第一篇：酶聯(lián)免疫法檢測蝦中的呋喃唑酮

酶聯(lián)免疫法檢測蝦中的呋喃唑酮代謝物

摘要建立養(yǎng)殖蝦類中 AOZ殘留 ELISA篩選方法。方法: 酸性條件下利用 2-硝基苯甲醛衍生化, 乙酸乙酯提取, 正己烷去雜質(zhì)后進(jìn)行 ELISA分析。結(jié)果: 方法最低檢測限為 013 Lg/kg, 向樣品中添加濃度為 015、110和 310Lg/kg3個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)品溶液時(shí),平均回收率范圍為 9017% ~ 9519%, RSD 為 4124% ~ 5142%。結(jié)論: 實(shí)驗(yàn)證明該方法適合養(yǎng)殖蝦類中 AOZ殘留篩選。

關(guān)鍵詞：蝦肉;呋喃唑酮代謝物;ELISA

一、前言

呋喃唑酮（FZD）,又名痢特靈,是一種廣譜抗菌藥物，屬于硝基呋喃類藥物，是人工合成的化學(xué)藥。常被摻放在飼料中，用于水產(chǎn)品養(yǎng)殖傳染病的預(yù)防與治療[1]。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，呋喃唑酮在動(dòng)物體內(nèi)的代謝非常快，現(xiàn)已明確此類抗生素的原型在體內(nèi) 4 d 后，就已完全分解成其代謝物，所以分析呋喃唑酮時(shí)，只能分析其代謝物[2]。經(jīng)研究表明，呋喃唑酮的代謝物中有相當(dāng)數(shù)量是以其完整側(cè)鏈 3-氨基-2-惡唑烷酮即 AOZ 與蛋白結(jié)合的殘留物形式存在, AOZ 進(jìn)一步代謝可產(chǎn)生具致癌、致突變作用的羥乙基肼[3]，因此檢測呋喃唑酮代謝物(AOZ)的殘留更具有現(xiàn)實(shí)意義。呋喃唑酮在畜產(chǎn)品和水產(chǎn)品中的殘留，通過食物鏈傳遞給人類,會(huì)使人體受到損害。另外,其作為人畜共用藥，長期微量攝入易使人體產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致呋喃唑酮藥物失去醫(yī)療功效[4]。

1990 年 7 月歐盟頒布 2377/90/EEC 條例，將硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物列為 A 類禁用藥物，規(guī)定其在動(dòng)物源性食品中的殘留檢測限為 1.0 μg/kg。由于對呋喃唑酮蛋白結(jié)合態(tài)殘留物的安全性產(chǎn)生懷疑，自1995 年起歐盟、日本、美國等都開始禁止這類抗菌劑在食用的畜禽及水產(chǎn)動(dòng)物中使用，并嚴(yán)格執(zhí)行對輸入的食用魚，蝦及禽類進(jìn)行殘留檢測[5]。同許多國家一樣，我國農(nóng)業(yè)部制訂的 NY5070-2002《無公害食品水產(chǎn)品中魚藥殘留限量》及 GB18406.4-2001《無公害水產(chǎn)品安全要求》規(guī)定，水產(chǎn)品中不得檢出呋喃唑酮，同時(shí)禁 止在飼料中添加[6]。目前呋喃唑酮在食品中殘留的監(jiān)測方法主要有高效液相色譜法[7-8]、酶聯(lián)免疫法[9]、分光光度法、原子吸收法[10]等，酶聯(lián)免疫法已受到廣泛重視。本試驗(yàn)主要 使用酶聯(lián)免疫法對出口蝦中呋喃唑酮代謝物AOZ 的殘留做快速檢測。

福建省詔安縣海利水產(chǎn)有限公司，是一家集水產(chǎn)品加工、銷售、研究、開發(fā)和養(yǎng)殖于一體的大型出口企業(yè)。該公司于2005年引進(jìn)投建，廠房和生產(chǎn)布局按照《出口食品生產(chǎn)企業(yè)衛(wèi)生注冊登記管理規(guī)定》和美國FDA法規(guī)及歐盟指令進(jìn)行設(shè)計(jì)建造，廠區(qū)占地面積八萬平方米，全封閉配套中央空調(diào)的水產(chǎn)加工車間二萬平方米，生產(chǎn)車間配套高效臭氧殺菌設(shè)施，制冷水機(jī)和大型制冰機(jī)等各種先進(jìn)加工設(shè)備，凍庫儲(chǔ)存能力達(dá)6000噸，同時(shí)配套建設(shè)大型對蝦養(yǎng)殖場及蝦苗孵化場，擁有一支高素質(zhì)員工隊(duì)伍，年加工生產(chǎn)水產(chǎn)品15000噸以上，產(chǎn)品近二十種，主要有凍生蝦、凍熟蝦、凍面包蝦、壽司蝦、凍魷魚、凍羅非魚等。公司秉承共同發(fā)展的目標(biāo)，不斷完善質(zhì)量管理體系，執(zhí)著追求品質(zhì),先后獲得了《衛(wèi)生注冊證書》、《輸美水產(chǎn)品HACCP驗(yàn)證證書》，2005年11月通過了BRC認(rèn)證，2006年1月通過了ISO9001認(rèn)證，2008年通過了歐盟相關(guān)質(zhì)量認(rèn)證，產(chǎn)品獲得了國外消費(fèi)者的肯定和喜歡，遠(yuǎn)銷日本、美國、加拿大、墨西哥和香港等國家和地區(qū)，在國外贏得了市場。公司自建成投產(chǎn)以來，企業(yè)迅速發(fā)展壯大。

1材料與方法

1.1

樣品

均來自福建省海利水產(chǎn)有限公司。

1.2

主要儀器及設(shè)備

MK3 型酶標(biāo)儀: Thermo 公司；Scientz-10 型均質(zhì)機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；ALC.210.4 電子天平:ACCULAB；DRP-9082 型恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；4K15 型高速冷凍離心機(jī)：Sigma公司；HH-w600s 恒溫水箱：山東鄄城新科教學(xué)儀器廠；MS1 Minishaker:IKA；1 000、200、20 μL 微量移液器：GILSON。

1.3

試劑與溶液

呋喃唑酮代謝產(chǎn)物-AOZ 試劑盒：北京望爾生物技術(shù)有限公司；靈敏度為 0.125 μg/kg，包括：AOZ 標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05 ng/mL）、濃縮緩沖液、濃縮提取/洗滌液、衍生試劑、濃縮酶標(biāo)記物、底物溶液、反應(yīng)終止液。正己烷，乙酸乙脂，1 mol/L NaOH，1 mol/L HCl。

1.4方法

1.4.1

樣品處理

蝦去頭去殼，取可食用部分，制成均質(zhì)物。

1.4.2

樣品制備

1）稱取 1 g 已均質(zhì)的樣品于 50 mL 離心管中，依次加入 4 mL 超純水、1.5 mL 1 mol/L HCl，100 μL 衍生試劑，漩渦振蕩 1 min。置 37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中溫育，靜置過夜（約 16 h）。

2）加入 5 mL 原倍緩沖液，0.4 mL 1 mol/L NaOH，5 mL 乙酸乙酯，振蕩混合約 1 min。

3）離心 10 min（3 000 r/min），取 2 mL 上清（乙酸乙酯層）至 10 mL 玻璃管中，于 50 ℃下氮?dú)獯蹈伞?/p>

4）于此玻璃管加入正己烷 1 mL，先將殘留物完全溶解后（若未能完全溶解，可能會(huì)導(dǎo)致回收率降低），再加入 2 mL 原倍萃取/清洗液，振蕩 1 min。

5）將玻璃試管置于 80℃～100℃熱水浴中約 3min，以減少水相與有機(jī)相間的乳化現(xiàn)象。6）離心 10 min（3 000 r/min），吸去上層液（正己烷），棄掉，再吸取下層液（水層）備用。

1.4.3測定

1）將 AOZ 試劑盒從冰箱中拿出，回溫至室溫。

2）取出相應(yīng)數(shù)量的微孔，各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液和待測樣品各做 2 個(gè)平行樣，做好記錄。

3）于適當(dāng)?shù)奈⒖字蟹謩e加入 50 μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液（0，0.05，0.15，0.45，1.35，4.05 ng/mL）。

4）于另外微孔中加入 50 μL 已完成前處理的樣品溶液。

5）再于每一微孔中另再加入 100 μL 已稀釋的酶標(biāo)記物。

6）輕敲盤子四周，使其充分混合后于室溫（25 ℃）下避光靜置溫育 50 min。

7）微孔中的反應(yīng)液甩掉，再將洗液加滿每一微孔后甩掉，重復(fù)洗 3 次。

8）最后一次甩掉后，在吸水紙上拍干。

9）于每一微孔中加入底物溶液 100 μL 后，輕敲盤子四周，使其充分混合。

10）于室溫（25 ℃）下避光靜置溫育 30 min。

11）于每一微孔中加入 100 μL 反應(yīng)終止液。

12）用酶標(biāo)儀于波長 450 nm 下判讀。

1.5

數(shù)據(jù)處理

1）計(jì)算（B/B0）×100 值。用樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值（B）除以零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值（B0）再乘以 100。

2）以（B/B0）×100 值為縱坐標(biāo)，以樣品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)對數(shù)曲線。

3）根據(jù)每個(gè)樣品的 B/B0值就可以從曲線上讀出相對應(yīng)樣品的濃度

2結(jié)果

2.1

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

AOZ 標(biāo)準(zhǔn)品的 ELISA 檢測結(jié)果見表 1。

2.4

試驗(yàn)過程中的注意事項(xiàng)

1）A回溫試劑（20℃-24℃）。B恒溫孵育，避免光線照射。

2）、將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。

3）加入50ul標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品液到各自的微孔中，每個(gè)孔加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)時(shí)注意更換移液器的吸頭。

4)加入50ul酶標(biāo)記物溶液（紅帽）到每一個(gè)微孔底部，充分混合。

5)加入50ul抗體溶液（黑帽）到每一個(gè)微孔底部充分混合，在室溫孵育1小時(shí)，覆蓋上薄膜。

6)倒出孔中的流體將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體。用250ul樣品洗滌緩沖液充入孔中，重復(fù)兩次。

7)加入100ul基質(zhì)/發(fā)色劑到每一微孔中，充分混合并在室溫暗處孵育15分鐘。

8）加入100ul反應(yīng)終止液到每一微孔中，混合好在450nm處測量吸光值以空氣為空白，必須在加入停止液后60分鐘內(nèi)讀取吸光值。

9）試劑盒內(nèi)容物要完全回穩(wěn)后再進(jìn)行操作，否則，會(huì)出現(xiàn)吸光值偏低或沒有吸光值。

10）溫浴時(shí)若室溫太低或太高，請適當(dāng)延長或縮短溫浴時(shí)間，或直接在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

11）加樣品或試劑時(shí)，吸頭請勿接觸微孔。

12）加樣和洗板過程中，要避免微孔間的相互污染。

13）整個(gè)試驗(yàn)過程中，勿使微孔干燥。

結(jié)論

本試驗(yàn)用酶聯(lián)免疫法檢測了海利水產(chǎn)有限公司中呋喃唑酮代謝物 AOZ 的殘留狀況，結(jié)果表明絕大多數(shù)的水產(chǎn)品符合規(guī)定，只有極少數(shù)部分有殘留。用酶聯(lián)免疫法對蝦肉呋喃唑酮代謝物 AOZ 殘留進(jìn)行測定，操作簡易，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，樣品預(yù)處理簡單，作為一種快速篩選手段，在食品工業(yè)中有著廣闊的推廣應(yīng)用前景，尤其在水產(chǎn)品出口企業(yè)中，但酶聯(lián)免疫試劑盒的價(jià)格將是最大的制約因素。

參考文獻(xiàn)：

[1] 景立新,孫武平,楊欽德,等.分光光度法快速測定海蝦中呋喃唑酮?dú)埩袅縖J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2006(5)：547-549

[2] 周新,張欣祥,王磊,等.UPLC-MS/MS 測定魚干中的呋喃唑酮代謝物[J].分析測試學(xué)報(bào),2007,26(9):262-263

[3]許蓓,徐志祥,王鳳俠,等.動(dòng)物性食品中呋喃唑酮代謝物酶聯(lián)免疫檢測方法的研究[J].食品研究與開發(fā),2007,28(12):145-148

[4]羅杰,李健.呋喃唑酮間接競爭 ELISA(ciELISA)檢測法的建立[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2005,3,35(20):213-218

[5]許春蘭,院榕生,劉小根,等.酶聯(lián)技術(shù)在水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物 AOZ 的檢測中的應(yīng)用

[J].食品研究與開發(fā),2007,28(5):124-126

[6]吳富忠, 歐陽立群.水產(chǎn)品中呋喃唑酮、呋喃西林藥物殘留的HPLC 法測定[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,16(7):812-813

[7]艾曉輝，劉長征，羅玉霜，等.水產(chǎn)品中呋喃唑酮含量的高效液相色譜檢測法[J].淡水漁業(yè)，2003，33(1)：8-10

[8]于慧娟，蔡友窮，畢士川，等.高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中呋喃唑酮的殘留量[J].色譜，2005，23(1)：114

[9] 沈美羅,宋紅波,耿雪冰，等.酶聯(lián)免疫法測定水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物 AOZ 的殘留[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2006，30(4)：520-524

[10] 焦更生，曹會(huì)蘭.原子吸收法間接測定呋喃唑酮[J].分析試驗(yàn)室,2006,25(8):88-90

第二篇：酶聯(lián)免疫法檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則

附件1

酶聯(lián)免疫法檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則

一、前言

本指導(dǎo)原則主要針對酶聯(lián)免疫類檢測試劑的主要原材料、生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系、產(chǎn)品質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)提出指導(dǎo)性技術(shù)要求。

本指導(dǎo)原則系對酶聯(lián)免疫法檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品特性確定其中的具體內(nèi)容是否適用，若不適用，需詳細(xì)闡述其理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制訂的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善、科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其相關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時(shí)的調(diào)整。

二、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于有關(guān)病原微生物檢測的第三類體外診斷試劑的注冊技術(shù)審查。其他酶聯(lián)免疫法檢測試劑（如作為二類管理的體外診斷試劑）可參考本指導(dǎo)原則執(zhí)行。

三、基本要求

（一）基本原則

1.研制、生產(chǎn)用的各種原料、輔料等應(yīng)制定其相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求。— 2 — 2.試劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具備相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員、儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境，獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》；同時(shí)，應(yīng)按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實(shí)施細(xì)則（試行）》的要求建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系，形成文件和記錄，加以實(shí)施并保持有效運(yùn)行；還應(yīng)通過《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》的考核。企業(yè)應(yīng)對試劑的使用范圍做出明確規(guī)定，并經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)。

3.診斷試劑的研制應(yīng)當(dāng)按照科學(xué)、規(guī)范的原則，各反應(yīng)條件的選擇和確定應(yīng)符合基本的科學(xué)原理。

4.試劑在研制、生產(chǎn)過程中所用的各種材料及工藝，應(yīng)充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生產(chǎn)和質(zhì)量控制的總體目標(biāo)：保證試劑使用安全、質(zhì)量穩(wěn)定、工藝可控、檢測有效。

（二）原材料質(zhì)量控制 1.主要生物原料

與產(chǎn)品質(zhì)量最密切相關(guān)的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標(biāo)反應(yīng)板、標(biāo)記相關(guān)酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應(yīng)用抗原或抗體、制備校準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品）等。使用前應(yīng)按照工藝要求對這類生物原料進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，以保證其達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn)，其工藝必須相對穩(wěn)定；若購買，其供應(yīng)商要求相對固定，不能隨意變更供應(yīng)商，如果主要原料（包括工藝）或其供應(yīng)商有變更，應(yīng)依據(jù)國家相關(guān)法規(guī)的要求進(jìn)行變更申請。

主要生物原料的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目一般包括：（1）外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒；或者為白色粉末，不含其他顏色的雜質(zhì)；特殊生

— 3 — 物原料應(yīng)具備相應(yīng)外觀標(biāo)準(zhǔn)。

（2）純度和分子量

主要經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進(jìn)行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據(jù)所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進(jìn)行電泳，一般每個(gè)電泳道加樣量為5μg，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍(lán)染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，分子量大小應(yīng)在正確的條帶位臵。

（3）蛋白濃度

蛋白濃度可通過Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲法或其他適宜的方法進(jìn)行檢測。

（4）效價(jià)

效價(jià)的測定一般根據(jù)蛋白含量測定結(jié)果，通過倍比稀釋法進(jìn)行。效價(jià)應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求。

（5）功能性實(shí)驗(yàn)

功能性實(shí)驗(yàn)是指生物原料用于試劑盒實(shí)際生產(chǎn)中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等，并比較其與上批次原料的相關(guān)性。

2.生物輔料

生物輔料一般指在生產(chǎn)過程中作為蛋白保護(hù)劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合2000年版的《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。建議作以下檢驗(yàn)：

（1）牛血清或羊血清

外 觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無溶血或異物。無菌試驗(yàn)：將血清直接37℃放臵7天，明亮處觀察，不得出現(xiàn)混濁或— 4 — 沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，蛋白含量≥32mg/ml。

球蛋白含量：取待測血清1ml，采用飽和硫酸銨法進(jìn)行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化鈉溶液，至1ml，用Lowry方法測定，蛋白含量應(yīng)≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外 觀：應(yīng)為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無吸潮，無結(jié)塊，無肉眼可見的其它雜質(zhì)顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，在18?26℃時(shí)，溶解時(shí)間應(yīng)≤15分鐘，pH值應(yīng)為6.5?7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲法，其標(biāo)準(zhǔn)為≥95％。

總蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標(biāo)準(zhǔn)為≥95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的BSA含量，其標(biāo)準(zhǔn)為≥90%。（3）酪蛋白：

應(yīng)符合生產(chǎn)所需的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。（4）標(biāo)記用酶

應(yīng)在產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明示所使用的標(biāo)記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時(shí)應(yīng)根據(jù)不同生產(chǎn)廠家的檢驗(yàn)方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，酶的純度RZ值（OD403nm/OD280nm）應(yīng)大于3.0。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應(yīng)進(jìn)行功能性實(shí)驗(yàn)，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進(jìn)行酶聯(lián)免疫測定，均不能出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。

生物輔料的供應(yīng)商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應(yīng)商。3.化學(xué)原材料

化學(xué)原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，包括外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘?jiān)龋鶓?yīng)符合《中國生物制品主要原輔材

— 5 — 料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（2000年版）》分析純級別的要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。

主要化學(xué)原材料的供應(yīng)商要求相對固定，不得隨意發(fā)生變更。化學(xué)原材料在購入時(shí)，原材料的生產(chǎn)商必須提供該批次化學(xué)原材料的質(zhì)量保證材料和質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告。

4.其他物料（1）酶標(biāo)板 ①外觀

明亮處用肉眼觀察板條的外觀質(zhì)量，如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差，底部有波紋及劃傷等應(yīng)剔除。②吸附能力和精密性 采用合適的方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

一般用一定濃度的正常人免疫球蛋白G(IgG)包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結(jié)合物吸附，通過顯色反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀讀數(shù)，計(jì)算CV值。CV值結(jié)果應(yīng)符合相關(guān)產(chǎn)品的功能性質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，一般批內(nèi)CV≤5％，批間CV≤10％。

（2）液體試劑裝量瓶

包括陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應(yīng)有相應(yīng)的裝量瓶，并建立相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規(guī)格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。

（3）其他材料

包括試劑瓶標(biāo)簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應(yīng)參照國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》和《醫(yī)療器械說明書、標(biāo)簽和包裝標(biāo)識管理規(guī)定》建立相應(yīng)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。— 6 — 5.企業(yè)質(zhì)控品

企業(yè)質(zhì)控品一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性、鉤狀效應(yīng)（hook效應(yīng)）等質(zhì)控樣品，對于定量檢測試劑，還包括線性質(zhì)控品樣品。如該產(chǎn)品具有國家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，應(yīng)使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）進(jìn)行標(biāo)化；若該診斷試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

企業(yè)質(zhì)控品的基質(zhì)應(yīng)與診斷試劑的待測樣品的基質(zhì)基本一致，如待測樣品為血清/血漿，質(zhì)控品基質(zhì)也應(yīng)為血清/血漿。

（三）試劑盒各組分的生產(chǎn)

酶聯(lián)免疫法檢測試劑主要組分的生產(chǎn)包括酶標(biāo)記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標(biāo)反應(yīng)板、分裝及包裝等步驟；并通過產(chǎn)品的半成品檢驗(yàn)和成品檢驗(yàn)兩個(gè)質(zhì)控過程來保證其質(zhì)量符合規(guī)定。

1.各種工作液的配制

酶聯(lián)免疫診斷試劑研制生產(chǎn)過程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰性陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等，對定量檢測試劑，還包括標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn)品）溶液。若陰性、陽性對照或其他液體組分涉及生物安全性問題，制備時(shí)應(yīng)在相應(yīng)的生物安全實(shí)驗(yàn)室完成。

各種工作液在配制過程中應(yīng)嚴(yán)格按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的配方進(jìn)行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻，同時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量檢驗(yàn)并達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后，方可使用或分裝。對于定量檢測試劑，其標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn)品）溶液應(yīng)具有量值溯源性。

應(yīng)對配制過程及配制的液體進(jìn)行的質(zhì)量控制，主要包括酶結(jié)合物的

— 7 — 功能性實(shí)驗(yàn)及穩(wěn)定性；各種溶液的外觀、pH值等；酶作用底物應(yīng)測定在無相應(yīng)酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標(biāo)；終止液應(yīng)對其終止酶促反應(yīng)的能力進(jìn)行測定。

2.包被酶標(biāo)反應(yīng)板

包被前應(yīng)對酶標(biāo)反應(yīng)板進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標(biāo)反應(yīng)板的批號、數(shù)量、標(biāo)識。酶標(biāo)反應(yīng)板經(jīng)檢驗(yàn)合格后方能用于包被。不同批號的板條不能混用。

選擇經(jīng)檢驗(yàn)合格的包被原料（如抗原、抗體等），經(jīng)一定的方法確定最佳包被濃度和酶結(jié)合物工作濃度，按照診斷試劑的生產(chǎn)規(guī)程，配制包被緩沖液、封閉液，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，包被酶標(biāo)反應(yīng)板，經(jīng)干燥后，已包被的酶標(biāo)反應(yīng)板用鋁箔紙封閉（內(nèi)臵干燥劑），保存于2?8℃。

應(yīng)對包被過程進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質(zhì)量檢驗(yàn)、包被液和封閉液的質(zhì)控（如配方、外觀、pH值）、包被過程的監(jiān)控（包括包被和封閉的體積、溫度、時(shí)間等）、包被均一性檢驗(yàn)、干燥過程的監(jiān)控等。

3.分裝和包裝

樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應(yīng)嚴(yán)格按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的量進(jìn)行過濾后再分裝，分裝量的誤差應(yīng)小于5%。

分裝及包裝均應(yīng)按照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程要求進(jìn)行。包裝前，應(yīng)嚴(yán)格檢查試劑盒的品名、批號等，核對各試劑盒各組分的數(shù)量，并在關(guān)盒前進(jìn)行復(fù)核。

（四）質(zhì)量控制 1.半成品質(zhì)量控制（1）半成品抽樣

檢驗(yàn)人員按試劑的批號，根據(jù)抽樣申請單抽取規(guī)定數(shù)量的半成品各— 8 — 組分，作號標(biāo)記、待檢。

（2）半成品檢驗(yàn)

根據(jù)試劑盒的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或者制檢規(guī)程進(jìn)行半成品的檢驗(yàn)。半成品檢驗(yàn)，一般使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）或經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）標(biāo)化后的企業(yè)參考品。若某類試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

檢驗(yàn)指標(biāo)一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。對于精密性，一般情況下CV不得高于15％（采用競爭抑制法的診斷試劑CV不得高于20％）。對定量檢測試劑，同時(shí)應(yīng)分析其線性相關(guān)系數(shù)和定量質(zhì)控品檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

企業(yè)應(yīng)該對每一批試劑的半成品進(jìn)行穩(wěn)定性研究。試劑盒各組分應(yīng)留樣，2?8℃定期作穩(wěn)定性考核，同時(shí)作37℃熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)符合產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.成品質(zhì)量控制

產(chǎn)品包裝完成后，質(zhì)檢人員根據(jù)試劑的批號、實(shí)際包裝量、抽樣申請單的要求進(jìn)行抽樣，同時(shí)填寫抽樣數(shù)量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數(shù)量應(yīng)包括檢驗(yàn)用數(shù)量和留樣數(shù)量。質(zhì)檢人員同時(shí)應(yīng)檢查相關(guān)原始記錄。

每一批酶聯(lián)免疫類檢測試劑的試生產(chǎn)量應(yīng)滿足工藝研究、分析性能驗(yàn)證、穩(wěn)定性研究、臨床試驗(yàn)、自測及注冊檢驗(yàn)等各階段所需樣品量的要求。

（1）成品檢驗(yàn)

成品檢驗(yàn)時(shí)，一般使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）或經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）標(biāo)化后的企業(yè)參考品，并達(dá)到相應(yīng)質(zhì)量要求。若該診斷試劑沒有國家

— 9 — 標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)

在批放行前，每一批試劑應(yīng)完成37℃熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)符合產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

四、名詞解釋

酶聯(lián)免疫法：是指在酶標(biāo)板上包被特定的抗原（和/或抗體）后，利用直接或間接的方法與待測樣品中的相關(guān)抗體（和/或抗原）反應(yīng)，形成的抗原抗體復(fù)合物再與相應(yīng)的酶標(biāo)記的抗體和/或抗原進(jìn)一步反應(yīng)，經(jīng)過酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，由形成的顏色的強(qiáng)弱來判斷樣本中相應(yīng)的抗體和/或抗原的存在。

五、參考文獻(xiàn)：

1.《中國生物制品規(guī)程》（2000年版），化學(xué)工業(yè)出版社

— 10 —

第三篇：酶聯(lián)免疫法檢測試劑主要原材料、生產(chǎn)工藝及質(zhì)量控制注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則(報(bào)批稿)

酶聯(lián)免疫法檢測試劑主要原材料、生產(chǎn)工藝及質(zhì)量控制注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則（報(bào)批稿）

2010-11-09 01:27

酶聯(lián)免疫法檢測試劑主要原材料、生產(chǎn)工藝及 質(zhì)量控制注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則（報(bào)批稿）

一、前言

本指導(dǎo)原則的主要目的是規(guī)范申請人對酶聯(lián)免疫類檢測試劑的主要原材料研究資料、生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究資料的準(zhǔn)備，并對產(chǎn)品質(zhì)量控制提出指導(dǎo)性技術(shù)要求。

本指導(dǎo)原則系對酶聯(lián)免疫法檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品特性確定其中的具體內(nèi)容是否適用，若不適用，需詳細(xì)闡述其理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其它方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制訂的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時(shí)的調(diào)整。

二、適用范圍 本指導(dǎo)原則適用于有關(guān)病原微生物檢測的第三類體外診斷試劑的注冊技術(shù)審查，其它酶聯(lián)免疫法檢測試劑（如作為二類管理的體外診斷試劑）可參考本指導(dǎo)原則執(zhí)行。

三、基本要求

（一）基本原則

1.研制、生產(chǎn)用的各種原料、輔料等應(yīng)制定其相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求。

2.試劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具備相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員、儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境，獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》；同時(shí)，應(yīng)按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實(shí)施細(xì)則（試行）》的要求建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系，形成文件和記錄，加以實(shí)施并保持有效運(yùn)行；還應(yīng)通過《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》的考核。企業(yè)應(yīng)對試劑的使用范圍做出明確規(guī)定，并經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)。

3.診斷試劑的研制應(yīng)當(dāng)按照科學(xué)、規(guī)范的原則，各反應(yīng)條件的選擇和確定應(yīng)符合基本的科學(xué)原理。

4.試劑在研制、生產(chǎn)過程中所用的各種材料及工藝，應(yīng)充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生產(chǎn)和質(zhì)量控制的總體目標(biāo)：保證試劑使用安全、質(zhì)量穩(wěn)定、工藝可控、檢測有效。

（二）原材料質(zhì)量控制 1.主要生物原料 與產(chǎn)品質(zhì)量最密切相關(guān)的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標(biāo)反應(yīng)板、標(biāo)記相關(guān)酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應(yīng)用抗原或抗體、制備校準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品）等。使用前應(yīng)按照工藝要求對這類生物原料進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，以保證其達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn)，其工藝必須相對穩(wěn)定；若購買，其供應(yīng)商要求相對固定，不能隨意變更供應(yīng)商，如果主要原料（包括工藝）或其供應(yīng)商有變更，應(yīng)依據(jù)國家相關(guān)法規(guī)的要求進(jìn)行變更申請。

主要生物原料的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目一般包括：（1）外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒；或者為白色粉末，不含其他顏色的雜質(zhì)；特殊生物原料應(yīng)具備相應(yīng)外觀標(biāo)準(zhǔn)。

（2）純度和分子量

主要經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進(jìn)行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據(jù)所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進(jìn)行電泳，一般每個(gè)電泳道加樣量為5μg，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍(lán)染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，分子量大小應(yīng)在正確的條帶位臵。

（3）蛋白濃度 蛋白濃度可通過Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲法或其他適宜的方法進(jìn)行檢測。

（4）效價(jià)

效價(jià)的測定一般根據(jù)蛋白含量測定結(jié)果，通過倍比稀釋法進(jìn)行。效價(jià)應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求。

（5）功能性實(shí)驗(yàn)

功能性實(shí)驗(yàn)是指生物原料用于試劑盒實(shí)際生產(chǎn)中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等，并比較其與上批次原料的相關(guān)性。

2.生物輔料

生物輔料一般指在生產(chǎn)過程中作為蛋白保護(hù)劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合2000年版的《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。建議作以下檢驗(yàn)：

（1）牛血清或羊血清

外 觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無溶血或異物 無菌試驗(yàn)：將血清直接37℃放臵7天，明亮處觀察，不得出現(xiàn)混濁或沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，蛋白含量≥32mg/ml。球蛋白含量：取待測血清1ml，采用飽和硫酸銨法進(jìn)行沉淀，沉淀溶于0.85%NaCl溶液，至1ml，用Lowry方法測定，蛋白含量應(yīng)≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外 觀：應(yīng)為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無吸潮，無結(jié)塊，無肉眼可見的其它雜質(zhì)顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，在18?26℃時(shí)，溶解時(shí)間應(yīng)≤15分鐘，pH值應(yīng)為6.5?7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲法，其標(biāo)準(zhǔn)為≥95％。

總蛋白中的BSA含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標(biāo)準(zhǔn)為≥95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的BSA含量，其標(biāo)準(zhǔn)為≥90%。

（3）酪蛋白：

應(yīng)符合生產(chǎn)所需的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。（4）標(biāo)記用酶

應(yīng)在產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明示所使用的標(biāo)記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時(shí)應(yīng)根據(jù)不同生產(chǎn)廠家的檢驗(yàn)方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，酶的純度RZ值（OD403nm/OD280nm）應(yīng)大于3.0。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應(yīng)進(jìn)行功能性實(shí)驗(yàn)，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進(jìn)行酶聯(lián)免疫測定，均不能出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。

生物輔料的供應(yīng)商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應(yīng)商。3.化學(xué)原材料

化學(xué)原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，包括外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘?jiān)龋鶓?yīng)符合《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（2000年版）》分析純級別的要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。

主要化學(xué)原材料的供應(yīng)商要求相對固定，不得隨意發(fā)生變更。化學(xué)原材料在購入時(shí)，原材料的生產(chǎn)商必須提供該批次化學(xué)原材料的質(zhì)量保證材料和質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告。

4.其他物料（1）酶標(biāo)板 ①外觀

明亮處用肉眼觀察板條的外觀質(zhì)量，如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差，底部有波紋及劃傷等應(yīng)剔除。

②吸附能力和精密性 采用合適的方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

一般用一定濃度的正常人IgG包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結(jié)合物吸附，通過顯色反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀讀數(shù)，計(jì)算CV值。CV值結(jié)果應(yīng)符合相關(guān)產(chǎn)品的功能性質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，一般批內(nèi)CV≤5％，批間CV≤10％。

（2）液體試劑裝量瓶

包括陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應(yīng)有相應(yīng)的裝量瓶，并建立相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規(guī)格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。

（3）其他材料

包括試劑瓶標(biāo)簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應(yīng)參照國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》和《醫(yī)療器械說明書、標(biāo)簽和包裝標(biāo)識管理規(guī)定》建立相應(yīng)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

5.企業(yè)質(zhì)控品

企業(yè)質(zhì)控品一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性、hook效應(yīng)等質(zhì)控樣品，對于定量檢測試劑，還包括線性質(zhì)控品樣品。如該產(chǎn)品具有國家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，應(yīng)使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）進(jìn)行標(biāo)化；若該診斷試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

企業(yè)質(zhì)控品的基質(zhì)應(yīng)與診斷試劑的待測樣品的基質(zhì)基本一致，如待測樣品為血清/血漿，質(zhì)控品基質(zhì)也應(yīng)為血清/血漿。

（三）試劑盒各組分的生產(chǎn)

酶聯(lián)免疫法檢測試劑主要組分的生產(chǎn)包括酶標(biāo)記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標(biāo)反應(yīng)板、分裝及包裝等步驟；并通過產(chǎn)品的半成品檢驗(yàn)和成品檢驗(yàn)兩個(gè)質(zhì)控過程來保證其質(zhì)量符合規(guī)定。1.各種工作液的配制

酶聯(lián)免疫診斷試劑研制生產(chǎn)過程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰性陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等，對定量檢測試劑，還包括標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn)品）溶液。若陰性、陽性對照或其他液體組分涉及生物安全性問題，制備時(shí)應(yīng)在相應(yīng)的生物安全實(shí)驗(yàn)室完成。

各種工作液在配制過程中應(yīng)嚴(yán)格按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的配方進(jìn)行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻，同時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量檢驗(yàn)并達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后，方可使用或分裝。對于定量檢測試劑，其標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn)品）溶液應(yīng)具有量值溯源性。

應(yīng)對配制過程及配制的液體進(jìn)行的質(zhì)量控制，主要包括酶結(jié)合物的功能性實(shí)驗(yàn)及穩(wěn)定性；各種溶液的外觀、pH值等；酶作用底物應(yīng)測定在無相應(yīng)酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標(biāo)；終止液應(yīng)對其終止酶促反應(yīng)的能力進(jìn)行測定。

2.包被酶標(biāo)反應(yīng)板

包被前應(yīng)對酶標(biāo)反應(yīng)板進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標(biāo)反應(yīng)板的批號、數(shù)量、標(biāo)識。酶標(biāo)反應(yīng)板經(jīng)檢驗(yàn)合格后方能用于包被。不同批號的板條不能混用。

選擇經(jīng)檢驗(yàn)合格的包被原料（如抗原、抗體等），經(jīng)一定的方法確定最佳包被濃度和酶結(jié)合物工作濃度，按照診斷試劑的生產(chǎn)規(guī)程，配制包被緩沖液、封閉液，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，包被酶標(biāo)反應(yīng)板，經(jīng)干燥后，已包被的酶標(biāo)反應(yīng)板用鋁箔紙封閉（內(nèi)臵干燥劑），保存于2?8℃。

應(yīng)對包被過程進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質(zhì)量檢驗(yàn)、包被液和封閉液的質(zhì)控（如配方、外觀、pH值）、包被過程的監(jiān)控（包括包被和封閉的體積、溫度、時(shí)間等）、包被均一性檢驗(yàn)、干燥過程的監(jiān)控等。

3.分裝和包裝

樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應(yīng)嚴(yán)格按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的量進(jìn)行過濾后再分裝，分裝量的誤差應(yīng)小于5%。

分裝及包裝均應(yīng)按照相應(yīng)的SOP要求進(jìn)行。包裝前，應(yīng)嚴(yán)格檢查試劑盒的品名、批號等，核對各試劑盒各組分的數(shù)量，并在關(guān)盒前進(jìn)行復(fù)核。

（四）質(zhì)量控制 1.半成品質(zhì)量控制（1）半成品抽樣

檢驗(yàn)人員按試劑的批號，根據(jù)抽樣申請單抽取規(guī)定數(shù)量的半成品各組分，作號標(biāo)記、待檢。

（2）半成品檢驗(yàn)

根據(jù)試劑盒的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或者制檢規(guī)程進(jìn)行半成品的檢驗(yàn)。半成品檢驗(yàn)，一般使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）或經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）標(biāo)化后的企業(yè)參考品。若某類試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

檢驗(yàn)指標(biāo)一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。對于精密性，一般情況下CV不得高于15％（采用競爭抑制法的診斷試劑CV不得高于20％）。對定量檢測試劑，同時(shí)應(yīng)分析其線性相關(guān)系數(shù)和校準(zhǔn)品檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

企業(yè)應(yīng)該對每一批試劑的半成品進(jìn)行穩(wěn)定性研究。試劑盒各組分應(yīng)留樣，2?8℃定期作穩(wěn)定性考核，同時(shí)作37℃熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)符合產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.成品質(zhì)量控制

產(chǎn)品包裝完成后，質(zhì)檢人員根據(jù)試劑的批號、實(shí)際包裝量、抽樣申請單的要求進(jìn)行抽樣，同時(shí)填寫抽樣數(shù)量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數(shù)量應(yīng)包括檢驗(yàn)用數(shù)量和留樣數(shù)量。質(zhì)檢人員同時(shí)應(yīng)檢查相關(guān)原始記錄。

每一批酶聯(lián)免疫診斷試劑報(bào)批批量應(yīng)至少為10000人份。（1）成品檢驗(yàn)

成品檢驗(yàn)時(shí)，一般使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）或經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）標(biāo)化后的企業(yè)參考品，并達(dá)到相應(yīng)質(zhì)量要求。若該診斷試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)

在批放行前，每一批試劑應(yīng)完成37℃熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)符合產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

四、名詞解釋

酶聯(lián)免疫法：是指在酶標(biāo)板上包被特定的抗原（和/或抗體）后，利用直接或間接的方法與待測樣品中的相關(guān)抗體（和/或抗原）反應(yīng)，形成的抗原抗體復(fù)合物再與相應(yīng)的酶標(biāo)記的抗體和/或抗原進(jìn)一步反應(yīng)，經(jīng)過酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，由形成的顏色的強(qiáng)弱來判斷樣本中相應(yīng)的抗體和/或抗原的存在。

五、參考文獻(xiàn)：

1.《中國生物制品規(guī)程》（2000年版），化學(xué)工業(yè)出版社

第四篇：食品中玉米赤霉烯酮的快速檢測 膠體金免疫層析法（KJ201913）

附件13

食品中玉米赤霉烯酮快速檢測

膠體金免疫層析法

(KJ201913)

1.范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中玉米赤霉烯酮快速檢測膠體金免疫層析法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用玉米、小麥及其碾磨加工品中玉米赤霉烯酮快速篩選測定。

第一法

比色法

2.原理

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的玉米赤霉烯酮經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條中檢測線（T線）上的抗原結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線（T線）與控制線（C線）顏色深淺的比較，對樣品中玉米赤霉烯酮進(jìn)行結(jié)果判定。

3.試劑及材料

除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為GB/T

6682規(guī)定的二級水。

3.1.試劑

3.1.1.乙腈。

3.1.2.甲醇+水（7+3，體積比）。

3.1.3.稀釋緩沖液（膠體金免疫層析檢測試劑盒專用提取液或根據(jù)產(chǎn)品使用說明書配置）。

3.2.參考物質(zhì)

玉米赤霉烯酮的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見表1，純度≥95%。

表1

玉米赤霉烯酮參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量

中文名稱

英文名稱

CAS登錄號

分子式

相對分子量

玉米赤霉烯酮

Zearalenone

17924-92-4

C18H22O5

318.36

注：或等同可溯源物質(zhì)。

3.3.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

3.3.1.標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈（3.1.1）溶解，配制成濃度為100

μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。﹣18

℃避光保存，有效期6個(gè)月。

3.3.2.標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100

μg/mL）（3.3.1）100

μL，置于10

mL容量瓶中，用乙腈（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1

μ稀/mL的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液，2

℃～8

℃避光保存，有效期1個(gè)月。

3.4.材料

玉米赤霉烯酮膠體金免疫層析試劑盒，適用基質(zhì)為玉米、小麥及其碾磨加工品。

4.儀器和設(shè)備

4.1.移液器：100

μL、200

μL、1

mL和5

mL。

4.2.旋渦混合器。

4.3.離心機(jī)。

4.4.電子天平：感量為0.01

g。

5.環(huán)境條件

環(huán)境溫度：20

℃～30

℃。

空氣相對濕度：最佳測定濕度45

%～65

%。若濕度低于45

%，相應(yīng)延長待測液-試紙條反應(yīng)時(shí)間，以質(zhì)控實(shí)驗(yàn)為準(zhǔn)；若濕度為65

%～80

%，微孔與試紙條拆開后立即使用，避免微孔與試紙條長時(shí)間暴露在空氣中受潮；避免在濕度80

%以上濕度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

6.分析步驟

6.1.試樣制備

按GB

5491扦取的樣品充分碾磨或粉碎混勻，過40目篩。

6.2.提取

準(zhǔn)確稱取試樣5.0

g（精確至0.01

g）于50

mL離心管中，加入20

mL

甲醇+水溶液（3.1.2），用旋渦混合器振蕩3

min，離心分層或靜置分層，上清液備用。

準(zhǔn)確移取0.8

mL稀釋緩沖液（3.1.3）于1.5

mL離心管中，加入25

μL上清液，混勻，待檢。

6.3.測定步驟

依檢驗(yàn)所需，取相應(yīng)數(shù)量的金標(biāo)微孔和試紙條，做好標(biāo)記。吸取待檢液200

μL于金標(biāo)微孔中，抽吸至孔底的紫紅色顆粒完全溶解，孵育10

min。將試紙條插入金標(biāo)微孔中，反應(yīng)3

min～5

min。

從金標(biāo)微孔中取出試紙條，棄去試紙條下端的樣品墊，觀察顯色情況，進(jìn)行結(jié)果判定。（若試劑盒冷藏保存，使用前需恢復(fù)至實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度。）

7.質(zhì)控試驗(yàn)

每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和陽性質(zhì)控試驗(yàn)，可根據(jù)檢測樣品量制定適宜頻次的質(zhì)控試驗(yàn)。

7.1.空白試驗(yàn)

7.1.1.試劑空白試驗(yàn)：除不稱取試樣外，均按6.2和6.3所述步驟操作。

7.1.2.基質(zhì)空白試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取空白試樣，按6.2和6.3所述步驟操作。

7.2.陽性質(zhì)控試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取玉米赤霉烯酮含量為60

μg/kg的質(zhì)控樣，按6.2和6.3步驟操作。或準(zhǔn)確稱取空白試樣，加入一定體積的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量為60

μg/kg，按6.2和6.3步驟操作。

8.結(jié)果判定

通過對比控制C線和檢測T線的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。

8.1.無效結(jié)果

無論樣品中有無玉米赤霉烯酮存在，控制C線均會(huì)出現(xiàn)一條紫紅色條帶。若C線未顯色，表明操作不正確或試紙條已失效，檢測結(jié)果無效（見圖1）。

無效

圖1

試紙條目視判定圖

8.2.陽性結(jié)果

控制C線顯色，檢測T線顯色比C線淺或者沒有顏色，判定為陽性（見圖2）。

8.3.陰性結(jié)果

控制C線顯色，檢測T線顯色比C線深或者一致，判定為陰性（見圖2）。

比色法

圖2

試紙條目視判定圖

8.4.質(zhì)控試驗(yàn)要求

空白試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陰性，陽性質(zhì)控試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陽性。

第二法

消線法

9.原理

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的玉米赤霉烯酮經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條中檢測線（T線）上的抗原結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。通過T線顯色與否進(jìn)行結(jié)果判定。

10.試劑及材料

同3。

11.儀器和設(shè)備

同4。

12.環(huán)境條件

環(huán)境溫度：10

℃～40

℃。

空氣相對濕度：同5。

13.分析步驟

13.1.試樣制備

同6.1。

13.2.提取

準(zhǔn)確稱取試樣5.0

g（精確至0.01

g）于50

mL離心管中，加入12.5

mL甲醇+水溶液（3.1.2），用旋渦混合器振蕩3

min，離心分層或靜置分層，上清液備用。

準(zhǔn)確移取400

μL稀釋緩沖液（3.1.3）于1.5

mL離心管中，加入上清液(小麥50

μL，玉米80

μL），混勻，待測。

13.3.測定步驟

同6.3。

14.質(zhì)控試驗(yàn)

每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和陽性質(zhì)控試驗(yàn)，可根據(jù)檢測樣品量制定適宜頻次的質(zhì)控試驗(yàn)。

14.1.空白試驗(yàn)

14.1.1.試劑空白試驗(yàn)：除不稱取試樣外，均按13.2和13.3所述步驟操作。

14.1.2.基質(zhì)空白試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取空白試樣，按13.2和13.3所述步驟操作。

14.2.陽性質(zhì)控試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取玉米赤霉烯酮含量為60

μg/kg的質(zhì)控樣，按13.2和13.3步驟操作。或準(zhǔn)確稱取空白試樣，加入一定體積的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量為60

μg/kg，按13.2和13.3步驟操作。

15.結(jié)果判定

通過觀察檢測T線顯色與否進(jìn)行結(jié)果判定。

15.1.無效

同8.1

15.2.陽性結(jié)果

控制C線顯色，檢測T線不顯色，判定為陽性（見圖3）。

15.3.陰性結(jié)果

控制C線顯色，檢測T線顯色，判定為陰性（見圖3）。

消線法

圖3

試紙條目視判定圖

16.質(zhì)控試驗(yàn)要求

同8.4

第三法

讀數(shù)儀法

17.具體檢測步驟及結(jié)果判定可參考相應(yīng)的說明書操作，質(zhì)控試驗(yàn)參照第一法與第二法。

18.結(jié)論

本方法篩查出的陽性樣品進(jìn)行確認(rèn)時(shí)，應(yīng)按GB

2761指定方法標(biāo)準(zhǔn)檢測并判定。

19.性能指標(biāo)

19.1.檢出限

μg/kg。

19.2.靈敏度

靈敏度≥95%。

19.3.特異性

特異性≥90%。

19.4.假陰性

假陰性≤5%。

19.5.假陽性

假陽性≤10%。

注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見附錄A。

20.其他

本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為了方便方法使用者，在使用本方法時(shí)不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進(jìn)行考察，滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)時(shí)方可使用。

本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為GB

5009.209-2016

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中玉米赤霉烯酮的測定。

附錄A

快速檢測方法性能指標(biāo)計(jì)算表

樣品情況a

檢測結(jié)果b

總數(shù)

陽性

陰性

陽性

N11

N12

N1.=N11+N12

陰性

N21

N22

N2.=N21+N22

總數(shù)

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

顯著性差異（c2）

c2=（?N12-N21?-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1

靈敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特異性（p-，%）

p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-靈敏度

假陽性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特異性

相對準(zhǔn)確度，%c

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：

a樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果；

b由玉米赤霉烯酮膠體金試紙條檢驗(yàn)方法得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。

N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C為方法的檢測結(jié)果相對準(zhǔn)確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價(jià)。

本方法起草單位：成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院。

本方法參與單位：江南大學(xué)、國家糧食局科學(xué)研究院、廣東省食品檢驗(yàn)所、山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院、浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院。

本方法主要起草人：肖全偉、姚蕾珺、王昕、張敏、胥傳來、田洪蕓、沈泓、周露

第五篇：WB03 酶聯(lián)免疫法快速檢測牛乳中的三聚氰胺操作視頻配音稿概要

農(nóng)產(chǎn)品與食品質(zhì)量檢測技術(shù)教學(xué)資源庫

酶聯(lián)免疫法快速檢測牛乳中的三聚氰胺操作視頻配音稿

準(zhǔn)備好物品后即可進(jìn)行檢測操作，首先進(jìn)行樣品處理。取1mL純牛奶樣本，加入一根小試管，再加1mL去離子水，渦動(dòng)1min混勻；取出40μL牛奶溶液，加入另一根小試管，再加入960μL樣本稀釋液稀釋，渦動(dòng)1min混勻。

接下來，吸取50μL牛奶樣本到微孔中，做2孔平行，并記錄所在位置。再取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品各50μL到微孔中，也做2孔平行，并記錄所在位置。然后，每孔各加50μL酶標(biāo)物，每孔再加入抗試劑50μL，輕輕振蕩均勻，用蓋板膜蓋板，置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。

取出微孔板，小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，每孔加入洗滌液250μL，充分洗滌4次，每次間隔10s，用吸水紙拍干。接下來各孔加入底物液A液50μL，再每孔加入底物液B液50μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，置25℃避光環(huán)境反應(yīng)15～20min。取出微孔板，每孔加入終止液50μL，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值。

測定完成后我們得到了三聚氰胺標(biāo)品和樣本的吸光度平均值，如表格所示。首先進(jìn)行三聚氰胺的定性分析，根據(jù)樣本的吸光度值1.870，可以得出它的三聚氰胺濃度范圍為1ppb-3ppb，再乘以稀釋倍數(shù)50得出此純牛奶中三聚氰胺的濃度為50ppb-150ppb。

接著我們進(jìn)行三聚氰胺的定量分析，先計(jì)算百分吸光率和三聚氰胺濃度的對數(shù)，如表格中所示。

然后，以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖所示。將樣本的百分吸光率帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式中，計(jì)算出樣本所對應(yīng)的濃度為1.77ppb，乘以稀釋倍數(shù)50得到樣本中三聚氰胺實(shí)際殘留量為88.5ppb。