床試驗機構開展臨床試驗。

1.2

臨床試驗適用人群和臨床樣本

具有地貧癥狀和/或體征，或血液學表現為小細胞低色素的疑似地貧患者和攜帶者；需與地貧進行鑒別診斷的其他疾病患者，如：缺鐵性貧血、鐵粒細胞性貧血或先天性紅細胞生成異常性貧血等。

臨床試驗所用樣本應為抗凝外周血樣本（基因組DNA非臨床樣本）。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應分別滿足申報產品說明書、對比試劑說明書（如適用）及第三方試劑說明書（如適用）的相關要求。

1.3臨床試驗方法

1.3.1已有同類產品上市的申報產品

對于已批準的α-地貧突變和β-地貧突變，原則上選擇已上市同類產品作為對比試劑，評價申報產品的臨床檢測性能。

1.3.2無同類產品上市的申報產品

1.3.2.1

如新突變位點的臨床意義已獲行業認可（如：國內相關指南或專家共識），且上述認可基于充分的中國人群的臨床數據，則臨床試驗可選擇Sanger基因測序（針對新的點突變）或臨床普遍使用的其他公認方法（針對其他類型的新突變位點，如缺失）作為對比方法，評價新突變位點的臨床檢測性能。除此之外，還應提交新位點臨床意義已獲行業認可的相關證據，該部分資料可不納入臨床方案和報告。

1.3.2.2

如新突變位點的臨床意義未獲行業認可，則臨床試驗應包括兩個目的，新突變位點的臨床檢測性能評價和臨床意義評價。新突變位點的臨床檢測性能評價可參考1.3.2.1；新突變位點的臨床意義評價應提交基于中國人群的充分的臨床證據，證明基因型與表型的關系，如：隨訪或其他可證明基因型與表型關系的臨床驗證資料。

1.4最低樣本量和陽性例數

臨床試驗樣本量應采用適當的統計學方法進行估算，并詳細描述所使用統計方法及各參數的確定依據。

1.4.1

臨床檢測性能評價的樣本量估算

臨床檢測性能評價的樣本量估算可分為以下幾種情況。

對于常見突變位點，建議采用單組目標值法分別估算每個突變位點臨床試驗的最低樣本量，通過陽性符合率計算所需陽性樣本的例數，通過陰性符合率計算所需陰性樣本的例數，同時考慮脫落情況，估算最低樣本總量。陽性符合率和陰性符合率的目標值（臨床可接受的最低標準）建議均不低于95%。

對于罕見突變位點，陰性樣本的例數可根據上述方法進行估算，陽性樣本則應保證一定的例數。

對于極其罕見的、且有確切臨床證據證明其臨床意義的突變位點，陰性樣本的例數可根據上述方法進行估算，陽性樣本的例數則應結合臨床證據確定。

1.4.2

新位點臨床意義評價的樣本量估算

新位點臨床意義評價的樣本量估算，建議采用抽樣調查公式或其他合理方法進行估算。

2.針對“地貧高風險夫婦的評估”和“胎兒的產前遺傳診斷”預期用途

針對上述兩個預期用途，本指導原則僅對部分內容進行了闡述，申請人應根據產品特性，充分考慮本指導原則未涉及的內容，設計科學合理的臨床試驗并進行評價。

2.1臨床試驗機構和人員

如申報產品的預期用途為胎兒的產前遺傳診斷，除滿足法規要求外，臨床試驗機構還應取得產前診斷技術服務資質。臨床試驗人員應為經過專門培訓的取得資質的人員。機構和人員應遵循《產前診斷技術管理辦法》《母嬰保健專項技術服務許可及人員資格管理辦法》，機構應取得《母嬰保健技術服務執業許可證》，人員應取得《母嬰保健技術考核合格證書》。

2.2

臨床試驗適用人群和臨床樣本

如預期用途為地貧高風險夫婦的評估，則適用人群為：地貧表型篩查陽性的育齡人群。地貧表型篩查陽性的育齡人群可根據國家衛生健康委員會和地貧高發地區相關政策確定。

如預期用途為胎兒的產前遺傳診斷，則適用人群為：地貧高風險夫婦的胎兒。地貧高風險夫婦的確定可參考國家衛生健康委員會等相關文件。

臨床試驗所用樣本應為胎兒羊水等臨床樣本（基因組DNA非臨床樣本）。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應符合國家衛生健康委員會等相關文件的要求，并滿足產品說明書的要求。

2.3

最低樣本量和陽性例數

針對每種不同的預期用途，應分別采用合理方法估算最低樣本量。同一預期用途的不同樣本類型（羊水和臍帶血等），也應分別采用合理方法估算最低樣本量。

3.如有其他預期用途，也應設計科學的臨床試驗，提供充分的證據，證明其預期用途。

4.不同預期用途的通用要求

4.1

臨床試驗方法、數據及統計分析

4.1.1應在臨床試驗方案或報告中明確申報產品、對比試劑和第三方試劑的試驗方法。

4.1.2臨床試驗病例總結表應以列表方式表示，包括申報產品的結果、對比試劑的結果、第三方試劑的檢測結果（如有）、臨床診斷、年齡和性別等。

4.1.3以交叉表分別總結兩種試劑的定性檢測結果，選擇合適的統計方法進行統計分析，以驗證兩種試劑檢測結果的一致性。

4.1.4

結果差異樣本的驗證

在數據收集過程中，對于兩種試劑檢測結果不一致的樣本，采用合理方法進行復核，并對差異原因進行分析。如無需復核，應說明理由。

4.2

臨床試驗方案

各臨床試驗機構的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床試驗機構的實驗室內并由該實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程。

試驗方案應確定嚴格的入選/排除標準，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程和結果判定時，應采用盲法以保證試驗結果的客觀性。各臨床試驗機構選用的對比試劑/方法應保持一致，以便進行合理的統計學分析。另外，申報產品的樣本類型不應超越對比試劑/方法對樣本類型的要求。

4.3臨床試驗報告

應對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的數據和統計分析方法。

（八）產品技術要求

產品技術要求應符合《辦法》、《44號公告》和《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》（原國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號）的相關要求。該類產品作為三類體外診斷試劑，應將主要原材料、生產工藝及半成品要求等內容作為附錄附于技術要求正文后。

目前，該類產品已有行業標準，產品技術要求的相關要求應不低于行業標準的要求。

（九）產品檢驗報告

根據《辦法》的要求，第三類體外診斷試劑申請注冊時應提交連續三個生產批次樣品的檢驗報告。目前，該產品已有國家參考品，產品檢驗應滿足國家參考品的要求。

（十）產品說明書

產品說明書應滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（原國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）的要求，產品說明書的所有內容均應與申請人提交的注冊申報資料的相關研究結果保持一致。下面對該類產品說明書的重點內容進行闡述。

1.【預期用途】應至少包括以下幾部分內容：

1.1本產品用于定性檢測人xx樣本基因組DNA中的α-和/或β-地貧xx突變，用于：α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷），地貧高風險夫婦的評估，或胎兒的產前遺傳診斷。

1.2介紹地貧相關的臨床背景信息及實驗室診斷方法等，介紹被測靶標（突變位點）的相關情況。

2.【主要組成成分】

2.1說明試劑盒包含組分的名稱或數量等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，企業應列出相關試劑/耗材的名稱及其他相關信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組分，則應在此注明經過驗證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產企業、產品名稱以和醫療器械備案號（如有）等詳細信息。

3.【檢驗原理】

3.1對試劑盒的被測靶標進行詳細描述（基因位置、突變位點及相關特征等），對試劑盒所用探針、引物或突變的判定等進行詳細介紹；對不同樣本反應管組合、對照品設置及熒光信號檢測原理等進行介紹。

3.2試劑盒技術原理的詳細介紹，建議結合適當圖示進行說明。如反應體系中添加了相關的防污染組分（如UNG酶），也應對其作用機理進行適當介紹。

4.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩定性等，應明確具體的儲存條件及有效期等信息。

5.【樣本要求】

樣本的采集、處理、運送和保存：明確樣本采集、核酸提取純化前的處理（如離心和洗滌等）、保存條件及期限以及運送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需要恢復至室溫，凍融次數的限制等。

6.【適用儀器】

所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

7.【檢驗方法】

詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1實驗條件：實驗室分區、實驗環境的溫度、濕度和空調氣流方向控制等注意事項。

7.2試劑配制方法和注意事項。

7.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項（如適用），對核酸提取純化環節進行合理質控，明確提取核酸的濃度純度等質量要求。

7.4擴增反應前準備：加樣體積、順序等。

7.5

PCR各階段的溫度、時間設置、循環數設置或相應的自動化檢測程序及相關注意事項。

7.6儀器設置（如適用）：特殊參數、探針的熒光素標記情況、對待測樣本及其他對照品的熒光通道選擇等。

8.【檢驗結果的解釋】

結合對照品、樣本管檢測結果以及檢測類型，以列表形式詳述所有可能出現的結果及相應的解釋。如存在檢測灰區，應詳述對于灰區結果的處理方式。

9.【檢驗方法的局限性】

9.1申報產品僅對下述檢測類型xx進行了驗證。

9.2有關假陰性結果的可能性分析

9.2.1不合理的樣本采集、運送及處理或核酸過度降解均有可能導致假陰性結果。

9.2.2未經驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導致假陰性結果（如有）。

10.【產品性能指標】簡述以下性能指標：

10.1最低檢測限：簡單介紹最低檢測限的確定方法，并明確最低檢測限結果。

10.2陽性/陰性參考品符合率。

10.3精密度：簡單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結果。

10.4分析特異性

10.4.1交叉反應驗證：同源性序列等交叉反應驗證。

10.4.2干擾物質驗證：樣本中常見干擾物質對檢測結果的影響。

10.5對比試驗研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統計學方法及統計分析結果。

11.【注意事項】應至少包括以下內容：

11.1如該產品含有人源或動物源性物質，應給出具有潛在感染性的警告。

11.2臨床實驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》現行有效版本等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規范執行。

三、起草單位

國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心。

第三篇：酶聯免疫法檢測試劑注冊技術審查指導原則

附件1

酶聯免疫法檢測試劑注冊技術審查指導原則

一、前言

本指導原則主要針對酶聯免疫類檢測試劑的主要原材料、生產工藝及反應體系、產品質量控制等環節提出指導性技術要求。

本指導原則系對酶聯免疫法檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品特性確定其中的具體內容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應的科學依據。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著法規和標準的不斷完善、科學技術的不斷發展，其相關內容也將進行適時的調整。

二、適用范圍

本指導原則適用于有關病原微生物檢測的第三類體外診斷試劑的注冊技術審查。其他酶聯免疫法檢測試劑（如作為二類管理的體外診斷試劑）可參考本指導原則執行。

三、基本要求

（一）基本原則

1.研制、生產用的各種原料、輔料等應制定其相應的質量標準，并應符合有關法規的要求。— 2 — 2.試劑生產企業應具備相應的專業技術人員、儀器設備以及適宜的生產環境，獲得《醫療器械生產許可證》；同時，應按照《體外診斷試劑生產實施細則（試行）》的要求建立相應的質量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行；還應通過《體外診斷試劑生產企業質量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。企業應對試劑的使用范圍做出明確規定，并經國家藥品監督管理部門批準。

3.診斷試劑的研制應當按照科學、規范的原則，各反應條件的選擇和確定應符合基本的科學原理。

4.試劑在研制、生產過程中所用的各種材料及工藝，應充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生產和質量控制的總體目標：保證試劑使用安全、質量穩定、工藝可控、檢測有效。

（二）原材料質量控制 1.主要生物原料

與產品質量最密切相關的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標反應板、標記相關酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應用抗原或抗體、制備校準品（標準品）等。使用前應按照工藝要求對這類生物原料進行質量檢驗，以保證其達到規定的質量標準。主要生物原料若為企業自己生產，其工藝必須相對穩定；若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，應依據國家相關法規的要求進行變更申請。

主要生物原料的常規檢驗項目一般包括：（1）外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒；或者為白色粉末，不含其他顏色的雜質；特殊生

— 3 — 物原料應具備相應外觀標準。

（2）純度和分子量

主要經SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進行電泳，一般每個電泳道加樣量為5μg，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應達到相應的質量標準，分子量大小應在正確的條帶位臵。

（3）蛋白濃度

蛋白濃度可通過Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲法或其他適宜的方法進行檢測。

（4）效價

效價的測定一般根據蛋白含量測定結果，通過倍比稀釋法進行。效價應達到規定的要求。

（5）功能性實驗

功能性實驗是指生物原料用于試劑盒實際生產中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩定性等，并比較其與上批次原料的相關性。

2.生物輔料

生物輔料一般指在生產過程中作為蛋白保護劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料的質量標準應符合2000年版的《中國生物制品主要原輔材料質控標準》規定的標準要求，并且要適合于本企業的生產。建議作以下檢驗：

（1）牛血清或羊血清

外 觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無溶血或異物。無菌試驗：將血清直接37℃放臵7天，明亮處觀察，不得出現混濁或— 4 — 沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，蛋白含量≥32mg/ml。

球蛋白含量：取待測血清1ml，采用飽和硫酸銨法進行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化鈉溶液，至1ml，用Lowry方法測定，蛋白含量應≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外 觀：應為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無吸潮，無結塊，無肉眼可見的其它雜質顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，在18?26℃時，溶解時間應≤15分鐘，pH值應為6.5?7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲法，其標準為≥95％。

總蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標準為≥95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的BSA含量，其標準為≥90%。（3）酪蛋白：

應符合生產所需的質量標準。（4）標記用酶

應在產品的質量標準中明示所使用的標記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應根據不同生產廠家的檢驗方法和質量標準進行檢驗，酶的純度RZ值（OD403nm/OD280nm）應大于3.0。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應進行功能性實驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進行酶聯免疫測定，均不能出現非特異性反應。

生物輔料的供應商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應商。3.化學原材料

化學原材料的質量標準，包括外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等，均應符合《中國生物制品主要原輔材

— 5 — 料質控標準（2000年版）》分析純級別的要求，并且要適合于本企業的生產。

主要化學原材料的供應商要求相對固定，不得隨意發生變更。化學原材料在購入時，原材料的生產商必須提供該批次化學原材料的質量保證材料和質量檢驗報告。

4.其他物料（1）酶標板 ①外觀

明亮處用肉眼觀察板條的外觀質量，如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差，底部有波紋及劃傷等應剔除。②吸附能力和精密性 采用合適的方法進行檢驗。

一般用一定濃度的正常人免疫球蛋白G(IgG)包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結合物吸附，通過顯色反應，使用酶標儀讀數，計算CV值。CV值結果應符合相關產品的功能性質量標準，一般批內CV≤5％，批間CV≤10％。

（2）液體試劑裝量瓶

包括陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應有相應的裝量瓶，并建立相應的質量控制標準，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。

（3）其他材料

包括試劑瓶標簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應參照國家食品藥品監督管理局發布的《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》和《醫療器械說明書、標簽和包裝標識管理規定》建立相應質量控制標準。— 6 — 5.企業質控品

企業質控品一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性、鉤狀效應（hook效應）等質控樣品，對于定量檢測試劑，還包括線性質控品樣品。如該產品具有國家標準品或參考品，應使用國家標準品（參考品）進行標化；若該診斷試劑沒有國家標準品（參考品），則企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

企業質控品的基質應與診斷試劑的待測樣品的基質基本一致，如待測樣品為血清/血漿，質控品基質也應為血清/血漿。

（三）試劑盒各組分的生產

酶聯免疫法檢測試劑主要組分的生產包括酶標記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標反應板、分裝及包裝等步驟；并通過產品的半成品檢驗和成品檢驗兩個質控過程來保證其質量符合規定。

1.各種工作液的配制

酶聯免疫診斷試劑研制生產過程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰性陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等，對定量檢測試劑，還包括標準品（或校準品）溶液。若陰性、陽性對照或其他液體組分涉及生物安全性問題，制備時應在相應的生物安全實驗室完成。

各種工作液在配制過程中應嚴格按質量標準中的配方進行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻，同時進行相應的質量檢驗并達到質量標準后，方可使用或分裝。對于定量檢測試劑，其標準品（或校準品）溶液應具有量值溯源性。

應對配制過程及配制的液體進行的質量控制，主要包括酶結合物的

— 7 — 功能性實驗及穩定性；各種溶液的外觀、pH值等；酶作用底物應測定在無相應酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標；終止液應對其終止酶促反應的能力進行測定。

2.包被酶標反應板

包被前應對酶標反應板進行質量檢驗，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標反應板的批號、數量、標識。酶標反應板經檢驗合格后方能用于包被。不同批號的板條不能混用。

選擇經檢驗合格的包被原料（如抗原、抗體等），經一定的方法確定最佳包被濃度和酶結合物工作濃度，按照診斷試劑的生產規程，配制包被緩沖液、封閉液，經檢驗合格后，包被酶標反應板，經干燥后，已包被的酶標反應板用鋁箔紙封閉（內臵干燥劑），保存于2?8℃。

應對包被過程進行相應的質量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質量檢驗、包被液和封閉液的質控（如配方、外觀、pH值）、包被過程的監控（包括包被和封閉的體積、溫度、時間等）、包被均一性檢驗、干燥過程的監控等。

3.分裝和包裝

樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應嚴格按照質量標準中的量進行過濾后再分裝，分裝量的誤差應小于5%。

分裝及包裝均應按照相應的標準操作規程要求進行。包裝前，應嚴格檢查試劑盒的品名、批號等，核對各試劑盒各組分的數量，并在關盒前進行復核。

（四）質量控制 1.半成品質量控制（1）半成品抽樣

檢驗人員按試劑的批號，根據抽樣申請單抽取規定數量的半成品各— 8 — 組分，作號標記、待檢。

（2）半成品檢驗

根據試劑盒的企業標準或者制檢規程進行半成品的檢驗。半成品檢驗，一般使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化后的企業參考品。若某類試劑沒有國家標準品（參考品），則使用企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

檢驗指標一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應達到相應的質量標準要求。對于精密性，一般情況下CV不得高于15％（采用競爭抑制法的診斷試劑CV不得高于20％）。對定量檢測試劑，同時應分析其線性相關系數和定量質控品檢測結果的準確性。

企業應該對每一批試劑的半成品進行穩定性研究。試劑盒各組分應留樣，2?8℃定期作穩定性考核，同時作37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產品的質量標準。

2.成品質量控制

產品包裝完成后，質檢人員根據試劑的批號、實際包裝量、抽樣申請單的要求進行抽樣，同時填寫抽樣數量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數量應包括檢驗用數量和留樣數量。質檢人員同時應檢查相關原始記錄。

每一批酶聯免疫類檢測試劑的試生產量應滿足工藝研究、分析性能驗證、穩定性研究、臨床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求。

（1）成品檢驗

成品檢驗時，一般使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化后的企業參考品，并達到相應質量要求。若該診斷試劑沒有國家

— 9 — 標準品（參考品），則使用企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

（2）穩定性試驗

在批放行前，每一批試劑應完成37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產品的質量標準。

四、名詞解釋

酶聯免疫法：是指在酶標板上包被特定的抗原（和/或抗體）后，利用直接或間接的方法與待測樣品中的相關抗體（和/或抗原）反應，形成的抗原抗體復合物再與相應的酶標記的抗體和/或抗原進一步反應，經過酶催化底物發生顯色反應，由形成的顏色的強弱來判斷樣本中相應的抗體和/或抗原的存在。

五、參考文獻：

1.《中國生物制品規程》（2000年版），化學工業出版社

— 10 —

第四篇：抗人球蛋白檢測試劑注冊技術審查指導原則（2018年）

附件3

抗人球蛋白檢測試劑注冊技術審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對抗人球蛋白檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是對抗人球蛋白檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。如申請人認為有必要增加本指導原則不包含的研究內容，可自行補充。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料，相關人員應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、范圍

抗人球蛋白檢測試劑可進行直接抗人球蛋白試驗和間接抗人球蛋白試驗，主要用于不規則抗體篩查、交叉配血、抗體致敏紅細胞的檢測等。

本指導原則適用于抗人球蛋白檢測試劑，同時適用于不同的檢測方法，如試管法、柱凝集法等，但不適用于血源篩查用抗人球蛋白檢測試劑。

本指導原則僅包括對抗人球蛋白檢測試劑注冊申報資料中部分項目的要求，適用于進行產品注冊和相關許可事項變更的產品。其他未盡事宜，應當符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第5號）（以下簡稱《辦法》）等相關法規要求。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料的撰寫應符合《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（國家食品藥品監督管理總局公告2014年第44號）（以下簡稱“44號公告”）的相關要求。內容主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、有關產品主要研究結果的總結和評價以及同類產品在國內外批準上市的情況介紹等內容，其中同類產品上市情況介紹部分應著重從靈敏度、特異性、效價、重復性等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的異同。

（二）主要原材料研究資料

主要原材料研究資料應包括主要組成成分（抗體、凝膠、玻璃珠等）的選擇、制備及其質量標準的研究資料。

1.抗體的選擇及質量標準

明確抗體的來源，如為單克隆抗體應明確細胞株、克隆號等內容。提供抗體靈敏度、特異性、效價等基本性能的驗證資料。

抗體如為自行生產，提供抗體的詳細生產及鑒定過程。

1.1靈敏度：已知抗體效價的臨床有意義的血型系統至少7種血型抗體（IgG）的最高稀釋倍數的凝集強度不小于1+。

1.2特異性：臨床有意義的已知血型系統至少7種，每種選1個抗體（IgG），與對應的抗原陽性細胞均應檢測陽性。

與不規則抗體陰性樣本檢測結果應為陰性。

1.3效價：如采用倍比稀釋的方法驗證抗人球蛋白試劑的效價，分別采用IgG和/或C3d致敏的細胞或根據廠家確立的研究方法進行驗證。

2.填充物的選擇：說明填充物如凝膠、玻璃珠的特性，如組成、粒徑及其質量控制要求。應提交選擇比較過程，提交驗證試驗資料。

3.填充緩沖液：應說明組成成分，并對外觀、性狀、pH值等物理指標及功能性進行研究驗證。

4.液體試劑稀釋液：應說明組成成分，并對外觀、性狀、pH值等物理指標及功能性進行研究驗證。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料

1.主要生產工藝介紹，可用流程圖方式表示，并簡要說明主要生產工藝的確定依據。

2.產品基本反應原理介紹。

3.主要生產工藝過程的研究資料、每一步生產工藝的確認資料及試驗數據。如抗體濃度的選擇確定過程、凝膠溶脹條件的確定、填充量及填充過程的研究資料，填充應確保均勻無氣泡，以及質量控制的要求。

4.主要反應體系的研究資料、每一步反應體系的確認資料及試驗數據。

反應體系的設置應符合《全國臨床檢驗操作規程》等公認標準操作規范、指南或標準的要求。如紅細胞懸液制備要求及紅細胞濃度的確定、用量的要求、孵育時間等；應提交離心條件的研究資料，建議以離心力或固定離心機型號固定轉數和時間的方式設置離心條件。

（四）分析性能評估資料

申請人應提交在產品研制或成品驗證階段對試劑進行的所有性能驗證的研究資料，對于每項分析性能的評價都應包括具體研究目的、實驗設計、研究方法、可接受標準、實驗數據、統計方法等詳細資料。有關分析性能驗證的背景信息也應在申報資料中有所體現，包括實驗地點（實驗室）、適用儀器、試劑規格、批號、臨床樣本來源等。分析性能評估的實驗方法可以參考國內或國際有關體外診斷產品性能評估的指導原則進行。

產品性能研究所采用的各種儀器、試劑或其他物品如可能均應采用境內或境外已批準上市的產品，如抗體篩查紅細胞、血型抗體等。

分析性能評估試驗中應明確所有試驗每種試劑的用量、試劑紅細胞的濃度、采用的試驗方法（試管法、柱凝集法、微孔板法等）。所有試驗方法應符合配合使用的血型試劑的具體操作要求。

對于抗人球蛋白檢測試劑建議著重對以下分析性能進行研究：

1.間接抗人球蛋白試驗：

提供臨床有意義的血型系統至少7種不規則抗體（IgG）檢測靈敏度和特異性的驗證資料，明確所檢出抗體的抗體效價的具體要求，可參照以下要求進行實驗。

1.1靈敏度

與已知抗體效價的血型抗體的最高稀釋倍數的凝集強度不小于1+，并且抗體效價不低于試管間接抗人球蛋白法測定結果。

C3d凝集強度≥2+。

1.2特異性

與已知抗體類型的血型抗體對應的O型相應抗原陽性紅細胞的反應為陽性。

與已知抗體類型的血型抗體對應的O型相應抗原陰性紅細胞的反應為陰性。

與C3d陽性或陰性樣本反應為陽性或陰性。

1.3重復性

分別采用IgG性質抗D抗體，IgG性質抗Jka/Jkb抗體，IgG性質抗Fya/Fyb抗體進行重復性驗證。

批內重復性采用同一批次檢測卡重復進行檢測，重復次數不少于10次。

日間重復性采用同一批次檢測卡每日重復進行檢測，重復天數不少于10天。

批間重復性采用至少三批檢測卡進行重復檢測。

批內、日間、批間重復性檢測結果應基本一致，檢測結果凝集強度差異不超過1+。

采用陰性結果的血清重復10次檢測，均應出現陰性反應。

1.4干擾

提供溶血、脂血、黃疸干擾的評估資料，應至少采用強、中、弱性質的抗體進行評價。

1.5血清、血漿比對的評估資料。

1.6抗凝劑的適用性研究驗證。

1.7采用部分臨床樣本進行檢測靈敏度和特異性的評價，應考慮涵蓋腫瘤、血液病、自身免疫病和貧血患者、老人及兒童等病例來源，應包括陽性和陰性病例。

1.8分別進行每個預期用途的完整的性能評估資料，應至少包括50例陽性病例。

2.直接抗人球蛋白試驗

使用被不規則抗體和/或C3d致敏的紅細胞進行反應，評價產品性能，適用的性能評價內容可以參照間接抗人球蛋白試驗。

（五）陽性判斷值

給出不同凝集強度的研究方法，并明確不同凝集強度代表的具體意義，并應包含溶血、混合視野雙群等情況，明確具體的試驗方法、實驗步驟，提供不同凝集強度的圖例或相片。

（六）穩定性研究資料

穩定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩定性和適用樣本的穩定性研究。前者主要包括實時穩定性（有效期）、加熱穩定性、開瓶穩定性等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案，實驗項目應至少包括靈敏度、特異性、重復性等內容。

穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對于實時穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

應對樣本穩定性進行研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度范圍內選擇溫度點（溫度范圍），每間隔一定的時間段對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認不同類型樣本的穩定性。適于冷凍保存的樣本還應對凍融次數進行評價。

試劑穩定性和樣本穩定性兩部分內容的研究結果應分別在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（七）臨床試驗

臨床試驗總體要求及臨床試驗資料的內容應符合《辦法》、“44號公告”及《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）的規定，以下僅結合抗人球蛋白檢測試劑的具體特點對其臨床試驗中應重點關注的內容進行闡述。

1.研究方法

該類試劑已有同類產品上市，按照法規要求應選擇境內已批準上市、臨床普遍認為質量較好的同類產品作為對比試劑，采用試驗用體外診斷試劑（以下稱考核試劑）與之進行比較研究試驗，證明本品與已上市產品等效。

2.臨床試驗單位的選擇

應選擇符合相關法規要求的臨床試驗機構進行臨床試驗，不得選擇血站進行臨床試驗。

3.病例選擇

臨床總病例數應不少于3000例。應采用臨床患者樣本進行臨床研究，供血者樣本不得作為臨床病例納入。應包括對檢測易產生干擾的病例，盡量選擇多種疾病患者樣本（如腫瘤患者、自身免疫病患者、血液病患者）、老人、兒童（不同年齡段）等。

4.實驗過程

無論直接抗人球蛋白試驗還是間接抗人球蛋白試驗，均應根據產品的預期用途和適用人群分別進行臨床試驗。

在進行間接抗人球蛋白檢測試劑臨床試驗的過程中除與對比試劑進行比較外，陽性結果應給出不規則抗體的具體鑒定結果。

產品如適用于不同的預期用途（如不規則抗體篩查、抗體致敏紅細胞檢測、交叉配血等），每種預期用途均應分別進行至少3000例的臨床試驗，如適用于不規則抗體篩查或抗體致敏紅細胞檢測等，每種預期用途應分別包含不少于100例陽性病例，如適用于交叉配血相關用途，應包含不少于100例交叉配血不合病例。抗體致敏紅細胞檢測應根據疾病的種類，分別進行臨床試驗。

交叉配血使用的供血者樣本，最多只能使用兩次，交叉配血不得使用血型不合的樣本進行實驗。

同時應明確配合使用的試劑產品。

5.統計學分析

應進行考核試劑與對比試劑檢測結果的陽性符合率、陰性符合率、總符合率的計算，并以四格表的形式進行列表，并對定性結果進行Kappa檢驗以驗證檢測結果的一致性。

6.結果差異樣本的驗證

對于兩種試劑檢測結果不一致[考核試劑與對比試劑檢測結果不一致、與對比試劑凝集強度差異較大（差異2個凝集強度及以上）]的樣本，應采用臨床上公認較好的第三種同類試劑進行確認試驗，同時應給出最終的抗體鑒定結果。

7.臨床試驗數據記錄表應作為臨床試驗報告附件提交。臨床試驗數據記錄表應列明所有病例的具體臨床診斷信息、凝集強度和抗體鑒定結果，如有不符樣本應列明第三方確認的結果。

（八）產品風險分析資料

產品風險分析資料應符合“44號公告”的基本要求，并參照相應的行業標準進行風險分析。風險分析中應充分考慮到各種可能影響檢測結果的因素，如某些樣本（如腫瘤患者、自身免疫病患者、血液病患者等）在進行抗人球蛋白檢測時可能存在一定的干擾、實驗過程不規范、有些抗體較弱導致的檢測結果不穩定等，申請人應根據這些不確定的因素分析產品應用可能存在的風險。

（九）產品技術要求

申請人應當在原材料質量和生產工藝穩定的前提下，根據產品研制、性能評估等結果，依據國家標準、行業標準及有關文獻，按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號）的有關要求，編寫產品技術要求。產品技術要求應符合《辦法》和“44號公告”的相關規定。

如果擬申報試劑已有相應的國家/行業標準發布，則企業標準的要求不得低于上述標準要求。

產品技術要求的性能指標應至少包括靈敏度、特異性、重復性等。

產品技術要求的附錄應包括主要原材料、生產工藝及半成品檢定要求。主要原材料應明確抗體來源、克隆號、純度、效價、特異性以及功能性驗證要求，應明確填充物來源及主要特征、質量控制要求，緩沖液應明確組成、pH值等特性及質控要求。主要生產工藝應以流程圖形式描述主要生產工藝過程，并明確主要生產工藝的具體條件和質量控制點。半成品檢定應明確半成品的檢驗要求及方法。

（十）產品注冊檢驗報告

根據《辦法》要求，首次申請注冊的第三類體外診斷試劑產品應在國家食品藥品監督管理部門認可的、具有相應承檢范圍的醫療器械檢驗機構進行連續三個生產批次樣品的注冊檢驗。

（十一）產品說明書

說明書承載了產品預期用途、檢驗原理、試驗方法、檢測結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學解釋的重要依據，因此，產品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）的要求，境外產品的中文說明書除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產品說明書的所有內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規范格式對此內容進行標注，并單獨列明參考文獻的相關信息。

以下內容僅對抗人球蛋白檢測試劑說明書的重點內容進行詳細說明，說明書其他內容應根據《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》要求進行編寫。

1.【預期用途】

1.1寫明本試劑用于直接抗人球蛋白試驗和/或間接抗人球蛋白試驗，主要用于不規則抗體篩查、交叉配血、抗體致敏紅細胞的檢測（明確疾病類型）等，同時明確不用于血源篩查，僅用于臨床檢驗。

1.2說明與預期用途相關的臨床適應癥背景情況，說明相關的臨床或實驗室診斷方法。

2.【儲存條件及有效期】

說明試劑的儲存條件及有效期、加速穩定性、開瓶穩定性等。

3.【適用儀器】明確具體的離心機和/或孵育器型號（如適用）。

4.【樣本要求】

明確溶血、脂血、黃疸樣本是否可以使用，或提供使用此類樣本的最低要求。依據穩定性研究結果寫明樣本穩定性。

明確適用的抗凝劑的要求。

明確具體的樣本采集、處理方法及過程。

明確紅細胞配制使用的LISS液的生產廠家、規格、貨號等內容。

5.【陽性判斷值】

明確各種試驗方法的結果判斷方法及標準，并通過不同凝集強度的圖例或照片進行詳細解釋。

6.【檢驗方法】

明確配合使用的抗體篩查用紅細胞的生產廠家、規格、貨號等內容。

須明確具體的檢驗步驟，反應體系的描述應準確且應與研究資料一致，不同的預期用途應分別詳細描述實驗過程。如配合其他試劑進行試驗，需注明試驗方法應完全符合配合試劑的試驗操作要求。

7.【檢驗方法的局限性】

未被檢出的抗IgG抗體在某些病例中可能有臨床意義。

8.【注意事項】

8.1上腔部分或封口處有氣泡或液滴的卡，必須在使用前離心。

8.2濃度過高或過低的紅細胞懸液會引起異常結果。

8.3在不規則抗體篩查、交叉配血試驗中LISS液可以增強抗原抗體的反應，應嚴格按產品說明書規范使用低離子液。

三、參考文獻

1.國家食品藥品監督管理總局.體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）.2014年9月

2.國家食品藥品監督管理總局.體外診斷試劑說明書編寫指導原則（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）.2014年9月

3.中國生物制品規程（2000年版）.化學工業出版社

四、起草單位

國家食品藥品監督管理總局醫療器械技術審評中心。

第五篇：核酸擴增法檢測試劑注冊技術審查指導原則3

附件3

核酸擴增法檢測試劑注冊技術審查指導原則

一、前言

本指導原則主要針對核酸擴增類檢測試劑的主要原材料、生產工藝及反應體系、產品質量控制等環節提出指導性技術要求。

本指導原則系對核酸擴增法檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品特性確定其中的具體內容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應的科學依據。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著法規和標準的不斷完善、科學技術的不斷發展，其相關內容也將進行適時的調整。

二、適用范圍

本指導原則適用于核酸擴增法檢測試劑的注冊技術審查，其他類核酸檢測試劑可參照相關內容。

三、基本要求

（一）基本原則

1.核酸擴增類檢測試劑的生產企業應獲得《醫療器械生產許可證》。研制、生產用的各種原料、輔料等應制定其相應的質量標準，并應符合有關法規的要求。

2．試劑生產企業應具有與其技術要求相適應的人員、廠房、設施和

— 23 — 儀器設備以及適宜的生產環境，配備滿足核酸提取和擴增檢測以及操作人員防護所需的設備。建立專用實驗室，實驗室應當嚴格分區，人員和物品應當單向流動，以最大限度地防止實驗過程中樣品之間的污染和避免擴增產物的污染。生產用于病原微生物核酸檢測的生產企業應建立符合生物安全要求的設施和措施。

3.試劑生產企業應按照《體外診斷試劑生產實施細則（試行）》的要求，建立相應的質量管理體系，并應通過《體外診斷試劑生產企業質量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。

4.核酸擴增類檢測試劑的引物設計應當符合核酸檢測設計的要求，擴增體系應設定合理的內標和外標，試劑需設置抗污染的特定措施，擴增產物須進行確證研究。

5.企業使用新型原材料時，應提供與通行原材料比對研究結果及相關資料。使用未列入上述標準的化學試劑，應不低于分析純。

（二）原材料

應提供主要原材料如引物、探針、企業參考品或標準品等的選擇與來源、制備過程、質量分析和質量標準等的相關研究資料。若主要原材料為企業自己生產，其生產工藝必須相對穩定；如主要原材料來自市場（從其他單位購買），應提供的資料包括：對物料供應商審核的相關資料、購買合同、供貨方提供的質量標準、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質量檢驗資料。主要原材料（包括生產工藝）或其供應商發生變更，應依據國家相關法規的要求進行變更申請。

核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應無脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

1.脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。應為高效液相色譜（HPLC）純、PCR級，無DNase和RNase污染。—20℃保存。— 24 — 2.引物

由一定數量的dNTP構成的特定序列，通常采用脫氧核糖核酸（DNA）合成儀人工合成，合成后經聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化。

凍干粉，序列正確，合成量應達到試劑生產要求。純度應達到電泳級（PAGE）或HPLC級，不含雜帶。應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如PAGE電泳結果或HPLC分析圖譜。

應作HPLC分析和紫外光吸收分析。以紫外分光光度計測定OD260nm/OD280nm的比值在1.6—2.0之間，可視為合格引物。-20℃保存。

3.探針

是指特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，在5'-端(和/或3'-端)進行標記，如熒光素報告基團或其他發光標記物，在3'-端標記熒光素淬滅基團，并經HPLC或其他適宜方法純化。

凍干粉，純度應達到HPLC純。應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如HPLC分析圖譜；應對探針的核酸序列及標記的熒光素或化學發光物進行核實，并作HPLC分析。應以可見—紫外分光光度計進行200—800nm掃描，在260nm處應有吸收峰。另外，根據標記熒光素的不同，還應該在熒光素的激發波長處有吸收峰，如FAM熒光素在494nm、TET熒光素在521nm、TAMRA熒光素在560nm處有特異的吸收峰，雜交探針在493nm、625nm、685nm處有特異的吸收峰，檢定合格后入庫。避光、-20℃保存。

4.DNA聚合酶

如Taq DNA聚合酶。應具有DNA聚合酶活性，無核酸內切酶活性；具熱穩定性，94℃保溫1小時后仍保持50%活性。-20℃保存。

5.尿嘧啶糖基化酶（UNG）

具有尿嘧啶糖基化酶活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性，IU UNG

— 25 — 在 37℃處理3分鐘后，103拷貝以下含U模板應完全降解，不能產生擴增產物。-20℃保存。

6.逆轉錄酶

具逆轉錄酶活性，無核酸內切酶活性。—20℃保存。

（三）生產工藝

核酸擴增類檢測試劑的基本生產工藝通常包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應符合要求，原材料應混合均勻，配制過程應對電導率pH、等關鍵參數進行有效控制。

工藝研究的資料應能對反應體系涉及到的基本內容，如樣本類型、樣本用量、試劑用量、反應條件、校準方法、質控方法、臨界值的確定、穩定性和有效期，提供確切的依據。

（四）質量控制 1.半成品質量控制

（1）按批號抽取規定數量的半成品。

（2）以參考品/對照品進行半成品質量控制。如果產品具有國家標準品或參考品，應以其進行檢定。如果產品不具有國家標準品或參考品，應根據規定制備相應的企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

（3）半成品檢定內容包括：陰/陽性參考品符合率、靈敏度、特異性、精密度。檢測結果應符合質量標準的要求。

（4）半成品檢定合格后，按試劑盒組成及時進行分裝和包裝。2.成品質量控制

（1）每一批核酸擴增法檢測試劑的試生產量應滿足工藝研究、分析性能驗證、穩定性研究、臨床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求。— 26 —（2）產品完成包裝后，應根據生產量進行抽樣和生產記錄審核。（3）以參考品/對照品進行成品質量檢驗。結果應符合要求。（4）成品檢驗的內容應包括：陰/陽性參考品符合率、靈敏度、特異性、精密度、線性范圍（定量產品）和穩定性。

5．試劑批放行前，應對需要進行穩定性考核的試劑成分，在特定溫度或條件下進行穩定性試驗。穩定性試驗可采用加速破壞試驗。

四、名詞解釋

核酸擴增法檢測試劑：核酸擴增技術泛指以擴增脫氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）為手段，檢測特定核酸序列或篩查特定基因的檢測技術，如聚合酶鏈反應（PCR）、連接酶鏈反應（LCR）、轉錄依賴的擴增反應（TMA）等。核酸擴增法檢測試劑是基于核酸擴增檢測技術的體外診斷試劑，目前已經用于病原體檢測、特定疾病的早期診斷和體內物質的型別鑒定等不同領域。

五、參考文獻

1.《中國生物制品規程》（2000年版），化學工業出版社