第一篇：溫醫研究生分子生物學課程總結

這份是2014級某人整理的，基本上都是上課涉及到的內容，里面“生物大分子（DNA,RNA,蛋白質）提取分離純化的具體方法沒有，分子生物學新技術幾個名解就寫啦CEMS，miRNA太多（可能是熱點吧?），RT-PCR沒有具體，基因診斷實例缺。其他的基本上都有啦。

分子生物學：從分子水平研究生物分子的結構與功能從而闡明生命現象本質和生命過程規律的一門交叉科學 ；主要研究遺傳信息的傳遞（復制）、保持（損傷和修復）、基因的表達（轉錄和翻譯）與調控。遺傳學角度：基因（gene）：是指攜帶有遺傳信息的DNA或RNA序列，也稱為遺傳因子。

分子生物學角度：基因（gene）：是合成有功能的蛋白質或RNA所必需的全部DNA，包括編碼蛋白質或RNA的核酸序列及為保證轉錄所必需的調控序列。

結構基因 ：可被轉錄成mRNA，并可翻譯成多肽，構成結構蛋白或催化各種生化反應的酶。調節基因 ：指某些可調節、控制結構基因表達的基因。

編碼區：能夠編碼產生蛋白質的序列，包括外顯子與內含子。前導區：位于編碼區上游，相當于mRNA5′端非編碼區。

調節區：包括啟動子和增強子等基因編碼區的兩側，也稱為側翼序列。

斷裂基因（splite gene）：真核生物結構基因，由若干個編碼區和非編碼區互相間隔開但又連續鑲嵌而成，去除非編碼區再連接后，可翻譯出由連續氨基酸組成的完整蛋白質，這些基因稱為斷裂基因 基因組（genome）：是指一個物種的單倍體的染色體所攜帶的全部遺傳信息。

C值（C value）：一種生物體單倍體基因組的DNA含量總是恒定的，它通常稱為該物種DNA的C值。C值矛盾：生物體的進化程度與基因組大小之間不完全成比例的現象（又稱：C值悖論，C value paradox）

必需基因：指關系到生物體存活的基因，可通過基因突變的方法確定致死位點的數量，以得知基因組必需基因的數量

重疊基因（overlapping gene）是指兩個或兩個以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成為兩個或兩個以上基因的組成部分。

多順反子mRNA：DNA序列中功能相關的蛋白質的基因叢集在基因組的一個或幾個特定的部位，形成一個功能單位或轉錄單元，它們可被一起轉錄成含有多個mRNA的分子。病毒基因組的結構與功能特征？ ① 病毒基因組基因組很小，且大小相差較大。② 病毒基因組可以由DNA組成，或由RNA組成。③ 多數RNA病毒的基因組是由連續的RNA鏈組成； ④ 基因重疊。⑤ 基因組的大部分可編碼蛋白質，只有非常小的一部份不編碼蛋白質。⑥ 形成多順反子結構（polycistronie）。⑦ 病毒基因組都是單倍體（逆轉錄病毒除外）。⑧ 噬菌體（細菌病毒）的基因是連續的，而少數真核細胞病毒的基因是不連續的。

類核（nucleoid）：是指原核生物基因組通常由一條環狀的雙鏈DNA分子組成，在細胞中與蛋白質結合成染色體的形式，在細胞內形成一個致密的區域。原核生物基因組的一般特點 基因組較?。?06bp～107bp）

功能上相關的幾個結構基因串聯在一起組成操縱子(operon)結構。結構基因均為單拷貝基因（除18s、28s、5s rRNA及tRNA基因外）

不編碼的DNA序列約占全基因組的10%以內（比真核生物少得多）：基因組中幾乎沒有重復序列，基因間幾乎沒有間隔，基因內沒有內含子（古細菌除外）。不編碼部分通常包含調控基因表達的序列

DNA分子中有各種功能區，如復制起始區OriC，復制終止區TerC，轉錄起始區和終止區等，這些區域往往有反向重復序列，能形成特殊的結構。

多順反子：即數個功能相關的結構基因串聯在一起，受同一個調節區的調節。

轉座子：能在基因組中從一個位點移至另一位點的DNA序列稱為轉座因子（transposable element），又稱為可轉座元件。

插入序列(insertion sequence，IS)：2 000bp以內，兩端正向重復序列（direct repeats，DR）、反向重復序列（inverted repeats，IR），中間1kb左右的編碼序列，僅編碼和轉座有關的轉座酶。

復合型轉座子(composite transposon)：2 000～20 000bp之間，兩端由一對IS元件組成，帶有與轉座作用有關的基因和其他基因。

質粒（plasmid）：是指一類染色體外具有自主復制能力的環狀雙鏈DNA分子，屬染色體外基因組。

共價閉環DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）沒有游離的末端，每條鏈上的核苷酸通過共價鍵彼此頭尾相連，這種結構稱為,常形成超螺旋結構。

嚴緊控制（stringent control）型質粒：其復制常與宿主的繁殖偶聯，拷貝數較少，每個細胞中只有1個到十幾個拷貝。

松弛控制（relaxed control）型質粒：其復制與宿主不偶聯，每個細胞中有幾十到幾百個拷貝。質粒的穩定性：質粒在宿主細胞內穩定地存在而不丟失稱為質粒地穩定性。

質粒的不相容性：兩種不同的質粒因利用同一復制和維持機制，在復制和隨后向子代細胞分配的過程中會發生競爭，從而不能在同一宿主細胞內穩定存在，其中一種質粒將被丟失的現象。

原核生物基因組的一般特點？

1.基因組較?。?06bp～107bp）。

2.操縱子結構是原核生物基因組的功能單位。

3.結構基因均為單拷貝基因（除18s、28s、5s rRNA及tRNA基因外）。

4.不編碼的DNA序列約占全基因組的10%以內（比真核生物少得多）：基因組中幾乎沒有重復序列，基因間幾乎沒有間隔，基因內沒有內含子（古細菌除外）。5.不編碼部分通常包含調控基因表達的序列

6.DNA分子中有各種功能區，如復制起始區OriC，復制終止區TerC，轉錄起始區和終止區等，這些區域往往有反向重復序列，能形成特殊的結構。

真核生物基因組的結構與功能特點

1.基因組DNA與蛋白質結合形成染色體，儲存于細胞核內，除配子細胞外，體細胞內基因組是雙份的（即雙倍體，diploid），有兩份同源的基因組。

2.基因轉錄產物為單順反子。一個結構基因經過轉錄生成一個mRNA分子，再翻譯生成一條多肽鏈。3.存在重復序列，重復次數可達百萬次以上。4.基因組中不編碼的區域多于編碼的區域。

5.大部分基因含有內含子，因此，基因是不連續的（斷裂基因，split gene）

6.基因組遠遠大于原核生物的基因組，具有許多復制起始點，而每個復制子的長度較小

rDNA：rRNA基因通常集中成簇存在，而不是分散于基因組中，這樣的區域稱為rDNA，如染色體的核仁組織區（nucleolus organizer region）即為rDNA區。

反向重復序列 ：是指兩個相同順序的互補拷貝在同一DNA鏈上的反向排列。

衛星DNA ：是另一類高度重復序列，這類重復序列的重復單位一般由2-10bp組成，成串排列。

DNA多態性：是指DNA序列發生變異從而導致的個體間核苷酸序列的差異，主要包括：單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）和串聯重復序列多態性（tandem repeats polymorphism）

SNP：是由基因組DNA上的單個堿基的變異引起的DNA序列多態性。是人群中個體差異最具代表性的DNA多態性，相當一部分還直接或間接與個體的表型差異、對疾病的易感性或抵抗能力、對藥物的反應性等相關。SNP被認為是一種能穩定遺傳的早期突變。

多基因家族（multi gene family）：是指由某一祖先基因經過復制和變異所產生的一組基因。

珠蛋白基因家族：家族的不同成員成簇地分布在不同染色體上，但核酸序列高度同源，編碼一組功能上緊密相關的蛋白質。

假基因(pseudogene)：具有與功能基因相似的序列，但由于有許多突變以致失去了原有的功能，不能轉錄或轉錄后生成無功能的蛋白質的基因，常用ψ表示。

高等動物線粒體基因組具有獨特的特點？

1.母系遺傳。

2.線粒體DNA損傷后不易修復，突變率較高。3.遺傳密碼與通用遺傳密碼存在差別。

遺傳圖譜（genetic map）：又稱連鎖圖譜(linkage map)，它是以具有遺傳多態性的遺傳標記為“路標”，以遺傳學距離為圖距的基因組圖。

遺傳多態性：在一個遺傳位點上具有一個以上的等位基因，在群體中的出現頻率皆高于1% 遺傳學距離：在減數分裂中，兩個位點之間進行交換、重組的百分率，1%的重組率稱為1cM 物理圖譜（physical map）：利用限制性內切酶將大分子DNA切成片段，再根據重疊序列確定片段間連接順序，以及遺傳標志之間物理距離〔堿基對(bp)或千堿基(kb)或兆堿基(Mb)〕為路標的圖譜。序列圖譜：是分子水平上最高層次，最為詳盡的物理圖譜，可得到全部的DNA序列。

基因圖譜（轉錄圖譜）：在識別基因組所包含的蛋白質編碼序列的基礎上繪制的結合有關基因序列、位置及表達模式等信息的圖譜。

基因定位克?。菏侵咐梦⑿l星和SNP全基因組掃描來搜索與疾病性狀緊密相關的位點，從而確定疾病相關基因的位置并進一步獲得克隆。

宏基因組：是指生境中全部微小生物遺傳物質的總和。

宏基因組學：就是以環境樣品中的微生物群體基因組為研究對象, 以功能基因篩選和測序分析為研究手段,通過非培方法進行某個特殊生態環境中微生物群落的鑒定。

蛋白質組學(proteomics): 指應用各種技術手段來研究蛋白質組的一門新興科學，其目的是從整體的角度分析細胞內動態變化的蛋白質組成成份、表達水平與修飾狀態，了解蛋白質之間的相互作用與聯系，揭示蛋白質功能與細胞生命活動規律。

雙向凝膠電泳技術（2-DE）：2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）等電聚焦電泳與第二向SDS-PAGE組成的分離系統，也稱雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳，簡稱2-DE。等電聚焦電泳是基于蛋白質等電點（pI）的差異進行分離，SDS-PAGE則是根據蛋白質分子量（Mw）的不同進行分離。

等電點：在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，所帶凈電荷為零，呈電中性，此時溶液的pH稱為該氨基酸的等電點。

等電聚焦電泳: 利用具有pH梯度的支持介質分離等電點不同的蛋白質的電泳技術。

等點聚焦：就是在電泳槽中放入載體兩性電解質，當通以直流電時，兩性電解質即形成一個由陽極到陰極逐步增加的pH梯度，當蛋白質放進此體系時，不同的蛋白質即移動到或聚焦于與其等電點相當的pH位置上； 優點：有很高的分辨率

缺點：一是電聚焦要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質可能發生沉淀；

二是樣品中的成分必需停留于其等電點，不適用在等電點不溶或發生變性的蛋白質。

2-DE原理

第一向電泳―IPG等電聚焦電泳在電場中電泳基質形成一個從正極到負極不斷增大的pH梯度，由于蛋白質為兩性電解質，帶負電荷的蛋白質分子向正極移動，帶正電荷的蛋白質分子向負極移動，當蛋白質分子運動到各自的pI處時，所帶凈電荷變為零，于是停止遷移而留在該位置上。這種不同的蛋白質分別聚集在各自的pI處，形成一條狹窄穩定的區帶而彼此分開的現象稱為等電點聚焦。

第二向電泳―SDS-PAGE 在PAGE系統中加入SDS和還原劑后所組成的電泳系統。SDS是一種陰離子去垢劑，疏水端能插入蛋白質分子內，破壞蛋白質分子內的氫鍵及疏水作用，改變蛋白質分子的三級和四級結構；還原劑則斷裂蛋白質分子內的二硫鍵，使蛋白質分子去折疊，結構變得舒展。蛋白質分子與SDS充分結合后，形成帶負電荷的蛋白質-SDS復合物，所帶負電荷大大超過蛋白質分子原有的電荷量，消除了不同分子間原有電荷的差異。蛋白質-SDS復合物在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統中的遷移率不再與電荷相關，而主要取決于蛋白質的分子量大小。

酵母雙雜交技術(yeast two-hybrid system)一種用于研究蛋白質相互作用的方法手段，它利用酵母細胞內的真核表達系統，將兩種外源蛋白質的基因分別與酵母轉錄因子的兩個功能結構域融合，通過質粒導入酵母細胞，以酵母細胞表型的改變作為外源蛋白是否發生相互作用的篩選標志。

基因工程（gene engineering）：又稱DNA重組技術（DNA recombination），是指將外源基因通過體外重組后導入受體細胞，并使其能在受體細胞內復制和表達的技術。

分子克隆（molecular cloning）：是指將目的DNA片段與載體重組，然后導入受體細胞，并在受體細胞中復制、擴增，以獲得該DNA分子大量拷貝的技術。

限制性核酸內切酶（restriction endonuclease）：簡稱限制酶，是一類能識別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。

回文結構（palindrome structure）：指雙鏈DNA分子上按對稱軸排列的反向互補序列（常為限制酶所識別）。粘性末端（sticky end）：指限制酶錯位切開兩條對稱軸互補DNA雙鏈所產生的末端。平末端（blunt end）：指限制酶平齊切開兩條對稱軸互補DNA雙鏈所產生的末端。同工異源酶（isoschizomers）：指來源不同，但能識別和切割同一位點的酶。

同尾酶（isocaudarner）：指識別序列不同，但能產生相同粘性末端的酶。

Taq DNA聚合酶（簡稱Taq 酶）：是一種耐熱的DNA聚合酶，分子量為65Kd，最佳作用溫度是70~80℃，Taq酶具有→聚合酶活性和依賴于聚合作用的→外切酶活性。逆轉錄酶（reverse transcriptase）：是依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板，4種dNTP為底物，催化合成DNA，此過程稱為逆轉錄過程。逆轉錄酶是多功能酶。RNA指導的DNA聚合酶活性（RDDP），核糖核酸酶H活性（RNaseH），DNA聚合酶活性（DDDP）。

末端脫氧核苷酰轉移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT，簡稱末端轉移酶）：分子量為60Kd，在二價陽離子存在下，催化脫氧核糖核苷酸轉移到單鏈或雙鏈DNA分子的末端-OH上。

DNA連接酶（DNA ligase）：主要功能是催化兩個互補粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的磷酸基團與羥基形成磷酸二酯鍵，將具有相同粘性末端或平末端的DNA連接起來。

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）：催化去除DNA、RNA或dNTP上的 5?-磷酸基團。核酸酶S1：可水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交分子中的單鏈部分。

載體（vector）：指能攜帶外源DNA片段導入宿主細胞進行擴增或表達的工具。載體的本質為DNA?？寺≥d體：能將外源DNA在受體細胞中復制、擴增并產生足夠量目的DNA的載體。

克隆載體應具備的特征

1.能自我復制并具較高的拷貝數。2.分子量一般< 10Kb。3.帶有遺傳篩選標記。

4.有適當的限制酶酶切位點，便于外源DNA的插入和篩選。

多克隆位點（multiple cloning sites，MCS）：載體上具有的多個限制酶的單一酶切位點。質粒：細菌染色體以外的小分子雙鏈環狀DNA，能自我復制并表達所攜帶的遺傳信息。

質粒克隆載體的主要用途：

① 用于保存和擴增< 2Kb目的DNA。

② 構建cDNA文庫。

③ 目的DNA的測序。

④ 作為核酸雜交時的探針來源。

溶菌性噬菌體：指噬菌體感染細胞后，連續增殖，直到細菌裂解，釋放的噬菌體又可感染其它細菌。

溶原性噬菌體：指噬菌體感染細胞后，可將自身的DNA整合到細菌的染色體中，和細菌染色體一起復制。粘粒載體：由質粒和λ噬菌體的cos位點構建而成。

表達載體:是指能將外源基因在受體細胞中有效轉錄和正確翻譯的載體。

報告基因：是指處于待測基因下游并通過轉錄和表達水平來反映上游待測基因功能的基因，又稱報道基因。?噬菌體載體的用途

1.用作一般的克隆載體。

2.用于構建基因組或cDNA文庫（<22Kb）。3.用于抗體庫或隨機肽庫的構建。4.核酸的序列分析。

粘粒載體組成：

1.質粒復制的起始位點(Ori)。2.攜帶抗藥基因。

3.用于插入目的基因的單一酶切位點。4.噬菌體的cos位點。

真核基因在原核細胞中表達需要保證外源基因：

1.插入方向的正確性； 2.受原核啟動子的控制；

3.必須能在原核細胞中有效轉錄和有效翻譯。

終止子：一個基因的末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶識別并停止轉錄的功能。

原核細胞表達載體的類型

1.非融合型表達載體：產生外源蛋白，易被原核細胞蛋白酶降解。如pKK223-3質粒載體。

2.分泌型表達載體：產生帶信號肽的分泌型融合蛋白，可減少外源蛋白被降解以及使蛋白質能在細胞外正確折疊，易提取。如PINlll系列。

3.融合型表達載體：產生由較短的原核細胞多肽和真核細胞蛋白質構成的融合蛋白，具有抗原性，較天然的外源蛋白穩定。如pGEX系列。

基因工程的基本步驟

1.目的基因的獲取 2.載體的選擇

3.目的基因和載體的連接 4.重組DNA導入受體細胞 5.重組體的篩選和鑒定

目的基因的獲取

1．從基因文庫中獲取 2.逆轉錄合成cDNA 3．人工合成DNA片段

4．直接從染色體DNA中分離目的基因

目的基因：指被研究的某一基因或DNA序列，即需要克隆或表達的基因。

基因組文庫（genomic library，G-文庫）：是指含有某種生物全部基因隨機片段的重組DNA克隆群。轉化（transformation）：是指以質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。

感受態細胞(competent cell)：細胞膜結構改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細胞。重組體的篩選

① 根據載體的抗藥性標志篩選

1.根據載體抗藥性標志插入失活選擇

2.?-半乳糖苷酶基因失活篩選（藍白斑篩選法）3.根據插入的外源性基因的性狀進行篩選 4.核酸雜交技術篩選

藍白斑篩選：某些質粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ?基因，該基因含一段編碼?-半乳糖苷酶氨基末端145個氨基酸?-肽的DNA片段，此片段能與宿主細胞所編碼的缺陷型?-半乳糖苷酶實現基因內?-互補，形成完整的?-半乳糖苷酶，催化指示劑底物X-gal 形成藍色產物，結果重組克隆呈藍色菌落。當外源基因插入lacZ?基因中MCS，lac ?-肽基因閱讀框架被破壞，細菌內將無?-半乳糖苷酶活性，結果重組克隆呈白色菌落。

重組體的鑒定

1.2.3.4.根據重組子大小鑒定 酶切鑒定 PCR鑒定

DNA序列分析鑒定

核酸變性：在某些理化因素的作用下，維系DNA分子二級結構的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA由雙螺旋變成單鏈過程。

增色效應：DNA變性時其溶液OD260增高的現象。

解鏈曲線：如果DNA是熱變性而導致增色效應，以溫度對A260的關系作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。

融解溫度（melting temperature，Tm）：在熱變性過程中，紫外吸收增加達到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度或融解溫度。

Tm的影響因素

1.DNA分子大小和堿基的組成 2.溶液的離子強度 3.pH值 4.變性劑

復性（renaturation）：指變性 DNA 在適當條件下，二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現象，它是變性的一種逆轉過程。

退火（annealing）：熱變性DNA一般經緩慢冷卻后即可復性，此過程稱之為“退火”。

核酸復性的影響因素

1.溫度和時間 2.DNA濃度

3.DNA分子大小和復雜度 4.離子強度

核酸分子雜交（molecular hybridization）:兩條DNA鏈或兩條RNA鏈或一條DNA鏈和一條RNA鏈按堿基互補的原則締合成異質雙鏈的過程稱為分子雜交或核酸分子雜交。

核酸探針（nucleic acid probe)：是指能與特定核苷酸序列發生特異性互補雜交，雜交后可用特殊方法檢測的已知被標記的核酸分子。

選擇探針的基本原則.高度特異性

2.探針的來源是否方便 3.制備探針的難易程度

核酸探針的類型

1.基因組DNA探針 2.cDNA探針 3.RNA探針 4.寡核苷酸探針

cDNA(complementary DNA)：是指與mRNA互補的DNA分子。

固相分子雜交：是將待測的靶核苷酸鏈預先固定在固體支持物上，然后放入含有標記探針的雜交液中，進行雜交反應后，使雜交分子留在支持物上，故稱固體雜交。

正向斑點雜交：簡稱斑點雜交，將待檢樣品（DNA、RNA 或細胞）直接點到膜上，烘烤固定。

反向斑點雜交：將不同的探針分別點到尼龍膜等固相介質上，再將已標記的待測DNA樣本與之雜交，經洗滌去除未結合的DNA樣本。

寡核苷酸探針設計原則

① 探針長度：一般要求在10～50bp。

②

G／C含量為40％～60％。

③

探針分子中應避免互補序列。

④

避免同一堿基連續出現，一般不能多于4個，如GGGG-或-CCCC-。

⑤

借助計算機相應軟件與已知的各種基因序列進行同源性比較。

理想的探針標記物應具有以下特點：

① 檢測物要靈敏、特異、穩定、簡便。② 標記物與探針結合后，應不影響雜交反應，尤其是雜 交特異性、穩定性和Tm值。③ 標記物對環境污染小，對人體無損傷，價格低廉。④ 標記物對檢測方法無干擾。

分子雜交技術一般流程

1.探針制備及標記（同位素或非同位素）

2.待測核酸樣品制備（分離，純化）3.雜交（液相，固相，原位雜交）4.雜交后處理（去掉非特異雜交分子）5.顯示結果（顯色，發光，放射自顯影）6.結果分析

Northern印跡雜交與Southern印跡雜交的不同點 ① RNA提取過程中需特別注意RNA酶的污染。② 所用器材最好與Southern印跡實驗分開使用。③ RNA變性的方法：變性劑為甲醛或聚乙二醛，不能用堿變性。

④ 印跡前將含變性劑的凝膠用水沖洗掉，再印跡、雜交。⑤ 如果測定RNA片段大小，可在同一塊膠上加分子量標記物一同電泳，之后將標記物切下、上色、照像，樣品膠則進行Northern轉印。⑥ 轉印后不能用低鹽緩沖液洗膜。

正向斑點雜交：簡稱斑點雜交，將待檢樣品（DNA、RNA 或細胞）直接點到膜上，烘烤固定。

反向斑點雜交：將不同的探針分別點到尼龍膜等固相介質上，再將已標記的待測DNA樣本與之雜交，經洗滌去除未結合的DNA樣本。

菌落雜交：將細菌從培養平板轉移到硝酸纖維濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂解以釋放出DNA，將DNA烘干固定于膜上與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。

夾心雜交法：設計兩條能與目的基因序列互補但又不重疊的探針，一個稱為捕獲探針，另一個稱為檢測探針，目的基因被夾在兩個探針之間。

微板酶聯雜交的優點

① 捕獲探針共價結合在微孔板上，不僅結合牢固而且結合量大，因而捕獲能力很強。② 捕獲探針豎直地而不是平躺地“包被”在微孔板表面，因而與目的片段的雜交效率很高。③ 檢測探針5’端、3’端均標記生物素，等量檢測探針結合親合素-辣根過氧化物酶的量增加。

原位雜交（In situ hybridization）：是以特定標記的已知序列的核酸分子作為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交并對其檢測的方法。

原位雜交的應用

① 正?；虍惓Ｈ旧w的基因定位。② 應用核酸探針與細胞內RNA進行雜交用于檢測該組織細胞中特定基因表達水平。③ 應用特異的病原體核酸作為探針對組織、細胞進行雜交，以檢測有無該病原體的感染等。

原位雜交基本流程

1.細胞或組織切片的處理：玻片清洗、組織和細胞的固定 2.增強組織的通透性和核酸探針的穿透性 3.預雜交 4.雜交

5.雜交后漂洗 6.結果檢測

熒光原位雜交（fluorescence in-situ hybridization, FISH）：是一種利用非放射性的熒光信號對原位雜交樣本進行檢測的技術。

基因芯片(gene chip)：又稱DNA芯片（DNA chip）或DNA微陣列（DNA microarray），是指集成了大量DNA片段的玻璃片或纖維膜等載體。

雜交條件優化

1、探針的選擇 ① 檢測單個堿基改變選用寡核苷酸探針。② 檢測單鏈靶序列選用與其互補的DNA單鏈探針或RNA探針。③ 長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復雜的靶核苷酸序列和病原體。④ 100bp左右的探針適合原位雜交。2.探針的標記方法

①在檢測單拷貝基因序列時，應選用標記效率高、顯示靈敏的探針標記方法。

②在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術和價廉的HRP顯示系統等。

3、探針的濃度

①隨探針濃度增加，雜交率也增加，在較窄的范圍內，隨探針濃度增加，敏感性增加。

② 膜雜交中32P標記探針與非放射性標記探針的用量分別為5～10ng/ml和25～1000ng/ml。

③原位雜交中，一般各種標記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。

4、雜交最適溫度 ① 若反應溫度低于Tm 10～15℃，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩定的雙鏈，錯配對減少。② 一般情況下，在不含變性劑甲酰胺時，大多數雜交反應在65℃進行，當含50%甲酰胺時，在42℃進行。

5、反應時間和洗膜溫度 ① 雜交時間短了，反應無法完成；長了引起非特異結合增多。一般雜交20 h左右。② 雜交后的最終洗膜溫度一般應低于Tm值5~12℃進行。

基因芯片的應用

1.基因表達水平的檢測

2.基因突變和多態性的檢測

3.基因芯片在藥物篩選中的應用 4.預防醫學領域的應用

5.基因芯片在疾病診斷中的應用：感染性疾病診斷、遺傳性疾病的診斷

基因診斷：分子診斷，通過分子生物學和分子遺傳學技術，直接檢測遺傳物質結構和表達是否異常，從而對疾病做出判斷的方法?；蛟\斷特點：

1.靈敏度高，特異性強。2.可以進行病因診斷。

3.病原體診斷時所耗時間短，同時可以檢查成百上千個病原體 4.在癥狀出現前作出前瞻性診斷。遺傳性疾病的基因診斷策略 1.直接診斷策略 2.間接診斷策略

感染性疾病的基因診斷策略 1.一般性檢出策略 2.完整檢出策略 腫瘤的基因診斷策略 1.檢測腫瘤相關基因 2.檢測腫瘤相關病毒基因 3.檢測腫瘤標志物 4.表觀遺傳學檢測

基因治療（Gene therapy）：將具有正常功能的基因置換或增補患者體內有缺陷的基因，從而達到治療疾病的目的。

廣義概念，將某種遺傳物質轉移到患者細胞內，使其在體內發揮作用，最終達到治療疾病的目的。基因治療的必備條件： 1.分子缺陷清楚

2.可以得到相應基因的克隆 3.病理生理機制已知 4.有利的風險-利益比 5.治療基因可以被調控 6.合適的靶細胞 7.有效安全 8.相關法規健全 基因治療的總體策略 針對致病基因：

（1）基因矯正（gene correction）

對于致病基因中的異常堿基進行精確修復，使其恢復正常功能；

（2）基因置換（gene replacement）

用正?；蛟谠惶鎿Q致病基因，使細胞DNA完全恢復正常狀態；

（3）基因增補（gene augmentation）

將正?；驅牖颊唧w細胞內，使其整合到染色體中一起表達，以補償缺陷基因的功能，但致病基因未去除；

（4）基因表達調節（modulation）

指將特定的反義核酸、RNA干擾或核酶等技術抑制目的基因表達從而消除致病基因的作用。針對非致病基因：（1）自殺基因

這種基因導入受體細胞后可產生一種酶，它可將原無細胞毒性或低毒藥

物前體轉化為細胞毒物質，將細胞受體細胞殺死，這種基因被稱為“自殺基因”。自殺基因導入腫瘤細胞后，可將腫瘤細胞殺死。但對正常細胞則無傷害作用。

（2）免疫基因治療

將某些細胞因子（IL-

2、GM-CSF等）基因導入腫瘤患者體內，以增強患者的抵抗力。

（3）耐藥基因治療

在腫瘤化療過程中，把產生抗藥物毒性的基因導入患者體內，從而使患者能耐受更大劑量的化療。

基因治療的基本程序

1.目的基因的選擇和獲取

2.目的基因與轉運載體結合 3.靶細胞的確認

4.載體攜帶外源基因進入細胞 5.外源基因的整合

6.外源基因的表達及檢測

7.治療作用及穩定性、安全性評價 逆轉錄病毒載體的特點

（1）結構和感染過程與普通逆轉錄病毒相似；

（2）可使靶細胞變成穩定表達目的基因的轉化細胞；（3）感染靶細胞后不擴散；

（4）假病毒感染靶細胞的效率非常高；（5）不感染非增殖細胞。缺點:

①容量小，只能容納8kb-10kb的外源基因片段；

②血清補體能使之失活；

③病毒滴度低，低于治療大腫瘤需要的滴度；

④病毒整合到DNA后，可能引起插入突變和激活癌基因的可能；

⑤宿主范圍有限，只感染增殖細胞，故在應用上有一定局限性。腺病毒載體特點（1）宿主范圍廣

（2）腺病毒蛋白表達不以宿主增殖為必要條件（3）可獲得高病毒效價（4）重組體非常穩定（5）不會引起腫瘤（6）有較高的安全性

（7）無包膜，不易被補體滅活，可直接在體內應用（8）不整合入染色體 痘苗病毒載體

優點：

1.宿主范圍廣泛且易于培養，容易獲得高滴度的病毒顆粒。

2.允許在同一或不同非必需區插入多個基因，以表達多種或一種外源蛋白。缺點：細胞毒性；病毒能被人體的補體系統滅活并降解

單純皰疹病毒載體 特點

（1）滴度高（2）容量大

（3）增殖細胞和非增殖細胞均可感染（4）不整合，但可長期存在并可穩定表達

脂質體載體：是用人造雙層磷脂質，包裝DNA 后形成的脂質體-DNA復合物。

優點：（1）無毒無抗原性；（2）目的基因與脂質體的包裹使其可以免受核酸酶降解，容量大；（3）可單獨或聯合其他載體使用，并可通過靜脈注射使目的基因進入特定部位。

缺點：表達時間短，不能通過細胞膜屏障

分子耦聯載體：由DNA、DNA結合因子和配體三部分組成。配體與特異的受體結合，經受體介導的細胞內吞途徑，將目的基因轉移至細胞內。

多聚物載體：利用帶正電荷的多聚陽離子與帶負電荷的DNA相結合，形成穩定的多聚復合物，使DNA不易被核酸酶降解，并可與細胞表面帶負電荷的受體相結合，而被攝入到細胞中。

納米微生物優點：

(1)納米脂質體主要由磷脂以及膽固醇合成，可以通過與細胞膜的融合或者胞吞作用將目的基因導入靶細胞；

(2)納米微生物材料具有生物兼容性和可生物降解性，在傳遞過程中無毒，無免疫原性，并且可以通過新陳代謝降解，因此不會對細胞產生毒性；

(3)通過調節納米材料的降解速度，還可以控制目的基因的釋放速度，延長其治療效果；

(4)納米基因載體比表面積大，并可在表面偶聯靶細胞的配體或抗體，實現基因治療的主動靶向性，大大提高基因傳遞的特異性和加強靶細胞對目的基因的攝取。

靶細胞的選擇原則：

（1）必須較堅固，足以耐受處理，并易于由人體分離又便于輸回體內；

（2）具有增殖優勢，生命周期長，能存活幾月至幾年，最后可延續至病人的整個生命期；（3）易于受外源遺傳物質的轉化；

（4）在選用反轉錄病毒載體時，目的基因表達最好具有組織特異性的細胞。干細胞:一種具有復制能力、可以形成各種組織的早期未分化細胞 進行基因治療必須具備下列條件：

（1）選擇適當的疾病，并對其發病機理及相應基因的結構功能了解清楚；（2）糾正該病的基因已被克隆，并了解該基因表達與調控的機制與條件；（3）該基因具有適宜的受體細胞并能在體外有效表達；

（4）具有安全有效的轉移載體和方法，以及可供利用的動物模型。

靶向性基因載體的選擇：

1.靶向特異性，并且可被免疫系統識別。2.高度穩定，容易制備，可濃縮和純化。3.安全，無毒性，對人體以及環境無危害。4.有利于基因高效轉移和長期表達。

反義技術：是指利用人工合成的反義RNA和反義DNA來阻斷基因的轉錄或復制，控制細胞生長在中間階段，使編碼蛋白質的基因能轉錄為mRNA，因而不能翻譯成相應的蛋白質，以達治療某一疾病的目的。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達。

小干擾性RNA（siRNA）：長雙鏈RNA被細胞內的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（small interfering RNA，siRNA）。

RISC ：RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex,)，siRNA與細胞內的某些酶和蛋白質形成復合體，稱為RISC。該復合體可識別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷。基因治療存在的問題：

1.導入基因的穩定高效表達；選擇合適的轉移方法；選擇適當的受體細胞。2.導入基因的安全性；一方面應構建相對安全的反轉錄病毒載體；另一方面，應尋找更安全的非病毒載體；體細胞基因治療。

3.基因治療與社會倫理道德?；蛑委煈獫M足的條件

1、單基因缺陷疾病

2、僅限體細胞的基因治療

3、靶細胞易獲取、培養、及回輸體內。

4、治療效果應勝過對病人的危害。

5、表達水平無需調控且無副作用。

6、需經動物實驗驗證安全可行。基因治療有待解決的問題

1、難以獲得真正有治療作用的基因。

2、外源基因的表達難以在體內精確調控。

3、體細胞經體外培養后，其生物學特性會有改變。

4、過多的外源蛋白對機體帶來可能的影響。

5、隨機整合潛在的威脅。

生物分子（Biomolecule）：泛指生物體特有的各類分子，是自然存在于生物體中的分子的總稱，是組成生命的基本單位。

生物大分子：生物體內結構具有一定規律性，由基本結構單位按一定順序和方式連接而形成的多聚體。主要是指蛋白質、核酸和糖復合物，是生命活動的物質基礎。提?。涸诜蛛x純化之前將經過預處理或破碎的細胞置于適當的溶液中，使被分離的生物大分子充分地釋放到溶液中，最大限度分離出來的過程。

根據作用原理生物分子的分離、純化可分為以下幾種類型：

（1）根據分子極性大小和溶解度的不同，如溶劑提取技術、鹽析法、分配層析法、分級沉淀法等；（2）根據分子形狀和大小不同，如凝膠過濾層析等；

（3）根據物質吸附性質不同，如選擇性吸附與吸附層析法等；

（4）根據分子帶電性（電離性質）的差異，如離子交換層析、電泳、等電聚焦法等。（5）根據配體特異性，如親和層析。影響提取效果的因素

1.2.3.4.5.6.PH值 鹽濃度 溫度 水解酶 攪拌與氧化 有機溶劑

鹽溶：蛋白質或酶在稀鹽溶液中，溶解質隨著鹽濃度升高而增加。

鹽析：蛋白質或酶在稀鹽溶液中，溶解質隨著鹽濃度升高而增加。但當鹽濃度達到一定數值時，其溶解度又以不同程度下降并先后析出。

選擇性沉淀法：生物大分子在物理化學性質等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白變性沉淀而得到分離提純。超濾：指在一定壓力下，使小分子溶質和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而大分子溶質不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質得到部分純化。

對于核酸的純化應達到以下三點要求：

（1）核酸樣品中不存在過高濃度的金屬離子和對酶有抑制作用的有機溶劑；

（2）其它生物大分子如蛋白質、脂類和多糖分子的污染應降至最低程度；（3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時應去除RNA，提取RNA分子時應去除DNA。

保持核酸的完整性

（1）溫度不要過高(0～4℃)；(高溫破壞氫鍵)（2）控制pH值范圍(pH值4-10);(極端酸堿破壞磷酸二酯鍵)（3）保持一定離子強度;

（4）減少物理因素對核酸的機械剪切力。

DNA提取，DNA樣品不純，抑制后續酶解和PCR反應。

原因：

1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質

2.DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續酶解反應 3.DNA中殘留有金屬離子 對策：

1.重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質（具體方法見前）2.重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發 3.增加70％乙醇洗滌的次數（2-3次）

DNA降解

原因：

1.材料不新鮮或反復凍融

2.未很好抑制內源核酸酶的活性

3.提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷 4.外源核酸酶污染 5.反復凍融 對策：

1.盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融

2.液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前加入裂解緩沖液

3.在提取內源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量 4.細胞裂解后的后續操作應盡量輕柔

5.所有試劑用無菌水配制，耗材經高溫滅菌 6.將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復凍融

DNA提取量少

原因： 1.實驗材料不佳或量少 2.破壁或裂解不充分 3.沉淀不完全 4.洗滌時DNA丟失 對策：

1.盡量選用新鮮（幼嫩）的材料

2.動植物要勻漿研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁 3.高溫裂解時，時間適當延長（對于動物細胞、細菌可增加PK的用量）4.低溫沉淀，延長沉淀時間 5.加輔助物，促進沉淀

6.洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒 蛋白質分離純化的總體原則 一是保證靶蛋白結構的完整，防止降解和活性蛋白質的變性； 二是盡量滿足研究與診斷對靶蛋白純度的要求。蛋白分離純化影響因素： 1.緩沖液2.鹽、金屬離子和螯合劑3.還原劑 4.去垢劑5.增溶劑 6.蛋白酶抑制劑7.蛋白質的環境因素：表面效應的影響；溫度的影響；保存的方式。

蛋白質的純度：指是否含有其他雜蛋白，而不包括鹽、緩沖液離子、SDS等小分子在內，及在一定條件下的相對均一性。

凝膠過濾層析：亦稱凝膠色譜、排阻色譜或分子篩，是利用凝膠把分子大小不同的物質分離開的一種方法。

電泳：蛋白質在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術, 稱為電泳。

親和層析：是以蛋白質與結合在介質上的配基間的特異親和力為工作基礎的蛋白質分離方法。

純化程度：常用某一特定靶蛋白成分的含量（一般用活力單位）與總蛋白量（質量單位）之比來表示。蛋白質的分離純化方法：

1.以溶解度的差異為依據的方法：鹽析、分配層析、有機溶劑沉淀、選擇性沉淀和結晶等； 2.以分子大小及形狀差異為依據的方法：差速離心、區帶離心、超濾、透析和凝膠過濾層析等； 3.以電離性質差異為依據的方法：電泳、離子交換層析等； 4.以生物學功能專一性為依據的方法：親和層析。生物小分子提取方法：

1、溶劑提取法

2、水蒸氣蒸餾法

3、升華法

4、超臨界流體萃取法

5、超聲提取法

6、固相萃取法

分離精制的原理主要是根據： 1.物質溶解度差別；

2.物質在兩相溶劑中的分配比不同； 3.物質的吸附性差別；

4.物質分子大小差異等進行分離 生物小分子純化方法 液-液萃取法

1、逆流分配法（CCD）

2、液滴逆流色譜法（DCCC）

3、高速逆流色譜法（HSCCC）

4、氣液分配色譜（GC或GLC）沉淀法

1.溶劑沉淀法 2.酸堿沉淀法 3.鹽析法 了解

超臨界流體：(SF)指某種氣體（液體）或氣體（液體）混合物在操作壓力和溫度均高于臨界點時，使其密度接近液體，而其擴散系數和黏度均接近氣體，是性質介于氣體和液體之間的流體。

超臨界流體萃取法（SFE）:利用超臨界流體為溶劑，從固體或液體中萃取出某些有效組分，并進行分離的一種技術。超生提取法：利用超聲波特殊的強縱向振動、空化效應、高速沖擊破碎、攪拌及加熱等物理性能，破壞提取物細胞結構，使溶劑能滲入細胞內部，從而加速有效成分的溶解，提高有效成分的提出率。

固相萃取法：利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達到分離和富集目標化合物的目的。PCR特點：

1.靈敏度高 皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平；能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；病毒檢測的靈敏度可達3個 PFU(空斑形成單位)；細菌檢測的最小檢出率為3個細菌

2.簡便、快速

一次性加好反應液，2～4 小時完成擴增；擴增產物一般用電泳分析 3.對標本的純度要求低

血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等組織的粗提DNA平臺效應:DNA的指數擴增并不能無限期地進行下去，PCR循環后期時由于引物、dNTP消耗、DNA聚合酶活力下降等因素使地擴增產物累積趨于飽和，原來以指數遞增的速率曲線變成平坦的曲線，此現象稱為平臺效應。

引物設計基本原則

1.引物長度，典型的引物為18-24個核苷酸，在一定范圍內引物需要足夠長，最多不超過50個核苷酸。

2.PCR產物長度，擴增片段長度在普通PCR以200～500bp為宜；實時熒光PCR則為50～150bp。3.引物的均衡性和GC含量，同一堿基連續出現不應超過5個，G-C含量一般為40-60%。

4.引物溶解溫度（Tm值），引物的Tm值一般控制在55-60度, 盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度.聚丙烯酰胺凝膠電泳特點

1.分辨力高，長度僅相差1bp的DNA分子即可分開； 2.上樣量遠大于瓊脂糖凝膠； 3.回收的DNA純度高；

4.采用銀染色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱點。PCR-限制性片段長度多態性分析法（PCR-RFLP）：根據目的基因序列可查出所包含的酶切位點，用相應的限制性核酸內切酶消化PCR擴增產物，然后進行電泳，觀察消化片段的大小是否與序列資料相符，從而確定產物的特異性。單鏈構型多態性分析法（PCR-SSCP）：將PCR 產物雙鏈DNA（dsDNA）變性為單鏈DNA（ssDNA），加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，由于DNA 分子在凝膠中的電泳遷移率與其分子量和空間結構有關，而空間結構又與ssDNA序列有關。因此，電泳結束后，ssDNA帶位置的差異即可反映出PCR產物序列的差異。PCR常見問題

一、假陽性

1.PCR產物是最主要的污染源。2.陽性對照的污染。

3.標本之間的交叉污染。

4.在采集標本時，其他污染源帶來的污染。5.用帶有污染的試劑。

二、假陰性

1.標本處理的原因

（1）處理標本時，靶DNA丟失。

（2）理標本時，雜質成分沒有去除干凈，帶入PCR反應中抑制了Taq酶活性。（3）標本放置不當，模板發生降解（尤其是RNA）

2.PCR試劑問題。

（1）引物設計不合理。（2）Taq DNA聚合酶失活。

（3）Mg2+濃度過低或是沒有加。3.PCR擴增過程中的問題

（1）PCR擴增儀故障。

（2）PCR擴增反應液沒有加液體石蠟油。

4.PCR產物鑒定中的問題

（1）電泳時沒有加溴化乙錠。

（2）電泳緩沖液和凝膠使用次數過多。（3）膠濃度過低，使擴增帶跑散。

三、引物二聚體

形成引物二聚體的原因有：

⑴兩個相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對，特別是引物3′端有互補區。

⑵引物比例太高，可增加模板用量。

⑶退火溫度過低。

⑷熱循環次數過多。

四、非特異性PCR產物

（1）引物特異性不高或用量太大，應更換引物或降低用量；

（2）TaqDNA聚合酶質量不好或用量太大，應更換酶或降低酶使用量；（3）Mg2+濃度過高，可適當調整其濃度；（4）退火溫度過低，可提高退火溫度；（5）延伸時間過長，可減少延伸時間；

（6）循環次數過多，應適當增加模板量，減少循環次數。

one-step RT-PCR：一步法RT-PCR，在同一體系中加入逆轉錄酶、逆轉錄引物、Taq DNA聚合酶、PCR引物、dNTP和緩沖液，直接以mRNA為模板進行逆轉錄和PCR擴增。多重PCR（multiplex PCR）：在一個反應體系中加入多對引物，同時擴增出多個核酸片段，由于每對引物擴增的片段長度不同，可用電泳加以鑒別。

重組PCR（recombinant PCR）：將兩個不相鄰的DNA片段重組在一起的PCR稱為重組PCR。該技術主要應用于DNA片段的任何位置引入點突變、插入、缺失以及兩個不相鄰片段的連接。

巢式PCR：用兩隊引物，一對引物序列在模板的外側，另一對引物在模板的內側。第一對引物做PCR的擴增產物作為第二對引物退火的模板，再做PCR。經過兩次PCR放大，靈敏度得以提高，并大大提高PCR的特異性。錨定PCR（anchored PCR，APCR）：用于擴增已知一端序列的目的DNA。

定量PCR:以參照物為標準，對PCR終產物進行分析或對PCR過程進行監測，從而達到評估樣本中靶基因的拷貝數，稱為定量PCR。

實時熒光定量PCR（RT-FQ-PCR）：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

Ct值的定義：PCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數

熒光定量PCR的臨床應用

1.遺傳疾病的早期診斷 2.腫瘤的診斷

3.抗病毒藥物療效的觀察、指導 4.病情評估和預后判斷 5.新藥驗證 6.輸血源的篩選

7.母嬰傳播的控制與觀察

PCR操作程序標準化

（一）上崗人員培訓制度

（二）標準化PCR診斷實驗室

（三）PCR標準化操作程序 1．試劑配制、分裝及保存 2．標本的采集與處理

3．基因擴增及其實驗條件的選擇 4．擴增產物檢測 5．PCR結果的判讀

（四）污染的預防及污染源的標準化處理

代謝組(metabolome)是指一個細胞、組織或器官中所有代謝物的集合, 包含一系列不同化學型的分子, 比如肽、碳水化合物、脂類、核酸以及異源物質的催化產物等。

代謝組學(metabonomics／metabolomics)通過考察生物體系（細胞、組織或生物體）受刺激或擾動后（如將某個特定的基因變異或環境變化后），其代謝產物的變化或其隨時間的變化，來研究生物體系的一門科學。

代謝組學特點：

1.關注于內源性小分子化合物。

2.對生物體系中的小分子化合物進行定性定量研究

3.內源性小分子化合物的上調和下調指示了與疾病、毒性、基因修飾或環境因子的影響。4.內源性化合物的特點用來表征疾病和藥物篩選。應用： 1.藥物研發 2.疾病研究 3.植物代謝組學 4.微生物代謝組學 5.中藥現代化

毛細管電泳-質譜聯用技術（CE-MS）：毛細管電泳是以毛細管為分離通道、采用高壓直流電場為驅動力的的新型液相分離技術，通過離子化合物的質荷比（m/z）不同造成遷移速率不同來實現分離。適用于普通反相色譜柱不易保留的離子性代謝物的分離分析。

miRNA：miRNA是由21~25個核苷酸組成的非編碼RNA；它通過與靶基因的3-UTR的配對，促進mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯從而抑制其靶基因的表達；它在生物體生長發育、細胞增殖、分化、凋亡以及人類各種疾病的發生發展過程中發揮重要的調控作用。

MicroRNA的起源與生物合成過程

1.miRNA基因被轉錄成pri-miRNA(RNA 聚合酶Ⅱ)；

2.pri-miRNA被剪切成具有70-100個核苷 酸 的pre-miRNA(Drosha,DGCR8)； 3.pre-miRNA從核內被轉移至胞質(Exportin-5, Ran-GTP)；

4.pre-miRNA被剪切成21-25個核苷酸的雙鏈 RNA雙體(Dicer,TRBP,PACT)； 5.雙鏈RNA雙體中成熟miRNA鏈會選擇性整合入RISC,并與mRNA互補配對。

MicroRNA的特征

1.廣泛存在于真核生物中, 是一類內源性表達的非編碼短序列RNA, 本身不具有開放閱讀框(ORF)； 2.成熟的miRNA長度通常為21～25nt； 3.miRNA在進化上具有高度保守性；

4.miRNA表達具有細胞和組織特異性，同時具有時序性

MicroRNA的調控機制

一、mRNA剪切 1.miRNA與靶mRNA幾乎完全互補；

2.切割位點在從5‘端起與miRNA配對的第10位和11位核苷酸之間 ； 3.由RISC中的內切酶催化完成； 4.可催化多個mRNA分子的降解

二、翻譯抑制

1.miRNA與靶mRNA互補程度較低；

2.翻譯抑制可能發生在翻譯起始后的某一階段； 3.翻譯順利進行但翻譯產物可能被特異性降解

MicroRNA表達的研究方法

1.miRNA基因芯片技術

2.PAGE/Northern blotting雜交法 3.原位雜交

4.miRNA實時定量PCR

MicroRNA功能研究方法

一、miRNA體外或體內水平的過表達研究 1.構建相應的表達載體

2.體外合成miRNA前體分子

二、miRNA表達抑制研究 3.基因水平抑制miRNA表達

4.使用反義核酸分子抑制miRNA表達

miRNA研究的實驗技術

1.miRNA基因的克隆

2.PAGE/Northern blotting 3.miRNA基因芯片技術 4.miRNA實時定量PCR

miRNA基因克隆的基本步驟

（一）總RNA的提取

關鍵：盡量不使小RNA丟失

（二）小分子RNA分離純化及富集

變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）方法是用于小分子RNA分離純化的理想方法。

（三）小分子RNA片段修飾

小分子RNA的修飾包括磷酸化、去磷酸化以及在3‘端和5’端連接上連接子等

（四）克隆及測序鑒定

含3‘與5’端接頭的小分子RNA，經RT-PCR擴增后連接至合適的載體，轉化克隆，最后用相關方法鑒定陽性克隆。

（五）PAGE/Northern blotting驗證

PAGE/Northern blotting方法是確認microRNA 最有效 和常用的方法。

PAGE/Northern blotting基本操作步驟

（一）總RNA的提取

關鍵：盡量不使小RNA丟失

（二）樣品處理

取適量提取的RNA樣品于上樣緩沖液及去離子甲酰胺中 混勻，55℃孵育30 min，冰浴后準備PAGE分離。

（三）PAGE分離、轉膜及固定

（四）寡核苷酸探針的制備 探針標記可選擇放射性核素或非放射性熒光，其中放射 性核素敏感度高，可檢測較低豐度的microRNA分子

（五）雜交、洗膜、壓片及顯影

（六）如果選用放射性標記的探針，在分析結果后要去除Northern印記膜上的放射性，避免放射性污染。

MicroRNA基因芯片技術主要應用：

（1）尋找和發現新microRNA基因；

（2）miRNA相關疾病的診斷和治療，如腫瘤、白血病、糖尿病等；

（3）藥物篩選和藥物開發等；

MicroRNA基因芯片技術操作流程

（一）MicroRNA基因芯片的設計與制作

（二）RNA提取與純化

（三）RNA樣品的標記

（四）芯片雜交及后處理

（五）圖像采集和數據分析

（六）驗證

MicroRNA實時定量PCR主要應用：

（1）microRNA的定量檢測，可精確檢測出細胞或組織樣品中特定微量的microRNA表達水平；

（2）由于該方法可以同時檢測microRNA及其前體，因此，可以根據兩者在不同發育階段的表達差異情況來深入了解microRNA的起源和發生；（3）應用于臨床診斷和治療等。

MicroRNA實時定量PCR操作步驟

（一）總RNA提取、小分子RNA的分離純化及富集

（二）逆轉錄反應

（三）實時定量PCR MicroRNA造成疾病發生的可能原因：突變、基因表達失活、低效轉錄等原因造成的microRNA表達下調；啟動子區域基因擴增或突變等原因造成的microRNA表達上調等。MicroRNA引發腫瘤的可能原因：

（1）microRNA與細胞的增殖、分化、凋亡密切相關，而腫瘤則是由細胞增殖、分化、凋亡功能紊亂而引發的 ；（2）許多microRNA的基因位于基因組中易發生斷裂、移位、缺失等變異的區域 ；（3）與正常組織相比，在惡性腫瘤和腫瘤細胞株中普遍存在著對microRNA的表達失控 MicroRNA引發糖尿病的可能原因：

（1）MicroRNA參與胰島素的合成分泌調節；（2）MicroRNA對血糖代謝起著直接或間接的調控作用；（3）MicroRNA與脂質代謝密切相關； 附作業一

1.斷裂基因: 基因是核酸分子中貯存遺傳信息的遺傳單位，一個基因不僅僅包括編碼蛋白質或 RNA 的核酸序列，還包括保證轉錄所必需的調控序列、位于編碼區 5 ' 端與 3 ' 端的非編碼序列和內含子。真核生物的結構基因，由若干個編碼區和非編碼區互相間隔開但又連續鑲嵌而成，去除非編碼區再連接后，可翻譯出由連續氨基酸組成的完整蛋白質，這些基因稱為斷裂基因（split gene）。

2.單核苷酸多態性：主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數可達300萬個甚至更多。1.簡述真核生物基因組的結構與功能特點。答：（1）真核生物細胞核基因組的結構和功能。

①：真核生物基因組存在大量的重復序列 a)單拷貝序列（低度重復序列）b)中度重復序列 c)高度重復序列

d)重復序列的多態性：主要包括單核苷酸多態性和串聯重復序列多態性 ②：真核基因組存在多基因家族和假基因

多基因家族：是指由某一祖先基因經過重復和變異所產生的一組基因。

假基因：是指與某些有功能基因結構相似，但不能表達有功能基因產物的某些基因。（2）真核生物細胞器基因組的結構和功能

真核生物有兩類細胞器能攜帶遺傳物質：線粒體和葉綠體

大多數細胞器基因組是環狀DNA，某些低等真核生物（如草履蟲、衣滴蟲和幾種酵母）的線粒體DNA是線狀分子。線粒體基因組的大小差異比較大，從1萬至數百萬bp不等。高等動物線粒體基因組具有獨特的特點：母系遺傳；線粒體DNA損傷后不易修復，突變率高，可能與衰老及某些疾病有關；遺傳密碼與通用遺傳密碼存在差別。2.試述雙向凝膠電泳技術的基本原理。

答：蛋白質組研究的發展以雙向電泳技術（2-DE）作為核心。原理簡明：是利用蛋白質的帶點性和分子量大小的差異，通過兩次凝膠電泳達到分離蛋白質的技術。第一向電泳是依據蛋白質的等電點不同，通過等電聚焦電泳（isoelec-tricfocusing，IEF）將不同凈電荷的蛋白質在PH梯度介質中外加電場作用形成分離的蛋白質區帶。然后將凝膠包埋在SDS-PAGE凝膠板上端，根據蛋白質分子量的不同，在垂直或水平方向進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），即第二向電泳。在IEF中，蛋白質因等電點不同而被分離，在SDS-PAGE中，不同分子量的蛋白質相互間被分離開。作業二

1.分子克隆技術包括哪些基本步驟？

答：分子克隆技術的基本步驟大致包括：①目的基因的獲取；②載體的選擇；③目的基因與載體連接；④重組DNA導入受體細胞；⑤重組體的篩選等；即分、切、接、轉、篩等過程。2.目的基因和載體連接主要有哪些方法？

答: 目的基因與載體構建成重組體的方法主要有：1).粘性末端DNA分子的連接2).平末端連接法3).通過同聚尾連接。

3.簡述分子克隆中常用的工具酶及其作用。

在分子克隆技術中，常用的工具酶主要有：1.限制性核酸內切酶，它是一類能識別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶；2.DNA聚合酶Ⅰ，它具有3種酶活性：1)5'→3'聚合酶活性；2)3'→5'核酸外切酶活性；3)5'→3'核酸外切酶活性；3.反轉錄酶，其功能主要有：1)逆轉錄作用2)核酸酶H的水解作用3)依賴DNA的DNA聚合酶作用；4.DNA連接酶，它在DNA重組中的主要功能是催化兩個互補粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的5'磷酸基團與3’羥基形成磷酸二酯鍵，將具有相同粘性末端或平末端的兩條雙鏈DNA片段連接起來，實現DNA的體外重組；5.堿性磷酸酶，它的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5'-磷酸基團；6.末端脫氧核糖核苷酰轉移酶，其功能主要有：1)在載體或目的基因 3'末端加上互補的同質多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重組連接。2)用于DNA 3'末端的同位素探針標記；7.核酸酶S1，其作用是除去雙鏈DNA的粘性末端以產生平末端、除去cDNA合成時形成的發夾結構以及分析RNA的莖環結構和DNA-RNA分子的雜交情況等。4.舉例說明載體應具備的基本要素。

答: 載體應具備以下特征：1)能自我復制并具有較高的拷貝數，并有適宜的分子量，一般應< 10 kb；2)帶有遺傳篩選標記；3)有適當的限制酶切位點，便于外源基因的插入和篩選。5.簡述雙抗生素篩選和藍白斑篩選的原理。

答：1.雙抗生素篩選的原理是：因大多數質粒載體帶有抗生素抗性標記的特征（如Ampr、Tetr等），當帶有完整抗性基因的載體轉化無抗性細菌后，被轉化的陽性菌獲得抗生素抗性基因而存活并形成噬菌斑，未轉化菌不能存活，但應排除未重組的空載體。2.藍白斑篩選的原理：某些質粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ基因，該基因含一段編碼β-半乳糖苷酶氨基末端145個氨基酸α-肽的DNA片段，IPTG可誘導此片段合成，此片段能與宿主細胞所編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶實現基因內α-互補，形成完整的β-半乳糖苷酶。該酶能催化指示劑底物X-gal 形成藍色菌落。當外源基因插入lacZ基因中MCS，lacα-肽基因閱讀框架被破壞，細菌內將無β-半乳糖苷酶活性，結果重組克隆呈白色菌落。6.有哪些常用的探針標記物？

答：常用的探針標記物有：1.放射性同位素標記，常用標記探針的同位素有 32P、3H、35S、131I、125I 等。2.非放射性標記，常用的非放射標記物有辣根過氧化物酶（HRP)、熒光素、生物素、光敏生物素、地高辛(DIG)等。

7.如何進行探針的標記？

答：1.放射性同位素標記探針的的方法有缺口平移法、隨機引物法、末端標記法和反轉錄標記法等。2.非放射性標記核酸探針的方法分為化學修飾標記法和酶促反應標記法兩大類： ① 化學修飾標記法是利用標記物分子上的活性基團與探針分子上的某些基團發生化學反應，將標記物直接或間接結合到探針分子上?；瘜W標記法具有方法簡單、成本低、標記方法較通用，也是目前較為常用的標記方法； ② 酶促反應標記法是將標記物預先標記在單核苷酸分子上，然后利用酶促反應將標記的核苷酸分子摻人到核酸探針分子中。這種標記法具有靈敏度高的優點，但其標記過程較復雜、成本較高。

8.影響核酸分子雜交的因素有那些？如何進行雜交條件的優化？ 答：影響核酸分子雜交的因素有: 雜交方法的選擇、探針的選擇、探針的濃度、溫度、雜交液的成分、反應時間等。核酸分子雜交實驗條件的優化有：

1.探針的選擇：針對不同的雜交實驗，選擇不同的核酸探針，在大多數情況下，可以選擇克隆的 DNA 或 cDNA 雙鏈探針。但在檢測靶序列上的單個堿基改變時應選用寡核苷酸探針，在檢測單鏈靶序列時應選用與其互補的 DNA 單鏈探針或 RNA 探針。

2.探針的標記方法，選擇什么標記方法視靈敏度和顯示方法等實驗要求和條件而定。

3.探針的濃度：隨探針濃度增加，雜交率也增加，在較窄的范圍內，隨探針濃度增加，敏感性增加。4.雜交最適溫度，在實驗前必須首先確定雜交溫度。5.雜交反應時間，一般雜交反應要進行 20 h 左右。

6.洗膜溫度，雜交后的最終洗膜溫度一般應低于 Tm 值 5~ 12 ℃ 進行。

7.雜交液的優化,通常用于 DNA 雜交的標準雜交液為 5×SSC, 1.0%casein , 0.1% 十二烷基肌氨酸，0.02% 十二烷基硫酸鈉。但除了以上成分外，必要的時候可以加一些雜交促進劑。常用的有硫酸葡聚糖，它能促進 DNA 鏈之間的締合。作業三

一、名解

1.生物大分子：指的是作為生物體內主要活性成分的各種分子量達到上萬或更多的有機分子。常見的生物大分子包括蛋白質、核酸、脂類、糖類。

2.酚抽提法：最初于1976年由Stafford及其同事提出，通過改良，以含EDTA、SDS及無DNA酶的RNA酶裂解緩沖液破碎細胞，經蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復抽提至一定純度后，根據不同需要進行透析或沉淀處理獲得所需的DNA樣品。

3.凝膠過濾層析：凝膠過濾層析也稱分子排阻層析或分子篩層析，利用凝膠分子篩對大小、形狀不同的分子進行層析分離，是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。

4.巢式PCR ：巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(PCR)，使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內部）結合在第一次PCR產物內部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴增產生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR的擴增非常特異。5.Real-time PCR：實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

6.變性：模板DNA經加熱至94℃左右5min 聚合酶鏈式反應時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備。

7.復性 ：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。

8.退火：溫度突然降至37-58℃時，變性的DNA單鏈在堿基互補的基礎上重新形成氫鍵開始復性。一般退火溫度比引物Tm值約低5℃。

1.根據作用原理生物分子的分離純化有那幾類？

答：根據作用原理生物分子的分離純化可分為：（1）根據分子極性大小和溶解度的不同，如溶劑提取技術、鹽析法、分配層析法、分級沉淀法等；（2）根據分子形狀和大小不同，如凝膠過濾層析等；（3）根據物質吸附性質不同，如選擇性吸附與吸附層析法等；（4）根據分子帶電性（電離性質）的差異，如離子交換層析、電泳、等電聚焦法等。（5）根據配體特異性，如親和層析。2.什么原因易引起DNA降解，該如何解決？

答：引起DNA降解的原因有：1）材料不新鮮或反復凍融2）未很好抑制內源核酸酶的活性3）提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷4）外源核酸酶污染5）反復凍融。

相應的解決方法有：1）盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融；液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前加入裂解緩沖液2）在提取內源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量3）細胞裂解后的后續操作應盡量輕柔4）所有試劑用無菌水配制，耗材經高溫滅菌5）將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復凍融。3.簡述PCR技術的基本原理及其反應體系的一般組成？

答：PCR技術的基本原理是DNA的半保留復制，是在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應。在反應中混合下列物質：模板DNA、四種dNTP（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、引物

1、引物

2、TaqDNA聚合酶、緩沖液及Mg2+（MgCl2），然后經下列過程大量擴增靶DNA。基本的反應分變性、退火、延伸等三步完成。

4.試分析PCR出現非特異性擴增產物的原因及解決方法？ 答：（1）引物特異性不高，引物用量過多，應調換引物或降低引物用量。（2）TaqDNA聚合酶質量不好或用量偏高，應降低酶量或使用質量較好的酶。（3）Mg2+濃度過高，可適當調節Mg2+濃度。（4）退火溫度過低，退火及延伸時間偏長，可提高退火溫度，減少退火及延伸時間，或者采用二溫循環PCR進行擴增。（5）熱循環次數過多，適當增加模板用量，減少循環次數。作業四

一、名解 1.代謝組學：通過考察生物體系（細胞、組織或生物體）受刺激或擾動后（如將某個特定的基因變異或環境變化后），其代謝產物的變化或其隨時間的變化，來研究生物體系的一門科學。其研究對象大都是相對分子質量1000以內的小分子物質。

2.毛細管電泳：毛細管電泳是以毛細管為分離通道、采用高壓直流電場為驅動力的的新型液相分離技術，通過離子化合物的質荷比（m/z）不同造成遷移速率不同來實現分離。

3.NMR：基于具有自旋性質的原子核在核外磁場的作用下，吸收射頻輻射而產生的能級躍遷譜學，主要用于反映化合物結構中的H和C原子的位置信息。

4.gene therapy：基因治療將某種遺傳物質轉移到患者細胞內，使其在體內發揮作用，最終達到治療疾病的目的。5.stem cell：干細胞將某種遺傳物質轉移到患者細胞內，使其在體內發揮作用，最終達到治療疾病的目的。

6.CRISPR/Cas system：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated(Cas)）Cas系統廣泛存在于細菌及古生菌中, 是機體長期進化形成的RNA指導的降解入侵病毒或噬菌體DNA的適應性免疫系統?；诩毦倪@種免疫功能，人們把Ⅱ型CRISPR-Cas系統改造成一種全新的人工核酸內切酶，從而使該系統能夠對靶基因進行修飾。

二、問答 1.簡述代謝組學特點？

答：1.關注于內源性小分子化合物。

2.對生物體系中的小分子化合物進行定性定量研究

3.內源性小分子化合物的上調和下調指示了與疾病、毒性、基因修飾或環境因子的影響。4.內源性化合物的特點用來表征疾病和藥物篩選。2.簡述MicroRNA的生物合成過程？

答：1.miRNA基因被轉錄成pri-miRNA(RNA 聚合酶Ⅱ)；

2.pri-miRNA被剪切成具有70-100個核苷 酸 的pre-miRNA(Drosha,DGCR8)； 3.pre-miRNA從核內被轉移至胞質(Exportin-5, Ran-GTP)；

4.pre-miRNA被剪切成21-25個核苷酸的雙鏈 RNA雙體(Dicer,TRBP,PACT)； 5.雙鏈RNA雙體中成熟miRNA鏈會選擇性整合入RISC,并與mRNA互補配對。3.簡述miRNA功能研究方法？

答：1.miRNA體外或體內水平的過表達研究 1.1 構建相應的表達載體 1.2 體外合成miRNA前體分子 2.miRNA表達抑制研究

2.1 基因水平抑制miRNA表達

2.2 使用反義核酸分子抑制miRNA表達 4.MicroRNA引發腫瘤的可能原因？ 答：（1）microRNA與細胞的增殖、分化、凋亡密切相關，而腫瘤則是由細胞增殖、分化、凋亡功能紊亂而引發的 ；

（2）許多microRNA的基因位于基因組中易發生斷裂、移位、缺失等變異的區域 ；

（3）與正常組織相比，在惡性腫瘤和腫瘤細胞株中普遍存在著對microRNA的表達失控 5.簡述基因治療的必備條件。

答：1）分子缺陷清楚2）可以得到相應基因的克隆3)病理生理機制已知 4)有利的風險-利益比 5)治療基因可以被調控 6)合適的靶細胞 7)有效安全 8)相關法規健全。6.簡述骨髓干細胞的特性。

答：1）具有可移植性和自我更新能力，在體內永不耗竭，只需單次治療；2）具有多能性，可分化為粒、紅、淋巴和血小板等各種血細胞，且在分化過程中保持基因組的相對穩定，使目的基因隨細胞的分化成熟而相對擴增，病人可終身受益；3）外源基因表達產物可通過血液循環遍布全身； 4）造血干/祖細胞的功能活性可在體內外進行分析；5）取材于自體骨髓或臍帶血，易于獲取也便于植回并存活，臨床已有成熟技術。7.簡述基因治療有待解決的問題。

答：1)難以獲得真正有治療作用的基因 2)外源基因的表達難以在體內精確調控 3)體細胞經體外培養后，其生物學特性會有改變 4)過多的外源蛋白對機體帶來可能的影響 5)隨機整合潛在的威脅。

第二篇：分子生物學課程教學大綱

《分子生物學》課程教學大綱（理論學時：16學時）

使用教材： 醫學分子生物學

（供8年制及7年制臨床醫學等專業用）

分子生物學是一門從分子水平研究生命現象、生命的本質、生命活動及其規律的科學。醫學分子生物學是分子生物學的一個重要分支，是從分子水平研究人體在正常及疾病狀態下生命活動及其規律的一門科學。它主要研究人體生物大分子和大分子體系的結構、功能、相互作用及其同疾病發生、發展的關系。作為一門課程，醫學分子生物學涵蓋了醫學各專業學生必須學習的分子生物學基礎知識，以及分子生物學在醫學領域中形成的專門研究領域及相關知識。

醫學分子生物學既要較系統地了解分子生物學的基礎理論知識和技術理論知識，同時也要了解分子生物學在醫學領域的應用和相關研究進展。

本書共二十三章，包括5個方面內容。第二章至第十章介紹分子生物學基本知識，主要介紹基因和基因組的基本概念和基本特點，基因組核酸復制與損傷修復、基因表達和功能蛋白形成與降解、基因表達調控、細胞間通訊與信號轉導的基本概念和基本理論，細胞增殖與凋亡的相關分子生物學機制。第十一章至第十三章介紹基因操作的基本知識，包括基因分析、基因功能研究和基因克隆與表達的相關基本知識和研究策略。第十四章至第十八章介紹疾病分子生物學機制，介紹了基因和基因組、細胞間通訊和信號與人類健康和疾病之間關系。第十九章至第二十一章介紹分子生物學理論與技術在醫學中應用，包括基因診斷和基因治療概念與相關研究。最后兩章介紹分子生物學新興研究領域、生物信息學在基因和蛋白質研究中的應用。

本大綱正是從上述目的出發，在要求學生掌握分子生物學基本知識與基本技術，同時了解分子生物學在醫學領域的應用與相關研究。使學生們在分子水平上研究人體在正常及疾病狀態下生命活動及其規律，為從事臨床醫學打下深厚的基礎。

緒 論

一、目的要求

了解分子生物學的定義、研究對象和研究內容；分子生物學發展簡史；生物遺傳物質的發現；現代分子生物學的建立和深入發展；分子生物學與相關學科的關系；分子生物學在醫學和生物學中的應用。

二、主要內容

分子生物學則是從分子水平研究生命現象及其規律的一門新興學科。它以核酸和蛋白質等生物大分子的結構與功能為研究對象

（一）、分子生物學的研究內容

分子生物學主要研究生物大分子的結構、功能、生物大分子之間的相互作用及其與疾病發生、發展的關系。

研究內容主要包括以下三個方面。1.核酸分子生物學 2.蛋白質分子生物學 3.細胞信號轉導

（二）、分子生物學發展簡史

1、生物遺傳物質的發現

2、現代分子生物學的建立

3、現代分子生物學的深入發展

（三）、分子生物學與相關學科的關系

由于生命本質的高度一致性，分子生物學已經對生物學和醫學的各個領域產生了全面而深刻的影響，并逐步形成了一系列的分子學科?？梢允褂猛惶桌碚?、同一套技術，來解釋和研究不同的病理、生理現象，甚至治療不同的疾病。

1、分子生物學與生物化學

2、細胞生物學與分子生物學

3、分子生物學與遺傳學

4、分子生物學與生物技術

（四）、分子生物學與醫學未來

分子生物學的發展和滲透從根本上改變了醫學（包括臨床和基礎醫學）各個學科的格局, 使醫學各學科進入了一個更高的水平——分子水平。

1、分子生物學在醫學和生物學中的應用

2、分子生物學與基礎醫學

3、分子生物學和病理學

4、分子生物學和疾病診斷

5、分子生物學和疾病治療

基因治療技術的發展與整個醫學科學的發展以及許多分子生物學新理論、新技術、新方法的應用密切相關。

所謂基因治療，就是用正常基因置換致病基因以糾正患者基因結構和功能異常的一種疾病治療的方法。

狹義的基因治療是指目的基因導入靶細胞后與宿主細胞內的基因發生整合、成為宿主基因組的一部分，目的基因的表達產物起治療疾病的作用。廣義的基因治療則包括通過基因轉移技術，使目的基因得到表達，封閉、剪切致病基因的mRNA，或自殺基因產物催化藥物前體轉化為細胞毒性物質，殺死腫瘤細胞，從而達到治療疾病的目的。

三、學時安排 1學時

第二章 基因與基因組

一、目的要求：

（一）掌握：基因的概念及結構特點；中心法則；基因轉錄調控相關序列；多順反子，單順反子；真核基因與原核基因的結構特點?；蚪M的概念；病毒、細菌及真核生物基因組的結構特征。

（二）熟悉：基因突變的意義，基因組變異的生理和病理學意義。

（三）了解：基因的命名法，基因組學；人類基因組計劃。

二、主要內容

基因是負責編碼RNA或一條多肽鏈的DNA片段，包括編碼序列、編碼序列外的側翼序列及插入序列。編碼RNA或蛋白質的DNA序列稱為結構基因。原核生物的結構基因是連續的，其RNA合成后不需要經過剪接加工。而大多數真核生物基因在編碼區內有非編碼的插入序列?；蛑泻信c轉錄有關調控序列。真核生物基因中調控序列一般稱為順式作用元件。

大多數生物的遺傳信息都是以特定的核苷酸排列順序貯存在DNA分 子中。但在一些病毒中，RNA作為遺傳物質。多數生物信息按照從DNA到RNA再到蛋白質的方向流。但是對RNA病毒是以RNA為模板，合成單鏈DNA，然后再合成雙鏈DNA。

mRNA將DNA中信息傳遞給蛋白質。在mRNA編碼區內每三個連續核苷酸，對應多肽鏈一個氨基酸，指導蛋白質合成。原核生物mRNA稱多順反子mRNA，而真核生物mRNA稱單順反子mRNA。

基因突變在進化上具有重要意義，它是形成生物多樣性主要因素之一。同時基因突變可以改變遺傳信息，導致疾病。導致基因突變因素有自發、物理、化學因素等，基因突變可直接影響蛋白質一級結構和空間結構，導致疾病或對疾病易感。

基因命名的基本原則是簡明、獨特、能夠表達基因的特征或功能?；蚍柕拿矐裱毺亍⒑喍?、僅含有大寫拉丁字母或大寫字母和阿拉伯數字、不應含有標點符號的基本原則。

1．重點內容：基因轉錄調控相關序列；多順反子，單順反子；基因組的概念；病毒、細菌及真核生物基因組的結構特征。

2．難點內容：基因的結構特點，真核生物基因組的結構特征。

三、學時安排

5學時

第三章 基因表達與基因表達調控

一、目的要求：

（一）掌握：遺傳信息表達，轉錄，翻譯，有意義鏈，轉錄模板鏈，開放閱讀框，遺傳密碼等基本概念。基因表達，管家基因，組成性基因表達，誘導表達，阻遏表達，協調表達，表達調控，反式作用因子，表達組織特異性等基本概念；乳糖操縱子的結構及其調節機制。

（二）熟悉：原核生物RNA和蛋白質的生物合成基本過程，真核生物RNA和蛋白質合成特點；真核生物基因表達調控的各個水平，DNA水平調控的不同方式，反式作用因子的主要特點和調節方式，轉錄后調控的不同環節，翻譯水平和翻譯后水平調控的基本環節

（三）、了解：了解轉錄和翻譯后的加工。反式作用因子結構域模式和反式作用因子的作用方式，基因表達的組織特異性和時相性。

二、主要內容

原核生物基因表達調控主要是在轉錄水平和翻譯水平。轉錄水平的調控涉及啟動子、S因子、阻遏蛋白、正調控蛋白等多種因素，翻譯水平的調控則涉及SD序列、mRNA的穩定性及翻譯產物的調控。

真核生物基因表達調控環節較多，在DNA水平可通過染色體丟失、基因擴增、基因重排、DNA甲基化以及染色質結構改變影響基因表達；在轉錄水平則主要通過反式作用因子的作用調控轉錄因子與TATA盒的結合、RNA聚合酶與轉錄因子-DNA復合物的結合以及轉錄起始復合物的形成；在轉錄后水平主要通過RNA修飾、剪接及mRNA運輸的控制來影響基因表達；影響翻譯水平的因素有影響翻譯起始的陰遏蛋白、5`AUG、5` 端非編碼區的長度等，另外還存在小分子反義RNA對翻譯調控。翻譯后蛋白質修飾和定位也是表達調控的重要環節。

同時近年提出的有關基因表達的統一理論慚被認識。從而形成一個完整的調控網絡。

1、重點內容：

原核生物轉錄水平的調控機制；真核生物轉錄水平的調控機制；真核生物轉錄后水平的調控機制。

2、難點內容：

原核生物轉錄水平的調控機制。

三、學時安排

4學時

第四章 基因分析的基本策略

一、目的要求

（一）掌握：Southern 雜交和PCR等技術原理及在分析基因拷貝數的應用；Northern blot和RT-PCR技術原理及在基因轉錄水平變化分析中的應用；

（二）熟悉：Western blot 原理及在特定基因產物-蛋白質分析中的應用。

（三）了解：DNA序列測定的原理及其主要應用；RNA酶保護試驗原理及應用；原位雜交技術；DNA微陣列技術原理； 流式細胞術的應用；免疫 組化方法的應用。

二、主要內容

基因分析是一種策略性很強的工作，有許多技術可以用于基因分析，正確選擇實驗技術方法和基因分析切入點是進行基因分析首先要考慮的問題。根據信息中心法則，DNA是遺傳信息的攜帶者，RNA是基因的轉錄產物，蛋白質是結構基因的最終產物，因此，分析基因可從DNA、RNA、蛋白質水平上進行。同時研究者善于將各種技術有機結合起來，根據研究目的篩選適當技術方法，也可先制定研究策略，再進行實驗技術路線設計。

1、重點內容：Southern 雜交和PCR等技術原理及應用；Northern blot和RT-PCR技術原理及應用Western blot 原理及應用。

2、難點內容：RNA酶保護試驗原理及應用。

三、學時安排

3學時

第五章基因功能分析的基本策略

一、目的要求

（一）掌握：轉基因模型研究基因的功能原理、基因敲除技術原理、利用基因沉默技術對基因功能進行分析的原理

（二）了解；三種實驗技術的操作過程及注意事項

二、主要內容

基因功能分析可以在DNA、RNA和蛋白質水平上采用不同的技術和模 型來實現。模式生物是研究基因功能不可缺少的工具，轉基因小鼠和基因敲除技術是目前研究特定基因功能最常用的動物模型，轉染細胞是利用轉基因技術建立的細胞模型。RNA干涉技術能夠實現在RNA水平上暫時關閉特定基因的方法。各種方法都具有各自的特點及局限性，研究者可根據不同目的篩選最合適方法與模型，實現對特定基因功能的研究目的。

1、重點內容：轉基因技術、基因敲除技術及RNA干涉技術原理

2、難點內容：轉基因技術、基因敲除技術及RNA干涉技術各自優點及局限性

三、學時安排

3學時

第六章 基因工程與體外表達

一、目的要求：

（一）、掌握：常用克隆載體；基因克隆的基本過程；外源基因在大腸桿菌和哺乳動物細胞中表達的原理和方法。

（二）、熟悉：限制性核酸內切酶和其他常用工具酶的概念和特點；定點誘變技術原理。

（三）、了解：昆蟲表達系統；酵母表達系統。

二、主要內容：

基因工程指在體外對DNA分子按照既定的目的與方案進行剪切和重新連接，或將DNA中某個位點進行人工替換或刪除，改造基因結構，然 后利用轉化、轉染、感染等方法將重組DNA導入宿主細胞，使DNA片段得到擴增。DNA的體外剪切和重新連接是在限制性核酸內切酶、邊接酶以及其他修飾酶的參與下進行的。不同目的的克隆基因需要不同的載體，常用的載體有質粒、噬菌體和粘性質粒等。載體可與外源DNA在體外連接，構成重組DNA分子，導入相應的宿主細胞，能在宿主細胞中自行復制與表達。

克隆的基因可進一步用于表達有關基因的產物，進行DNA序列分析，基因治療，研究基因表達的調節因子以及基因的功能等。還可通過寡核苷酸介導法、含U模板法、PCR介導的定點誘變法等技術，定向改變克隆基因的序列結構，從而改造相應蛋白的結構。

基因工程在得到重組體后，通常利用大腸桿菌、哺乳動物細胞、昆蟲、酵母等表達系統進行克隆基因的體外表達。

1、重點內容：基因克隆的基本操作過程。

2、難點內容：α－互補篩選；陽性轉染細胞的篩選；定點誘變技術原理。

三、學時安排：

6學時

第七章 基因診斷(自學)

一、目的要求：

（一）掌握：基因診斷的基本概念；掌握基因診斷中常用的分子生物學技術——核酸分子雜交、聚合酶鏈式反應（PCR）、單鏈構象多態性（SSCP）檢測、限制性酶酶譜分析、DNA序列測定、DNA 芯片技術；

（二）熟悉基因診斷的基本方法；

（三）了解遺傳病、感染性疾病以及腫瘤的基因診斷的策略；了解基因診斷在法醫學中的應用。

二、主要內容：

基因診斷已成為臨床實驗醫學的一個重要組成部分。PCR擴增和分子雜交是現代基因診斷技術的基本方法，基因診斷的基本操作流程是：樣本抽提、樣本擴增、分子雜交和信號檢測。遺傳病的基因診斷主要是針對DNA分子的遺傳分析技術，其基本方法學包括連鎖分析和直接診斷。用作連鎖分析的遺傳標志物主要有RFLP、STR、SNP。用于遺傳分析的代表性直接診斷技術有：用于DNA制圖的Southern印跡法、用于檢測點突變的ASO分子雜交法以及用于識別STR序列的PCR直接擴增法等。同時基因診斷技術已經成為現代法醫學的重要內容。

1、重點內容：各種檢測方法原理

2、難點內容：各自優點及缺點

三、學時安排

3學時

第八章 基因治療(自學)

一、目的要求：

（一）掌握：基因治療、基因標記、基因置換、基因添加、基因干預、反義RNA、核酶等基本概念；

（二）熟悉：基因轉移技術，逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒載體的特點；熟悉腫瘤基因治療思路，理解抑癌基因治療原理、實驗研究和臨床試驗及腫瘤的免疫基因治療；理解反義RNA在基因治療中的意義和應用；

（三）了解：了解其它基因轉移方法；了解核酶及三鏈DNA在基因治療中的意義和基本原理；了解基因治療的前景與問題。

二、主要內容

基因治療是指以改變人類遺傳物質為基礎的生物醫學學治療，即通過一定方式將人正?；蛞吧突蚧蛴兄委熥饔玫腄NA順序導入人體靶細胞，以矯正或轉換致病基因的治療方法。目前開展基因治療方案采取的策略包括：用正常基因置換染色體上致病基因，將正?；蜣D移至患者的宿主細胞，使治療基因代替致病基因表達正常蛋白質而發揮作用；向患者體內或腫瘤細胞內導入腫瘤抑制基因，以抑制其表達；也可用反義RNA、SiRNA、核酶、肽核酸抑制或封閉有害基因mRNA表達；也可將抗體、細胞因子等基因導入腫瘤細胞以激活體內免疫細胞活力，增強患者免疫力。

治療基因導入體內方法有非病毒方法與病毒方法，非病毒方法包括直接注射法、電穿孔法、脂質體轉運法，其方法安全性好但效率低。與病毒方法各具有不同優缺點。

1、重點內容：基因治療概念、基因治療策略方法、2、難點內容：治療基因導入體內方法，各自優缺點、病毒載體結構特點；核酶及三鏈DNA在基因治療的原理

三、學時安排

3學時

第九章 基因組學與醫學(自學)

一、目的求：

（一）掌握：基因組學、人類基因組計劃、基因病和SNP的概念；結構基因組學、功能基因組學的概念及研究內容。

（二）熟悉：比較基因組學的概念；疾病相關基因的鑒定策略。

（三）了解：基因組學與醫學的關系。

二、主要內容

人類基因組計劃的研究目標是闡明構成人類基因組的全部DNA的結構；闡明基因的編碼方式和分布特點；理解基因及其調控序列之間的相互關系；理解DNA全部序列所蘊藏的意義。該計劃包括為遺傳圖譜、物理圖譜、序列圖譜、轉錄圖譜分析。

功能基因組學是研究基因組中所有基因功能的學科。功能基因組學是從基因整體水平對基因的活動規律進行探討，其研究內容主要包括基因組的表達、蛋白質產物的功能、基因組多樣性的研究、基因組功能注釋。

1、重點內容：人類基因組計劃、功能基因組學的研究內容。

2、難點內容：功能基因組學的研究內容。

三、學時安排 2學時

四、實驗內容及學時安排

1大腸桿菌質粒DNA的提取 3學時 2瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 3學時 3 DNA純度、濃度和分子量的測定 4學時 4大腸桿菌感受態細胞的制備與轉化 4學時 5動植物基因組DNA的提取與純化 4學時

第三篇：研究生分子生物學課程學習體會及建議

研究生分子生物學課程學習體會及建議

一個學期的分子生物學課程就要結束了，這一學期，對于我一個跨專業的學生來說，還是學習到很多知識的的。

剛開始還是很沒有信心能聽懂這門課程，老師考慮到我們跨專業的同學，對很多基礎知識的講解都是很仔細的，給了我一些信心。分子生物學課程的學習讓我初步建立了分子的概念，掌握了以中心法則為核心的最基本的分子生物學知識。圍繞著中心法則，我們學習了DNA復制、轉錄、翻譯的機制，從根本上了解了中心法則的作用機理。了解了蛋白的表達過程是一個多分子協同作用的結果，每一步都經過著嚴格的調控，對這些基本概念和過程的理解為今后的科研奠定了基礎。但是核酸到底是什么樣子，什么是質粒，什么是轉化，生物大分子之間的相互作用這樣的概念對我來說還是有點模糊。部分章節的思維導圖的制作也對我們受益匪淺，既幫助我們復習了所需知識，也鍛煉了我們總結表達的能力，同時也在無形中加強了我們同學之間的交流。

我覺得美中不足的地方就是沒有實驗課的安排。沒有實踐操作，一切都是在紙上談兵。其次就是沒有布置一些有查閱文獻的作業，對我這個跨專業的人來說，對新的領域還是存在一些迷茫的地方，所以我希望老師能夠通過布置作業給我指點方向。

第四篇：分子生物學總結

SectionA 1 三個域：真細菌，古細菌，真核生物 2 組裝中的主要作用力：非共價健作用力

SectionB 1 蛋白質純化的分析方法

正電荷：天冬氨酸 谷氨酸

負電荷：賴氨酸 精氨酸

組氨酸

極性：天冬酰胺 谷氨酰胺

蘇氨酸 絲氨酸 半胱氨酸

非極性：脂肪族 甘氨酸 丙氨酸 纈氨酸 亮氨酸

異亮氨酸 甲硫氨酸 脯氨酸

芳香族 苯丙氨酸

酪氨酸 色氨酸 Cys 二硫鍵 Gly 無手性 Pro 亞氨基酸

芳香族氨基酸最大吸收峰280mm 3 蛋白質的一級(決定蛋白折疊及其最后的形狀的最重要的因素)：氨基酸脫水縮合形成肽鏈 N端到C端

共價鍵

二級：多肽鏈中空間結構鄰近的肽鏈骨架通過氫鍵形成的特殊結構。

α轉角

β螺旋 氫鍵為主要作用力

三級： 多肽鏈中的所有二級結構和其他松散肽鏈區域（散環結構）通過各種分子間作用力（非共價鍵為主），彎曲、折疊成具有特定走向的緊密球狀構象。

非共價鍵

四級： 許多蛋白分子由多條多肽鏈（亞基，subunits）構成。組成蛋白的各亞基以各種非共價鍵作用力為主，結合形成的立體空間結構即為四級結構。非共價鍵 偶極：電子云在極性共價鍵的兩原子間不均勻分布，使共價鍵兩端的原子分別呈現不同的電性

兼性離子：具有正電荷（堿性），又具有負電荷（酸性）的分子 雙極性分子：

Section C 1核酸的光學特性：

增色性：一種化合物隨著結構的改變對光的吸收能力增加的現象 減色性：一種化合物隨著結構的改變對光的吸收能力減少的現象 Reason: 堿基環暴露在環境中的越多，對紫外的吸收力越強 Absorbance（吸收值）：Nucleotide > ssDNA/RNA > dsDNA 核酸的最大吸收峰260mm(堿基有芳香環)芳香族氨基酸最大吸收峰280mm A260/A280:

純的 dsDNA：1.8 純的 RNA：2.0 純的 Protein：0.5 2 Tm 值（熔解溫度）：熱變性時，使得DNA雙鏈解開一半所需要的溫度。

Tm=2x(A+T)+ 4x(G+C)

Tm值與DNA分子的長度，及GC的含量成正比

Annealing（退火）:熱變性的DNA經過緩慢冷卻后復性

快速冷卻： Stay as ssDNA

緩慢冷卻: 復性成dsDNA 3 脫氧核糖核酸與核糖核苷酸得到畫法 支持雙螺旋結構的兩個實驗：查戈夫規則

X射線晶體衍射 5 雙螺旋的內容：

雙鏈之間的關系：DNA分子由兩條鏈組成

雙鏈反向平行(5’?3’ 方向)

兩鏈的堿基通過氫鍵互補配對，A:T;G:C。

雙鏈序列反向互補

各基團排列方式：糖-磷酸骨架DNA分子排列在外;

堿基對平面相互平行，排列在DNA分子的內部。空間結構為：右手雙螺旋結構

每轉一圈~10個堿基對，每一圈長度33.2A

雙鏈螺旋中形成大溝，小溝。堿對DNA的影響：高pH值對DNA的影響比低pH值的要小。

高 pH 值(pH>11)會改變堿基構象，使DNA變性（雙鏈解旋，成單鏈）

RNA的影響：高pH值，2’羥基會攻擊磷酸二酯鍵，使其斷裂，形成2’，3’-環式磷酸二酯鍵，從而使RNA分子斷裂 共價閉合環狀DNA(convalently closed circular DNA, cccDNA）。即通過共價鍵結合形成的封閉環狀DNA分子。超螺旋DNA（Supercoil DNA）:松弛型雙鏈DNA進一步旋轉后，再形成閉環結構時，就會形成DNA超螺旋結構

L=T+W 判斷是否為超螺旋 正負超螺旋 拓撲異構酶：暫時斷裂DNA分子中一條或兩條單鏈上的磷酸二酯鍵，改變DNA分子的連接數及拓撲狀態。

功能：消除DNA復制和轉錄等過程產生的超螺旋。

細胞中，Ⅰ型酶與Ⅱ型酶的活性保持一種平衡狀態。Ⅱ型酶的“使DNA超螺旋化” 與Ⅰ型酶“使DNA松馳化” 相抗衡，從而使DNA保持適當的超螺旋密度。EB: 嵌入DNA配對堿基之間，使DNA分子在嵌入處局部解旋，增加ccDNA其它部位的正超螺旋 Type II RE

二型限制性內切酶:識別位點一般為４～8個堿基對的回文序列

如：EcoRI

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5

Section D 1 染色體的折疊：串珠結構 ：核心組蛋白:H2A, H2B, H3 and H4.連接組蛋白 H1

核小體

30nm纖絲

高級環狀結構（染色質的最高結構）

緊密纏繞結構 著絲粒：兩側是大量的名叫衛星DNA的重復序列

端粒：上百個短的重復序列

作用：端粒DNA 形成特殊的環狀二級結構，保護染色體末端不被核酸外切酶降解。

抵消DNA復制時每一輪復制都導致兩末端形成的后隨鏈比母鏈要短一截的現象對染色體的影響 異染色質：高度濃縮，無轉錄活性

常染色質：結構松散，有轉錄活性

DNaseI 敏感區域：對區域內DNA的轉錄活躍

串珠結構

DNaseI 超敏感區域：轉錄活躍的基因的調控區域

DNA裸露 4 原核染色體結構：非特異性DNA結合蛋白：類組蛋白

位點特異性DNA結合蛋白：與特殊的DNA序列結合

有其他特殊的生理功能：RNA polymerases

對結構域的形成也很重要

復性動力曲線：

Low C0t: 高重復 衛星DNA Moderate C0t : 中重復 串聯基因簇

反轉座子 High C0t :單拷貝或低重復

大腸桿菌基因組 染色體結構對基因轉錄的影響

CpG 抑制→CpG位點中的胞嘧啶的C-5常發生甲基化(CpG甲基化），CpG 甲基化可能可以DNA轉錄被限制→哺乳動物基因組中，有些區域含有很多未甲基化的CpG 位點，被稱為CpG 孤島。

甲基化—轉錄抑制

去甲基化—恢復轉錄

組蛋白的乙?；汉诵慕M蛋白N-端的Lys被乙?；?，DNA與核心組蛋白體解聚。Gene 表達被激活

去乙?；阂种?gene表達

組蛋白的磷酸化:對組蛋白 H1 磷酸化，抑制基因表達 其他組蛋白中心法則

Section E 1 DNA復制：細胞中，一條雙鏈DNA分子通過堿基配對，形成兩條與其序列相同的DNA雙鏈分子的過程。2

確定DNA半保留復制

半不連續復制 3 復制的基本步驟 復制為雙向

大腸桿菌的復制：

起始AT含量高的區域

參與蛋白：DnaA（復制起始因子)：識別并結合于重復序列上，驅使富含AT的重復序列解鏈，需負超螺旋，及ATP

DnaB(DNA解旋酶):DNA雙鏈解旋，形成復制叉

SSB:(單鏈結合蛋白):保持解旋部分的單鏈狀態

DnaG(引發酶/引物酶):RNA引物合成，引發復制 延伸

參與蛋白：DNA Pol III全酶：負責新鏈的合成:前導鏈，岡崎片段

DNA pol

I：復制中除去引物，填補引物處空缺

終止： 真核生物的復制：

一個細胞周期內，一個DNA分子只能復制一次

Section F 1 復制忠實性的機制：

DNA復制的高精度：模板連和進入核苷酸在DNA聚合酶的作用位點正確配對

3’到5’外切核酸酶對錯誤堿基的校正

錯配修復 2 holiday模型 3

Section K 編碼鏈 模板鏈 2 大腸桿菌的轉錄

RNAP酶：核心酶：a 亞基：aNTD對核心酶的組裝很重要。

aCTD在識別啟動子、調節轉錄水平中起著非常重要的作用。

b 亞基：RNAP的催化中心。

與模板DNA、RNA產物、及底物核糖核苷酸緊密結合。

抗生素利福平結合在在b 亞基上，可以抑制RNAP的轉錄活性。

利福平只抑制轉錄的起始。

利迪鏈菌素只抑制延伸而不抑制轉錄起始

b’ 亞基：可能與RNAP的催化有關。

肝素與b’亞基結合后，能干擾RNAP與DNA的結合，抑制轉錄。

w 亞基：可能與RNAP的組裝及維持RNAP結構的穩定性有關

s factor(s因子)：s factor 在啟動子特異性識別過程中至關重要 移動慢的原因：可以保持與翻譯同步。

與有些基因轉錄調控相關。

有利于轉錄終止

RNAP沒有3’ →5’外切酶活性，不能進行轉錄校正。其錯配率達10-4。RNAP倒退暴露新合成的錯配堿基，可以有利于其他輔助核酸酶將錯配堿基切除，增加轉錄的忠實性。s70基礎啟動子的一般結構

-10 序列：它對轉錄起始時，RNAP打開DNA雙鏈的過程非常重要。-

10序列到TSS位點的距離對轉錄效率也有很大的影響-35 序列：增強RNAP s factor 的識別能力及與DNA的結合能力 4 影響啟動子效率的DNA序列：

核心啟動子的序列：與保守序列越像，效率越高。

TSS周圍序列：影響起始效率。

轉錄單位的前30個核苷酸的堿基序列：影響RNAP從啟動子處移動出去（啟動子區清空）的速率。

核心啟動子附近的調控元件。轉錄的起始：開放復合物 閉合復合物 無效起始

延伸：啟動子的清空，鏈的延伸轉錄泡，s因子的循環利用

終止：依賴性 不依賴性

反復重復序列

Section L 1.順式作用元件（cis-acting elements）：一般為DNA上較為保守的、有著特異性序列或結構的特定區域。它們只能影響與其在同一條染色體上的基因的活動。如：啟動子，轉錄激活因子結合位點等。

反式作用基因/調節基因（trans-acting genes，regulator genes）

可以影響與他們不在同一條染色體上的基因的表達水平的DNA元件。2 乳糖操縱子 色氨酸操縱子 正負調控都可以有誘導和阻遏兩種調控方式。

正控誘導：誘導因子活化激活因子，使其可以增加基因的表達。（Lac operon，CRP調控）正控阻遏：共阻遏物使激活因子失活，減少基因的表達。負控誘導：誘導因子使阻遏蛋白失活，增加基因的表達。（Lac operon，lac repressor）負控阻遏:共阻遏物活化阻遏蛋白，使其可以降低基因的表達。（Trp operon，trp repressor）

Section M 增強子 沉默子 TFIID：可與多種核心啟動子元件或特異性轉錄因子結合，啟動二類轉錄預起始復合物組裝的通用轉錄因子。

TBP(TATA-box binding protein):可識別并結合TATA-box TAFII（TBP-associated factor II）：TBP關聯蛋白，TFIID中與TBP形成復合體的所有蛋白，～13個。

TFII H的結構與功能：蛋白激酶(4 個亞基)：催化蛋白磷酸化。將NTP（一般為ATP）的g-磷酸基團轉移到蛋白上。

磷酸化 RNA pol II 中的CTD 結構域。TFIIE 刺激TFIIH介導的磷酸化反應。DNA 解旋酶/ATPase(5 亞基)：

水解ATP，利用其能量打開DNA的雙鏈 TBP(TATA-binding protein): 確保 RNA Pol I能正確定位到轉錄起始區域上。

SP1 為組成性表達的轉錄因子，在所有的細胞中都存在，與基因本底表達水平有關 SL1，選擇因子,RNA Pol I起始轉錄所必需的因子 CTD:羧基末端結構域，的磷酸化狀態與轉錄進程有關

轉錄起始時期，CTD結構域一般處于去磷酸化形式，與結合啟動子有關。

轉錄延伸時期，CTD結構域常處于磷酸化形式，與mRNA的加工有關。

Section N 1 DNA-binding domains（DBD）:DNA結合結構域

螺旋-轉角-螺旋結構（域）

鋅指結構（域）

堿性結構（域）

Dimerization domains：二聚體化結構域

亮氨酸拉鏈 螺旋 散環 螺旋 DBD+DM 激活結構域 酸性激活結構域 富含谷氨酰胺結構域 富含脯氨酸的結構域 LBD

Section O 真核生物中mRNA 加工的一般過程 5’加帽: CTD作用：轉錄起始時，參與加帽反應的三種酶結合在RNA Pol II的CTD結構域上。轉錄產物剛開始合成時，即對其5’端進行加帽反應。

作用：防止降解：核糖核酸酶一般不能降解帽結構中的三磷酸鍵

幫助轉運mRNA到細胞質中

增強翻譯水平：mRNA需要帽結合蛋白的幫助才能更好的與核糖體結合 幫助去除pre-mRNA中的第一個內含子。3’加Poly(A)尾：

作用：防止被核酸酶降解：增加mRNA的穩定性

有助于mRNA從細胞核到細胞質的轉運

參與pre-mRNA的最后一個內含子的剪接。

增強mRNA的翻譯水平，增加基因的表達 剪接 甲基化 2 核酶有：有催化功能的RNA即為核酶

U2 U6 RNAP 3 RNA的多樣性：可變加工，反式剪接，RNA編輯 原核生物核糖體

真核生物核糖體 原核rRNA 加工的大致過程：形成多個莖環結構，與蛋白結合形成RNP，核苷酸修飾，逐級切割

真核rRNA 加工的大致過程：甲基化，切割。內含子剪接 原核tRNA 加工的大致過程:將多順反子前體切割，分離出單順反子前體

單順反子前體進一步被切割，形成與成熟tRNA長度一致分子（RNases D, E, F，P

.堿基修飾，形成成熟tRNA 真核tRNA 加工的大致過程：5’-末端成熟，3’-末端成熟（添加5’-CCA-3’）去除內含子 7 miRNA and siRNA的調控機制：mRNA降解，抑制翻譯，抑制轉錄

Section P 1 遺傳密碼的特性:

蛋白的編碼信息由三聯體密碼子組成。

密碼子為連續的，之間無間隔、無重疊。

除三個終止密碼子之外，每個密碼子對應一種氨基酸

有密碼簡并現象。即：多個密碼子對應同一種氨基酸。

標準遺傳密碼子在各類生物中基本通用，不過少數生物體或細胞器中，有一些密碼子對應的氨基酸與標準的不同。

生物對同義密碼子的使用經常有偏好性。不同生物的密碼子偏好性不同。

基因一般不重疊。一段核酸分子一般只有一個開放閱讀框（open reading frame, ORF/可讀框），被翻譯成一個蛋白。

有些物種也有重疊基因的現象。開放閱讀框:ORF 從起始密碼子ATG 到終止密碼子

TGA,TAA or TAG 之間的連續的蛋白編碼序列

CDS 編碼序列 當ORF可以預測一個蛋白時 3 tRNA 二級結構:三葉草結構 4 tRNA的特異性加載：（翻譯的高保真性）

氨酰-tRNA合成酶對相應tRNA分子有很強的專一性：第二密碼子：

氨酰-tRNA合成酶接受相應氨基酸時有很強的忠實性：校正：雙篩選機制—酶的活性中心，酶中的編輯位點 氨酰-tRNA（AA-tRNA）： 3’-end加載了一個氨基酸的tRNA分子。是在蛋白質合成中，將密碼子轉換氨基酸的適配器。

Section Q 1 密碼子與反密碼子的反向互補配對 一個tRNA可識別的密碼子數由反密碼子的第一位堿基決定

擺動學說：第三位密碼子與第一位反密碼子的配對可以擺動

反密碼子第一位為A或C時，配對無搖擺現象。3 核糖體的E，P，A位點 A位：接受AA-tRNA部位.除了起始氨酰-tRNA，其他所有AA-tRNA都只能進A位點。P位：肽?；?tRNA結合部位。起始氨酰-tRNA也進入此位點。E位：空載tRNA離開核糖體的位點。4 核糖體各亞基的功能

核糖體小亞基功能：結合mRNA

促進密碼子與反密碼子的正確結合 mRNA移位

大亞基的功能A位、P位、肽酰轉移酶（轉肽酶）中心等在大亞基上。

負責攜帶AA-tRNA、肽鍵/肽鏈的形成 5 翻譯的基本內容 核糖體與mRNA結合

氨酰tRNA逐個進入核糖體

氨酰tRNA通過反密碼子與mRNA互補配對 氨酰tRNA分子的氨基酸之間形成肽鍵。空載tRNA的釋放 肽鏈的釋放

第五篇：分子生物學課程教學改革初探

分子生物學課程教學改革初探

摘要：文章總結了在十余年分子生物學教學過程中，不斷開展的對教師自身綜合素質和能力、教學內容、教學方法和教學手段的改革探索，旨在提高分子生物學的教學效果。實踐證實，新的教學模式，在傳授學生專業知識的同時，激發了學生的學習興趣，改進了學生的學習方法，也逐步提高了學生的自主學習能力，從而滿足了社會對高素質創新型生物人才的需求。

關鍵詞：分子生物學；課程教學；改革研究；創新生物學人才

中圖分類號：G642.0 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2016）26-0128-03

前言：

分子生物學的目標是在分子水平上闡明細胞活動的規律，從而揭示生命的本質[1]。雖然它在生物類專業課程體系中充當著重要角色，對生命科學的發展起著至關重要的作用，但是分子生物學的教學卻因為課程內容多，學科交叉廣，理解難度高，信息量大，知識更新快而使教學效果差強人意，集中表現為教師授課難和學生學習難。這種現狀不但困擾著老師和同學，也與大學培養高素質創新型人才的目標不相適應。如何克服分子生物學課堂教學的“瓶頸”？本人在從事十多年的分子生物學教學過程中，努力研究和探索多種形式的教學改革，力求提升教學效果和教學質量。

一、教學內容的合理組織

分子生物學的教學除了選用好的教材，制定完善的教學大綱，如何組織教學內容是教學的一個非常重要環節[2]。教學內容呈現給學生的應該是完整、清晰的、有層次、條理的知識。我們在組織教學的過程中，首先從提高自身學科素養著手?！耙槐窘滩臅?，數種參考書”，除分子生物學國內、國外各類版本外，與分子生物學相互交叉和滲透的其他學科，如細胞生物學、生物化學、遺傳學，我們也都進行了系統的學習和強化，不斷夯實專業知識、拓展專業領域，基本構建了分子生物學完整的知識體系，具備了對教材處理的前提。既避免了教學中各學科的重復，也進一步凝練了知識。此外，我們還通過網絡教學平臺向全國優秀教師學習，在不斷的探索中總結出了教學內容合理組織的一些思路。

1.思維導學模式。在DNA復制教學環節，知識點多，并且較分散，很容易在教學中造成學習困難和知識混淆的現象，針對這章教學的特點，我們采用了思維導學模式，收到了非常好的教學效果。

2.重點、難點解讀。本科教學形式多樣化，也更提倡學生的自主學習，但并不是淡化了教師的教學，反而對教師提出了更高的要求[3]。教師必須圍繞每堂課的教學目的，合理組織和引導學生理解并掌握教學的重點和難點內容。

比如在講解染色體端粒末端修復機制中，教師首先要從教材的知識結構中梳理出重點。染色體端粒末端修復機制的知識點包括：（1）引物切除造成的遺傳信息缺失；（2）端粒末端的特點；（3）體細胞和性細胞末端修復機制的不同；（4）DNA結構的變化；（5）端粒酶的修復機制。梳理知識點后，總結教學重點：一是引物切除后損傷修復在體細胞和性細胞中的不同；二是四鏈DNA結構；三是端粒酶的修復機制。其中端粒酶修復機制的講授是學生學習的難點。難點集中在端粒酶的性質和修復發生的過程。

經過對教學內容中重點和難點的準確把握和合理組織，教師才能在課堂教學中突出重點、突破難點，讓學生的課堂學習無障礙。

二、教學方法和手段的改進

教學方法的推陳出新，是教學改革的重要內容[4]。為發揮學生作為教學主體的能動性，我們根據具體的教學內容設置了啟發式、聯想式、探究式等多種教學方法[5]，讓學生參與到教學過程中，不僅活躍了課堂氣氛，而且在分享知識的同時，更注重教會學生靈活掌握學習的方法。

1.啟發式教學。啟發的目的在于舉一反三，觸類旁通。針對每一次的課堂教學，設計一些拋磚引玉的問題，供學生思考與討論，這成為了分子生物學理論教學的重要組成部分。如進行到真核生物基因表達調控學習環節，提出甲基化修飾的生物學意義，這個問題覆蓋范圍廣，涉及到了DNA復制的調節、蛋白質和DNA甲基化修飾對基因表達的調控，以及Epigenetic（表觀遺傳學）方面的知識。通過提出問題―討論分析―不斷啟發―再討論分析―歸納總結―解決問題這一系列的互動教學活動，充分調動了學生課堂學習的主動性和積極性，在不斷的討論分析中通過展示不同的思維、發表各自的觀點，不但有利于促進學生在學習中發現問題、解決問題，而且有利于學生通過對基礎知識的消化、理解來達到理論的升華、拓展[4]。

2.聯想式教學。分子生物學是在生物化學、細胞生物學和遺傳學的基礎上發展而來[6]，因此知識相互交叉、相互滲透。在授課的過程中，教師一方面要避免重復，一方面要通過聯想知識點適時培養學生的發散性思維，提高學生對知識的遷移能力和整合能力。如在講解化學修飾對基因的表達調控時，將細胞生物學中的信號轉導有機結合，使學生了解基因表達調控對細胞信號轉導的作用機制。

3.探究式教學。在分子生物學教學中，每一個理論知識的背后都是科學研究的重大突破。如確定遺傳物質是DNA的兩大經典實驗，我們以探究的形式呈現教學內容，從實驗設計，到結果顯示，再經過討論分析并得出結論，以課題研究的角度，研究人員的身份引導學生進入學習角色，將學科概念、理論產生的起因和過程展示給學生，啟發學生努力探索，走近科學，讓學生從中領悟知識形成的探究性和科學性，逐漸培養具有創新意識和能力的高素質研究型人才。

4.多媒體多樣化教學。分子生物學的教學內容具有微觀性、復雜性、抽象性和動態性。傳統的教學手段無法滿足教學的需求，而多媒體技術則具有聲像俱佳、動靜皆宜的特點[7]，是傳統教學無法比擬的。多年來我們不斷補充和完善教學手段，逐漸形成了獨具特色的多媒體教學課件。

多媒體圖像處理清晰直觀，文字表述簡潔明了、主題突出。課件中的圖像來源于國內外的網絡數據平臺。如講述DNA半保留復制機理時[8]，首先將DNA可能存在的幾種復制方式用圖像展現，并利用Meselson和Stahl設計的DNA復制同位素示蹤實驗和密度梯度離心實驗來進行結果驗證，引導學生明確掌握DNA半保留復制特點，并結合文字，通過圖文并茂的多媒體課件，將教學內容中的背景知識、基本概念、基本理論，以及靜態、抽象的微觀知識清晰講解。

多媒體課件動靜結合、聲像互動。對于生命過程中動態的知識點，比如DNA的復制、RNA的轉錄、蛋白質的翻譯過程，可以將這些復雜的生命過程利用多媒體手段做成動畫并配以文字和聲像，形象直觀地展現給學生，既加深了學生對知識的理解，也提高了其學習效率。

三、知識領域的拓展

分子生物學的教學內容除包含基礎理論知識外，還有大量理論應用的研究方法部分。我們在教學中不僅僅將知識局限在教材中，利用課堂教學不斷引導學生去了解本學科相關領域內的研究熱點、最新進展、發展趨勢[8]，以及生物技術在生產實踐中的廣泛應用。

1.專題講座與專題討論。專題講座是教師根據教學內容，自己組織參考資料對教學內容的延伸與拓展。比如在講授“SNP技術”時，先從遺傳標記分析的發展著手，把一代、二代的標記分析做知識性的回顧，再將納入教材的第三代標記分析“SNP”做詳細的講解，引導大家理解什么是單核苷酸多態性，核苷酸多態性研究的生物學意義以及在醫學、農業、畜牧等多種領域的發展與應用。通過這種方式激發了學生的學習熱情和求知欲，也使教師不斷地進行知識的更新，及時了解本學科當前發展的趨勢、研究的熱點以及爭論的問題。

專題討論則是以學生為主體，根據課程教學內容，組織學生就某一個專題自行查閱、組織文獻資料，并在課堂上展開討論[9]。比如在講授基因重組的教學內容時，設計“轉基因的利與弊”供學生討論。引導學生思考基因工程藥物和轉基因動植物對社會產生的巨大影響，讓知識離開課本走進生活，從而喚起學生學習的興趣和探索未知領域的欲望。這不僅使學生更加深入、系統地理解所學知識，并且培養了學生靈活運用知識的能力[10]。

2.生物信息技術與數據庫。生物信息技術已經發展成為分子生物學研究方法中不可分割的一部分，比如在“PCR技術”的專題講座中，不僅要對實驗目的、原理、操作以及應用進行講解，還要特別對引物設計的生物信息技術進行補充，介紹學生對一些常規的生物信息技術軟件Primer6.0、DNAman、Olig6.0、DNAStar、Cluster等有一個基本的認知度。

在整個分子生物學的教學中，學生需要自行查閱和組織各種文獻資料，因此，必須特別強調互聯網資源運用的重要性。教師通過介紹中國知網、維普、清華同方、NCBI等幾個常用資源庫，使學生了解如何利用資源庫進行查詢，對互聯網資源的熟練應用使學生的知識體系得以完善，學生通過自身的努力來提高信息收集和辨別的能力，培養了學生的自學能力。

四、教學改革中應該注意的問題

1.教師的專業修養與教學基本功。教師在教學中具有雙重身份，既是一名導演，又是一名演員。作為導演，首先需要有最新的教學理念，整個教學過程中適時設問、適時討論、適時啟發。其次要有較強的課堂組織能力，根據學生的學習情況，把握課堂節奏，調動學生課堂學習激情，使教學有的放矢。否則會在教學中出現“啟而不發”和論證條理不清的現象；作為演員，還要有良好的課程駕馭能力，通過教師扎實的專業知識、廣泛的認知領域、全面的知識結構，呈現給學生的是一個豐盛的知識大餐，而不是一鍋夾生飯。因此作為教師，必須從理論水平、科研水平、思維水平這3個方面提高教師自身的專業素質，此外，還要掌握適合自己的各項教學技能。

2.多媒體教學的合理應用。多媒體教學只是一種提高教學效果的輔助手段，是為教師的教學和學生的學習服務的，只有運用合理才可能達到好的效果。因此盡量避免在多媒體教學課件上出現過多的文字，否則多媒體成了教學活動中的主體，老師由照本宣科轉變為扮演放映員和播音員的角色。學生的學習興趣不高，教學效果也就適得其反。多媒體和傳統教學只有合理地結合，取長補短，才能在課堂教學中體現出其真正的價值。

總之，教學改革的目標是幫助學生建立學科知識體系，培養學生良好的科學素養，提升學生后繼學習的能力。正如葉圣陶先生所說：“教師的教學，不在于給學生搬去可以致富的金子。而在于給學生點金的指頭?！蹦壳?，我們關于分子生物學課堂教學改革還處于不斷探索和實踐階段，除了需要不斷地提高教師自身的學科修養和科研素質外，也以“夯實基礎、拓展知識、增強能力、提高素質”[8]作為教學的目的和人才培養目標，努力在今后把教學工作開展得更加有生有色，為社會培養更多高素質創新型人才。

參考文獻：

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