第一篇：酶聯免疫法檢測蝦中的呋喃唑酮

酶聯免疫法檢測蝦中的呋喃唑酮代謝物

摘要建立養殖蝦類中 AOZ殘留 ELISA篩選方法。方法: 酸性條件下利用 2-硝基苯甲醛衍生化, 乙酸乙酯提取, 正己烷去雜質后進行 ELISA分析。結果: 方法最低檢測限為 013 Lg/kg, 向樣品中添加濃度為 015、110和 310Lg/kg3個梯度標準品溶液時,平均回收率范圍為 9017% ~ 9519%, RSD 為 4124% ~ 5142%。結論: 實驗證明該方法適合養殖蝦類中 AOZ殘留篩選。

關鍵詞：蝦肉;呋喃唑酮代謝物;ELISA

一、前言

呋喃唑酮（FZD）,又名痢特靈,是一種廣譜抗菌藥物，屬于硝基呋喃類藥物，是人工合成的化學藥。常被摻放在飼料中，用于水產品養殖傳染病的預防與治療[1]。藥代動力學研究表明，呋喃唑酮在動物體內的代謝非常快，現已明確此類抗生素的原型在體內 4 d 后，就已完全分解成其代謝物，所以分析呋喃唑酮時，只能分析其代謝物[2]。經研究表明，呋喃唑酮的代謝物中有相當數量是以其完整側鏈 3-氨基-2-惡唑烷酮即 AOZ 與蛋白結合的殘留物形式存在, AOZ 進一步代謝可產生具致癌、致突變作用的羥乙基肼[3]，因此檢測呋喃唑酮代謝物(AOZ)的殘留更具有現實意義。呋喃唑酮在畜產品和水產品中的殘留，通過食物鏈傳遞給人類,會使人體受到損害。另外,其作為人畜共用藥，長期微量攝入易使人體產生抗藥性，導致呋喃唑酮藥物失去醫療功效[4]。

1990 年 7 月歐盟頒布 2377/90/EEC 條例，將硝基呋喃類藥物及其代謝產物列為 A 類禁用藥物，規定其在動物源性食品中的殘留檢測限為 1.0 μg/kg。由于對呋喃唑酮蛋白結合態殘留物的安全性產生懷疑，自1995 年起歐盟、日本、美國等都開始禁止這類抗菌劑在食用的畜禽及水產動物中使用，并嚴格執行對輸入的食用魚，蝦及禽類進行殘留檢測[5]。同許多國家一樣，我國農業部制訂的 NY5070-2002《無公害食品水產品中魚藥殘留限量》及 GB18406.4-2001《無公害水產品安全要求》規定，水產品中不得檢出呋喃唑酮，同時禁 止在飼料中添加[6]。目前呋喃唑酮在食品中殘留的監測方法主要有高效液相色譜法[7-8]、酶聯免疫法[9]、分光光度法、原子吸收法[10]等，酶聯免疫法已受到廣泛重視。本試驗主要 使用酶聯免疫法對出口蝦中呋喃唑酮代謝物AOZ 的殘留做快速檢測。

福建省詔安縣海利水產有限公司，是一家集水產品加工、銷售、研究、開發和養殖于一體的大型出口企業。該公司于2005年引進投建，廠房和生產布局按照《出口食品生產企業衛生注冊登記管理規定》和美國FDA法規及歐盟指令進行設計建造，廠區占地面積八萬平方米，全封閉配套中央空調的水產加工車間二萬平方米，生產車間配套高效臭氧殺菌設施，制冷水機和大型制冰機等各種先進加工設備，凍庫儲存能力達6000噸，同時配套建設大型對蝦養殖場及蝦苗孵化場，擁有一支高素質員工隊伍，年加工生產水產品15000噸以上，產品近二十種，主要有凍生蝦、凍熟蝦、凍面包蝦、壽司蝦、凍魷魚、凍羅非魚等。公司秉承共同發展的目標，不斷完善質量管理體系，執著追求品質,先后獲得了《衛生注冊證書》、《輸美水產品HACCP驗證證書》，2005年11月通過了BRC認證，2006年1月通過了ISO9001認證，2008年通過了歐盟相關質量認證，產品獲得了國外消費者的肯定和喜歡，遠銷日本、美國、加拿大、墨西哥和香港等國家和地區，在國外贏得了市場。公司自建成投產以來，企業迅速發展壯大。

1材料與方法

1.1

樣品

均來自福建省海利水產有限公司。

1.2

主要儀器及設備

MK3 型酶標儀: Thermo 公司；Scientz-10 型均質機：寧波新芝生物科技股份有限公司；ALC.210.4 電子天平:ACCULAB；DRP-9082 型恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；4K15 型高速冷凍離心機：Sigma公司；HH-w600s 恒溫水箱：山東鄄城新科教學儀器廠；MS1 Minishaker:IKA；1 000、200、20 μL 微量移液器：GILSON。

1.3

試劑與溶液

呋喃唑酮代謝產物-AOZ 試劑盒：北京望爾生物技術有限公司；靈敏度為 0.125 μg/kg，包括：AOZ 標準溶液（0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05 ng/mL）、濃縮緩沖液、濃縮提取/洗滌液、衍生試劑、濃縮酶標記物、底物溶液、反應終止液。正己烷，乙酸乙脂，1 mol/L NaOH，1 mol/L HCl。

1.4方法

1.4.1

樣品處理

蝦去頭去殼，取可食用部分，制成均質物。

1.4.2

樣品制備

1）稱取 1 g 已均質的樣品于 50 mL 離心管中，依次加入 4 mL 超純水、1.5 mL 1 mol/L HCl，100 μL 衍生試劑，漩渦振蕩 1 min。置 37 ℃的恒溫培養箱中溫育，靜置過夜（約 16 h）。

2）加入 5 mL 原倍緩沖液，0.4 mL 1 mol/L NaOH，5 mL 乙酸乙酯，振蕩混合約 1 min。

3）離心 10 min（3 000 r/min），取 2 mL 上清（乙酸乙酯層）至 10 mL 玻璃管中，于 50 ℃下氮氣吹干。

4）于此玻璃管加入正己烷 1 mL，先將殘留物完全溶解后（若未能完全溶解，可能會導致回收率降低），再加入 2 mL 原倍萃取/清洗液，振蕩 1 min。

5）將玻璃試管置于 80℃～100℃熱水浴中約 3min，以減少水相與有機相間的乳化現象。6）離心 10 min（3 000 r/min），吸去上層液（正己烷），棄掉，再吸取下層液（水層）備用。

1.4.3測定

1）將 AOZ 試劑盒從冰箱中拿出，回溫至室溫。

2）取出相應數量的微孔，各個標準液和待測樣品各做 2 個平行樣，做好記錄。

3）于適當的微孔中分別加入 50 μL 標準溶液（0，0.05，0.15，0.45，1.35，4.05 ng/mL）。

4）于另外微孔中加入 50 μL 已完成前處理的樣品溶液。

5）再于每一微孔中另再加入 100 μL 已稀釋的酶標記物。

6）輕敲盤子四周，使其充分混合后于室溫（25 ℃）下避光靜置溫育 50 min。

7）微孔中的反應液甩掉，再將洗液加滿每一微孔后甩掉，重復洗 3 次。

8）最后一次甩掉后，在吸水紙上拍干。

9）于每一微孔中加入底物溶液 100 μL 后，輕敲盤子四周，使其充分混合。

10）于室溫（25 ℃）下避光靜置溫育 30 min。

11）于每一微孔中加入 100 μL 反應終止液。

12）用酶標儀于波長 450 nm 下判讀。

1.5

數據處理

1）計算（B/B0）×100 值。用樣品和標準溶液吸光度值（B）除以零標準吸光度值（B0）再乘以 100。

2）以（B/B0）×100 值為縱坐標，以樣品濃度的對數值為橫坐標，做標準對數曲線。

3）根據每個樣品的 B/B0值就可以從曲線上讀出相對應樣品的濃度

2結果

2.1

標準曲線的繪制

AOZ 標準品的 ELISA 檢測結果見表 1。

2.4

試驗過程中的注意事項

1）A回溫試劑（20℃-24℃）。B恒溫孵育，避免光線照射。

2）、將足夠標準和樣品所用數量的孔條插入微孔架，標準和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準和樣品的位置。

3）加入50ul標準或處理好的樣品液到各自的微孔中，每個孔加入樣品或標準時注意更換移液器的吸頭。

4)加入50ul酶標記物溶液（紅帽）到每一個微孔底部，充分混合。

5)加入50ul抗體溶液（黑帽）到每一個微孔底部充分混合，在室溫孵育1小時，覆蓋上薄膜。

6)倒出孔中的流體將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體。用250ul樣品洗滌緩沖液充入孔中，重復兩次。

7)加入100ul基質/發色劑到每一微孔中，充分混合并在室溫暗處孵育15分鐘。

8）加入100ul反應終止液到每一微孔中，混合好在450nm處測量吸光值以空氣為空白，必須在加入停止液后60分鐘內讀取吸光值。

9）試劑盒內容物要完全回穩后再進行操作，否則，會出現吸光值偏低或沒有吸光值。

10）溫浴時若室溫太低或太高，請適當延長或縮短溫浴時間，或直接在恒溫培養箱中進行。

11）加樣品或試劑時，吸頭請勿接觸微孔。

12）加樣和洗板過程中，要避免微孔間的相互污染。

13）整個試驗過程中，勿使微孔干燥。

結論

本試驗用酶聯免疫法檢測了海利水產有限公司中呋喃唑酮代謝物 AOZ 的殘留狀況，結果表明絕大多數的水產品符合規定，只有極少數部分有殘留。用酶聯免疫法對蝦肉呋喃唑酮代謝物 AOZ 殘留進行測定，操作簡易，不需要復雜的儀器設備，樣品預處理簡單，作為一種快速篩選手段，在食品工業中有著廣闊的推廣應用前景，尤其在水產品出口企業中，但酶聯免疫試劑盒的價格將是最大的制約因素。

參考文獻：

[1] 景立新,孫武平,楊欽德,等.分光光度法快速測定海蝦中呋喃唑酮殘留量[J].光譜實驗室，2006(5)：547-549

[2] 周新,張欣祥,王磊,等.UPLC-MS/MS 測定魚干中的呋喃唑酮代謝物[J].分析測試學報,2007,26(9):262-263

[3]許蓓,徐志祥,王鳳俠,等.動物性食品中呋喃唑酮代謝物酶聯免疫檢測方法的研究[J].食品研究與開發,2007,28(12):145-148

[4]羅杰,李健.呋喃唑酮間接競爭 ELISA(ciELISA)檢測法的建立[J].中國海洋大學學報,2005,3,35(20):213-218

[5]許春蘭,院榕生,劉小根,等.酶聯技術在水產品中呋喃唑酮代謝物 AOZ 的檢測中的應用

[J].食品研究與開發,2007,28(5):124-126

[6]吳富忠, 歐陽立群.水產品中呋喃唑酮、呋喃西林藥物殘留的HPLC 法測定[J].中國衛生檢驗雜志,2006,16(7):812-813

[7]艾曉輝，劉長征，羅玉霜，等.水產品中呋喃唑酮含量的高效液相色譜檢測法[J].淡水漁業，2003，33(1)：8-10

[8]于慧娟，蔡友窮，畢士川，等.高效液相色譜法測定水產品中呋喃唑酮的殘留量[J].色譜，2005，23(1)：114

[9] 沈美羅,宋紅波,耿雪冰，等.酶聯免疫法測定水產品中呋喃唑酮代謝物 AOZ 的殘留[J].水產學報，2006，30(4)：520-524

[10] 焦更生，曹會蘭.原子吸收法間接測定呋喃唑酮[J].分析試驗室,2006,25(8):88-90

第二篇：酶聯免疫法檢測試劑注冊技術審查指導原則

附件1

酶聯免疫法檢測試劑注冊技術審查指導原則

一、前言

本指導原則主要針對酶聯免疫類檢測試劑的主要原材料、生產工藝及反應體系、產品質量控制等環節提出指導性技術要求。

本指導原則系對酶聯免疫法檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品特性確定其中的具體內容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應的科學依據。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著法規和標準的不斷完善、科學技術的不斷發展，其相關內容也將進行適時的調整。

二、適用范圍

本指導原則適用于有關病原微生物檢測的第三類體外診斷試劑的注冊技術審查。其他酶聯免疫法檢測試劑（如作為二類管理的體外診斷試劑）可參考本指導原則執行。

三、基本要求

（一）基本原則

1.研制、生產用的各種原料、輔料等應制定其相應的質量標準，并應符合有關法規的要求。— 2 — 2.試劑生產企業應具備相應的專業技術人員、儀器設備以及適宜的生產環境，獲得《醫療器械生產許可證》；同時，應按照《體外診斷試劑生產實施細則（試行）》的要求建立相應的質量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行；還應通過《體外診斷試劑生產企業質量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。企業應對試劑的使用范圍做出明確規定，并經國家藥品監督管理部門批準。

3.診斷試劑的研制應當按照科學、規范的原則，各反應條件的選擇和確定應符合基本的科學原理。

4.試劑在研制、生產過程中所用的各種材料及工藝，應充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生產和質量控制的總體目標：保證試劑使用安全、質量穩定、工藝可控、檢測有效。

（二）原材料質量控制 1.主要生物原料

與產品質量最密切相關的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標反應板、標記相關酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應用抗原或抗體、制備校準品（標準品）等。使用前應按照工藝要求對這類生物原料進行質量檢驗，以保證其達到規定的質量標準。主要生物原料若為企業自己生產，其工藝必須相對穩定；若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，應依據國家相關法規的要求進行變更申請。

主要生物原料的常規檢驗項目一般包括：（1）外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒；或者為白色粉末，不含其他顏色的雜質；特殊生

— 3 — 物原料應具備相應外觀標準。

（2）純度和分子量

主要經SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進行電泳，一般每個電泳道加樣量為5μg，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應達到相應的質量標準，分子量大小應在正確的條帶位臵。

（3）蛋白濃度

蛋白濃度可通過Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲法或其他適宜的方法進行檢測。

（4）效價

效價的測定一般根據蛋白含量測定結果，通過倍比稀釋法進行。效價應達到規定的要求。

（5）功能性實驗

功能性實驗是指生物原料用于試劑盒實際生產中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩定性等，并比較其與上批次原料的相關性。

2.生物輔料

生物輔料一般指在生產過程中作為蛋白保護劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料的質量標準應符合2000年版的《中國生物制品主要原輔材料質控標準》規定的標準要求，并且要適合于本企業的生產。建議作以下檢驗：

（1）牛血清或羊血清

外 觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無溶血或異物。無菌試驗：將血清直接37℃放臵7天，明亮處觀察，不得出現混濁或— 4 — 沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，蛋白含量≥32mg/ml。

球蛋白含量：取待測血清1ml，采用飽和硫酸銨法進行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化鈉溶液，至1ml，用Lowry方法測定，蛋白含量應≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外 觀：應為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無吸潮，無結塊，無肉眼可見的其它雜質顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，在18?26℃時，溶解時間應≤15分鐘，pH值應為6.5?7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲法，其標準為≥95％。

總蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標準為≥95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的BSA含量，其標準為≥90%。（3）酪蛋白：

應符合生產所需的質量標準。（4）標記用酶

應在產品的質量標準中明示所使用的標記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應根據不同生產廠家的檢驗方法和質量標準進行檢驗，酶的純度RZ值（OD403nm/OD280nm）應大于3.0。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應進行功能性實驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進行酶聯免疫測定，均不能出現非特異性反應。

生物輔料的供應商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應商。3.化學原材料

化學原材料的質量標準，包括外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等，均應符合《中國生物制品主要原輔材

— 5 — 料質控標準（2000年版）》分析純級別的要求，并且要適合于本企業的生產。

主要化學原材料的供應商要求相對固定，不得隨意發生變更。化學原材料在購入時，原材料的生產商必須提供該批次化學原材料的質量保證材料和質量檢驗報告。

4.其他物料（1）酶標板 ①外觀

明亮處用肉眼觀察板條的外觀質量，如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差，底部有波紋及劃傷等應剔除。②吸附能力和精密性 采用合適的方法進行檢驗。

一般用一定濃度的正常人免疫球蛋白G(IgG)包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結合物吸附，通過顯色反應，使用酶標儀讀數，計算CV值。CV值結果應符合相關產品的功能性質量標準，一般批內CV≤5％，批間CV≤10％。

（2）液體試劑裝量瓶

包括陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應有相應的裝量瓶，并建立相應的質量控制標準，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。

（3）其他材料

包括試劑瓶標簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應參照國家食品藥品監督管理局發布的《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》和《醫療器械說明書、標簽和包裝標識管理規定》建立相應質量控制標準。— 6 — 5.企業質控品

企業質控品一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性、鉤狀效應（hook效應）等質控樣品，對于定量檢測試劑，還包括線性質控品樣品。如該產品具有國家標準品或參考品，應使用國家標準品（參考品）進行標化；若該診斷試劑沒有國家標準品（參考品），則企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

企業質控品的基質應與診斷試劑的待測樣品的基質基本一致，如待測樣品為血清/血漿，質控品基質也應為血清/血漿。

（三）試劑盒各組分的生產

酶聯免疫法檢測試劑主要組分的生產包括酶標記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標反應板、分裝及包裝等步驟；并通過產品的半成品檢驗和成品檢驗兩個質控過程來保證其質量符合規定。

1.各種工作液的配制

酶聯免疫診斷試劑研制生產過程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰性陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等，對定量檢測試劑，還包括標準品（或校準品）溶液。若陰性、陽性對照或其他液體組分涉及生物安全性問題，制備時應在相應的生物安全實驗室完成。

各種工作液在配制過程中應嚴格按質量標準中的配方進行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻，同時進行相應的質量檢驗并達到質量標準后，方可使用或分裝。對于定量檢測試劑，其標準品（或校準品）溶液應具有量值溯源性。

應對配制過程及配制的液體進行的質量控制，主要包括酶結合物的

— 7 — 功能性實驗及穩定性；各種溶液的外觀、pH值等；酶作用底物應測定在無相應酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標；終止液應對其終止酶促反應的能力進行測定。

2.包被酶標反應板

包被前應對酶標反應板進行質量檢驗，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標反應板的批號、數量、標識。酶標反應板經檢驗合格后方能用于包被。不同批號的板條不能混用。

選擇經檢驗合格的包被原料（如抗原、抗體等），經一定的方法確定最佳包被濃度和酶結合物工作濃度，按照診斷試劑的生產規程，配制包被緩沖液、封閉液，經檢驗合格后，包被酶標反應板，經干燥后，已包被的酶標反應板用鋁箔紙封閉（內臵干燥劑），保存于2?8℃。

應對包被過程進行相應的質量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質量檢驗、包被液和封閉液的質控（如配方、外觀、pH值）、包被過程的監控（包括包被和封閉的體積、溫度、時間等）、包被均一性檢驗、干燥過程的監控等。

3.分裝和包裝

樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應嚴格按照質量標準中的量進行過濾后再分裝，分裝量的誤差應小于5%。

分裝及包裝均應按照相應的標準操作規程要求進行。包裝前，應嚴格檢查試劑盒的品名、批號等，核對各試劑盒各組分的數量，并在關盒前進行復核。

（四）質量控制 1.半成品質量控制（1）半成品抽樣

檢驗人員按試劑的批號，根據抽樣申請單抽取規定數量的半成品各— 8 — 組分，作號標記、待檢。

（2）半成品檢驗

根據試劑盒的企業標準或者制檢規程進行半成品的檢驗。半成品檢驗，一般使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化后的企業參考品。若某類試劑沒有國家標準品（參考品），則使用企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

檢驗指標一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應達到相應的質量標準要求。對于精密性，一般情況下CV不得高于15％（采用競爭抑制法的診斷試劑CV不得高于20％）。對定量檢測試劑，同時應分析其線性相關系數和定量質控品檢測結果的準確性。

企業應該對每一批試劑的半成品進行穩定性研究。試劑盒各組分應留樣，2?8℃定期作穩定性考核，同時作37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產品的質量標準。

2.成品質量控制

產品包裝完成后，質檢人員根據試劑的批號、實際包裝量、抽樣申請單的要求進行抽樣，同時填寫抽樣數量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數量應包括檢驗用數量和留樣數量。質檢人員同時應檢查相關原始記錄。

每一批酶聯免疫類檢測試劑的試生產量應滿足工藝研究、分析性能驗證、穩定性研究、臨床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求。

（1）成品檢驗

成品檢驗時，一般使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化后的企業參考品，并達到相應質量要求。若該診斷試劑沒有國家

— 9 — 標準品（參考品），則使用企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

（2）穩定性試驗

在批放行前，每一批試劑應完成37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產品的質量標準。

四、名詞解釋

酶聯免疫法：是指在酶標板上包被特定的抗原（和/或抗體）后，利用直接或間接的方法與待測樣品中的相關抗體（和/或抗原）反應，形成的抗原抗體復合物再與相應的酶標記的抗體和/或抗原進一步反應，經過酶催化底物發生顯色反應，由形成的顏色的強弱來判斷樣本中相應的抗體和/或抗原的存在。

五、參考文獻：

1.《中國生物制品規程》（2000年版），化學工業出版社

— 10 —

第三篇：酶聯免疫法檢測試劑主要原材料、生產工藝及質量控制注冊技術審查指導原則(報批稿)

酶聯免疫法檢測試劑主要原材料、生產工藝及質量控制注冊技術審查指導原則（報批稿）

2010-11-09 01:27

酶聯免疫法檢測試劑主要原材料、生產工藝及 質量控制注冊技術審查指導原則（報批稿）

一、前言

本指導原則的主要目的是規范申請人對酶聯免疫類檢測試劑的主要原材料研究資料、生產工藝及反應體系研究資料的準備，并對產品質量控制提出指導性技術要求。

本指導原則系對酶聯免疫法檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品特性確定其中的具體內容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應的科學依據。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其它方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將進行適時的調整。

二、適用范圍 本指導原則適用于有關病原微生物檢測的第三類體外診斷試劑的注冊技術審查，其它酶聯免疫法檢測試劑（如作為二類管理的體外診斷試劑）可參考本指導原則執行。

三、基本要求

（一）基本原則

1.研制、生產用的各種原料、輔料等應制定其相應的質量標準，并應符合有關法規的要求。

2.試劑生產企業應具備相應的專業技術人員、儀器設備以及適宜的生產環境，獲得《醫療器械生產許可證》；同時，應按照《體外診斷試劑生產實施細則（試行）》的要求建立相應的質量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行；還應通過《體外診斷試劑生產企業質量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。企業應對試劑的使用范圍做出明確規定，并經國家藥品監督管理部門批準。

3.診斷試劑的研制應當按照科學、規范的原則，各反應條件的選擇和確定應符合基本的科學原理。

4.試劑在研制、生產過程中所用的各種材料及工藝，應充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生產和質量控制的總體目標：保證試劑使用安全、質量穩定、工藝可控、檢測有效。

（二）原材料質量控制 1.主要生物原料 與產品質量最密切相關的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標反應板、標記相關酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應用抗原或抗體、制備校準品（標準品）等。使用前應按照工藝要求對這類生物原料進行質量檢驗，以保證其達到規定的質量標準。主要生物原料若為企業自己生產，其工藝必須相對穩定；若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，應依據國家相關法規的要求進行變更申請。

主要生物原料的常規檢驗項目一般包括：（1）外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒；或者為白色粉末，不含其他顏色的雜質；特殊生物原料應具備相應外觀標準。

（2）純度和分子量

主要經SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進行電泳，一般每個電泳道加樣量為5μg，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應達到相應的質量標準，分子量大小應在正確的條帶位臵。

（3）蛋白濃度 蛋白濃度可通過Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲法或其他適宜的方法進行檢測。

（4）效價

效價的測定一般根據蛋白含量測定結果，通過倍比稀釋法進行。效價應達到規定的要求。

（5）功能性實驗

功能性實驗是指生物原料用于試劑盒實際生產中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩定性等，并比較其與上批次原料的相關性。

2.生物輔料

生物輔料一般指在生產過程中作為蛋白保護劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料的質量標準應符合2000年版的《中國生物制品主要原輔材料質控標準》規定的標準要求，并且要適合于本企業的生產。建議作以下檢驗：

（1）牛血清或羊血清

外 觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無溶血或異物 無菌試驗：將血清直接37℃放臵7天，明亮處觀察，不得出現混濁或沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，蛋白含量≥32mg/ml。球蛋白含量：取待測血清1ml，采用飽和硫酸銨法進行沉淀，沉淀溶于0.85%NaCl溶液，至1ml，用Lowry方法測定，蛋白含量應≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外 觀：應為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無吸潮，無結塊，無肉眼可見的其它雜質顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，在18?26℃時，溶解時間應≤15分鐘，pH值應為6.5?7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲法，其標準為≥95％。

總蛋白中的BSA含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標準為≥95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的BSA含量，其標準為≥90%。

（3）酪蛋白：

應符合生產所需的質量標準。（4）標記用酶

應在產品的質量標準中明示所使用的標記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應根據不同生產廠家的檢驗方法和質量標準進行檢驗，酶的純度RZ值（OD403nm/OD280nm）應大于3.0。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應進行功能性實驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進行酶聯免疫測定，均不能出現非特異性反應。

生物輔料的供應商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應商。3.化學原材料

化學原材料的質量標準，包括外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等，均應符合《中國生物制品主要原輔材料質控標準（2000年版）》分析純級別的要求，并且要適合于本企業的生產。

主要化學原材料的供應商要求相對固定，不得隨意發生變更。化學原材料在購入時，原材料的生產商必須提供該批次化學原材料的質量保證材料和質量檢驗報告。

4.其他物料（1）酶標板 ①外觀

明亮處用肉眼觀察板條的外觀質量，如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差，底部有波紋及劃傷等應剔除。

②吸附能力和精密性 采用合適的方法進行檢驗。

一般用一定濃度的正常人IgG包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結合物吸附，通過顯色反應，使用酶標儀讀數，計算CV值。CV值結果應符合相關產品的功能性質量標準，一般批內CV≤5％，批間CV≤10％。

（2）液體試劑裝量瓶

包括陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應有相應的裝量瓶，并建立相應的質量控制標準，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。

（3）其他材料

包括試劑瓶標簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應參照國家食品藥品監督管理局頒布的《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》和《醫療器械說明書、標簽和包裝標識管理規定》建立相應質量控制標準。

5.企業質控品

企業質控品一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性、hook效應等質控樣品，對于定量檢測試劑，還包括線性質控品樣品。如該產品具有國家標準品或參考品，應使用國家標準品（參考品）進行標化；若該診斷試劑沒有國家標準品（參考品），則企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

企業質控品的基質應與診斷試劑的待測樣品的基質基本一致，如待測樣品為血清/血漿，質控品基質也應為血清/血漿。

（三）試劑盒各組分的生產

酶聯免疫法檢測試劑主要組分的生產包括酶標記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標反應板、分裝及包裝等步驟；并通過產品的半成品檢驗和成品檢驗兩個質控過程來保證其質量符合規定。1.各種工作液的配制

酶聯免疫診斷試劑研制生產過程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰性陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等，對定量檢測試劑，還包括標準品（或校準品）溶液。若陰性、陽性對照或其他液體組分涉及生物安全性問題，制備時應在相應的生物安全實驗室完成。

各種工作液在配制過程中應嚴格按質量標準中的配方進行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻，同時進行相應的質量檢驗并達到質量標準后，方可使用或分裝。對于定量檢測試劑，其標準品（或校準品）溶液應具有量值溯源性。

應對配制過程及配制的液體進行的質量控制，主要包括酶結合物的功能性實驗及穩定性；各種溶液的外觀、pH值等；酶作用底物應測定在無相應酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標；終止液應對其終止酶促反應的能力進行測定。

2.包被酶標反應板

包被前應對酶標反應板進行質量檢驗，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標反應板的批號、數量、標識。酶標反應板經檢驗合格后方能用于包被。不同批號的板條不能混用。

選擇經檢驗合格的包被原料（如抗原、抗體等），經一定的方法確定最佳包被濃度和酶結合物工作濃度，按照診斷試劑的生產規程，配制包被緩沖液、封閉液，經檢驗合格后，包被酶標反應板，經干燥后，已包被的酶標反應板用鋁箔紙封閉（內臵干燥劑），保存于2?8℃。

應對包被過程進行相應的質量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質量檢驗、包被液和封閉液的質控（如配方、外觀、pH值）、包被過程的監控（包括包被和封閉的體積、溫度、時間等）、包被均一性檢驗、干燥過程的監控等。

3.分裝和包裝

樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應嚴格按照質量標準中的量進行過濾后再分裝，分裝量的誤差應小于5%。

分裝及包裝均應按照相應的SOP要求進行。包裝前，應嚴格檢查試劑盒的品名、批號等，核對各試劑盒各組分的數量，并在關盒前進行復核。

（四）質量控制 1.半成品質量控制（1）半成品抽樣

檢驗人員按試劑的批號，根據抽樣申請單抽取規定數量的半成品各組分，作號標記、待檢。

（2）半成品檢驗

根據試劑盒的企業標準或者制檢規程進行半成品的檢驗。半成品檢驗，一般使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化后的企業參考品。若某類試劑沒有國家標準品（參考品），則使用企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

檢驗指標一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應達到相應的質量標準要求。對于精密性，一般情況下CV不得高于15％（采用競爭抑制法的診斷試劑CV不得高于20％）。對定量檢測試劑，同時應分析其線性相關系數和校準品檢測結果的準確性。

企業應該對每一批試劑的半成品進行穩定性研究。試劑盒各組分應留樣，2?8℃定期作穩定性考核，同時作37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產品的質量標準。

2.成品質量控制

產品包裝完成后，質檢人員根據試劑的批號、實際包裝量、抽樣申請單的要求進行抽樣，同時填寫抽樣數量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數量應包括檢驗用數量和留樣數量。質檢人員同時應檢查相關原始記錄。

每一批酶聯免疫診斷試劑報批批量應至少為10000人份。（1）成品檢驗

成品檢驗時，一般使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化后的企業參考品，并達到相應質量要求。若該診斷試劑沒有國家標準品（參考品），則使用企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

（2）穩定性試驗

在批放行前，每一批試劑應完成37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產品的質量標準。

四、名詞解釋

酶聯免疫法：是指在酶標板上包被特定的抗原（和/或抗體）后，利用直接或間接的方法與待測樣品中的相關抗體（和/或抗原）反應，形成的抗原抗體復合物再與相應的酶標記的抗體和/或抗原進一步反應，經過酶催化底物發生顯色反應，由形成的顏色的強弱來判斷樣本中相應的抗體和/或抗原的存在。

五、參考文獻：

1.《中國生物制品規程》（2000年版），化學工業出版社

第四篇：食品中玉米赤霉烯酮的快速檢測 膠體金免疫層析法（KJ201913）

附件13

食品中玉米赤霉烯酮快速檢測

膠體金免疫層析法

(KJ201913)

1.范圍

本標準規定了食品中玉米赤霉烯酮快速檢測膠體金免疫層析法。

本標準適用玉米、小麥及其碾磨加工品中玉米赤霉烯酮快速篩選測定。

第一法

比色法

2.原理

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的玉米赤霉烯酮經提取后與膠體金標記的特異性抗體結合，抑制抗體和試紙條中檢測線（T線）上的抗原結合，從而導致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線（T線）與控制線（C線）顏色深淺的比較，對樣品中玉米赤霉烯酮進行結果判定。

3.試劑及材料

除另有規定外，本方法所用試劑均為分析純，試驗用水為GB/T

6682規定的二級水。

3.1.試劑

3.1.1.乙腈。

3.1.2.甲醇+水（7+3，體積比）。

3.1.3.稀釋緩沖液（膠體金免疫層析檢測試劑盒專用提取液或根據產品使用說明書配置）。

3.2.參考物質

玉米赤霉烯酮的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見表1，純度≥95%。

表1

玉米赤霉烯酮參考物質的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量

中文名稱

英文名稱

CAS登錄號

分子式

相對分子量

玉米赤霉烯酮

Zearalenone

17924-92-4

C18H22O5

318.36

注：或等同可溯源物質。

3.3.標準溶液的配制

3.3.1.標準儲備液：稱取適量標準品，用乙腈（3.1.1）溶解，配制成濃度為100

μg/mL的標準儲備液。﹣18

℃避光保存，有效期6個月。

3.3.2.標準工作液：準確量取標準儲備液（100

μg/mL）（3.3.1）100

μL，置于10

mL容量瓶中，用乙腈（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1

μ稀/mL的玉米赤霉烯酮標準工作液，2

℃～8

℃避光保存，有效期1個月。

3.4.材料

玉米赤霉烯酮膠體金免疫層析試劑盒，適用基質為玉米、小麥及其碾磨加工品。

4.儀器和設備

4.1.移液器：100

μL、200

μL、1

mL和5

mL。

4.2.旋渦混合器。

4.3.離心機。

4.4.電子天平：感量為0.01

g。

5.環境條件

環境溫度：20

℃～30

℃。

空氣相對濕度：最佳測定濕度45

%～65

%。若濕度低于45

%，相應延長待測液-試紙條反應時間，以質控實驗為準；若濕度為65

%～80

%，微孔與試紙條拆開后立即使用，避免微孔與試紙條長時間暴露在空氣中受潮；避免在濕度80

%以上濕度進行實驗。

6.分析步驟

6.1.試樣制備

按GB

5491扦取的樣品充分碾磨或粉碎混勻，過40目篩。

6.2.提取

準確稱取試樣5.0

g（精確至0.01

g）于50

mL離心管中，加入20

mL

甲醇+水溶液（3.1.2），用旋渦混合器振蕩3

min，離心分層或靜置分層，上清液備用。

準確移取0.8

mL稀釋緩沖液（3.1.3）于1.5

mL離心管中，加入25

μL上清液，混勻，待檢。

6.3.測定步驟

依檢驗所需，取相應數量的金標微孔和試紙條，做好標記。吸取待檢液200

μL于金標微孔中，抽吸至孔底的紫紅色顆粒完全溶解，孵育10

min。將試紙條插入金標微孔中，反應3

min～5

min。

從金標微孔中取出試紙條，棄去試紙條下端的樣品墊，觀察顯色情況，進行結果判定。（若試劑盒冷藏保存，使用前需恢復至實驗環境溫度。）

7.質控試驗

每批樣品應同時進行空白試驗和陽性質控試驗，可根據檢測樣品量制定適宜頻次的質控試驗。

7.1.空白試驗

7.1.1.試劑空白試驗：除不稱取試樣外，均按6.2和6.3所述步驟操作。

7.1.2.基質空白試驗：準確稱取空白試樣，按6.2和6.3所述步驟操作。

7.2.陽性質控試驗

準確稱取玉米赤霉烯酮含量為60

μg/kg的質控樣，按6.2和6.3步驟操作。或準確稱取空白試樣，加入一定體積的玉米赤霉烯酮標準工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量為60

μg/kg，按6.2和6.3步驟操作。

8.結果判定

通過對比控制C線和檢測T線的顏色深淺進行結果判定。

8.1.無效結果

無論樣品中有無玉米赤霉烯酮存在，控制C線均會出現一條紫紅色條帶。若C線未顯色，表明操作不正確或試紙條已失效，檢測結果無效（見圖1）。

無效

圖1

試紙條目視判定圖

8.2.陽性結果

控制C線顯色，檢測T線顯色比C線淺或者沒有顏色，判定為陽性（見圖2）。

8.3.陰性結果

控制C線顯色，檢測T線顯色比C線深或者一致，判定為陰性（見圖2）。

比色法

圖2

試紙條目視判定圖

8.4.質控試驗要求

空白試驗結果應為陰性，陽性質控試驗結果應為陽性。

第二法

消線法

9.原理

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的玉米赤霉烯酮經提取后與膠體金標記的特異性抗體結合，抑制抗體和試紙條中檢測線（T線）上的抗原結合，從而導致檢測線顏色深淺的變化。通過T線顯色與否進行結果判定。

10.試劑及材料

同3。

11.儀器和設備

同4。

12.環境條件

環境溫度：10

℃～40

℃。

空氣相對濕度：同5。

13.分析步驟

13.1.試樣制備

同6.1。

13.2.提取

準確稱取試樣5.0

g（精確至0.01

g）于50

mL離心管中，加入12.5

mL甲醇+水溶液（3.1.2），用旋渦混合器振蕩3

min，離心分層或靜置分層，上清液備用。

準確移取400

μL稀釋緩沖液（3.1.3）于1.5

mL離心管中，加入上清液(小麥50

μL，玉米80

μL），混勻，待測。

13.3.測定步驟

同6.3。

14.質控試驗

每批樣品應同時進行空白試驗和陽性質控試驗，可根據檢測樣品量制定適宜頻次的質控試驗。

14.1.空白試驗

14.1.1.試劑空白試驗：除不稱取試樣外，均按13.2和13.3所述步驟操作。

14.1.2.基質空白試驗：準確稱取空白試樣，按13.2和13.3所述步驟操作。

14.2.陽性質控試驗

準確稱取玉米赤霉烯酮含量為60

μg/kg的質控樣，按13.2和13.3步驟操作。或準確稱取空白試樣，加入一定體積的玉米赤霉烯酮標準工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量為60

μg/kg，按13.2和13.3步驟操作。

15.結果判定

通過觀察檢測T線顯色與否進行結果判定。

15.1.無效

同8.1

15.2.陽性結果

控制C線顯色，檢測T線不顯色，判定為陽性（見圖3）。

15.3.陰性結果

控制C線顯色，檢測T線顯色，判定為陰性（見圖3）。

消線法

圖3

試紙條目視判定圖

16.質控試驗要求

同8.4

第三法

讀數儀法

17.具體檢測步驟及結果判定可參考相應的說明書操作，質控試驗參照第一法與第二法。

18.結論

本方法篩查出的陽性樣品進行確認時，應按GB

2761指定方法標準檢測并判定。

19.性能指標

19.1.檢出限

μg/kg。

19.2.靈敏度

靈敏度≥95%。

19.3.特異性

特異性≥90%。

19.4.假陰性

假陰性≤5%。

19.5.假陽性

假陽性≤10%。

注：性能指標計算方法見附錄A。

20.其他

本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為了方便方法使用者，在使用本方法時不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進行考察，滿足本方法規定的各項性能指標時方可使用。

本方法參比標準為GB

5009.209-2016

食品安全國家標準食品中玉米赤霉烯酮的測定。

附錄A

快速檢測方法性能指標計算表

樣品情況a

檢測結果b

總數

陽性

陰性

陽性

N11

N12

N1.=N11+N12

陰性

N21

N22

N2.=N21+N22

總數

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

顯著性差異（c2）

c2=（?N12-N21?-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1

靈敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特異性（p-，%）

p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-靈敏度

假陽性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特異性

相對準確度，%c

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：

a樣品中實際的公議值結果；

b由玉米赤霉烯酮膠體金試紙條檢驗方法得到的結果。靈敏度的計算使用確認后的結果。

N：任何特定單元的結果數，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C為方法的檢測結果相對準確性的結果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價。

本方法起草單位：成都市食品藥品檢驗研究院。

本方法參與單位：江南大學、國家糧食局科學研究院、廣東省食品檢驗所、山東省食品藥品檢驗研究院、浙江省食品藥品檢驗研究院。

本方法主要起草人：肖全偉、姚蕾珺、王昕、張敏、胥傳來、田洪蕓、沈泓、周露

第五篇：WB03 酶聯免疫法快速檢測牛乳中的三聚氰胺操作視頻配音稿概要

農產品與食品質量檢測技術教學資源庫

酶聯免疫法快速檢測牛乳中的三聚氰胺操作視頻配音稿

準備好物品后即可進行檢測操作，首先進行樣品處理。取1mL純牛奶樣本，加入一根小試管，再加1mL去離子水，渦動1min混勻；取出40μL牛奶溶液，加入另一根小試管，再加入960μL樣本稀釋液稀釋，渦動1min混勻。

接下來，吸取50μL牛奶樣本到微孔中，做2孔平行，并記錄所在位置。再取三聚氰胺標準品各50μL到微孔中，也做2孔平行，并記錄所在位置。然后，每孔各加50μL酶標物，每孔再加入抗試劑50μL，輕輕振蕩均勻，用蓋板膜蓋板，置25℃避光環境中反應30min。

取出微孔板，小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，每孔加入洗滌液250μL，充分洗滌4次，每次間隔10s，用吸水紙拍干。接下來各孔加入底物液A液50μL，再每孔加入底物液B液50μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，置25℃避光環境反應15～20min。取出微孔板，每孔加入終止液50μL，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值。

測定完成后我們得到了三聚氰胺標品和樣本的吸光度平均值，如表格所示。首先進行三聚氰胺的定性分析，根據樣本的吸光度值1.870，可以得出它的三聚氰胺濃度范圍為1ppb-3ppb，再乘以稀釋倍數50得出此純牛奶中三聚氰胺的濃度為50ppb-150ppb。

接著我們進行三聚氰胺的定量分析，先計算百分吸光率和三聚氰胺濃度的對數，如表格中所示。

然后，以標準品百分吸光率為縱坐標，三聚氰胺標準品濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準曲線，如圖所示。將樣本的百分吸光率帶入標準曲線的公式中，計算出樣本所對應的濃度為1.77ppb，乘以稀釋倍數50得到樣本中三聚氰胺實際殘留量為88.5ppb。