第一篇：分子生物學技術員

生物信息部

生物信息工程師

職位職責：

1.生物信息數據分析與數據挖掘； 2.產品生物信息技術支持。

應聘要求：

1.生物信息學、醫學、生物及生物技術相關專業本科或以上學歷； 2.具有良好的英文閱讀和中文寫作能力；

3.了解或熟悉Linux操作系統及Linux Shell腳本，了解MYSQL數據庫，有Perl、Python、R或者PHP編程經驗優先；

4.了解常用生物信息學工具(BLAST，ClustalW 等)和公共基因信息數據庫資源(Genbank等)，有生物學數據處理經驗者優先；

5.有責任心，頭腦靈活，良好的溝通協調能力及團隊合作精神；

生物信息高級工程師

職位職責：

1.生物信息數據分析與數據挖掘；

2.高通量檢測數據統計分析；

3.生物信息數據的采集、整理、挖掘和利用；

4.根據客戶分析要求，進行檢測數據分析，出具分析報告,并負責對所分析數據進行問題解答。

應聘要求：

1.生物信息學專業碩士或以上學歷；醫學、統計學、數學專業的等有生物信息數據分析經驗者亦可；

2.具有良好的中英文閱讀寫作能力，能流利閱讀、翻譯英文科技文獻；

3.對生物統計學原理及意義有深刻的理解及應用能力；

4.有責任心，頭腦靈活，良好的溝通協調能力及團隊合作精神；

5.熟悉Linux操作系統及Linux Shell腳本，熟悉MYSQL數據庫；

6.掌握Perl或R，有一定的編程能力；

7.熟悉常用生物信息學工具(BLAST，ClustalW 等)和公共基因信息數據庫資源。

信息技術部

網站美工

職位職責：

1.負責公司所屬網站界面的規劃和設計；

2.配合程序開發人員進行相應頁面制作、圖片處理和FLASH動畫制作；

3.電子雜志的美術設計和排版。

應聘要求：

1.大專以上學歷，計算機或美術設計相關專業；

2.熟練Flash、PhotoShop、DreamWeaver、CorelDRAW等相關工具的使用；

3.精通CSS和HTML，熟練運用DIV+CSS制作網頁；

4.能夠了解FireFox、IE、Chrome 及Safari 等不同瀏覽器間的兼容問題；

5.熟悉InDesign或者iBooks Author優先考慮。市場部

市場主管

職位職責：

1.執行公司市場戰略規劃，制定公司的市場總體工作計劃，實施市場推廣、品牌、公關、活動等方面的工作；

2.組織和監督實施年度市場推廣計劃的落實；

3.掌握市場動態，及進行應對準備策略；

4.建立完善工作流程以及制度規范；對團隊成員和相關部門進行市場培訓和指導；

5.領導交辦的其他事項。

應聘要求：

1.扎實的分子生物學知識，能夠快速理解公司產品；碩士優先；

2.良好的Marketing觸覺和推廣意識；

3.有一定的網絡知識和熟練的計算機日常操作能力。

市場專員

職位職責：

1.根據產品推廣要求，制定常規活動、促銷推廣方案并組織實施參與重大促銷推廣活動的策劃和執行；

2.收集、分析市場信息、動態，協助制定和完成新產品推廣計劃，完成各類圍繞品牌、提升品牌和發展品牌的推廣活動。

應聘要求：

1.本科以上，分子生物學專業，女生優先；

2.較強的市場策劃能力和信息分析能力,要對產品的運作、銷售渠道、公關及促銷有全面的了解；

3.具備良好的語言表達能力和溝通能力，對工作認真負責，有媒體溝通經驗；

4.有一定的網絡推廣知識，具備一定互聯網基礎。

研發部

產品生產專員

職位職責：

1.產品質量檢測；

2.產品分裝、包裝；

3.產品說明書、標簽和包裝盒的整理和保存等；

4.配合其他部門工作。

應聘要求：

1.大專以上學歷，良好的英文水平；

2.熱愛實驗室工作者，活潑開朗、思維活躍者；

3.有高度責任心和敬業精神，工作認真細致，條理性強；

4.良好的溝通協作能力和團隊合作精神，獨立思考和解決問題的能力。

細胞生物學研究員

職位職責：

1.細胞水平Assay開發、優化和項目的執行；

2.進行細胞培養、原代細胞分離、慢病毒等相關產品研發

3.撰寫工作和實驗結果的報告，撰寫產品手冊。應聘要求：

1.生物，生化，細胞生物、分子生物及相關專業；碩士或以上學歷；英語六級，計算機水平優秀； 具有3－5年以上科研經歷（博士學歷可為應屆生）；

2.精通細胞生物學理論和實驗技術，有一定的開拓創新能力，具有獨立解決問題的能力，具有從實驗設計到實驗結果分析的能力；

3.能流利閱讀并編譯生物領域相關資料；

4.熟悉生物學領域發展新動態和新技術，敢于接受挑戰性的工作，能承受一定的工作壓力；

5.具有慢病毒包裝、干細胞、原代細胞分離培養等工作經驗優先；

6.誠實正直，工作認真嚴謹，具有良好的團隊合作精神，具有高度的責任感和敬業精神。

研發高級研究員

職位職責：

1.領導一個小組進行產品的設計、開發、優化和項目的執行；

2.完成技術報告、計劃總結、Protocol的撰寫；

3.對相關人員進培訓。

應聘要求：

1.畢業于生物技術領域較為知名的高校和研究院所，擁有生物化學、生物技術，分子生物或其他相關專業碩士或以上學歷，具有3－5年以上科研經歷（博士學歷可為應屆生）；

2.具有良好的生物化學和酶學基礎和技能；

3.有項目開發工作經驗及管理工作經驗，較強的計劃、組織協調能力；

4.知識面廣，思路開闊，較強的分析問題、解決問題和交流的能力；

5.計劃性強，有撰寫項目建議書、項目階段報告及結題報告的經驗和能力。

蛋白質表達與純化研究員

職位職責：

1.從事基因工程重組蛋白的表達，細胞破碎，蛋白質提取和純化以及SDS-PAGE、酶活鑒定等技術工作；

2.完成上級主管安排的實驗工作、研究方向；

3.撰寫實驗報告等。

應聘要求：

1.生物化學、生物技術或其它相關專業本科以上，有蛋白純化及分析相關工作經驗者優先；

2.熟練掌握重組蛋白的濃縮，超濾，AKTA純化系統，各種蛋白純化介質的使用方法，蛋白電泳，酶活檢測。

3.具有扎實的專業基礎知識，善于學習和溝通，責任心強；

具有很強的動手能力，熱愛實驗室工作。

核酸部

配料員

職位職責：

負責常規使用試劑的配制。應聘要求：

學歷不限，年齡不限，有一定化學試劑配制的基礎最佳。

分子生物學研究員

職位職責：

研究和優化克隆流程，解決困難問題，構建新載體。應聘要求： 1.生物及生物技術相關專業碩士或以上學歷，且有3年以上相關工作研究經驗；

2.具有良好的英文閱讀和中文寫作能力；

3.有扎實的生物化學和分子生物學基礎，擅長進行PCR和載體構建；熟練運用NCBI等相關數據庫、PCR設計及基因序列分析相關軟件的使用；

4.誠實正直，工作認真嚴謹，富有探索、鉆研精神和具有良好的團隊合作精神，具有高度的責任感和敬業精神。

分子生物學實驗員

職位職責：

主要協助技術員進行科研工作（要有獨立操作實驗的能力）。

應聘要求：

1.對生物技術行業感興趣，有強烈的探索欲望；

2.中專，大專或同等學歷，本科及以上學歷勿投；

3.工作認真，責任心強，有自律精神，有團隊合作精神。

4.有相關分子生物學實驗經驗者優先；

5.生物學相關專業（即有微生物、生物化學或分析化學的基礎）優先。

分子生物學技術員

職位職責：

負責基因的克隆和載體的構建。

應聘要求：

1.有相關研究經驗的本科生或碩士優先；

2.生物學相關專業畢業，有PCR和載體構建工作經驗者優先考慮；

3.有扎實的生物化學和分子生物學基礎；有較強的分子生物學技術操作技能，以及獨立思考解決問題能力； 4.熟悉NCBI等相關數據庫、PCR設計及基因序列分析相關軟件的使用；

5.熟練操作各種相關儀器；熟練查閱相關中英文資料；

6.具有較強的英語讀寫能力、協調能力和團隊合作精神。

實習助理

職位職責：協助實驗員或技術員開展實驗工作。應聘要求：

1.對生物技術行業感興趣，有強烈的探索欲望；

2.中專，大專或同等學歷；

3.工作認真，責任心強，有自律精神，有團隊合作精神。

4.生物學相關專業（即有微生物、生物化學或分析化學的基礎）優先。

蛋白部

實驗員

職位職責：

協助技術員日常工作，完成工作任務（要有獨立操作實驗的能力）。應聘要求：

1.對生物技術行業感興趣，有強烈的探索欲望；

2.中專，大專或同等學歷，具有相關發酵或微生物培養實驗經歷者優先； 3.工作認真，責任心強，有自律精神，有團隊合作精神。

4.熟練操作各種相關儀器；熟練查閱相關中英文資料；

5.具有較強的學習能力和動手操作能力、協調能力和團隊合作精神；

蛋白表達技術員

職位職責：

協助技術員日常工作，完成工作任務。

應聘要求：

1.本科學歷，生化相關專業畢業，具有相關發酵或微生物培養實驗經歷者優先；

2.具有一定生物學理論基礎，具有英語基礎，會使用計算機。

3.熟悉NCBI等相關數據庫，了解PCR設計及基因序列分析相關軟件的使用；

4.熟練操作各種相關儀器；熟練查閱相關中英文資料；

5.具有較強的學習能力和動手操作能力、協調能力和團隊合作精神；

蛋白純化技術員

職位職責：

完成重組蛋白的表達、純化及檢測工作。

應聘要求：

1.本科學歷，生物學相關專業畢業，有蛋白及免疫實驗經驗者優先考慮；

2.有扎實的生物化學和分子生物學基礎；有較強的蛋白技術操作技能，以及獨立思考解決問題能力；

3.熟悉NCBI等相關數據庫，了解PCR設計及基因序列分析相關軟件的使用；

4.熟練操作各種相關儀器；熟練查閱相關中英文資料；

5.具有較強的英語讀寫能力、協調能力和團隊合作精神。

第二篇：分子生物學

分子生物技術在微生物鑒定中的應用

摘要：微生物多樣性是生物多樣性的重要組成部分。由于微生物和 動、植物 相比, 存在著多種顯著差異。而傳統的基于微生物培養與純種分離的技術具有很大的局限性，分子生物學及其有關技術的長足進展及其在為生物中的使用, 使微生物的研究進入了分子的階段。

關鍵詞：16SrDNA PCR 溫度梯度電泳 變性梯度凝膠電泳 微生物包括了從原核到真核的不同類群的生物: 細菌、放線菌、原生動物、真菌、部分藻類和病毒, 是生物多樣性的重要組成部分。此外, 微生物多樣性與其他生物類群相比有許多獨特之處, 包括: 1)生存環境多樣;2)生長、繁殖速度多樣;3)營養、代謝類型多樣;4)生活方式多樣。因而, 微生物多樣性的研究無論對于生態系統功能的完整理解, 還是對于微生物資源的利用和開發都具有特殊重要的意義[1]。微生物作為生態系統中極重要的一員, 對動植物的生長，生態系統中的能流和物質循環及環境污染物的降解和解毒等方面起著重要作用并且與人的生活健康息息相關。隨著微生物的不斷發現及研究，傳統微生物技術越來越不能滿足其發展的需要，最主要的不足是丟失了微生物的多樣性, 許多報道都指出, 在自然環境中有相當多的菌種(約90%-99%)用傳統方法無法培養出來[2].這對于微生物基因組學研究來說是很不利的.，導致研究的片面性并且效率低下。而分子生物學技術則避開了傳統微生物培養分離的環節, 而是采取直接從樣品中抽取所含微生物總DNA, 然后通過16S rDNA, PCR, RAPD, DGGE

和RFLP 等多種分子生物學研究手段, 對直接提取的總DNA進行分析, 了解其中所包含的微生物DNA 的種類和含量, 以研究樣品中微生物的實際組成, 同時可以利用直接提取得到的總DNA 建立基因文庫, 并從中篩選有用的基因。由于是直接從樣品中提取總DNA, 中間沒有任何篩選性的過程, 因此, 所得DNA 能夠準確地反映樣品中微生物的實際情況, 避免了傳統培養方法不能真實反映微生態實際情況的缺點, 也不會丟失樣品中存在的任何微生物,同時, 這種方法能夠很容易、大批量地取得同一環境下乃至不同環境下的不同微生物的同源基因, 為微生物比較基因組學研究開辟了道路.此外, 用直接提取的總DNA 構建的基因文庫, 包含了大量以前因為無法培養而不能獲得的微生物基因, 從這些文庫中發現全新的具有巨大應用價值的抗生素類、酶類及其他生物活性物質的基因應該是非常有潛力的。1．16SrRNA比較測序

16SrDNA是編碼原核生物16SrRNA的基因，長度約1500bp，存在于所有的原核生物的基因組中，由多個保守區和與之相間的多個可變區組成。保守區為所有細菌共有，細菌之間無顯著差異；可變區在不同細菌之間存在一定程度的差異，具有細菌屬或種特異[3]。2.PCR近年來,對環境樣品總DNA 進行PCR 擴增, 推動了利用分子標記技術研究微生物的多樣性。PCR技術是美國letus公司人類遺傳研究室的科學家與1983年發明的一種在體外快速擴增特異基因或DNA 序列的方法, 其目的是將極微量DNA大量擴增。該技術模仿生物體內DNA 的復制過程,首先使DNA 變性, 兩條鏈解開;然后使引物模板退火, 二者堿基配對;耐高溫的Taq DNA 聚合酶以4種dNTP為底物, 在引物的引導下合成與模板鏈互補的DNA 新鏈[4]。PCR 技術可在體外快速擴增DNA, 具有快速、簡便、靈敏度高的特點。當然常規 PCR技術也存在很多的問題，如出現假陽性、形成引物二聚體、傳統的PCR技術一次擴增只能檢測一種微生物、RNA病毒的PCR檢測操作繁瑣，中間污染環節多，易出現假陽性或假陰性結果等.為了彌補上面這些不足，一些新的PCR技術逐漸衍生出來并被用于實踐，如熱啟動PCR、巢式PCR、逆轉錄PCR、多重PCR、通用引物PCR、PCR單鏈構象多態性分析、隨機引物DNA 多態性擴增（RAPD）、限制性長度多態性分析（RFLP）、實時熒光PCR（real-time PCR）等[5]。3.電泳分離及其顯示方法

除過我們熟知的瓊脂糖凝膠電泳并用溴乙錠(EB)染色方法和聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE 分離)銀染方法外, 還有一些通過特殊的電泳分離技術而建立的分子標記, 如變性梯度凝膠電泳(DGGE), 可分離長度相同但是序列不同的DNA 片段的混合物。對于特異性引物PCR 擴增的環境微生物的16SrRNA 基因, 一般的電泳很難將序列不同的片段分開。DGGE膠在聚丙烯酰氨膠中添加了線性梯度的變性劑, 可以形成從低到高的線性梯度, 在一定溫度下, 同一濃度的變性劑中, 不同序列的產物，其部分解鏈程度不同。DNA 解鏈程度不同決定其電泳的遷移率, 結果不同的產物在凝膠上分離開。在變性條件適當的情況下, 該技術能分辨一個堿基對。DGGE 技術在微生物群落結構 的研究、微生物種群的動態分析、富集培養以及分離物的分析、16SDNA 同源性的分析中得到廣泛應用[6]。

溫度梯度電泳(TGGE)是利用不同構象的分子具有不同的變 性溫度來進行分離, 最先應用于DNA /RNA 的分子構象分析和序列變異分析, 是一種新出現的檢測點突變的電泳技術, 其最大特點上具有高分辨能力。單鏈構象多態性(SSCP)也是根據不同的結構對DNA在凝膠中遷移速率影響很大, 結果不同序列的DNA 片段在凝膠上得以高分辨率的分離。基因芯片可分為cDNA 芯片、寡核苷酸芯片及基因組芯片。在一定條件下, 載體上的核酸分子可以與來自樣品的序列互補的核酸片段雜交。如果把樣品中的核酸片段進行標記, 在專用的芯片閱讀儀上就可以檢測到雜交信號[7]。

分子生物學技術在環境微生物研究中的應用中rRNA 技術提供了一種擺脫傳統的純種培養方法而鑒定環境微生的途徑,并已被廣泛應用于微生物的各個領域。雖然當前,標準rRNA 技術的靈敏度還難以檢測到低豐度的(低于1/ 1 000)在群落中僅占很小比例的微生物種類, 從而使之在微生物生態以及環境學上的應用受到很大的限制。然而, rRNA 技術與其它的分子技術以及特別是與傳統的純種培養方法相結合, 具備分析微生物多樣性的巨大潛力。隨著這些新的分子方法的不斷改進以及rRNA 數據庫中序列信息的不斷增加, 我們能探知更多的未知的微生物世界。

參考文獻：

[1]楊永華，姚健.分子生物學方法在微生物多樣性研究中的應用[J].生物多樣性，2000 8(3):337-342.[2]李 紅,周友兵,陳炳耀,胡錦矗.分子生物學技術在微生物多樣性研究中的應用[J].河北大學學報(自然版),2003 12(23).[3]朱詩應，戚中田.１６ＳｒＤＮＡ擴增及測序在細菌鑒定與分類中的應用[J].微生物與感染,2013 8(2):104-109.[4，7] 高小朋, 張欠欠, 任桂梅.分子生物學技術在環境微生物研究中的應用[J].延安大學學報(自然科學版),2008 9(27)：27-45.[5] 路則寶，白現廣。分子生物學技術在微生物檢驗中的應用研究進展[J].紅河學院學報，2013 4（1）38-46.[6]雷正瑜.16RsDNA序列分析技術在微生物鑒定中的應用[J].湖北生態工程職業技術學院學報，2006 1（4）：35-45.

第三篇：分子生物學課件整理

注：根據課件內容簡單整理，為了方便大家理解，內容較多;如果僅僅為了考試，可以根據自己的需要進行內容的刪減。Lecture 1.Introduction

1.What is Molecular Biology? Molecular biology seeks to explain the relationships between the structure and function of biological molecules and how these relationships contribute to the operation and control of biochemical processes.Molecular biology is the study of genes and their activities at the molecular level, including transcription, translation, DNA

（一）基因的概念的產生和發展

2、Morgan 基因的物質載體是染色體

3、G.Beadle & R.Tatum

基因是決定蛋白質一級結構的遺傳物質單位

5、O.Avery

基因的化學本質是DNA

6、Jacob & Monod

基因是在特定的遺傳調控系統的調節下和控制下表達其功能的遺傳物質單位

7、現代的基因概念

基因是核酸分子中儲存遺傳信息的遺傳單位，是指儲存有功能的蛋白replication, recombination and translocation.分子生物學的研究內容

Major content of molecular biology ◆ Structure and Function of nucleic acid ★conformation and function of DNA ★conformation and function of RNA ◎mRNA ◎tRNA◎rRNA ◎ ribozyme ◎antisence RNA ◎ microRNA ◎ RNA interfrence 人們開發出：RNAi、RNAa、ncRNA、SiRNA、microRNA、Antisene RNA、SatellileRNA、TelomereRNA、lincRNA、InCRNA、PiRNA、qiRNA、endoSiRNA等等，其他還有RNA結合蛋白(RNPs)、RNA酶等成百上千種RNA相關的新成員，組成了一個龐大的RNA新世界

這些RNA不僅在基因-蛋白質的合成中發揮重要作用，它更調節和管理著—基因的轉錄、表達、表型等幾乎所有的功能。

在細胞增殖、分化、生長、凋亡、生殖、發育、遺傳、損傷、修復、炎癥、感染、防治等一切生命活動中發揮著重要作用；

RNA還是生命起源的“先驅’’，近年來研究證明，RNA比DNA更古老，它是地球上最早出現的生命形式；它可以攜帶遺傳信息，能自我復制，自我進化，自我編譯，又具有催化分子功能------,以后才有了DNA和蛋白質，才有了今天的生物世界。

RNA更是人類生命健康的維護者，它不僅調節和管理著人類的一切生命活動，而且它還是防治許多重大的疾病和開發新藥物的靶分子和預警分子，并可直接和間接的發揮防治疾病的作用。

◆Functional Genomics ◎As the Human Genome Project has mostly determined the genetic sequence, the next step is functional genomics, which will reveal each gene's functions and controls ◎ Human Genome Diversity Project ◎ Environmental Genome Project ◎Pharmacogenomics ◎Comparative Genomics

Artificial life 人工生命是通過人工模擬生命系統,來研究生命的領域。人工生命的概念，包括兩個方面內容

1.屬于計算機科學領域的虛擬生命系統，涉及計算機軟件工程與人工智能技術，以及

2.基因工程技術人工改造生物的工程生物系統，涉及合成生物學技術。

分子生物學與醫學

◆人體發育調控和人體功能調控的分子生物學基礎 ◎發育、分化與衰老的分子生物學基礎 ◎細胞增殖調控的分子生物學基礎

◎神經、內分泌和免疫調控的分子生物學基礎

◆ 基因與疾病 ◎疾病的分子機理

致病基因的克隆

復雜疾病的分子基礎 ◎基因診斷 ◎基因治療

Lecture 2 structure and function of gene 第一節 基因的概念及其發展 一 基因（gene）

質多肽鏈或RNA序列信息所必需的全部核苷酸序列

二、基因組（genomic）The genome is the entirety of an organism's hereditary information.It is encoded either in DNA or, for many types of virus, in RNA.The genome includes both the genes and the non-coding sequences of the DNA

細胞或生物體中，一套完整單倍體的遺傳物質的總和。

人類基因組包含24條染色體以及線粒體上的全部的遺傳物質。

第二節 真核生物基因組

一、基因分類

1、結構基因（strutual gene）可被轉錄形成mRNA并進而翻譯位多肽鏈，構成各種結構蛋白的基因

2、調節基因（regulatory gene）可調節、控制結構基因表達的基因。其突變可能會影響一個或多個結構基因的功能，導致一個（或多個）蛋白質的改變。

3、rRNA基因和tRNA基因

二、基因的結構

enhancer pr omoter e xon 5UTR, 3UTR intron

（一）編碼區、外顯子（exon）

2、內含子（intron）★GT—AG規則：

內含子多是以GT開始，并以AG結尾

★一個基因的內含子可以是另一個基因的外顯子。★外顯子的數量是描述基因結構特征的重要指標。三、調控元件（acting elements）

（二）前導區：

位于編碼區的上游，相當于mRNA5端的非編碼區

（三）調節區：

包括啟動子、增強子等基因編碼區的兩側，也稱側翼序列

◎順式調控元件（cis-acting elements）：與結構基因表達調控相關。能夠被基因調控蛋白特異性識別和結合的DNA序列。◎反式調控元件（trans-acting elements）:一些可以通過結合順式元件而調節基因轉錄活性的蛋白因子。

（一）啟動子（promoter）

啟動子是DNA分子可以與RNA聚合酶特異結合的部位，也就是使轉錄開始的部位。在基因表達的調控中，轉錄的起始是個關鍵。常常某個基因是否應當表達決定于在特定的啟動子起始過程。2 啟動子的類型

(1)一類是RNA聚合酶可以直接識別的啟動子 這類啟動子應當總是能被轉錄。

但實際上也不都如此，外來蛋白質可對其有影響，即該蛋白質可直接阻斷啟動子，也可間接作用于鄰近的DNA結構，使聚合酶不能和啟動子結合(2)另一類啟動子在和聚合酶結合時需要有蛋白質輔助因子的存在。這種蛋白質因子能夠識別與該啟動子順序相鄰或甚至重疊的DNA順序。3 啟動子的共同順序

⑴ 真核生物基因啟動子 位于RNA合成開始位點的上游大約10bp和35bp處有兩個共同的順序，稱為-10和-35序列。這兩個序列的共同順序如下，-35區“AATGTGTGGAAT”，-10區“TTGACATATATT”。

-10序列又稱為Pribnow盒(原核生物)。是RNA聚合酶所結合和作用必需的順序

⑵真核生物基因啟動子

▲TATA box（Goldberg-Hogness box）：

位于-35bp處，序列為TATA（A/T）A（T/A）是RNA聚合酶Ⅱ的結合部位

▲CAAT盒：在轉錄起始位點上游70-80bp處

保守的共同順序：GCCTCAATCT。RNA聚合酶Ⅱ可以識別這一順序。⑶啟動子中的－10和-35序列是RNA聚合酶所結合和作用必需的順序 [1]RNA聚合酶能和-35和-10序列中的堿基和DNA主 鏈中的磷酸基相接觸;[2]離開共同順序較遠的啟動子的活性亦較弱;[3]最重要的是，破壞啟動子功能的突變中有75%都是改變了共同順序中的堿基，其余25%亦為離共同順序較近的。-35和-10序列相距約20bp，即大致是雙螺旋繞兩圈的長度。因為這兩個結合區是在DNA分子的同一側面，沉默子的作用機理

沉默子介導產生的沉默是一種狀態的變化,在此過程中,產生類似于異染色質的結構阻止轉錄因子與DNA的相互作用,使轉錄被抑制,沉默子作為異染色質形成中的失活中心參與沉默狀態的建立和擴散

沉默子含阻遏蛋白結合序列，阻遏蛋白與其結合后阻遏基因的轉錄。直接阻遏(direct repression)沉默子結合蛋白與轉錄復合物中的成員結合后將其固定，使基礎轉錄復合物無法形成而喪失活性

競爭(competition)在一些基因中沉默子與增強子等正調控元件相鄰或相重疊，阻遏蛋白結合后阻止激活蛋白與鄰近正調控元件的結合從而阻遏轉錄

淬滅

沉默子與增強子相鄰，阻遏蛋白與沉默子結合后,雖不影響激活蛋白與DNA的結合能力,卻通過蛋白之間的相互作用阻止激活蛋白與轉錄復合物的正確接觸來抑制其活性 可見此酶是結合在雙螺旋的一面。可以想像，它能“感覺到每個結合區的溝底中堿基所產生的特異形狀。”

（三）增強子（enhancer)★位于結構基因附近，能夠增強該基因轉錄活性的一段DNA順序稱為增強子(enhancer)。

★增強子是另一類順式作用的DNA片段，可使基因轉錄的速率大大提高。

增強子的類型

①組織和細胞專一性增強子

許多增強子的增強效應有很高的組織細胞專一性，只有在特定的轉錄因子(蛋白質)參與下，才能發揮其功能。②誘導性增強子

這種增強子的活性通常要有特定的啟動子參與。

例如，金屬硫蛋白基因可以在多種組織細胞中轉錄，又可受類固醇激素、鋅、鎘和生長因子等的誘導而提高轉錄水平。

增強子的特點

①增強子可提高同一條DNA鏈上基因轉錄效率，可以遠距離作用，通常距離l～4kb，個別情況下離開所調控的基因30kb仍能發揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。

②增強子作用與其序列的正反方向無關，將增強子方向倒置依然能起作用。而將啟動子倒置就不能起作用，可見增強子與啟動子是很不相同的。③增強子要有啟動子才能發揮作用，沒有啟動子存在，增強子不能表現其活性。但增強子對啟動子沒有嚴格的專一性，同一增強子可以影響不同類型啟動子的轉錄。

④增強子必須與特定的蛋白質因子結合后才能發揮增強轉錄的作用。增強子一般具有組織或細胞特異性，許多增強子只在某些細胞或組織中表現活性，是由這些細胞或組織中具有的特異性蛋白質因子所決定的。

例如，人類胰島素基因5’端上游約250個核苷酸處有一組織特異性增強子。在胰島素p細胞中有一種特異性蛋白因子，可以作用于這個區域，以增強胰島素基因的轉錄。在其他組織細胞中沒有這種蛋白因子，所以也就沒有此作用。

⑤大多為重復序列，一般長約50bp，適合與某些蛋白因子結合。其內部常含有一個核心序列，即(G)TGGA／TA／TA／T(G)，是產生增強效應時所必需的。

⑥許多增強子還受外部信號的調控，如金屬硫蛋白的基因啟動區上游所帶的增強子，就可以對環境中的鋅、鎘濃度做出反應。

增強子的作用機理

①增強子中有Z-DNA結構，這種結構的雙鏈間距離大于B-DNA，與蛋白質的親和力更高一些，有利于轉錄。

②增強子中有DNA水解酶容易切斷的部位，可與一些轉錄因子蛋白形成復合物，促進轉錄。

③增強子可與核基質結合形成結構體，促進轉錄。

3．沉默子（Silencer）

Silencers are control regions of DNA that, like enhancers, may be located thousands of base pairs away from the gene they control.However, when transcription factors bind to them, expression of the gene they control is repressed.沉默子的特點

(1)可以在遠距離作用于啟動子

(2)對基因的阻遏作用沒有方向的限制，即無論其位于啟動子的上游或下游均可阻遏啟動子的表達

某些沉默子中含有骨架結合位點保守序列

沉默子與蛋白結合,通過蛋白之間的相互作用形成DNA環后與啟動子作用，破壞起始復合物而抑制轉錄;

或者產生的DNA環發生了組蛋白的修飾和拓撲結構的變化,這種變化使關鍵的轉錄因子不能正確結合從而阻止轉錄

也可能沉默子和核基質相互作用將轉錄單元固定于缺乏轉錄因子的亞顯微結構

4.絕緣子(insulator)

絕緣子(insulator)長約幾百個核苷酸對，是通常位于啟動子同正調控元件(增強子)或負調控因子(為異染色質)之間的一種調控序列。

絕緣子本身對基因的表達既沒有正效應，也沒有負效應，其作用只是不讓其他調控元件對基因的活化效應或失活效應發生作用。絕緣子的功能

①有序地裝置龐大的染色體DNA以及確保其中上萬種基因每一種都能在時空上正確無誤地表達。

絕緣子在這里起著關鍵的阻斷作用,保護啟動子的功能不受其它異常增強子或其它激發信號的有害影響

②防止基因免受鄰近沉默信號的作用。這類沉默信號系來自細胞核的內環境中遍布的大量致密染色質的“擴張”或“溢出”。

絕緣子的這種功能可以維持染色質區域的分界以及保護基因座位的獨立性。

絕緣子的作用原理

①結構域邊界模型(Domain boundary model,)

絕緣子能使它所限定的染色質區域發生折疊成環,促使該區域內各種調節元件彼此相互作用,同時也阻止了不同區域調節元件之間互相影響。染色質形成環狀結構域能對抗附近致密染色質結構的擴展。這樣一來,絕緣子能防止位置效應也能得到合理的解釋。②“跟蹤”模型(“Tracking” model):

結合在增強子元件上的轉錄因子沿DNA鏈向它的目標啟動子追逐。此時絕緣子的特異結合蛋白在中途阻擋轉錄因子,使其不能抵達啟動子區域。③轉錄誘捕模型(Transcription decoy model)

在絕緣子與其特異結合蛋白結合所形成的復合物可成為捕捉增強子的籠子,將增強子復合物吸引到其中而使之失去功能。

四、基因家族（gene family）

（一）基因家族的概念

1、基因家族：核苷酸序列或編碼產物的結構具有一定程度同源性的一組基因。由同一祖先基因進化而來。

2、假基因（pseudogene）

在多基因家族中，某些成員并不能表達出有功能的產物，這些基因稱為假基因。

假基因與有功能的基因同源，原來可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或點突變等，使這一基因失去活性，成為無功能基因。

與相應的正常基因相比，假基因往往缺少正常基因的內含子，兩側有順向重復序列。

人們推測，假基因的來源之一，可能是基因經過轉錄后生成的RNA前體通過剪接失去內含子形成mRNA，如果mRNA經反轉錄產cDNA，再整合到染色體DNA中去，便有可能成為假基因，因此該假基因是沒有內含子的，在這個過程中，可能同時會發生缺失，倒位或點突變等變化，從而使假基因不能表達。

（二）、基因家族大致可分為兩類

1、一類是基因家族成簇地分布在某一條染色體上，它們可同時發揮作

用，合成某些蛋白質，如組蛋白基因家族就成簇地集中在第7號染色體長臂3區2帶到3區6帶區域內；

2、另一類是一個基因家族的不同成員成簇地分布 在不同的染色體上，這些不同成員編碼一組功能上緊密相關的蛋白質，如珠蛋白基因家族

五、重復序列：高度重復序列 中度重復順序 單拷貝順序

（一）高度重復序列

高度重復序列在基因組中重復頻率高，可達百萬(106)以上，因此復性速度很快。

在基因組中所占比例隨種屬而異，約占10-60％，在人基因組中約占20％。

高度重復順序又按其結構特點分為三種。

1、倒位（反向）重復序列（inverted repeats）

反向重復序列由兩個相同順序的互補拷貝在同一DNA鏈上反向排列而成。約占人基因組的5％。

2、衛星DNA

衛星DNA(satelliteDNA)是另一類高度重復序列，這類重復順序的重復單位一般由2-10bp組成，成串排列。由于這類序列的堿基組成不同于其他部份，可用等密度梯度離心法將其與主體DNA分開，因而稱為衛星DNA或隨體DNA。在人細胞組中衛星DNA約占5-6％。§大衛星DNA（macrosatellite DNA）§小衛星DNA（minisatellite DNA）

§微衛星DNA（microsatellite DNA）

3、較復雜的重復單位組成的重復順序

這種重復順序為靈長類所獨有。用限制性內切酶HindⅢ消化非洲綠猴DNA，可以得到重復單位為172bp的高度重復順序，這種順序大部份由交替變化的嘌呤和嘧啶組成。有人把這類稱為α衛星DNA。而人的α衛星DNA更為復雜，含有多順序家族。

4、高度重復順序的功能

⑴參與復制水平的調節反向序列常存在于DNA復制起點區的附近。另外，許多反向重復序列是一些蛋白質（包括酶）和DNA的結合位點。

⑵參與基因表達調控DNA的重復順序可以轉錄到核內不均一RNA分子中，而有些反向重復順序可以形成發夾結構，這對穩定RNA分子，免遭分解有重要作用

⑶參與轉位作用幾乎所有轉位因子的末端都包括反向重復順序，長度由幾個bp到1400bp。由于這種順序可以形成回文結構，因此在轉位作用中即能連接非同源的基因，又可以被參與轉位的特異酶所識別。

⑷與進化有關 不同種屬的高度重復順序的核苷酸序列不同，具有種屬特異性，但相近種屬又有相似性。如人的α衛星DNA長度僅差1個堿基（前者為171bp，后者為172bp），而且堿基序列有65％是相同的，這表明它們來自共同的祖先。在進化中某些特殊區段保守的，而其他區域的堿基序列則累積著變化。

⑸同一種屬中不同個體的高度重復順序的重復次數不一樣，這可以作為每一個體的特征，即DNA指紋。

（二）中度重復順序

中度重復序列大致指在真核基因組中重復數十至數萬（<105）次的重復順序。其復性速度快于單拷貝順序，但慢于高度重復順序。少數在基因組中成串排列在一個區域，大多數與單拷貝基因間隔排列。依據重復順序的長度，中度重復順序可分為兩種類型。（1）短分散片段

（short interspersed repeated segments, SINES）這類重復順序的平均長度約為300bp（〈500bp），它們與平均長度約為1000bp的單拷貝順序間隔排列。拷貝數可達10萬左右。如Alu家族，Hinf

家族等屬于這種類型的中度重復序列（2）長分散片段

（Long interspersed repeated segments, LINES）

這類重復順序的長度大于1000bp，平均長度為3500-5000bp，它們與平均長度為13000bp（個別長幾萬bp）的單拷貝順序間隔排列。

也有的實驗顯示人基因組中所有LINES之間的平均距離為2.2kb,拷貝數一般在1萬左右，如KpnⅠ家族等。

中度重復順序在基因組中所占比例在不同種屬之間差異很大，一般約占10-40％，在人約為12％。這些順序大多不編碼蛋白質。這些非編碼的中度重復順序的功能可能類似于高度重復順序。

在結構基因之間，基因簇中，以及內含子內都可以見到這些短的和長的中度重復順序。如HLA基因，rRNA基因，tRNA基因,組蛋白基因,免疫球蛋白基因等。

中度重復順序一般具有種屬特異性；在適當的情況下，可以應用它們作為探針區分不同種哺乳動物細胞的DNA。下面介紹幾種典型的中度重復順序。

Alu家族是哺乳動物包括人基因組中含量最豐富的一種中度重復順序家族，在單倍體人基因組中重復達30萬-50萬次，約占人基因組的3-6％。Alu家族每個成員的長度約300bp，由于每個單位長度中有一個限制性內切酶Alu的切點（AG↓CT）從而將其切成長130和170bp的兩段，因而定名為Alu序列（或Alu家族）。

Alu序列分散在整個人體或其他哺乳動物基因組中，在間隔DNA，內含子中都發現有Alu序列，平均每5kbDNA就有一個Alu順序。

KpnⅠ家族是中度重復順序中僅次于Alu家族的第二大家族。用限制性內切酶KpnⅠ消化人類及其它靈長類動物的DNA，在電泳譜上可以看到4個不同長度的片段，分別為1.2,1.5,1.8和1.9kb，這就是所謂的KpnⅠ家族。

KpnⅠ家族成員順序比Alu家族更長（如人KpnⅠ順序長6.4kb），而且更加不均一，呈散在分布，屬于中度重復順序的長分散片段型。

盡管不同長度類型的KpnⅠ家族（稱為亞類，subfamily）之間同源性比較小，不能互相雜交，但它們的3'端有廣泛的同源性。KpnⅠ家族的拷貝數約為3000￣4800個，占人體基因組的1％,與散在分布的Alu家族相似，KpnⅠ家族中至少有一部份也是通過KpnⅠ順序的RNA轉錄產物的cDNA拷貝的重新插入到人基因組DNA中而產生的。

Hinf家族：

這一家族以319bp長度的串聯重復存在于人體基因組中。用限制性內切酶HinfⅠ消化人體DNA，可以分離到這一片段。Hinf家族在單位基因組內約有50 100個拷貝，分散在不同的區域。319bp單位可以再分成兩個亞單位，分別為172bp和147bp,它們之間有70%的同源性。

rRNA基因：在原核生物如大腸桿菌基因組中，rRNA基因一共是七套；在真核生物中rRNA基因的重復次數更多。在真核生物基因組中18S和28S,rRNA基因是在同一轉錄單位中，低等的真核生物如酵母中，5SrRNA也和18S,28SrRNA在同一轉錄單位中；

而在高等生物中，5SrRNA是單獨轉錄的，而且其在基因組中的重復次數高于18S和28S基因。和一般的中度重復順序不一樣，各重復單位中的rRNA基因都是相同的。

rRNA基因通常集中成簇存在，而不是分散于基因組中，這樣的區域稱為rDNA，如染色體的核仁組織區（nucleolus organizer region）即為rDNA區。

（三）單拷貝順序

單拷貝順序在單倍體基因組中只出現一次或數次，因而復性速度很慢。單拷貝順序在基因組中占50-80％，如人基因組中，大約有60-65％的順序屬于這一類。單拷貝順序中儲存了巨大的遺傳信息，編碼各種不同功能的蛋白質。

六、真核生物基因組的特點

1.真核生物基因組DNA與蛋白質結合形成染色體，儲存于細胞核內，除配子細胞外，體細胞內的基因的基因組是雙份的（即雙倍體,diploid），即有兩份同源的基因組。

2.真核細胞基因轉錄產物為單順反子。一個結構基因經過轉錄和翻譯生成一個mRNA分子和一條多肽鏈。

3.存在重復序列，重復次數可達百萬次以上。4.基因組中不編碼的區域多于編碼區域。

5.大部分基因含有內含子，因此，基因是不連續的。

6.基因組遠遠大于原核生物的基因組，具有許多復制起點，而每個復制子的長度較小

重疊基因有以下幾種情況

（1）一個基因完全在另一個基因里面。如基因Ａ和Ｂ是兩個不同基因，而Ｂ包含在基因Ａ內。同樣，基因Ｅ在基因Ｄ內。（2）部分重疊。（3）兩個基因只有一個堿基重疊。

八、原核生物基因組的結構和功能

（1）基因組通常僅由一條環狀雙鏈DNA 分子組成。

（2）具有操縱子結構，即數個功能相關的結構基因串聯在一起，受同一個調節區的調節。數個操縱子還可以由一個共同的調節基因（regulatorygene）即調節子（regulon）所調控。

（3）在大多數情況下，結構基因在細菌基因組中都是單拷貝，但是編碼rRNA的基因rDNA往往是多拷貝的,這樣可能有利于核糖體的快速組裝，便于在急需蛋白質合成時細胞可以在短時間內有大量核糖體生成。

（4）和病毒的基因組相似，不編碼的DNA部份所占比例比真核細胞基因組少得多。

（5）具有編碼同工酶的同基因（isogene）例如，在大腸桿菌基因組中有兩個編碼分支酸（chorismicacid）變位酶的基因，兩個編碼乙酰乳酸（acetolactate）合成酶的基因。

（6）和病毒基因組不同的是，在細菌基因組中編碼順序一般不會重疊，即不會出現基因重疊現象。

（7）在DNA分子中具有各種功能的識別區域如復制起始區OriC，復制終止區TerC,轉錄啟動區和終止區等。這些區域往往具有特殊的順序，并且含有反向重復順序。

（8）在基因或操縱子的終末往往具有特殊的終止順序,它可使轉錄終止和RNA聚合酶從DNA鏈上脫落。

例如大腸桿菌色氨酸操縱子后尾含有40bp的GC豐富區，其后緊跟AT豐富區，這就是轉錄終止子的結構。

終止子有強、弱之分，強終止子含有反向重復順序，可形成莖環結構，其后面為polyT結構，這樣的終止子無需終止蛋白參與即可以使轉錄終止。而弱終止子盡管也有反向重復序列，但無polyT結構，需要有終止蛋白參與才能使轉錄終止。

Lecture 3 DNA replication 第一節 DNA的復制

一、DNA復制的基本特點

（一）復制的起始點和方向

★復制起始點：復制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復制起始點(origin of replication)常用ori或o表示

★復制子： replicon DNA復制從起始點開始直到終點為止，每個這樣的DNA單位稱為復制子或復制單元

★復制叉：在復制開始時，復制起始點出呈現一叉形結構，稱為復制叉（replication fork）

1、復制起始點：

DNA復制起始點有結構上的特殊性。這些特殊的結構對于在DNA復制起始過程中參與的酶和許多蛋白質分子的識別和結合都是必須的。§大腸桿菌染色體DNA復制起始點Oric由422個核苷酸組成，是一系列對稱排列的反向重復序列，即回文結構(palindrome)，其中有9個核苷酸或13個核苷酸組成的保守序列，這些部位是大腸桿菌中DnaA蛋白識別的位置

2、DNA復制的方向

(1)定點開始雙向復制：這是原核生物和真核生物DNA復制最主要的形式，從一個特定位點解鏈，沿著兩個相反的方向各生長出兩條鏈，形成一個復制泡。

(2)定點開始單向復制：質粒colE1是個典型的例子，復制從一個起始點開始，以同一方向生長出兩條鏈，形成一個復制

(3)兩點開始單向復制：腺病毒DNA的復制是從兩個起點開始的，形成兩個復制叉，各以一個單一方向復制出一條新鏈。

二、復制的基本方式

(一)DNA的半保留復制(semiconservative replication)

（二）半不連續復制 前導鏈(leading strand)：在以3′→5′方向的母鏈為模板時，復制合成出一條5′→3′方向的前導鏈，前導鏈的前進方向與復制叉打開方向是一致的，因此前導鏈的合成是連續進行的 隨從鏈(lagging strand)：另一條母鏈DNA是5′→3′方向，它作為模板時，復制合成許多條5′→3′方向的短鏈，叫做隨從鏈，隨從鏈的前進方向是與復制叉的打開方向相反的。

隨從鏈只能先以片段的形式合成，這些片段就叫做崗崎片段(Okazaki fragments)，原核生物崗崎片段含有1000-2000核苷酸，真核生物一般10000核苷酸。最后再將多個崗崎片段連接成一條完整的鏈。

由于前導鏈的合成是連續進行的，而隨從鏈的合成是不連續進行的，所以從總體上看DNA的復制是半不連續復制

三、復制過程

（一）DNA復制的起始階段

1、DNA復制起始引發體的形成及所參與的酶和蛋白質

⑴解鏈酶(helicase)：解鏈酶的作用就是打開DNA雙鏈之間的氫鍵。

大腸桿菌中DnaB蛋白就有解鏈酶活性，與隨從鏈的模板DNA結合，沿5′→3′方向移動，還有一種叫做Rep蛋白和前導鏈的模板DNA結合沿3′→5′方向移動。

⑵.單鏈結合蛋白：(single strand binding proteins, SSBP)

它與解開的單鏈DNA結合，使其穩定不會再度螺旋化并且避免核酸內切酶對單鏈DNA的水解，保證了單鏈DNA做為模板時的伸展狀態，SSBP可以重復利用。

⑶ 引發體的形成

DNA復制起始的關健步驟是前導鏈DNA的合成，一旦前導鏈DNA的聚合作用開始，隨從鏈DNA的合成也隨著開始。由于前導鏈的合成是連續進行的，所以它的起始相對簡單，而隨從鏈的合成是不連續進行的，所以引發階段比較復雜。大腸桿菌的引發前體由Dna B.Dna C和單鏈結合蛋白組成。★引物酶(primase)它是一種特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。這種短RNA片段一般十幾個至數十個核苷酸不等，它們在DNA復制起始處做為引物。RNA引物的3′OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一個磷酸二酯鍵的位置

★引發體(primosome)高度解鏈的模板DNA與多種蛋白質因子形成的引發前體促進引物酶結合上來，共同形成引發體，引發體主要在DNA隨從鏈上開始，它連續地與引物酶結合并解離，從而在不同部位引導引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3′OH末端接下去合成DNA片段，這就是隨從鏈不連續合成的開始。

（二）DNA復制的延長階段以及參與的酶和蛋白質分子

1、DNA的聚合反應和DNA聚合酶

★DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerse Ⅰ）：

DNA polⅠ是由一條多肽鏈組成，分子量為109KD。酶分子中含有一個Zn++，是聚合活性必須的。

(1)DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′聚合活性 這是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸順序，將互補的dNTP逐個加到引物RNA3′-OH末端，并促進3′-OH與dNTP的5′-OH形成磷酸二酯鍵，酶的專一性表現為新進入的dNTP必須與模板DNA堿基配對時才有催化作用。

(2)DNA聚合酶Ⅰ的3′→5′外切核酸酶活性

這種酶活性的主要功能是從3′→5′方向識別并切除DNA生長鏈末端與模板DNA不配對而游離的核苷酸，這種功能稱為校對功能，這是保證其聚合作用的正確性不可缺少的，因此對于DNA復制中極高的保真性是至關重要的。

(3)DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′外切核酸酶活性

這種酶活性是從DNA鏈的5′端向3′末端水解已配對的核苷酸，本質是切斷磷酸二酯鍵，每次能切除10個核苷酸。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復中可能起重要作用，對完成的DNA片段去除5′端的RNA引物也是必須的。

DNA polⅠ并不是DNA復制過程中的主要酶，它的作用主要與DNA損傷后的修復有關。

DNA聚合酶Ⅱ(DNA polⅡ）

分子量為120KD，每個細胞約有100個酶分子，但活性只有DNA polⅠ的5%，它具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，而沒有5′→3′外切活性，它的作用可能與DNA損傷修復有關。DNA聚合酶Ⅲ(DNA polⅢ）

這是在DNA復制過程中起主要作用的聚合酶，它是由一個多亞基組成的蛋白質分子，其分子量＞600kDa整個酶分子形成一個不對稱的二聚體 DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是單獨起作用的，而是與引發體，解鏈酶等構成一個復制體。由于復制體的存在，先導鏈和隨從鏈可以同時復制。DNA polⅢ是由多亞基組成的不對稱二聚體，它可能同時負責先導鏈和隨從鏈的復制

2、與超螺旋松馳有關的酶

拓撲異構酶(topoisomerase)是一類改變DNA拓撲性質的酶。

在體外可催化DNA的各種拓撲異構化反應，而在生物體內它們可能參與了DNA的復制與轉錄。

在DNA復制時，復制叉行進的前方DNA分子部分產生有正超螺旋，拓撲酶可松馳超螺旋，有利于復制叉的前進及DNA的合成。

DNA復制完成后，拓撲酶又可將DNA分子引入超螺旋，使DNA纏繞、折疊，壓縮以形成染色質。

DNA拓撲異構酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它們廣泛存在于原核生物及真核生物中。

拓撲異構酶Ⅰ(TopoⅠ)的主要作用

將環狀雙鏈DNA的一條鏈切開一個口，切口處鏈的末端繞螺旋軸按照松馳超螺旋的方向轉動，然后再將切口封起來。這就使DNA復制叉移動時所引起的前方DNA正超螺旋得到緩解，利于DNA復制叉繼續向前打開。

對環狀單鏈DNA還有打結或解結作用，對環狀雙鏈DNA的環連或解連以及使環狀單鏈DNA形成環狀雙鏈DNA都有作用

拓撲異構酶Ⅱ(TopoⅡ)的主要作用

是在大腸桿菌中發現的，曾被稱為旋轉酶(gyrase)，它們作用特點是切開環狀雙鏈DNA的兩條鏈，分子中的部分經切口穿過而旋轉，然后封閉切口。還可使DNA分子從超螺旋狀態轉變為松馳狀態，此反應不需要ATP參與。DNA復制完成后，TopoⅡ在ATP參與下，DNA分子從松馳狀態轉變為負超螺旋。

催化的拓撲異構化反應還有環連或解環連，以及打結或解結。

DNA連接酶(DNA ligase)作用：消耗ATP，將隨從鏈中相鄰的兩個DNA片段連接起來

催化同一模板DNA鏈上的兩個相鄰DNA片段的3＇端與5＇端間形成磷酸二酯鍵，把相鄰的兩段DNA連成完整的鏈

（三）DNA復制的終止階段

DNA在復制過程中，合成出的前導鏈為一條連續的長鏈。隨從鏈則是由合成出許多相鄰的片段，在連接酶的催化下，連接成為一條長鏈。連接作用是在連接酶催化下進行的。

DNA復制的過程 延長:

DNA-pol Ⅲ(DDDP-Ⅲ)的5? → 3?的聚合活性使核苷酸之間生成3?，5?磷酸二酯鍵

模板 以DNA單鏈為模板

底物 dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）

引物 以小片段RNA為引物，在 RNA引物的 3?-OH末端上開始逐個添加dNTP

按堿基配對原則（A = T G ≡ C）按5? → 3? 方向

第二節 真核生物DNA復制的特點 1.復制起始點及方向

與原核生物不同，真核生物DNA復制有許多起始點，例如酵母S.cerevisiae的17號染色體約有400個起始點，因此，雖然真核生物DNA復制的速度(60核苷酸/每秒鐘)比原核生物DNA復制的速度(E.coli 1700核苷酸/每秒鐘)慢得多，但復制完全部基因組DNA也只要幾分鐘的時間。2.在真核生物DNA復制叉處，需要兩種不同的酶。DNA聚合酶α(polα)和DNA聚合酶δ(polδ)

polα和引物酶緊密結合，在DNA模板上先合成RNA引物，再由polα延長DNA鏈，這種活性還要復制因子C參與。

同時結合在引物模板上的PCNA，此時釋放了polα，然后由polδ結合到生長鏈3′末端，并與PCNA結合，繼續合成前導鏈。

而隨從鏈的合成靠polα緊密與引物酶結合并在復制因子C幫助下，合成崗崎片段

3、末端復制與端粒酶 端區(telomeres)由于真核生物染色體是線性DNA，它的兩端叫做端區(telomeres)，端區是由重復的寡核苷酸序列構成的。

由于隨從鏈是以一種不連續的形式合成崗崎片段，所以不能完成線性染色體末端的復制，如果這個問題不解決，真核生物在細胞分裂時DNA復制將產生5′末端隱縮，使DNA縮短。端粒酶(telomerase)由蛋白質和RNA兩部分組成的，它以自身的RNA為模板，在隨從鏈模板DNA的3′OH末端延長DNA，再以這種延長的DNA為模板，繼續合成隨從鏈。第三節 DNA損傷與修復

一、DNA的損傷

(一)DNA損傷的原因 1.DNA分子的自發性損傷

2.物理因素引起的DNA損傷

3.化學因素引起的DNA損傷 1.DNA分子的自發性損傷(1)DNA復制中的錯誤

堿基配對的錯誤頻率約為10-1－10-2 在DNA復制酶的作用下堿基錯誤配對頻率降到約10-5－10-6 DNA聚合酶還會暫停催化作用，以其3′－5′外切核酸酶的活性切除錯誤接上的核苷酸，然后再繼續正確的復制但校正后的錯配率仍約在10-10左右.(2)DNA的自發性化學變化

a.堿基的異構互變

DNA中的4種堿基各自的異構體間都可以自發地相互變化(例如烯醇式與酮式堿基間的互變)，這種變化就會使堿基配對間的氫鍵改變，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鳥嘌呤等，如果這些配對發生在DNA復制時，就會造成子代DNA序列與親代DNA不同的錯誤性損傷 b.堿基的脫氨基作用

堿基的環外氨基有時會自發脫落，從而胞嘧啶會變成尿嘧啶、腺嘌呤會變成次黃嘌呤(H)、鳥嘌呤會變成黃嘌呤(X)等，遇到復制時，U與A配對、H和X都與C配對就會導致子代DNA序列的錯誤變化。胞嘧啶自發脫氨基的頻率約為每個細胞每天190個。c.脫嘌呤與脫嘧啶

自發的水解可使嘌呤和嘧啶從DNA鏈的核糖磷酸骨架上脫落下來。一個哺乳類細胞在37℃條件下，20h內DNA鏈上自發脫落的嘌呤約1000個、嘧啶約500個 估計一個長壽命不復制繁殖的哺乳類細胞(如神經細胞)在整個生活期間自發脫嘌呤數約為108，約占細胞DNA中總嘌呤數的3%。d.堿基修飾與鏈斷裂

細胞呼吸的副產物O2、H2O2等會造成DNA損傷，能產生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，還可能引起DNA單鏈斷裂等損傷，每個哺乳類細胞每天DNA單鏈斷裂發生的頻率約為5萬次。此外，體內還可以發生DNA的甲基化，結構的其他變化等，這些損傷的積累可能導致老化。

2.物理因素引起的DNA損傷

(1)紫外線引起的DNA損傷

DNA分子損傷最早就是從研究紫外線的效應開始的。當DNA受到最易被其吸收波長(～260nm)的紫外線照射時，主要是使同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價鍵連成二聚體，相鄰的兩個T、或兩個C、或C與T間都可以環丁基環(cyclobutane ring)連成二聚體，其中最容易形成的是TT二聚體

(2)電離輻射引起的DNA損傷

電離輻射損傷DNA有直接和間接的效應，直接效應是DNA直接吸收射線能量而遭損傷，間接效應是指DNA周圍其他分子(主要是水分子)吸收射線能量產生具有很高反應活性的自由基進而損傷DNA。電離輻射可導致DNA分子的多種變化： a.堿基變化

主要是由OH－自由基引起，包括DNA鏈上的堿基氧化修飾、過氧化物的形成、堿基環的破壞和脫落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。b.脫氧核糖變化

脫氧核糖上的每個碳原子和羥基上的氫都能與OH－反應，導致脫氧核糖分解，最后會引起DNA鏈斷裂。c.DNA鏈斷裂

單鏈斷裂:DNA雙鏈中一條鏈斷裂稱單鏈斷裂(single strand broken)雙鏈斷裂:DNA雙鏈在同一處或相近處斷裂稱為雙鏈斷裂(doublestrand broken)。

雖然單鏈斷裂發生頻率為雙鏈斷裂的10-20倍，但還比較容易修復；對單倍體細胞來說(如細菌)一次雙鏈斷裂就是致死事件。

d.交聯 同一條DNA鏈上或兩條DNA鏈上的堿基間可以共價鍵結合 DNA與蛋白質之間也會以共價鍵相連，組蛋白、染色質中的非組蛋白、調控蛋白、與復制和轉錄有關的酶都會與DNA共價鍵連接。這些交聯是細胞受電離輻射后在顯微鏡下看到的染色體畸變的分子基礎，會影響細胞的功能和DNA復制。

3.化學因素引起的DNA損傷(1)烷化劑對DNA的損傷

烷化劑是一類親電子的化合物，很容易與生物體中大分子的親核位點起反應。烷化劑的作用可使DNA發生各種類型的損傷： a.堿基烷基化

烷化劑很容易將烷基加到DNA鏈中嘌呤或嘧啶的N或O上，其中鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻擊，烷基化的嘌呤堿基配對會發生變化，例如鳥嘌呤N7被烷化后就不再與胞嘧啶配對，而改與胸腺嘧啶配對，結果會使G－C轉變成A－T。b.堿基脫落

烷化鳥嘌呤的糖苷鍵不穩定，容易脫落形成DNA上無堿基的位點，復制時可以插入任何核苷酸，造成序列的改變。c.斷鏈

DNA鏈的磷酸二酯鍵上的氧也容易被烷化，結果形成不穩定的磷酸三酯鍵，易在糖與磷酸間發生水解，使DNA鏈斷裂。d.交聯

烷化劑有兩類

單功能基烷化劑，如甲基甲烷碘酸，只能使一個位點烷基化；

雙功能基烷化劑，化學武器如氮芥、硫芥等，一些抗癌藥物如環磷酰胺、苯丁酸氮芥、絲裂霉素等，某些致癌物如二乙基亞硝胺等均屬此類，其兩個功能基可同時使兩處烷基化，結果就能造成DNA鏈內、DNA鏈間，以及DNA與蛋白質間的交聯。

(2)堿基類似物、修飾劑對DNA的損傷 人工可以合成一些堿基類似物用作促突變劑或抗癌藥物，如5－溴尿嘧啶(5－BU)、5－氟尿嘧啶(5－FU)、2－氨基腺嘌呤(2－AP)等。由于其結構與正常的堿基相似，進入細胞能替代正常的堿基參入到DNA鏈中而干擾DNA復制合成，例如5－BU結構與胸腺嘧啶十分相近，在酮式結構時與A配對，卻又更容易成為烯醇式結構與G配對，在DNA復制時導致A－T轉換為G－C。(二)DNA損傷的后果

1.點突變(point mutation)

指DNA上單一堿基的變異。嘌呤替代嘌呤(A與G之間的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C與T之間的替代)稱為轉換(transition)；嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤則稱為顛換(transvertion)。2.缺失(deletion)

指DNA鏈上一個或一段核苷酸的消失。3.插入(insertion)

指一個或一段核苷酸插入到DNA鏈中。在為蛋白質編碼的序列中如缺失及插入的核苷酸數不是3的整倍數，則發生讀框移動(reading frame shift)，使其后所譯讀的氨基酸序列全部混亂，稱為移碼突變 4.倒位或轉位(transposition)

指DNA鏈重組使其中一段核苷酸鏈方向倒置、或從一處遷移到另一處。 5.雙鏈斷裂

已如前述，對單倍體細胞一個雙鏈斷裂就是致死性事件。突變或誘變對生物可能產生4種后果 ①致死性；

②喪失某些功能；

③改變基因型而不改變表現型

④發生了有利于物種生存的結果，使生物進化。

二、DNA修復(一)回復修復

1.光修復

這是最早發現的DNA修復方式。

修復是由細菌中的DNA光解酶(photolyase)完成，此酶能特異性識別紫外線造成的核酸鏈上相鄰嘧啶共價結合的二聚體，并與其結合，這步反應不需要光；結合后如受300－600nm波長的光照射，則此酶就被激活，將二聚體分解為兩個正常的嘧啶單體，然后酶從DNA鏈上釋放，DNA恢復正常結構。后來發現類似的修復酶廣泛存在于動植物中，人體細胞中也有發現。2.單鏈斷裂的重接

DNA單鏈斷裂是常見的損傷，其中一部分可僅由DNA連接酶(ligase)參與而完全修復。此酶在各類生物各種細胞中都普遍存在，修復反應容易進行。但雙鏈斷裂幾乎不能修復。3.堿基的直接插入

DNA鏈上嘌呤的脫落造成無嘌呤位點，能被DNA嘌呤插入酶(insertase)識別結合，在K＋存在的條件下，催化游離嘌呤或脫氧嘌呤核苷插入生成糖苷鍵，且催化插入的堿基有高度專一性、與另一條鏈上的堿基嚴格配對，㈡ 轉錄模板

對于不同的基因來說，其轉錄信息可以存在于兩條不同的DNA鏈上。能夠轉錄RNA的那條DNA鏈稱為有意義鏈(模板鏈）而與之互補的另一條DNA鏈稱為反意義鏈（編碼鏈）。使DNA完全恢復。4.烷基的轉移

在細胞中發現有一種O6甲基鳥嘌呤甲基轉移酶，能直接將甲基從DNA鏈鳥嘌呤O6位上的甲基移到蛋白質的半胱氨酸殘基上而修復損傷的DNA。這個酶的修復能力并不很強，但在低劑量烷化劑作用下能誘導出此酶的修復活性。

(二)切除修復(excision repair)①首先由核酸酶識別DNA的損傷位點，在損傷部位的5′側切開磷酸二酯鍵。不同的DNA損傷需要不同的特殊核酸內切酶來識別和切割。②由5′→3′核酸外切酶將有損傷的DNA片段切除。

③在DNA聚合酶的催化下，以完整的互補鏈為模板，按5′→3′方向DNA鏈，填補已切除的空隙

④由DNA連接酶將新合成的DNA片段與原來的DNA斷鏈連接起來。這樣完成的修復能使DNA恢復原來的結構。

（三)重組修復(recombinational repair)受損傷的DNA鏈復制時，產生的子代DNA在損傷的對應部位出現缺口。另一條母鏈DNA與有缺口的子鏈DNA進行重組交換，將母鏈DNA上相應的片段填補子鏈缺口處，而母鏈DNA出現缺口 以另一條子鏈DNA為模板，經DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填補母鏈DNA的缺口，最后由DNA連接酶連接，完成修補。

重組修復不能完全去除損傷，損傷的DNA段落仍然保留在親代DNA鏈上，只是重組修復后合成的DNA分子是不帶有損傷的，但經多次復制后，損傷就被“沖淡”了，在子代細胞中只有一個細胞是帶有損傷DNA的。

(四)SOS修復

SOS修復是指DNA受到嚴重損傷、細胞處于危急狀態時所誘導的一種DNA修復方式，修復結果只是能維持基因組的完整性，提高細胞的生成率，但留下的錯誤較多，故又稱為易誤修復(error prone repair)，使細胞有較高的突變率。

Lecture 3 The expression of genetic information 轉錄（transcription): 在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA鏈為模板合成RNA，從而將DNA所攜帶的遺傳信息傳遞給RNA的過程稱為轉錄。

經轉錄生成的RNA有多種，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和HnRNA。

第一節 轉錄

一、轉錄與復制的比較

（一）轉錄與復制的相同點

1、均以DNA為模板

2、合成方向是5--3 `

3、服從堿基配對原則

4、均需要依賴DNA的聚合酶

二、轉錄作用及其特點 ㈠不對稱轉錄

㈡真核細胞中的轉錄產物都是各種RNA的前體，既無活性，亦物功能，必須在細胞核內加工，形成由活性的RNA后，由核運至細胞質中才能執行翻譯功能

三、原核生物RNA的生物合成

㈠ RNA聚合酶（RNA polymerase）

這是一種不同于引物酶的依賴DNA的RNA聚合酶。

該酶在單鏈DNA模板以及四種核糖核苷酸存在的條件下，不需要引物，即可從5'→3'聚合RNA。

原核生物中的RNA聚合酶全酶由五個亞基構成，即α2ββ‘σ。σ亞基與轉錄起始點的識別有關，而在轉錄合成開始后被釋放，余下的部分（α2ββ'）被稱為核心酶，與RNA鏈的聚合有關。

㈢轉錄過程 1.起始階段

⑴σ因子的識別作用

① RNA鏈的起始通常是在RNA聚合酶所結合DNA區域的一端，在解開的雙鏈部分，離-10開始

②處第一個核苷酸通常是pppA或pppG,較少為pppC，但偶而亦可為pppU。大約12或13個堿基處 ③σ因子的解離

RNA鏈的延伸階段開始后，σ因子即從核心酶-DNA-新生RNA復合體上解離下來，并可再用于和新的核心酶結合 延長階段

⑴ RNA聚合酶在延伸新生RNA鏈時繼續使DNA螺旋解鏈，以便暴露出模板鏈，RNA鏈的生長點是大約12bp長的RNA-DNA雜交區 在RNA鏈離開模板時，此雜交區即復原，同時兩條DNA鏈即又重復螺旋化。終止階段

細菌DNA中有轉錄終止信號，稱為終止子(terminator)終止子的作用是在DNA模板的特異位點處終止RNA的合成。

在終止子處，RNA聚合酶停止其聚合作用，將新生RNA鏈釋出，并離開模板DNA。在某些位點處，終止需要一種輔助蛋白質，即ρ因子，但在其他位點處，核心酶本身即可終止轉錄。

不依賴ρ因子的終止子有兩個特征:

DNA順序有雙重對稱(dyad)，位于RNA3‘端之前15-20核苷酸處；

DNA模板鏈中有一串約6個A，轉錄為RNA3'端的U。雙重對稱的意義在于其轉錄本能形成發夾結構。

依賴ρ的終止子沒有不依賴ρ的終止子特有的多聚dA序列，并且也不是都能形成穩定的發夾。

ρ因子的作用機制，但有幾種可能性

ρ因子在RNA的存在下能水解ATP，說明它能與新生RNA鏈結合，并可能應用ATP放出的能量將RNA鏈從酶和模板中釋出。ρ因子可能與RNA聚合酶結合。

編碼ρ因子的基因rho發生突變時產生的某些ρ蛋白質僅能在RNA聚合酶的β亞基也發生相應突變時才能有RNA合成的活性。

已知RNA聚合酶本身能識別DNA模板中依賴ρ的終止順序，而ρ因子是在以后才發揮作用而釋出RNA的。即使是在沒有ρ時，RNA聚合酶也在依賴ρ的終止子處暫停，不過以后仍繼續向前進。

四、真核生物的轉錄作用 ㈠ 真核細胞中的RNA聚合酶

真核生物中的RNA聚合酶可按其對α-鵝膏蕈堿敏感性而分為三種，它們均由10～12個大小不同的亞基所組成，結構非常復雜，其功能也不同

㈡ RNA聚合酶Ⅰ

合成RNA的活性最顯著。它位于核仁中，負責轉錄編碼rRNA的基因(稱rRNA)，而細胞內絕大部分RNA是rRNA。

聚合酶Ⅰ不被雙環八肽──α-鵝膏蕈堿抑制。RNA聚合酶Ⅱ

它位于核漿中，負責核內不勻一RNA(hnRNA)的合成。而hnRNA是mRNA的前體。它是最直接和遺傳調節相關的酶。

RNA聚合酶Ⅱ的活性均可被低濃度的α-鵝膏蕈堿所迅速抑制 ㈢RNA聚合酶Ⅲ

負責合成tRNA和許多小的核內RNAs。對α-鵝膏蕈堿的反應則不盡相同

在動物細胞中聚合酶Ⅲ可被高濃度α-鵝膏蕈堿所抑制 在酵母和昆蟲細胞中則不會被抑制。㈣常用的轉錄抑制劑

★轉錄單位

真核生物的一個轉錄單位就是一個基因，由一個結構基因和相應的順式調控元件組成。

一個轉錄單位只有一個結構基因。㈤轉錄因子

真核生物在轉錄時往往需要多種蛋白質因子的協助。一般可將這些轉錄所需的蛋白質分為三大類(1)RNA聚合酶的亞基，它們是轉錄必須的，但并不對某一啟動子有特異性。(2)某些轉錄因子能與RNA聚合酶結合形成起始復合物，但不組成游離聚合酶的成分。

這些因子可能是所有啟動子起始轉錄所必須的。亦可能僅是轉錄終止所必須的。

在這一類因子中，要嚴格區分開哪些是RNA聚合酶的亞基，哪些僅是輔助因子，是很困難的。

(3)某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異順序結合。

如果這些順序存在于啟動子中，則這些順序因子是一般轉錄機構的一部分。如果這些順序僅存在于某些種類的啟動子中，則識別這些順序的因子也只是在這些特異啟動子上起始轉錄必須的。

起始階段

RNA聚合酶Ⅱ的轉錄起始

RNA聚合酶Ⅱ的轉錄產物是hnRNA 真核生物的轉錄起始較為復雜。目前已知RNA聚合酶Ⅱ至少有六種不同的蛋白因子參與轉錄復合體的形成。這些蛋白因子被稱為轉錄因子（transcriptional factor, TF)。包括 TFⅡA，TFⅡB，TFⅡD，TFⅡE，TFⅡF，TFⅡ-I。終止階段

RNA轉錄合成的終止機制有兩種：

1．自動終止：模板DNA鏈在接近轉錄終止點處存在相連的富含GC和AT的區域，使RNA轉錄產物形成寡聚U及發夾形的二級結構，引起RNA聚合酶變構及移動停止，導致RNA轉錄的終止。2．依賴輔助因子的終止：由終止因子(ρ因子)識別特異的終止信號，并促使RNA的釋放。

真核生物RNA轉錄后的加工修飾

一、mRNA的轉錄后加工 1．加帽(adding cap)：

即在mRNA的5'-端加上m7GTP的結構。此過程發生在細胞核內，即HnRNA即可進行加帽。加工過程首先是在磷酸酶的作用下，將5'-端的磷酸基水解，然后再加上鳥苷三磷酸，形成GpppN的結構，再對G進行甲基化。

2．加尾(adding tail)：

這一過程也是細胞核內完成，首先由核酸外切酶切去3'-端一些過剩的核苷酸，然后再加入polyA。polyA結構與mRNA的半壽期有關。3．剪接（splicing)：

真核生物中的結構基因基本上都是斷裂基因。結構基因中能夠指導多肽鏈合成的編碼順序被稱為外顯子，而不能指導多肽鏈合成的非編碼順序就被稱為內含子。

第二節 翻譯

翻譯（translation）

蛋白質的生物合成過程，就是將DNA傳遞給mRNA的遺傳信息，再具體的解譯為蛋白質中氨基酸排列順序的過程，這一過程被稱為翻譯 蛋白質合成體系

① mRNA：作為蛋白質生物合成的模板，決定多肽鏈中氨基酸的排列順序； ② tRNA：搬運氨基酸的工具；

③ 核蛋白體：蛋白體生物合成的場所； ④ 酶及其他蛋白質因子； ⑤ 供能物質及無機離子。

一、mRNA

作為指導蛋白質生物合成的模板。mRNA中每三個相鄰的核苷酸組成三聯體，代表一個氨基酸的信息，此三聯體就稱為密碼(coden)。共有64種不同的密碼。

遺傳密碼具有以下特點：

① 連續性； ② 簡并性； ③ 通用性；（但在線粒體或葉綠體中特殊）④ 方向性，即解讀方向為5′→ 3′； ⑤ 擺動性；

⑥ 起始密碼：AUG；終止密碼：UAA、UAG、UGA。

二、tRNA

在氨基酸tRNA合成酶催化下，特定的tRNA可與相應的 氨基酸結合，生成氨基酸tRNA，從而攜帶氨基酸參與蛋白質的生物合成。tRNA反密碼環中部的三個核苷酸構成三聯體，可以識別mRNA上相應的密碼，此三聯體就稱為反密碼(anticoden)。

反密碼對密碼的識別，通常也是根據堿基互補原則，即A—U，G—C配對。但反密碼的第一個核苷酸與第三核苷酸之間的配對，并不嚴格遵循堿基互補原則。如反密碼第一個核苷酸為Ⅰ，則可與A、U或C配對，如為U，則可與A或G配對，這種配對稱為不穩定配對。

三、rRNA和核蛋白體

原核生物中的核蛋白體大小為70S，可分為30S小亞基和50S大亞基。小亞基：由16SrRNA和21種蛋白質構成。大亞基：由5SrRNA，23SRNA和35種蛋白質構成。

真核生物中的核蛋白體大小為80S，也分為40S小亞基和60S大亞基。小亞基：由18SrRNA和30多種蛋白質構成。大亞基：則由5S rRNA，28S rRNA和50多種蛋白質構成

蛋白質生物合成過程包括三大步驟： ①氨基酸的活化與搬運；

②活化氨基酸在核蛋白體上的縮合； ③多肽鏈合成后的加工修飾。

一、氨基酸的活化與搬運

氨基酸的活化以及活化氨基酸與tRNA的結合，均由氨基酰tRNA合成酶催化完成。其反應過程為：

（一）起動階段

1．40S起動復合物的形成：

在起動因子的促進下，40S小亞基與mRNA的起動部位，起動tRNA

（fmet-tRNAfmet），和GTP結合，形成復合體。

原核mRNA的起動部位由一段富含嘌呤的特殊核苷酸順序組成，稱為SD序列（核蛋白體結合位點，RBS），可被核蛋白體小亞基辨認結合。真核生物中的mRNA具有帽子結構，已知需一種特殊的帽子結合蛋白（CBP）以識別此結構。

2．80S起動前復合體的形成：IF3從40S起動復合體上脫落，60S大亞基與復合體結合，形成80S起動前復合

（二）肽鏈延長階段

1．進位：與mRNA下一個密碼相對應的氨基酰tRNA進入核蛋白體的受位。此步驟需GTP，Mg2+，和EF參與。2．成肽：

在轉肽酶的催化下，將給位上的tRNA所攜帶的甲酰蛋氨酰基或肽酰基轉移到受位上的氨基酰tRNA上，與其α-氨基縮合形成肽鍵。此步驟需Mg2+，1973年S.Cohen 也成功的進行了另一個體外重組實驗，他將編碼有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌R6-5質粒DNA與編碼有四環素抗性基因的另一種大腸桿菌質粒pSC101 DNA混合后加入內切酶EcoRI對DNA進行切割，再用T4連接酶將它們連接成重組分子，用這種連接后的重組DNA轉化大腸桿菌，結果發現，某些轉化菌落表現出了既抗卡那霉素又抗四環素的雙重抗性特征。

以上兩個實驗帶給人們的啟示：

DNA是可以在體外進行切割和拼接的

利用細菌細胞可以快速的復制DNA并能夠合成蛋白質。這兩個實驗也標致著基因工程技術的誕生 K+。給位上已失去蛋氨酰基或肽酰基的tRNA 3．移位：

核蛋白體向mRNA的3'-端滑動相當于一個密碼的距離，同時使肽酰基tRNA從受體移到給位。此步驟需EF（EFG）、GTP和Mg2+參與。此時，核蛋白體的受位留空，與下一個密碼相對應的氨基酰tRNA即可再進入，重復以上循環過程，使多肽鏈不斷延長。

（三）肽鏈終止階段

核蛋白體沿mRNA鏈滑動，不斷使多肽鏈延長，直到終止信號進入受位。1．識別：RF識別終止密碼，進入核蛋白體的受位。

2．水解：RF使轉肽酶變為水解酶，多肽鏈與tRNA之間的酯鍵被水解，多肽鏈釋放。

3．解離：通過水解GTP，使核蛋白體與mRNA分離，tRNA、RF脫落，核蛋白體解離為大、小亞基。

分子生物學研究的對象 蛋白質和核酸

對核酸、蛋白質的研究積累為分子生物學技術的成熟打下了重要性的基礎。

70年代初是分子生物學成熟標致的重要時期，因為誕生了分子生物學應用的一個重要學科——基因工程。

80年代誕生的PCR技術將復雜的分子生物學技術簡單化了，便得更加容易推廣和應用。使得分子生物學技術一下普及到了一般的實驗室。PCR技術，又稱為聚合酶鏈式反應，它利用一對特異性的引物和耐高溫的DNA聚合酶，在短短的2-3小時內將一段DNA擴增到1000萬倍，對實驗室的條件的要求也降到最低點。

1990年開始的“人類基因組計劃”將分子生物學帶入到一個高通量的發展時代。生命科學進入到了基因組和后基因組時代。

基因工程genetic engineering

1.基因工程誕生的理論基礎

基因工程的誕生依賴于在此之前生命科學基礎理論的發展成就，概括起來主要包括三個方面：

⑴ 40年代確定了遺傳物質是DNA，它是遺傳信息的載體。

⑵ 50年代發現DNA分子的雙螺旋結構并揭示了半保留復制的機理，揭示了基因的自我復制和表達的機理。

⑶ 50年代末至60年代初，相繼提出了“中心法則”和操縱子學說，并成功破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達問題。2．工具酶的發現為基因工程的誕生奠定了技術的基礎： 3．基因工程的誕生

1972年H.Boyer 和 P.Berg 第一次完成了DNA的體外重組實驗，用E.coRI在體外對SV40的DNA和λ噬菌體的DNA進行了消化，然后用T4連接酶將消化后的DNA片段進行了連接，結果獲得了重組的雜種DNA分子。

基因工程所使用的名稱：

重組DNA技術(recombinant DNA technique)遺傳工程(genetic engineering)基因工程(gene engineering)基因操作(gene manipulation)基因克隆(gene cloning)

分子克隆(molecular cloning)基因工程的基本內容：

1．將兩種不同來源的DNA－－即目的DNA和載體DNA提取純化。2．用限制性內切酶處理DNA。

3．用連接酶將切開的不同源的DNA連接到一起，構成重組DNA。4．將重組DNA轉化到大腸桿菌中。

5．通過大量的培養細菌，以達到擴增目的基因或表達蛋白的目的。

基因工程的目的： 進行分子克隆

表達重組基因所編碼的蛋白質

工具酶

一、限制酶(restriction enzyme)

?

全稱限制性核酸內切酶、簡稱限制酶或內切酶。

1． 限制酶的分類

限制酶有三種：I型、II型、III型。2.限制酶的命名

一般的限制酶通常由四個拉丁文字母組成第1個字母代表產生該酶的細菌的屬名，第2、3個字母代表產生該酶的細菌種名

第4個字母代表產生該酶的菌株號。

3.限制酶的識別和切割位點

根據Ⅱ型酶種類割雙鏈DNA產生3種不同的切口： ⑴產生平末端

⑵產生5’端突出的粘性末端 ⑶產生3’端突出的粘性末端 6.限制酶使用的條件 ⑴ 緩沖系統：

50mmol/L tris.Cl 10mmol/L Mg++ 1mmol/L DTT NaCl ⑵ 反應體積

⑶ 反應溫度和時間 ⑷ 限制酶的商業化 7.限制酶的商業化

試劑公司的名稱： Promaga公司 安瑪西亞公司

大連保生物公司 北京賽百勝公司 北京華美公司

購買酶時的注意事項：價格因素 供貨時間 運輸方式

酶的保存

修飾酶

⒈逆轉錄酶種類：

禽類成骨細胞性白血病病毒(AMV)逆轉錄酶

小鼠白血病病毒(MMLV)逆轉錄酶 ⒉ T4DNA連接酶

從噬菌體中提取，用于DNA的連接 ⒊ 堿性磷酸酶

可將DNA或RNA5’的磷酸去除，可用于制止不希望發生的連接反應進行。⒋末端脫氧核苷酰轉移酶

用于將已標記好的單核苷酸加到DAN的3’端上，起到標記的作用；有時也可用于DNA片段的同聚尾的形成。

載體(vector)在基因工程中的作用: 將外源DNA插入其中，并一同轉化或轉染到宿主細胞中，能夠穩定的保存下來，完成外源DNA克隆和表達的功能。載體所必需的條件

1必須有自身的復制子，并能攜帶重組DNA一起復制。2載體分子上必須有限制性內切酶位點即多克隆位點。3載體必須具有可供選擇的標置，便于重組分子的篩選。

4載體分子盡量小，便于能插入較大的外源DNA，最好是高考貝。5表達載體必須具備能在宿主細胞中表達的能力。

一、常用的克隆載體

㈠質粒plasmid 1．質粒的一般特點

? 細菌質粒是一些雙鏈閉環的DNA分子，這些質粒都是獨立于染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。通常，質粒含編碼某些基因的酶，這些酶在一定環境下對宿主細胞有利。由質粒產生的表型對抗生素的抗性、產抗生素、降解復雜有機化合物，以及產生大腸桿菌素，及限制酶、修飾酶等。

? 質粒都帶有獨立的復制子，能獨立的自我復制。但在復制時必須依賴宿細菌的酶。

?

質粒的不親和性(不相容性)

質粒的三種狀態

松馳型和嚴緊型 質粒的轉移性

多數質粒在自然條件下可以通過細菌結合的作用轉移到新的宿細胞中。然而，由于質粒缺少一種轉移所必須的mob基因，因此不能獨立的從一個細菌到另一個細菌的接合轉移。選擇標記

質粒載體的發展經歷了三個階段：

第一階段：將選擇標記引入含有復制子的質粒中。

最早用作克隆載體的質粒子有多種局限性：復制效率低；帶有不適合的選擇標記；酶切位點少且不集中等，pBR322是早期最為成功的將所有理想的特性囊括于一身的質粒載體。第二階段：高效型載體的發展

發展的趨勢是調整載體的結構，提高載體的效率，減少載體的長度，擴充載體的容納外源DNA的能力。這期間質粒的代表是：pUC19等。第三階段：引入多種用途的輔助序列

這些用途包括通過組織化學檢測方法肉眼鑒定重組克隆，產生用于序列分析的單鏈DNA，外源蛋白的大量表達等用途的質粒載體。

㈡λ噬菌體

1．λ噬菌體分子生物學

λ噬菌體的基因組是一長度50kb的雙鏈DNA，其末端為長12bp的天然互補單鏈（粘端）。當它進入宿細胞后其粘端會配對結合成環形，它在侵入宿細胞后可以兩種方式進行復制：

裂解性生長 溶源性生長

2．λ噬菌體作為載體所具有的特征

不利因素：野生型λ噬菌體有一個龐大的基因組，其DNA可分為頭部、中央部分和尾部三個部分。其基因組由頭部（由7個基因組成）、尾部（由11個基因組成）、重組基因（5個基因和一個識別位點）、正調控基因（2個基因）、負調控基因（5個基因）、DNA合成基因（2個基因）、裂解基因（2個基因）、轉錄調控及識別位點組成。在沒有改造的情況下，λ噬菌體無法插入較大的外源DNA片段，無較集中的酶切位點和好的識別標置。3．λ噬菌體載體的改造：

在λ噬菌體DNA的中央部分（約占30%）是其生長的非必須區，當外源基因取代該區或該區缺失時，對噬菌體的生長不會造成影響。此外，外源基因不超過其本身的10倍數時，均可被包裝為成熟顆粒，具有噬菌體活性。

目前使用的λ噬菌體載體都經過了改造，在其中加上了較集中的酶切位點、還加上了細菌的啟動子，這不僅使其具有擴增外源DNA的能力，還使它能夠表達外源基因的產物。

λ噬菌體的用途： λ噬菌體主要用于cDNA文庫的構建。㈢粘性質粒

粘性質粒是一種將λ噬菌體和質粒兩種載體結合起來形成的一種人工載體。它具有如下特征：

⑴含有質粒的抗藥性標記，如Ampr基因。

⑵載體帶有噬菌體的cos區，所以對其進行體包裝是必不可少的。

⑶具有多克隆位點。

⑷形體本身的體積很小，但容量大，可插入40kb大小的DNA片段。

⑸一般非重組的載體體積小，而無法進行體外包裝，因而無法轉染細菌，只有包裝了的重組體才能進入細菌，有利于篩選。㈣M13噬菌體

M13噬菌體是一種大腸桿菌的噬菌體它在轉染大腸桿菌后進行一段時間的復制后開始進行不對稱復制，而形成大量的單鏈DNA，而后將這些單鏈DNA進行包裝病毒顆粒后釋放到細菌外，利用這一特點，可大量克隆單鏈的DNA分子用于制備核酸探針和DNA測序的材料。㈤大容量測序用載體

在基因組學的研究中，需要將基因組的DNA片段切割成較的片段進行測序，以此來提高測序的速度。但我們前面提到的載體一般都無法滿足這一需要，為了達到這一目的，人們開發出了酵母人工染色體(YAC)和細菌人工染色體(BAC)，前者可容納100萬個堿基的DNA片段，后者可容納30萬個堿基的DNA片段。

載體的表達

用于目的基因的表達。可分為大腸桿菌表達載體和哺乳動物表達載體。㈠大腸桿菌表達載體

一般具備有細菌轉錄的啟動子，可人為的進行操縱，如多數質粒載

體中都帶有乳糖操縱子的啟動子，能在乳糖存在的情況進行誘表達。㈡哺乳動物表達載體

多數是一些真核細胞病毒經過改造而成形的。

重組DNA技術的基本過程

一、目的基因的制備 ㈠傳統的辦法 1.制備基因組DNA 將整個一個物種的基因組提取出來后用于基因工程的操作。常用于建立基因文庫。

2.制備cDNA文庫,并從中篩選目的基因

將一個物種或細胞中的全部RNA提取出來再從中提取mRNA，利用逆轉錄酶將其合成為cDNA，再將其重組于載體后，轉錄到大腸桿菌后形成cDNA文庫。

㈡制備用于表達的基因片段 ⒈直接用限制性酶切取

⒉用PCR技術體外擴增目的基因 ⒊化學合成

㈢利用生物信息學的技術和原理來選擇目的片段

是現在最普遍使用及最為方便的手段

二、載體的選擇和制備

載體均是商品，根據實驗的目的來選擇合適的載體，如分子克隆、表達、測序或長期保存目的基因等。即可以購買，也可以索求

三、DNA分子體外重組 基因工程的策略

?確定重組實驗的目的——是獲得目的基因，還是獲得表達產物。

?根據經濟情況選擇合適的用品——包括質粒（可以買成品，也可以向人索取質粒自己提取）、酶的選擇等。

?制定周密的實驗計劃，基因工程的實驗周期都比較長，如計劃不周，將造成時間和經濟上的損失。

?酶切位點的選擇 選擇合適的連接方式

四、將外源重組DNA導入宿主細胞

㈠轉化：主要指將質粒轉入宿主細菌的過程。通常是先將細菌細胞制備成感受態的菌，然后再進行轉化。

轉化常用的方法有兩種：化學轉化和電轉移

㈡轉染：主要指將噬菌體和病毒轉入細胞的過程。

五、目的基因的篩選和鑒定

篩選和鑒定的方式有許多種，要仿照最初的實驗方案來確定。常用的方式有：

用抗生素選擇培養基來篩選

用藍白斑選擇培養基來篩選

根據酶切方案來篩選

直接提取質粒來篩選

提取質粒和酶相結合來篩選

分子雜交 DNA測序

在醫學中的應用

1.基因工程用于生產蛋白質類藥物

治療糖尿病的胰島素，是一種 51 個氨基酸殘基組成的蛋白質1982 年美國 EliLilly 公司推出基因工程制造的人胰島素，商品名為(Humulin)。干擾素用于治療肝炎等病毒感染性疾病，有良好療效。升發酵液中所得的干擾素相當于過去從 1000 升人血中所得。生產成本也大為降低。

目前用基因工程生產的蛋白質藥物已達數十種，許多以前本不可能大量生產的生長因子，凝血因子等蛋白質藥物，現在用基因工程辦法便可能大量生產。

正在開發的350種生物技術藥物中，1/3以上用于腫瘤，其中有30種用于黑素瘤，20種用于結直腸癌，13種用于乳腺癌，13種用于前列腺癌。

正在開發的疫苗有77種，用于預防或治療HIV感染、AIDS、結直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、多發性硬化、中風。

正在開發的生物技術藥物中，有29種用于HIV感染、AIDS和AIDS相關疾病；19種用于自身免疫性疾病，其中11種用于類風濕性關節炎、3種用于狼瘡；8種用于血液疾病，其中4種用于血友病，一種用于鐮形細胞性貧血。

2.基因工程用于疫苗生產

常用的制備疫苗的方法，一種是弱毒活疫苗，一種是死疫苗。兩種疫苗各有自身的弱點。活疫苗隱含著感染的危險性。死疫苗免疫活性不高，需加

大注射量或多次接種。

利用基因工程制備重組疫苗，可以克服上述缺點，亞基疫苗指只含有病原物的一個或幾個抗原成分，不含病原物遺傳信息。重組亞基疫苗就是用基因工程方法，把編碼抗原蛋白質的基因重組到載體上去，再送入細菌細胞或其他細胞中區大量生產。這樣得到的重組疫苗往往效價很高，但決無感染毒性等危險。

在酵母中表達乙型肝炎表面抗原 HBsAg 產量可達每升 2.5mg，已于 1984 年問世。

基因工程生產疫苗有良好的發展前景。3.基因工程用于基因治療

人體基因的缺失，導致一些遺傳疾病，應用基因工程技術使缺失的基因歸還人體，達到治療的目的，已成為基因工程在醫學方面應用的又一重要內容。

分子生物學常用技術

核酸的分子雜交Nucleic acid hybridization 分子雜交的原理：

DNA具有變性的特點 變性的DNA還能復性

分子雜交的概念 用已知的DNA序列制成探針，來檢測末知的樣本DNA。

核酸分子雜交的基本過程:

首先要確定檢測的目標，即檢測的目的核酸片段，這個片段的序列必須是已知的。

根據此設計一個探針（與檢測目的核酸互補的序列），并對其進行合成和標記。

再通過雜交實驗來完成探針對目的核酸的檢測。

分子雜交的形式：

液相雜交 固相雜交 固相雜交的一般過程

1.首先設計、合成探針。2.收集標本，并提取核酸。

3.將提好的核酸樣本點到固相支持物上。4.封閉。

5.通過變性和復性完成雜交。6.漂洗

7.放射自顯影

核酸分子雜交技術的演變

斑點雜交 southern blot northern blot 原位雜交 芯片技術

聚合酶鏈式反應 Polymerase chain reaction(PCR)PCR技術的形成及發展

PCR的實現 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內復制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適的條件——摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間, 合成DNA的原料。

PCR的改進與完善

Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優點，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫學界的足夠重視

1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發現為PCR技術的廣泛應用打下了基礎。PCR 技術的實驗原理

模擬細胞內DNA合成的過程

利用了DNA變性、復性和能進行雜交的特點，在引物存在的條件下DNA聚合酶開始對DNA進行體外合成。

通過全自動的熱循環儀來完成 PCR的基本原理 PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點

PCR反應的基本條件

模板的制備: 模板是進行DNA體外擴增的依據，它的來源于不同的材料。PCR對模板的質量要求很高，但對它量的要求不高。

制備模板的材料：

新鮮材料：人或動物的血液及組織中提取；

從少量材料：痰、尿液、腹腔液等;法醫學的材料：血斑、精斑等；

考古材料

從以往保存的材料，如石蠟切片的蠟塊中。

提取的原理和方法：（略）

引物的設計：

引物的設計首先要依據你已知的序列來設計。即你要擴增的目的DNA片段。這些資料可以從文獻上查找或從互聯網上來檢索。

實際做的過程中，引物也可借助于別人已經發表的引物來。但從經驗上說，別人公開發表的引物常常含有一定的錯誤。所以要進行核查。

設計引物應遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

⑤引物-3’端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物 量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

PCR所用試劑： DNA聚合酶

buffer:包括兩種，一種是含Mg++，一種是不含Mg++。dNTPs 純凈水

自己要準備的模板DNA的制備和引物的設計與合成。PCR的操作過程

設定一個加樣配方： 標準的PCR反應體系：

10×擴增緩沖液 5ul

4種dNTP混合物

各200umol/L

引物

各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至 50ul

加樣：

單樣本加樣

多樣本加樣

加樣的順序 PCR反應條件的設定：

預就性溫度： 94℃，5分

變性溫度： 94℃，30秒

退火溫度： 需要摸條件

延伸溫度： 72℃，30秒

總延伸溫度： 72℃，15分

PCR結果的鑒定

通過凝膠電泳的方式來進行。

RT-PCR(reverse transcription-PCR)RT－PCR技術的應用

用于制備基因工程的目的基因片段。

用于表達譜的檢測。PCR技術的應用

PCR的初衷是為特異性的擴增某段DNA

現在PCR在醫學研究中主要是用于基因診斷，常用于：

對遺傳病的突變基因進行診斷

對病原體的基因診斷

通過PCR結合限制酶切的診斷 SSCP技術進行點突變的診斷 RT-PCR進行結構基因的擴增及定量表達 熒光定量PCR技術

PCR結合多態性分析

PCR擴增產物的多態性分析有2種情況：

限制片段多態性分析(A)、(B)重復序列多態性分析(A)、(C)SSCP技術進行點突變的診斷 實時熒光定量PCR技術

電泳技術electrophoresis technology 核酸的凝膠電泳

一、基本原理

1．核酸分子在水溶液中呈多聚陰離子。加上電場，它們會向正電極的方向遷移。2．在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于核酸分子本身的大小和構型。

3．電泳環境的影響：緩沖液的組成和離子強度直接影響遷移速度。

當電泳緩沖液中無離子時，溶液導電性極小，電泳速度慢。當電泳緩沖液中離子濃度極強時，則導電性極高，并易產熱。

pH值也影響遷移率，溶液的pH遠離樣品的等電點時，樣品顆粒的電離程度大，相應的電泳速率就大。凝膠的濃度的不同對同樣大小顆粒的電泳速

率也不相同，因此，不同濃度的凝膠分辨DNA分子大小的能力也不同。

表：瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力

凝膠類型及結構 分離DNA片段的大小范圍(bp)0.3%瓊脂糖 50 000-1 000 0.7%瓊脂糖 20 000-1 000 1.4%瓊脂糖 6 000-300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000-100 10.0%聚丙烯酰胺 500-25 20.0%聚丙烯酰 50-1

4．凝膠電泳的目的：

可將大小不等的DNA片段和蛋白分子進行分離，并通過標準分子量基本原理：

maker鑒定其大小。

對所要的目的分子進行純化提取。

二、瓊脂糖凝膠電泳 Agarose Gel Electrophoresis 瓊脂糖是從海藻中提取出的長鏈狀多聚糖，當它被加熱到90℃時可被溶解成半透明的液體，這時便于澆板并在冷卻后固化成凝膠。其凝固點這40-45℃。

瓊脂糖電泳的優點：操作方便，并可用來鑒定和純化特定的DNA分子。

用低溶點瓊脂糖來分離并純化DNA。

瓊脂糖電泳的不足之處：它的分辨范圍在0.3-50kb之間，對一些分辨更小DNA分子的實驗將無法進行。

瓊脂糖電泳結果的顯示：

利用核酸與溴化乙錠吸附性強的特點，用溴化乙錠來顯色。

三、聚丙烯酰胺凝膠電泳

(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)電泳材料：

丙烯酰胺

CH2═CH─C—NH2 ║ O N,N?ˉ-亞甲雙丙烯酰胺

H H │ │ CH2═CH─C—N—CH2—N—CH═CH2 ║ O 兩種丙烯酰胺在促凝劑存在的條件下可以凝集成膠。

PAGE的優點和不足：優點是分辨率高，不足是操作復雜，成本高。PAGE的凝膠可用溴化乙錠染色，也可以銀染，后者的分辨率高。

四、SDS-變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

(SOS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)

SDS-PAGE專門用于蛋白質電泳。

基本原理：在蛋白質電泳前，先將其變性成線結構，并使其表面都吸附上帶負電荷的活性分子-----SDS。

蛋白質印跡技術

Western blotWestern blot 技術是借鑒了Southern blot 技術的原理而設計。它也是在凝膠電泳后通過轉移電泳將電泳分離物移到固相支持物上再進行進一步的分析。

與Southern blot不同的是，它用來雜交的不是探針，而是特異性的物體。

Western blot的基本過程

先通過SDS-PAGE將樣本中的蛋白質分離

通過轉移電泳將凝膠上的樣本移到硝酸纖維膜上 封閉硝酸纖維膜

用一抗來特異性的識別目標蛋白 用酶標二抗來識別一抗 顯色

DNA序列分析

Sanger雙脫氧終止法(手工測序)基本原理：

DNA在復制時，需要兩個單核苷酸之間脫去一分子水后形成磷酸二酯鍵。如果在其中加入雙脫氧的單核苷酸，將中止DAN的復制。通過自動化的DNA測序儀來進行測序

二、基因組的大規模的測序列 新一代測技術的出現

第二代測序技術的核心思想是邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis)，即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列，現有的技術平臺主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。

酶聯免疫吸附分析Enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA)

通過免疫學技術(抗原、抗體反應)對樣本中的目標蛋白質進行特異性的定性或定量分析。被檢測的蛋白質即可能是抗原，也可以是抗體。基本過程：

1.將抗體或抗原結合到固相支持物上

2.用特異性的抗原或抗體(被酶標記)對其進行免疫識別。3.通過酶標儀來檢測結果

ELISA常用的方法有：

雙抗體夾心法

間接法

一、轉基因技術 1.轉基因技術的概念

轉基因技術指的是將一個物種的特定基因通過人工的方法轉入到另一種生物的細胞中，并使它獲得了轉入基因的特性。

2.轉基因技術的類型

轉基因技術可分多個層次：

廣義的講，最基本的轉基因技術就是基因工程，即將高等生物的基因通過體外重組后，轉化入細菌或酵母細胞。

真正意義上的轉基因技術是指轉基因植物和轉基因動物。它們多是將外源基因注入生殖細胞或受精卵子中，并讓外源基因整合到其基因組中，并使其在胚胎及發育成熟的個體中獲得表達，形成具有新特性的個體。

三、轉基因動物 transgenic animal

1．轉基因動物的簡史

1980年，J.W.Gordon等人首次報道用顯微注射的方法向小鼠胚胎注射純化的DNA，開辟了轉基因動物研究的先河。

1982年，R.D.Palmiter等又報道用轉移生長激素基因的方法，獲得了7只轉基因鼠，其中1只比一般小鼠大一倍，被稱為巨鼠，引起極大的轟動。相繼有轉基因豬、魚、兔和羊等問世。

2．轉基因動物研究概況

⑴轉基因動物在培育新品種中的應用

在轉基因動物歷史上，培育高效益的家畜、家禽和水生動物新品種曾經是研究工作的主流。受“巨鼠”的影響，人們期望能通過轉基因動物的研究，獲得快速生長、節約飼料、產毛多、產蛋多和抗病的動物新品種。

主要是將生長激素和類胰島激素的基因轉入動物體內，并且取得了良好的增長效果，但也表現出一系列病理性副作用，關節炎和胃病尤其明顯。但轉基因魚是一個例外。

⑵動物生物反應器(animal bioreactor)用動物乳腺生產醫用蛋白質的優點：

動物乳腺是一個自我封閉的系統，它表達的蛋白質絕大多數不會回到血液循環系統中去，可以避免大量表達的外源蛋白質對動物的健康造成危害。

乳腺組織是一種有效的蛋白質合成器，一頭奶牛一年可產乳蛋白250-300千克，一只羊一年可產乳蛋白25-30千克。如果把百分之一的乳蛋白代換為醫用蛋白質，產量十分可觀。

乳腺組織可以對人體蛋白質進行正確的修飾和后加工，產品活性接近天然產品。

在動物乳腺表達的外源基因可以遺傳，一旦獲得成功，可以用常規畜牧技術繁殖產生群體。

我國轉基因動物研究的領軍人物

——中國工程院院士曾溢滔教授

⑶抗病育種

將具有抗病能力的基因導入動物，使其具有較理想的抗病能力。目前已做的工作有：

抗豬瘟育種：

抗流感基因工程育種：1989年Young將INF基因質粒導入小鼠受精卵，獲得表達，獲得抗病轉基因小鼠。

抗腫瘤動物模型：美國首先培育出易發乳腺癌的轉基因小鼠，為研究癌誘發和抗腫瘤藥物的篩選提供了研究的模型。迄今已培育出許多與癌基因有關的轉基因小鼠。⑷基因治療

⑸組織器官移植：

將人的標志基因移入豬，使其器官上具有了人的抗原標志，減小了排異反應。

3.轉基因動物的技術路線 ⑴經典的技術路線

先從已交配的供體動物的輸卵管中采取受精卵；

顯微注射法向受精卵的雄性核導入人工構建的藥物蛋白基因；

經外科手術把已導入外源基因的受精卵移入同步發情的受體母羊輸卵管內；

讓受精卵在“養母”體發育至分娩出生；

用分子生物學技術檢測出生小羊是否已整合了導入的外源基因。

該法的缺點：實驗周期長，注射的外源基因整合率低。

⑵整合胚胎移植技術路線

該技術是對前種方法的改進。它利用了生殖技術中的體外受精技術，使精子和卵子在體外受精；然后找到一個最佳時機向體外受精的細胞顯微注射藥物蛋白基因。然后在體對胚胎體進行整合的鑒定。從中挑選有目的基因整合的胚胎進行移植。采用經陰道的非手術胚胎移植法，減少了對受精卵的損傷。

⑶核移植（克隆）技術路線

利用克隆技術進行轉基因實驗。即在進行克隆之前，先目的基因注射到將進行移植的核中，在按克隆技術進行操作。其成功率比經典技術路線高2.5倍。

⑷整合卵受精技術路線

即在受精之前先將藥物蛋白基因注射進入卵細胞，經檢測已經完成整合后，再進行體外受精和胚胎移植。

基因組學(genomics)功能基因組學(functional genomics)蛋白質組學(proteomics)Genome這個述語是德國遺傳學家Winkler在1920年創造的。它的含義是指一個細胞中所含有的全套遺傳信息。也是泛指一個物種中所含的全部的遺傳信息。

基因組學(genomics)主要是研究一個物種的基因組的組成，包括DNA堿基的排列順序，基因的分布情況。

人類基因組計劃簡介(human genome project, HGP)HGP簡介

人類基因組計劃是由美國科學家于1985年率先提出、于1990年正式啟動的。美國、英國、法國、德國、日本和我國科學家共同參與了這一價值達30億美元的人類基因組計劃。這一計劃旨在為30多億個堿基對構成的人類基因組精確測序，發現所有人類基因并搞清其在染色體上的位置，破譯人類全部遺傳信息。

基因組(Genome):基因組就是一個物種中所有基因的整體組成 人類基因組有兩層意義： ——遺傳物質 ——遺傳信息

從整體水平研究基因的存在、基因的結構與功能、基因之間的相互關系

人類基因組計劃的目標：

1.測定人類基因組中32億個單核苷酸（堿基）的排列順序。

2.確定各個基因和功能元件在序列中的位置，也就通常說的基因定位。3.確定出與疾病相關的基因及找出有治療和藥用價值的基因。4.繪制出一個完整的人類基因圖譜。

HGP是如何進行的： 1.基因組測序概觀

基因組的測序的基本過程：

①選擇物種

②從細胞中提取DNA ③把經純化的DNA隨機切割成大小合適的重疊片段

④指導DNA片段插入到載體中，并克隆

⑤測出第一DNA片段的堿基順序

⑥確定片段間的重疊，把序列組裝成最終的基因序列 敲碎基因組，分析研究內容所處的染色體位置

2.DNA的測序方法

在發明自動測序技術之前，人們用手工進行測序，最常用的方法是末端終止法（后面專門介紹）。

手工測序是通過凝膠電泳的手段將DNA片段進行分離，然后在膠上“讀出”堿基的排列順序。這就決定了被測序的DNA片段不可能太大，而且效率很低，在20世紀80年代時，一天只能完成500bp片段的測序工作。

3.自動化測序

1985年Leroy Hood, Lioyd Smith, Mike Hunkapiller發明了第一臺自動測序儀，每天能測15 000個bp，1998年Hunkapiller領導的小組發明了一種新的測序列儀——ABI 3700G型DNA分析儀，每天可測多達400 000bp。測序的自動化推動了HGP的神速發展，研究人員僅用15個月的時間就完成了人類基因序列的90%。

技術的改進促進了測序的發展，每18個月全世界的測序總量翻一番，而測序成本則減少一半。從20世紀80年代末期到2001年，測序成本從10美元降到10美分。

4.測序用載體的改進

在進行基因組測序時，先要將提取的基因組DNA用限制性內切酶切成大小不等的片段，并使每個片段之間能夠出現部分的重疊，然后需將這些片段放入載體大量克隆后才能完成測序的需要。

分子生物學中常用的載體是質粒，它一般能攜帶較小的DNA片段。但在HGP的測序中需要能攜帶更大片段的載體，人工染色體載體的出現解決了這一困難。現在用的人工染色體分為細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome BAC)或酵母人工染色體(yeast artificial chromosome YAC)。BAC能攜帶300 000bp的DNA，YAC能攜帶1 000 000bp 的DNA，但不夠穩定。

5.組裝基因組的拼圖游戲

基因測序后，要將一個個小的DNA片段拼裝起來就象一個游戲，但是一個十困難的工作。一個原因是人的基因組過于龐大，32億個堿基對被切成小片段也要有上千萬個片段，把它們從頭到尾找到一起本身就是很困難的工作。加上人的基因組中存在著大量的重復順序，約占人基因組的一半以上，這樣在拼接時很容易把一個區誤認為另一個區域，因此在基因組測序和拼圖中常常會出現空洞和錯誤。要彌補這些空洞和錯誤，基因組的工作草圖的每一個堿基至少被測4-5次，人類基因組的最終目標是產生完全的序列，沒有空隙，準確率要達到99.99%。

6.目前進行基因組計劃的兩種策略： 霰彈法測序：

先將人的基因組制備成各級小片段，并且小片段間有重疊的關系 然后對每個小片段進行測序 通過重疊的關系將相互聯系著的小片段拼接成較大片段 當拼到比較大的片段時，就可用于構建圖譜 最終全部基因的序列。

全基因組霰彈法測序：

將基因組分割成小片段 然后對小片段進行隨機的測序

通過計算機的程序將所有這些小片段組裝成連續的大片段，最終得到全基因組序列。

模式生物體的研究

通過對進化不同階段的生物體基因組序列的比較，發現基因組結構組成和功能調節的規律。

人類基因組計劃的完成示標志著生命基礎科學的研究進入到后基因組時代。

HGP對人類的重要意義

1、HGP對人類疾病基因研究的貢獻

人類疾病相關的基因是人類基因組中結構和功能完整性至關重要的信息。對于單基因病，采用“定位克隆”和“定位候選克隆”的全新思路，導致了亨廷頓舞蹈病、遺傳性結腸癌和乳腺癌等一大批單基因遺傳病致病基因的發現，為這些疾病的基因診斷和基因治療奠定了基礎。對于心血管疾病、腫瘤、糖尿病、神經精神類疾病（老年性癡呆、精神分裂癥）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重點。健康相關研究是HGP的重要組成部分，1997年相繼提出：“腫瘤基因組解剖計劃”“環境基因組學計劃”。

2、HGP對醫學的貢獻

基因診斷、基因治療和基于基因組知識的治療、基于基因組信息的疾病預防、疾病易感基因的識別、風險人群生活方式、環境因子的干預

3、HGP對生物技術的貢獻

（1）基因工程藥物：分泌蛋白（多肽激素，生長因子，趨化因子，凝血和抗凝血因子等）及其受體。

（2）診斷和研究試劑產業：基因和抗體試劑盒、診斷和研究用生物芯片、疾病和篩藥模型。

（3）對細胞、胚胎、組織工程的推動：胚胎和成年期干細胞、克隆技術、器官再造。

4、HGP對制藥工業的貢獻

篩選藥物的靶點：與組合化學和天然化合物分離技術結合，建立高通量的受體、酶結合試驗為基礎的藥物設計：基因蛋白產物的高級結構分析、預測、模擬—藥物作用“口袋”

個體化的藥物治療：藥物基因組學。

5、HGP對社會經濟的重要影響

生物產業與信息產業是一個國家的兩大經濟支柱；發現新功能基因的社會和經濟效益；轉基因食品；轉基因藥物（如減肥藥，增高藥）

6、HGP對生物進化研究的影響

生物的進化史，都刻寫在各基因組的“天書”上；草履蟲是人的親戚發現了大約一百四十萬個單核苷酸多態性，并進行了精確的定位，初步確定了30多種致病基因。隨著進一步分析，我們不僅可以確定遺傳病、腫瘤、心血管病、糖尿病等危害人類生命健康最嚴重疾病的致病基因，尋找出個體化的防治藥物和方法，同時對進一步了解人類的進化產生重大的作用。

9、蛋白組的復雜性

人類基因組編碼的全套蛋白質（蛋白質組）比無脊椎動物編碼的蛋白質組更復雜。人類和其他脊椎動物重排了已有蛋白質的結構域，形成了新的結構。也就是說人類的進化和特征不僅靠產生全新的蛋白質，更重要的是要靠重排和擴展已有的蛋白質，以實現蛋白質種類和功能的多樣性。有人推測一個基因平均可以編碼2-10種蛋白質，以適應人類復雜的功能 ——13億年；人是由300～400萬年前的一種猴子進化來的；人類第一次“走出非洲”——200萬年的古猿；人類的“夏娃”來自于非洲，距今20萬年——第二次“走出非洲”？

7、HGP帶來的負面作用 侏羅紀公園不只是科幻故事 種族選擇性滅絕性生物武器 基因專利戰

基因資源的掠奪戰 基因與個人隱私。

人類基因組帶給我們的新發現

1、基礎數據

全部人類基因組約有2.91Gbp，約有39000多個基因；平均的基因大小有27kbp；其中G+C含量偏低，僅占38%，而2號染色體中G+C的含量最多；到目前仍有9%的堿基對序列未被確定，19號染色體是含基因最豐富的染色體，而13號染色體含基因量最少等等（具體信息可參見cmbi 特別報道：生命科學的重大進展）。

2、基因的分布情況

目前已經發現和定位了26000多個功能基因，其中尚有42%的基因尚不知道功能，在已知基因中酶占10.28%，核酸酶占7.5%，信號傳導占12.2%，轉錄因子占6.0%，信號分子占1.2%，受體分子占5.3%，選擇性調節分子占3.2%，等。發現并了解這些功能基因的作用對于基因功能和新藥的篩選都具有重要的意義。

3、基因數量少得驚人：

一些研究人員曾經預測人類約有14萬個基因，但Celera公司將人類基因總數定在2.6383萬到3.9114萬個之間，不超過40,000，只是線蟲或果蠅基因數量的兩倍，人有而鼠沒有的基因只有300個。如此少的基因數目，而能產生如此復雜的功能，說明基因組的大小和基因的數量在生命進化上可能不具有特別重大的意義，也說明人類的基因較其他生物體更'有效'，人類某些基因的功能和控制蛋白質產生的能力與其他生物的不同。這將對我們目前的許多觀念產生重大的挑戰，它為后基因組時代中生物醫學的發展提供新的非凡的機遇。但由于基因剪切，EST數據庫的重復以及一些技術和方法上的誤差，將來亦可能人類的基因數會多于4萬。

4、不同各族間DNA的差異

人類單核苷酸多態性的比例約為1/1250bp，不同人群僅有140萬個核苷酸差異，人與人之間99.99％的基因密碼是相同的。并且發現，來自不同人種的人比來自同一人種的人在基因上更為相似。在整個基因組序列中，人與人之間的變異僅為萬分之一，從而說明人類不同“種屬”之間并沒有本質上的區別。

5、人類基因組中存在大片“荒漠”。

在染色體上有基因成簇密集分布的區域，有大片的區域只有“無用DNA” ——不包含或含有極少基因的成分。基因組上大約有1／4的區域沒有基因的片段。在所有的DNA中，只有1%-1.5%DNA能編碼蛋白，在人類基因組中98%以上序列都是所謂的“無用DNA”，分布著300多萬個長片斷重復序列。這些重復的“無用”序列，決不是無用的，它一定蘊含著人類基因的新功能和奧秘，包含著人類演化和差異的信息。經典分子生物學認為一個基因只能表達一種蛋白質，而人體中存在著非常復雜繁多的蛋白質，提示一個基因可以編碼多種蛋白質，蛋白質比基因具有更為重要的意義

6、男女性別間基因的差異

男性的基因突變率是女性的兩倍，而且大部分人類遺傳疾病是在Y染色體上進行的。所以，可能男性在人類的遺傳中起著更重要的作用。

7、外來基因

人類基因組中大約有200多個基因是來自于插入人類祖先基因組的細菌基因。這種插入基因在無脊椎動物是很罕見的，說明是在人類進化晚期才插入我們基因組的。可能是在我們人類的免疫防御系統建立起來前，寄生于機體中的細菌在共生過程中發生了與人類基因組的基因交換。

8、新的遺傳標記

蛋白質組學(Proteomics)

proteome一詞于1994年提出，源于proteins和genome,意思是proteins expressed by a genome。研究細胞、組織或生物體蛋白質組成及其變化規律的科學

蛋白質組的廣義含義：

指某種細胞或組織中基因組所表達的所有的蛋白質。但與基因組不同的是，蛋白質組是一個動態的概念，因此有人用功能蛋白質組的概念，指的是細胞在一定階段或與某一生理現象相關的所有蛋白質。蛋白質組的狹義含義：

可以指不同類型細胞內蛋白質的變化，如正常細胞和異常細胞之間、細胞用藥或不用藥之間的蛋白質水平差異、不同組織細胞間的蛋白質類型的差異。

蛋白質組研究的意義和背景

蛋白組學可從另一方面來進行探索。即找到蛋白再來找其基因。

蛋白研究的困難性

蛋白質與核酸相比，結構更復雜

前者與后者殘基的比為20:4；后者能在體外進行合成、前者則不能；后者結構和組成的差異不大、前者有著復雜的翻譯后修飾如磷酸化、甲基化等內容。

蛋白質的結構易被破壞

核酸在變性后能夠復性，并且結構不被破壞(這一點正是人們所利用的)。

蛋白質結構一旦變性則很難恢復。

蛋白質組研究主要分兩個步驟

蛋白質組分離技術 蛋白質組分析技術 蛋白質的分離

將各種蛋白進行分離是進行后續分析的基礎。分離的越細、分辨率越高將會為分析創造更好的條件。常用的蛋白質分離手段有：

親和層析 分子篩 離子交換

毛細管電泳 一向電泳 雙向電泳

雙向電泳技術 樣品的制備

等電聚焦電泳(1向)SDS-PAGE電泳(2向)掃描保留圖象

強大的分析軟件進行數據分析 選定目標蛋白 切膠 后續分析 對膠的染色 圖象的采集 圖象分析和處理

切膠收集目標蛋白

基因診斷

(Gene Diagnosis)基因診斷是以DNA或RNA為實驗材料，通過對某種特異堿基序列的檢出來確定某種疾病的發生或某種病原體的存在。

基因診斷要達到的目的 對已知突變基因的檢出

臨床應用和基礎研究

對一些未知基因突變的篩選和分析。

對一些基因表達水平高低與某些疾病相關性的研究 對病原體基因的檢出。基因診斷早期的方法

分子雜交(hybridization)限制片段長度多態性的研究

(restriction fragment length polymorphism RFLP)分子雜交應用于基因診斷的基本原理

根據被檢測目標設計一個核酸探針，再用探針對來檢測具體的樣本，從而達到診斷的目的。

在實際應用中，常用southern blot的方法來進行突變基因的篩查。

PCR技術進行基因診斷的幾種基本設計：

1.根據突變位點來設計特異性的引物。通過有無擴增片段來進行定性的。

2.通過基因片段長度的多態性來進行鑒定。3.PCR結合限制片段長度多態性來進行鑒定。

4.通過PCR-SSCP來進行鑒定。

5.通過設計特異性的引物來診斷病原體的特異性基因。

基因診斷的應用 多態性分析

對遺傳病突變基因的診斷

已知突變位點的診斷

未知突變位點的篩查和定位 基因異常表達的診斷（定量表達）外源DNA的檢測

腫瘤標記物的確定和診斷 在法醫學中的應用

DNA多態性

序列多態性(SNPs – 單堿基多態性)同源染色體 5-GGTTTACACCTAA-同源染色體 5-GTTTTAAACCGAA-

長度多態性(VNTR-可變的串聯重復順序)同源染色體 5-AATCAATCAATC-

同源染色體 5-AATCAATCAATCAATCAATC-

核心序列較長者（如大于8bp）常稱為小衛星DNA，或稱可變數目串聯重復序列（VNTR）核心序列較短者（如2-5bp）常稱為微衛星DNA，或稱短串聯重復序列（STR）

微衛星多態性 單堿基多態性

遺傳信息變異是所有基因組的共同特征。不同個體、群體在疾病易感性、對環境理、化、生、致病因子反應性和其他性狀上的差別，都與基因組序列中的變異有關，這些變異最常見的形式是單核苷酸多態性（SNP）。

人類基因組中SNP的數目約為3百萬－1千萬。人類遺傳多態性的意義 與性狀相關；

與疾病相關，可用于預測發病風險； 個體醫學發展的基礎；

可作為遺傳標志，用于疾病連鎖診斷； 作為個人身份識別標識用于法醫學。

遺傳性狀

遺傳多態性在身份識別方面的應用

公安司法系統——罪犯及受害人的身份識別及親子鑒定； 部隊 —— 傷亡士兵的身份識別；

保安 —— 個人DNA身份證，用于人員識別；

何為RFLP? 限制性片段長度多態性

(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)

何為DNA指紋？用一種或幾種限制性內切酶切割基因組DNA，用探針雜交并放射自顯影。

中國人群的遺傳學關系

主要成果：證實中國人群可分為南、北兩大組，兩者之間有明顯的基因融匯；提出了東亞人群可能起源于東南亞、而東亞現代智人與其他各大洲現代人群都起源于10－20萬年前“走出非洲”的群體的觀點。

基因治療Gene Therapy

依靠遺傳物質來治療疾病，包括糾正人自身基因的結構或功能上錯亂、阻止病變的進展，殺滅病變的細胞，或抑制外源原體遺傳物質的復制，從而達到治病的目的。這就是基因治療的含義。基因工程與基因治療有相似的一面：

二者都需將“目的基因”（基因治療也可稱為治療基因）分離和純化；都需要將選擇合適的載體，并將“目的基因”與載體在體進行重組；都需要將重組體導入受體（靶）細胞。基因工程與基因治療有不同的一面：

基因工程的主要目的是將重組體導入宿主細胞，并使得外源基因在宿主細胞中表達、純化，最終獲得重組蛋白。

基因治療的主要目的是將具有治療價值的基因形成的重組體導入體細胞直接表達，并無需對表達產物進行純化。

基因工程的全部過程都在體外操作；而基因治療需將外源基因導入體細胞中，因此技術上具有很大難度，而且對其有效性和安全性方面提出了

苛刻的要求

基因治療有兩種途徑：

ex vivo in vivo ex vivo ：

將含有外源基因的載體在體外導入人體細胞或異體細胞（也稱基因工程化細胞），經體外細胞擴增后，輸回人體。這種方法易于操作，并易于解決安全性的問題，但不易于工程化生產。in vivo途徑

將外源的治療基因裝配于合適的真核細胞表達載體，直接導入人體內，這種方式的導入有利于在規模的工業生產。但是，這種方式導入治療基因及其載體必須證明其安全性，而且導入體內后需能進入靶細胞，有效地表達并達到治療的目的。因此，在技術上要求很高，其難度明顯高于前者。

致病基因的確定(定位)近日，來自國際上六個國家的科學家展開合作，通過分析全球不同人群之間的遺傳基因信息，初步繪制出首張人類DNA序列中變異基因片段的遺傳圖譜“HapMap”。這張圖譜對于基因治療來講，意義非凡。

所謂“HapMap計劃”，是由加拿大、中國、日本、尼日利亞、英國和美國共同資助并聯合展開的基因研究項目，全名為“國際人類基因組單體型圖計劃”(簡稱“HapMap計劃”)，項目旨在建立一個幫助研究者發現人類疾病及其對藥物反應相關基因的公眾資源。

反義技術 又稱反義寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides）技術，是指利用人工合成的反義RNA和反義DNA來阻斷基因的轉錄或復制，控制細胞生長在中間階段,使編碼蛋白質的基因能轉錄為mRNA，因而不能翻譯成相應的蛋白質，以達治療某一疾病的目的、用反義RNA已對某些癌癥進行臨床試驗。這類反義技術只能認為是一種從基因水平進行治療的技術，它們以不同方式，在DNA復制、轉錄和翻譯水平發揮作用。由于它們的分子量低，故而有潛力進入靶細胞，但其臨床穩定性、毒性、細胞通透性等各方面都需要進一步研究。

藥物靶向治療（drugs targeting）此法機理可概括為病毒導向酶的藥物前體治療（virus directed enzyeme prodrug therapy,vdept），即用反轉錄病毒載體的外源基因轉移到細胞內.該基因編碼一種酶，此酶可將一種無害的藥物前體轉變為細胞毒素復合物。帶有這一基因的病毒載體只在特殊組織或腫瘤細胞中而不在正常細胞中表達

第四篇：分子生物學論文

分子生物學論文

姓名：

專業：藥學

班級：11級藥學三班 學號：

基因工程抗體治療白血病的研究進展

【摘要】目前采用基因工程藥物治療白血病逐漸成為熱點。研究表明白血病在獲得緩解后用基因工程藥物治療即可提高療效，又可減輕化療藥物的毒副反應，并可望達到治愈白血病的目的。

【關鍵詞】白血病；基因工程抗體；研究進展

引文

白血病是一類造血干細胞的克隆性疾病，在骨髓和其他造血組織中白血病細胞大量增生積聚，并浸潤其他器官和組織，而使正常造血受抑制。在兒童至35歲以下青壯年人群中因患惡性腫瘤致死的以白血病為首，故可稱為“第一殺手” [1]。治療白血病通常采用細胞毒藥物，雖然能使大部分患者病狀緩解和生存期延長，但治愈率仍很低。基因工程技術的發展為降低單克隆抗體的免疫源性提供了一個有力的手段。目前嵌合抗體、人源化抗體和全人抗體三種人源抗體很好地克服了HAMA反應的缺陷。2 正文

Campath一1H是在體內外對大部分正常和惡性淋巴細胞都有溶解殺傷作用的人源化CD52抗體，但對造血干細胞沒有殺傷作用。起初，Campath一1H主要集中在對非霍奇金淋巴瘤(NHL)的臨床試驗中，但由于Campath一1H對血循環中的淋巴細胞有強力的清除作用，現已經將其應用到CLL、T— PLL疾病中。

氟達拉濱等嘌呤類似物在各種慢性淋巴細胞白血病的治療中獲得較高的緩解率，但完全根除疾病的報道很少。將Campath一1H給予預先接受氟達拉濱治療的CLL患者，來清除微小殘留病變(MRD)，從而提高完全緩解率和持續時間，這可以使難治性CLL患者的總生存率(overall survival，OS)得到改善。Galimbeai[2] 等對8名CLL患者在氟達拉濱治療后給予Campath一1H治療。在Campath一1H治療后，5例患者獲得分子學緩解(62．5％)，其中4例在治療結束后一個月內獲得。OR(overall response)率為72％，CR率為43％，因此Campath一1H對CLL的治療作用是顯著的。

另外，Keating[3]等 2002年對76例先前治療過的T—PLL患者給予Campath—IH治療的安全性和功效進行了回顧性的分析。接受Campath一1H治療的患者，其OR率為51％，CR為39．5％，CR中位持續時間8．7個月，0s率為7．5個月(CR者14．8個月)。作者認為Campath一1H是補救T—PLL一線治療失敗__的較好藥物。

在造血干細胞移植中，Campath一1H還能有效地清除供者的T淋巴細胞而不影響采集的干細胞的數目和功能，成為預防異基因移植中預防移植物抗宿主病(GVHD)較為理想的藥物。

隨著減輕強度的預處理(RIC)方案的發展，出現了“非清髓性”造血干細胞移植。這種方案主要是靠免疫活性細胞作用，目的是使供體干細胞既易于植入，又最終起到根除腫瘤的作用。通常是包括氟達拉濱等藥物的聯合應用，但仍然有較高的慢性GVHD的發生和死亡率。而Campath一1H能有效地清除供受者的T淋巴細胞，從而減少了排斥反應和GVHD的發生，為“非清髓性”移植提供了一種較為理想的免疫抑制效應。Faulkner[4] 等報道了65例接受BEAM+Campath一1H預處理方案進行異基因移植的患者，包括CLL、PLL，中位年齡為45．6歲。其中Campath—IH每天用10mg。11例發生了急性GVHD(I一Ⅱ)，9例發生了慢性GVHD。55例獲得了反應，其中41例為CR，6例復發。2年Os率為68．1％，無事件生存率(EFS)為57．7％。結果2年移植相關死亡率(TRM)為13．3％。3 結語

基因工程藥物治療白血病首先可以有效的避免治愈白血病過程中由于腫瘤的微小殘留病變(MRD)不能被徹底清除而引起的疾病復發；其次是避免單純化療帶來的毒副反應而引起機體的損傷以及機體對化療藥物的耐受性。因此用基因工程藥物治療白血病的方法成為了國內外科學家研究熱點。我國與國外相比，雖起步較晚，但也獲得了較大的發展，取得了一定的科研成果。例如，已經研制成功和正在研制的基因工程產品就有幾十種，有些已經投產并開始使用，女ⅡIFN一、rhIL一

2、rhG—CSF、rhGM—CSF等。總之，基因工程藥物治療前景是十分誘人的，還有待于科研工作者的繼續努力，讓它為人類的健康作出更大的貢獻。

【參考獻文】

[1] 楊進．血液病中西醫結合治療學[M]．北京：科學技術文獻出版社，2005：65．

[2]Galimberti S，Cervetti G，Cecconi N，et a1．Quantitative molecular e．valuation of minimal residual disease in patients with chronic lym—phocytic leukemia：efficacy of in vivo purging by alemtuzumab(campath一1H)[J]．J Immunother，2004，27(5)：389—393．

[3]Keating MJ，Cazin B，Coutre S，et a1．Campatb一1H treatment of T—cell prolymphocytie leukemia in patients for whom at I east oneprior chemotherapy regimen has failed[J]．J Clin Oncol，2002，20(1)：205—213． [4] Faulkner RD，Craddock C，Byrne JI，et a1．BEAM—alemtuzumabreduced intensity allogeneic stem cell transplantation for lympho—proliferative diseases；GVHD，toxicity，and survival in 65patients[J]．Blood，2004，103(2)：428-434．

第五篇：分子生物學作業

分子生物學作業

一、DNA雙螺旋結構特點?

1DNA有兩條反向平行的脫氧核苷酸(兩條鏈的走向為5＇-3＇和3＇到5＇)，圍繞一中心軸(假想軸)構成右手螺旋結構。

2磷酸基與脫氧核糖在外側彼此間以磷酸二酯鍵相連，構成DNA的骨架主鏈。

3兩條鏈間存在堿基互補配對:A與T或G與C配對形成氫鍵，稱為堿基互補原則。

4螺旋的穩定因素為氫鍵和堿基堆砌力。

5螺旋的直徑為2nm，螺距為3.4nm。

二、轉座作用機理及遺傳學效應？

（1）機理：在基因組中可以移動的一段DNA序列稱作轉座子，一個轉座子由基因組的一個位置轉移到另一個位置的過程叫轉座。可以分為復制性轉座和非復制性轉座。復制性轉座中，這個轉座子被復制，所移動和轉位的是原轉座子的拷貝，需要解離酶；非復制性轉座中原始轉座子作為一個可移動的實體被直接移位，需要轉座酶。

（2）DNA轉座會引起插入突變、產生新的基因、影響插入位置臨近基因的表達并使宿主表型改變、產生染色體畸變以及引起生物進化。

3.原核生物和真核生物基因組特點：

（1）原核生物一般只有一個環狀的DNA分子，其含有的基因為一個基因組；真核生物基因組指一個物種的單倍體染色體組所含有的一整套基因。

（2）原核生物的染色體分子量較小，基因組含有大量單一順序；真核生物基因組存在大量的非編碼序列，如內含子外顯子等，還有復雜譜系。

（3）原核生物DNA在細胞中央，成為類核；真核生物有細胞核，DNA以染色體形式存在。

（4）原核基因組序列由DNA序列組成外，還可能有RNA；真核基因組由DNA序列組成。

（5）除了主要的染色體，原核生物中還有質粒及轉座因子；真核生物中的細胞器也含有DNA，并可以自主復制。