第一篇：分子生物學技術總結1

分子生物學技術總結

關鍵詞：分子 技術 原理 應用

摘要:本文主要是描述分子生物學技術的基本原理，通過其原理我們可以深刻的理解其功能

還有實際操作的過程。另外還列舉了每項技術所給我們帶來的好處及其現實的應用，通過實際的例子我們可以清楚的了解到其強大的功能和深遠的影響以及將來的發展前景，充分體現出了科技給人類帶來的創新及利益，可以說分子生物學技術將會改變人類未來的生活環境和生活條件，為人類的長期發展起到了不可替代的作用。下文將詳細的介紹部分分子生物學的技術及其應用。

1.核酸分子雜交技術：具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下(適宜的溫室度及離

子強度等)可按堿基互補原成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸序列及探針，待測核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細胞總RNA。核酸探針是指用放射性核素，生物素或其他活性物質標記的能與待定的核酸序列發生特異性互補的已知DNA或RNA片段。根據其來源和性質可分為CDNA探針，基因組探針，寡核苷酸探針，RNA探針等。

其應用：核酸分子雜交技術可以用來診斷弓形蟲病分子。

2． 寡核苷酸微點隈雜交：是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使他共價結合與

持物表面，與平均長度為20-50nt的混合RNA或cDNA探針進行雜交，以提高雜交的特異性和靈敏度。應用共聚焦顯微鏡可檢測跨越三個數量級的雜交信息。適用于低豐度mRNA的檢測，以區分基因家族不同成員的差異表達特征，或鑒定同一轉錄在不同組織和細胞中的選擇性剪接。但有工作量較大，成本較高，速度較慢的弱點。

其作用：激發細胞潛在的活性，寡核苷酸一方面能激發巨噬細胞的活性，巨噬細胞相

當于城市里的“大垃圾車”。專門處理衰老和死亡細胞。另一方面，寡核苷酸就像一把剪刀，定位尋找并及時剪斷病毒基因鏈，快速吞噬病毒細胞，阻止病毒基因的轉錄和翻譯，保護正常細胞不受侵害。

3.分子克隆技術： 在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉化與轉導的方式，引入適合的寄主體內得到復制與擴增，然后再從篩選的寄主細胞內分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴增。將DNA片段(或基因)與載體DNA分子共價連接，然后引入寄主細胞，再篩選獲得重組的克隆，按克隆的目的可分為DNA和cDNA克隆兩類。其作用：克隆技術對保護物種特別是珍稀、瀕危物種來講是一個福音，具有很大的應用前景。從生物學的角度看，這也是克隆技術最有價值的地方之一，克隆技術被譽為“一座

挖掘不盡的金礦”，它在生產實踐上具有重要的意義，潛在的經濟價值十分巨大。首先，在動物雜種優勢利用方面，較常規方法而言，哺乳動物克隆技術費時少、選育的種畜性

狀穩定；其次，克隆技術在搶救瀕危珍稀物種、保護生物多樣性方面可發揮重要作用，即使在自然交配成功率很低的情況下，科研人員也可以從瀕危珍稀動物個體身上選擇適

當的體細胞進行無性繁殖，達到有效保護這些物種的目的。培育大量品種優良的家畜，如培養一些肉質好的牛、羊和豬等，也可以培養一些產奶量高，且富含人體所需營養元

素的奶牛。利用克隆等生物技術，改變農作物的基因型，產生大量抗病、抗蟲、抗鹽堿

等的新品種，在短時間內培育出大量農作物、從而大大提高農作物的產量。

4.核酸序列的測定：目前最常用的手工DNA序列測定技術，仍然是Sanger等(1977)提出的酶法，也稱雙脫氧末端終止法。這種方法生成相互獨立的若干組帶放射性標記的寡核

苷酸，每組核苷酸都有共同的起點，卻隨機終止于一種(或多種)特定的殘基,形成一系列

以某一特定核苷酸為末端的長度，各不相同的寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由

這個特定堿基，在待測DNA片段上的位置所決定。然后通過高分辨率的變性聚丙烯酰

胺凝膠電泳，經放射自顯影后,從放射自顯影膠片上，直接讀出待測DNA上的核苷酸順

序。

其作用：根據雜交膜的顯色情況來判斷：以陽性對照樣顯出的顏色為標準，樣品的顏色

與陽性對照顏色相同或相近，則樣品為病毒攜帶者；樣品的顏色比陽性對照顏色深，則

樣品為已發病或臨死狀態；樣品不顯出顏色，則樣品為不帶病毒（陰性）

5.PCR技術： 類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙

鏈或經PCR擴增

形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃

左右，引

物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為

反應原料，靶

序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保

留復制

鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈

又

可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基

因擴增放

大幾百萬倍。(Plateau)。到達平臺期所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。其作用：由于微生物的DNA具有高度特異性，它決定了各個物種的千差萬別，利用一

特性，PCR技術對性病的病原體進行診斷，具有操作簡便、報告結果迅速、敏感性和

特異性高等特點。但PCR技術檢查也會出現假陽性結果，臨床主要結合病史、癥狀、體征等綜合分析判斷，才不致貽誤診斷。

6．電泳技術：電泳就是帶電荷的樣品在電場力的作用下，以不同的遷移行為而彼此得以分

離的方法。根據其載體介質的不同可以分為等電聚焦電泳、梯度電泳、紙上電泳、醋酸

纖維薄膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳等。

許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取決于分子結構機器所在介質的pH和組成。

由于混合物中各組分所帶電荷性質、電荷數量以及相對分子質量的不同，在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速率也有差異。因此，在一定時間內各組分移動的距離也

不同，從而達到分離鑒定各組分的目的。

在電泳的過程種藥品會受到電場力、分子篩作用、靜電吸附作用、共價結合作用等等方

面的作用力。藥品在這些作用力的綜合作用下，泳動的速度產生差異，從而將不同的組

分分 離開來。

電泳的介質不同，則電泳的功能也不大相同，其所最適用的方向也是不一樣的，最終檢

測的指標也是不一樣的。等電聚焦電泳常用于測定蛋白質的等電點，他最后測定的指標就是pH值。瓊脂糖凝膠最常應用于核酸的檢測之中，最后是以分子量的大小來衡量電

泳結果的。

其作用：

a)主要應用于分離各種有機物（氨基酸、多肽、蛋白質、酶、脂類、核苷、核苷酸、核酸等）。

b)可用于分析物質的純度。

c)用于測定相對分子量。

d)與層析連用可用于蛋白質結構分析。

7.基因轉染技術：將特定的遺傳信息傳遞到真核細胞中，這種能力不但革新了生物學和醫

學中許多基本問題的研究，也推動了診斷和治療方面的分子技術發展，并使基因治療成為可能。目前基因轉移技術已廣泛用于基因的結構和功能分析、基因表達與調控、基因

治療與轉基因動物等研究。本部分將介紹目前基因轉移的主要方法；重點介紹基因轉移的病毒方法的基因轉染技術。

其作用：用于轉染的質粒DNA必須無蛋白質，無RNA和其了化學物質的污染，OD26

0/280比值應在1.8以上。應用酚-氯仿抽提法制備的質粒DNA一般難以達到此標準，目前大多采用進口的術提取純化試劑盒。

8.熒光原位雜交技術：應用核素標記核苷酸制備探針，通過放射自顯影檢測雜交信號。應

用核素標記的探針其敏感性可以檢測到中期染色體上幾百個堿基的單拷貝靶核苷酸序

列，敏感性雖高，但定位不夠精確。FISH具有探針穩定、操作安全，可快速、多色顯示

多個不同探針的雜交信號等優點。FISH的靈敏感與探針標記方法和檢測儀器性能有關，探針標記時摻入的修飾核苷酸比例直接影響雜交信號強度。FISH探針一般采用隨機引物

法或切口翻譯法，如將PCR技術引入FISH探針標記，可使其靈敏度提高到0.25kb。

應用慢掃描CCD配合影像處理理軟件，增強信噪比，有利于檢測微弱信號，如應用TS

A系統能將雜交信號再放大1000倍，可用于單拷貝基因的定位。FISH分辨率大約為1-

3Mb,如果應用強變性劑處理染色體，讓DNA分子從蛋白質中分離出來，使雙DNA完全

伸展并粘附在玻片上，經引處理后，分辨率可達1-2kb。還可采用對分裂中期染色體進

行顯微解剖法以提高分辨率。FISH的另一個特點是可以聯合慶用地高辛、生物素等多種

標記系統，在一次雜交中可檢測多種探針在染色體上的位置及探針間的相互關系，即多

色FISH或多靶FISH。

其作用：被廣泛應用于腫瘤研究中的基因擴增、易位重排及缺失等的檢測，在腫瘤

診斷和鑒別診斷、預后和治療監控等方面都有重要意義。

參考文獻：《分子遺傳學》《分子克隆》《現代分子生物學》《微生物學》《基因9》《分子和細胞生物學》《系統生物學》《分子生物學技術》《生物學基礎》《細胞工程》《免疫學》

第二篇：分子生物學總結

SectionA 1 三個域：真細菌，古細菌，真核生物 2 組裝中的主要作用力：非共價健作用力

SectionB 1 蛋白質純化的分析方法

正電荷：天冬氨酸 谷氨酸

負電荷：賴氨酸 精氨酸

組氨酸

極性：天冬酰胺 谷氨酰胺

蘇氨酸 絲氨酸 半胱氨酸

非極性：脂肪族 甘氨酸 丙氨酸 纈氨酸 亮氨酸

異亮氨酸 甲硫氨酸 脯氨酸

芳香族 苯丙氨酸

酪氨酸 色氨酸 Cys 二硫鍵 Gly 無手性 Pro 亞氨基酸

芳香族氨基酸最大吸收峰280mm 3 蛋白質的一級(決定蛋白折疊及其最后的形狀的最重要的因素)：氨基酸脫水縮合形成肽鏈 N端到C端

共價鍵

二級：多肽鏈中空間結構鄰近的肽鏈骨架通過氫鍵形成的特殊結構。

α轉角

β螺旋 氫鍵為主要作用力

三級： 多肽鏈中的所有二級結構和其他松散肽鏈區域（散環結構）通過各種分子間作用力（非共價鍵為主），彎曲、折疊成具有特定走向的緊密球狀構象。

非共價鍵

四級： 許多蛋白分子由多條多肽鏈（亞基，subunits）構成。組成蛋白的各亞基以各種非共價鍵作用力為主，結合形成的立體空間結構即為四級結構。非共價鍵 偶極：電子云在極性共價鍵的兩原子間不均勻分布，使共價鍵兩端的原子分別呈現不同的電性

兼性離子：具有正電荷（堿性），又具有負電荷（酸性）的分子 雙極性分子：

Section C 1核酸的光學特性：

增色性：一種化合物隨著結構的改變對光的吸收能力增加的現象 減色性：一種化合物隨著結構的改變對光的吸收能力減少的現象 Reason: 堿基環暴露在環境中的越多，對紫外的吸收力越強 Absorbance（吸收值）：Nucleotide > ssDNA/RNA > dsDNA 核酸的最大吸收峰260mm(堿基有芳香環)芳香族氨基酸最大吸收峰280mm A260/A280:

純的 dsDNA：1.8 純的 RNA：2.0 純的 Protein：0.5 2 Tm 值（熔解溫度）：熱變性時，使得DNA雙鏈解開一半所需要的溫度。

Tm=2x(A+T)+ 4x(G+C)

Tm值與DNA分子的長度，及GC的含量成正比

Annealing（退火）:熱變性的DNA經過緩慢冷卻后復性

快速冷卻： Stay as ssDNA

緩慢冷卻: 復性成dsDNA 3 脫氧核糖核酸與核糖核苷酸得到畫法 支持雙螺旋結構的兩個實驗：查戈夫規則

X射線晶體衍射 5 雙螺旋的內容：

雙鏈之間的關系：DNA分子由兩條鏈組成

雙鏈反向平行(5’?3’ 方向)

兩鏈的堿基通過氫鍵互補配對，A:T;G:C。

雙鏈序列反向互補

各基團排列方式：糖-磷酸骨架DNA分子排列在外;

堿基對平面相互平行，排列在DNA分子的內部?？臻g結構為：右手雙螺旋結構

每轉一圈~10個堿基對，每一圈長度33.2A

雙鏈螺旋中形成大溝，小溝。堿對DNA的影響：高pH值對DNA的影響比低pH值的要小。

高 pH 值(pH>11)會改變堿基構象，使DNA變性（雙鏈解旋，成單鏈）

RNA的影響：高pH值，2’羥基會攻擊磷酸二酯鍵，使其斷裂，形成2’，3’-環式磷酸二酯鍵，從而使RNA分子斷裂 共價閉合環狀DNA(convalently closed circular DNA, cccDNA）。即通過共價鍵結合形成的封閉環狀DNA分子。超螺旋DNA（Supercoil DNA）:松弛型雙鏈DNA進一步旋轉后，再形成閉環結構時，就會形成DNA超螺旋結構

L=T+W 判斷是否為超螺旋 正負超螺旋 拓撲異構酶：暫時斷裂DNA分子中一條或兩條單鏈上的磷酸二酯鍵，改變DNA分子的連接數及拓撲狀態。

功能：消除DNA復制和轉錄等過程產生的超螺旋。

細胞中，Ⅰ型酶與Ⅱ型酶的活性保持一種平衡狀態。Ⅱ型酶的“使DNA超螺旋化” 與Ⅰ型酶“使DNA松馳化” 相抗衡，從而使DNA保持適當的超螺旋密度。EB: 嵌入DNA配對堿基之間，使DNA分子在嵌入處局部解旋，增加ccDNA其它部位的正超螺旋 Type II RE

二型限制性內切酶:識別位點一般為４～8個堿基對的回文序列

如：EcoRI

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5

Section D 1 染色體的折疊：串珠結構 ：核心組蛋白:H2A, H2B, H3 and H4.連接組蛋白 H1

核小體

30nm纖絲

高級環狀結構（染色質的最高結構）

緊密纏繞結構 著絲粒：兩側是大量的名叫衛星DNA的重復序列

端粒：上百個短的重復序列

作用：端粒DNA 形成特殊的環狀二級結構，保護染色體末端不被核酸外切酶降解。

抵消DNA復制時每一輪復制都導致兩末端形成的后隨鏈比母鏈要短一截的現象對染色體的影響 異染色質：高度濃縮，無轉錄活性

常染色質：結構松散，有轉錄活性

DNaseI 敏感區域：對區域內DNA的轉錄活躍

串珠結構

DNaseI 超敏感區域：轉錄活躍的基因的調控區域

DNA裸露 4 原核染色體結構：非特異性DNA結合蛋白：類組蛋白

位點特異性DNA結合蛋白：與特殊的DNA序列結合

有其他特殊的生理功能：RNA polymerases

對結構域的形成也很重要

復性動力曲線：

Low C0t: 高重復 衛星DNA Moderate C0t : 中重復 串聯基因簇

反轉座子 High C0t :單拷貝或低重復

大腸桿菌基因組 染色體結構對基因轉錄的影響

CpG 抑制→CpG位點中的胞嘧啶的C-5常發生甲基化(CpG甲基化），CpG 甲基化可能可以DNA轉錄被限制→哺乳動物基因組中，有些區域含有很多未甲基化的CpG 位點，被稱為CpG 孤島。

甲基化—轉錄抑制

去甲基化—恢復轉錄

組蛋白的乙?；汉诵慕M蛋白N-端的Lys被乙?；珼NA與核心組蛋白體解聚。Gene 表達被激活

去乙?；阂种?gene表達

組蛋白的磷酸化:對組蛋白 H1 磷酸化，抑制基因表達 其他組蛋白中心法則

Section E 1 DNA復制：細胞中，一條雙鏈DNA分子通過堿基配對，形成兩條與其序列相同的DNA雙鏈分子的過程。2

確定DNA半保留復制

半不連續復制 3 復制的基本步驟 復制為雙向

大腸桿菌的復制：

起始AT含量高的區域

參與蛋白：DnaA（復制起始因子)：識別并結合于重復序列上，驅使富含AT的重復序列解鏈，需負超螺旋，及ATP

DnaB(DNA解旋酶):DNA雙鏈解旋，形成復制叉

SSB:(單鏈結合蛋白):保持解旋部分的單鏈狀態

DnaG(引發酶/引物酶):RNA引物合成，引發復制 延伸

參與蛋白：DNA Pol III全酶：負責新鏈的合成:前導鏈，岡崎片段

DNA pol

I：復制中除去引物，填補引物處空缺

終止： 真核生物的復制：

一個細胞周期內，一個DNA分子只能復制一次

Section F 1 復制忠實性的機制：

DNA復制的高精度：模板連和進入核苷酸在DNA聚合酶的作用位點正確配對

3’到5’外切核酸酶對錯誤堿基的校正

錯配修復 2 holiday模型 3

Section K 編碼鏈 模板鏈 2 大腸桿菌的轉錄

RNAP酶：核心酶：a 亞基：aNTD對核心酶的組裝很重要。

aCTD在識別啟動子、調節轉錄水平中起著非常重要的作用。

b 亞基：RNAP的催化中心。

與模板DNA、RNA產物、及底物核糖核苷酸緊密結合。

抗生素利福平結合在在b 亞基上，可以抑制RNAP的轉錄活性。

利福平只抑制轉錄的起始。

利迪鏈菌素只抑制延伸而不抑制轉錄起始

b’ 亞基：可能與RNAP的催化有關。

肝素與b’亞基結合后，能干擾RNAP與DNA的結合，抑制轉錄。

w 亞基：可能與RNAP的組裝及維持RNAP結構的穩定性有關

s factor(s因子)：s factor 在啟動子特異性識別過程中至關重要 移動慢的原因：可以保持與翻譯同步。

與有些基因轉錄調控相關。

有利于轉錄終止

RNAP沒有3’ →5’外切酶活性，不能進行轉錄校正。其錯配率達10-4。RNAP倒退暴露新合成的錯配堿基，可以有利于其他輔助核酸酶將錯配堿基切除，增加轉錄的忠實性。s70基礎啟動子的一般結構

-10 序列：它對轉錄起始時，RNAP打開DNA雙鏈的過程非常重要。-

10序列到TSS位點的距離對轉錄效率也有很大的影響-35 序列：增強RNAP s factor 的識別能力及與DNA的結合能力 4 影響啟動子效率的DNA序列：

核心啟動子的序列：與保守序列越像，效率越高。

TSS周圍序列：影響起始效率。

轉錄單位的前30個核苷酸的堿基序列：影響RNAP從啟動子處移動出去（啟動子區清空）的速率。

核心啟動子附近的調控元件。轉錄的起始：開放復合物 閉合復合物 無效起始

延伸：啟動子的清空，鏈的延伸轉錄泡，s因子的循環利用

終止：依賴性 不依賴性

反復重復序列

Section L 1.順式作用元件（cis-acting elements）：一般為DNA上較為保守的、有著特異性序列或結構的特定區域。它們只能影響與其在同一條染色體上的基因的活動。如：啟動子，轉錄激活因子結合位點等。

反式作用基因/調節基因（trans-acting genes，regulator genes）

可以影響與他們不在同一條染色體上的基因的表達水平的DNA元件。2 乳糖操縱子 色氨酸操縱子 正負調控都可以有誘導和阻遏兩種調控方式。

正控誘導：誘導因子活化激活因子，使其可以增加基因的表達。（Lac operon，CRP調控）正控阻遏：共阻遏物使激活因子失活，減少基因的表達。負控誘導：誘導因子使阻遏蛋白失活，增加基因的表達。（Lac operon，lac repressor）負控阻遏:共阻遏物活化阻遏蛋白，使其可以降低基因的表達。（Trp operon，trp repressor）

Section M 增強子 沉默子 TFIID：可與多種核心啟動子元件或特異性轉錄因子結合，啟動二類轉錄預起始復合物組裝的通用轉錄因子。

TBP(TATA-box binding protein):可識別并結合TATA-box TAFII（TBP-associated factor II）：TBP關聯蛋白，TFIID中與TBP形成復合體的所有蛋白，～13個。

TFII H的結構與功能：蛋白激酶(4 個亞基)：催化蛋白磷酸化。將NTP（一般為ATP）的g-磷酸基團轉移到蛋白上。

磷酸化 RNA pol II 中的CTD 結構域。TFIIE 刺激TFIIH介導的磷酸化反應。DNA 解旋酶/ATPase(5 亞基)：

水解ATP，利用其能量打開DNA的雙鏈 TBP(TATA-binding protein): 確保 RNA Pol I能正確定位到轉錄起始區域上。

SP1 為組成性表達的轉錄因子，在所有的細胞中都存在，與基因本底表達水平有關 SL1，選擇因子,RNA Pol I起始轉錄所必需的因子 CTD:羧基末端結構域，的磷酸化狀態與轉錄進程有關

轉錄起始時期，CTD結構域一般處于去磷酸化形式，與結合啟動子有關。

轉錄延伸時期，CTD結構域常處于磷酸化形式，與mRNA的加工有關。

Section N 1 DNA-binding domains（DBD）:DNA結合結構域

螺旋-轉角-螺旋結構（域）

鋅指結構（域）

堿性結構（域）

Dimerization domains：二聚體化結構域

亮氨酸拉鏈 螺旋 散環 螺旋 DBD+DM 激活結構域 酸性激活結構域 富含谷氨酰胺結構域 富含脯氨酸的結構域 LBD

Section O 真核生物中mRNA 加工的一般過程 5’加帽: CTD作用：轉錄起始時，參與加帽反應的三種酶結合在RNA Pol II的CTD結構域上。轉錄產物剛開始合成時，即對其5’端進行加帽反應。

作用：防止降解：核糖核酸酶一般不能降解帽結構中的三磷酸鍵

幫助轉運mRNA到細胞質中

增強翻譯水平：mRNA需要帽結合蛋白的幫助才能更好的與核糖體結合 幫助去除pre-mRNA中的第一個內含子。3’加Poly(A)尾：

作用：防止被核酸酶降解：增加mRNA的穩定性

有助于mRNA從細胞核到細胞質的轉運

參與pre-mRNA的最后一個內含子的剪接。

增強mRNA的翻譯水平，增加基因的表達 剪接 甲基化 2 核酶有：有催化功能的RNA即為核酶

U2 U6 RNAP 3 RNA的多樣性：可變加工，反式剪接，RNA編輯 原核生物核糖體

真核生物核糖體 原核rRNA 加工的大致過程：形成多個莖環結構，與蛋白結合形成RNP，核苷酸修飾，逐級切割

真核rRNA 加工的大致過程：甲基化，切割。內含子剪接 原核tRNA 加工的大致過程:將多順反子前體切割，分離出單順反子前體

單順反子前體進一步被切割，形成與成熟tRNA長度一致分子（RNases D, E, F，P

.堿基修飾，形成成熟tRNA 真核tRNA 加工的大致過程：5’-末端成熟，3’-末端成熟（添加5’-CCA-3’）去除內含子 7 miRNA and siRNA的調控機制：mRNA降解，抑制翻譯，抑制轉錄

Section P 1 遺傳密碼的特性:

蛋白的編碼信息由三聯體密碼子組成。

密碼子為連續的，之間無間隔、無重疊。

除三個終止密碼子之外，每個密碼子對應一種氨基酸

有密碼簡并現象。即：多個密碼子對應同一種氨基酸。

標準遺傳密碼子在各類生物中基本通用，不過少數生物體或細胞器中，有一些密碼子對應的氨基酸與標準的不同。

生物對同義密碼子的使用經常有偏好性。不同生物的密碼子偏好性不同。

基因一般不重疊。一段核酸分子一般只有一個開放閱讀框（open reading frame, ORF/可讀框），被翻譯成一個蛋白。

有些物種也有重疊基因的現象。開放閱讀框:ORF 從起始密碼子ATG 到終止密碼子

TGA,TAA or TAG 之間的連續的蛋白編碼序列

CDS 編碼序列 當ORF可以預測一個蛋白時 3 tRNA 二級結構:三葉草結構 4 tRNA的特異性加載：（翻譯的高保真性）

氨酰-tRNA合成酶對相應tRNA分子有很強的專一性：第二密碼子：

氨酰-tRNA合成酶接受相應氨基酸時有很強的忠實性：校正：雙篩選機制—酶的活性中心，酶中的編輯位點 氨酰-tRNA（AA-tRNA）： 3’-end加載了一個氨基酸的tRNA分子。是在蛋白質合成中，將密碼子轉換氨基酸的適配器。

Section Q 1 密碼子與反密碼子的反向互補配對 一個tRNA可識別的密碼子數由反密碼子的第一位堿基決定

擺動學說：第三位密碼子與第一位反密碼子的配對可以擺動

反密碼子第一位為A或C時，配對無搖擺現象。3 核糖體的E，P，A位點 A位：接受AA-tRNA部位.除了起始氨酰-tRNA，其他所有AA-tRNA都只能進A位點。P位：肽酰基-tRNA結合部位。起始氨酰-tRNA也進入此位點。E位：空載tRNA離開核糖體的位點。4 核糖體各亞基的功能

核糖體小亞基功能：結合mRNA

促進密碼子與反密碼子的正確結合 mRNA移位

大亞基的功能A位、P位、肽酰轉移酶（轉肽酶）中心等在大亞基上。

負責攜帶AA-tRNA、肽鍵/肽鏈的形成 5 翻譯的基本內容 核糖體與mRNA結合

氨酰tRNA逐個進入核糖體

氨酰tRNA通過反密碼子與mRNA互補配對 氨酰tRNA分子的氨基酸之間形成肽鍵。空載tRNA的釋放 肽鏈的釋放

第三篇：分子生物學技術

生物實驗室安全常識（廢液處理篇）生物谷

生物谷編者按：

我們的生物實驗室存在多少危險？

生物實驗對我們操作人員造成了怎樣的危害？ 實驗室工程菌外流對我們環境的影響有幾多？

這些平時并不引起我們注意的隱患也許會給我們自身健康，或者環境帶來長遠的影響，因此生物通網站聯合《遺傳》、《中國生物工程雜志》、《生命世界》雜志開展2007賽默飛世爾中國生物實驗室安全現狀調查活動，提出警示，珍惜生命！此次活動的現狀調查報告將發于相關部門，提出寶貴意見的讀者將有機會獲得精美禮品。

實驗室的污染主要有生物性污染和化學污染兩種。如按形態分則可大致分為廢水、廢氣和固體污染物三種。其中生物污染包括生物廢棄物污染和生物細菌毒素污染，如血液、尿、糞便、各種電泳液、特種生物試劑等。而化學污染則包括有機物污染和無機物污染。除此以外，還有部分實驗室存在放射性污染。在此次賽默飛世爾中國生物實驗室安全調查活動中，從現有調查結果中，我們驚訝的發現許多生物實驗室存在嚴重的污染問題，而其中又以廢液廢品的處理為最，大部分實驗室在進行生物實驗過程中產生的大量高濃度含有害微生物的培養液、培養基，未經適當的滅菌處理而直接外排，而且許多實驗室的下水道與附近居民的下水道相通，污染物通過下水道形成交叉污染，最后流入河中或者滲入地下，時間長了將造成不可估量的危害。

由于目前雖然國家環保總局將各類實驗室納入環保監管范圍，但是許多實驗室仍然處于監控真空狀態，缺乏規章制度、缺乏實驗室污染控制的經費投入、缺乏對實驗室的監管等各種原因導致了實驗室成為了污染源，對環境造成了威脅，這些種種都需要社會各界的共同關注。

生物實驗室產生的廢液污染主要是化學性污染和生物性污染，另外還有放射性污染，化學性污染包括有機物污染和無機物污染。有機物污染主要是有機試劑污染和有機樣品污染。在大多數情況下，實驗室中的有機試劑并不直接參與發生反應，僅僅起溶劑作用，因此消耗的有機試劑以各種形式排放到周邊的環境中，排放總量大致就相當于試劑的消耗量。日復一日，年復一年，排放量十分可觀。有機樣品污染包括一些劇毒的有機樣品，如農藥、苯并(α)芘、黃曲霉毒素、亞硝胺等。無機物污染有強酸、強堿的污染，重金屬污染，氰化物污染等。其中汞、砷、鉛、鎘、鉻等重金屬的毒性不僅強，且有在人體中有蓄積性。

生物性污染包括生物廢棄物污染和生物細菌毒素污染。生物廢棄物有檢驗實驗室的標本，如血液、尿、糞便、痰液和嘔吐物等；檢驗用品，如實驗器材、細菌培養基和細菌陽性標本等。生物實驗室的通風設備設計不完善或實驗過程個人安全保護漏洞，會使生物細菌毒素擴散傳播，帶來污染，甚至帶來嚴重不良后果。2003年非典流行肆虐后，許多生物實驗室加強對SAS病毒的研究，之后報道的非典感染者，多是科研工作者在實驗室研究時被感染的。在對這些污染處理的時候，需要注意以下幾個方面：

廢液的濃度超過規定的濃度時，必須進行處理。但處理設施比較齊全時，往往把廢液的處理濃度限制放寬。? 最好先將廢液分別處理，如果是貯存后一并處理時，雖然其處理方法將有所不同，但原則上要將可以統一處理的各種化合物收集后進行處理。? 處理含有絡離子、螯合物之類的廢液時，如果有干擾成份存在，要把含有這些成份的廢液另外收集。?

下面所列的廢液不能互相混合：

①過氧化物與有機物；②氰化物、硫化物、次氯酸鹽與酸；③鹽酸、氫氟酸等揮發性酸與不揮發性酸；④濃硫酸、磺酸、羥基酸、聚磷酸等酸類與其它的酸；⑤銨鹽、揮發性胺與堿。

要選擇沒有破損及不會被廢液腐蝕的容器進行收集。將所收集的廢液的成份及含量，貼上明顯的標簽，并置于安全的地點保存。特別是毒性大的廢液，尤要十分注意。? 對硫醇、胺等會發出臭味的廢液和會發生氰、磷化氫等有毒氣體的廢液，以及易燃性大的二硫化碳、乙醚之類廢液，要把它加以適當的處理，防止泄漏，并應盡快進行處理。? 含有過氧化物、硝化甘油之類爆炸性物質的廢液，要謹慎地操作，并應盡快處理。? 含有放射性物質的廢棄物，用另外的方法收集，并必須嚴格按照有關的規定，嚴防泄漏，謹慎地進行處理。?

另外不同種類的廢液等污染也要進行不同的處理：

一、化學類廢物

一般的有毒氣體可通過通風櫥或通風管道，經空氣稀釋排出。大量的有毒氣體必須通過與氧充分燃燒或吸收處理后才能排放。廢液應根據其化學特性選擇合適的容器和存放地點，通過密閉容器存放，不可混合貯存，容器標簽必須標明廢物種類、貯存時間，定期處理。一般廢液可通過酸堿中和、混凝沉淀、次氯酸鈉氧化處理后排放，有機溶劑廢液應根據性質進行回收。

1.含汞廢液的處理

排放標準3：廢液中汞的最高容許排放濃度為0.05mg/L(以Hg計)。

處理方法：①硫化物共沉淀法：先將含汞鹽的廢液的pH值調至8-10，然后加入過量的Na2S，使其生成HgS沉淀。再加入FeS04(共沉淀劑)，與過量的S2-生成FeS沉淀，將懸浮在水中難以沉淀的HgS微粒吸附共沉淀．然后靜置、分離，再經離心、過濾，濾液的含汞量可降至0.05mg/L以下。[2] ②還原法：用銅屑、鐵屑、鋅粒、硼氫化鈉等作還原劑，可以直接回收金屬汞。2.含鎘廢液的處理 ①氫氧化物沉淀法：在含鎘的廢液中投加石灰，調節pH值至10.5以上，充分攪拌后放置，使鎘離子變為難溶的Cd(OH)2沉淀．分離沉淀，用雙硫腙分光光度法檢測濾液中的Cd離子后(降至0.1mg/L以下)，將濾液中和至pH值約為7，然后排放。

②離子交換法：利用Cd2+離子比水中其它離子與陽離子交換樹脂有更強的結合力，優先交換． 3.含鉛廢液的處理 在廢液中加入消石灰，調節至pH值大于11，使廢液中的鉛生成Pb(OH)2沉淀．然后加入Al2(S04)3(凝聚劑)，將pH值降至7-8，則Pb(OH)2與Al(OH)3共沉淀，分離沉淀，達標后，排放廢液。4.含砷廢液的處理

在含砷廢液中加入FeCl3，使Fe／As達到50，然后用消石灰將廢液的pH值控制在8-10。利用新生氫氧化物和砷的化合物共沉淀的吸附作用，除去廢液中的砷。放置一夜，分離沉淀，達標后，排放廢液。

5.含酚廢液的處理

酚屬劇毒類細胞原漿毒物，處理方法：低濃度的含酚廢液可加入次氯酸鈉或漂白粉煮一下，使酚分解為二氧化碳和水。如果是高濃度的含酚廢液，可通過醋酸丁酯萃取，再加少量的氫氧化鈉溶液反萃取，經調節pH值后進行蒸餾回收．處理后的廢液排放。6.綜合廢液處理

用酸、堿調節廢液PH為3-

4、加入鐵粉，攪拌30min，然后用堿調節p H為9左右，繼續攪拌10min，加入硫酸鋁或堿式氯化鋁混凝劑、進行混凝沉淀，上清液可直接排放，沉淀于廢渣方式處理。

二、生物類廢物

生物類廢物應根據其病源特性、物理特性選擇合適的容器和地點，專人分類收集進行消毒、燒毀處理，日產日清。

液體廢物一般可加漂白粉進行氯化消毒處理。固體可燃性廢物分類收集、處理、一律及時焚燒。固體非可燃性廢物分類收集，可加漂白粉進行氯化消毒處理。滿足消毒條件后作最終處置。

1.一次性使用的制品如手套、帽子、工作物、口罩等使用后放入污物袋內集中燒毀。

2.可重復利用的玻璃器材如玻片、吸管、玻瓶等可以用1000-3000mg/L有效氯溶液浸泡2-6h．然后清洗重新使用，或者廢棄。3.盛標本的玻璃、塑料、搪瓷容器可煮沸15min.或者用1000mg/L有效氯漂白粉澄清液浸泡2-6h，消毒后用洗滌劑及流水刷洗、瀝干；用于微生物培養的，用壓力蒸汽滅菌后使用。4.微生物檢驗接種培養過的瓊脂平板應壓力滅菌30min，趁熱將瓊脂倒棄處理。

5.尿、唾液、血液等生物樣品，加漂白粉攪拌后作用2-4h，倒入化糞池或廁所?；蛘哌M行焚燒處理。

三、放射性廢棄物

一般實驗室的放射性廢棄物為中低水平放射性廢棄物，將實驗過程中產生的放射性廢物收集在專門的污物桶內，桶的外部標明醒目的標志，根據放射性同位素的半衰期長短，分別采用貯存一定時間使其衰變和化學沉淀濃縮或焚燒后掩埋處理。

1.放射性同位素的半衰期短(如：碘131、磷32等)的廢棄物，用專門的容器密閉后，放置于專門的貯存室，放置十個半衰期后排放或者焚燒處理。

2.放射性同位素的半衰期較長(如：鐵

59、鉆60等)的廢棄物，液體可用蒸發、離子交換、混凝劑共沉淀等方法濃縮，裝入容器集中埋于放射性廢物坑內。除了這些需要注意的事項以外，處理廢液等污染也需要一些安全可靠的產品，目前國際上公認的安全廢液處理，回收等方面的產品來自賽默飛世兒公司，這在之前[駐外觀察員特稿]美國與加拿大生物實驗室廢棄物處置 文中也可以看出來。這些廢液處理小器具包括：

把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術,送進受體細胞中去進行繁殖和表達的工具叫載體(Vector)。細菌質粒是重組DNA技術中常用的載體。

質粒(Plasmid)是一種染色體外的穩定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環的DNA分子,并以超螺旋狀態存在于宿主細胞中。質粒主要發現于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復制和轉錄能力,能在子代細胞中保持恒定的拷貝數,并表達所攜帶的遺傳信息。質粒的復制和轉錄要依賴于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質，如離開宿主細胞則不能存活,而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對抗生素的抗性等。F質粒(又稱F因子或性質粒)、R質粒(抗藥性因子)和Col質粒(產大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質粒。

質粒在細胞內的復制一般有兩種類型:緊密控制型(Stringent control)和松馳控制型(Relaxed control)。前者只在細胞周期的一定階段進行復制,當染色體不復制時,它也不能復制,通常每個細胞內只含有1個或幾個質粒分子,如F因子。后者的質粒在整個細胞周期中隨時可以復制,在每個細胞中有許多拷貝,一般在20個以上,如Col E1質粒。在使用蛋白質合成抑制劑-氯霉素時,細胞內蛋白質合成、染色體DNA復制和細胞分裂均受到抑制,緊密型質粒復制停止,而松馳型質粒繼續復制,質?？截悢悼捎稍瓉?0多個擴增至1000-3000個,此時質粒DNA占總DNA的含量可由原來的2%增加至40-50%。

利用同一復制系統的不同質粒不能在同一宿主細胞中共同存在,當兩種質粒同時導入同一細胞時,它們在復制及隨后分配到子細胞的過程中彼此競爭,在一些細胞中,一種質粒占優勢,而在另一些細胞中另一種質粒卻占上風。當細胞生長幾代后,占少數的質粒將會丟失,因而在細胞后代中只有兩種質粒的一種，這種現象稱質粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同復制系統的質粒則可以穩定地共存于同一宿主細胞中。質粒通常含有編碼某些酶的基因,其表型包括對抗生素的抗性,產生某些抗生素,降解復雜有機物,產生大腸桿菌素和腸毒素及某些限制性內切酶與修飾酶等。

質粒載體是在天然質粒的基礎上為適應實驗室操作而進行人工構建的。與天然質粒相比,質粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標記基因(如抗生素抗性基因)和一個人工合成的含有多個限制性內切酶識別位點的多克隆位點序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量盡可能減少,以便于基因工程操作。大多質粒載體帶有一些多用途的輔助序列,這些用途包括通過組織化學方法肉眼鑒定重組克隆、產生用于序列測定的單鏈DNA、體外轉錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達等。一個理想的克隆載體大致應有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；（2）具有多種常用的限制性內切酶的單切點；（3）能插入較大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的檢測表型。常用的質粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡稱pBS）等。

從細菌中分離質粒DNA的方法都包括3個基本步驟:培養細菌使質粒擴增；收集和裂解細胞;分離和純化質粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細胞壁,十二烷基磺酸鈉(SDS)和Triton X-100可使細胞膜裂解。經溶菌酶和SDS或Triton X-100處理后,細菌染色體DNA會纏繞附著在細胞碎片上,同時由于細菌染色體DNA比質粒大得多,易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA變性,而共價閉合環狀DNA(Covalently closed circular DNA，簡稱cccDNA)的兩條鏈不會相互分開，當外界條件恢復正常時，線狀染色體DNA片段難以復性,而是與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起,而質粒DNA雙鏈又恢復原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態存在于液相中。

在細菌細胞內,共價閉環質粒以超螺旋形式存在。在提取質粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會產生其它形式的質粒DNA。如果質粒DNA兩條鏈中有一條鏈發生一處或多處斷裂,分子就能旋轉而消除鏈的張力,形成松馳型的環狀分子,稱開環DNA(Open circular DNA, 簡稱 ocDNA)；如果質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA(Linear DNA)。當提取的質粒DNA電泳時,同一質粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環和線狀分子的泳動速度快。第二節 材料、設備及試劑

一、材料

含pBS的E.coli DH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料離心管(又稱eppendorf管),離心管架。

二、設備

微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)，渦旋振蕩器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和 恒溫水浴鍋等。

三、試劑

1、LB液體培養基(Luria-Bertani)：稱取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract)5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調pH至7.5, 加去離子水至總體積1升,高壓下蒸氣滅菌20分鐘。

2、LB固體培養基：液體培養基中每升加12g瓊脂粉,高壓滅菌。

3、氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液,-20℃保存備用。

4、溶菌酶溶液： 用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分裝成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一經使用后便予丟棄。

5、3mol/l NaAc(pH5.2)： 50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋酸調pH至5.2, 加水定容至100ml, 分裝后高壓滅菌,儲存于4℃冰箱。

6、溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌15分鐘,儲存于4℃冰箱。

7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH(臨用前用10mol/L NaOH母液稀釋)，1％ SDS。

8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高壓滅菌。溶液終濃度為: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。

9、RNA酶A母液：將RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加熱15分鐘,使混有的DNA酶失活。冷卻后用1.5ml eppendorf管分裝成小份保存于-20℃。

10、飽和酚：市售酚中含有醌等氧化物,這些產物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導致RNA和DNA的交聯,應在160℃用冷凝管進行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羥基喹啉(作為抗氧化劑),并用等體積的0.5mol/L Tris·Cl(pH8.0)和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)緩沖液反復抽提使之飽和并使其pH值達到7.6以上,因為酸性條件下DNA會分配于有機相。

11、氯仿:按氯仿:異戊醇＝24:1體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開,異戊醇則可起消除抽提過程中出現的泡沫。

按體積/體積＝1:1混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應戴手套。

12、TE緩沖液：10 mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1 mmol/L EDTA(pH8.0)。高壓滅菌后儲存于4℃冰箱中。

13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA(pH8.0)，5% Triton X-100。

14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。

15、電泳所用試劑：（1）TBE 緩沖液(5×)：稱取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000ml。（2）上樣緩沖液(6×)：0.25% 溴酚藍，40%(w/v)蔗糖水溶液。第三節 操作步驟

一、細菌的培養和收集

將含有質粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培養12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養基(含50μg/ml Amp)中,37℃振蕩培養約12小時至對數生長后期。

二、質粒DNA少量快速提取

質粒DNA小量提取法對于從大量轉化子中制備少量部分純化的質粒DNA十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣,所得DNA有一定純度,可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。

（一）、煮沸法

1、將1.5ml培養液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ離心30秒。

2、棄上清，將管倒置于衛生紙上幾分鐘，使液體流盡。

3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中, 渦旋混勻。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 渦旋振蕩3秒鐘。

5、將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量離心機4℃下12000g離心10分鐘。

7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。

8、取20ml進行電泳檢查。

[注意] 1.對大腸桿菌可從固體培養基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質粒DNA。

2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時,細菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。

3.提取的質粒DNA中會含有RNA,但RNA并不干擾進一步實驗,如限制性內切酶消化,亞克隆及連接反應等。

（二）、堿法

1、取1.5ml培養液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。

2、棄上清,將管倒置于衛生紙上數分鐘,使液體流盡。

3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數次,以混勻內容物(千萬不要振蕩),冰浴5分鐘。

5、加入150μl預冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘。

6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘。

7、將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。

8、棄上清,將管口敞開倒置于衛生紙上使所有液體流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g離心5-10分鐘。

9、吸除上清液,將管倒置于衛生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。

10、將沉淀溶于20μl TE緩沖液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，儲于-20℃冰箱中。

[注意] 1.提取過程應盡量保持低溫。

2.提取質粒DNA過程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好,要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。

3.沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用異丙醇(一般使用等體積),且沉淀完全,速度快,但常把鹽沉淀下來,所以多數還是用乙醇。

（三）、Wizard少量 DNA 純化系統

Promega公司的Wizard少量DNA純化系統可快速有效的抽提質粒DNA,整個過程只需15分鐘。提取的質?？芍苯佑糜贒NA測序、酶切分析和體外轉錄等。

該系統中所含試劑和柱子可以用于50次1-3ml質粒培養液的分離和純化，試劑包括10ml細胞懸浮液，10ml細胞裂解液；10ml中和液，50ml Wizard少量DNA純化樹脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml)和50支Wizard微型柱。

1、1-3ml過夜培養細胞液4℃下 12000g離心1-2分鐘。

2、去除上清液，菌體細胞懸浮于200μl 細胞懸浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中。

3、加200μl 細胞裂解液, 顛倒離心管數次,直到溶液變清亮。

4、加200μl 中和液,顛倒離心管數次。5、4℃下12000g離心5分鐘，取上清液于新的eppendorf管中。

6、加1ml Wizard少量 DNA 純化樹脂,顛倒離心管數次以充分混勻。

7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒與Wizard微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進入微型柱。

8、將注射器與微型柱分開,取出注塞, 再將注射筒與微型柱相連,加入2ml柱洗液,并用注塞輕推，使柱洗液進入微型柱。

9、取出微型柱置于eppendorf管中,離心2分鐘以除去微型柱中的柱洗液。

10、將微型柱放在一個新eppendorf管中，加50μl TE(或水)于微型柱中，靜止1分鐘后，4℃下12000g離心20秒。

11、丟棄微型柱，將eppendorf管中的質粒DNA貯于4℃或-20℃冰箱。

[注意] 樹脂使用前應充分混勻,如有結晶,可將樹脂用25-37℃水浴處理10分鐘。

三、質粒DNA的大量提取和純化

在制作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質粒DNA,為此需要大量提取質粒DNA。大量提取的質粒DNA一般需進一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。

（一）、堿法

1、取培養至對數生長后期的含pBS質粒的細菌培養液250ml，4℃下5000g離心15分鐘,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。

2、將細菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預冷的STE中（此步可省略）。

3、同步驟1方法離心以收集細菌細胞。

4、將細菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中,充分懸浮菌體細胞。

5、加入12ml新配制的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數次,以充分混勻內容物,冰浴10分鐘。

6、加9ml用冰預冷的溶液III, 搖動離心管數次以混勻內容物,冰上放置15分鐘,此時應形成白色絮狀沉淀。

7、4℃下5000g離心15分鐘。

8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分鐘。

9、加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g離心10分鐘。

10、取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g離心10分鐘。

11、取上層水相,加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分鐘。12、4℃下12000g離心15分鐘, 沉淀用數ml 70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g離心5分鐘。

13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。

[注意] 1.提取過程中應盡量保持低溫。

2.加入溶液II和溶液III后操作應混和,切忌劇烈振蕩。

3.由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐熱的特性,使用時應先對該酶液進行熱處理(80℃ 1小時),使DNA酶失活。

（二）、Wazard大量DNA純化系統

堿法大量提取DNA往往需要很長的時間.Promega公司的Wiazrd大量DNA純化系統既簡單又快速,只需要離心和真空抽干,這個系統可以從500ml培養液中在3小時以內獲得1mg以上的高質量的質粒DNA(200-20000bp)。該系統不需要酚和氯仿抽提,純化后的DNA溶于水或TE緩沖液中，不含任何鹽份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反應，也可以用于在核酸酶抑制劑（如RNasin）存在的條件下進行體外轉錄反應等。

該系統中含有的試劑和柱子可以用于10次100-500ml質粒培養液的分離和純化,試劑包括: 150ml 細胞懸浮液，150ml 細胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量DNA純化樹脂，125ml Wizard柱子洗脫溶液和10支 Wizard帶有存儲離心管的柱子。1、100-500ml細胞培養液置離心管中, 22-25℃下5000g離心10分鐘, 所得細胞沉淀充分懸浮于細胞懸浮液中。

2、加15ml細胞裂解溶液并輕輕混合,可以反復倒置混合,但不能用渦旋振蕩,細胞裂解完全時,溶液會變清,這一步需要20分鐘。

3、加15ml中和溶液,立即反復倒置離心管數次，并使之混勻。

4、14000g,22-25℃離心15分鐘。

5、小心地將上清液吸出并移至一個新離心管中。

6、加0.5倍體積的異丙醇,混合均勻, 14000g 22-25℃下離心15分鐘。

7、棄上清,懸浮DNA沉淀于2ml TE緩沖液中。這一步中也許有的沉淀不能溶解。

8、加10ml Wizard大量DNA純化樹脂溶液, 并渦旋混合。

9、每一個樣品,使用一支Wizard大量柱子,柱子的頭插在真空器上(Promega產品,與此配套)。

10、將樹脂/DNA混合液轉入柱子中,真空抽取樹脂/DNA混合液。

11、將樹脂/DNA混合液抽干后,加13ml柱子洗脫溶液至離心管中, 對管底部的樹脂/DNA進行洗脫(柱子一邊旋轉一邊加入洗脫液)，并加入柱子中。

12、真空抽干所加入的洗脫。

13、再加12ml柱子洗脫液進柱子并抽干。

14、加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的樹脂, 柱子真空抽干后將柱子放入用戶提供的離心管中,2500rpm(1300g)離心5分鐘。

15、取出柱子，真空抽干5分鐘,再將柱子放入系統中所提供的離心管中，2500rpm(1300g)離心5分鐘。

16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃預熱過的滅菌重蒸水或TE,1分鐘后2500rpm(1300g)離心柱子/離心管5分鐘。

17、取出柱子,離心管中溶液即為提取的質粒DNA,可以直接放在離心管中,蓋上蓋子，儲存在4℃或-20℃備用。[注意] 1.在使用之前,系統所提供的柱子洗脫液按1:1加入125ml 95％乙醇。

2.純化樹脂必須混勻后再用.（三）、Sephrose 2B柱純化質粒DNA

堿法提取的質粒DNA即使用RNA酶處理,仍會含有少量RNA。當有些試驗需無RNA污染的DNA制品時,則需進行進一步純化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B進行純化,該方法具有快速,條件溫和,重復性好,載體物質可以再利用等優點,因而已廣泛用于質粒DNA純化。

1、將Sepharose 2B經含0.1% SDS的TE（pH8.0）平衡后上柱。

2、將至多1ml的DNA溶液鋪在Sepharase 2B柱上。

3、待DNA溶液完全進入柱內后立即在柱的上部連接含有0.1% SDS的TE(pH8.0)貯液瓶。

4、以1ml流出液為1份進行收集。

5、對每一管測定其OD260值,以確定哪些管中含有質粒DNA。通常質粒DNA在柱上流出的第一個峰中。

6、合并所有含質粒的洗脫液,用等體積的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g離心2分鐘,將上層水相轉入新管。

7、加入2倍體積的冰冷無水乙醇，-20℃下沉淀10分鐘,然后4℃下12000g離心10分鐘,棄去上清液。

8、沉淀加70%乙醇洗滌,4℃下12000g離心10分鐘,棄去上清液。

9、沉淀真空抽干,重新溶于TE或無菌水中。

[注意] 在裝柱過程中,要防止柱床中出現斷裂或氣泡現象,要使界面保持平整。對新裝成的柱,應用含0.1% SDS的TE平衡, 以使柱內的凝膠均勻。

思考題

1.質粒的基本性質有哪些？

2.質粒載體與天然質粒相比有哪些改進？

3.在堿法提取質粒DNA操作過程中應注意哪些問題？ 第二章 DNA酶切及凝膠電泳 未知

第二章 DNA酶切及凝膠電泳 第一節 概 述

一.DNA的限制性內切酶酶切分析

限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列;另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛應用，它們是重組DNA的基礎。絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列:5'-G↓AATTC-3'),有少數酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位點在對稱軸一側,產生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端, 如EcoRⅠ切割識別序列后產生兩個互補的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'

3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'

DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內切酶本身都會影響限制性內切酶的活性。大部分限制性內切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當微量的污染物進入限制性內切酶貯存液中時,會影響其進一步使用,因此在吸取限制性內切酶時,每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內切酶,必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內切酶必須首先使用,隨后調節鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內切酶水解。也可在第一個酶切反應完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇，混勻后置-70℃低溫冰箱30分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進行第二個酶切反應。

DNA限制性內切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內切酶酶切位點組成，以直線或環狀圖式表示。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA的無性繁殖、基因文庫的構建等工作中，建立限制性內切酶圖譜都是不可缺少的環節，近年來發展起來的RFLP(限制性片段長度多態性)技術更是建立在它的基礎上。

構建DNA限制性內切酶圖譜有許多方法。通常結合使用多種限制性內切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點及其相對位置。酶切圖譜的使用價值依賴于它的準確性和精確程度。

在酶切圖譜制作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA用量約為0.5-1μg。限制性內切酶的酶解反應最適條件各不相同,各種酶有其相應的酶切緩沖液和最適反應溫度(大多數為37℃)。對質粒DNA酶切反應而言, 限制性內切酶用量可按標準體系1μg DNA加1單位酶,消化1-2小時。但要完全酶解則必須增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反應時間也要適當延長。

二.凝膠電泳

瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標準方法。該技術操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。

瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力極高,甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進行電泳。目前,一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳。

瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質,其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:

1、DNA的分子大小:

線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

2、瓊脂糖濃度

一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

3、DNA分子的構象

當DNA分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,超螺旋DNA移動最快,而線狀雙鏈DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時,可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收,用同一種限制性內切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。

4、電源電壓

在低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達到最大,所加電壓不得超過5v/cm。

5、嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA，使其剛性更強,還會使線狀DNA遷移率降低15％。

6、離子強度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導率最小,DNA幾乎不移動,在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導很高并明顯產熱,嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。

對于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成濃縮母液,儲于室溫。

第二節 材料、設備及試劑

一、材料

λDNA: 購買或自行提取純化;重組pBS質料或pUC19質粒;EcoRI酶及其酶切緩沖液: 購買成品;HindⅢ酶及其酶切緩沖液: 購買成品;瓊脂糖(Agarose): 進口或國產的電泳用瓊脂糖均可。

二、設備

水平式電泳裝置,電泳儀,臺式高速離心機, 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀, 照相支架, 照相機及其附件。

三、試劑1、5×TBE電泳緩沖液：配方見第一章。

2、6×電泳載樣緩沖液：0.25％ 溴粉藍，40％(w/v)蔗糖水溶液，貯存于 4℃。

3、溴化乙錠(EB)溶液母液:將EB配制成10mg/ml,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲于室溫即可。第三節 操作步驟

一、DNA酶切反應

1、將清潔干燥并經滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號,用微量移液槍分別加入DNA 1μg和相應的限制性內切酶反應10×緩沖液2μl,再加入重蒸水使總體積為19μl,將管內溶液混勻后加入1μl酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個實驗成敗的關鍵,要防止錯加，漏加。使用限制性內切酶時應盡量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。

2、混勻反應體系后,將eppendorf管置于適當的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保溫2-3小時,使酶切反應完全。

3、每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻,以停止反應,置于冰箱中保存備用。

二、DNA分子量標準的制備

采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段來作為電泳時的分子量標準。λDNA為長度約50kb的雙鏈DNA分子,其商品溶液濃度為0.5mg/ml,酶解反應操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8個片段,長度分別為23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6個片段,長度分別為21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。

三、瓊脂糖凝膠的制備

1、取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀釋緩沖液,待用。

2、膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜,以減少水份蒸發。

3、膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙。

向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg /ml(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內側,待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內,使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應樣品槽附近會有一些隆起,阻礙緩沖液進入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應注滿緩沖液。

4、加樣：取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip頭,以防止互相污染,注意上樣時要小心操作,避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。

5、電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V,電流在40mA以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時,停止電泳。

6、染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室溫下染色20-25分鐘。

7、觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時應戴上防護眼鏡或有機玻璃面罩,以免損傷眼睛。經照相機鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6,曝光時間10-120秒(根據熒光條帶的深淺選擇)。

8、DNA分子量標準曲線的制作：在放大的電泳照片上,以樣品槽為起點,用卡尺測量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離,以厘米為單位。以核苷酸數的常用對數為縱坐標,以遷移距離為橫坐標,在坐標紙上繪出連結各點的平滑曲線,即為該電泳條件下DNA分子量的標準曲線。

9、DNA酶切片段大小的測定：在放大的電泳照片上,用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離,根據此數值,在DNA分子量標準曲線上查出相應的對數值,進一步計算出各片段的分子量大小(若用單對數坐標紙來繪制標準曲線,則可根據遷移距離直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由標準曲線上查出它預計的遷移距離。

10、DNA酶切片段排列順序的確定：根據單酶切,雙酶切和多酶切的電泳分析結果,對照DNA酶切片段大小的數據進行邏輯推理,然后確定各酶切片段的排列順序和各酶切位點的相對位置。以環狀圖或直線圖表示,即成該DNA分子的限制性內切酶圖譜。[注意] 1.酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應。

2、酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應條件下，1小時完全降解1mg lDNA的酶量為一個單位，但是許多實驗制備的DNA不象lDNA那樣易于降解，需適當增加酶的使用量。反應液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質可能干擾隨后的反應。

3、市場銷售的酶一般濃度很大，為節約起見，使用時可事先用酶反應緩沖液（1×）進行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應將反應液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。

4、觀察DNA離不開紫外透射儀,可是紫外光對DNA分子有切割作用。從膠上回收DNA時,應盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm）,以減少紫外光切割DNA。

5、EB是強誘變劑并有中等毒性,配制和使用時都應戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經專門處理后才能清洗或丟棄。

6、當EB太多,膠染色過深,DNA帶看不清時,可將膠放入蒸餾水沖泡,30分鐘后再觀察。思考題

1.如果一個DNA酶解液在電泳后發現DNA未被切動, 你認為可能是什么原因？

2.瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響？ 第三章 大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化 未知

第三章 大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化 第一節 概 述

在自然條件下,很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內,但在人工構建的質粒載體中,一般缺乏此種轉移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌，需誘導受體細菌產生一種短暫的感受態以攝取外源DNA。

轉化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。

轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進入體內并穩定地遺傳給后代。受體細胞經過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學試劑法)的處理后,細胞膜的通透性發生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態細胞(Compenent cells)。進入受體細胞的DNA分子通過復制,表達實現遺傳信息的轉移,使受體細胞出現新的遺傳性狀。將經過轉化后的細胞在篩選培養基中培養，即可篩選出轉化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細胞)。目前常用的感受態細胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制備的感受態細胞轉化效率較高,但CaCl2 法簡便易行,且其轉化效率完全可以滿足一般實驗的要求,制備出的感受態細胞暫時不用時,可加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法為使用更廣泛。為了提高轉化效率, 實驗中要考慮以下幾個重要因素：

1.細胞生長狀態和密度: 不要用經過多次轉接或儲于４℃的培養菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好，可通過監測培養液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5時,細胞密度在5×107 個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。

2.質粒的質量和濃度: 用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態DNA(cccDNA)。轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受態細胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5％。

3.試劑的質量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。

4.防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新的,并經高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。

本實驗以E.coli DH5a菌株為受體細胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態,然后與pBS質粒共保溫,實現轉化。由于pBS質粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，可通過Amp抗性來篩選轉化子。如受體細胞沒有轉入pBS，則在含Amp的培養基上不能生長。能在Amp培養基上生長的受體細胞（轉化子）肯定已導入了pBS。轉化子擴增后，可將轉化的質粒提取出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。

本實驗以E.coli DH5a菌株為受體細胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態,然后與pBS質粒共保溫,實現轉化。由于pBS質粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，可通過Amp抗性來篩選轉化子。如受體細胞沒有轉入pBS，則在含Amp的培養基上不能生長。能在Amp培養基上生長的受體細胞（轉化子）肯定已導入了pBS。轉化子擴增后，可將轉化的質粒提取出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。第二節 材料、設備及試劑

一.材料

E.coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS質粒DNA: 購買或實驗室自制，eppendorf管。

二.設備

恒溫搖床,電熱恒溫培養箱,臺式高速離心機,無菌工作臺,低溫冰箱, 恒溫水浴鍋, 制冰機, 分光光度計,微量移液槍。

三.試劑

1.LB固體和液體培養基：配方見第一章。

2.Amp母液：配方見第一章。

3.含Amp的LB固體培養基:將配好的LB固體培養基高壓滅菌后冷卻至60℃左右,加入Amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪板。

4.麥康凱培養基(Maconkey Agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲存液使終濃度為50ug/ml,然后搖勻后涂板。

5.0.05mol/L CaCl2溶液:稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。

6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。

第三節 操作步驟

一、受體菌的培養

從LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α單菌落,接種于3-5ml LB液體培養基中,37℃下振蕩培養12小時左右,直至對數生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養基中,37℃振蕩培養2-3小時至OD600 ＝0.5左右。

二、感受態細胞的制備(CaCl2 法)

1、將培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃下3000g離心10分鐘。

2、棄去上清,用預冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘后,4℃下3000g離心10分鐘。

3、棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液。

4、感受態細胞分裝成200μl的小份,貯存于-70℃可保存半年。

三、轉化

1、從-70℃冰箱中取200μl感受態細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上。

2、加入pBS質粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘后。3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。

4、向管中加入1ml LB液體培養基(不含Amp),混勻后37℃振蕩培養1小時,使細菌恢復正常生長狀態,并表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr)。

5、將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿,37℃培養16-24小時。

同時做兩個對照:

對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現。

對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。

四、計算轉化率

統計每個培養皿中的菌落數。

轉化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率，公式如下：

轉化子總數＝菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積／涂板菌液體積

轉化頻率（轉化子數／每mg質粒DNA）＝轉化子總數／質粒DNA加入量(mg)

感受態細胞總數＝對照組２菌落數×稀釋倍數×菌液總體積／涂板菌液體積

感受態細胞轉化效率＝轉化子總數／感受態細胞總數

[注意] 本實驗方法也適用于其它E.coli受體菌株的不同的質粒DNA的轉化。但它們的轉化效率并不一定一樣。有的轉化效率高，需將轉化液進行多梯度稀釋涂板才能得到單菌落平板,而有的轉化效率低,涂板時必須將菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉化率。

思考題

1.制備感受態細胞的原理是什么？

2.如果實驗中對照組本不該長出菌落的平板上長出了一些菌落，你將如何解釋這種現象？

第四章 RNA的提取和cDNA合成 未知

第四章 RNA的提取和cDNA合成 第一節 概 述

從真核生物的組織或細胞中提取mRNA,通過酶促反應逆轉錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA和載體連接,然后轉化擴增, 即可獲得cDNA文庫,構建的cDNA文庫可用于真核生物基因的結構、表達和調控的分析;比較cDNA和相應基因組DNA序列差異可確定內含子存在和了解轉錄后加工等一系列問題?？傊甤DNA的合成和克隆已成為當今真核分子生物學的基本手段。自70年代中葉首例cDNA克隆問世以來,已發展了許多種提高cDNA合成效率的方法,并大大改進了載體系統，目前cDNA合成試劑已商品化。cDNA合成及克隆的基本步驟包括用反轉錄酶合成cDNA第一鏈,聚合酶合成cDNA第二鏈,加入合成接頭以及將雙鏈DNA克隆到于適當載體(噬菌體或質粒)。

一、RNA制備

模板mRNA的質量直接影響到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的結構特點,容易受RNA酶的攻擊反應而降解,加上RNA酶極為穩定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴格防止RNA酶的污染,并設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作并經常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,再用蒸餾水沖凈。DEPC是RNA酶的化學修飾劑,它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環反應而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會產生致癌物,因而使用時需小心。試驗所用試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。但DEPC能與胺和巰基反應,因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌,可用DEPC處理水配制,并盡可能用未曾開封的試劑。除DEPC外,也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需經硅烷化處理。

細胞內總RNA制備方法很多,如異硫氰酸胍熱苯酚法等。許多公司有現成的總RNA提取試劑盒,可快速有效地提取到高質量的總RNA。分離的總RNA可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特點,當RNA流經oligo(dT)纖維素柱時,在高鹽緩沖液作用下,mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上,然后逐漸降低鹽濃度洗脫,在低鹽溶液或蒸餾水中,mRNA被洗下。經過兩次oligo(dT)纖維素柱,可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

二、cDNA第一鏈的合成

所有合成cDNA第一鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)來催化反應。目前商品化反轉錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒(AMV)逆轉錄酶和從表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉錄酶。AMV反轉錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基,這些活性包括依賴于RNA的DNA合成,依賴于DNA的 DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA部分進行內切降解(RNA酶H活性)。MLV反轉錄酶只有單個多肽亞基,兼備依賴于RNA和依賴于DNA的DNA合成活性,但降解RNA:DNA雜交體中的RNA的能力較弱,且對熱的穩定性較AMV反轉錄酶差。MLV反轉錄酶能合成較長的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶利用RNA模板合成cDNA時的最適pH值,最適鹽濃度和最適溫室各不相同,所以合成第一鏈時相應調整條件是非常重要。

AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶都必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是與真核細胞mRNA分子3'端poly(A)結合的12-18核苷酸長的oligo(dT)。

三、cDNA第二鏈的合成

cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種:

(1)自身引導法 合成的單鏈cDNA 3'端能夠形成一短的發夾結構,這就為第二鏈的合成提供了現成的引物,當第一鏈合成反應產物的DNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反轉錄酶合成cDNA第二鏈,最后用對單鏈特異性的S1核酸酶消化該環,即可進一步克隆。但自身引導合成法較難控制反應，而且用S1核酸酶切割發夾結構時無一例外地將導致對應于mRNA 5'端序列出現缺失和重排,因而該方法目前很少使用。

(2)置換合成法 該方法利用第一鏈在反轉錄酶作用下產生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產生一系列RNA引物,使之成為合成第二鏈的引物,在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。該反應有3個主要優點:(1)非常有效;(2)直接利用第一鏈反應產物,無須進一步處理和純化;(3)不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發夾環。目前合成cDNA常采用該方法。

四、cDNA的分子克隆

已經制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣,可以插入到質粒或噬菌體中,為此,首先必需連接上接頭(Linker),接頭可以是限制性內切酶識別位點片段,也可以利用末端轉移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重組質粒,并轉化到宿主菌中進行擴增。合成的cDNA也可以經PCR擴增后再克隆入適當載體。第二節 動植物組織mRNA提取

一、材料

水稻葉片或小鼠肝組織。

二、設備

研缽，冷凍臺式高速離心機，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測儀，電泳儀，電泳槽。

三、試劑

1、無RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小時）裝蒸餾水，然后加入0.01%的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌。2、75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。3、1×層析柱加樣緩沖液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。

4、洗脫緩沖液：10mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.05% SDS。

四、操作步驟

（一）動植物總RNA提取-Trizol法

Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交，Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。

1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。

2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。

3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。

4、棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。

5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55℃-60℃水溶 10分鐘。RNA可進行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。[注意]

1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。

2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

（二）mRNA提取

由于mRNA末端含有多poly(A)+，當總RNA流徑oligo(dT)纖維素時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經過兩次oligo(dT)纖維素柱，可得到較純的mRNA。

1、用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。

2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經DEPC處理并經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。

3、用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。

4、將

（一）中提取的RNA液于65℃溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2x柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有RNA溶液進入柱床后，加入1倍柱床體積的1x層析柱加樣溶液。

5、測定每一管的OD260，當洗出液中OD為0時，加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。

6、測定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。

7、加入1/10體積的3M NaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。8、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗 滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。

9、小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。

10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃）。[注意]

1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

2、oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。第三節 植物病毒RNA提取

大多植物病毒RNA為單鏈RNA，并且其極性與mRNA極性相同，植物病毒RNA提取較為簡單，一般使用酚氯仿即可獲得滿意結果。

一、材料

提純TMV病毒液（10mg/ml）。

二、設備

冷凍臺式離心機，低溫真空干燥儀，電泳儀，電泳槽。

三、試劑

TE-飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液，無RNA酶的雙菌水。

四、操作步驟

1、取一eppendorf管加入提純TMV（10mg/ml)400ml，再加入等體積酚/氯仿，蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘，4℃下12000g離心10分鐘。

2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機相交界面無蛋白為止。

3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等體積氯仿，用手倒置離心管數十秒，4℃下12000g離心10分鐘。

4、取水相，加入1/10倍體積的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。5、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。

6、小心棄去上清液，沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘，并溶于無RNA酶的雙菌水或TE緩沖液中。

7、取10ml進行電泳分析，另10ml用于cDNA合成。[注意]

1、整個操作應盡可能在低溫下進行。

2、由于病毒RNA鑲嵌于外殼蛋白里面，因此要充分剝去病毒外殼蛋白，一般需要多次進行酚/氯仿的抽提。第四節 cDNA合成技術

一、Riboclone M-MLV(H-)cDNA合成技術

Promega公司的RibocloneR M-MLV(H-)cDNA合成系統采用M-MLV反轉錄酶的RNase H缺失突變株取代AMV反轉錄酶,使合成的cDNA更長。該系統的第一鏈合成使用M-MLV反轉錄酶,cDNA第二鏈合成采用置換合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ進行置換合成,最后用T4 DNA聚合酶切去單鏈末端,方法簡便易行。該系統試劑包括：

20μg 特異性引物

200μl M-MLV第一鏈緩沖液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris·Cl pH8.3(37℃時);375mmol/l KCl;

15mmol/L MgCl2;50mmol/L DTT;10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP混合物(各2.5mmol/L)

2×625μ rRNasinR RNA酶抑制劑

10,000μ M-MLV反轉錄酶, RNase H-

5μg 對照RNA

400μl M-MLV第二鏈緩沖液(10×)，配方如下：

400mmol/L Tris·Cl ,pH7.2;850mmol/L KCl;44mmol/L MgCl2;

30mmol/L DTT;0.5mg/ml BSA。

500μ RNase H

500μ DNA聚合酶Ⅰ

100μ T4 DNA聚合酶Ⅰ

2×1.25ml 不含核酸酶的水

以上所有試劑除對照RNA需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg mRNA。

（一）第一鏈合成 1.試劑

[α-32 P] dCTP(>400Ci/mmol)，EDTA(50mM和200mM)，TE-飽和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液。

2.操作步驟

(1)取一滅菌的無RNA酶的eppendorf管,加入RNA模板和適當引物,每μg RNA使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接頭,使用0.3μg),用H2 O調整體積至15μl, 70℃處理5分鐘,冷卻至室溫,離心使溶液集中在管底,再依次加入

5×第一鏈緩沖液 5μl

rRNasin RNA酶抑制劑 25U

M-MLV(H-)反轉錄酶 200U

H2 O 調至總體積25μl

(2)用手指輕彈管壁,吸取5μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP(>400Ci/mmol),用以第一鏈同位素摻入放射性活性測定。

(3)37℃(隨機引物)或42℃(其它引物)溫浴1小時

(4)取出置于冰上

(5)摻入測定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA終止反應,并使總體積為100μl?？扇?0μl進行電泳分析(先用苯酚抽提),另10μl進行同位素摻入放射性活性測定。

(6)第一鏈合成eppendorf管可直接用于第二鏈合成

注：以上25μl反應總體積中所用RNA量為1μg,如合成5μg RNA,則可按比例擴大反應體積, 倒5μg RNA使用125μl總體積進行合成。

（二）第二鏈合成

1、取第一鏈反應液 20μl, 再依次加入

10×第二鏈緩沖液 20μl

DNA聚合酶Ⅰ 23μ

RNase H 0.8μ

H2O 加至終體積為100μl

2、輕輕混勻,如需進行第二鏈同位素摻入放射性活性測定,可取出10μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。3、14℃溫浴2小時(如需合成長于3kb的cDNA, 則需延長至3-4小時)。

4、摻入測定eppendorf管中加入90μl 50mM EDTA, 取10μl進行同位素摻入放射性測定,余下的可進行電泳分析。

5、cDNA第二鏈合成離心管反應液70℃處理10分鐘, 低速離心后置冰上。

6、加入2μ T4 DNA聚合酶, 37℃溫浴10分鐘。

7、加入10μl 200mmol/L EDTA終止反應。

8、用等體積酚:氯仿抽提cDNA反應液,離心2分鐘。

9、水相移至另一eppendorf管,加入0.5倍體積的7.5M醋酸銨(或0.1倍體積的1.5M醋酸鈉,pH5.2), 混勻后再加入2.5倍體積的冰冷乙醇(-20℃),-20℃放置30分鐘后離心5分鐘。

10、小心丟去上清液,加入0.5ml冰冷的70%乙醇,離心2分鐘。

11、小心移去上清液,干燥沉淀。

12、沉淀溶于10-20μl TE緩沖液。

（三）同位素摻入放射性活性測定、計算和電泳分析

1.試劑

1mg/ml鮭魚精DNA，三氯乙酸(TCA, 5%和7%)，堿性瓊脂糖膠，堿性膠電泳緩沖液，（30mM NaOH，1mM EDTA），2×樣品緩沖液，（20mM NaOH，20% 甘油，0.025%溴酚藍）。

2.操作步驟

(1)各取一2(5)中和二(4)反應液各3μl,點于玻璃纖維濾紙,室溫干燥, 這些樣品代表總放射性活性。

(2)同樣各取3μl中反應液至含有100μl(1mg/ml)鮭魚精DNA中,混勻,加入0.5ml 5% TCA, 渦旋混合儀混合后置冰上5-30分鐘。

(3)用玻璃纖維濾紙過濾,用冰冷的5% TCA洗三次,每次用5ml TCA,再用5ml丙酮或乙醇漂洗, 這些樣品代表摻入放射性活性。

(4)分別測定總放射性活性強度和摻入放射性活性強度,可用蓋革計算器,也可用液閃計數。

3.第一鏈產量測定

第一鏈摻入率(%)= 摻入cpm/總cpm ×100%

摻入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反應體積(μl)×(第一鏈摻入率)

設330為每mol dNTP的平均分子量

合成cDNA量(ng)=摻入dNTP(nmol)×330ng/nmol

mRNA向cDNA轉變率=合成cDNA量(ng)/ 模板RNA量(ng)×100%

例如總放射性活性強度為254,000cpm, 摻入放射性活性強度為3040cpm, 所用RNA摸板量為1μg,反應體積為25μl, 則:

摻入率＝3040/254000×100%=1.2

摻入dNTP量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol

合成cDNA量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng

mRNA向cDNA轉變率=198nm/1000ng×100%=19.8%

由于1000ng RNA中20%(5μl/25μl)用于摻入測定,而反應體積占總體積80%,因而實際第一鏈cDNA合成量為0.8×198ng=158ng。

4.第二鏈產量計算

除需去除第一鏈摻入dNTP外,方法同第一鏈產量計算

第二鏈摻入率= 摻入放射性活性/ 總放射性活性??

摻入dNTP量(nnol)=[0.4nmol dNTP/μl×反應體積(μl)－第一鏈摻入nmol]×第二鏈摻入率

第二鏈cDNA合成量(ng)=nmol dNTP×330ng/nmol

雙鏈cDNA轉變率=雙鏈cDNA合成量(ng)/ 單鏈cDNA合成量(ng)

例: 第二鏈摻入放射性活性強度為2780cmp, 總放射性活性強度為235000cpm.第二鏈摻入率=2780/235000×100%=1.18%

第二鏈合成dNTP量=[(0.4nmol/μl×100μl)－0.48nm]×1.18% =0.47nmol

合成第二鏈cDNA量(ng)=0.47nmol×330ng/nmol =155ng

雙鏈cDNA轉變率=155ng /158ng×100%=98%

一般cDNA第一鏈轉變率和雙鏈轉變率以12-50%和50-200%為好。

（四）電泳分析

通常合成的cDNA第一鏈和第二鏈長度為350-6000堿基,需進行1.4%堿性瓊脂糖電泳。將第一鏈和第二鏈摻入測定管中的反應液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法見本章

（二）第二鏈合成中的9-12步，一般第一鏈和第二鏈上樣量相同。

1.標準分子量DNA參照物的同位素標記

(1)通常使用λDNA/HindⅢ片段,用Klenow DNA聚合酶進行32 P標記

10×HindⅢ緩沖液 2.5μl

dATP 0.2mmol/L

dGTP 0.2mmol/L

[α-32 P]dCTP(400Ci/mmol)2μCi

λDNA/HindⅢ標準DNA 1μg

Klenow DNA聚合酶 1μ

加H2O 到總體積25μl

(2)室溫放置10分鐘, 加2.5μl 200mM EDTA終止反應, 加入2×樣品緩沖液,貯存于-20℃。

2.電泳分析

(1)用50mM NaCl, 1mM EDTA制備1.4%的堿性瓊脂糖電泳, 并置堿性電泳緩沖液中30分鐘。

(2)取樣品液, 用TE調整體積, 使第一鏈和第二鏈產率測定液的體積相同,加入等體積的2×樣品緩沖液(20mmol/L NaOH, 20%甘油，0.025%溴粉蘭）。

(3)加樣,電泳到染料距前沿線只剩膠長度的1/3處，電泳緩沖液為30mmol/L NaOH, 1mmol/L EDTA。

(4)將膠浸入7% TCA中,室溫放置30分鐘(直至染料由藍色變至黃色),取出置濾紙上,干燥數小時。

(5)用保鮮膜包裹干燥的膠,室溫壓X光片(用增感屏時-70℃壓片)。

二、其它cDNA合成技術

除Riboclone M-MLV(H-)cDNA合成技術外，Promega公司還提供有多個AMV合成試劑盒，不同試劑盒所提供的引物或引物一延接頭(Primpr-Adaptor)不同，有oligo(dT)15 引物、隨機引物、XbaⅠ引物-延接頭、NotⅠ引物-延接頭等，其余試劑一樣，這些系統包括：

20mg 引物

20ml 5×第一鏈緩沖液, 配方如下：

250mmol/L Tris·Cl,pH8.3(42℃);250mmol/L KCl;50mmol/L

MgCl2;2.5mmol/L 亞精胺(Spermidine);50mmol/L DTT;

20mmol/L dATP, dCTP,dGTP,dTTP(各5mmol/L)。

50ml 40mM焦碳酸鈉

625m rRNasin RNA酶抑制劑

600m AMV反轉錄酶

5mg 1.2kb對照RNA

200ml 10×第二鏈緩沖液，配方如下：

400mmol/L Tris·Cl,pH7.2;900mmol/L KCl;30mmol/L

MgCl2;30mmol/L DTT;0.5mg/ml BSA。

2m E.Coli RNaseH

500m E.ColiDNA PolymeraseⅠ

100m T4 DNA PolymeraseⅠ

1.5ml 不含核酸酶的水

以上所有試劑除對照RNA需在-70℃保存外，其余均可保存于-20℃，可以合成40mgmRNA。

（一）第一鏈合成

下面介紹的是25ml體積反應系統，該系統可合成多至2mgmRNA，每增加1mg mRNA，需增加反應體積10ml，如5mg mRNA需55ml反應體積。

引物或引物-延接頭和反轉錄酶與mRNA的比例應分別保持為0.5mg/mg（對NotⅠ引物-延接頭為0.3mg/mg）和15m/mg.1、試劑：

[a-32P]dCTP（>400ci/mmol)，EDTA(50mM和200mM)，TE飽和酶/氯仿，7.5mM NH4Ac，100%和70%乙醇，TE緩沖液(10mM Tris·Cl,pH8.0,1mm EDTA)。

2、操作步驟：

（1）取一滅菌的無RNA酶的eppendorf管加入的RNA樣品，及引物或引物-延接頭，用H2O調節0.5mg引物/mg mRNA（或0.3mg NotⅠ引物-延接頭/mg mRNA）的體積至15ml，70℃加熱5分鐘，待冷至室溫，離心數秒鐘使溶液集中在管底，然后依次加入：

5×第一鏈緩沖液 5ml

rRNasinR RNA酶抑制劑 25ml

40mM焦碳酸鈉2.5ml

AMV反轉錄酶 15m/mg RNA

加無水RNA酶水至總體積25ml

在加入焦碳酸鈉和AMV反轉錄酶前，需將反應液42℃溫浴5分鐘，以阻止焦碳酸鈉沉淀。焦碳酸鈉主要用于抑止第一鏈形成發夾結構。

（2）輕彈eppendorf管，取出5ml至另一加于2-5m[a-32P]dCTP c>400ci/mmol）（其體積不能超過1ml），用以第一鏈同位素摻入放射性活性測定。

（3）42℃溫浴1小時。

（4）取出置冰上。

（5）摻入測定的eppendorf管加入50mM EDTA，終止反應，并使總體積為100ml?？扇?0ml進行電泳分析，另10ml進行同位素摻入測定。

（6）第一鏈合成離心管可直接用于第二鏈合成。

（二）第二鏈合成

第二鏈合成可在第一鏈合成反應液中直接進行。

1、第一鏈反應液（20ml）中依次加入

10X 第二鏈緩沖液 10ml

E.Coli DNA polymeraseⅠ 23m

E.Coli RNaseH 0.8m

加無核酸酶水至總體積 100ml

余下步驟同本章第四節一

（二）2-12步及

（三）和

（四）。

思考題:

1.為什么mRNA提取是cDNA合成成敗的關鍵？

2.試比較自導引導法和置換合成法合成cDNA的優缺點。第五章 重組質粒的連接、轉化及篩選 未知

第五章 重組質粒的連接、轉化及篩選

第一節 概 述

質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成。但在實際工作中, 如何區分插入有外源DNA的重組質粒和無插入而自身環化的載體分子是較為困難的。通過調整連接反應中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環化限制在一定程度之下,也可以進一步采取一些特殊的克隆策略,如載體去磷酸化等來最大限度的降低載體的自身環化,還可以利用遺傳學手段如α互補現象等來鑒別重組子和非重組子。

外源DNA片段和質粒載體的連接反應策略有以下幾種：

1、帶有非互補突出端的片段 用兩種不同的限制性內切酶進行消化可以產生帶有非互補的粘性末端,這也是最容易克隆的DNA片段，一般情況下,常用質粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴增時，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。

2、帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。由于質粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個相同粘性末端，因此在連接反應中外源片段和質粒載體DNA均可能發生自身環化或幾個分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細調整連接反應中兩種DNA的濃度, 以便使正確的連接產物的數量達到最高水平。還可將載體DNA的5'磷酸基團用堿性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制質粒DNA的自身環化。帶5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地與去磷酸化的載體相連, 產生一個帶有兩個缺口的開環分子,在轉入E.coli受體菌后的擴增過程中缺口可自動修復。

3、帶有平末端 是由產生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產生，或由DNA聚合酶補平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應中，T4 DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進DNA分子凝聚成聚集體的物質以提高轉化效率。

特殊情況下，外源DNA分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,則可以在線狀質粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E.coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端轉變為互補末端或轉為平末端后再進行連接。

本實驗所使用的載體質粒DNA為pBS,轉化受體菌為E.coli DH5α菌株。由于pBS上帶有Ampr 和lacZ基因,故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與α-互補現象篩選相結合的方法。

因pBS帶有Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉化受體菌后只有帶有pBS DNA的轉化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來;而只帶有自身環化的外源片段的轉化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。

pBS上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。這個編碼區中插入了一個多克隆位點,但并沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能。E.coli DH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨立的情況下,pBS和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS和DH5α融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區段的突變體與帶有完整的近操縱基因區段的β-半乳糖苷酸陰性突變體之間實現互補的現象叫α-互補。由α-互補產生的Lac+ 細菌較易識別，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。當外源片段插入到pBS質粒的多克隆位點上后會導致讀碼框架改變, 表達蛋白失活, 產生的氨基酸片段失去α-互補能力, 因此在同樣條件下含重組質粒的轉化子在生色誘導培養基上只能形成白色菌落。在麥康凱培養基上，α-互補產生的Lac+細菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麥康凱培養基中的乳糖，產生乳酸，使pH下降，因而產生紅色菌落，而當外源片段插入后，失去α-互補能力，因而不產生β-半乳糖苷酶，無法分解培養基中的乳糖，菌落呈白色。由此可將重組質粒與自身環化的載體DNA分開。此為α-互補現象篩選。第二節 材料、設備及試劑

一、材料

外源DNA片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA溶液,濃度已知;載體DNA: pBS質粒(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知;宿主菌: E.coli DH5α,或JM系列等具有α-互補能力的菌株。

二、設備

恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋，瓊脂糖凝膠電泳裝置，電熱恒溫培養箱，電泳儀無菌，工作臺，微量移液槍，eppendorf管。

三、試劑

1、連接反應緩沖液(10×)：0.5mol/L Tris·Cl(pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫蘇糖醇(DTT)(過濾滅菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(組分V.Sigma 產品）（可用可不用），10mol/L ATP（過濾滅菌）。

2、T4 DNA連接酶(T4 DNA ligase)；購買成品。

3、X-gal儲液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的儲液, 包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞, 儲存于-20℃。

4、IPTG儲液(200mg/ml): 在800μl蒸餾水中溶解200mg IPTG后,用蒸餾水定容至1ml,用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝于eppendorf管并儲于-20℃。

5、麥康凱選擇性培養基(Maconkey Agar)：取52g麥康凱瓊脂加蒸餾水1000ml，微火煮沸至完全浴解，高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲存液使終濃度為50mg/ml，然后搖勻后涂板。

6、含X-gal和IPTG的篩選培養基：在事先制備好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal儲液和4μlIPTG儲液,用無菌玻棒將溶液涂勻,置于37℃下放置3-4小時,使培養基表面的液體完全被吸收。

7、感受態細胞制備試劑: 見第三章。

8、煮沸法快速分離質粒試劑: 見第一章。

9、質粒酶及電泳試劑: 見第二章。第三節 操作步驟

一、連接反應

1、取新的經滅菌處理的0.5ml eppendorf管, 編號。

2、將0.1μg載體DNA轉移到無菌離心管中，加等摩爾量(可稍多)的外源DNA片段。

3、加蒸餾水至體積為8μl,于45℃保溫5分鐘,以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷卻至0℃。

4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混勻后用微量離心機將液體全部甩到管底,于16℃保溫8-24小時。

同時做二組對照反應，其中對照組一只有質粒載體無外源DNA；對照組二只有外源DNA片段沒有質粒載體。

二、E.coli DH5α感受態細胞的制備及轉化

每組連接反應混和物各取2μl轉化E.coli DH5α感受態細胞。具體方法見第三章。

三、重組質粒的篩選

1、每組連接反應轉化原液取100μl用無菌玻棒均勻涂布于篩選培養基上,37℃下培養半小時以上,直至液體被完全吸收。

2、倒置平板于37℃繼續培養12-16小時,待出現明顯而又未相互重疊的單菌落時拿出平板。

3、放于4℃數小時,使顯色完全（此步麥康凱培養基不做）。

不帶有pBS質粒DNA的細胞,由于無Amp抗性,不能在含有Amp的篩選培養基上成活。帶有pBS載體的轉化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麥康凱篩選培養基上呈現為紅色菌落。在X-gal和ITPG培養基上為藍色菌落。帶有重組質粒轉化子由于喪失了β-半乳糖苷酶活性,在麥康凱選擇性培養基和x-gal和ITPG培養基上均為白色菌落。

四、酶切鑒定重組質粒

用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含Amp 50μg/ml的 5ml LB液體培養基中,37℃下振蕩培養12小時。使用煮沸法快速分離質粒DNA直接電泳，同時以煮沸法抽提的pBS質粒做對照，有插入片段的重組質粒電泳時遷移率較pBS慢。再用與連接未端相對應的限制性內切酶進一步進行酶切檢驗。還可用雜交法篩選重組質粒。

[注意]

1、DNA連接酶用量與DNA片段的性質有關，連接平齊末端，必須加大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10-100倍。

2、在連接帶有粘性末端的DNA片段時，DNA濃度一般為2-10mg/ml，在連接平齊末端時，需加入DNA濃度至100-200mg/ml。

3、連接反應后，反應液在0℃儲存數天，-80℃儲存2個月，但是在-20℃冰凍保存將會降低轉化效率。

4、粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩定，所以盡管T4 DNA連接酶的最適反應溫度為37℃，在連接粘性末端時，反應溫度以10-16℃為好，平齊末端則以15-20℃為好。

5、在連接反應中，如不對載體分子進行去5'磷酸基處理，便用過量的外源DNA片段（2-5倍），這將有助于減少載體的自身環化，增加外源DNA和載體連接的機會。

6、麥康凱選擇性瓊脂組成的平板，在含有適當抗生素時，攜有載體DNA的轉化子為淡紅色菌落，而攜有帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落。該產品篩選效果同藍白斑篩選，且價格低廉。但需及時挑取白色菌落，當培養時間延長，白色菌落會逐漸變成微紅色，影響挑選。

7、X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物顯藍色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，為非生理性的誘導物，它可以誘導lacZ的表達。

8、在含有X-gal和IPTG的篩選培養基上，攜帶載體DNA的轉化子為藍色菌落，而攜帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落，平板如在37℃培養后放于冰箱3-4小時可使顯色反應充分，藍色菌落明顯。

思考題

1.在用質粒載體進行外源DNA片段克隆時主要應考慮哪些因素？

2.利用α－互補現象篩選帶有插入片段的重組克隆的原理是什么？ 第六章 基因組DNA的提取 未知

第六章 基因組DNA的提取 第一節 概 述

基因組DNA的提取通常用于構建基因組文庫、Southern雜交(包括RFLP)及PCR分離基因等。利用基因組DNA較長的特性,可以將其與細胞器或質粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團飄浮其中, 可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部, 從而達到提取的目的。在提取過程中,染色體會發生機械斷裂,產生大小不同的片段,因此分離基因組DNA時應盡量在溫和的條件下操作,如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩, 以保證得到較長的DNA。一般來說,構建基因組文庫, 初始DNA長度必須在100kb以上,否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。而進行RFLP和PCR分析, DNA長度可短至50kb, 在該長度以上,可保證酶切后產生RFLP片段(20kb以下),并可保證包含PCR所擴增的片段(一般2kb以下)。

不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同;不同種類或同一種類的不同組織因其細胞結構及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時必須參照文獻和經驗建立相應的提取方法, 以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質對隨后的酶切、PCR反應等有較強的抑制作用,因此用富含這類物質的材料提取基因組DNA時, 應考慮除去多糖和酚類物質。

本實驗以水稻幼苗(禾本科)、李(蘋果)葉子、動物肌肉組織和大腸桿菌培養物為材料,學習基因組DNA提取的一般方法。第二節 從植物組織提取基因組DNA

一、材料

水稻幼苗或其它禾本科植物，李（蘋果）幼嫩葉子。

二、設備

移液器，冷凍高速離心機，臺式高速離心機，水浴鍋，陶瓷研缽，50ml離心管（有蓋）及5ml和1.5ml離心管，彎成鉤狀的小玻棒。

三、試劑

1、提取緩沖液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。

2、提取緩沖液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸鈉，6.0gPVP，240ul巰基乙醇，加水至300ml。

3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇

4、RnaseA母液：配方見第一章。

5、其它試劑：液氮、異丙醇、TE緩沖液，無水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。

四、操作步驟：

（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因組DNA提取

1.在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液Ⅰ, 60℃水浴預熱。

2.水稻幼苗或葉子5-10g, 剪碎, 在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預熱的離心管中, 劇烈搖動混勻, 60℃水浴保溫30-60分鐘(時間長,DNA產量高), 不時搖動。

3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 顛倒混勻(需帶手套, 防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10分鐘, 使水相和有機相分層(必要時可重新混勻)。

4.室溫下5000rpm離心5分鐘。

5.仔細移取上清液至另一50ml離心管,加入1倍體積異丙醇,混勻,室溫下放置片刻即出現絮狀DNA沉淀。

6.在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團,在干凈吸水紙上吸干,轉入含TE的離心管中,DNA很快溶解于TE。

7.如DNA不形成絮狀沉淀,則可用5000rpm離心5分鐘, 再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀,往往難溶解于TE,可在60℃水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。

8.將DNA溶液3000rpm離心5分鐘, 上清液倒入干凈的5ml離心管。

9.加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分鐘, 除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。

10.加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇,混勻,-20℃放置20分鐘左右,DNA形成絮狀沉淀。

11.用玻棒撈出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干凈吸水紙上吸干。

12.將DNA重溶解于1ml TE,-20貯存。

13.取2μl DNA樣品在0.7% Agarose膠上電泳, 檢測DNA的分子大小。同時取15μl稀釋20倍, 測定OD260/OD280, 檢測DNA含量及質量。

[注意] 5g樣品可保證獲得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。

（二）.從李(蘋果)葉子提取基因組DNA

1.取3-5克嫩葉, 液氮磨成粉狀。

2.加入提取緩沖液Ⅱ10ml, 再研磨至溶漿狀。10000rpm, 10min。

3.去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混勻。65℃, 30-60min, 常搖動。

4.同本節

（一）中步驟3-13操作。第三節 從動物組織提取基因組DNA

一、材料

哺乳動物新鮮組織。

二、設備

移液管、高速冷凍離心機、臺式離心機、水浴鍋。

三、試劑

1、分離緩沖液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。

2、其它試劑：10% SDS，蛋白酶 K(20mg/ml或粉劑)，乙醚，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。

四、操作步驟:

1.切取組織5g左右,剔除結締組織,吸水紙吸干血液,剪碎放入研缽(越細越好)。

2.倒入液氮,磨成粉末,加10ml分離緩沖液。

3.加1ml 10% SDS, 混勻,此時樣品變得很粘稠。

4.加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保溫1-2小時, 直到組織完全解體。

5.加1ml 5mol/L NaCl, 混勻,5000rpm離心數秒鐘。

6.取上清液于新離心管，用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提。待分層后,3000rpm離心 5分鐘。

7.取上層水相至干凈離心管, 加2倍體積乙醚抽提(在通風情況下操作)。

8.移去上層乙醚,保留下層水相。

9.加1/10 體積3mol/L NaAc, 及2倍體積無水乙醇顛倒混合沉淀DNA。室溫下靜止10-20分鐘，DNA沉淀形成白色絮狀物。

10.用玻棒鉤出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水紙上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。

11.如果DNA溶液中有不溶解顆粒,可在5000rpm短暫離心,取上清;如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保溫30分鐘, 用酚抽提后, 按步驟9-10重沉淀DNA。第四節 細菌基因組DNA的制備

一、材料

細菌培養物。

二、設備

移液管, 高速冷凍離心機, 臺式離心機，水浴鍋。

三、試劑

1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,緩慢加入10g CTAB,加水至100ml。

2、其它試劑：氯仿:異戊醇(24:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，異丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K(20mg/ml或粉劑)，5mol/L NaCl。

四、操作步驟：

1.100ml 細菌過夜培養液, 5000rpm離心10分鐘, 去上清液。

2.加9.5ml TE懸浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混勻, 37℃保溫1小時。

3.加1.5ml 5mol/L NaCl, 混勻。

4.加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混勻, 65℃保溫20分鐘。

5.用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm離心10分鐘, 將上清液移至干凈離心管。

6.用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干凈管中。

7.加1倍體積異丙醇, 顛倒混合, 室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。

8.用玻棒撈出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE,-20℃保存。如DNA沉淀無法撈出,可5000rpm離心, 使DNA沉淀。

9.如要除去其中的RNA, 可以按本章第三節中操作步驟處理。

第五節 基因組DNA的檢測

上述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA產量及質量均不同,有時DNA中含有酚類和多糖類物質,會影響酶切和PCR的效果。所以獲得基因組DNA后,均需檢測DNA的產量和質量。

1.DNA溶液稀釋20-30倍后,測定OD260 /OD280 比值, 明確DNA的含量和質量。

2.取2-5μl 在0.7% agarose膠上電泳, 檢測DNA的分子大小。

3.取2μg DNA, 用10單位(U)HindⅢ酶切過夜, 0.7% agarose膠上電泳, 檢測能否完全酶解(做RFLP, DNA必須完全酶解)。

如果DNA中所含雜質多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影響接續的分析和操作,可以用下列方法處理：

（1）選用幼嫩植物組織，可減少淀粉類的含量。

（2）酚:氯仿抽提, 去除蛋白質和多糖。

（3）Sepharose柱過濾, 去除酚類、多糖和小分子DNA。

（4）CsCl梯度離心, 去除雜質, 分離大片段DNA(可用作文庫構建)。思考題:

1.為什么構建DNA文庫時,一定要用大分子DNA？

2.如何檢測和保證DNA的質量？ 第七章 RFLP和RAPD技術 未知

第七章 RFLP和RAPD技術 第一節 概 述

DNA分子水平上的多態性檢測技術是進行基因組研究的基礎。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段長度多態性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究。RFLP是根據不同品種（個體）基因組的限制性內切酶的酶切位點堿基發生突變，或酶切位點之間發生了堿基的插入、缺失，導致酶切片段大小發生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同品種（個體）的DNA水平的差異（即多態性），多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA的克隆，位于染色體的不同位點，從而可以作為一種分子標記(Mark)，構建分子圖譜。當某個性狀（基因）與某個（些）分子標記協同分離時，表明這個性狀（基因）與分子標記連鎖。分子標記與性狀之間交換值的大小，即表示目標基因與分子標記之間的距離，從而可將基因定位于分子圖譜上。分子標記克隆在質粒上，可以繁殖及保存。不同限制性內切酶切割基因組DNA后，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內切酶與分子標記組成不同組合進行研究。常用的限制性內切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標記則有幾個甚至上千個。分子標記越多，則所構建的圖譜就越飽和。構建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標之一。

運用隨機引物擴增尋找多態性DNA片段可作為分子標記。這種方法即為RAPD(Random amplified polymorphic DNA，隨機擴增的多態性DNA)。盡管RAPD技術誕生的時間很短, 但由于其獨特的檢測DNA多態性的方式以及快速、簡便的特點,使這個技術已滲透于基因組研究的各個方面。該RAPD技術建立于PCR技術基礎上,它是利用一系列(通常數百個)不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對所研究基因組DNA進行PCR擴增.聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經EB染色或放射性自顯影來檢測擴增產物DNA片段的多態性,這些擴增產物DNA片段的多態性反映了基因組相應區域的DNA多態性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對于任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結合位點.這些特異的結合位點在基因組某些區域內的分布如符合PCR擴增反應的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補位置,且引物3'端相距在一定的長度范圍之內,就可擴增出DNA片段.因此如果基因組在這些區域發生DNA片段插入、缺失或堿基突變就可能導致這些特定結合位點分布發生相應的變化,而使PCR產物增加、缺少或發生分子量的改變。通過對PCR產物檢測即可檢出基因組DNA的多態性。分析時可用的引物數很大,雖然對每一個引物而言其檢測基因組DNA多態性的區域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD可以對整個基因組DNA進行多態性檢測。另外，RAPD片段克隆后可作為RFLP的分子標記進行作圖分析。

本實驗將學習RFLP的酶切,電泳和膜的制作以及RAPD技術。探針標記及雜交檢測方法請另詳見分子雜交技術。第二節 RFLP技術

一、材料

基因組DNA(大于50kb,分別來自不同的材料)。

二、設備

電泳儀及電泳槽，照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比膠塊略大)4塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙，eppendorf管(0.5ml)若干。

三、試劑：

1、限制性內切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切緩沖液。

2、5×TBE電泳緩沖液：配方見第一章。

3、變性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl。

4、中和液：1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl。

5、10×SSC：配方見第九章。

6、其它試劑：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC，ddH2O，Agarose 0.8%，0.25mol/L HCl。

四.操作步驟

1.基因組DNA的酶解

(1)大片斷DNA的提取詳見基因組DNA提取實驗,要求提取的DNA分子量大于50kb, 沒有降解。

(2)在50μl反應體系中,進行酶切反應:

5μg基因組DNA

5μl 10×酶切緩沖液

20單位（U）限制酶(任意一種)

加ddH2 O, 至50μl

(3)輕微振蕩, 離心,37℃反應過夜。

(4)取5μl反應液,0.8％瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底，這時不應有大于30kb的明顯亮帶出現。

[注意] 未酶切的DNA要防止發生降解, 酶切反應一定要徹底。

2.Southern轉移

（1）酶解的DNA經0.8％瓊脂糖凝膠電泳(可18V過夜)后EB染色觀察。

（2）將凝膠塊浸沒于0.25mol/L HCl中脫嘌呤, 10分鐘。

（3）取出膠塊, 蒸餾水漂洗, 轉至變性液變性45分鐘。經蒸餾水漂洗后轉至中和液中和30分鐘。

（4）預先將尼龍膜,濾紙浸入水中,再浸入10×SSC中,將一玻璃板架于盆中鋪一層濾紙(橋)然后將膠塊反轉放置,蓋上尼龍膜,上覆二層濾紙,再加蓋吸水紙,壓上半公斤重物, 以10×SSC鹽溶液吸印,維持18-24小時。也可用電轉移或真空轉移。

（5）取下尼龍膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速轉至0.2mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分鐘。

（6）將膜夾于2層濾紙內, 80℃真空干燥2小時。

（7）探針的制備和雜交見第九章分子雜交部分。[注意]

1、步驟（2）中脫嘌呤時間不能過長。

2、除步驟（1）、（4）、（5）外, 其余均在搖床上進行操作。

3、步驟（4）中,當尼龍膜覆于膠上時, 絕對防止膠與膜之間有氣泡發生, 加蓋濾時也不應有氣泡發生。

4、有時用一種限制性內切酶不能發現RFLP的差異，這時應該試用另一種酶。

第三節 RAPD技術

一、材料

不同來源的DNA(50ng/ul)。

二、設備

PCR儀，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，電泳裝置。

三、試劑

1、隨機引物(10mer)(5umol/L)：購買成品。

2、Taq酶：購買成品。3、10xPCR 緩沖液：配方見第八章。

4、MgCl2 ：25mmol/L。

5、dNTP：每種2.5mmol/L。

四、操作步驟：

1.在25ul反應體系中,加入

模板DNA 1ul(50ng)

隨機引物 1ul(約5pmol)

10xPCR Buffer 2.5ul

MgCl2 2ul

dNTP 2ul

Taq酶 1單位（U）

加ddH2O 至 25ul

混勻稍離心, 加一滴礦物油。

2.在加熱至90℃以上的PCR儀中預變性94℃ 2分鐘, 然后循環: 94℃ 1分鐘，36℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，共40輪循環。

3.循環結束后, 72℃ 10分鐘，4℃保存。

4.取PCR產物15ul加3ul上樣緩沖液(6x)于2% 瓊脂糖膠上電泳, 穩壓50-100Ｖ（電壓低帶型整齊，分辨率高）。

5.電泳結束，觀察、拍照。

[注意]

1、電泳時一般RAPD帶有5-15條, 大小0.1-2.0kb。

2、特異性的DNA帶可以克隆作為一個新的分子標記應用。思考題

1.DNA酶切反應不徹底會有何結果? DNA發生降解有何影響？

2.Southern轉移中脫嘌呤時間為何不能太長？

3.隨機引物擴增,為什么會產生DNA雙鏈產物? 第八章 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆 未知

第八章 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆 第一節 概 述

PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟:(1)變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈;(2)退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3)延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下,以目的DNA為模板進行合成.由這三個基本步驟組成一輪循環,理論上每一輪循環將使目的DNA擴增一倍（圖4）,這些經合成產生的DNA又可作為下一輪循環的模板,所以經25-35輪循環就可使DNA擴增達106 倍。

一、PCR反應中的主要成份

1.引物：PCR反應產物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關鍵。引物設計和選擇目的DNA序列區域時可遵循下列原則：(1)引物長度約為16-30bp，太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費,且難以合成。(2)引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T).(3)四種堿基應隨機分布，在3'端不存在連續3個G或C,因這樣易導致錯誤引發。(4)引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應, 以減少由于密碼子擺動產生的不配對。(5)在引物內, 尤其在3'端應不存在二級結構。(6)兩引物之間尤其在3'端不能互補, 以防出現引物二聚體, 減少產量。兩引物間最好不存在4個連續堿基的同源性或互補性。(7)引物5'端對擴增特異性影響不大, 可在引物設計時加上限制酶位點、核糖 體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等.通常應在5'端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。(8)引物不與模板結合位點以外的序列互補。所擴增產物本身無穩定的二級結構, 以免產生非特異性擴增,影響產量。(9)簡并引物應選用簡并程度低的密碼子, 例如選用只有一種密碼子的Met, 3'端應不存在簡并性。否則可能由于產量低而看不見擴增產物。

一般PCR反應中的引物終濃度為0.2-1.0μmol/L。引物過多會產生錯誤引導或產生引物二聚體, 過低則降低產量。利用紫外分光光度計, 可精確計算引物濃度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物濃度可按下式計算： X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)X: 引物摩爾濃度,A、C、G、T: 引物中4種不同堿基個數。

2.4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：dNTP應用NaOH 將pH調至7.0,并用分光光度計測定其準確濃度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分裝,-20℃貯存。一般反應中每種dNTP的終濃度為20-200μmol/L。理論上4 種 dNTP各20μmol/L,足以在100μl反應中合成2.6μg的DNA。當dNTP終濃度大于50mmol/L時可抑制Taq DNA聚合酶的活性.4種dNTP的濃度應該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現的錯誤摻入。

3.Mg2+：Mg2+濃度對Taq DNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性和真實性,影響引物退火和解鏈溫度, 影響產物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+ 濃度范圍為0.5-2mmol/L.對于一種新的PCR反應,可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+ 進行預備實驗,選出最適的Mg2+濃度。在PCR反應混合物中, 應盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團, 例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg2+ 離子濃度的物質,以保證最適Mg2+ 濃度。

第四篇：病毒分子生物學鑒定常用技術

實驗二十三

病毒核酸檢測常用技術

（Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses in

Common Use）

近年來隨著分子生物學的發展，基因檢測技術在微生物學實驗室診斷中也取得了長足的進展。由于部分病原微生物的基因組已成功地被克隆并進行了核苷酸序列測定，因此根據病原微生物的基因特點，應用分子生物學技術檢測樣品中有無相應病原微生物的核酸，從而可以特異、靈敏地判定標本中是否含有相應的病原微生物。在微生物學的研究及感染性疾病的診斷中，最常使用的微生物核酸檢測技術有PCR、RT-PCR、核酸雜交等技術，現對病毒核酸（DNA、RNA）的分離、PCR、RT-PCR、核酸雜交等技術的基本原理、操作方法、應用及影響因素等進行概述。

實驗 1 PCR 檢測傳染性喉氣管炎病毒核酸

【目的要求】

通過本實驗使學生初步了解和熟悉病毒核酸（DNA）的分離與PCR技術的基本原理、操作方法、影響因素和應用。

【基本原理】

雞傳染性喉氣管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科的喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一種急性上呼吸道傳染病, 常表現呼吸困難、產蛋雞產蛋下降和死亡, 是危害養雞業發展的重要疫病之一。但在臨診上極易與其它一些呼吸道疾病相混淆, 如禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎、支原體感染等。常規檢測IL TV 的方法有病原分離鑒定和血清學試驗, 這些方法雖經典，但費時且敏感性差, 不能檢測亞臨床感染, 而傳染性喉氣管炎潛伏感染是疾病的一種重要表現形式。聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前比較快速、敏感、特異的檢測手段，已被廣泛應用在病毒核酸檢測方面。本實驗以PCR方法檢測雞傳染性喉氣管炎病毒核酸為例，對PCR方法進行介紹。

PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應組成一個循環，通過多次循環反應，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是：將待擴增的模板DNA置高溫下（通常為93～94℃）使其變性解成單鏈；人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復性溫度下分別與目的基因兩側的兩條單鏈互補結合，兩個引物在模板上結合的位置決定了擴增片段的長短；耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因為模板從5’→3’方向延伸，合成DNA的新互補鏈。如此反復進行，每一次循環所產生的DNA均能成為下一次循環的模板，每一次循環都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區拷貝數擴增一倍，PCR產物得以2n的批數形式迅速擴增，經過25～30個循環后，理論上可使基因擴增109倍以上，實際上一般可達106～107倍（圖23-1）。

圖23-1 PCR基本原理示意圖

本實驗是將被檢樣品中ILTV 顆粒經裂解、變性后，分離ILTV—DNA。選擇雞傳染性喉氣管炎病毒的TK基因保守序列設計引物，由于引物與雞傳染性喉氣管炎病毒的TK基因存在著特異的互補性，當加入DNA聚合酶后，就會在引物的引導下合成該段基因，該基因片段通過人工擴增后，經含溴乙錠的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可顯示橙紅色ILTV—DNA條帶，根據片段大小來判定標本中雞傳染性喉氣管炎病毒的存在。

【器材準備】

1．病毒裂解液：醋酸鈉1.7g，EDTA鈉鹽4.65g，20mg/ml蛋白酶K 2.5ml，100g/L SDS 10ml，DEPC三重蒸餾水加至50ml。

2.3mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 5.2)，酚/氯仿/異戊醇混合液(25：24：1)，無水乙醇及70％乙醇。

3.2.5mmol dNTPs：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM。

4.10×PCR Buffer，Taq DNA聚合酶。

5.DNA分子量標準。

6.上樣緩沖液：2.5g/L溴酚藍、400g/L蔗糖水溶液。10mg/ml溴乙錠(EB)(具致癌性，操作時應戴手套)，瓊脂糖。

7.50×TAE緩沖液：242g Tris，57.1mL 冰乙酸，100mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0）加三蒸水定容到1000mL。使用液為1×。

8.ILTV北京E2 株、ILTV-DNA可疑組織樣品、ILTV-DNA陰性組織樣品等。

9.引物序列: 參考已發表的ILTV的TK基因序列,設計并合成了一對引物,其序列如下：引物P1：5’-TTCGAGAACGATGACTCCG-3’；引物P2：5’-ATAGTCATCTGAACTTCCGC-3’。

10.儀器：臺式高速離心機、PCR擴增儀、電泳儀、水平式電泳槽、紫外透射反射分析儀、微量加樣器、Eppendorf 管與吸頭等。

【實驗步驟】

1.病毒核酸的分離

（1）取ILTV-DNA可疑組織樣品上清液200μL、病毒裂解液20μL于Eppendorf管中，60℃水浴1h，同時設ILTV北京E2 株、ILTV-DNA陰性組織樣品對照。

（2）加酚/氯仿/異戊醇混合液200μL，上下顛倒混勻，14000rpm離心5min，吸上清液于另一新的Eppendorf管中。

（3）加1/10體積的3 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 5.2)及2倍體積的無水乙醇，-20℃過夜。14000rpm離心15min，棄上清液。

（4）加70％乙醇至Eppendorf管2/3處，混勻，洗滌沉淀。14000rpm離心15min，棄上清液，室溫中使乙醇揮發。

2.加樣及PCR擴增

（1）按以下次序將各成分加入0.5ml 滅菌Eppendorf管中。

10×PCR buffer μl 2.5mM dNTPs

μl

引物P1（25pmol/μL）μl

引物P2（25pmol/μL）μl Taq DNA聚合酶（5U/μl）

0.5 μl 模板液（病毒核酸的分離液）μl 加ddH2O至

μl

（2）將上述混合液稍加離心，調整好反應程序，立即置PCR儀上，執行擴增。一般在94℃預變性3min，進入循環擴增階段：94℃ 60s→58℃ 30s→72℃ 60s，循環30-35次，最后在72℃保溫7min。

3.電泳檢測

（1）將倒膠槽兩端用透明膠帶封閉并放置在水平的臺面上，放好梳板，使梳板齒下沿距倒膠槽板1mm。

（2）配制合適濃度的瓊脂糖凝膠，如配制1.2％的凝膠，則稱取瓊脂糖1.2g于三角瓶中，加入100ml 1×TAE電泳緩沖液，置微波爐中加熱煮沸后以蒸餾水補足體積至100ml，迅速混勻，待冷至60℃左右時，加入100μL 0.5mg/ml的EB液，充分混勻。倒膠至倒膠槽內，使厚度為3～5mm，排除氣泡后待膠完全凝固，撕去兩端膠帶。

（3）將倒膠槽置電泳槽中，加入1×TAE電泳緩沖液使其沒過膠面2～3mm，輕輕拔出梳板。

（4）加樣：取2μL上樣緩沖液于Parafilm膜上，加入PCR產物5μL，混勻后，加入點樣孔中，不要溢出孔外。同時設DNA分子量標準。

（5）電泳：樣品在負極端，接通電源，5V/cm恒壓電泳30～60min即可。

（6）檢測：電泳結束，關閉電泳儀電源，取出倒膠槽，將電泳完畢的瓊脂糖凝膠放在紫外燈300nm下觀察，可見桔紅色明亮帶，根據電泳條帶的位置判斷結果。

4.結果判定

在陽性對照孔出現相應擴增帶、陰性對照孔無此擴增帶時判定結果。若樣品擴增帶與陽性對照擴增帶（約265bp）處于同一位置，則判定為ILTV-DNA陽性，否則判定為陰性。

【注意事項】

1.所有實驗結果都有成功或失敗，實驗的失敗可能是應該出結果而沒有出，我們把它稱作假陰性，不該出結果而出了結果我們把它稱為假陽性。PCR實驗中最常見的問題就是假陰性和假陽性問題。

（1）假陰性：出現假陰性結果最常見的原因有Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設計不合理；提取的模板質量或數量不過關以及PCR系統欠妥當；循環次數不夠。為了防止假陰性的出現在選用Taq DNA聚合酶時，要注意用活力高、質量好的酶。同時在提取PCR模板時，應特別注意防止污染抑制酶活性物質（如酚、氯仿）的存在。盡管Taq DNA聚合酶對模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機試劑的污染。保證引物的3’端與靶基因的互補。PCR反應的各溫度點的設置要合理。

（2）假陽性：PCR反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生，所以污染是PCR假陽性的主要根源。污染的原因可能有：

① 樣品間交叉污染。樣品污染主要有收集樣品的容器被污染，或樣品放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有樣品而造成相互間交叉污染；樣品核酸模板在提取過程中，由于移液器污染導致樣品間污染；有些微生物樣品尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。

② PCR試劑的污染。主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于移液器、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

③ PCR擴增產物污染。這是PCR反應中最主要最常見的污染問題，因為PCR產物拷貝量大，遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可造成假陽性。還有一種容易忽視，最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染移液器的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。

④ 實驗室中克隆質粒的污染。在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見，因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。

為了避免因污染而造成的假陽性，PCR操作時采取如下措施：

① 合理分隔實驗室。將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環擴增及PCR產物的鑒定等步驟分區或分室進行，特別注意樣本處理及PCR產物的鑒定應與其它步驟嚴格分開，最好能劃分①標本處理區；②PCR反應液制備區；③PCR循環擴增區；④PCR產物鑒定區。

② 移液器：移液器污染是一個值得注意的問題，由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入移液器內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產生氣溶膠污染。

③ 預混和分裝PCR試劑：所有的PCR試劑都應小量分裝，如有可能，PCR反應液應預先配制好，然后小量分裝，-20℃保存，以減少重復加樣次數，避免污染機會。另外，PCR試劑與反應液應與樣品及PCR產物分開保存，不應放于同一冰盒或同一冰箱。

④ 防止操作人員污染，手套、吸頭、小離心管應一次性使用。

⑤ 設立適當的陽性對照和陰性對照，陽性對照以能出現擴增條帶的最低量的標準核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。

⑥ 減少PCR循環次數，只要PCR產物達到檢測水平就適可而止。

⑦ 選擇質量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部，開管動作要輕，以防管內液體濺出。

2.注意個人防護和環境保護，電泳中用到的EB（Times New Roman體）可誘發基因突變，試驗中被EB污染的物品要有專用收集處，并通過焚燒作無害化處理。

3.實驗用品應專用，實驗前應將實驗室用紫外線照射以破壞殘留的DNA或RNA?？偠灾琍CR的條件是隨系統而異的，并無統一的最佳條件，先選用通用的條件擴增，然后可以通過稍稍改變各參數，使反應條件得到優化，以取得優良的特異性和產率。

【實驗報告】

1.實驗結果（1）你所做的PCR實驗陽性對照是否出現相應擴增帶? 如果有擴增帶，請對你的試驗結果進行描述。如果失敗，請分析其原因。

2.思考題

（1）PCR技術的基本原理？

（2）影響PCR實驗成功的因素有哪些？

（3）PCR檢測中出現假陽性，可能導致的因素有哪些？

（4）根據實驗過程中的體會，總結如何做好PCR實驗？關鍵因素有哪些？

實驗2 RT-PCR檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸

【目的要求】

通過本實驗使學生初步了解和熟悉病毒核酸（RNA）的分離與RT-PCR技術的基本原理、操作方法、影響因素和應用。

【基本原理】

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)引起的一種傳染病,其臨診特征為各種年齡的豬均可感染,病豬厭食、嗜睡、體溫升高,妊娠母豬發生早產、流產、死胎、弱胎和木乃伊胎,種公豬性功能下降,仔豬和育肥豬呼吸障礙。1987年該病首次報道于美國,隨后迅速蔓延北美、歐洲及亞洲各國,目前已成為一種地方性流行病。1996年初,我國也報道了本病的發生。由于PRRS與其它引起豬繁殖障礙的疾病存在著非常類似的臨診癥狀,根據現場診斷很難做出準確鑒別。實驗室診斷方面,如病毒的分離與鑒定,抗原及抗體的檢測等方法或特異性、敏感性差,或操作技術復雜、費時費力等缺點,不能滿足臨床需要。PRRSV屬動脈炎病毒科成員，有囊膜，基因組為單股正鏈RNA，大小約15kb。反轉錄-聚合酶鏈式反應（Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）方法具有特異、敏感、快速診斷等優點，因此PRRSV適用RT-PCR方法進行檢測。

RT-PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，它是以RNA為模板，根據堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA。這一過程與一般遺傳信息流轉錄的方向相反，故稱為反轉錄，催化此過程的DNA聚合酶叫做反轉錄酶(reverse transcriptase)?；具^程是以dNTP為底物，以RNA為模板，按5’→3’方向，合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA(complementary DNA, cDNA)，它與RNA模板形成RNA-DNA雜交體。隨后又在反轉錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導的DNA合成(圖23-2)，然后將DNA進行PCR擴增。PCR擴增的基本原理見實驗1部分。

圖23-2 RT-PCR基本原理示意圖

【器材準備】

1.TRIzol LS Reagent RNA提取試劑。2.氯仿、異丙醇、70%乙醇。

3.DEPC處理水：按1∶1000的比例將DEPC加入三蒸水，室溫放置12h以上。4.5×反轉錄反應緩沖液。

5.SuperScriptTMⅡ反轉錄酶（200U/μL）。6.RNA酶抑制劑(40U/μL)。

7.2.5 mM dNTPs：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mM。

8.10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶。9.DNA分子量標準。

10.上樣緩沖液：2.5g/L溴酚藍、400g/L蔗糖水溶液。10mg/ml溴乙錠(EB)(具致癌性，操作時應戴手套)，瓊脂糖。

11.50×TAE：242g Tris，57.1mL 冰乙酸，100mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0）加三蒸水定容到1000mL。使用液為1×。

12.PRRSV標準毒株、PRRSV-RNA可疑組織樣品、PRRSV-RNA陰性組織樣品等。13.引物：

（1）反轉錄引物：可用隨機引物（Random Primers）（市售）、Oligo（dT）12-18（市售）或Random Primers與Oligo（dT）按3：1混合而成的引物Oligo（dT）/Random primer，或用相對PRRSV RNA來說的PCR下游單側特異性引物。

（2）PCR引物序列：以高度保守的ORF7作為擴增靶區設計并合成一對引物，序列如下：引物F：5-ATGCCAAATAACAACGGCAAGC；引物R：5-TTAATTTGCACCCTGACTG-3。

14.儀器：臺式高速離心機、PCR擴增儀、電泳儀、水平式電泳槽、紫外透射反射分析儀、微量加樣器、Eppendorf 管、吸頭與水浴箱等。

【實驗步驟】

1.病毒核酸（RNA）的分離：病毒核酸（RNA）分離方法很多，實際應用時可靈活考慮。本實驗選擇市售商品化TRIzol LS Reagent RNA提取試劑完成豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒(PRRSV)基因組RNA的分離。操作按TRIzol LS Reagent RNA提取試劑使用說明書進行，步驟如下：

（1）在1.5mL離心管中加入250μL的PRRSV細胞培養物和750μL TRIzol LS，蓋上管蓋，倒置混勻，室溫放置10min。

（2）加入200μL氯仿，將勻漿劇烈振蕩15sec，室溫靜置5min使核蛋白質復合體徹底裂解。

（3）4℃ 12 000 rpm離心15min，將上層含RNA的水相移入一新管中。為了降低被處于水相和有機相分界處的DNA污染的可能性，不要吸取水相的最下層。（4）加入等體積的異丙醇，充分混勻液體，室溫放置10min。

（5）4℃ 12 000 rpm離心15min，棄上清，再用70%的乙醇洗滌沉淀，然后離心，再用吸頭徹底吸棄上清，在自然條件下干燥沉淀，溶于適量DEPC處理的水中。直接用于RT-PCR或-80℃貯存，備用。

（6）另外，也可選擇異硫氰酸胍法完成PRRSV RNA的提取。2.病毒cDNA第一鏈的合成（反轉錄，RT）

病毒cDNA第一鏈的合成參照Invitrogen公司的SuperScriptTMⅡ反轉錄酶使用說明進行，步驟如下：

（1）于微量離心管中加入6μL RNA、2μL反轉錄引物：Oligo（dT）/Random primer混合物，混勻，65℃ 5min。（2）冰浴2min，離心。（3）繼續加入以下組分：

5×反轉錄反應緩沖液 4μL 0.1 m M DTT 2μL 2.5mmol dNTPs 2μL SuperScriptTMⅡ反轉錄酶 1μL（200U/μL）RNA酶抑制劑 0.5μL（40U/μL）DEPC水 2.5μL（4）混勻，42℃水浴50min，最后70℃水浴15min，完成cDNA鏈合成。取出后可以直接進行PCR，或者放于-20℃保存備用。試驗中同時設立陽性和陰性對照。

3.PCR擴增

根據擴增目的選擇引物F與引物R，按TaKaRa公司Ex-Taq DNA 聚合酶使用說明進行，步驟如下：

按以下次序將各成分加入0.5ml 滅菌Eppendoff管中。

雙蒸滅菌水 37.5μL 反轉錄產物 4μL 引物F（25pmol/μL）0.5μL 引物R（25pmol/μL）0.5μL 10×PCR Buffer 5μL 2.5mmol dNTPs 2μL Taq酶 0.5μL（5U/μL）

注意首先加入雙蒸滅菌水，然后再按照順序逐一加入上述成分，每一次要加入到液面下。

（4）全部加完后，混懸，瞬時離心，使液體都沉降到Eppendorf管底。（5）在PCR擴增儀上執行如下反應程序：94℃ 3min；94℃ 30 sec，50℃ 45 sec，72℃ 1min，30個循環；最后72℃延伸10min結束。可根據擴增目的基因的不同，選擇不同的循環參數。

4.電泳檢測

（1）將倒膠槽兩端用透明膠帶封閉并放置在水平的臺面上，放好梳板，使梳板齒下沿距倒膠槽板1mm。

（2）配制合適濃度的瓊脂糖凝膠，如配制1.2％的凝膠，則稱取瓊脂糖1.2g于三角瓶中，加入100ml 1×TAE電泳緩沖液，置微波爐中加熱煮沸后以蒸餾水補足體積至100ml，迅速混勻，待冷至60℃左右時，加入100μL 0.5mg/ml的EB液，充分混勻。倒膠至倒膠槽內，使厚度為3～5mm，排除氣泡后待膠完全凝固，撕去兩端膠帶。

（3）將倒膠槽置電泳槽中，加入1×TAE電泳緩沖液使沒過膠面2～3mm，輕輕拔出梳板。

（4）加樣：取2μL上樣緩沖液于Parafilm膜上，加入PCR產物5μL，混勻后，加入點樣孔中，不要溢出孔外。同時設DNA分子量標準。

（5）電泳：樣品在負極端，接通電源，5V/cm恒壓電泳30～60min即可。

（6）檢測：電泳結束，關閉電泳儀電源，取出倒膠槽，將電泳完畢的瓊脂糖凝膠放在紫外燈300nm下觀察，可見桔紅色明亮帶，根據電泳條帶的位置判斷結果。

5.結果判定

在陽性對照孔出現相應擴增帶、陰性對照孔無此擴增帶時判定結果。

若樣品擴增帶與陽性對照擴增帶處于同一位置，則判定為PRRSV-RNA陽性，否則判定為陰性。

【注意事項】

1.分離高質量的病毒RNA是RT-PCR成敗的關鍵。由于RNA酶無處不在，且可耐受多種處理（例如煮沸）而不失活，因此RNA在分離過程中極易受其污染而降解。為了獲取完整的RNA，應創造一個無RNA酶的環境。整個操作過程應戴一次性手套并勤換。所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫（240℃）烘烤以達到消除RNA酶的目的。注意采用滅菌的一次性塑料制品，且不得重復使用；非一次性的玻璃和塑料用品須在使用前應用0.05%焦碳酸二乙酯（DEPC）室溫處理過夜，然后高壓滅菌去除DEPC，以確保無RNA酶；所有溶液（Tris除外）均須加入0.05% DEPC浸泡過夜后高壓滅菌。

2.病毒cDNA第一鏈的合成（反轉錄）步驟（1）、（2）中，將RNA溶液置65℃中溫育，然后冷卻再加樣目的是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級結構，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率，此步驟不能省略。

3.RT-PCR過程中的PCR步驟中最常見的問題參見實驗1注意事項內容。

【實驗報告】

1.實驗結果

（1）你所做的RT-PCR實驗陽性對照是否出現相應擴增帶? 如果有擴增帶，請對你的試驗結果進行描述。如果失敗，請分析其原因。

2.思考題

（1）RT-PCR技術的基本原理？

（2）影響RT-PCR實驗成功的因素有哪些？

（3）RT-PCR檢測中出現假陽性，可能導致的因素有哪些？

（4）根據實驗過程的體會，總結如何做好RT-PCR實驗？關鍵因素有哪些？

實驗3 核酸雜交技術檢測病毒核酸

【目的要求】

通過本實驗使學生初步了解和熟悉病毒核酸雜交技術的基本原理、操作方法、影響因素和應用。

【基本原理】

雞馬立克氏病(Marek’s Disease，MD)是由馬立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus，MDV)引起的雞的一種傳染性腫瘤病,它同時還能引起感染雞的免疫抑制,從而導致對多種疫苗免疫效應降低。應用特異、敏感的方法對該病作出早期診斷是控制其流行的一項重要措施。實驗室診斷MD的方法很多,到目前為止有瓊脂擴散試驗、免疫熒光抗體試驗、酶聯免疫吸附試驗等,但這些方法存在敏感性低及易出現非特異性反應等缺點。近年來業已建立的一些分子生物學方法,如核酸探針技術，以其特異、快速、敏感，適合檢測和早期診斷等特點,已在MDV檢測及MD的診斷上得到應用。

核酸雜交技術是從核酸分子混合液中檢測特定大小的核酸分子的方法。其原理主要是利用四種脫氧核苷酸中堿基配對原則(G=C、A=T)，核酸變性和復性理論（圖23-3）。

圖23-3核酸分子雜交原理示意圖

病毒核酸雜交基本原理是將和已知病毒核酸特定區域堿基互補的DNA或RNA克隆片

32段，用非放射性物質(如生物素、地高辛)或放射性物質(如P)標記，制備成核酸分子探針。在適當條件下，核酸探針與臨床樣品中的病毒核酸形成雙鏈結構而被保留，然后通過放射自顯影或免疫技術檢測標記的核酸片段。若被檢樣品與探針形成雜交雙鏈，則顯示陽性結果。如樣品中無與探針互補的序列，則不發生分子雜交，結果為陰性。常用的雜交方法有DNA斑點雜交、原位雜交、Southern雜交和Northern雜交。

下面以地高辛(Dig)標記的單鏈DNA探針試劑盒檢測MDV核酸為例，對常用的DNA斑點雜交法進行介紹。將MDV-DNA樣品滴于硝酸纖維素膜上，MDV-DNA經處理變性，雙螺旋DNA變為單鏈DNA吸附在固相濾膜上，再加分子質量較小的地高辛標記的單鏈DNA（即核酸探針），在一定條件下按互補堿基順序配對的特點進行結合，形成DNA—DNA的雙鏈雜交分子。然后用偶聯有酶的抗地高辛抗體結合物作為酶標記，再分別用顯色底物使雜交部位顯色以達到檢測目的，其反應過程見圖23-4。

圖23-4 地高辛標記的探針檢測酶聯免疫反應

【器材準備】

1.Dig-MDV-DNA探針：參照Dig-DNA探針標記試劑盒說明進行制備。2.預雜交液（pH7.0-8.6）：Ficoll 0.8ml，2.0g/L BSA 0.8ml，20g/L PVP 0.8ml，20×SSC 2ml，1 mg/m1小牛胸腺DNA 0.4ml, 雙蒸水2.8ml,0.5mol/L HCl 0.4ml。

3.漂洗液（1）20×SSC：NaCl 175.32g，枸櫞酸鈉(2H2O)88.2g，加雙蒸水至1000ml。（2）4×SSC-1.0g/L SDS：20×SSC 100ml，100.0g/L SDS 5ml，雙蒸水395ml。（3）參照（2）法配制4×SSC-5.0g/L SDS、0.1×SSC-1.0g/L SDS。

（4）3mol/L NaCl-0.5mol/L Tris：NaCl 175.32g，Tris 60.5g，雙蒸水395ml。

4.MDV 中國疫苗株814 株或中國標準株Jing-1 株、MDV-DNA可疑組織樣品與MDV-DNA陰性組織樣品等。

5.器材：負壓抽濾點樣器、硝酸纖維素膜、塑料袋、烤箱、水浴箱、冰箱、塑料封接機。

【實驗步驟】

1.病毒DNA 分離：MDV核酸分離方法參照實驗1 PCR 檢測傳染性喉氣管炎病毒核酸部分（1.病毒核酸的分離）進行。

2.探針標記：MDV pp38基因片段DNA 特異寡核苷酸探針標記，參照Dig-DNA探針試劑盒說明書進行。

3.點樣：將上述適度稀釋的病毒核酸（DNA）80μl、陽性對照80μl、陰性對照80μl點樣于硝酸纖維素膜(NC膜)或尼龍膜上，負壓抽濾。

4.變性：用0.5 mol/L NaOH變性點樣膜10min，再抽干水分按下述順序洗膜。（1）0.5 mol/L HCl漂洗1次，每次10min。

（2）3 mol/L NaCl-0.5 mol/L Tris(pH7.5)漂洗1次，每次15min。（3）1 mol/L Tris-0.5 mol/L NaCl(pH7.5)漂洗1次，每次20min。（4）0.5 mol/L Tris-0.5 mol/L NaCl(pH7.5)漂洗1次，每次20min。（5）0.2mol/L Tris-EDTA(0.002mol/L)(pH7.5)漂洗1次，每次5min。

（6）2×SSC漂洗1次，每次5min。

（7）80℃ 5min，氯仿浸泡5min，再80℃烘干2h。

5.預雜交：將濾膜和預雜交液—起放塑料袋內密封65℃水浴5h。

6.雜交：

（1）將地高辛標記的MDV pp38基因探針放沸水中煮沸10 min ,再置冰中速冷變性。（2）在塑料袋內留有適量預雜交液，加入變性的Dig-ILTV DNA，除去氣泡，充分混勻，密封，68℃搖動，雜交過夜或6 h 以上。

7.洗膜：按下列順序充分洗去未雜交的標記物。

（1）4×SSC 1.0g/L SDS漂洗1次，每次10～30min。（2）4×SSC 5.0g/L SDS 65℃漂洗1次，每次4h。（3）0.1×SSC 1.0g/L SDS 45℃漂洗1次，每次2h。

8.顯色：將雜交膜置80℃烘干30min，再裝入塑料袋內，加堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體，室溫顯色3～4h；雙蒸水洗滌，終止反應，以BCIP和NBT為底物進行顯色。

9.結果判定

在陰陽對照正常的情況下，陽性標本硝酸纖維素膜點樣處呈紫色?？膳c同時雜交的已知的MDV DNA樣品顯色強度相比較，進行樣品中MDV DNA的定量檢測。陽性與陰性結果如圖23-5。

圖23-5 DNA斑點雜交檢測結果

【注意事項】

1.實驗要設立各種對照（陽性對照、陰性對照與空白對照）。

2.非特異顯色的排除。非特異顯色是固相膜雜交方法常遇到的問題，指標記DNA非特異結合到空白膜上而顯色，即本底。這個問題的克服一是使用高純度的核酸制品和充分嚴格的雜交條件，二是選擇合格的雜交反應液充分封閉膜上的非特異結合位點和對膜進行處理。

3.使用的抗體進行梯度測試，找出最佳的使用濃度。抗體的有效期和保存條件要經常檢查，現在大多數試劑公司的抗體均要求在4~8℃條件下保存，應避免反復凍融，試劑保存時一定要避免與揮發性有機溶劑同放一室，以免降低抗體的效價。底物顯色液最好新鮮配制，如有沉渣應進行過濾后再用。

4.顯色過程最好實時監控，達到理想的染色程度時立即終止反應。

5.結果判定時，應與陽性、陰性對照進行比較，克服肉眼觀察所造成的誤差。

6.在實驗過程中應嚴格注意控制污染，所用器皿需高溫消毒，實驗者需戴手套。另外，在處理點樣硝酸纖維素膜(NC膜)或尼龍膜時，自始至終應保持濕潤，勿令其干燥。

【實驗報告】

1.實驗結果

DNA斑點雜交實驗設立的各種對照顯色是否正常? 并對你的試驗結果進行描述。如果失敗，請分析其原因。

2.思考題

（1）核酸雜交技術的基本原理？請闡述斑點雜交法主要步驟。

（2）在斑點雜交實驗中引起非特異性染色的主要因素有哪些？應如何排除？

(陳金頂)

參考文獻

1.J.薩姆布魯克.分子克隆實驗指南.北京：科學出版社，1999 2.魏群.分子生物學實驗指導.北京：高等教育出版社，1999 3.郝福英.分子生物學實驗技術.北京：北京大學出版社，1999 4.殷震,劉景華.動物病毒學[M].北京:科學技術出版社,1997 5.陸承平.獸醫微生物學.第三版.北京：中國農業出版社，2001

6.劉水平，鄔國軍.醫學微生物學實驗指導.西安：世界圖書出版公司西安公司，2002 7.張卓然.醫學微生物實驗學.第二版.北京：科學出版社，2002

8.徐秀芬，趙曼瑞，胡軍.微生物與免疫學·寄生蟲學實驗指導.北京：人民軍醫出版社，2005

9.曹澍澤等主編.獸醫微生物學及免疫學技術.北京：北京農業出版社，2003

第五篇：現代分子生物學總結

醫學細胞與分子生物學習題庫

一、名詞解釋

1．基因組

2．基因文庫

3．衛星DNA

4．SD序列

5．分子克隆

6．載體

7．反式作用因子

8．粘性末端

9．限制性內切酶

10．cDNA文庫

11．轉化率

12．質?？截悢?/p>

13．體外重組

14．感受態細胞

15．探針

16．核酸雜交

17．陽性克隆

18．固相雜交

19．解鏈溫度

20．C值悖理

21．基因家簇

22．反義RNA

23．RNA干擾

24．魔斑

25．順式作用元件

二．填空題

1.真核生物基因組DNA序列可分為（）、（）和（）。

2.真核生物基因組高度重復序列包括（）、（）、（）和（）四種。

5.原核生物轉錄水平調控的方式有（）和（）兩種方式；前者又可分為（）和（）；后者可分為（）和（）。

6.真核生物基因表達調控包括（）、（）、（）、（）和（）五個層次。

7.真核生物基因組DNA水平的調控包括（）、（）、（）、（）和（）五種方式。

8.反式作用因子可劃分為（）、（）和（）三類。

12.影響雜交的因素有（）、（）、（）、（）和（）。

15.逆轉錄酶是多功能酶，具有（）、（）、（）三種功能，但無（）作用。

16.DN的損傷突變類型有（）、（）、（）、（）和（）。

17.引起DNA損傷突變的因素是（）、（）、（）、（）和（）。

18.DNA的損傷修復方式有（）、（）、（）和（）。

20.病毒基因組可由（）或（）組成；細菌基因組由一條（）組成；真核生物基因組由（）和（）形成（）。

21.原核生物基因表達調控的方式有（）和（）；其中（）是主要的方式。

22.、操縱子由（）、（）和（）組成；受（）產物的調控。

23．順式作用元件按功能可劃分為（）、（）、（）和（）。

24．分子克隆技術的操作包括（）、（）、（）和（）等四個基本過程。

25．限制性內切酶分為（）、（）、（）三種，其中只

有（）在基因工程操作中被應用。

26.限制性內切酶識別（）序列； DNA分子在該酶切割下可產生（）、（）或（）末端。

27．分子克隆中常用的工具酶有（）、（）、（）和（）。

28．分子克隆中常用的載體有（）、（）、（）和（）。

29．目的基因制備的常用方法有（）、（）、（）。

30．體外重組常用方法有（）、（）、（）和（）。

31．重組體導入原核生物細胞中的常用方法有（）和（）；重組體導入真核生物細胞中的常用方法有（）、（）和（）。

32．重組體的篩選方法有（）、（）、（）、（）。

33．cDNA文庫的構建步驟是（）、（）（）、（）。

34．常用的核酸探針包括（）、（）和（）。

35．放射性同位素標記常用的標記方法有（）、（）、（）。

36．分子克隆中常用的非放射性同位素標記物有（）、（）、（）等；常用的標記方法有（）、（）。

37．核酸雜交技術可分為（）和（）兩種類型；后者又可分為（）和（）。

39．PCR技術的基本過程是（）、（）、（）。

40．影響PCR的因素有（）、（）、（）、（）、（）。

41．PCR反應的特點是（）、（）、（）、（）。

45．限制性核酸內切酶的作用特點是（）、（）、（）、（）。

50．DNA切除修復需要的酶有（）、（）和（）。

三、判斷題

1、生物越高度，基因組越龐大，基因數目就越多。（）

2、真核生物結構基因都是單拷貝，rRNA基因為多拷貝。（）

3、同基因是一類結構上完全相同，表達產物功能也相同的一組基因。（）

4、真核細胞基因轉錄產物為單順反子。（）

5、原核細胞基因轉錄產物為多順反子。（）

6、真核生物基因組中不編碼的區域多于編碼的區域。（）

7、衛星DNA實際上是出現在非編碼區的串聯重復序列。

8、串聯重復序列是形成衛星DNA 的基礎。

9、所有真核生物基因組中都有α衛星DNA。

10、高度重復序列在真核生物細胞基因組中重復出現可達106次以上。

11、中度重復序列的長度和拷貝數很不均一。

12、短分散片段重復順序的平均長度約為3500-5000bp。

13、長分散片段重復順序的平均長度約為300bp。

14、中度重復序列大多不編碼蛋白質。

15、高度重復序列中有一些可編碼蛋白質。

16、中度重復順序一般具有種特異性。

17、每種組蛋白的基因在同一種生物中拷貝數是相同的。

18、不同生物中組蛋白基因在基因組中的排列不一樣。

19、端粒是所有生物染色體末端的一種特殊結構。

20、以RNA為模版合成出的DNA鏈叫負股鏈。

21、顛換是指原為嘧啶突變后變為嘌呤。

22、置換是指原為嘧啶突變后變為嘌呤。

23、重組修復也叫復制后的修復。

24、原核細胞和真核細胞中許多mRNA都是多順反子轉錄產物。

25、限制性內切酶切割的DNA片段都具有粘性末端。

26、原核生物中mRNA一般不需要轉錄后加工。

27、增強子并沒有啟動子活性，卻具有增強啟動子活性，促進轉錄起始的效能。

28、在雙向復制中一條鏈按5′→3′的方向合成，另一條鏈按3′→5′的方向合成。

29、原核細胞和真核細胞復制在多個位點同時起始進行。

30、真核細胞的基因是不連續的，轉錄出來的所有RNA都必須經過加工。（31、生物DNA分子的大小等于基因的總和。（）

32、所有多肽鏈經核糖體翻譯出來即有正常生理功能。

33、核糖體是蛋白質和rRNA構成的功能復合體。

34、機體的各種細胞中含有相同的遺傳信息，所以有相同的表達，35、在負控誘導系統中，阻遏蛋白不與效應物結合時，結構基因不轉錄。

36、在負控阻遏系統中，阻遏蛋白不與效應物結合時，結構基因不轉錄。

37、CAP結合在啟動子上時，能促進RNA聚合酶與啟動子結合，促進轉錄。）

38、CAP首先與cAMP形成復合物才能與啟動子結合。

39、RBS是指mRNA起始密碼AUG前的一段非翻譯區。

40、反義RNA由反義基因轉錄而來。

41、轉錄后基因沉默被稱為RNAi。

42、細胞中蛋白質合成旺盛時，mRNA鏈上核糖體數量就多，poly（A）也較長。

43、限制性核酸內切酶是原核生物所特有的酶。

44、只有Ⅱ型限制性核酸內切酶在分子生物學中被應用。

45、COS區是指λ噬菌體粘性末端構成的區域。

53、基因擴增是指某些基因的拷貝數大量增加的現象。

54、基因重排是DNA水平調控的重要方式之一

55、所有核酸的合成都是以堿基配對為基礎的。

56、甲基化程度與基因的表達一般呈反比關系。

57、基因的甲基化程度愈高，其表達則降低。

58、去除組蛋白基因轉錄活性降低。

59、常染色質:結構松散，基因不表達。

60、異染色質:結構緊密，基因表達。

61、有基因表達活性的染色質DNA對DNaseⅠ更敏感。

62、真核生物基因調控主要也是在轉錄水平上進行的。

四、選擇題：

1.原核生物基因組中的復制起始點有（）

A．1個B．2個C．多個D．1000個以上

2．真核生物基因組中的復制起始點有（）

A．1個B．2個C．多個D．1000個以上

3.真核生物基因之間的間隔區與基因組大小（）

A．有關B．無關C．成正比E．成反比

４.衛星DNA的長度一般為()

A．5-10bpB．300bpC．100bpD．500-1000bp

５.在大腸桿菌細胞中DNA復制的保真性主要是下列哪個酶的作用（A．DNA聚合酶ⅠB．DNA聚合酶Ⅱ

C．DNA聚合酶ⅢD．DNA連接酶

６.既有內切酶活力，又有連接酶活力的是

A．拓撲異構酶B．DNA聚合酶Ⅱ

C．解螺旋酶D．DNA連接酶）

7.轉錄過程中遺傳信息的轉遞方向是()

A．DNA→RNAB．RNA→DNAC．DNA→DNAD．RNA→RNA

8.hnRNA是()

A．存在于細胞核內的tRNA前體B.存在于細胞核內的mRNA前體

C.存在于細胞核內的rRNA前體D.存在于細胞核內的snRNA前體

9.以RNA為模板合成DNA的酶是（）

A．DNA聚合酶ⅢB．DNA聚合酶ⅠC．RNA聚合酶D．反轉錄酶

10.蛋白質的生物合成中肽鏈延伸方向是（）

A．5→3B．從N端到C端C．3→5D．從C端到N端，，11.蛋白質翻譯后的加工主要包括（）。

A．氨基酸側鏈修飾B．水解修飾

C．二硫鍵的形成D． 上述各種修飾都包括

12.操縱子調控系統屬于哪一種水平的調控（）

A．復制水平的調節B。轉錄水平的調節

C．翻譯水平的調節D。轉錄后加工的調控

13.與乳糖操縱子操縱基因結合的物質是（）

A．RNA聚合酶B．DNA聚合酶C．阻遏蛋白D．誘導物

14、參與線粒體DNA復制的酶是（）

A．polαB．polδC．polβD．polγ

15、參與領頭鏈DNA復制的酶是（）

A．polαB．polδC．polβD．polγ

16、端粒酶是一種()

A．逆轉錄酶B．RNA聚合酶C．DNA聚合酶D．DNA酶

17.含稀有堿基最多的RNA是（）

A．mRNAB、rRNAC．5S-rRNAD．tRNA

18.大腸桿菌DNA連接酶需要下列哪一種輔助因子？（）

A．FAD作為電子受體B．NADP+作為磷酸供體

C．NAD+形成活性腺苷酰酶D．NAD+作為電子受體

19.真核生物RNA聚合酶I催化轉錄的產物是（）

A．mRNAB．45S-rRNAC．5S-rRNAD．tRNA

20.魔斑是指（）

A．ppGppB．cAMPC．cGMPD．7mGppp

21.CAP復合體與操縱子結合的部位是（）

A．啟動子B．操縱基因C．結構基因D．調節基因

22.基因的甲基化修飾一般發生在（）

A．CpGB．ApGC．GpTD．TpG

23.有基因表達活性的染色質DNA對下列那個酶敏感性增加？（）

A．DNaseⅠB．DNA polⅠC．DNA polⅡD.Rnase H

24.真核生物的RNA聚合酶識別的是（）

A．啟動子B．增強子C．TF-DNA復合體D．RF

25.在分子生物學中被應用的限制性核酸內切酶是（）

A．Ⅰ型B．Ⅱ型C．Ⅲ型D．以上都沒用

26.限制性核酸內切酶錯位切割產生（）

A．粘性末端B．平頭末端C．3’-磷酸D．5’-羥基

27.大腸桿菌DNA連接酶只能連接（）

A．粘性末端B．平頭末端C．3’-磷酸D．5’-羥基

28.pBR322是（）

A．復制型載體B．表達型載體C．穿梭載體D．噬菌體載體

29、pUC載體是（）

A．復制型載體B．表達型載體C．穿梭載體D．噬菌體載體

30.M13噬菌體是（）

A．單鏈DNA噬菌體B．雙鏈DNA噬菌體

C．RNA噬菌體D．都不是

31、B．表達型載體C．穿梭載體D．噬菌體載體

五．問答題

1．分子克隆中常用的工具酶有哪些？各有何用途？

2．何謂載體？分子克隆中常用的載體有哪些？理想的載體應具備哪些條件？

3．何謂PCR？試述PCR基本技術原理和影響因素。

4．常用的核酸探針有哪些類型？各有何優缺點？

5．將目的DNA與載體DNA連接起來的方法有哪些？并用文或圖表示各種連接過程。

6．簡述原核生物與真核生物基因組結構特點。

9．體外重組常用的連接方法有哪些？各有何優缺點？

13．何謂核酸雜交？常用的雜交方法有哪些？

28.何謂宿主細胞？分子克隆中常用的宿主細胞有哪些？宿主細胞應具備哪些條件？

31.簡述重組體導入哺乳動物細胞的方法

35、DNA損傷修復有哪些類型？試述各類型的修復方式。