第一篇：磁敏傳感器競爭免疫法檢測牛奶中的氯霉素殘留量

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磁敏傳感器競爭免疫法檢測牛奶中的氯霉素殘留量

作者：史晶晶 廉潔 周穩穩 石西增 高云華

來源：《分析化學》2012年第10期

摘要：利用直接競爭免疫原理和巨磁致電阻效應，建立了磁敏生物傳感器檢測氯霉素的方法。制備氯霉素半抗原芯片，依次加入待測樣品、生物素化抗體、鏈霉親和素磁顆粒偶聯物，使之發生競爭免疫反應，再利用傳感器檢測芯片上結合的磁顆粒數目。通過對檢測條件的優化，建立了氯霉素濃度與磁顆粒數目的標準工作曲線。本方法的檢測范圍為0.05～100.0 μg/L；檢出限為50 ng/L；用于牛奶檢測，回收率為95.97%～99.36%；批內相對標準偏差為0.8%～3.9%，批間相對標準偏差為1.1%～1.7%；與ELISA方法的一致相關系數達到0.98。本方法可在30 min內快速完成定量檢測，為快速多靶標磁敏競爭免疫檢測體系的建立提供了可行性。

第二篇：水產品中氯霉素的快速檢測 膠體金免疫層析法（KJ201905）

附件5

水產品中氯霉素的快速檢測

膠體金免疫層析法

（KJ201905）

范圍

本方法規定了水產品中氯霉素的膠體金免疫層析快速檢測方法。

本方法適用于水產品中氯霉素的快速測定。

原理

本方法的測定以競爭抑制免疫層析原理為基礎。樣品中的氯霉素經有機試劑提取，固相萃取小柱凈化，濃縮復溶后，氯霉素與膠體金標記的特異性單克隆抗體結合，抑制了抗體和微孔膜檢測線（T線）上抗原的結合，從而導致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線顏色深淺比較，對樣品中氯霉素含量進行定性判定。

試劑和材料

除另有規定外，本方法所用試劑均為分析純，水為

GB/T

6682

規定的二級水。

3.1

試劑

3.1.1

正己烷。

3.1.2

丙酮。

3.1.3

乙酸乙酯。

3.1.4乙腈

3.1.5磷酸二氫鈉，NaH2PO4·2H2O。

3.1.6磷酸氫二鈉，Na2HPO4·12H2O。

3.1.7

氯化鈉

3.1.8

復溶液：稱取0.12

g磷酸二氫鈉

(3.1.5)置于100

mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，制成溶液A；稱取磷酸氫二鈉7.16

g

(3.1.6)置于100

mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，制成溶液B。取溶液A

2.8

mL、溶液B

7.2

mL、氯化鈉(3.1.7)0.85

g，用水溶解并稀釋至100

mL，得磷酸鹽緩沖液，即為復溶液。

3.1.9丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按體積比1：9混勻。

3.1.10丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按體積比6：4混勻。

3.2

標準物質

氯霉素標準物質的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分之式、相對分子質量見表1，純度≥98.6%。

表1

氯霉素參考物質中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質量

中文名稱

英文名稱

CAS登錄號

分子式

相對分子量

氯霉素

Chloramphenicol

56-75-7

C11H12Cl2N2O5

323.13

注：或等同可溯源物質。

3.3標準溶液配制

3.3.1

氯霉素標準儲備液（1

mg/mL）：精密稱取氯霉素標準物質（3.2）10

mg，置于10

mL容量瓶中，用乙腈（3.1.4）溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1

mg/mL的氯霉素標準儲備液。4℃避光保存，有效期6個月。

3.3.2

氯霉素標準中間液A（10

μg/mL）：精密量取氯霉素標準儲備液（1

mg/mL）（3.3.1）0.1

mL，置于10

mL

容量瓶中，用乙腈（3.1.4）稀釋至刻度，搖勻，制成10

μg/mL的氯霉素標準中間液A。4℃避光保存，有效期3個月。

3.3.3

氯霉素標準工作液（0.01

μg/mL）：精密移取氯霉素標準中間液A（10

μg/mL）（3.3.2）0.01

mL分別置于10

mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.01

μg/mL的氯霉素標準工作液。臨用新配。

3.4材料

3.4.1固相萃取小柱：Cleanert

Silica，200

mg/6mL。LOT：0170198。

3.4.2免疫膠體金試劑盒（在2～30℃、干燥陰涼條件下保存，在產品有效期內使用）。

3.4.2.1

金標微孔。

3.4.2.2

試紙條或檢測卡。

儀器和設備

4.1

移液器：200

μL、1

mL和5

mL。

4.2

渦旋混合器。

4.3

離心機：轉速≥4000

r/min。

4.4

電子天平：感量分別為

0.01

mg和

0.01

g。

4.5

樣品濃縮儀：如有需要。

4.6

環境條件：

溫度：15～25℃，相對濕度：≤60%。

5分析步驟

5.1試樣制備

取具有代表性樣品約500

g，充分粉碎混勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為試樣和留樣，密封，標記，于常溫保存。

5.2試樣提取和凈化

準確稱取試樣6

g（精確至0.01

g）置于50

mL具塞離心管中，依次加入1

mL水和8

mL乙酸乙酯（3.1.3），渦旋提取5

min，以4000

r/min離心5

min。轉移全部乙酸乙酯層于50

mL具塞離心管中，加入正己烷25

mL，氯化鈉1

g渦旋混勻，4000

r/min

離心1

min，上清液待凈化。5

mL丙酮-正己烷（1+9）（3.1.9）淋洗LC-Si硅膠小柱，棄去淋洗液，將待凈化溶液轉移到固相萃取小柱上，棄去流出液，用5

mL丙酮-正己烷（6+4）（3.1.10）洗脫，收集洗脫液，洗脫液于40℃氮氣吹干，精密加入600

μL復溶液（3.1.8），渦旋混合1

min，作為待測液。

5.3

測定步驟

5.3.1

檢測卡與金標微孔測定步驟

吸取150

μL樣品待測液于反應微孔（3.4.2.1）中，抽吸

5～10次使混合均勻，室溫溫育3

min；溫育結束后，將金標微孔中溶液滴加到檢測卡（3.4.2.2）上的加樣孔中，室溫溫育5～8

min，對結果進行判定。

5.3.2

試紙條與金標微孔測定步驟

吸取150

μL樣品待測液于反應微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10次使混合均勻，室溫溫育3

min；溫育結束后，將檢測試紙條（3.4.2.2）吸水海綿端垂直向下插入反應微孔中，室溫溫育3

min，從微孔中取出試紙條，去掉試紙條下端的吸水海綿，并于5

min內進行結果判定。

5.3.3

檢測卡測定步驟

吸取150

μL樣品待測液滴加到檢測卡（3.4.2.2）上的加樣孔中，室溫溫育5～8

min，對結果進行判定。

5.4質控試驗

每批樣品應同時進行空白試驗和加標質控試驗。

5.4.1

空白試驗

稱取空白試樣，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。

5.4.2

加標質控試驗

準確稱取空白樣品6

g或適量（精確至0.01

g）置于15

mL具塞離心管中，加入180

μL氯霉素標準工作液（0.01

μg/mL）（3.3.3），使氯霉素濃度為0.3

μg/kg，一式2份，按照

5.2和5.3步驟與樣品同法操作。

結果判定要求

通過對比控制線和檢測線的顏色深淺進行結果判定。由于長時間放置會引起檢測線顏色的變化，需在規定時間內進行結果判定。目視結果判讀依據如圖1所示。

6.1

無效

控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試紙條/檢測卡無效。

6.2

陽性結果

檢測線（T線）不顯色或檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色淺，表明樣品中氯霉素含量高于方法檢測限，判定為陽性。

6.3

陰性結果

檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或者檢測線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相當，表明樣品中氯霉素含量低于方法檢測限，判定為陰性。

6.4質量控制要求

空白試驗測定結果應為陰性，加標質控試驗測定結果應為陽性。

結論

如被測樣品中氯霉素檢測結果為陽性時，應采用確證方法進行確證檢測。

性能指標

8.1

檢測限

氯霉素為0.1

μg/kg。

8.2

靈敏度

靈敏度應≥98%。

8.3

特異性

特異性應≥90%。

8.4

假陰性率

假陰性率應≤1%。

8.5

假陽性率

假陽性率應≤10%。

注：性能指標計算方法見附錄A

9其他

本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進行考察，應滿足本方法規定的各項性能指標。

本方法參比標準為GB/T

22338-2008

動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定

(包括所有修改單)。

附錄

A

定性方法性能計算表

樣品情況a

檢驗結果b

總數

陽性

陰性

陽性

N11

N12

N1.=N11+N12

陰性

N21

N22

N2.=N21+N22

總數

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

顯著性差異(χ2)

χ2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1

靈敏度（p+）

p+=N11/N1.特異性（p-）

p-=N22/N2.假陰性率(pf-)

pf-=N12/N1.=1-靈敏度

假陽性率(pf+)

pf+=N21/N2.=1-特異性

相對準確度

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：N:任何特定單元的結果數，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

a由基準方法檢驗得到的結果；

b由本方法檢驗得到的結果。靈敏度的計算使用確認后的結果。

本方法負責起草單位：山西省食品藥品檢驗所。

驗證單位：陜西省食品藥品檢驗所、廣東省藥品檢驗所、四川省食品藥品檢驗檢測院。

主要起草人：李倩、閻安婷、陳煜、楊國偉。

第三篇：食用油中苯并（a）芘的快速檢測 膠體金免疫層析法（KJ201910）

附件10

食用油中苯并（a）芘的快速檢測

膠體金免疫層析法

(KJ201910)

范圍

本方法規定了食用油中苯并（a）芘的膠體金免疫層析快速檢測方法。

本方法適用于食用油中苯并（a）芘的快速測定。

原理

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的苯并（a）芘經提取后與膠體金標記的特異性抗體結合，抑制抗體和試紙條或檢測卡中檢測線（T線）上抗原的結合，從而導致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線（C線）顏色深淺比較，對樣品中苯并（a）芘進行定性判定。

試劑和材料

除另有規定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T

6682規定的二級水。

3.1

試劑

3.1.1

正己烷：色譜純。

3.1.2

乙腈：色譜純。

3.1.3

二甲基亞砜（DMSO）。

3.1.4

NaH2PO4?2H2O。

3.1.5

Na2HPO4?12H2O。

3.1.6

氯化鈉。

3.1.7

吐溫-20。

3.1.8

氫氧化鈉溶液（2

mol/L）：稱取80g氫氧化鈉用水溶解，并定容至1L。

3.1.9

PBST溶液：稱取0.2965

g

NaH2PO4?2H2O、2.9

g

Na2HPO4?12H2O、8.76

g氯化鈉與0.55

g吐溫-20用水溶解并定容至1

L。

3.2

參考物質

苯并（a）芘參考物質的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質量見表1，純度均≥95%。

表1

苯并（a）芘參考物質中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質量

中文名稱

英文名稱

CAS登錄號

分子式

相對分子質量

苯并（a）芘

Benzo(a)pyrene

50-32-8

C20H12

252.32

注：或等同可溯源物質。

3.3

標準溶液的配制

苯并（a）芘標準儲備液（0.1?mg/mL）：精密稱取適量苯并（a）芘標準品（3.2），置于10

mL容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.1?mg/mL的苯并（a）芘標準儲備液；或可直接購買苯并（a）芘標準儲備液。0

℃~5

℃避光保存備用，有效期1年。

3.4

材料

苯并（a）芘膠體金免疫層析試劑盒，適用基質為食用油。

3.4.1金標微孔（含膠體金標記的特異性抗體）。

3.4.2

試紙條或檢測卡。

儀器和設備

4.1

移液器：100

μL、1

mL、5

mL和10

mL。

4.2

渦旋混合器。

4.3

離心機：轉速≥4000

r/min。

4.4

電子天平：感量為0.01

g。

4.5

氮吹儀或空氣吹干儀（帶溫度控制）。

分析步驟

5.1

試樣制備

取適量有代表性樣品充分混勻。

5.2

試樣提取和凈化除脂

稱取10

g油樣于離心管中，加入5

mL

正己烷（3.1.1）和15

mL

DMSO（3.1.3）并混合均勻。漩渦振蕩2min，然后4000

r/min離心2

min。棄去上層正己烷層。加入5

mL

正己烷（3.1.1），漩渦振蕩30

s，然后4000

r/min離心30

s。棄去上層正己烷層。加入10

mL

氫氧化鈉溶液（2

mol/L）（3.1.8）和15

mL正己烷（3.1.1），漩渦振蕩30s，然后4000

r/min離心30

s。吸取上層正己烷層于15

mL離心管，4000

r/min離心2

min。取全部正己烷層于氮吹管中，50℃氮吹或空氣吹10

min，吹干后加入200μL

DMSO（3.1.3）復溶，混合均勻，此為待測液。

5.3

測定步驟

打開試紙筒，取出所需數量的紅色反應微孔（取出微孔后，立即蓋好桶蓋，以防受潮）。往微孔中加入200

μL的PBST溶液，再加入50

μL待測液，上下抽吸5~10次至微孔試劑混合均勻，室溫（20℃~25℃）反應7

min。將已做好標記的試紙條插入至上述紅色微孔中，使樣品墊充分進

入樣品中，并計時7

min。從微孔中取出試紙條，棄去試紙條下端的樣品墊，進行結果判定。

5.4

質控試驗

每批樣品應同時進行空白試驗和加標質控試驗。

5.4.1

空白試驗

稱取空白試樣，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。

5.4.2

加標質控試驗

準確稱取空白試樣（精確至0.01

g）置于玻璃試劑瓶中，加入一定體積的苯并（a）芘標準儲備液（0.1

mg/mL）（3.3.1），使試樣中苯并（a）芘濃度為10

μg/kg，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。

結果判定方式

由于長時間放置會引起質控線（C線）與檢測線（T線）顏色的變化，需在規定時間內進行結果判定。試紙條與檢測卡如圖1所示。結果判定也可根據產品說明書進行。

6.1

讀數儀測定結果

通過讀數儀對結果進行判讀，根據不同廠家儀器規定進行判讀。

無效：質控線（C線）不顯色，無論檢測線（T線）是否顯色，均表示實驗結果無效。

陽性：若檢測結果顯示“+”（陽性），表示試樣中含有待測組分且其含量大于等于方法檢出限。

陰性：若檢測結果顯示“-”（陰性），表示試樣中不含待測組分或其含量低于方法檢出限。

6.2

目視判定

通過對比質控線（C線）和檢測線（T線）的顏色深淺進行結果判定。

無效：質控線（C線）不顯色，無論檢測線（T線）是否顯色，均表示實驗結果無效。

陽性：質控線（C線）顯色，若檢測線（T線）不出現或出現但顏色淺于質控線（C線），表示試樣中含有待測組分且其含量高于方法檢出限，判為陽性。

陰性：質控線（C線）顯色，若檢測線（T線）顏色深于或等于質控線（C線），表示試樣中不含待測組分或其含量低于方法檢出限，判為陰性。

6.3

質控實驗要求

空白試驗測定結果應為陰性，加標質控試驗測定結果應為陽性。

C

T

S

C

S

T

C

T

S

C

T

S

C

T

S

C

T

S

加樣孔

無效

陰性

陽性

B．檢測卡

吸水紙

NC膜

樣品墊

無效

陰性

陽性

C線

T線

A．試紙條

圖1目視判定示意圖

結論

當檢測結果為陽性時，應對結果進行確證。

性能指標

8.1

檢測限

10μg/kg。

8.2

靈敏度

≥95%。

8.3

特異性

≥85%。

8.4

假陰性率

≤5%。

8.5

假陽性率

≤15%。

注：性能指標計算方法參見附錄A。

其他

本方法分析步驟和結果判定可以根據廠家試劑盒的說明書進行，但應符合或優于本方法規定的性能指標。

本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進行考察，應滿足本方法規定的各項性能指標。

本方法參比標準為GB

5009.27-2016《食品安全國家標準

食品中苯并（a）芘的測定》。

本方法使用試劑盒可能與苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽、苯并（e）芘、苯并（j）熒蒽等物質存在交叉反應，當結果判定為陽性時應對結果進行確證。

附錄A

定性方法性能計算表

表A.1性能指標計算方法

樣品情況a

檢測結果b

總數

陽性

陰性

陽性

N11

N12

N1.=N11+N12

陰性

N21

N22

N2.=N21+N22

總數

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

顯著性差異（χ2）

χ2=（|N12-N21|-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1

靈敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特異性（p-，%）

p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-靈敏度

假陽性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特異性

相對準確度，%c

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：

a由參比方法檢驗得到的結果或者樣品中實際的公議值結果。

b由待確認方法檢驗得到的結果。靈敏度的計算使用確認后的結果。

N：任何特定單元的結果數，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C為方法的檢測結果相對準確性的結果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價。

本方法負責起草單位：廣東省食品檢驗所。

驗證單位：成都市食品藥品檢驗研究院、中國農業科學院油料作物研究所。

本方法主要起草人：熊含鴻、王立亞、簡德威、陳思敏、雷毅

第四篇：酶聯免疫法檢測蝦中的呋喃唑酮

酶聯免疫法檢測蝦中的呋喃唑酮代謝物

摘要建立養殖蝦類中 AOZ殘留 ELISA篩選方法。方法: 酸性條件下利用 2-硝基苯甲醛衍生化, 乙酸乙酯提取, 正己烷去雜質后進行 ELISA分析。結果: 方法最低檢測限為 013 Lg/kg, 向樣品中添加濃度為 015、110和 310Lg/kg3個梯度標準品溶液時,平均回收率范圍為 9017% ~ 9519%, RSD 為 4124% ~ 5142%。結論: 實驗證明該方法適合養殖蝦類中 AOZ殘留篩選。

關鍵詞：蝦肉;呋喃唑酮代謝物;ELISA

一、前言

呋喃唑酮（FZD）,又名痢特靈,是一種廣譜抗菌藥物，屬于硝基呋喃類藥物，是人工合成的化學藥。常被摻放在飼料中，用于水產品養殖傳染病的預防與治療[1]。藥代動力學研究表明，呋喃唑酮在動物體內的代謝非常快，現已明確此類抗生素的原型在體內 4 d 后，就已完全分解成其代謝物，所以分析呋喃唑酮時，只能分析其代謝物[2]。經研究表明，呋喃唑酮的代謝物中有相當數量是以其完整側鏈 3-氨基-2-惡唑烷酮即 AOZ 與蛋白結合的殘留物形式存在, AOZ 進一步代謝可產生具致癌、致突變作用的羥乙基肼[3]，因此檢測呋喃唑酮代謝物(AOZ)的殘留更具有現實意義。呋喃唑酮在畜產品和水產品中的殘留，通過食物鏈傳遞給人類,會使人體受到損害。另外,其作為人畜共用藥，長期微量攝入易使人體產生抗藥性，導致呋喃唑酮藥物失去醫療功效[4]。

1990 年 7 月歐盟頒布 2377/90/EEC 條例，將硝基呋喃類藥物及其代謝產物列為 A 類禁用藥物，規定其在動物源性食品中的殘留檢測限為 1.0 μg/kg。由于對呋喃唑酮蛋白結合態殘留物的安全性產生懷疑，自1995 年起歐盟、日本、美國等都開始禁止這類抗菌劑在食用的畜禽及水產動物中使用，并嚴格執行對輸入的食用魚，蝦及禽類進行殘留檢測[5]。同許多國家一樣，我國農業部制訂的 NY5070-2002《無公害食品水產品中魚藥殘留限量》及 GB18406.4-2001《無公害水產品安全要求》規定，水產品中不得檢出呋喃唑酮，同時禁 止在飼料中添加[6]。目前呋喃唑酮在食品中殘留的監測方法主要有高效液相色譜法[7-8]、酶聯免疫法[9]、分光光度法、原子吸收法[10]等，酶聯免疫法已受到廣泛重視。本試驗主要 使用酶聯免疫法對出口蝦中呋喃唑酮代謝物AOZ 的殘留做快速檢測。

福建省詔安縣海利水產有限公司，是一家集水產品加工、銷售、研究、開發和養殖于一體的大型出口企業。該公司于2005年引進投建，廠房和生產布局按照《出口食品生產企業衛生注冊登記管理規定》和美國FDA法規及歐盟指令進行設計建造，廠區占地面積八萬平方米，全封閉配套中央空調的水產加工車間二萬平方米，生產車間配套高效臭氧殺菌設施，制冷水機和大型制冰機等各種先進加工設備，凍庫儲存能力達6000噸，同時配套建設大型對蝦養殖場及蝦苗孵化場，擁有一支高素質員工隊伍，年加工生產水產品15000噸以上，產品近二十種，主要有凍生蝦、凍熟蝦、凍面包蝦、壽司蝦、凍魷魚、凍羅非魚等。公司秉承共同發展的目標，不斷完善質量管理體系，執著追求品質,先后獲得了《衛生注冊證書》、《輸美水產品HACCP驗證證書》，2005年11月通過了BRC認證，2006年1月通過了ISO9001認證，2008年通過了歐盟相關質量認證，產品獲得了國外消費者的肯定和喜歡，遠銷日本、美國、加拿大、墨西哥和香港等國家和地區，在國外贏得了市場。公司自建成投產以來，企業迅速發展壯大。

1材料與方法

1.1

樣品

均來自福建省海利水產有限公司。

1.2

主要儀器及設備

MK3 型酶標儀: Thermo 公司；Scientz-10 型均質機：寧波新芝生物科技股份有限公司；ALC.210.4 電子天平:ACCULAB；DRP-9082 型恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；4K15 型高速冷凍離心機：Sigma公司；HH-w600s 恒溫水箱：山東鄄城新科教學儀器廠；MS1 Minishaker:IKA；1 000、200、20 μL 微量移液器：GILSON。

1.3

試劑與溶液

呋喃唑酮代謝產物-AOZ 試劑盒：北京望爾生物技術有限公司；靈敏度為 0.125 μg/kg，包括：AOZ 標準溶液（0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05 ng/mL）、濃縮緩沖液、濃縮提取/洗滌液、衍生試劑、濃縮酶標記物、底物溶液、反應終止液。正己烷，乙酸乙脂，1 mol/L NaOH，1 mol/L HCl。

1.4方法

1.4.1

樣品處理

蝦去頭去殼，取可食用部分，制成均質物。

1.4.2

樣品制備

1）稱取 1 g 已均質的樣品于 50 mL 離心管中，依次加入 4 mL 超純水、1.5 mL 1 mol/L HCl，100 μL 衍生試劑，漩渦振蕩 1 min。置 37 ℃的恒溫培養箱中溫育，靜置過夜（約 16 h）。

2）加入 5 mL 原倍緩沖液，0.4 mL 1 mol/L NaOH，5 mL 乙酸乙酯，振蕩混合約 1 min。

3）離心 10 min（3 000 r/min），取 2 mL 上清（乙酸乙酯層）至 10 mL 玻璃管中，于 50 ℃下氮氣吹干。

4）于此玻璃管加入正己烷 1 mL，先將殘留物完全溶解后（若未能完全溶解，可能會導致回收率降低），再加入 2 mL 原倍萃取/清洗液，振蕩 1 min。

5）將玻璃試管置于 80℃～100℃熱水浴中約 3min，以減少水相與有機相間的乳化現象。6）離心 10 min（3 000 r/min），吸去上層液（正己烷），棄掉，再吸取下層液（水層）備用。

1.4.3測定

1）將 AOZ 試劑盒從冰箱中拿出，回溫至室溫。

2）取出相應數量的微孔，各個標準液和待測樣品各做 2 個平行樣，做好記錄。

3）于適當的微孔中分別加入 50 μL 標準溶液（0，0.05，0.15，0.45，1.35，4.05 ng/mL）。

4）于另外微孔中加入 50 μL 已完成前處理的樣品溶液。

5）再于每一微孔中另再加入 100 μL 已稀釋的酶標記物。

6）輕敲盤子四周，使其充分混合后于室溫（25 ℃）下避光靜置溫育 50 min。

7）微孔中的反應液甩掉，再將洗液加滿每一微孔后甩掉，重復洗 3 次。

8）最后一次甩掉后，在吸水紙上拍干。

9）于每一微孔中加入底物溶液 100 μL 后，輕敲盤子四周，使其充分混合。

10）于室溫（25 ℃）下避光靜置溫育 30 min。

11）于每一微孔中加入 100 μL 反應終止液。

12）用酶標儀于波長 450 nm 下判讀。

1.5

數據處理

1）計算（B/B0）×100 值。用樣品和標準溶液吸光度值（B）除以零標準吸光度值（B0）再乘以 100。

2）以（B/B0）×100 值為縱坐標，以樣品濃度的對數值為橫坐標，做標準對數曲線。

3）根據每個樣品的 B/B0值就可以從曲線上讀出相對應樣品的濃度

2結果

2.1

標準曲線的繪制

AOZ 標準品的 ELISA 檢測結果見表 1。

2.4

試驗過程中的注意事項

1）A回溫試劑（20℃-24℃）。B恒溫孵育，避免光線照射。

2）、將足夠標準和樣品所用數量的孔條插入微孔架，標準和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準和樣品的位置。

3）加入50ul標準或處理好的樣品液到各自的微孔中，每個孔加入樣品或標準時注意更換移液器的吸頭。

4)加入50ul酶標記物溶液（紅帽）到每一個微孔底部，充分混合。

5)加入50ul抗體溶液（黑帽）到每一個微孔底部充分混合，在室溫孵育1小時，覆蓋上薄膜。

6)倒出孔中的流體將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體。用250ul樣品洗滌緩沖液充入孔中，重復兩次。

7)加入100ul基質/發色劑到每一微孔中，充分混合并在室溫暗處孵育15分鐘。

8）加入100ul反應終止液到每一微孔中，混合好在450nm處測量吸光值以空氣為空白，必須在加入停止液后60分鐘內讀取吸光值。

9）試劑盒內容物要完全回穩后再進行操作，否則，會出現吸光值偏低或沒有吸光值。

10）溫浴時若室溫太低或太高，請適當延長或縮短溫浴時間，或直接在恒溫培養箱中進行。

11）加樣品或試劑時，吸頭請勿接觸微孔。

12）加樣和洗板過程中，要避免微孔間的相互污染。

13）整個試驗過程中，勿使微孔干燥。

結論

本試驗用酶聯免疫法檢測了海利水產有限公司中呋喃唑酮代謝物 AOZ 的殘留狀況，結果表明絕大多數的水產品符合規定，只有極少數部分有殘留。用酶聯免疫法對蝦肉呋喃唑酮代謝物 AOZ 殘留進行測定，操作簡易，不需要復雜的儀器設備，樣品預處理簡單，作為一種快速篩選手段，在食品工業中有著廣闊的推廣應用前景，尤其在水產品出口企業中，但酶聯免疫試劑盒的價格將是最大的制約因素。

參考文獻：

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[2] 周新,張欣祥,王磊,等.UPLC-MS/MS 測定魚干中的呋喃唑酮代謝物[J].分析測試學報,2007,26(9):262-263

[3]許蓓,徐志祥,王鳳俠,等.動物性食品中呋喃唑酮代謝物酶聯免疫檢測方法的研究[J].食品研究與開發,2007,28(12):145-148

[4]羅杰,李健.呋喃唑酮間接競爭 ELISA(ciELISA)檢測法的建立[J].中國海洋大學學報,2005,3,35(20):213-218

[5]許春蘭,院榕生,劉小根,等.酶聯技術在水產品中呋喃唑酮代謝物 AOZ 的檢測中的應用

[J].食品研究與開發,2007,28(5):124-126

[6]吳富忠, 歐陽立群.水產品中呋喃唑酮、呋喃西林藥物殘留的HPLC 法測定[J].中國衛生檢驗雜志,2006,16(7):812-813

[7]艾曉輝，劉長征，羅玉霜，等.水產品中呋喃唑酮含量的高效液相色譜檢測法[J].淡水漁業，2003，33(1)：8-10

[8]于慧娟，蔡友窮，畢士川，等.高效液相色譜法測定水產品中呋喃唑酮的殘留量[J].色譜，2005，23(1)：114

[9] 沈美羅,宋紅波,耿雪冰，等.酶聯免疫法測定水產品中呋喃唑酮代謝物 AOZ 的殘留[J].水產學報，2006，30(4)：520-524

[10] 焦更生，曹會蘭.原子吸收法間接測定呋喃唑酮[J].分析試驗室,2006,25(8):88-90

第五篇：食品中玉米赤霉烯酮的快速檢測 膠體金免疫層析法（KJ201913）

附件13

食品中玉米赤霉烯酮快速檢測

膠體金免疫層析法

(KJ201913)

1.范圍

本標準規定了食品中玉米赤霉烯酮快速檢測膠體金免疫層析法。

本標準適用玉米、小麥及其碾磨加工品中玉米赤霉烯酮快速篩選測定。

第一法

比色法

2.原理

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的玉米赤霉烯酮經提取后與膠體金標記的特異性抗體結合，抑制抗體和試紙條中檢測線（T線）上的抗原結合，從而導致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線（T線）與控制線（C線）顏色深淺的比較，對樣品中玉米赤霉烯酮進行結果判定。

3.試劑及材料

除另有規定外，本方法所用試劑均為分析純，試驗用水為GB/T

6682規定的二級水。

3.1.試劑

3.1.1.乙腈。

3.1.2.甲醇+水（7+3，體積比）。

3.1.3.稀釋緩沖液（膠體金免疫層析檢測試劑盒專用提取液或根據產品使用說明書配置）。

3.2.參考物質

玉米赤霉烯酮的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見表1，純度≥95%。

表1

玉米赤霉烯酮參考物質的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量

中文名稱

英文名稱

CAS登錄號

分子式

相對分子量

玉米赤霉烯酮

Zearalenone

17924-92-4

C18H22O5

318.36

注：或等同可溯源物質。

3.3.標準溶液的配制

3.3.1.標準儲備液：稱取適量標準品，用乙腈（3.1.1）溶解，配制成濃度為100

μg/mL的標準儲備液。﹣18

℃避光保存，有效期6個月。

3.3.2.標準工作液：準確量取標準儲備液（100

μg/mL）（3.3.1）100

μL，置于10

mL容量瓶中，用乙腈（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1

μ稀/mL的玉米赤霉烯酮標準工作液，2

℃～8

℃避光保存，有效期1個月。

3.4.材料

玉米赤霉烯酮膠體金免疫層析試劑盒，適用基質為玉米、小麥及其碾磨加工品。

4.儀器和設備

4.1.移液器：100

μL、200

μL、1

mL和5

mL。

4.2.旋渦混合器。

4.3.離心機。

4.4.電子天平：感量為0.01

g。

5.環境條件

環境溫度：20

℃～30

℃。

空氣相對濕度：最佳測定濕度45

%～65

%。若濕度低于45

%，相應延長待測液-試紙條反應時間，以質控實驗為準；若濕度為65

%～80

%，微孔與試紙條拆開后立即使用，避免微孔與試紙條長時間暴露在空氣中受潮；避免在濕度80

%以上濕度進行實驗。

6.分析步驟

6.1.試樣制備

按GB

5491扦取的樣品充分碾磨或粉碎混勻，過40目篩。

6.2.提取

準確稱取試樣5.0

g（精確至0.01

g）于50

mL離心管中，加入20

mL

甲醇+水溶液（3.1.2），用旋渦混合器振蕩3

min，離心分層或靜置分層，上清液備用。

準確移取0.8

mL稀釋緩沖液（3.1.3）于1.5

mL離心管中，加入25

μL上清液，混勻，待檢。

6.3.測定步驟

依檢驗所需，取相應數量的金標微孔和試紙條，做好標記。吸取待檢液200

μL于金標微孔中，抽吸至孔底的紫紅色顆粒完全溶解，孵育10

min。將試紙條插入金標微孔中，反應3

min～5

min。

從金標微孔中取出試紙條，棄去試紙條下端的樣品墊，觀察顯色情況，進行結果判定。（若試劑盒冷藏保存，使用前需恢復至實驗環境溫度。）

7.質控試驗

每批樣品應同時進行空白試驗和陽性質控試驗，可根據檢測樣品量制定適宜頻次的質控試驗。

7.1.空白試驗

7.1.1.試劑空白試驗：除不稱取試樣外，均按6.2和6.3所述步驟操作。

7.1.2.基質空白試驗：準確稱取空白試樣，按6.2和6.3所述步驟操作。

7.2.陽性質控試驗

準確稱取玉米赤霉烯酮含量為60

μg/kg的質控樣，按6.2和6.3步驟操作。或準確稱取空白試樣，加入一定體積的玉米赤霉烯酮標準工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量為60

μg/kg，按6.2和6.3步驟操作。

8.結果判定

通過對比控制C線和檢測T線的顏色深淺進行結果判定。

8.1.無效結果

無論樣品中有無玉米赤霉烯酮存在，控制C線均會出現一條紫紅色條帶。若C線未顯色，表明操作不正確或試紙條已失效，檢測結果無效（見圖1）。

無效

圖1

試紙條目視判定圖

8.2.陽性結果

控制C線顯色，檢測T線顯色比C線淺或者沒有顏色，判定為陽性（見圖2）。

8.3.陰性結果

控制C線顯色，檢測T線顯色比C線深或者一致，判定為陰性（見圖2）。

比色法

圖2

試紙條目視判定圖

8.4.質控試驗要求

空白試驗結果應為陰性，陽性質控試驗結果應為陽性。

第二法

消線法

9.原理

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的玉米赤霉烯酮經提取后與膠體金標記的特異性抗體結合，抑制抗體和試紙條中檢測線（T線）上的抗原結合，從而導致檢測線顏色深淺的變化。通過T線顯色與否進行結果判定。

10.試劑及材料

同3。

11.儀器和設備

同4。

12.環境條件

環境溫度：10

℃～40

℃。

空氣相對濕度：同5。

13.分析步驟

13.1.試樣制備

同6.1。

13.2.提取

準確稱取試樣5.0

g（精確至0.01

g）于50

mL離心管中，加入12.5

mL甲醇+水溶液（3.1.2），用旋渦混合器振蕩3

min，離心分層或靜置分層，上清液備用。

準確移取400

μL稀釋緩沖液（3.1.3）于1.5

mL離心管中，加入上清液(小麥50

μL，玉米80

μL），混勻，待測。

13.3.測定步驟

同6.3。

14.質控試驗

每批樣品應同時進行空白試驗和陽性質控試驗，可根據檢測樣品量制定適宜頻次的質控試驗。

14.1.空白試驗

14.1.1.試劑空白試驗：除不稱取試樣外，均按13.2和13.3所述步驟操作。

14.1.2.基質空白試驗：準確稱取空白試樣，按13.2和13.3所述步驟操作。

14.2.陽性質控試驗

準確稱取玉米赤霉烯酮含量為60

μg/kg的質控樣，按13.2和13.3步驟操作。或準確稱取空白試樣，加入一定體積的玉米赤霉烯酮標準工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量為60

μg/kg，按13.2和13.3步驟操作。

15.結果判定

通過觀察檢測T線顯色與否進行結果判定。

15.1.無效

同8.1

15.2.陽性結果

控制C線顯色，檢測T線不顯色，判定為陽性（見圖3）。

15.3.陰性結果

控制C線顯色，檢測T線顯色，判定為陰性（見圖3）。

消線法

圖3

試紙條目視判定圖

16.質控試驗要求

同8.4

第三法

讀數儀法

17.具體檢測步驟及結果判定可參考相應的說明書操作，質控試驗參照第一法與第二法。

18.結論

本方法篩查出的陽性樣品進行確認時，應按GB

2761指定方法標準檢測并判定。

19.性能指標

19.1.檢出限

μg/kg。

19.2.靈敏度

靈敏度≥95%。

19.3.特異性

特異性≥90%。

19.4.假陰性

假陰性≤5%。

19.5.假陽性

假陽性≤10%。

注：性能指標計算方法見附錄A。

20.其他

本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為了方便方法使用者，在使用本方法時不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進行考察，滿足本方法規定的各項性能指標時方可使用。

本方法參比標準為GB

5009.209-2016

食品安全國家標準食品中玉米赤霉烯酮的測定。

附錄A

快速檢測方法性能指標計算表

樣品情況a

檢測結果b

總數

陽性

陰性

陽性

N11

N12

N1.=N11+N12

陰性

N21

N22

N2.=N21+N22

總數

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

顯著性差異（c2）

c2=（?N12-N21?-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1

靈敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特異性（p-，%）

p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-靈敏度

假陽性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特異性

相對準確度，%c

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：

a樣品中實際的公議值結果；

b由玉米赤霉烯酮膠體金試紙條檢驗方法得到的結果。靈敏度的計算使用確認后的結果。

N：任何特定單元的結果數，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C為方法的檢測結果相對準確性的結果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價。

本方法起草單位：成都市食品藥品檢驗研究院。

本方法參與單位：江南大學、國家糧食局科學研究院、廣東省食品檢驗所、山東省食品藥品檢驗研究院、浙江省食品藥品檢驗研究院。

本方法主要起草人：肖全偉、姚蕾珺、王昕、張敏、胥傳來、田洪蕓、沈泓、周露