第一篇：分子生物學小結(jié)

第二章小結(jié)

在自然界各種生物中，DNA和RNA的一級序列貯存著遺傳信息，大多數(shù)生物以DNA作為遺傳信息的主要載體。RNA也可以作為遺傳物質(zhì)，但目前這種現(xiàn)象只存在于病毒中。除DNA，RNA序列貯存遺傳信息以外，DNA的甲基化修飾造成與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合特性的改變、染色質(zhì)組蛋白的乙酰化、甲基化修飾造成DNA與核小體結(jié)合特性的變化，以及蛋白質(zhì)本身也具有DNA序列變化以外的、可遺傳的表觀遺傳信息。朊病毒是不含有核酸的蛋白質(zhì)顆粒，但是可以復制并具有傳染性。

核酸包括DNA和RNA，DNA和RNA分別由A、T、C、G和A、U、C、G等核苷酸組成。A、T、C、G和A、U、C、G等堿基與核糖構(gòu)成核苷，核苷與磷酸殘基形成核苷酸，不同核苷酸的排列組合構(gòu)成了核酸的一級結(jié)構(gòu)。體內(nèi)的DNA由兩條DNA單鏈形成雙鏈，是DNA的主要存在形式。DNA雙鏈之間通過堿基配對方式形成，即A-T, C-G，因此，只要知道其中的一條鏈的序列，即可推導出另一條鏈的堿基組成。

雙鏈DNA具有規(guī)則的右手雙螺旋結(jié)構(gòu)，在螺旋結(jié)構(gòu)中，脫氧核糖和磷酸間隔排列組成主鏈，而堿基局限于螺旋內(nèi)部，并在A-T和C-G間以氫鍵相連配對。氫鍵結(jié)合力和相鄰堿基的堆集力有利于DNA維持雙螺旋構(gòu)型，而磷酸基的靜電斥力和堿基分子的內(nèi)能則不利于DNA維持雙螺旋構(gòu)型。這四種因素競爭的結(jié)果形成穩(wěn)定的DNA分子結(jié)構(gòu)。

Watson–Crick DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)在一定環(huán)境條件下，或在不同功能狀態(tài)下可以發(fā)生扭曲、旋轉(zhuǎn)、伸展等結(jié)構(gòu)變化，特別是細胞核內(nèi)的DNA常常與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，因此可以形成不同形態(tài)的DNA結(jié)構(gòu)，如A-、B-、Z等不同的構(gòu)象。不同構(gòu)象DNA的存在，對DNA的基本功能如復制和轉(zhuǎn)錄以及基因表達調(diào)控都是十分重要的。復制和轉(zhuǎn)錄時DNA雙鏈的解螺旋，轉(zhuǎn)錄因子與基因調(diào)控區(qū)特定結(jié)合序列的結(jié)合等都涉及蛋白質(zhì)對DNA特定構(gòu)型上的特定信息的解讀。

DNA除了存在特定的二級結(jié)構(gòu)以外，還形成不同的三級結(jié)構(gòu)。原核細胞和真核細胞的DNA在生理狀態(tài)下均存在超螺旋結(jié)構(gòu)形式。根據(jù)DNA每個螺旋的堿基對數(shù)目不同，超螺旋具有正超螺旋和負超螺旋兩種方向。所有的DNA超螺旋都是由DNA拓撲異構(gòu)酶產(chǎn)生。同時，在DNA發(fā)生同源重組過程中還成Holliday聯(lián)合體，在真核細胞中DNA雙螺旋還進一步與組蛋白包裝成核小體的結(jié)構(gòu)。

在化學和/或物理因素的影響下，核酸分子可發(fā)生變性，由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)甚至解旋成單鏈。凡能破壞有利于維持DNA雙螺旋構(gòu)型的因素，以及增強不利于維持DNA雙螺旋構(gòu)型的因素的各種理化條件都可以成為變性的原因。常用的DNA變性方法主要是熱變性和堿變性。核酸分子變性的過程可以逆轉(zhuǎn)，在適當條件下，變性DNA可以復性，兩條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)。

復性受到溫度、時間、DNA濃度以及DNA復雜性的影響。根據(jù)DNA變、復性的特點，可以針對特定序列的DNA設計探針，進行檢測特定DNA和RNA的定性、定量和定位的分子雜交研究。

第三章小結(jié)

從抽象符號到具體的化學本質(zhì)，人們對基因的理解隨著研究手段的發(fā)展而不斷深入。目前，人們不僅能從表型上去研究基因，而且能夠先克隆基因，再深入研究其結(jié)構(gòu)和功能，并且發(fā)現(xiàn)了諸如斷裂基因、重復片段、重疊基因、轉(zhuǎn)位基因和假基因等以各種形式存在的基因。真核生物基因是以單順反子的形式存在，編碼的是單基因產(chǎn)物；而原核生物基因卻是以多順反子的形式存在，由它轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的是一種大分子量的mRNA，可同時編碼兩種甚至數(shù)種基因產(chǎn)物。原核生物的基因和真核生物的基因都可以分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)。絕大多數(shù)真核生物其編碼區(qū)被非編碼區(qū)所打斷，稱為斷裂基因；但是絕大多數(shù)的原核生物，其編碼區(qū)則是連續(xù)的。當然，某些真核生物的基因也可能是連續(xù)，而某些原核生物中也有斷裂基因存在。基因的大小與外顯子沒有關系，而是決定于內(nèi)含子的大小和數(shù)目。內(nèi)含子越多，片段越長，則其基因越大。真核生物中，從酵母到人類，基因的平均大小略有增加。根據(jù)基因密度可推知基因組中基因的數(shù)目。生物從低等到高等，基因數(shù)目逐漸增加。真核生物基因組中來源相同，結(jié)構(gòu)相似，功能相關的一組基因，稱為基因家族。根據(jù)家族成員在染色體上的分布形式，基因家族又分為在染色體上串聯(lián)重復存在的基因簇和在染色體上散在分布的散在基因家族。除了能編碼蛋白的基因家族外，染色體上還存在大量無轉(zhuǎn)錄活性的重復DNA序列。根據(jù)重復單位的大小，一些高度重復序列又分為了衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星和微衛(wèi)星DNA。

基因組可分為原核生物基因組、真核生物基因組和細胞器基因組。原核生物基因組簡單，只有一個染色體組成，其類核外可能有質(zhì)粒DNA存在；細胞器基因組主要指真核生物的線粒體和葉綠體基因組，能夠合成部分所需的蛋白質(zhì)。真核生物的基因組比較復雜，可分為非重復序列、中度重復序列和高重復序列。非重復序列是獨特的，中度重復序列是分散但并非已知的拷貝，高重復序列是短的前后串聯(lián)重復序列。每個基因組中各成分所占比率不同，但較大的基因組非重復序列部分較少。復雜度描述了其中獨特序列的長度，重復頻率描述了每個序列重復的次數(shù)。C值矛盾描述了真核基因組中編碼潛力和DNA含量并非一致。大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因位于非重復DNA內(nèi)。非重復DNA的復雜度比總基因組能更好地反映生物的復雜程度，非重復DNA 最大復雜度達2×109 bp。人類基因組計劃自1990年啟動到現(xiàn)在，其基本任務已經(jīng)完成，成功繪制了人類的遺傳學和物理學圖譜，并完成人類基因組的全部測序工作。在繪制遺傳學圖譜時，主要用到的遺傳標記有RFLP、STR和SNP等。物理圖譜的繪制實際上是對DNA序列兩點間的實際距離的測定，用到的遺傳標記主要為STS。利用全基因組的“鳥槍法”測序策略，除了人類基因組序列外，還得到了數(shù)十幾種模式生物的基因組序列。

研究基因組的科學即為基因組學，包括結(jié)構(gòu)基因組學和功能基因組學。結(jié)構(gòu)基因組學的主要任務已經(jīng)完成，即人類基因組的作圖、測序和基因定位。目前，對基因組的研究進入了功能基因組學時代。功能基因組學以高通量、大規(guī)模實驗方法以及統(tǒng)計與計算機分析為特征。基因芯片、基因表達系列分析、定位克隆等都是功能基因組學的主流研究方法。蛋白質(zhì)組學是功能基因組學的一個分支，包括結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學和功能蛋白質(zhì)組學，采用的主要研究方法有蛋白質(zhì)分離中的2D電泳，蛋白質(zhì)分析中的質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)相互作用研究中用到的酵母雙雜交、蛋白質(zhì)芯片等等。功能基因組學的發(fā)展，尤其是蛋白質(zhì)組學的研究，都少不了生物信息學的支持，同時海量的數(shù)據(jù)也帶給了生物信息學巨大的挑戰(zhàn)。

第四章小結(jié)

DNA的生物合成有DNA復制和逆轉(zhuǎn)錄兩種手段。DNA復制是以DNA為模板合成相

＋同DNA分子的過程，其主要特征有：需要模板、四種dNTP和Mg2；被復制的區(qū)域必須進行解鏈；半保留復制；需要引物，作為引物的主要是短的RNA，少數(shù)是蛋白質(zhì)；復制的方向始終是5′→3′；具有固定的起點；多為雙向復制；半不連續(xù)性；高度有序、高度進行和高度忠實。

參與DNA復制的主要酶和蛋白質(zhì)有DNA聚合酶、解鏈酶、SSB、引發(fā)酶、拓撲異構(gòu)酶、連接酶和端聚酶等。

DNA聚合酶是參與DNA復制的主要酶。E.coli細胞中有DNA聚合酶I、II、III、IV和V。E.coli的DNA聚合酶I也稱為Kornberg酶，是一種多功能酶，具有5′→3′的聚合酶活性、5′→3′和3′→5′的核酸外切酶活性。使用特殊的蛋白酶處理聚合酶I得到的大片段稱為Klenow酶，具有3′→5′外切酶和5′→3′聚合酶活性，Klenow酶的手指-拇指-掌心三維結(jié)構(gòu)模式出現(xiàn)在許多具聚合酶上。聚合酶II也具有3′→5′外切酶活性，但無5′→3′外切酶活性，參與DNA的修復。聚合酶III由多個亞基組成，雖然也具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，但卻分屬不同的亞基。該酶是參與E.coli染色體DNA復制的主要酶。完整的聚合酶III由核心酶、滑動鉗和鉗載復合物組成。在DNA復制過程中，滑動鉗松散地夾住DNA模板，并能自由地向前滑動，大大提高了酶的進行性。DNA聚合酶IV和V屬于易錯的DNA聚合酶，參與DNA的修復合成。真核細胞中至少有15種以上的DNA聚合酶，除了5種發(fā)現(xiàn)較早的聚合酶α、β、γ、δ和ε以外，還發(fā)現(xiàn)了聚合酶ζ、δ、ε、θ、η、κ、ι、ψ和ξ等。這些新發(fā)現(xiàn)的聚合酶主要參與DNA的跨越合成。γ、δ、ε和ζ具有3′-外切酶活性。

DNA解鏈酶是一類催化DNA雙螺旋解鏈的酶，它除了能夠結(jié)合DNA以外，還能夠結(jié)合NTP并同時具有依賴于DNA的NTP酶活性。SSB是一種專門與DNA單鏈區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)，無任何酶的活性。

DNA拓撲異構(gòu)酶是一類通過催化DNA鏈的斷裂、旋轉(zhuǎn)和重新連接而直接改變DNA拓撲學性質(zhì)的酶。拓撲異構(gòu)酶被分I型和II型。I型在作用過程中，只能切開DNA的一條鏈，而II型在作用過程中同時交錯切開DNA的兩條鏈。參與DNA復制的是II型。所有拓撲異構(gòu)酶的作用都是通過兩次轉(zhuǎn)酯反應來完成的。

DNA引發(fā)酶是一種特殊的RNA聚合酶，用來合成RNA引物。原核細胞內(nèi)切除RNA的酶是DNA聚合酶I或核糖核酸酶H。真核細胞內(nèi)負責切除RNA引物的酶核糖核酸酶HⅠ/FEN1或FEN1/Dna2。

DNA連接酶是一類催化一個雙螺旋DNA內(nèi)相鄰核苷酸3′-羥基和5′-磷酸甚至兩個雙螺旋DNA兩端的3′-羥基和5′-磷酸發(fā)生連接反應形成3′,5′-磷酸二酯鍵的酶。DNA連接酶在催化連接反應時需消耗能量。有的連接酶使用 NAD+，有的使用ATP。

尿嘧啶-DNA糖苷酶是一種專門用來切除出現(xiàn)在DNA鏈上非正常U的水解酶。

端聚酶由蛋白質(zhì)和RNA組成，其中RNA部分序列充當模板，蛋白質(zhì)具有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，它所起的作用是復制端粒DNA，維持染色體端粒結(jié)構(gòu)的完整。

所有的DNA復制都可以分為起始、延伸、終止和分離三個階段。復制是以復制子為單位進行的。任何一個復制子都含有一個復制起始區(qū)。不同基因組DNA具有不同的復制子結(jié)構(gòu)，像細菌染色體、質(zhì)粒、噬菌體、病毒和線粒體基因組DNA都只有一個復制子，而真核細胞內(nèi)的每一個染色體DNA則含有多個復制子。

E.coli染色體DNA的復制為ζ復制，起始階段最重要的事件是對其復制起始區(qū)OriC的識別，直到形成引發(fā)體。在此階段涉及DnaA、DnaC、DnaT、DnaB、PriA、PriB、PriC和DnaG蛋白，它們按照一定的次序在OriC結(jié)合或解離，相互間具有招募作用。復制的延伸首先是復制體的形成，這需要聚合酶III全酶加入到引發(fā)體。一個雙向復制的復制子有兩個復制體。在每一個復制體上，同時進行前導鏈和后隨鏈的合成。在一個復制叉內(nèi)的聚合酶III全酶同時催化前導鏈和后隨鏈的合成，這是因為后隨鏈的模板在復制中形成突環(huán)結(jié)構(gòu)。復制結(jié)束于終止區(qū)，需要Tus蛋白的幫助。最后的兩個子代DNA分子的分離需要拓撲異構(gòu)酶IV。

某些噬菌體DNA和一些小的質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)以滾環(huán)復制方式擴增DNA，此外，真核細胞染色體DNA的局部擴增也可以通過這種方式進行；線粒體DNA、葉綠體DNA和少數(shù)病毒以D-環(huán)的方式進行復制。

真核細胞的細胞核DNA復制與原核細胞的染色體DNA復制不完全相同。參與細胞核DNA正常復制的聚合酶是α、δ和ε。前導鏈和后隨鏈的合成都經(jīng)歷了從DNA聚合酶α/引發(fā)酶復合物到PCNA/DNA聚合酶δ的轉(zhuǎn)換；FEN-1/RNaseH1負責切除RNA引物，DNA連接酶I負責連接相鄰的岡崎片段，拓撲異構(gòu)酶I負責清除復制叉移動中形成的正超螺旋，拓撲異構(gòu)酶IIa和IIb則負責將最后的2個以共價鍵相連的連環(huán)體DNA分開。

解決線形DNA末端復制難題的機制有：使用端聚酶、經(jīng)重組形成串聯(lián)體、將線形DNA暫時轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)形DNA、滾環(huán)復制，以及使用蛋白質(zhì)-dNTP作為引物。

DNA復制的調(diào)控主要在起始階段，原核細胞利用甲基化來調(diào)控，ColE1利用反義RNA進行調(diào)控，真核細胞內(nèi)存在兩種機制控制DNA復制的起動，一種是由執(zhí)照因子控制的正調(diào)控，另一種是由增殖蛋白控制的負調(diào)控。

逆轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板合成DNA的過程，它主要發(fā)生在逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活史之中。一個典型的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒按照從外到內(nèi)的次序，依次是外被、衣殼和基因組RNA。基因組RNA共有兩個拷貝，有逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶和tRNA引物與其結(jié)合。一個基因組RNA等同于一個全長的病毒mRNA。

HIV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，它是艾滋病的元兇。其宿主細胞主要包括：CD4-T淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞和樹突狀細胞，這些細胞都含有CD4蛋白和趨化因子受體。HIV的生活史包括：附著與融合；核心顆粒釋放和逆轉(zhuǎn)錄；原病毒DNA進入細胞核；整合；轉(zhuǎn)錄及后加工；轉(zhuǎn)錄物輸出到細胞質(zhì)；翻譯及翻譯后加工；新病毒裝配和出芽釋放。

逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶以tRNA為引物，具有三個酶活性： 5'→3'的依賴于RNA的DNA聚合酶活性，該活性用來催化負鏈DNA的合成；核糖核酸酶H活性，該活性用來水解tRNA引物和基因組RNA； 5'→3'的依賴于DNA的DNA聚合酶活性，該活性用來合成正鏈DNA。逆轉(zhuǎn)錄酶無3'→5'外切酶活性而缺乏校對能力。

逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄共經(jīng)歷7步反應，直至基因組RNA被轉(zhuǎn)變成兩端含有LTR（U3-R-U5）序列的雙鏈DNA。控制逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)錄的啟動子和增強子序列位于U3，在T淋巴細胞和巨噬細胞中含有與啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，只有在5'-端加上了U3以后，將來才可能在宿主細胞RNA聚合酶II的催化下得到全長的mRNA，再經(jīng)過后加工得到完整的基因組RNA。

其它與逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象有關的成分有：反轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、逆轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄內(nèi)含子、逆轉(zhuǎn)子、端聚酶催化的逆轉(zhuǎn)錄反應。某些DNA病毒的生活史中也有逆轉(zhuǎn)錄。

第五章小結(jié)

DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)使其成為細胞內(nèi)唯一的一種損傷后可被完全修復的生物大分子。導致DNA損傷的內(nèi)在因素有DNA復制過程中發(fā)生的錯誤、DNA結(jié)構(gòu)本身的不穩(wěn)定、細胞內(nèi)活性氧的破壞作用；屬于環(huán)境因素的有紫外輻射、離子輻射和各種化學誘變劑。

DNA損傷分為堿基損傷和DNA鏈的損傷。堿基損傷包括堿基脫落、轉(zhuǎn)換、修飾、交聯(lián)和錯配。DNA鏈的損傷包括DNA鏈的斷裂和交聯(lián)。

DNA修復可分為直接修復、切除修復、易錯修復和重組修復等。

直接修復是直接將損傷逆轉(zhuǎn)，通常只需要單一的酶。能夠被這種機制修復的損傷有嘧啶二聚體、6-烷基鳥嘌呤和某些簡單的DNA鏈斷裂。參與嘧啶二聚體直接修復的酶為光復活酶，此酶能夠直接識別和結(jié)合嘧啶二聚體，利用吸光色素捕捉到的光能將嘧啶二聚體打開，最后再與DNA解離。催化烷基化堿基直接修復的酶是烷基轉(zhuǎn)移酶，該酶以“自殺”的方式參與反應。DNA鏈斷裂的直接修復由DNA連接酶催化。

切除修復就是先切除損傷的堿基或核苷酸，然后以互補鏈為模板，重新合成正常的核苷酸，包括識別、切除、重新合成和重新連接等幾個階段。切除修復又分為BER和NER，前者直接識別具體的受損傷的堿基，而后者識別損傷對DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)造成的扭曲。

BER最初的切點一般是N-糖苷鍵，首先切除的受損傷的堿基，由DNA糖苷酶催化。堿基切除后在DNA分子上留下AP位點，AP位點被細胞內(nèi)的AP內(nèi)切酶識別后切除。隨后的修補合成有短修補和長修補兩種途徑，其中短修補是主要途徑。

NER最初的切點是損傷部位附近的3′,5′-磷酸二酯鍵，損傷以寡聚核苷酸的形式被切除。修復過程在所有的生物體內(nèi)都很相似，共包括5步：識別損傷、特殊的內(nèi)切酶在損傷部位的兩側(cè)切開DNA鏈、去除切口之間的帶有損傷的DNA片段、聚合酶填補缺口、連接酶重新縫合切口。NER分為GGR和TCR，前者負責修復整個基因組的損傷，速度慢，效率低；后者專門負責修復那些正在轉(zhuǎn)錄的基因在模板鏈上的損傷，速度快，效率高。兩類NER的主要差別在于識別損傷的機制，TCR識別損傷的是RNA聚合酶，當它轉(zhuǎn)錄到受損傷部位而前進受阻的時候，TCR即被起動。

MMR屬于是一種特殊的NER，主要用來修復DNA分子上錯配的堿基，也能修復一些因“復制打滑”而誘發(fā)的核苷酸插入或缺失。E.coli的MMR系統(tǒng)為甲基化導向的錯配修復，它利用甲基化來區(qū)分子鏈和母鏈的。

DNA雙鏈斷裂修復機制有精確性較高的同源重組和易錯的NHEJ。后者是人類修復雙鏈斷裂的主要方式，需要Ku70、K80、Artemis、DNA-PKCS、連接酶IV以及XRCC4。

損傷跨越僅僅是細胞面對DNA損傷做出的一種適應反應，損傷并沒有真正消失。反應的目的是為了維持復制的連續(xù)性，克服損傷對復制的阻礙。反應的手段一是通過重組，第二種是所謂的“跨越合成術”。重組跨越使用同源重組的方法將DNA模板進行交換以避免損傷對復制的抑制；跨越合成由專門的一般無校對能力的DNA聚合酶與取代停留在損傷位點上原來的催化復制的聚合酶，在子鏈上隨意插入核苷酸結(jié)果導致對損傷位點的跨越。

發(fā)生在DNA分子上可遺傳的結(jié)構(gòu)變化通稱為突變，分為點突變和移碼突變。點突變是指DNA 分子某一位點上所發(fā)生的堿基對變化，有轉(zhuǎn)換和顛換兩種形式。其后果取決于突變位置和具體的變換方式。根據(jù)突變的后果，發(fā)生在蛋白質(zhì)基因編碼區(qū)的點突變可分為沉默突變、錯義突變、無義突變和通讀突變。移碼突變是指在一個蛋白質(zhì)基因的編碼區(qū)發(fā)生的一個或多個核苷酸的缺失或插入，其危害性最大。

突變的原因有內(nèi)因和外因。由內(nèi)因引起的突變被稱為自發(fā)性突變，由外因引發(fā)的突變被稱為誘發(fā)突變。自發(fā)移碼突變的主要原因有“復制打滑”和轉(zhuǎn)座作用。誘發(fā)點突變的試劑有堿基類似物、烷基化試劑、脫氨基試劑和羥胺。誘發(fā)移碼突變的主要是能插入到堿基之間DNA嵌入試劑。

DNA突變在特定的情況下可以發(fā)生逆轉(zhuǎn)。如果在第一次突變位點上發(fā)生第二次突變，導致原來的表現(xiàn)型得到恢復，這樣的突變?yōu)榛貜屯蛔儯蝗绻l(fā)生在非起始突變位點上但能夠掩蓋或抵消起始突變的第二次突變，則稱為校正突變。校正突變又名假回復突變，有基因內(nèi)校正和基因間校正。基因內(nèi)校正與第一次突變發(fā)生在相同的基因內(nèi)，基因間校正發(fā)生在與第一次突變不同的基因上，通常在翻譯的水平上起作用。

第六章小結(jié)

DNA重組是指發(fā)生在DNA分子內(nèi)或DNA分子之間核苷酸序列的交換、重排和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，主要包括同源重組、位點特異性重組和轉(zhuǎn)座重組。

同源重組是兩個DNA分子的同源序列直接進行交換。細菌的接合、轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化和真核細胞的同源染色體之間的交換等都屬于同源重組。解釋同源重組的模型有Holliday 模型、Aviemore模型（單鏈斷裂模型）和雙鏈斷裂模型。三種模型在重組過程中形成χ狀的Holliday連接是一致的。同源重組的基本步驟包括：鏈斷裂與切除、鏈侵入、退火與合成、形成Holliday 結(jié)構(gòu)、Holliday連接的分離和交換。

重組是在特定的蛋白質(zhì)和酶的協(xié)助下完成的。參與E.coli同源重組有關的蛋白質(zhì)包括：RecA蛋白、RecBCD蛋白、RuvA、RuvB和RuvC蛋白等。RecA蛋白是同源重組中最重要的蛋白質(zhì)，它參與E.coli所有的同源重組途徑。RecA的主要功能有促進2個DNA分子之間鏈的交換，以及作為共蛋白酶促進LexA 阻遏蛋白的自我水解。RecBCD蛋白由RecB、RecC和RecD三個亞基組成，具有外切核酸酶V、解鏈酶、核酸內(nèi)切酶、ATP酶和單鏈DNA外切酶共五個酶活性。RecBCD蛋白的功能是參與細胞內(nèi)的RecBCD同源重組途徑。RuvA蛋白的功能是識別Holliday連接，協(xié)助RuvB蛋白催化分叉的遷移。RuvB蛋白是一個解鏈酶，其功能是催化Holliday連接中分叉的遷移。RuvC蛋白是一種特殊的核酸內(nèi)切酶，催化Holliday連接的分離，因此被稱為解離酶。

發(fā)生在E.coli的同源重組途徑有RecBCD途徑、RecF途徑和RecE途徑。真核生物的同源重組主要發(fā)生在細胞的減數(shù)分裂的前期I的兩個配對的同源染色體之間，其中，在細線期和合線期，形成聯(lián)會復合體，在粗線期進行交換。同源重組也會發(fā)生在DNA修復之中，用以修復DNA雙鏈斷裂、單鏈斷裂和鏈間交聯(lián)。適合真核生物同源重組的模型應該是雙鏈斷裂模型，參與同源重組的主要蛋白質(zhì)有Rad50、Mre11、Nbs1、Spo11、MSH4、Dmc1、PCNA、RPA和DNA聚合酶δ/ε等。

位點特異性重組是指在DNA特定位點上發(fā)生的重組，需要專門的蛋白質(zhì)識別發(fā)生重組的特異性位點并催化重組反應。位點特異性重組也發(fā)生鏈交換、形成Holliday連接、分叉遷移和Holliday連接解離。位點特異性重組可以發(fā)生在2個DNA分子之間，導致2個DNA分子之間發(fā)生整合。位點特異性重組也可以發(fā)生在1個DNA分子內(nèi)部，可能導致缺失或倒位。位點特異性重組的功能包括：調(diào)節(jié)噬菌體的整合、調(diào)節(jié)基因表達、調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育期間程序性的DNA重排。

轉(zhuǎn)座重組是指DNA上的核苷酸序列從一個位置轉(zhuǎn)位或跳躍到另外一個位置的現(xiàn)象，在原核生物和真核生物的基因組內(nèi)均可以發(fā)生，發(fā)生轉(zhuǎn)位或跳躍的核苷酸序列被稱為轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座子的靶點與轉(zhuǎn)座子并不存在序列的同源性，接受轉(zhuǎn)座子的靶位點可能是隨機的，也可能具有一定的傾向性，這與轉(zhuǎn)座子本身的性質(zhì)有關。轉(zhuǎn)座事件可導致基因組內(nèi)核苷酸序列發(fā)生轉(zhuǎn)移、缺失、倒位或重復。轉(zhuǎn)座子本身還可能作為細胞內(nèi)同源重組系統(tǒng)的底物。兩個轉(zhuǎn)座子之間發(fā)生的同源重組可導致缺失、插入、倒位和移位。細菌內(nèi)的轉(zhuǎn)座子分為插入序列、復雜型轉(zhuǎn)座子、復合型轉(zhuǎn)座子和Mu噬菌體四類。

轉(zhuǎn)座機制分為 “剪切”和“粘貼”機制以及“復制”和“粘貼”機制。原核轉(zhuǎn)座子與真核轉(zhuǎn)座子的差別主要反映在轉(zhuǎn)座的機制上：真核生物轉(zhuǎn)座過程中的剪切和插入是分開進行的，轉(zhuǎn)座子的復制很多通過RNA中間物來進行。根據(jù)轉(zhuǎn)座的機理將真核生物的轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)座子和DNA轉(zhuǎn)座子。反轉(zhuǎn)座子在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和轉(zhuǎn)位的方式上與逆轉(zhuǎn)錄病毒的復制相似。根據(jù)兩端的結(jié)構(gòu)，反轉(zhuǎn)座子可進一步分為LTR反轉(zhuǎn)座子和非LTR反轉(zhuǎn)座子。果蠅基因組上的Copia 元件和酵母體基因組上的 Ty元件屬于LTR反轉(zhuǎn)座子，LINE和SINE屬于非LTR反轉(zhuǎn)座子。DNA轉(zhuǎn)座子又分為復制型DNA轉(zhuǎn)座子和保留型DNA轉(zhuǎn)座子。每一類轉(zhuǎn)座子都有自主型和非自主型。自主型轉(zhuǎn)座子含有開放的閱讀框架，它們編碼轉(zhuǎn)座所必需的酶或蛋白質(zhì)；非自主型轉(zhuǎn)座子缺乏足夠的編碼能力，卻保留了轉(zhuǎn)座所必需的順式序列，在合適的自主型轉(zhuǎn)座子編碼的轉(zhuǎn)座酶的作用下，它們照樣可以進行轉(zhuǎn)座。

第七章小結(jié)

以DNA作為模板合成RNA的過程被稱為轉(zhuǎn)錄，它是基因表達的第一步。轉(zhuǎn)錄具有以下特征：發(fā)生在DNA分子上某些特定的區(qū)域；以四種NTP為原料，并需要Mg2+的激活；需要模板，需要解鏈，但不需要引物；第一個被轉(zhuǎn)錄的核苷酸通常是嘌呤核苷酸；轉(zhuǎn)錄的方向總是從5′→3′；具有高度的忠實性和進行性；轉(zhuǎn)錄是受到嚴格調(diào)控的。

參與轉(zhuǎn)錄反應的主要酶是RNAP，它不需要引物，缺乏3′-外切酶活性。在三維結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)上，RNAP類似于DNA聚合酶的“手掌”狀結(jié)構(gòu)。形成原核細胞RNAP只有一種，有核心酶和全酶兩種形式，全酶由核心酶α2ββ′ω和可變的ζ因子組裝而成，負責起始階段的反應，純粹的核心酶只負責延伸階段的反應。原核細胞RNAP特異性的抑制劑有利福霉素和利鏈霉素。在真核細胞有RNAPI、II和III，它們分別催化不同性質(zhì)的RNA的合成。真核RNAPII對α-鵝膏蕈堿高度敏感。所有的真核細胞RNAPII最大亞基的羧基端都含有一段7個富含羥基氨基酸殘基組成的高度重復的序列，為CTD，CTD的磷酸化參與調(diào)節(jié)RNAPII的活性。

轉(zhuǎn)錄過程分為起始、延伸和終止三個階段。轉(zhuǎn)錄起始階段最重要的事件是識別啟動子，形成轉(zhuǎn)錄起始復合物。原核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中，RNAP能夠直接識別啟動子。而真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)之中，直接識別啟動子序列的是特定的轉(zhuǎn)錄因子。原核生物屬于啟動子的序列通常包含稱為“－35”區(qū)和Pribnow盒（或－10區(qū)），其中－35區(qū)的一致序列為TTGACA，Pribnow盒的一致序列是TATAAT。起始復合物的形成為轉(zhuǎn)錄的限速步驟，起始頻率主要取決于啟動子強度。一旦啟動發(fā)生，RNA合成的速度與啟動子強度無關。轉(zhuǎn)錄的起始實際上是RNAP與啟動子相互作用并形成活性轉(zhuǎn)錄起始復合物的過程，E.coli轉(zhuǎn)錄起始反應依次為： RNAP全酶與dsDNA非特異性結(jié)合；全酶與啟動子形成封閉復合物；封閉復合物異構(gòu)化成開放復合物；形成第一個磷酸二酯鍵；啟動子清空。在E.coli中，當ζ因子釋放后，轉(zhuǎn)錄即進入延伸階段。失去ζ因子的核心酶通過“滑動鉗”構(gòu)象握住DNA，以更快的速度沿著DNA模板鏈向前移動，催化RNA鏈的延伸。原核系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄的終止有兩種方式：一種依賴于被稱為ρ因子；另一種方式則不需要ρ因子，而需要RNA轉(zhuǎn)錄物3′-端的終止子序列。轉(zhuǎn)錄的忠實性除了聚合酶本身的高度選擇性以外，還與轉(zhuǎn)錄過程中的校對機制有關。轉(zhuǎn)錄校對有兩種方式：一種是焦磷酸解編輯，使用聚合酶的活性中心，以逆反應形式，通過重新參入焦磷酸，催化錯誤插入的核苷酸的去除；另一種是水解編輯，需要聚合酶倒退一到幾個核苷酸，然后通過GreA和GreB切除 3′-端幾個核苷酸，包括錯配的核苷酸。

真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)與原核系轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的差別有：染色質(zhì)和核小體結(jié)構(gòu)對轉(zhuǎn)錄有深刻的影響；真核細胞RNAP高度分工；需要許轉(zhuǎn)錄因子；啟動子以外的序列參與調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄；轉(zhuǎn)錄與翻譯不存在偶聯(lián)關系；轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物多為單順反子。

真核細胞RNAPI負責28S rRNA、18S rRNA和5.8S rRNA的基因轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄的場所為核仁。這三種rRNA共享一個啟動子，由核心啟動子上游啟動子元件組成。轉(zhuǎn)錄需要UBF和SL1兩種轉(zhuǎn)錄因子。UBF作為組裝因子，SL1作為定位因子將聚合酶I招募到啟動子上。轉(zhuǎn)錄的終止于一個分散的由18個nt組成的終止子區(qū)域，需要轉(zhuǎn)錄終止因子。

RNAPIII負責小分子RNA的轉(zhuǎn)錄，包括tRNA、5S rRNA、7S RNA、snoRNA和無帽子結(jié)構(gòu)的snRNA和某些病毒的mRNA等。轉(zhuǎn)錄需要的轉(zhuǎn)錄因子有TFIIIA、B和C。其中TFIIIC為組裝因子，TFIIIB為定位因子。轉(zhuǎn)錄終止與原核生物不需要ρ因子的終止機制相似。

RNAPII負責催化mRNA、具有帽子結(jié)構(gòu)的snRNA和某些病毒RNA的轉(zhuǎn)錄。控制蛋白質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄順式作用元件包括核心啟動子、調(diào)控元件、增強子和沉默子。屬于核心啟動子的原件有：TATA盒、起始子、TFIIB識別元件、下游啟動子元件和GC盒。調(diào)控元件的作用需要特殊的反式作用因子的結(jié)合。增強子是一種能夠大幅度增強基因轉(zhuǎn)錄效率的順式作用元件，沉默子則是一種抑制基因表達的順式作用元件。增強子和沉默子的作用與距離、方向、位置均無關，對臨近的基因作用最強。參與蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子有所有的蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄都需要的基礎轉(zhuǎn)錄因子和特定基因轉(zhuǎn)錄才需要特異性轉(zhuǎn)錄因子。已知的基礎轉(zhuǎn)錄因子有TFIIA、B、D、E、F、H和J等。轉(zhuǎn)錄因子和RNAPII與啟動子結(jié)合的可能次序是：TFIID→TFIIA→TFIIB→(TFIIF + RNAP II)→TFIIE→TFIIH。

第八章小結(jié)

基因轉(zhuǎn)錄的直接產(chǎn)物在細胞內(nèi)必須經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄后加工才會轉(zhuǎn)變成有活性的成熟RNA分子。RNA經(jīng)歷的后加工反應主要有：去除或填加某些核苷酸序列，修飾某些特定的核苷酸。

原核系統(tǒng)的mRNA很少經(jīng)歷后加工。原核細胞的rRNA前體的后加工主要是剪切、修剪和核苷酸的修飾。原核細胞的三種rRNA和某些tRNA作為一個共轉(zhuǎn)錄物被轉(zhuǎn)錄，需要通過剪切將三種rRNA從共轉(zhuǎn)錄物中釋放出來。剪切和修剪涉及核糖核酸酶有III、D、P、F、E、M16、M23和M5等。核苷酸的修飾主要形式為核糖2′-羥基的甲基化，它發(fā)生在剪切和修剪反應之前。原核細胞tRNA前體的后加工方式也包括剪切和修剪以及核苷酸的修飾。其中的核糖核酸酶P由M1RNA和蛋白質(zhì)組成。核苷酸的修飾主要集中在堿基上。已發(fā)現(xiàn)tRNA上的堿基修飾有近百種方式。

真核細胞的細胞核mRNA前體所經(jīng)歷的后加工反應主要包括5′-端“戴帽”、3′-端“加尾”、內(nèi)部甲基化、剪接和編輯。戴帽和加尾僅發(fā)生在mRNA和某些snRNA，這與聚合酶II的CTD發(fā)生特異的磷酸化有關。

帽子與第一個被轉(zhuǎn)錄的核苷酸之間以5′,5′三磷酸酯鍵相連，有0型、1型和2型。加帽反應是一種共轉(zhuǎn)錄反應。尾巴是指大多數(shù)真核細胞核mRNA的3′-端含有一段多聚腺苷酸序列，是在轉(zhuǎn)錄后填加上去的。由兩種因素控制加尾反應：一種位于mRNA前體內(nèi)部，為一段6核苷酸序列，充當加尾信號，其一致序列為AAUAAA；另一種為識別加尾信號的蛋白質(zhì)或催化加尾反應的酶，包括剪切/多聚腺苷酸化特異性因子、剪切刺激因子、剪切因子I和II、poly A聚合酶，以及poly A結(jié)合蛋白。剪接就是去除內(nèi)含子，連接外顯子的過程。真核細胞mRNA前體的剪接是高度精確的。其精確性取決于兩個因素：其一是位于外顯子和內(nèi)含子交界處的剪接信號；其二是5種snRNP。

真核細胞內(nèi)有主要剪接途徑和次要剪接途徑。在主要剪接途徑中，剪接信號的一致序列是內(nèi)含子的前兩個GU和最后兩個AG，此外還包括在3′-SS不遠處存在的一段主要由11個嘧啶堿基組成的序列，還有內(nèi)含子中間還有一段被稱為分支點的一致序列。參與剪接反應snRNP有U1、U2、U4、U5和U6。其中U1負責識別5′-SS的信號；U2的主要識別分支點。U2與U6之間通過配對形成兩段雙螺旋，對于剪接反應非常重要；U5能夠與一個外顯子的最后一個核苷酸以及下一個外顯子的第一個核苷酸結(jié)合，從而有助于將兩個相鄰的外顯子并置在一起；U6既能與內(nèi)含子的5′-端互補配對，也能夠與U4配對。U4和U6之間的配對導致兩者形成緊密的復合物。次要剪接途徑的位于內(nèi)含子和外顯子的剪接信號為AT-GC，參與剪接的snRNP有U11、U12、U4atac、U6atac和U5。剪接反應發(fā)生在剪接體。而剪接體主要是由mRNA前體、mRNA前體結(jié)合蛋白和5種snRNP在細胞核內(nèi)按照一定的次序組裝起來的超分子復合物。剪接反應是2次連續(xù)的轉(zhuǎn)酯反應。剪接體的組裝是一個有序和耗能的過程，而且剪接體本身又處在動態(tài)變化過程中。同一種Pre-mRNA的不同剪接方式被稱為選擇性剪接，選擇性剪接可導致一個基因編碼出兩種或兩種以上的蛋白質(zhì)。在某些生物體內(nèi)（錐體蟲和線蟲），剪接能發(fā)生在兩種不同的mRNA前體分子之間，這樣的剪接被稱為反式剪接。

編輯是指在mRNA 的編碼區(qū)內(nèi)引入或丟失任何與其基因編碼鏈序列不同信息的過程。它主要有兩種方式：一種是在編碼區(qū)內(nèi)增加或減少一定數(shù)目的核苷酸（主要是U）；另外一種是編碼區(qū)的堿基在RNA水平上發(fā)生轉(zhuǎn)換或顛換。編輯的機理因編輯方式的不同而不同，核苷酸的插入或缺失一般需要gRNA引導，而堿基的轉(zhuǎn)換或顛換則需要特殊的核苷酸脫氨酶的催化。編輯都需要一系列特殊蛋白質(zhì)的參與，形成所謂的編輯體，以識別、結(jié)合和加工編輯點，保證編輯的忠實性。編輯的意義是調(diào)節(jié)基因表達、創(chuàng)造起始密碼子或終止密碼子等。

真核生物rRNA前體的后加工包括剪切、修剪和修飾，有的還需要剪接。一般需要snoRNA。某些snoRNAs 參與rRNA初級轉(zhuǎn)錄物剪切成個別rRNA，但絕大多數(shù)snoRNA是通過其特定序列與rRNA前體上修飾位點周圍序列的互補配對來確定修飾位點。在核苷酸修飾的同時或結(jié)束以后，rRNA前體在特定的核酸酶的催化下進行剪切和修剪。

四膜蟲26S rRNA前體含有內(nèi)含子，其后加工包括剪接。此類內(nèi)含子的切除需要鳥苷或鳥苷酸充當輔助因子，但不需要剪接體和任何其它的蛋白質(zhì)的參與，完全是一種自我催化的過程。四膜蟲rRNA前體中的內(nèi)含子同時被稱為第一類內(nèi)含子。起催化作用的是由414個核苷酸組成的內(nèi)含子。除了第一類內(nèi)含子以外，還有第二類內(nèi)含子、第三類內(nèi)含子和tRNA內(nèi)含子。第一類內(nèi)含子和第二類內(nèi)含子的切除不需要任何蛋白質(zhì)因子的參與，完全是一種自我催化，屬于核酶；第三類內(nèi)含子的去除需要SnRNP的幫助，并在剪接體內(nèi)發(fā)生的；tRNA中的內(nèi)含子非常短，通常為10-20 nt，無一致序列。對于真細菌，tRNA內(nèi)含子屬于第一類或第二類內(nèi)含子，但在真核生物和古細菌，tRNA剪接由一系列專門的蛋白質(zhì)組成的酶按照一定的次序進行催化。

真核生物tRNA前體的后加工方式包括剪切、修剪、堿基修飾、添加CCA和剪接。其中剪切、修剪和堿基修飾與原核系統(tǒng)相似。而添加CCA和tRNA剪接則是真核系統(tǒng)所特有的兩種后加工方式。

第九章小結(jié)

蛋白質(zhì)的生物合成也稱為翻譯，參與翻譯的主要成分有核糖體、mRNA、各種氨酰-tRNA、一種特殊的起始tRNA、起始因子、延伸因子和終止因子。

核糖體含有多個功能部位，包括A部位、P部位、E部位、肽酰轉(zhuǎn)移酶、mRNA結(jié)合部位、多肽鏈離開通道、一些可溶性蛋白質(zhì)因子的結(jié)合部位。在蛋白質(zhì)生物合成中起決定性作用的是rRNA，其肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性由大亞基的23S rRNA承擔。

mRNA作為翻譯的模板，在其分子上至少含有一個ORF。每一個ORF一般以起始密碼子AUG開始，終止密碼子UAG、UGA或UAA結(jié)束。原核生物的mRNA通常是多順反子，含有幾個ORF，每一個ORF可翻譯出一種蛋白質(zhì)，而真核生物mRNA為單順反子，只有一個ORF，一般只翻譯出一種蛋白質(zhì)。

tRNA負責攜帶特定的氨基酸通過其反密碼子去閱讀mRNA上的密碼子。決定某一種tRNA接受氨基酸專一性的主要因素是tRNA分子上由幾個核苷酸甚至一個核苷酸組成的正、負元件。

氨基酸與tRNA形成氨酰-tRNA的過程被稱為氨基酸的活化。活化反應由特定的aaRS催化，共消耗2個ATP。催化反應的每一種aaRS面對兩種不同的底物都表現(xiàn)出高度的特異性，以確保能夠識別和結(jié)合正確的tRNA與正確的氨基酸，從而合成正確的氨酰-tRNA。氨酰-tRNA合成酶使用“雙篩”機制盡可能降低誤載的氨酰-tRNA的生成。

起始因子、延伸因子、釋放因子和核糖體循環(huán)因子分別參與翻譯的起始、延伸、肽鏈釋放和核糖體循環(huán)。其中的某些蛋白質(zhì)因子為G蛋白，其功能的發(fā)揮需要結(jié)合和水解GTP。

自然界存在原核翻譯系統(tǒng)、真核細胞質(zhì)翻譯系統(tǒng)、葉綠體翻譯系統(tǒng)和線粒體翻譯系統(tǒng)。所有的翻譯系統(tǒng)都具有以下特征：以mRNA為模板，tRNA為運載氨基酸的工具，核糖體為翻譯的場所；閱讀mRNA的方向都是從5′-端→3′-端，多肽鏈延伸的方向是從N-端→C-端；使用三聯(lián)體密碼；正確的氨基酸的參入取決于密碼子與反密碼子之間的相互作用，與tRNA所攜帶的氨基酸無關；遵守擺動規(guī)則。

翻譯可分為氨基酸的活化、起始、延伸、終止和釋放。在原核生物的氨基酸活化階段，除了形成各種氨酰-tRNA以外，還要形成fMet-tRNAfMet，由它閱讀起始密碼子。翻譯的起始階段發(fā)生的主要事件是起始密碼子的識別和起始復合物的形成。

原核起始密碼子的識別主要是依賴于mRNA的5′-端的SD序列與16S rRNA3′-端的一段反SD序列之間的互補配對。SD序列是mRNA分子上位于起始密碼子上游的一段富含嘌呤堿基的序列。此外，mRNA分子上的特殊的二級結(jié)構(gòu)對起始密碼子的識別也有影響。起始復合物的形成需要IF-

1、IF-2和IF-3的幫助。在形成的三元復合物中，起始密碼子正好處于P部位，而fMet-tRNAfMet通過密碼子與反密碼子的互補作用定位于P部位，A部位是空著的。肽鏈的合成進入延伸階段以后，發(fā)生的主要事件是進位、轉(zhuǎn)肽和移位且不斷的循環(huán)。進位需要EF-Tu和ET-Ts，轉(zhuǎn)肽由23SrRNA催化，移位由EF-G催化。正在合成的多肽鏈通過一個狹窄的出口通道離開核糖體。當終止密碼子進入A部位以后，RF1或RF2便識別并結(jié)合上去，RF3·GTP促進RF1和RF2的作用。核糖體上的肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性受到釋放因子的作用發(fā)生改變，它將肽酰基轉(zhuǎn)移給水分子，肽鏈因此被釋放出來。隨后空載的tRNA離開核糖體，釋放因子因為與RF3結(jié)合的GTP水解而得以釋放。最后，在RRF的幫助下，核糖體與mRNA解離。

真核生物翻譯過程與原核生物的差別有：核糖體的結(jié)構(gòu)不同；原核生物的翻譯和轉(zhuǎn)錄是緊密偶聯(lián)的，而真核生物的轉(zhuǎn)錄和翻譯不存在偶聯(lián)關系；真核起始tRNA并不進行甲酰化；起始密碼子的識別機制不同；起始tRNA與小亞基的結(jié)合先于mRNA；起始階段不僅需要GTP，還需要ATP；起始因子種類與結(jié)構(gòu)比原核生物要復雜得多；還沒有證據(jù)表明肽酰轉(zhuǎn)移酶活性由rRNA承擔；釋放因子有2種；對抑制劑的敏感性不同。

真核生物的翻譯的起始分為四個階段：mRNA的準備和檢查；Met-tRNAiMet 與核糖體小亞基的結(jié)合；小亞基復合物與mRNA復合物結(jié)合后通過掃描發(fā)現(xiàn)起始密碼子。一些病毒病毒使用內(nèi)部進入識別起始密碼子；大亞基的結(jié)合與起始因子的解離。

真核生物的肽鏈延伸反應與原核生物相似，同樣不斷地經(jīng)歷進位、轉(zhuǎn)肽和移位反應，只是由eEF-1代替了EF-Tu和EF-Ts，eEF-2代替了EF-G，轉(zhuǎn)肽酶的活性似乎由核糖體蛋白提供。在真菌中，還需要第三種延伸因子eEF-3的參與。

真核生物的肽鏈終止反應只有2個釋放因子，其中eRF1識別所有的3種終止密碼子。線粒體和葉綠體內(nèi)發(fā)生的翻譯更接近原核生物，但是它們也各有自己特有的性質(zhì)。細胞有專門的質(zhì)量控制機制處理異常的mRNA，以防止錯誤的翻譯產(chǎn)物的在細胞內(nèi)的堆積。原核細胞對喪失終止密碼子的mRNA使用tmRNA進行搶救翻譯，以釋放出核糖體以及水解異常的多肽產(chǎn)物。真核細胞對于異常mRNA控制的機制有兩種，一種是無義介導的mRNA降解，另一種無終止mRNA降解。

細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)在不斷地合成或分解。在真核細胞中，主要存在兩套蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)：一套是溶酶體系統(tǒng)，不依賴于ATP，另一套是蛋白酶體系統(tǒng)，依賴于ATP，還需要泛素，而降解的真正場所是在蛋白酶。蛋白質(zhì)的泛酰化有單泛酰化、多重單泛酰化和多聚泛酰化三種形式。通過泛素Lys48殘基的多聚泛酰化參與蛋白酶體的降解，實際上，多泛素鏈的形成是將需要降解的蛋白質(zhì)打上“死亡標簽”，它似乎是靶蛋白進入蛋白酶體進行降解的先決條件。細菌既沒有泛素，也缺乏與蛋白酶體相關的蛋白質(zhì)，但也存在依賴于ATP的蛋白酶降解系統(tǒng)。

第十章小結(jié)

細胞內(nèi)剛翻譯好的產(chǎn)物還需經(jīng)歷后加工、定向和分揀等過程，才能最終成為有功能的蛋白質(zhì)。翻譯后加工反應來主要包括：多肽鏈的剪切、N-端添加氨基酸、蛋白質(zhì)的剪接、氨基酸的修飾、添加輔助因子和寡聚化。

多肽鏈的剪切是在特殊的蛋白酶催化下進行的。通過剪切反應，許多蛋白質(zhì)丟掉一些已經(jīng)無用的氨基酸序列，如信號序列的切除，還有許多蛋白質(zhì)只有去除一些氨基酸序列以后才有活性，如酶原的水解激活和激素原轉(zhuǎn)變?yōu)榧に氐取Ｄ承┑鞍踪|(zhì)在翻譯以后以多聚蛋白質(zhì)的形式存在，或者與其它蛋白質(zhì)融合在一起，需要通過剪切才能釋放出來。

N-端添加氨基酸是在特定的氨酰-tRNA:蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移酶的催化下進行的，添加氨基酸的場所并不在核糖體上。

蛋白質(zhì)剪接是指一條多肽鏈內(nèi)部的內(nèi)蛋白子序列被去除，兩側(cè)的外蛋白子的序列重新被連接起來的翻譯后加工方式。剪接反應經(jīng)歷一種分枝蛋白中間體，是一種自催化反應。

氨基酸的修飾包括對肽鏈N-端或C-端的修飾以及對各種氨基酸側(cè)鏈的修飾。氨基酸修飾的主要形式有：磷酸化、糖基化、脂酰基化、異戊二烯化、羥基化、泛酰化、ADP-核糖體基化、甲基化、酰胺化、乙酰化、甲酰化、γ羧基化、碘基化、焦谷氨酰化、硫酸化、GPI附著、腺苷酸化、小泛素相關修飾物修飾

多肽鏈的折疊有時也可視為后加工的一種方式。體內(nèi)一個蛋白質(zhì)的折疊總結(jié)起來有五點：正確折疊的信號包含在其一級結(jié)構(gòu)之中；不同種類的蛋白質(zhì)具有不同的折疊途徑；體內(nèi)絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的折疊需要分子伴侶的幫助；某些蛋白質(zhì)折疊還需要肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶或蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的幫助；非折疊蛋白會誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過載反應。

蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的定向和分揀可用信號學說進行解釋。其主要內(nèi)容是：各種蛋白質(zhì)在細胞中的最終定位是由蛋白質(zhì)本身所具有的特定氨基酸序列決定的。這些特殊的氨基酸序列起著一種信號的作用，稱為信號序列。信號序列能夠被細胞中的特殊成分識別，由此啟動定向和分揀的過程。如果一個蛋白質(zhì)缺乏任何一種信號序列，則會留在細胞液。整個定向和分揀的過程可分為三步：識別、移位和成熟。

細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)定向和分揀有兩種途徑，一種是共翻譯途徑，另一種是翻譯后途徑。細胞膜蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白、分泌蛋白和溶酶體蛋白為共翻譯定向，這些蛋白質(zhì)的信號肽序列一般位于N-段，富含疏水氨基酸殘基。轉(zhuǎn)位過程需要SRP。膜蛋白和可溶性蛋白的移位過程有所不同，其中前者還可能含有停止轉(zhuǎn)移序列，其作用是阻止肽鏈的進一步移位而讓肽鏈在信號序列被切除以后仍然錨定在膜上。

由細胞核基因編碼的定位于線粒體、質(zhì)體、細胞核和過氧化物酶體的蛋白質(zhì)基本上屬于翻譯后定向。某些蛋白質(zhì)具有雙重的定位信號（其中有一種定位信號比較隱蔽），這樣的蛋白質(zhì)可定位到不同的細胞器。進入線粒體的蛋白質(zhì)信號序列位于N-端。為了便于將來的跨膜轉(zhuǎn)運，細胞質(zhì)中的分子伴侶與蛋白質(zhì)前體結(jié)合，以防止其提前折疊。分子伴侶在細胞液和細胞器分別執(zhí)行不同的功能：在細胞液阻止蛋白質(zhì)折疊，維持蛋白質(zhì)處于一種細長的、容易跨膜的伸展狀態(tài)，而在細胞器，卻是促進蛋白質(zhì)折疊成有功能的形式。蛋白質(zhì)進入葉綠體的過程與蛋白質(zhì)進入線粒體很相似，但也有不同：分揀和定位更加復雜；參與跨膜運輸?shù)耐ǖ琅c參與線粒體膜運輸?shù)牡鞍踪|(zhì)無同源性；輸入到線粒體基質(zhì)的蛋白質(zhì)需要跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子梯度。蛋白質(zhì)定位于細胞核信號序列NLS位于多肽鏈的內(nèi)部，主要由一些堿性氨基酸殘基組成。核蛋白不是直接通過膜的轉(zhuǎn)運，而是通過核孔復合物，以完全折疊的狀態(tài)進入的。指導蛋白質(zhì)進入過氧化物酶體的信號序列PTS一般位于肽鏈的C-端，其一致序列為SKL，進入過氧化物酶體蛋白質(zhì)在細胞液已完全折疊成有功能的形式。

細菌也需要將它的某些蛋白質(zhì)輸送到外膜、內(nèi)膜、外周腔或胞外的培養(yǎng)基上。這些需要被輸送出細胞質(zhì)的蛋白質(zhì)在N-端也含有特殊的信號序列。在原核細胞里也發(fā)現(xiàn)了SRP，也發(fā)現(xiàn)分子伴侶結(jié)合需要轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)。

第十一章小結(jié)

基因表達的調(diào)控主要集中在轉(zhuǎn)錄水平、RNA轉(zhuǎn)錄物的選擇性后加工水平和翻譯水平。由于原核生物細胞容量有限，能獲得的物質(zhì)和能量也有限，其基因表達的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。

原核生物的基因多數(shù)以操縱子的形式組成基因表達調(diào)控的單元，操縱子是原核生物基因表達調(diào)控最重要的形式。組成操縱子的最基本的元件包括結(jié)構(gòu)基因群、啟動子、操作子、調(diào)節(jié)基因和終止子。

大腸桿菌乳糖操縱子是第一個被發(fā)現(xiàn)的操縱子，由一個調(diào)節(jié)基因（i）、操作子（o）和三個結(jié)構(gòu)基因（z、y 和a）組成。在沒有乳糖的環(huán)境中，lac操縱子處于阻遏狀態(tài)，低水平、組成型表達產(chǎn)生阻遏蛋白，同乳糖操縱子的操縱子區(qū)域結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的進行。在有乳糖的環(huán)境中，誘導物與R結(jié)合，使R構(gòu)象變化，失去與ｏ的親和力，結(jié)構(gòu)基因開始轉(zhuǎn)錄這就是乳糖對lac操縱子的誘導作用。乳糖操縱子中還有CAP結(jié)合位點，CAP-cAMP起正調(diào)控作用。隨后，又發(fā)現(xiàn)了多個操縱子，如阿拉伯糖操縱子，其調(diào)控蛋白具有正調(diào)控和負調(diào)控功能；具有雙啟動子的大腸桿菌gal操縱子，以及可阻遏的色氨酸操縱子。

結(jié)構(gòu)基因起始轉(zhuǎn)錄后，細胞還可以根據(jù)細胞內(nèi)表達產(chǎn)物的含量通過衰減作用對轉(zhuǎn)錄進行進一步的調(diào)控。衰減子由轉(zhuǎn)錄出的RNA中的幾個區(qū)域組成，是在RNA聚合酶起始合成后控制轉(zhuǎn)錄的進行。前導序列位于操縱子第一個編碼區(qū)起始位點之前。衰減子序列包含編碼前導肽的密碼子，這段RNA能夠形成多個不同穩(wěn)定性的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，對翻譯的終止起到調(diào)節(jié)作用。

原核生物的基因表達還有時序調(diào)節(jié)。在λ噬菌體中，是通過抗終止作用，調(diào)控從早期基因的表達轉(zhuǎn)換到下一個區(qū)域基因的表達。

群體感應是細菌根據(jù)細胞密度變化進行基因表達調(diào)控的一種生理行為。具有群體感應的細菌能產(chǎn)生并釋放被稱為自體誘導物的信號分子，它隨著細胞密度增加而同步增加。當自體誘導物積累到一定濃度時會改變細菌特定基因的表達，與特異的靶基因啟動子結(jié)合，從而激活目的基因的轉(zhuǎn)錄，改變細菌的一系列生理活性。

RNA也可以調(diào)節(jié)基因的表達。核開關最初由耶魯大學的分子生物學家Ronald Breaker和他的同事提出的。這種RNA分子同特異蛋白結(jié)合后能夠改變它的形狀，從而打開或關閉基因的表達。所有已知的核開關都會折疊形成RNA二級結(jié)構(gòu)，有一個莖，一個中心多環(huán)和幾個分支發(fā)夾結(jié)構(gòu)。核開關在細菌中廣泛存在。核開關是mRNA所形成的調(diào)節(jié)基因表達的結(jié)構(gòu)。與其它的RNA調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)不同，它們調(diào)節(jié)基因表達的機制為同小分子效應物直接作用，形成可變的結(jié)構(gòu)，從而打開或關閉基因的表達。核開關還可以進行翻譯水平的調(diào)控。此外，還有的核開關的作用機制與核酶的作用類似。核開關調(diào)節(jié)許多代謝途徑的表達，包括維生素（如核黃素、硫氨素和鈷胺素）的生物合成途徑以及Met、Leu和嘌呤的合成等。在古細菌和真核生物中也發(fā)現(xiàn)有核開關的存在。

除核開關外，mRNA高級結(jié)構(gòu)可以影響翻譯的進行，還可以通過影響mRNA的壽命進行基因表達的調(diào)節(jié)已經(jīng)早已被人們所認識。反義RNA是指與靶RNA（多為mRNA）具有互補序列的RNA分子，它通過與靶RNA進行堿基配對結(jié)合的方式參與基因表達的調(diào)控。現(xiàn)在反義RNA技術已經(jīng)有了廣泛的應用。

當細菌生長在饑餓的條件下，特別是缺乏維持蛋白質(zhì)合成的氨基酸時，還可以通過嚴謹反應，將大部分代謝活動都關閉掉。這是它們抵御不良條件，保存自己的一種機制。細菌通過僅僅維持最低量的活性來節(jié)約其資源，直到條件改善時，它們又恢復活動，所有代謝區(qū)域也都活躍起來。

第二篇：2012年分子生物學組實習小結(jié)

分子生物學室實習報告

前言

分子診斷學作為一門新興的學科，在疾病的診斷、療效監(jiān)測等多方面都逐漸扮演起了重要的角色，但真正能很好的將分子生物學診斷信息運用好的醫(yī)務工作者還只是少數(shù)，不少醫(yī)生目前仍對傳統(tǒng)的檢驗項目的臨床意義和可信度仍然懷有質(zhì)疑的態(tài)度，更不用說一些剛發(fā)展起來的檢驗項目。因此檢驗專業(yè)的實習生不僅要掌握分子診斷學常用檢驗項目的原理、方法，更應該孰知其臨床意義，更好的與臨床進行溝通，才能更好的運用先進的檢驗診斷技術為患者服務。實習目的：

熟悉分子室常規(guī)的檢查項目，掌握標本的簽收和處理，掌握PCR的原理，核酸（DNA和RNA）的提取，PCR儀的使用，熟悉核酸雜交的原理和操作方法及雜交儀的使用。了解各檢測項目的臨床意義。

實習內(nèi)容：

1．HBV DNA檢測（定性和定量）、HCV RNA檢測（定量）：核酸提取是擴增前最主要的步驟，每個環(huán)節(jié)都要注意防止交叉污染。主要步驟：每個EP管加100微升DNA濃縮液，再加100微升待測血清，震蕩混勻，離心12000rpmx10min，用加樣槍棄上清，加30微升DNA提取液，震蕩，金屬浴（100℃）10min，離心12000 rpmx5min。提取后，配試劑，加樣，擴增1h45min，擴增儀型號為7300。分析結(jié)果。注意，金屬浴過程中，金屬浴箱要蓋上，每個EP管要蓋嚴，防止加熱過程中發(fā)生爆管，造成實驗室的污染。若發(fā)生爆管，詳細記錄好發(fā)生爆管的標本編號，爆管發(fā)生的原因，時間等情況。HSV-II型病毒DNA檢測（定量）、HPV病毒（6、11型和16、18型）DNA檢測（定量）的標本均為分泌物，標本加生理鹽水，震蕩，取1ml至EP管，離心12000rpmx5min，棄上清，注意沉淀易漂起，不要講沉淀棄掉，加50微升DNA提取液，震蕩，金屬浴（100℃）10min。然后配試劑，加樣，擴增1h20min，PCR儀為7600。檢驗結(jié)果需要與患者的病史、臨床信息綜合分析，絕對不可僅僅只憑PCR結(jié)果進行疾病的診斷。2．核酸雜交 主要是指HPV21型檢測，標本多為女性的陰道分泌物，首先提取DNA，進行核酸體外擴增，得到擴增產(chǎn)物，然后金屬浴煮沸，淬火，得到大量單鏈的DNA片段，將單鏈DNA片段加入到500微升雜交液中（之前的DNA提取及淬火等操作在標本處理間進行，擴增在核酸擴增間進行），并到產(chǎn)物分析間進行核酸的雜交，每臺雜交儀可一次做15個標本，應注意防止漏液和交叉污染。

3．其他

流式細胞術等，但由于標本量較少，平時多的不多。

實習存在的問題和不足

分子生物學室的實習感覺還是太過短暫，再加之實習人數(shù)多，操作的機會少，特別是標本少的項目，基本還是處于見習的狀態(tài)，而且相比其他組的實習，缺乏主動思考的的動力，也許事理論知識學習不夠扎實，也許是跟老師交流太少，在以后的學習和工作中，應加強相關學習，真正掌握好這這一門新興的學科，為今后的學習、該工作或者科研服務

實習感想：

一個月的實習很快結(jié)束了，每天其實都在做著大量的重復工作，但是我并沒有因此而感到厭煩，相反我覺得這是一門藝術，因為沒有誰能保證2次加樣的量是完全一樣的，而我們能做的就是是通過不斷的練習，規(guī)范我們的操作，使每次加樣量盡可能的減小誤差，會做不代表能做好，真正的快樂就在于，將別人認為枯燥無聊的工作做的完美無瑕。

分子診斷學是一門有力的科研武器，不僅可以運用于臨床診斷，在今后的工作中我們也可以運用這一門學科，在學術上進行更深入的探索

在實習結(jié)束之際，我要感謝分子生物學室每一位老師，感謝他們耐心、親切的教導，是他們嚴謹、一絲不茍的工作態(tài)度教育了我，是他們團結(jié)協(xié)作、融洽的工作氣氛感染了我。他們循循善誘給我講解，他們耐心規(guī)范了我的操作，他們給予我很大的信任與鼓勵。而我能做的是在今后的學習和工作中帶著一顆感恩的心認真負責地工作，培養(yǎng)高尚的職業(yè)道德、嚴肅的科學態(tài)度和一絲不茍的工作作風，使自己成為一名合格的檢驗專業(yè)的的優(yōu)秀人員。祝福分子生物學室每一位老師工作順利、闔家幸福

第三篇：分子生物學

分子生物技術在微生物鑒定中的應用

摘要：微生物多樣性是生物多樣性的重要組成部分。由于微生物和 動、植物 相比, 存在著多種顯著差異。而傳統(tǒng)的基于微生物培養(yǎng)與純種分離的技術具有很大的局限性，分子生物學及其有關技術的長足進展及其在為生物中的使用, 使微生物的研究進入了分子的階段。

關鍵詞：16SrDNA PCR 溫度梯度電泳 變性梯度凝膠電泳 微生物包括了從原核到真核的不同類群的生物: 細菌、放線菌、原生動物、真菌、部分藻類和病毒, 是生物多樣性的重要組成部分。此外, 微生物多樣性與其他生物類群相比有許多獨特之處, 包括: 1)生存環(huán)境多樣;2)生長、繁殖速度多樣;3)營養(yǎng)、代謝類型多樣;4)生活方式多樣。因而, 微生物多樣性的研究無論對于生態(tài)系統(tǒng)功能的完整理解, 還是對于微生物資源的利用和開發(fā)都具有特殊重要的意義[1]。微生物作為生態(tài)系統(tǒng)中極重要的一員, 對動植物的生長，生態(tài)系統(tǒng)中的能流和物質(zhì)循環(huán)及環(huán)境污染物的降解和解毒等方面起著重要作用并且與人的生活健康息息相關。隨著微生物的不斷發(fā)現(xiàn)及研究，傳統(tǒng)微生物技術越來越不能滿足其發(fā)展的需要，最主要的不足是丟失了微生物的多樣性, 許多報道都指出, 在自然環(huán)境中有相當多的菌種(約90%-99%)用傳統(tǒng)方法無法培養(yǎng)出來[2].這對于微生物基因組學研究來說是很不利的.，導致研究的片面性并且效率低下。而分子生物學技術則避開了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)分離的環(huán)節(jié), 而是采取直接從樣品中抽取所含微生物總DNA, 然后通過16S rDNA, PCR, RAPD, DGGE

和RFLP 等多種分子生物學研究手段, 對直接提取的總DNA進行分析, 了解其中所包含的微生物DNA 的種類和含量, 以研究樣品中微生物的實際組成, 同時可以利用直接提取得到的總DNA 建立基因文庫, 并從中篩選有用的基因。由于是直接從樣品中提取總DNA, 中間沒有任何篩選性的過程, 因此, 所得DNA 能夠準確地反映樣品中微生物的實際情況, 避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法不能真實反映微生態(tài)實際情況的缺點, 也不會丟失樣品中存在的任何微生物,同時, 這種方法能夠很容易、大批量地取得同一環(huán)境下乃至不同環(huán)境下的不同微生物的同源基因, 為微生物比較基因組學研究開辟了道路.此外, 用直接提取的總DNA 構(gòu)建的基因文庫, 包含了大量以前因為無法培養(yǎng)而不能獲得的微生物基因, 從這些文庫中發(fā)現(xiàn)全新的具有巨大應用價值的抗生素類、酶類及其他生物活性物質(zhì)的基因應該是非常有潛力的。1．16SrRNA比較測序

16SrDNA是編碼原核生物16SrRNA的基因，長度約1500bp，存在于所有的原核生物的基因組中，由多個保守區(qū)和與之相間的多個可變區(qū)組成。保守區(qū)為所有細菌共有，細菌之間無顯著差異；可變區(qū)在不同細菌之間存在一定程度的差異，具有細菌屬或種特異[3]。2.PCR近年來,對環(huán)境樣品總DNA 進行PCR 擴增, 推動了利用分子標記技術研究微生物的多樣性。PCR技術是美國letus公司人類遺傳研究室的科學家與1983年發(fā)明的一種在體外快速擴增特異基因或DNA 序列的方法, 其目的是將極微量DNA大量擴增。該技術模仿生物體內(nèi)DNA 的復制過程,首先使DNA 變性, 兩條鏈解開;然后使引物模板退火, 二者堿基配對;耐高溫的Taq DNA 聚合酶以4種dNTP為底物, 在引物的引導下合成與模板鏈互補的DNA 新鏈[4]。PCR 技術可在體外快速擴增DNA, 具有快速、簡便、靈敏度高的特點。當然常規(guī) PCR技術也存在很多的問題，如出現(xiàn)假陽性、形成引物二聚體、傳統(tǒng)的PCR技術一次擴增只能檢測一種微生物、RNA病毒的PCR檢測操作繁瑣，中間污染環(huán)節(jié)多，易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果等.為了彌補上面這些不足，一些新的PCR技術逐漸衍生出來并被用于實踐，如熱啟動PCR、巢式PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、多重PCR、通用引物PCR、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、隨機引物DNA 多態(tài)性擴增（RAPD）、限制性長度多態(tài)性分析（RFLP）、實時熒光PCR（real-time PCR）等[5]。3.電泳分離及其顯示方法

除過我們熟知的瓊脂糖凝膠電泳并用溴乙錠(EB)染色方法和聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE 分離)銀染方法外, 還有一些通過特殊的電泳分離技術而建立的分子標記, 如變性梯度凝膠電泳(DGGE), 可分離長度相同但是序列不同的DNA 片段的混合物。對于特異性引物PCR 擴增的環(huán)境微生物的16SrRNA 基因, 一般的電泳很難將序列不同的片段分開。DGGE膠在聚丙烯酰氨膠中添加了線性梯度的變性劑, 可以形成從低到高的線性梯度, 在一定溫度下, 同一濃度的變性劑中, 不同序列的產(chǎn)物，其部分解鏈程度不同。DNA 解鏈程度不同決定其電泳的遷移率, 結(jié)果不同的產(chǎn)物在凝膠上分離開。在變性條件適當?shù)那闆r下, 該技術能分辨一個堿基對。DGGE 技術在微生物群落結(jié)構(gòu) 的研究、微生物種群的動態(tài)分析、富集培養(yǎng)以及分離物的分析、16SDNA 同源性的分析中得到廣泛應用[6]。

溫度梯度電泳(TGGE)是利用不同構(gòu)象的分子具有不同的變 性溫度來進行分離, 最先應用于DNA /RNA 的分子構(gòu)象分析和序列變異分析, 是一種新出現(xiàn)的檢測點突變的電泳技術, 其最大特點上具有高分辨能力。單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)也是根據(jù)不同的結(jié)構(gòu)對DNA在凝膠中遷移速率影響很大, 結(jié)果不同序列的DNA 片段在凝膠上得以高分辨率的分離。基因芯片可分為cDNA 芯片、寡核苷酸芯片及基因組芯片。在一定條件下, 載體上的核酸分子可以與來自樣品的序列互補的核酸片段雜交。如果把樣品中的核酸片段進行標記, 在專用的芯片閱讀儀上就可以檢測到雜交信號[7]。

分子生物學技術在環(huán)境微生物研究中的應用中rRNA 技術提供了一種擺脫傳統(tǒng)的純種培養(yǎng)方法而鑒定環(huán)境微生的途徑,并已被廣泛應用于微生物的各個領域。雖然當前,標準rRNA 技術的靈敏度還難以檢測到低豐度的(低于1/ 1 000)在群落中僅占很小比例的微生物種類, 從而使之在微生物生態(tài)以及環(huán)境學上的應用受到很大的限制。然而, rRNA 技術與其它的分子技術以及特別是與傳統(tǒng)的純種培養(yǎng)方法相結(jié)合, 具備分析微生物多樣性的巨大潛力。隨著這些新的分子方法的不斷改進以及rRNA 數(shù)據(jù)庫中序列信息的不斷增加, 我們能探知更多的未知的微生物世界。

參考文獻：

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第四篇：分子生物學課件整理

注：根據(jù)課件內(nèi)容簡單整理，為了方便大家理解，內(nèi)容較多;如果僅僅為了考試，可以根據(jù)自己的需要進行內(nèi)容的刪減。Lecture 1.Introduction

1.What is Molecular Biology? Molecular biology seeks to explain the relationships between the structure and function of biological molecules and how these relationships contribute to the operation and control of biochemical processes.Molecular biology is the study of genes and their activities at the molecular level, including transcription, translation, DNA

（一）基因的概念的產(chǎn)生和發(fā)展

2、Morgan 基因的物質(zhì)載體是染色體

3、G.Beadle & R.Tatum

基因是決定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的遺傳物質(zhì)單位

5、O.Avery

基因的化學本質(zhì)是DNA

6、Jacob & Monod

基因是在特定的遺傳調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)節(jié)下和控制下表達其功能的遺傳物質(zhì)單位

7、現(xiàn)代的基因概念

基因是核酸分子中儲存遺傳信息的遺傳單位，是指儲存有功能的蛋白replication, recombination and translocation.分子生物學的研究內(nèi)容

Major content of molecular biology ◆ Structure and Function of nucleic acid ★conformation and function of DNA ★conformation and function of RNA ◎mRNA ◎tRNA◎rRNA ◎ ribozyme ◎antisence RNA ◎ microRNA ◎ RNA interfrence 人們開發(fā)出：RNAi、RNAa、ncRNA、SiRNA、microRNA、Antisene RNA、SatellileRNA、TelomereRNA、lincRNA、InCRNA、PiRNA、qiRNA、endoSiRNA等等，其他還有RNA結(jié)合蛋白(RNPs)、RNA酶等成百上千種RNA相關的新成員，組成了一個龐大的RNA新世界

這些RNA不僅在基因-蛋白質(zhì)的合成中發(fā)揮重要作用，它更調(diào)節(jié)和管理著—基因的轉(zhuǎn)錄、表達、表型等幾乎所有的功能。

在細胞增殖、分化、生長、凋亡、生殖、發(fā)育、遺傳、損傷、修復、炎癥、感染、防治等一切生命活動中發(fā)揮著重要作用；

RNA還是生命起源的“先驅(qū)’’，近年來研究證明，RNA比DNA更古老，它是地球上最早出現(xiàn)的生命形式；它可以攜帶遺傳信息，能自我復制，自我進化，自我編譯，又具有催化分子功能------,以后才有了DNA和蛋白質(zhì)，才有了今天的生物世界。

RNA更是人類生命健康的維護者，它不僅調(diào)節(jié)和管理著人類的一切生命活動，而且它還是防治許多重大的疾病和開發(fā)新藥物的靶分子和預警分子，并可直接和間接的發(fā)揮防治疾病的作用。

◆Functional Genomics ◎As the Human Genome Project has mostly determined the genetic sequence, the next step is functional genomics, which will reveal each gene's functions and controls ◎ Human Genome Diversity Project ◎ Environmental Genome Project ◎Pharmacogenomics ◎Comparative Genomics

Artificial life 人工生命是通過人工模擬生命系統(tǒng),來研究生命的領域。人工生命的概念，包括兩個方面內(nèi)容

1.屬于計算機科學領域的虛擬生命系統(tǒng)，涉及計算機軟件工程與人工智能技術，以及

2.基因工程技術人工改造生物的工程生物系統(tǒng)，涉及合成生物學技術。

分子生物學與醫(yī)學

◆人體發(fā)育調(diào)控和人體功能調(diào)控的分子生物學基礎 ◎發(fā)育、分化與衰老的分子生物學基礎 ◎細胞增殖調(diào)控的分子生物學基礎

◎神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫調(diào)控的分子生物學基礎

◆ 基因與疾病 ◎疾病的分子機理

致病基因的克隆

復雜疾病的分子基礎 ◎基因診斷 ◎基因治療

Lecture 2 structure and function of gene 第一節(jié) 基因的概念及其發(fā)展 一 基因（gene）

質(zhì)多肽鏈或RNA序列信息所必需的全部核苷酸序列

二、基因組（genomic）The genome is the entirety of an organism's hereditary information.It is encoded either in DNA or, for many types of virus, in RNA.The genome includes both the genes and the non-coding sequences of the DNA

細胞或生物體中，一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和。

人類基因組包含24條染色體以及線粒體上的全部的遺傳物質(zhì)。

第二節(jié) 真核生物基因組

一、基因分類

1、結(jié)構(gòu)基因（strutual gene）可被轉(zhuǎn)錄形成mRNA并進而翻譯位多肽鏈，構(gòu)成各種結(jié)構(gòu)蛋白的基因

2、調(diào)節(jié)基因（regulatory gene）可調(diào)節(jié)、控制結(jié)構(gòu)基因表達的基因。其突變可能會影響一個或多個結(jié)構(gòu)基因的功能，導致一個（或多個）蛋白質(zhì)的改變。

3、rRNA基因和tRNA基因

二、基因的結(jié)構(gòu)

enhancer pr omoter e xon 5UTR, 3UTR intron

（一）編碼區(qū)、外顯子（exon）

2、內(nèi)含子（intron）★GT—AG規(guī)則：

內(nèi)含子多是以GT開始，并以AG結(jié)尾

★一個基因的內(nèi)含子可以是另一個基因的外顯子。★外顯子的數(shù)量是描述基因結(jié)構(gòu)特征的重要指標。三、調(diào)控元件（acting elements）

（二）前導區(qū)：

位于編碼區(qū)的上游，相當于mRNA5端的非編碼區(qū)

（三）調(diào)節(jié)區(qū)：

包括啟動子、增強子等基因編碼區(qū)的兩側(cè)，也稱側(cè)翼序列

◎順式調(diào)控元件（cis-acting elements）：與結(jié)構(gòu)基因表達調(diào)控相關。能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識別和結(jié)合的DNA序列。◎反式調(diào)控元件（trans-acting elements）:一些可以通過結(jié)合順式元件而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白因子。

（一）啟動子（promoter）

啟動子是DNA分子可以與RNA聚合酶特異結(jié)合的部位，也就是使轉(zhuǎn)錄開始的部位。在基因表達的調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄的起始是個關鍵。常常某個基因是否應當表達決定于在特定的啟動子起始過程。2 啟動子的類型

(1)一類是RNA聚合酶可以直接識別的啟動子 這類啟動子應當總是能被轉(zhuǎn)錄。

但實際上也不都如此，外來蛋白質(zhì)可對其有影響，即該蛋白質(zhì)可直接阻斷啟動子，也可間接作用于鄰近的DNA結(jié)構(gòu)，使聚合酶不能和啟動子結(jié)合(2)另一類啟動子在和聚合酶結(jié)合時需要有蛋白質(zhì)輔助因子的存在。這種蛋白質(zhì)因子能夠識別與該啟動子順序相鄰或甚至重疊的DNA順序。3 啟動子的共同順序

⑴ 真核生物基因啟動子 位于RNA合成開始位點的上游大約10bp和35bp處有兩個共同的順序，稱為-10和-35序列。這兩個序列的共同順序如下，-35區(qū)“AATGTGTGGAAT”，-10區(qū)“TTGACATATATT”。

-10序列又稱為Pribnow盒(原核生物)。是RNA聚合酶所結(jié)合和作用必需的順序

⑵真核生物基因啟動子

▲TATA box（Goldberg-Hogness box）：

位于-35bp處，序列為TATA（A/T）A（T/A）是RNA聚合酶Ⅱ的結(jié)合部位

▲CAAT盒：在轉(zhuǎn)錄起始位點上游70-80bp處

保守的共同順序：GCCTCAATCT。RNA聚合酶Ⅱ可以識別這一順序。⑶啟動子中的－10和-35序列是RNA聚合酶所結(jié)合和作用必需的順序 [1]RNA聚合酶能和-35和-10序列中的堿基和DNA主 鏈中的磷酸基相接觸;[2]離開共同順序較遠的啟動子的活性亦較弱;[3]最重要的是，破壞啟動子功能的突變中有75%都是改變了共同順序中的堿基，其余25%亦為離共同順序較近的。-35和-10序列相距約20bp，即大致是雙螺旋繞兩圈的長度。因為這兩個結(jié)合區(qū)是在DNA分子的同一側(cè)面，沉默子的作用機理

沉默子介導產(chǎn)生的沉默是一種狀態(tài)的變化,在此過程中,產(chǎn)生類似于異染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)阻止轉(zhuǎn)錄因子與DNA的相互作用,使轉(zhuǎn)錄被抑制,沉默子作為異染色質(zhì)形成中的失活中心參與沉默狀態(tài)的建立和擴散

沉默子含阻遏蛋白結(jié)合序列，阻遏蛋白與其結(jié)合后阻遏基因的轉(zhuǎn)錄。直接阻遏(direct repression)沉默子結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)錄復合物中的成員結(jié)合后將其固定，使基礎轉(zhuǎn)錄復合物無法形成而喪失活性

競爭(competition)在一些基因中沉默子與增強子等正調(diào)控元件相鄰或相重疊，阻遏蛋白結(jié)合后阻止激活蛋白與鄰近正調(diào)控元件的結(jié)合從而阻遏轉(zhuǎn)錄

淬滅

沉默子與增強子相鄰，阻遏蛋白與沉默子結(jié)合后,雖不影響激活蛋白與DNA的結(jié)合能力,卻通過蛋白之間的相互作用阻止激活蛋白與轉(zhuǎn)錄復合物的正確接觸來抑制其活性 可見此酶是結(jié)合在雙螺旋的一面。可以想像，它能“感覺到每個結(jié)合區(qū)的溝底中堿基所產(chǎn)生的特異形狀。”

（三）增強子（enhancer)★位于結(jié)構(gòu)基因附近，能夠增強該基因轉(zhuǎn)錄活性的一段DNA順序稱為增強子(enhancer)。

★增強子是另一類順式作用的DNA片段，可使基因轉(zhuǎn)錄的速率大大提高。

增強子的類型

①組織和細胞專一性增強子

許多增強子的增強效應有很高的組織細胞專一性，只有在特定的轉(zhuǎn)錄因子(蛋白質(zhì))參與下，才能發(fā)揮其功能。②誘導性增強子

這種增強子的活性通常要有特定的啟動子參與。

例如，金屬硫蛋白基因可以在多種組織細胞中轉(zhuǎn)錄，又可受類固醇激素、鋅、鎘和生長因子等的誘導而提高轉(zhuǎn)錄水平。

增強子的特點

①增強子可提高同一條DNA鏈上基因轉(zhuǎn)錄效率，可以遠距離作用，通常距離l～4kb，個別情況下離開所調(diào)控的基因30kb仍能發(fā)揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。

②增強子作用與其序列的正反方向無關，將增強子方向倒置依然能起作用。而將啟動子倒置就不能起作用，可見增強子與啟動子是很不相同的。③增強子要有啟動子才能發(fā)揮作用，沒有啟動子存在，增強子不能表現(xiàn)其活性。但增強子對啟動子沒有嚴格的專一性，同一增強子可以影響不同類型啟動子的轉(zhuǎn)錄。

④增強子必須與特定的蛋白質(zhì)因子結(jié)合后才能發(fā)揮增強轉(zhuǎn)錄的作用。增強子一般具有組織或細胞特異性，許多增強子只在某些細胞或組織中表現(xiàn)活性，是由這些細胞或組織中具有的特異性蛋白質(zhì)因子所決定的。

例如，人類胰島素基因5’端上游約250個核苷酸處有一組織特異性增強子。在胰島素p細胞中有一種特異性蛋白因子，可以作用于這個區(qū)域，以增強胰島素基因的轉(zhuǎn)錄。在其他組織細胞中沒有這種蛋白因子，所以也就沒有此作用。

⑤大多為重復序列，一般長約50bp，適合與某些蛋白因子結(jié)合。其內(nèi)部常含有一個核心序列，即(G)TGGA／TA／TA／T(G)，是產(chǎn)生增強效應時所必需的。

⑥許多增強子還受外部信號的調(diào)控，如金屬硫蛋白的基因啟動區(qū)上游所帶的增強子，就可以對環(huán)境中的鋅、鎘濃度做出反應。

增強子的作用機理

①增強子中有Z-DNA結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的雙鏈間距離大于B-DNA，與蛋白質(zhì)的親和力更高一些，有利于轉(zhuǎn)錄。

②增強子中有DNA水解酶容易切斷的部位，可與一些轉(zhuǎn)錄因子蛋白形成復合物，促進轉(zhuǎn)錄。

③增強子可與核基質(zhì)結(jié)合形成結(jié)構(gòu)體，促進轉(zhuǎn)錄。

3．沉默子（Silencer）

Silencers are control regions of DNA that, like enhancers, may be located thousands of base pairs away from the gene they control.However, when transcription factors bind to them, expression of the gene they control is repressed.沉默子的特點

(1)可以在遠距離作用于啟動子

(2)對基因的阻遏作用沒有方向的限制，即無論其位于啟動子的上游或下游均可阻遏啟動子的表達

某些沉默子中含有骨架結(jié)合位點保守序列

沉默子與蛋白結(jié)合,通過蛋白之間的相互作用形成DNA環(huán)后與啟動子作用，破壞起始復合物而抑制轉(zhuǎn)錄;

或者產(chǎn)生的DNA環(huán)發(fā)生了組蛋白的修飾和拓撲結(jié)構(gòu)的變化,這種變化使關鍵的轉(zhuǎn)錄因子不能正確結(jié)合從而阻止轉(zhuǎn)錄

也可能沉默子和核基質(zhì)相互作用將轉(zhuǎn)錄單元固定于缺乏轉(zhuǎn)錄因子的亞顯微結(jié)構(gòu)

4.絕緣子(insulator)

絕緣子(insulator)長約幾百個核苷酸對，是通常位于啟動子同正調(diào)控元件(增強子)或負調(diào)控因子(為異染色質(zhì))之間的一種調(diào)控序列。

絕緣子本身對基因的表達既沒有正效應，也沒有負效應，其作用只是不讓其他調(diào)控元件對基因的活化效應或失活效應發(fā)生作用。絕緣子的功能

①有序地裝置龐大的染色體DNA以及確保其中上萬種基因每一種都能在時空上正確無誤地表達。

絕緣子在這里起著關鍵的阻斷作用,保護啟動子的功能不受其它異常增強子或其它激發(fā)信號的有害影響

②防止基因免受鄰近沉默信號的作用。這類沉默信號系來自細胞核的內(nèi)環(huán)境中遍布的大量致密染色質(zhì)的“擴張”或“溢出”。

絕緣子的這種功能可以維持染色質(zhì)區(qū)域的分界以及保護基因座位的獨立性。

絕緣子的作用原理

①結(jié)構(gòu)域邊界模型(Domain boundary model,)

絕緣子能使它所限定的染色質(zhì)區(qū)域發(fā)生折疊成環(huán),促使該區(qū)域內(nèi)各種調(diào)節(jié)元件彼此相互作用,同時也阻止了不同區(qū)域調(diào)節(jié)元件之間互相影響。染色質(zhì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)域能對抗附近致密染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的擴展。這樣一來,絕緣子能防止位置效應也能得到合理的解釋。②“跟蹤”模型(“Tracking” model):

結(jié)合在增強子元件上的轉(zhuǎn)錄因子沿DNA鏈向它的目標啟動子追逐。此時絕緣子的特異結(jié)合蛋白在中途阻擋轉(zhuǎn)錄因子,使其不能抵達啟動子區(qū)域。③轉(zhuǎn)錄誘捕模型(Transcription decoy model)

在絕緣子與其特異結(jié)合蛋白結(jié)合所形成的復合物可成為捕捉增強子的籠子,將增強子復合物吸引到其中而使之失去功能。

四、基因家族（gene family）

（一）基因家族的概念

1、基因家族：核苷酸序列或編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有一定程度同源性的一組基因。由同一祖先基因進化而來。

2、假基因（pseudogene）

在多基因家族中，某些成員并不能表達出有功能的產(chǎn)物，這些基因稱為假基因。

假基因與有功能的基因同源，原來可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或點突變等，使這一基因失去活性，成為無功能基因。

與相應的正常基因相比，假基因往往缺少正常基因的內(nèi)含子，兩側(cè)有順向重復序列。

人們推測，假基因的來源之一，可能是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后生成的RNA前體通過剪接失去內(nèi)含子形成mRNA，如果mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)cDNA，再整合到染色體DNA中去，便有可能成為假基因，因此該假基因是沒有內(nèi)含子的，在這個過程中，可能同時會發(fā)生缺失，倒位或點突變等變化，從而使假基因不能表達。

（二）、基因家族大致可分為兩類

1、一類是基因家族成簇地分布在某一條染色體上，它們可同時發(fā)揮作

用，合成某些蛋白質(zhì)，如組蛋白基因家族就成簇地集中在第7號染色體長臂3區(qū)2帶到3區(qū)6帶區(qū)域內(nèi)；

2、另一類是一個基因家族的不同成員成簇地分布 在不同的染色體上，這些不同成員編碼一組功能上緊密相關的蛋白質(zhì)，如珠蛋白基因家族

五、重復序列：高度重復序列 中度重復順序 單拷貝順序

（一）高度重復序列

高度重復序列在基因組中重復頻率高，可達百萬(106)以上，因此復性速度很快。

在基因組中所占比例隨種屬而異，約占10-60％，在人基因組中約占20％。

高度重復順序又按其結(jié)構(gòu)特點分為三種。

1、倒位（反向）重復序列（inverted repeats）

反向重復序列由兩個相同順序的互補拷貝在同一DNA鏈上反向排列而成。約占人基因組的5％。

2、衛(wèi)星DNA

衛(wèi)星DNA(satelliteDNA)是另一類高度重復序列，這類重復順序的重復單位一般由2-10bp組成，成串排列。由于這類序列的堿基組成不同于其他部份，可用等密度梯度離心法將其與主體DNA分開，因而稱為衛(wèi)星DNA或隨體DNA。在人細胞組中衛(wèi)星DNA約占5-6％。§大衛(wèi)星DNA（macrosatellite DNA）§小衛(wèi)星DNA（minisatellite DNA）

§微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）

3、較復雜的重復單位組成的重復順序

這種重復順序為靈長類所獨有。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ消化非洲綠猴DNA，可以得到重復單位為172bp的高度重復順序，這種順序大部份由交替變化的嘌呤和嘧啶組成。有人把這類稱為α衛(wèi)星DNA。而人的α衛(wèi)星DNA更為復雜，含有多順序家族。

4、高度重復順序的功能

⑴參與復制水平的調(diào)節(jié)反向序列常存在于DNA復制起點區(qū)的附近。另外，許多反向重復序列是一些蛋白質(zhì)（包括酶）和DNA的結(jié)合位點。

⑵參與基因表達調(diào)控DNA的重復順序可以轉(zhuǎn)錄到核內(nèi)不均一RNA分子中，而有些反向重復順序可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這對穩(wěn)定RNA分子，免遭分解有重要作用

⑶參與轉(zhuǎn)位作用幾乎所有轉(zhuǎn)位因子的末端都包括反向重復順序，長度由幾個bp到1400bp。由于這種順序可以形成回文結(jié)構(gòu)，因此在轉(zhuǎn)位作用中即能連接非同源的基因，又可以被參與轉(zhuǎn)位的特異酶所識別。

⑷與進化有關 不同種屬的高度重復順序的核苷酸序列不同，具有種屬特異性，但相近種屬又有相似性。如人的α衛(wèi)星DNA長度僅差1個堿基（前者為171bp，后者為172bp），而且堿基序列有65％是相同的，這表明它們來自共同的祖先。在進化中某些特殊區(qū)段保守的，而其他區(qū)域的堿基序列則累積著變化。

⑸同一種屬中不同個體的高度重復順序的重復次數(shù)不一樣，這可以作為每一個體的特征，即DNA指紋。

（二）中度重復順序

中度重復序列大致指在真核基因組中重復數(shù)十至數(shù)萬（<105）次的重復順序。其復性速度快于單拷貝順序，但慢于高度重復順序。少數(shù)在基因組中成串排列在一個區(qū)域，大多數(shù)與單拷貝基因間隔排列。依據(jù)重復順序的長度，中度重復順序可分為兩種類型。（1）短分散片段

（short interspersed repeated segments, SINES）這類重復順序的平均長度約為300bp（〈500bp），它們與平均長度約為1000bp的單拷貝順序間隔排列。拷貝數(shù)可達10萬左右。如Alu家族，Hinf

家族等屬于這種類型的中度重復序列（2）長分散片段

（Long interspersed repeated segments, LINES）

這類重復順序的長度大于1000bp，平均長度為3500-5000bp，它們與平均長度為13000bp（個別長幾萬bp）的單拷貝順序間隔排列。

也有的實驗顯示人基因組中所有LINES之間的平均距離為2.2kb,拷貝數(shù)一般在1萬左右，如KpnⅠ家族等。

中度重復順序在基因組中所占比例在不同種屬之間差異很大，一般約占10-40％，在人約為12％。這些順序大多不編碼蛋白質(zhì)。這些非編碼的中度重復順序的功能可能類似于高度重復順序。

在結(jié)構(gòu)基因之間，基因簇中，以及內(nèi)含子內(nèi)都可以見到這些短的和長的中度重復順序。如HLA基因，rRNA基因，tRNA基因,組蛋白基因,免疫球蛋白基因等。

中度重復順序一般具有種屬特異性；在適當?shù)那闆r下，可以應用它們作為探針區(qū)分不同種哺乳動物細胞的DNA。下面介紹幾種典型的中度重復順序。

Alu家族是哺乳動物包括人基因組中含量最豐富的一種中度重復順序家族，在單倍體人基因組中重復達30萬-50萬次，約占人基因組的3-6％。Alu家族每個成員的長度約300bp，由于每個單位長度中有一個限制性內(nèi)切酶Alu的切點（AG↓CT）從而將其切成長130和170bp的兩段，因而定名為Alu序列（或Alu家族）。

Alu序列分散在整個人體或其他哺乳動物基因組中，在間隔DNA，內(nèi)含子中都發(fā)現(xiàn)有Alu序列，平均每5kbDNA就有一個Alu順序。

KpnⅠ家族是中度重復順序中僅次于Alu家族的第二大家族。用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ消化人類及其它靈長類動物的DNA，在電泳譜上可以看到4個不同長度的片段，分別為1.2,1.5,1.8和1.9kb，這就是所謂的KpnⅠ家族。

KpnⅠ家族成員順序比Alu家族更長（如人KpnⅠ順序長6.4kb），而且更加不均一，呈散在分布，屬于中度重復順序的長分散片段型。

盡管不同長度類型的KpnⅠ家族（稱為亞類，subfamily）之間同源性比較小，不能互相雜交，但它們的3'端有廣泛的同源性。KpnⅠ家族的拷貝數(shù)約為3000￣4800個，占人體基因組的1％,與散在分布的Alu家族相似，KpnⅠ家族中至少有一部份也是通過KpnⅠ順序的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA拷貝的重新插入到人基因組DNA中而產(chǎn)生的。

Hinf家族：

這一家族以319bp長度的串聯(lián)重復存在于人體基因組中。用限制性內(nèi)切酶HinfⅠ消化人體DNA，可以分離到這一片段。Hinf家族在單位基因組內(nèi)約有50 100個拷貝，分散在不同的區(qū)域。319bp單位可以再分成兩個亞單位，分別為172bp和147bp,它們之間有70%的同源性。

rRNA基因：在原核生物如大腸桿菌基因組中，rRNA基因一共是七套；在真核生物中rRNA基因的重復次數(shù)更多。在真核生物基因組中18S和28S,rRNA基因是在同一轉(zhuǎn)錄單位中，低等的真核生物如酵母中，5SrRNA也和18S,28SrRNA在同一轉(zhuǎn)錄單位中；

而在高等生物中，5SrRNA是單獨轉(zhuǎn)錄的，而且其在基因組中的重復次數(shù)高于18S和28S基因。和一般的中度重復順序不一樣，各重復單位中的rRNA基因都是相同的。

rRNA基因通常集中成簇存在，而不是分散于基因組中，這樣的區(qū)域稱為rDNA，如染色體的核仁組織區(qū)（nucleolus organizer region）即為rDNA區(qū)。

（三）單拷貝順序

單拷貝順序在單倍體基因組中只出現(xiàn)一次或數(shù)次，因而復性速度很慢。單拷貝順序在基因組中占50-80％，如人基因組中，大約有60-65％的順序?qū)儆谶@一類。單拷貝順序中儲存了巨大的遺傳信息，編碼各種不同功能的蛋白質(zhì)。

六、真核生物基因組的特點

1.真核生物基因組DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，儲存于細胞核內(nèi)，除配子細胞外，體細胞內(nèi)的基因的基因組是雙份的（即雙倍體,diploid），即有兩份同源的基因組。

2.真核細胞基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。一個結(jié)構(gòu)基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯生成一個mRNA分子和一條多肽鏈。

3.存在重復序列，重復次數(shù)可達百萬次以上。4.基因組中不編碼的區(qū)域多于編碼區(qū)域。

5.大部分基因含有內(nèi)含子，因此，基因是不連續(xù)的。

6.基因組遠遠大于原核生物的基因組，具有許多復制起點，而每個復制子的長度較小

重疊基因有以下幾種情況

（1）一個基因完全在另一個基因里面。如基因Ａ和Ｂ是兩個不同基因，而Ｂ包含在基因Ａ內(nèi)。同樣，基因Ｅ在基因Ｄ內(nèi)。（2）部分重疊。（3）兩個基因只有一個堿基重疊。

八、原核生物基因組的結(jié)構(gòu)和功能

（1）基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA 分子組成。

（2）具有操縱子結(jié)構(gòu)，即數(shù)個功能相關的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，受同一個調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)。數(shù)個操縱子還可以由一個共同的調(diào)節(jié)基因（regulatorygene）即調(diào)節(jié)子（regulon）所調(diào)控。

（3）在大多數(shù)情況下，結(jié)構(gòu)基因在細菌基因組中都是單拷貝，但是編碼rRNA的基因rDNA往往是多拷貝的,這樣可能有利于核糖體的快速組裝，便于在急需蛋白質(zhì)合成時細胞可以在短時間內(nèi)有大量核糖體生成。

（4）和病毒的基因組相似，不編碼的DNA部份所占比例比真核細胞基因組少得多。

（5）具有編碼同工酶的同基因（isogene）例如，在大腸桿菌基因組中有兩個編碼分支酸（chorismicacid）變位酶的基因，兩個編碼乙酰乳酸（acetolactate）合成酶的基因。

（6）和病毒基因組不同的是，在細菌基因組中編碼順序一般不會重疊，即不會出現(xiàn)基因重疊現(xiàn)象。

（7）在DNA分子中具有各種功能的識別區(qū)域如復制起始區(qū)OriC，復制終止區(qū)TerC,轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)和終止區(qū)等。這些區(qū)域往往具有特殊的順序，并且含有反向重復順序。

（8）在基因或操縱子的終末往往具有特殊的終止順序,它可使轉(zhuǎn)錄終止和RNA聚合酶從DNA鏈上脫落。

例如大腸桿菌色氨酸操縱子后尾含有40bp的GC豐富區(qū)，其后緊跟AT豐富區(qū)，這就是轉(zhuǎn)錄終止子的結(jié)構(gòu)。

終止子有強、弱之分，強終止子含有反向重復順序，可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其后面為polyT結(jié)構(gòu)，這樣的終止子無需終止蛋白參與即可以使轉(zhuǎn)錄終止。而弱終止子盡管也有反向重復序列，但無polyT結(jié)構(gòu)，需要有終止蛋白參與才能使轉(zhuǎn)錄終止。

Lecture 3 DNA replication 第一節(jié) DNA的復制

一、DNA復制的基本特點

（一）復制的起始點和方向

★復制起始點：復制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復制起始點(origin of replication)常用ori或o表示

★復制子： replicon DNA復制從起始點開始直到終點為止，每個這樣的DNA單位稱為復制子或復制單元

★復制叉：在復制開始時，復制起始點出呈現(xiàn)一叉形結(jié)構(gòu)，稱為復制叉（replication fork）

1、復制起始點：

DNA復制起始點有結(jié)構(gòu)上的特殊性。這些特殊的結(jié)構(gòu)對于在DNA復制起始過程中參與的酶和許多蛋白質(zhì)分子的識別和結(jié)合都是必須的。§大腸桿菌染色體DNA復制起始點Oric由422個核苷酸組成，是一系列對稱排列的反向重復序列，即回文結(jié)構(gòu)(palindrome)，其中有9個核苷酸或13個核苷酸組成的保守序列，這些部位是大腸桿菌中DnaA蛋白識別的位置

2、DNA復制的方向

(1)定點開始雙向復制：這是原核生物和真核生物DNA復制最主要的形式，從一個特定位點解鏈，沿著兩個相反的方向各生長出兩條鏈，形成一個復制泡。

(2)定點開始單向復制：質(zhì)粒colE1是個典型的例子，復制從一個起始點開始，以同一方向生長出兩條鏈，形成一個復制

(3)兩點開始單向復制：腺病毒DNA的復制是從兩個起點開始的，形成兩個復制叉，各以一個單一方向復制出一條新鏈。

二、復制的基本方式

(一)DNA的半保留復制(semiconservative replication)

（二）半不連續(xù)復制 前導鏈(leading strand)：在以3′→5′方向的母鏈為模板時，復制合成出一條5′→3′方向的前導鏈，前導鏈的前進方向與復制叉打開方向是一致的，因此前導鏈的合成是連續(xù)進行的 隨從鏈(lagging strand)：另一條母鏈DNA是5′→3′方向，它作為模板時，復制合成許多條5′→3′方向的短鏈，叫做隨從鏈，隨從鏈的前進方向是與復制叉的打開方向相反的。

隨從鏈只能先以片段的形式合成，這些片段就叫做崗崎片段(Okazaki fragments)，原核生物崗崎片段含有1000-2000核苷酸，真核生物一般10000核苷酸。最后再將多個崗崎片段連接成一條完整的鏈。

由于前導鏈的合成是連續(xù)進行的，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進行的，所以從總體上看DNA的復制是半不連續(xù)復制

三、復制過程

（一）DNA復制的起始階段

1、DNA復制起始引發(fā)體的形成及所參與的酶和蛋白質(zhì)

⑴解鏈酶(helicase)：解鏈酶的作用就是打開DNA雙鏈之間的氫鍵。

大腸桿菌中DnaB蛋白就有解鏈酶活性，與隨從鏈的模板DNA結(jié)合，沿5′→3′方向移動，還有一種叫做Rep蛋白和前導鏈的模板DNA結(jié)合沿3′→5′方向移動。

⑵.單鏈結(jié)合蛋白：(single strand binding proteins, SSBP)

它與解開的單鏈DNA結(jié)合，使其穩(wěn)定不會再度螺旋化并且避免核酸內(nèi)切酶對單鏈DNA的水解，保證了單鏈DNA做為模板時的伸展狀態(tài)，SSBP可以重復利用。

⑶ 引發(fā)體的形成

DNA復制起始的關健步驟是前導鏈DNA的合成，一旦前導鏈DNA的聚合作用開始，隨從鏈DNA的合成也隨著開始。由于前導鏈的合成是連續(xù)進行的，所以它的起始相對簡單，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進行的，所以引發(fā)階段比較復雜。大腸桿菌的引發(fā)前體由Dna B.Dna C和單鏈結(jié)合蛋白組成。★引物酶(primase)它是一種特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。這種短RNA片段一般十幾個至數(shù)十個核苷酸不等，它們在DNA復制起始處做為引物。RNA引物的3′OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一個磷酸二酯鍵的位置

★引發(fā)體(primosome)高度解鏈的模板DNA與多種蛋白質(zhì)因子形成的引發(fā)前體促進引物酶結(jié)合上來，共同形成引發(fā)體，引發(fā)體主要在DNA隨從鏈上開始，它連續(xù)地與引物酶結(jié)合并解離，從而在不同部位引導引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3′OH末端接下去合成DNA片段，這就是隨從鏈不連續(xù)合成的開始。

（二）DNA復制的延長階段以及參與的酶和蛋白質(zhì)分子

1、DNA的聚合反應和DNA聚合酶

★DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerse Ⅰ）：

DNA polⅠ是由一條多肽鏈組成，分子量為109KD。酶分子中含有一個Zn++，是聚合活性必須的。

(1)DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′聚合活性 這是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸順序，將互補的dNTP逐個加到引物RNA3′-OH末端，并促進3′-OH與dNTP的5′-OH形成磷酸二酯鍵，酶的專一性表現(xiàn)為新進入的dNTP必須與模板DNA堿基配對時才有催化作用。

(2)DNA聚合酶Ⅰ的3′→5′外切核酸酶活性

這種酶活性的主要功能是從3′→5′方向識別并切除DNA生長鏈末端與模板DNA不配對而游離的核苷酸，這種功能稱為校對功能，這是保證其聚合作用的正確性不可缺少的，因此對于DNA復制中極高的保真性是至關重要的。

(3)DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′外切核酸酶活性

這種酶活性是從DNA鏈的5′端向3′末端水解已配對的核苷酸，本質(zhì)是切斷磷酸二酯鍵，每次能切除10個核苷酸。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復中可能起重要作用，對完成的DNA片段去除5′端的RNA引物也是必須的。

DNA polⅠ并不是DNA復制過程中的主要酶，它的作用主要與DNA損傷后的修復有關。

DNA聚合酶Ⅱ(DNA polⅡ）

分子量為120KD，每個細胞約有100個酶分子，但活性只有DNA polⅠ的5%，它具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，而沒有5′→3′外切活性，它的作用可能與DNA損傷修復有關。DNA聚合酶Ⅲ(DNA polⅢ）

這是在DNA復制過程中起主要作用的聚合酶，它是由一個多亞基組成的蛋白質(zhì)分子，其分子量＞600kDa整個酶分子形成一個不對稱的二聚體 DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是單獨起作用的，而是與引發(fā)體，解鏈酶等構(gòu)成一個復制體。由于復制體的存在，先導鏈和隨從鏈可以同時復制。DNA polⅢ是由多亞基組成的不對稱二聚體，它可能同時負責先導鏈和隨從鏈的復制

2、與超螺旋松馳有關的酶

拓撲異構(gòu)酶(topoisomerase)是一類改變DNA拓撲性質(zhì)的酶。

在體外可催化DNA的各種拓撲異構(gòu)化反應，而在生物體內(nèi)它們可能參與了DNA的復制與轉(zhuǎn)錄。

在DNA復制時，復制叉行進的前方DNA分子部分產(chǎn)生有正超螺旋，拓撲酶可松馳超螺旋，有利于復制叉的前進及DNA的合成。

DNA復制完成后，拓撲酶又可將DNA分子引入超螺旋，使DNA纏繞、折疊，壓縮以形成染色質(zhì)。

DNA拓撲異構(gòu)酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它們廣泛存在于原核生物及真核生物中。

拓撲異構(gòu)酶Ⅰ(TopoⅠ)的主要作用

將環(huán)狀雙鏈DNA的一條鏈切開一個口，切口處鏈的末端繞螺旋軸按照松馳超螺旋的方向轉(zhuǎn)動，然后再將切口封起來。這就使DNA復制叉移動時所引起的前方DNA正超螺旋得到緩解，利于DNA復制叉繼續(xù)向前打開。

對環(huán)狀單鏈DNA還有打結(jié)或解結(jié)作用，對環(huán)狀雙鏈DNA的環(huán)連或解連以及使環(huán)狀單鏈DNA形成環(huán)狀雙鏈DNA都有作用

拓撲異構(gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)的主要作用

是在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的，曾被稱為旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)，它們作用特點是切開環(huán)狀雙鏈DNA的兩條鏈，分子中的部分經(jīng)切口穿過而旋轉(zhuǎn)，然后封閉切口。還可使DNA分子從超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗神Y狀態(tài)，此反應不需要ATP參與。DNA復制完成后，TopoⅡ在ATP參與下，DNA分子從松馳狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樨摮菪?/p>

催化的拓撲異構(gòu)化反應還有環(huán)連或解環(huán)連，以及打結(jié)或解結(jié)。

DNA連接酶(DNA ligase)作用：消耗ATP，將隨從鏈中相鄰的兩個DNA片段連接起來

催化同一模板DNA鏈上的兩個相鄰DNA片段的3＇端與5＇端間形成磷酸二酯鍵，把相鄰的兩段DNA連成完整的鏈

（三）DNA復制的終止階段

DNA在復制過程中，合成出的前導鏈為一條連續(xù)的長鏈。隨從鏈則是由合成出許多相鄰的片段，在連接酶的催化下，連接成為一條長鏈。連接作用是在連接酶催化下進行的。

DNA復制的過程 延長:

DNA-pol Ⅲ(DDDP-Ⅲ)的5? → 3?的聚合活性使核苷酸之間生成3?，5?磷酸二酯鍵

模板 以DNA單鏈為模板

底物 dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）

引物 以小片段RNA為引物，在 RNA引物的 3?-OH末端上開始逐個添加dNTP

按堿基配對原則（A = T G ≡ C）按5? → 3? 方向

第二節(jié) 真核生物DNA復制的特點 1.復制起始點及方向

與原核生物不同，真核生物DNA復制有許多起始點，例如酵母S.cerevisiae的17號染色體約有400個起始點，因此，雖然真核生物DNA復制的速度(60核苷酸/每秒鐘)比原核生物DNA復制的速度(E.coli 1700核苷酸/每秒鐘)慢得多，但復制完全部基因組DNA也只要幾分鐘的時間。2.在真核生物DNA復制叉處，需要兩種不同的酶。DNA聚合酶α(polα)和DNA聚合酶δ(polδ)

polα和引物酶緊密結(jié)合，在DNA模板上先合成RNA引物，再由polα延長DNA鏈，這種活性還要復制因子C參與。

同時結(jié)合在引物模板上的PCNA，此時釋放了polα，然后由polδ結(jié)合到生長鏈3′末端，并與PCNA結(jié)合，繼續(xù)合成前導鏈。

而隨從鏈的合成靠polα緊密與引物酶結(jié)合并在復制因子C幫助下，合成崗崎片段

3、末端復制與端粒酶 端區(qū)(telomeres)由于真核生物染色體是線性DNA，它的兩端叫做端區(qū)(telomeres)，端區(qū)是由重復的寡核苷酸序列構(gòu)成的。

由于隨從鏈是以一種不連續(xù)的形式合成崗崎片段，所以不能完成線性染色體末端的復制，如果這個問題不解決，真核生物在細胞分裂時DNA復制將產(chǎn)生5′末端隱縮，使DNA縮短。端粒酶(telomerase)由蛋白質(zhì)和RNA兩部分組成的，它以自身的RNA為模板，在隨從鏈模板DNA的3′OH末端延長DNA，再以這種延長的DNA為模板，繼續(xù)合成隨從鏈。第三節(jié) DNA損傷與修復

一、DNA的損傷

(一)DNA損傷的原因 1.DNA分子的自發(fā)性損傷

2.物理因素引起的DNA損傷

3.化學因素引起的DNA損傷 1.DNA分子的自發(fā)性損傷(1)DNA復制中的錯誤

堿基配對的錯誤頻率約為10-1－10-2 在DNA復制酶的作用下堿基錯誤配對頻率降到約10-5－10-6 DNA聚合酶還會暫停催化作用，以其3′－5′外切核酸酶的活性切除錯誤接上的核苷酸，然后再繼續(xù)正確的復制但校正后的錯配率仍約在10-10左右.(2)DNA的自發(fā)性化學變化

a.堿基的異構(gòu)互變

DNA中的4種堿基各自的異構(gòu)體間都可以自發(fā)地相互變化(例如烯醇式與酮式堿基間的互變)，這種變化就會使堿基配對間的氫鍵改變，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鳥嘌呤等，如果這些配對發(fā)生在DNA復制時，就會造成子代DNA序列與親代DNA不同的錯誤性損傷 b.堿基的脫氨基作用

堿基的環(huán)外氨基有時會自發(fā)脫落，從而胞嘧啶會變成尿嘧啶、腺嘌呤會變成次黃嘌呤(H)、鳥嘌呤會變成黃嘌呤(X)等，遇到復制時，U與A配對、H和X都與C配對就會導致子代DNA序列的錯誤變化。胞嘧啶自發(fā)脫氨基的頻率約為每個細胞每天190個。c.脫嘌呤與脫嘧啶

自發(fā)的水解可使嘌呤和嘧啶從DNA鏈的核糖磷酸骨架上脫落下來。一個哺乳類細胞在37℃條件下，20h內(nèi)DNA鏈上自發(fā)脫落的嘌呤約1000個、嘧啶約500個 估計一個長壽命不復制繁殖的哺乳類細胞(如神經(jīng)細胞)在整個生活期間自發(fā)脫嘌呤數(shù)約為108，約占細胞DNA中總嘌呤數(shù)的3%。d.堿基修飾與鏈斷裂

細胞呼吸的副產(chǎn)物O2、H2O2等會造成DNA損傷，能產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，還可能引起DNA單鏈斷裂等損傷，每個哺乳類細胞每天DNA單鏈斷裂發(fā)生的頻率約為5萬次。此外，體內(nèi)還可以發(fā)生DNA的甲基化，結(jié)構(gòu)的其他變化等，這些損傷的積累可能導致老化。

2.物理因素引起的DNA損傷

(1)紫外線引起的DNA損傷

DNA分子損傷最早就是從研究紫外線的效應開始的。當DNA受到最易被其吸收波長(～260nm)的紫外線照射時，主要是使同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價鍵連成二聚體，相鄰的兩個T、或兩個C、或C與T間都可以環(huán)丁基環(huán)(cyclobutane ring)連成二聚體，其中最容易形成的是TT二聚體

(2)電離輻射引起的DNA損傷

電離輻射損傷DNA有直接和間接的效應，直接效應是DNA直接吸收射線能量而遭損傷，間接效應是指DNA周圍其他分子(主要是水分子)吸收射線能量產(chǎn)生具有很高反應活性的自由基進而損傷DNA。電離輻射可導致DNA分子的多種變化： a.堿基變化

主要是由OH－自由基引起，包括DNA鏈上的堿基氧化修飾、過氧化物的形成、堿基環(huán)的破壞和脫落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。b.脫氧核糖變化

脫氧核糖上的每個碳原子和羥基上的氫都能與OH－反應，導致脫氧核糖分解，最后會引起DNA鏈斷裂。c.DNA鏈斷裂

單鏈斷裂:DNA雙鏈中一條鏈斷裂稱單鏈斷裂(single strand broken)雙鏈斷裂:DNA雙鏈在同一處或相近處斷裂稱為雙鏈斷裂(doublestrand broken)。

雖然單鏈斷裂發(fā)生頻率為雙鏈斷裂的10-20倍，但還比較容易修復；對單倍體細胞來說(如細菌)一次雙鏈斷裂就是致死事件。

d.交聯(lián) 同一條DNA鏈上或兩條DNA鏈上的堿基間可以共價鍵結(jié)合 DNA與蛋白質(zhì)之間也會以共價鍵相連，組蛋白、染色質(zhì)中的非組蛋白、調(diào)控蛋白、與復制和轉(zhuǎn)錄有關的酶都會與DNA共價鍵連接。這些交聯(lián)是細胞受電離輻射后在顯微鏡下看到的染色體畸變的分子基礎，會影響細胞的功能和DNA復制。

3.化學因素引起的DNA損傷(1)烷化劑對DNA的損傷

烷化劑是一類親電子的化合物，很容易與生物體中大分子的親核位點起反應。烷化劑的作用可使DNA發(fā)生各種類型的損傷： a.堿基烷基化

烷化劑很容易將烷基加到DNA鏈中嘌呤或嘧啶的N或O上，其中鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻擊，烷基化的嘌呤堿基配對會發(fā)生變化，例如鳥嘌呤N7被烷化后就不再與胞嘧啶配對，而改與胸腺嘧啶配對，結(jié)果會使G－C轉(zhuǎn)變成A－T。b.堿基脫落

烷化鳥嘌呤的糖苷鍵不穩(wěn)定，容易脫落形成DNA上無堿基的位點，復制時可以插入任何核苷酸，造成序列的改變。c.斷鏈

DNA鏈的磷酸二酯鍵上的氧也容易被烷化，結(jié)果形成不穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，易在糖與磷酸間發(fā)生水解，使DNA鏈斷裂。d.交聯(lián)

烷化劑有兩類

單功能基烷化劑，如甲基甲烷碘酸，只能使一個位點烷基化；

雙功能基烷化劑，化學武器如氮芥、硫芥等，一些抗癌藥物如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、絲裂霉素等，某些致癌物如二乙基亞硝胺等均屬此類，其兩個功能基可同時使兩處烷基化，結(jié)果就能造成DNA鏈內(nèi)、DNA鏈間，以及DNA與蛋白質(zhì)間的交聯(lián)。

(2)堿基類似物、修飾劑對DNA的損傷 人工可以合成一些堿基類似物用作促突變劑或抗癌藥物，如5－溴尿嘧啶(5－BU)、5－氟尿嘧啶(5－FU)、2－氨基腺嘌呤(2－AP)等。由于其結(jié)構(gòu)與正常的堿基相似，進入細胞能替代正常的堿基參入到DNA鏈中而干擾DNA復制合成，例如5－BU結(jié)構(gòu)與胸腺嘧啶十分相近，在酮式結(jié)構(gòu)時與A配對，卻又更容易成為烯醇式結(jié)構(gòu)與G配對，在DNA復制時導致A－T轉(zhuǎn)換為G－C。(二)DNA損傷的后果

1.點突變(point mutation)

指DNA上單一堿基的變異。嘌呤替代嘌呤(A與G之間的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C與T之間的替代)稱為轉(zhuǎn)換(transition)；嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤則稱為顛換(transvertion)。2.缺失(deletion)

指DNA鏈上一個或一段核苷酸的消失。3.插入(insertion)

指一個或一段核苷酸插入到DNA鏈中。在為蛋白質(zhì)編碼的序列中如缺失及插入的核苷酸數(shù)不是3的整倍數(shù)，則發(fā)生讀框移動(reading frame shift)，使其后所譯讀的氨基酸序列全部混亂，稱為移碼突變 4.倒位或轉(zhuǎn)位(transposition)

指DNA鏈重組使其中一段核苷酸鏈方向倒置、或從一處遷移到另一處。 5.雙鏈斷裂

已如前述，對單倍體細胞一個雙鏈斷裂就是致死性事件。突變或誘變對生物可能產(chǎn)生4種后果 ①致死性；

②喪失某些功能；

③改變基因型而不改變表現(xiàn)型

④發(fā)生了有利于物種生存的結(jié)果，使生物進化。

二、DNA修復(一)回復修復

1.光修復

這是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修復方式。

修復是由細菌中的DNA光解酶(photolyase)完成，此酶能特異性識別紫外線造成的核酸鏈上相鄰嘧啶共價結(jié)合的二聚體，并與其結(jié)合，這步反應不需要光；結(jié)合后如受300－600nm波長的光照射，則此酶就被激活，將二聚體分解為兩個正常的嘧啶單體，然后酶從DNA鏈上釋放，DNA恢復正常結(jié)構(gòu)。后來發(fā)現(xiàn)類似的修復酶廣泛存在于動植物中，人體細胞中也有發(fā)現(xiàn)。2.單鏈斷裂的重接

DNA單鏈斷裂是常見的損傷，其中一部分可僅由DNA連接酶(ligase)參與而完全修復。此酶在各類生物各種細胞中都普遍存在，修復反應容易進行。但雙鏈斷裂幾乎不能修復。3.堿基的直接插入

DNA鏈上嘌呤的脫落造成無嘌呤位點，能被DNA嘌呤插入酶(insertase)識別結(jié)合，在K＋存在的條件下，催化游離嘌呤或脫氧嘌呤核苷插入生成糖苷鍵，且催化插入的堿基有高度專一性、與另一條鏈上的堿基嚴格配對，㈡ 轉(zhuǎn)錄模板

對于不同的基因來說，其轉(zhuǎn)錄信息可以存在于兩條不同的DNA鏈上。能夠轉(zhuǎn)錄RNA的那條DNA鏈稱為有意義鏈(模板鏈）而與之互補的另一條DNA鏈稱為反意義鏈（編碼鏈）。使DNA完全恢復。4.烷基的轉(zhuǎn)移

在細胞中發(fā)現(xiàn)有一種O6甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶，能直接將甲基從DNA鏈鳥嘌呤O6位上的甲基移到蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基上而修復損傷的DNA。這個酶的修復能力并不很強，但在低劑量烷化劑作用下能誘導出此酶的修復活性。

(二)切除修復(excision repair)①首先由核酸酶識別DNA的損傷位點，在損傷部位的5′側(cè)切開磷酸二酯鍵。不同的DNA損傷需要不同的特殊核酸內(nèi)切酶來識別和切割。②由5′→3′核酸外切酶將有損傷的DNA片段切除。

③在DNA聚合酶的催化下，以完整的互補鏈為模板，按5′→3′方向DNA鏈，填補已切除的空隙

④由DNA連接酶將新合成的DNA片段與原來的DNA斷鏈連接起來。這樣完成的修復能使DNA恢復原來的結(jié)構(gòu)。

（三)重組修復(recombinational repair)受損傷的DNA鏈復制時，產(chǎn)生的子代DNA在損傷的對應部位出現(xiàn)缺口。另一條母鏈DNA與有缺口的子鏈DNA進行重組交換，將母鏈DNA上相應的片段填補子鏈缺口處，而母鏈DNA出現(xiàn)缺口 以另一條子鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填補母鏈DNA的缺口，最后由DNA連接酶連接，完成修補。

重組修復不能完全去除損傷，損傷的DNA段落仍然保留在親代DNA鏈上，只是重組修復后合成的DNA分子是不帶有損傷的，但經(jīng)多次復制后，損傷就被“沖淡”了，在子代細胞中只有一個細胞是帶有損傷DNA的。

(四)SOS修復

SOS修復是指DNA受到嚴重損傷、細胞處于危急狀態(tài)時所誘導的一種DNA修復方式，修復結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細胞的生成率，但留下的錯誤較多，故又稱為易誤修復(error prone repair)，使細胞有較高的突變率。

Lecture 3 The expression of genetic information 轉(zhuǎn)錄（transcription): 在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA鏈為模板合成RNA，從而將DNA所攜帶的遺傳信息傳遞給RNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄。

經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成的RNA有多種，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和HnRNA。

第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄

一、轉(zhuǎn)錄與復制的比較

（一）轉(zhuǎn)錄與復制的相同點

1、均以DNA為模板

2、合成方向是5--3 `

3、服從堿基配對原則

4、均需要依賴DNA的聚合酶

二、轉(zhuǎn)錄作用及其特點 ㈠不對稱轉(zhuǎn)錄

㈡真核細胞中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都是各種RNA的前體，既無活性，亦物功能，必須在細胞核內(nèi)加工，形成由活性的RNA后，由核運至細胞質(zhì)中才能執(zhí)行翻譯功能

三、原核生物RNA的生物合成

㈠ RNA聚合酶（RNA polymerase）

這是一種不同于引物酶的依賴DNA的RNA聚合酶。

該酶在單鏈DNA模板以及四種核糖核苷酸存在的條件下，不需要引物，即可從5'→3'聚合RNA。

原核生物中的RNA聚合酶全酶由五個亞基構(gòu)成，即α2ββ‘σ。σ亞基與轉(zhuǎn)錄起始點的識別有關，而在轉(zhuǎn)錄合成開始后被釋放，余下的部分（α2ββ'）被稱為核心酶，與RNA鏈的聚合有關。

㈢轉(zhuǎn)錄過程 1.起始階段

⑴σ因子的識別作用

① RNA鏈的起始通常是在RNA聚合酶所結(jié)合DNA區(qū)域的一端，在解開的雙鏈部分，離-10開始

②處第一個核苷酸通常是pppA或pppG,較少為pppC，但偶而亦可為pppU。大約12或13個堿基處 ③σ因子的解離

RNA鏈的延伸階段開始后，σ因子即從核心酶-DNA-新生RNA復合體上解離下來，并可再用于和新的核心酶結(jié)合 延長階段

⑴ RNA聚合酶在延伸新生RNA鏈時繼續(xù)使DNA螺旋解鏈，以便暴露出模板鏈，RNA鏈的生長點是大約12bp長的RNA-DNA雜交區(qū) 在RNA鏈離開模板時，此雜交區(qū)即復原，同時兩條DNA鏈即又重復螺旋化。終止階段

細菌DNA中有轉(zhuǎn)錄終止信號，稱為終止子(terminator)終止子的作用是在DNA模板的特異位點處終止RNA的合成。

在終止子處，RNA聚合酶停止其聚合作用，將新生RNA鏈釋出，并離開模板DNA。在某些位點處，終止需要一種輔助蛋白質(zhì)，即ρ因子，但在其他位點處，核心酶本身即可終止轉(zhuǎn)錄。

不依賴ρ因子的終止子有兩個特征:

DNA順序有雙重對稱(dyad)，位于RNA3‘端之前15-20核苷酸處；

DNA模板鏈中有一串約6個A，轉(zhuǎn)錄為RNA3'端的U。雙重對稱的意義在于其轉(zhuǎn)錄本能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

依賴ρ的終止子沒有不依賴ρ的終止子特有的多聚dA序列，并且也不是都能形成穩(wěn)定的發(fā)夾。

ρ因子的作用機制，但有幾種可能性

ρ因子在RNA的存在下能水解ATP，說明它能與新生RNA鏈結(jié)合，并可能應用ATP放出的能量將RNA鏈從酶和模板中釋出。ρ因子可能與RNA聚合酶結(jié)合。

編碼ρ因子的基因rho發(fā)生突變時產(chǎn)生的某些ρ蛋白質(zhì)僅能在RNA聚合酶的β亞基也發(fā)生相應突變時才能有RNA合成的活性。

已知RNA聚合酶本身能識別DNA模板中依賴ρ的終止順序，而ρ因子是在以后才發(fā)揮作用而釋出RNA的。即使是在沒有ρ時，RNA聚合酶也在依賴ρ的終止子處暫停，不過以后仍繼續(xù)向前進。

四、真核生物的轉(zhuǎn)錄作用 ㈠ 真核細胞中的RNA聚合酶

真核生物中的RNA聚合酶可按其對α-鵝膏蕈堿敏感性而分為三種，它們均由10～12個大小不同的亞基所組成，結(jié)構(gòu)非常復雜，其功能也不同

㈡ RNA聚合酶Ⅰ

合成RNA的活性最顯著。它位于核仁中，負責轉(zhuǎn)錄編碼rRNA的基因(稱rRNA)，而細胞內(nèi)絕大部分RNA是rRNA。

聚合酶Ⅰ不被雙環(huán)八肽──α-鵝膏蕈堿抑制。RNA聚合酶Ⅱ

它位于核漿中，負責核內(nèi)不勻一RNA(hnRNA)的合成。而hnRNA是mRNA的前體。它是最直接和遺傳調(diào)節(jié)相關的酶。

RNA聚合酶Ⅱ的活性均可被低濃度的α-鵝膏蕈堿所迅速抑制 ㈢RNA聚合酶Ⅲ

負責合成tRNA和許多小的核內(nèi)RNAs。對α-鵝膏蕈堿的反應則不盡相同

在動物細胞中聚合酶Ⅲ可被高濃度α-鵝膏蕈堿所抑制 在酵母和昆蟲細胞中則不會被抑制。㈣常用的轉(zhuǎn)錄抑制劑

★轉(zhuǎn)錄單位

真核生物的一個轉(zhuǎn)錄單位就是一個基因，由一個結(jié)構(gòu)基因和相應的順式調(diào)控元件組成。

一個轉(zhuǎn)錄單位只有一個結(jié)構(gòu)基因。㈤轉(zhuǎn)錄因子

真核生物在轉(zhuǎn)錄時往往需要多種蛋白質(zhì)因子的協(xié)助。一般可將這些轉(zhuǎn)錄所需的蛋白質(zhì)分為三大類(1)RNA聚合酶的亞基，它們是轉(zhuǎn)錄必須的，但并不對某一啟動子有特異性。(2)某些轉(zhuǎn)錄因子能與RNA聚合酶結(jié)合形成起始復合物，但不組成游離聚合酶的成分。

這些因子可能是所有啟動子起始轉(zhuǎn)錄所必須的。亦可能僅是轉(zhuǎn)錄終止所必須的。

在這一類因子中，要嚴格區(qū)分開哪些是RNA聚合酶的亞基，哪些僅是輔助因子，是很困難的。

(3)某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異順序結(jié)合。

如果這些順序存在于啟動子中，則這些順序因子是一般轉(zhuǎn)錄機構(gòu)的一部分。如果這些順序僅存在于某些種類的啟動子中，則識別這些順序的因子也只是在這些特異啟動子上起始轉(zhuǎn)錄必須的。

起始階段

RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄起始

RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是hnRNA 真核生物的轉(zhuǎn)錄起始較為復雜。目前已知RNA聚合酶Ⅱ至少有六種不同的蛋白因子參與轉(zhuǎn)錄復合體的形成。這些蛋白因子被稱為轉(zhuǎn)錄因子（transcriptional factor, TF)。包括 TFⅡA，TFⅡB，TFⅡD，TFⅡE，TFⅡF，TFⅡ-I。終止階段

RNA轉(zhuǎn)錄合成的終止機制有兩種：

1．自動終止：模板DNA鏈在接近轉(zhuǎn)錄終止點處存在相連的富含GC和AT的區(qū)域，使RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成寡聚U及發(fā)夾形的二級結(jié)構(gòu)，引起RNA聚合酶變構(gòu)及移動停止，導致RNA轉(zhuǎn)錄的終止。2．依賴輔助因子的終止：由終止因子(ρ因子)識別特異的終止信號，并促使RNA的釋放。

真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾

一、mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 1．加帽(adding cap)：

即在mRNA的5'-端加上m7GTP的結(jié)構(gòu)。此過程發(fā)生在細胞核內(nèi)，即HnRNA即可進行加帽。加工過程首先是在磷酸酶的作用下，將5'-端的磷酸基水解，然后再加上鳥苷三磷酸，形成GpppN的結(jié)構(gòu)，再對G進行甲基化。

2．加尾(adding tail)：

這一過程也是細胞核內(nèi)完成，首先由核酸外切酶切去3'-端一些過剩的核苷酸，然后再加入polyA。polyA結(jié)構(gòu)與mRNA的半壽期有關。3．剪接（splicing)：

真核生物中的結(jié)構(gòu)基因基本上都是斷裂基因。結(jié)構(gòu)基因中能夠指導多肽鏈合成的編碼順序被稱為外顯子，而不能指導多肽鏈合成的非編碼順序就被稱為內(nèi)含子。

第二節(jié) 翻譯

翻譯（translation）

蛋白質(zhì)的生物合成過程，就是將DNA傳遞給mRNA的遺傳信息，再具體的解譯為蛋白質(zhì)中氨基酸排列順序的過程，這一過程被稱為翻譯 蛋白質(zhì)合成體系

① mRNA：作為蛋白質(zhì)生物合成的模板，決定多肽鏈中氨基酸的排列順序； ② tRNA：搬運氨基酸的工具；

③ 核蛋白體：蛋白體生物合成的場所； ④ 酶及其他蛋白質(zhì)因子； ⑤ 供能物質(zhì)及無機離子。

一、mRNA

作為指導蛋白質(zhì)生物合成的模板。mRNA中每三個相鄰的核苷酸組成三聯(lián)體，代表一個氨基酸的信息，此三聯(lián)體就稱為密碼(coden)。共有64種不同的密碼。

遺傳密碼具有以下特點：

① 連續(xù)性； ② 簡并性； ③ 通用性；（但在線粒體或葉綠體中特殊）④ 方向性，即解讀方向為5′→ 3′； ⑤ 擺動性；

⑥ 起始密碼：AUG；終止密碼：UAA、UAG、UGA。

二、tRNA

在氨基酸t(yī)RNA合成酶催化下，特定的tRNA可與相應的 氨基酸結(jié)合，生成氨基酸t(yī)RNA，從而攜帶氨基酸參與蛋白質(zhì)的生物合成。tRNA反密碼環(huán)中部的三個核苷酸構(gòu)成三聯(lián)體，可以識別mRNA上相應的密碼，此三聯(lián)體就稱為反密碼(anticoden)。

反密碼對密碼的識別，通常也是根據(jù)堿基互補原則，即A—U，G—C配對。但反密碼的第一個核苷酸與第三核苷酸之間的配對，并不嚴格遵循堿基互補原則。如反密碼第一個核苷酸為Ⅰ，則可與A、U或C配對，如為U，則可與A或G配對，這種配對稱為不穩(wěn)定配對。

三、rRNA和核蛋白體

原核生物中的核蛋白體大小為70S，可分為30S小亞基和50S大亞基。小亞基：由16SrRNA和21種蛋白質(zhì)構(gòu)成。大亞基：由5SrRNA，23SRNA和35種蛋白質(zhì)構(gòu)成。

真核生物中的核蛋白體大小為80S，也分為40S小亞基和60S大亞基。小亞基：由18SrRNA和30多種蛋白質(zhì)構(gòu)成。大亞基：則由5S rRNA，28S rRNA和50多種蛋白質(zhì)構(gòu)成

蛋白質(zhì)生物合成過程包括三大步驟： ①氨基酸的活化與搬運；

②活化氨基酸在核蛋白體上的縮合； ③多肽鏈合成后的加工修飾。

一、氨基酸的活化與搬運

氨基酸的活化以及活化氨基酸與tRNA的結(jié)合，均由氨基酰tRNA合成酶催化完成。其反應過程為：

（一）起動階段

1．40S起動復合物的形成：

在起動因子的促進下，40S小亞基與mRNA的起動部位，起動tRNA

（fmet-tRNAfmet），和GTP結(jié)合，形成復合體。

原核mRNA的起動部位由一段富含嘌呤的特殊核苷酸順序組成，稱為SD序列（核蛋白體結(jié)合位點，RBS），可被核蛋白體小亞基辨認結(jié)合。真核生物中的mRNA具有帽子結(jié)構(gòu)，已知需一種特殊的帽子結(jié)合蛋白（CBP）以識別此結(jié)構(gòu)。

2．80S起動前復合體的形成：IF3從40S起動復合體上脫落，60S大亞基與復合體結(jié)合，形成80S起動前復合

（二）肽鏈延長階段

1．進位：與mRNA下一個密碼相對應的氨基酰tRNA進入核蛋白體的受位。此步驟需GTP，Mg2+，和EF參與。2．成肽：

在轉(zhuǎn)肽酶的催化下，將給位上的tRNA所攜帶的甲酰蛋氨酰基或肽酰基轉(zhuǎn)移到受位上的氨基酰tRNA上，與其α-氨基縮合形成肽鍵。此步驟需Mg2+，1973年S.Cohen 也成功的進行了另一個體外重組實驗，他將編碼有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌R6-5質(zhì)粒DNA與編碼有四環(huán)素抗性基因的另一種大腸桿菌質(zhì)粒pSC101 DNA混合后加入內(nèi)切酶EcoRI對DNA進行切割，再用T4連接酶將它們連接成重組分子，用這種連接后的重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，某些轉(zhuǎn)化菌落表現(xiàn)出了既抗卡那霉素又抗四環(huán)素的雙重抗性特征。

以上兩個實驗帶給人們的啟示：

DNA是可以在體外進行切割和拼接的

利用細菌細胞可以快速的復制DNA并能夠合成蛋白質(zhì)。這兩個實驗也標致著基因工程技術的誕生 K+。給位上已失去蛋氨酰基或肽酰基的tRNA 3．移位：

核蛋白體向mRNA的3'-端滑動相當于一個密碼的距離，同時使肽酰基tRNA從受體移到給位。此步驟需EF（EFG）、GTP和Mg2+參與。此時，核蛋白體的受位留空，與下一個密碼相對應的氨基酰tRNA即可再進入，重復以上循環(huán)過程，使多肽鏈不斷延長。

（三）肽鏈終止階段

核蛋白體沿mRNA鏈滑動，不斷使多肽鏈延長，直到終止信號進入受位。1．識別：RF識別終止密碼，進入核蛋白體的受位。

2．水解：RF使轉(zhuǎn)肽酶變?yōu)樗饷福嚯逆溑ctRNA之間的酯鍵被水解，多肽鏈釋放。

3．解離：通過水解GTP，使核蛋白體與mRNA分離，tRNA、RF脫落，核蛋白體解離為大、小亞基。

分子生物學研究的對象 蛋白質(zhì)和核酸

對核酸、蛋白質(zhì)的研究積累為分子生物學技術的成熟打下了重要性的基礎。

70年代初是分子生物學成熟標致的重要時期，因為誕生了分子生物學應用的一個重要學科——基因工程。

80年代誕生的PCR技術將復雜的分子生物學技術簡單化了，便得更加容易推廣和應用。使得分子生物學技術一下普及到了一般的實驗室。PCR技術，又稱為聚合酶鏈式反應，它利用一對特異性的引物和耐高溫的DNA聚合酶，在短短的2-3小時內(nèi)將一段DNA擴增到1000萬倍，對實驗室的條件的要求也降到最低點。

1990年開始的“人類基因組計劃”將分子生物學帶入到一個高通量的發(fā)展時代。生命科學進入到了基因組和后基因組時代。

基因工程genetic engineering

1.基因工程誕生的理論基礎

基因工程的誕生依賴于在此之前生命科學基礎理論的發(fā)展成就，概括起來主要包括三個方面：

⑴ 40年代確定了遺傳物質(zhì)是DNA，它是遺傳信息的載體。

⑵ 50年代發(fā)現(xiàn)DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)并揭示了半保留復制的機理，揭示了基因的自我復制和表達的機理。

⑶ 50年代末至60年代初，相繼提出了“中心法則”和操縱子學說，并成功破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達問題。2．工具酶的發(fā)現(xiàn)為基因工程的誕生奠定了技術的基礎： 3．基因工程的誕生

1972年H.Boyer 和 P.Berg 第一次完成了DNA的體外重組實驗，用E.coRI在體外對SV40的DNA和λ噬菌體的DNA進行了消化，然后用T4連接酶將消化后的DNA片段進行了連接，結(jié)果獲得了重組的雜種DNA分子。

基因工程所使用的名稱：

重組DNA技術(recombinant DNA technique)遺傳工程(genetic engineering)基因工程(gene engineering)基因操作(gene manipulation)基因克隆(gene cloning)

分子克隆(molecular cloning)基因工程的基本內(nèi)容：

1．將兩種不同來源的DNA－－即目的DNA和載體DNA提取純化。2．用限制性內(nèi)切酶處理DNA。

3．用連接酶將切開的不同源的DNA連接到一起，構(gòu)成重組DNA。4．將重組DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。

5．通過大量的培養(yǎng)細菌，以達到擴增目的基因或表達蛋白的目的。

基因工程的目的： 進行分子克隆

表達重組基因所編碼的蛋白質(zhì)

工具酶

一、限制酶(restriction enzyme)

?

全稱限制性核酸內(nèi)切酶、簡稱限制酶或內(nèi)切酶。

1． 限制酶的分類

限制酶有三種：I型、II型、III型。2.限制酶的命名

一般的限制酶通常由四個拉丁文字母組成第1個字母代表產(chǎn)生該酶的細菌的屬名，第2、3個字母代表產(chǎn)生該酶的細菌種名

第4個字母代表產(chǎn)生該酶的菌株號。

3.限制酶的識別和切割位點

根據(jù)Ⅱ型酶種類割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口： ⑴產(chǎn)生平末端

⑵產(chǎn)生5’端突出的粘性末端 ⑶產(chǎn)生3’端突出的粘性末端 6.限制酶使用的條件 ⑴ 緩沖系統(tǒng)：

50mmol/L tris.Cl 10mmol/L Mg++ 1mmol/L DTT NaCl ⑵ 反應體積

⑶ 反應溫度和時間 ⑷ 限制酶的商業(yè)化 7.限制酶的商業(yè)化

試劑公司的名稱： Promaga公司 安瑪西亞公司

大連保生物公司 北京賽百勝公司 北京華美公司

購買酶時的注意事項：價格因素 供貨時間 運輸方式

酶的保存

修飾酶

⒈逆轉(zhuǎn)錄酶種類：

禽類成骨細胞性白血病病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶

小鼠白血病病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶 ⒉ T4DNA連接酶

從噬菌體中提取，用于DNA的連接 ⒊ 堿性磷酸酶

可將DNA或RNA5’的磷酸去除，可用于制止不希望發(fā)生的連接反應進行。⒋末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶

用于將已標記好的單核苷酸加到DAN的3’端上，起到標記的作用；有時也可用于DNA片段的同聚尾的形成。

載體(vector)在基因工程中的作用: 將外源DNA插入其中，并一同轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到宿主細胞中，能夠穩(wěn)定的保存下來，完成外源DNA克隆和表達的功能。載體所必需的條件

1必須有自身的復制子，并能攜帶重組DNA一起復制。2載體分子上必須有限制性內(nèi)切酶位點即多克隆位點。3載體必須具有可供選擇的標置，便于重組分子的篩選。

4載體分子盡量小，便于能插入較大的外源DNA，最好是高考貝。5表達載體必須具備能在宿主細胞中表達的能力。

一、常用的克隆載體

㈠質(zhì)粒plasmid 1．質(zhì)粒的一般特點

? 細菌質(zhì)粒是一些雙鏈閉環(huán)的DNA分子，這些質(zhì)粒都是獨立于染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。通常，質(zhì)粒含編碼某些基因的酶，這些酶在一定環(huán)境下對宿主細胞有利。由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型對抗生素的抗性、產(chǎn)抗生素、降解復雜有機化合物，以及產(chǎn)生大腸桿菌素，及限制酶、修飾酶等。

? 質(zhì)粒都帶有獨立的復制子，能獨立的自我復制。但在復制時必須依賴宿細菌的酶。

?

質(zhì)粒的不親和性(不相容性)

質(zhì)粒的三種狀態(tài)

松馳型和嚴緊型 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性

多數(shù)質(zhì)粒在自然條件下可以通過細菌結(jié)合的作用轉(zhuǎn)移到新的宿細胞中。然而，由于質(zhì)粒缺少一種轉(zhuǎn)移所必須的mob基因，因此不能獨立的從一個細菌到另一個細菌的接合轉(zhuǎn)移。選擇標記

質(zhì)粒載體的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段：

第一階段：將選擇標記引入含有復制子的質(zhì)粒中。

最早用作克隆載體的質(zhì)粒子有多種局限性：復制效率低；帶有不適合的選擇標記；酶切位點少且不集中等，pBR322是早期最為成功的將所有理想的特性囊括于一身的質(zhì)粒載體。第二階段：高效型載體的發(fā)展

發(fā)展的趨勢是調(diào)整載體的結(jié)構(gòu)，提高載體的效率，減少載體的長度，擴充載體的容納外源DNA的能力。這期間質(zhì)粒的代表是：pUC19等。第三階段：引入多種用途的輔助序列

這些用途包括通過組織化學檢測方法肉眼鑒定重組克隆，產(chǎn)生用于序列分析的單鏈DNA，外源蛋白的大量表達等用途的質(zhì)粒載體。

㈡λ噬菌體

1．λ噬菌體分子生物學

λ噬菌體的基因組是一長度50kb的雙鏈DNA，其末端為長12bp的天然互補單鏈（粘端）。當它進入宿細胞后其粘端會配對結(jié)合成環(huán)形，它在侵入宿細胞后可以兩種方式進行復制：

裂解性生長 溶源性生長

2．λ噬菌體作為載體所具有的特征

不利因素：野生型λ噬菌體有一個龐大的基因組，其DNA可分為頭部、中央部分和尾部三個部分。其基因組由頭部（由7個基因組成）、尾部（由11個基因組成）、重組基因（5個基因和一個識別位點）、正調(diào)控基因（2個基因）、負調(diào)控基因（5個基因）、DNA合成基因（2個基因）、裂解基因（2個基因）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及識別位點組成。在沒有改造的情況下，λ噬菌體無法插入較大的外源DNA片段，無較集中的酶切位點和好的識別標置。3．λ噬菌體載體的改造：

在λ噬菌體DNA的中央部分（約占30%）是其生長的非必須區(qū)，當外源基因取代該區(qū)或該區(qū)缺失時，對噬菌體的生長不會造成影響。此外，外源基因不超過其本身的10倍數(shù)時，均可被包裝為成熟顆粒，具有噬菌體活性。

目前使用的λ噬菌體載體都經(jīng)過了改造，在其中加上了較集中的酶切位點、還加上了細菌的啟動子，這不僅使其具有擴增外源DNA的能力，還使它能夠表達外源基因的產(chǎn)物。

λ噬菌體的用途： λ噬菌體主要用于cDNA文庫的構(gòu)建。㈢粘性質(zhì)粒

粘性質(zhì)粒是一種將λ噬菌體和質(zhì)粒兩種載體結(jié)合起來形成的一種人工載體。它具有如下特征：

⑴含有質(zhì)粒的抗藥性標記，如Ampr基因。

⑵載體帶有噬菌體的cos區(qū)，所以對其進行體包裝是必不可少的。

⑶具有多克隆位點。

⑷形體本身的體積很小，但容量大，可插入40kb大小的DNA片段。

⑸一般非重組的載體體積小，而無法進行體外包裝，因而無法轉(zhuǎn)染細菌，只有包裝了的重組體才能進入細菌，有利于篩選。㈣M13噬菌體

M13噬菌體是一種大腸桿菌的噬菌體它在轉(zhuǎn)染大腸桿菌后進行一段時間的復制后開始進行不對稱復制，而形成大量的單鏈DNA，而后將這些單鏈DNA進行包裝病毒顆粒后釋放到細菌外，利用這一特點，可大量克隆單鏈的DNA分子用于制備核酸探針和DNA測序的材料。㈤大容量測序用載體

在基因組學的研究中，需要將基因組的DNA片段切割成較的片段進行測序，以此來提高測序的速度。但我們前面提到的載體一般都無法滿足這一需要，為了達到這一目的，人們開發(fā)出了酵母人工染色體(YAC)和細菌人工染色體(BAC)，前者可容納100萬個堿基的DNA片段，后者可容納30萬個堿基的DNA片段。

載體的表達

用于目的基因的表達。可分為大腸桿菌表達載體和哺乳動物表達載體。㈠大腸桿菌表達載體

一般具備有細菌轉(zhuǎn)錄的啟動子，可人為的進行操縱，如多數(shù)質(zhì)粒載

體中都帶有乳糖操縱子的啟動子，能在乳糖存在的情況進行誘表達。㈡哺乳動物表達載體

多數(shù)是一些真核細胞病毒經(jīng)過改造而成形的。

重組DNA技術的基本過程

一、目的基因的制備 ㈠傳統(tǒng)的辦法 1.制備基因組DNA 將整個一個物種的基因組提取出來后用于基因工程的操作。常用于建立基因文庫。

2.制備cDNA文庫,并從中篩選目的基因

將一個物種或細胞中的全部RNA提取出來再從中提取mRNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶將其合成為cDNA，再將其重組于載體后，轉(zhuǎn)錄到大腸桿菌后形成cDNA文庫。

㈡制備用于表達的基因片段 ⒈直接用限制性酶切取

⒉用PCR技術體外擴增目的基因 ⒊化學合成

㈢利用生物信息學的技術和原理來選擇目的片段

是現(xiàn)在最普遍使用及最為方便的手段

二、載體的選擇和制備

載體均是商品，根據(jù)實驗的目的來選擇合適的載體，如分子克隆、表達、測序或長期保存目的基因等。即可以購買，也可以索求

三、DNA分子體外重組 基因工程的策略

?確定重組實驗的目的——是獲得目的基因，還是獲得表達產(chǎn)物。

?根據(jù)經(jīng)濟情況選擇合適的用品——包括質(zhì)粒（可以買成品，也可以向人索取質(zhì)粒自己提取）、酶的選擇等。

?制定周密的實驗計劃，基因工程的實驗周期都比較長，如計劃不周，將造成時間和經(jīng)濟上的損失。

?酶切位點的選擇 選擇合適的連接方式

四、將外源重組DNA導入宿主細胞

㈠轉(zhuǎn)化：主要指將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細菌的過程。通常是先將細菌細胞制備成感受態(tài)的菌，然后再進行轉(zhuǎn)化。

轉(zhuǎn)化常用的方法有兩種：化學轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)移

㈡轉(zhuǎn)染：主要指將噬菌體和病毒轉(zhuǎn)入細胞的過程。

五、目的基因的篩選和鑒定

篩選和鑒定的方式有許多種，要仿照最初的實驗方案來確定。常用的方式有：

用抗生素選擇培養(yǎng)基來篩選

用藍白斑選擇培養(yǎng)基來篩選

根據(jù)酶切方案來篩選

直接提取質(zhì)粒來篩選

提取質(zhì)粒和酶相結(jié)合來篩選

分子雜交 DNA測序

在醫(yī)學中的應用

1.基因工程用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物

治療糖尿病的胰島素，是一種 51 個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)1982 年美國 EliLilly 公司推出基因工程制造的人胰島素，商品名為(Humulin)。干擾素用于治療肝炎等病毒感染性疾病，有良好療效。升發(fā)酵液中所得的干擾素相當于過去從 1000 升人血中所得。生產(chǎn)成本也大為降低。

目前用基因工程生產(chǎn)的蛋白質(zhì)藥物已達數(shù)十種，許多以前本不可能大量生產(chǎn)的生長因子，凝血因子等蛋白質(zhì)藥物，現(xiàn)在用基因工程辦法便可能大量生產(chǎn)。

正在開發(fā)的350種生物技術藥物中，1/3以上用于腫瘤，其中有30種用于黑素瘤，20種用于結(jié)直腸癌，13種用于乳腺癌，13種用于前列腺癌。

正在開發(fā)的疫苗有77種，用于預防或治療HIV感染、AIDS、結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、多發(fā)性硬化、中風。

正在開發(fā)的生物技術藥物中，有29種用于HIV感染、AIDS和AIDS相關疾病；19種用于自身免疫性疾病，其中11種用于類風濕性關節(jié)炎、3種用于狼瘡；8種用于血液疾病，其中4種用于血友病，一種用于鐮形細胞性貧血。

2.基因工程用于疫苗生產(chǎn)

常用的制備疫苗的方法，一種是弱毒活疫苗，一種是死疫苗。兩種疫苗各有自身的弱點。活疫苗隱含著感染的危險性。死疫苗免疫活性不高，需加

大注射量或多次接種。

利用基因工程制備重組疫苗，可以克服上述缺點，亞基疫苗指只含有病原物的一個或幾個抗原成分，不含病原物遺傳信息。重組亞基疫苗就是用基因工程方法，把編碼抗原蛋白質(zhì)的基因重組到載體上去，再送入細菌細胞或其他細胞中區(qū)大量生產(chǎn)。這樣得到的重組疫苗往往效價很高，但決無感染毒性等危險。

在酵母中表達乙型肝炎表面抗原 HBsAg 產(chǎn)量可達每升 2.5mg，已于 1984 年問世。

基因工程生產(chǎn)疫苗有良好的發(fā)展前景。3.基因工程用于基因治療

人體基因的缺失，導致一些遺傳疾病，應用基因工程技術使缺失的基因歸還人體，達到治療的目的，已成為基因工程在醫(yī)學方面應用的又一重要內(nèi)容。

分子生物學常用技術

核酸的分子雜交Nucleic acid hybridization 分子雜交的原理：

DNA具有變性的特點 變性的DNA還能復性

分子雜交的概念 用已知的DNA序列制成探針，來檢測末知的樣本DNA。

核酸分子雜交的基本過程:

首先要確定檢測的目標，即檢測的目的核酸片段，這個片段的序列必須是已知的。

根據(jù)此設計一個探針（與檢測目的核酸互補的序列），并對其進行合成和標記。

再通過雜交實驗來完成探針對目的核酸的檢測。

分子雜交的形式：

液相雜交 固相雜交 固相雜交的一般過程

1.首先設計、合成探針。2.收集標本，并提取核酸。

3.將提好的核酸樣本點到固相支持物上。4.封閉。

5.通過變性和復性完成雜交。6.漂洗

7.放射自顯影

核酸分子雜交技術的演變

斑點雜交 southern blot northern blot 原位雜交 芯片技術

聚合酶鏈式反應 Polymerase chain reaction(PCR)PCR技術的形成及發(fā)展

PCR的實現(xiàn) 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內(nèi)復制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適的條件——摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間, 合成DNA的原料。

PCR的改進與完善

Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統(tǒng)的基因擴增具備許多突出的優(yōu)點，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得PCR技術在一段時間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學界的足夠重視

1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)為PCR技術的廣泛應用打下了基礎。PCR 技術的實驗原理

模擬細胞內(nèi)DNA合成的過程

利用了DNA變性、復性和能進行雜交的特點，在引物存在的條件下DNA聚合酶開始對DNA進行體外合成。

通過全自動的熱循環(huán)儀來完成 PCR的基本原理 PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點

PCR反應的基本條件

模板的制備: 模板是進行DNA體外擴增的依據(jù)，它的來源于不同的材料。PCR對模板的質(zhì)量要求很高，但對它量的要求不高。

制備模板的材料：

新鮮材料：人或動物的血液及組織中提取；

從少量材料：痰、尿液、腹腔液等;法醫(yī)學的材料：血斑、精斑等；

考古材料

從以往保存的材料，如石蠟切片的蠟塊中。

提取的原理和方法：（略）

引物的設計：

引物的設計首先要依據(jù)你已知的序列來設計。即你要擴增的目的DNA片段。這些資料可以從文獻上查找或從互聯(lián)網(wǎng)上來檢索。

實際做的過程中，引物也可借助于別人已經(jīng)發(fā)表的引物來。但從經(jīng)驗上說，別人公開發(fā)表的引物常常含有一定的錯誤。所以要進行核查。

設計引物應遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

⑤引物-3’端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物 量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

PCR所用試劑： DNA聚合酶

buffer:包括兩種，一種是含Mg++，一種是不含Mg++。dNTPs 純凈水

自己要準備的模板DNA的制備和引物的設計與合成。PCR的操作過程

設定一個加樣配方： 標準的PCR反應體系：

10×擴增緩沖液 5ul

4種dNTP混合物

各200umol/L

引物

各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至 50ul

加樣：

單樣本加樣

多樣本加樣

加樣的順序 PCR反應條件的設定：

預就性溫度： 94℃，5分

變性溫度： 94℃，30秒

退火溫度： 需要摸條件

延伸溫度： 72℃，30秒

總延伸溫度： 72℃，15分

PCR結(jié)果的鑒定

通過凝膠電泳的方式來進行。

RT-PCR(reverse transcription-PCR)RT－PCR技術的應用

用于制備基因工程的目的基因片段。

用于表達譜的檢測。PCR技術的應用

PCR的初衷是為特異性的擴增某段DNA

現(xiàn)在PCR在醫(yī)學研究中主要是用于基因診斷，常用于：

對遺傳病的突變基因進行診斷

對病原體的基因診斷

通過PCR結(jié)合限制酶切的診斷 SSCP技術進行點突變的診斷 RT-PCR進行結(jié)構(gòu)基因的擴增及定量表達 熒光定量PCR技術

PCR結(jié)合多態(tài)性分析

PCR擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分析有2種情況：

限制片段多態(tài)性分析(A)、(B)重復序列多態(tài)性分析(A)、(C)SSCP技術進行點突變的診斷 實時熒光定量PCR技術

電泳技術electrophoresis technology 核酸的凝膠電泳

一、基本原理

1．核酸分子在水溶液中呈多聚陰離子。加上電場，它們會向正電極的方向遷移。2．在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。

3．電泳環(huán)境的影響：緩沖液的組成和離子強度直接影響遷移速度。

當電泳緩沖液中無離子時，溶液導電性極小，電泳速度慢。當電泳緩沖液中離子濃度極強時，則導電性極高，并易產(chǎn)熱。

pH值也影響遷移率，溶液的pH遠離樣品的等電點時，樣品顆粒的電離程度大，相應的電泳速率就大。凝膠的濃度的不同對同樣大小顆粒的電泳速

率也不相同，因此，不同濃度的凝膠分辨DNA分子大小的能力也不同。

表：瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力

凝膠類型及結(jié)構(gòu) 分離DNA片段的大小范圍(bp)0.3%瓊脂糖 50 000-1 000 0.7%瓊脂糖 20 000-1 000 1.4%瓊脂糖 6 000-300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000-100 10.0%聚丙烯酰胺 500-25 20.0%聚丙烯酰 50-1

4．凝膠電泳的目的：

可將大小不等的DNA片段和蛋白分子進行分離，并通過標準分子量基本原理：

maker鑒定其大小。

對所要的目的分子進行純化提取。

二、瓊脂糖凝膠電泳 Agarose Gel Electrophoresis 瓊脂糖是從海藻中提取出的長鏈狀多聚糖，當它被加熱到90℃時可被溶解成半透明的液體，這時便于澆板并在冷卻后固化成凝膠。其凝固點這40-45℃。

瓊脂糖電泳的優(yōu)點：操作方便，并可用來鑒定和純化特定的DNA分子。

用低溶點瓊脂糖來分離并純化DNA。

瓊脂糖電泳的不足之處：它的分辨范圍在0.3-50kb之間，對一些分辨更小DNA分子的實驗將無法進行。

瓊脂糖電泳結(jié)果的顯示：

利用核酸與溴化乙錠吸附性強的特點，用溴化乙錠來顯色。

三、聚丙烯酰胺凝膠電泳

(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)電泳材料：

丙烯酰胺

CH2═CH─C—NH2 ║ O N,N?ˉ-亞甲雙丙烯酰胺

H H │ │ CH2═CH─C—N—CH2—N—CH═CH2 ║ O 兩種丙烯酰胺在促凝劑存在的條件下可以凝集成膠。

PAGE的優(yōu)點和不足：優(yōu)點是分辨率高，不足是操作復雜，成本高。PAGE的凝膠可用溴化乙錠染色，也可以銀染，后者的分辨率高。

四、SDS-變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

(SOS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)

SDS-PAGE專門用于蛋白質(zhì)電泳。

基本原理：在蛋白質(zhì)電泳前，先將其變性成線結(jié)構(gòu)，并使其表面都吸附上帶負電荷的活性分子-----SDS。

蛋白質(zhì)印跡技術

Western blotWestern blot 技術是借鑒了Southern blot 技術的原理而設計。它也是在凝膠電泳后通過轉(zhuǎn)移電泳將電泳分離物移到固相支持物上再進行進一步的分析。

與Southern blot不同的是，它用來雜交的不是探針，而是特異性的物體。

Western blot的基本過程

先通過SDS-PAGE將樣本中的蛋白質(zhì)分離

通過轉(zhuǎn)移電泳將凝膠上的樣本移到硝酸纖維膜上 封閉硝酸纖維膜

用一抗來特異性的識別目標蛋白 用酶標二抗來識別一抗 顯色

DNA序列分析

Sanger雙脫氧終止法(手工測序)基本原理：

DNA在復制時，需要兩個單核苷酸之間脫去一分子水后形成磷酸二酯鍵。如果在其中加入雙脫氧的單核苷酸，將中止DAN的復制。通過自動化的DNA測序儀來進行測序

二、基因組的大規(guī)模的測序列 新一代測技術的出現(xiàn)

第二代測序技術的核心思想是邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis)，即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術平臺主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。

酶聯(lián)免疫吸附分析Enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA)

通過免疫學技術(抗原、抗體反應)對樣本中的目標蛋白質(zhì)進行特異性的定性或定量分析。被檢測的蛋白質(zhì)即可能是抗原，也可以是抗體。基本過程：

1.將抗體或抗原結(jié)合到固相支持物上

2.用特異性的抗原或抗體(被酶標記)對其進行免疫識別。3.通過酶標儀來檢測結(jié)果

ELISA常用的方法有：

雙抗體夾心法

間接法

一、轉(zhuǎn)基因技術 1.轉(zhuǎn)基因技術的概念

轉(zhuǎn)基因技術指的是將一個物種的特定基因通過人工的方法轉(zhuǎn)入到另一種生物的細胞中，并使它獲得了轉(zhuǎn)入基因的特性。

2.轉(zhuǎn)基因技術的類型

轉(zhuǎn)基因技術可分多個層次：

廣義的講，最基本的轉(zhuǎn)基因技術就是基因工程，即將高等生物的基因通過體外重組后，轉(zhuǎn)化入細菌或酵母細胞。

真正意義上的轉(zhuǎn)基因技術是指轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因動物。它們多是將外源基因注入生殖細胞或受精卵子中，并讓外源基因整合到其基因組中，并使其在胚胎及發(fā)育成熟的個體中獲得表達，形成具有新特性的個體。

三、轉(zhuǎn)基因動物 transgenic animal

1．轉(zhuǎn)基因動物的簡史

1980年，J.W.Gordon等人首次報道用顯微注射的方法向小鼠胚胎注射純化的DNA，開辟了轉(zhuǎn)基因動物研究的先河。

1982年，R.D.Palmiter等又報道用轉(zhuǎn)移生長激素基因的方法，獲得了7只轉(zhuǎn)基因鼠，其中1只比一般小鼠大一倍，被稱為巨鼠，引起極大的轟動。相繼有轉(zhuǎn)基因豬、魚、兔和羊等問世。

2．轉(zhuǎn)基因動物研究概況

⑴轉(zhuǎn)基因動物在培育新品種中的應用

在轉(zhuǎn)基因動物歷史上，培育高效益的家畜、家禽和水生動物新品種曾經(jīng)是研究工作的主流。受“巨鼠”的影響，人們期望能通過轉(zhuǎn)基因動物的研究，獲得快速生長、節(jié)約飼料、產(chǎn)毛多、產(chǎn)蛋多和抗病的動物新品種。

主要是將生長激素和類胰島激素的基因轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)，并且取得了良好的增長效果，但也表現(xiàn)出一系列病理性副作用，關節(jié)炎和胃病尤其明顯。但轉(zhuǎn)基因魚是一個例外。

⑵動物生物反應器(animal bioreactor)用動物乳腺生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)的優(yōu)點：

動物乳腺是一個自我封閉的系統(tǒng)，它表達的蛋白質(zhì)絕大多數(shù)不會回到血液循環(huán)系統(tǒng)中去，可以避免大量表達的外源蛋白質(zhì)對動物的健康造成危害。

乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器，一頭奶牛一年可產(chǎn)乳蛋白250-300千克，一只羊一年可產(chǎn)乳蛋白25-30千克。如果把百分之一的乳蛋白代換為醫(yī)用蛋白質(zhì)，產(chǎn)量十分可觀。

乳腺組織可以對人體蛋白質(zhì)進行正確的修飾和后加工，產(chǎn)品活性接近天然產(chǎn)品。

在動物乳腺表達的外源基因可以遺傳，一旦獲得成功，可以用常規(guī)畜牧技術繁殖產(chǎn)生群體。

我國轉(zhuǎn)基因動物研究的領軍人物

——中國工程院院士曾溢滔教授

⑶抗病育種

將具有抗病能力的基因?qū)雱游铮蛊渚哂休^理想的抗病能力。目前已做的工作有：

抗豬瘟育種：

抗流感基因工程育種：1989年Young將INF基因質(zhì)粒導入小鼠受精卵，獲得表達，獲得抗病轉(zhuǎn)基因小鼠。

抗腫瘤動物模型：美國首先培育出易發(fā)乳腺癌的轉(zhuǎn)基因小鼠，為研究癌誘發(fā)和抗腫瘤藥物的篩選提供了研究的模型。迄今已培育出許多與癌基因有關的轉(zhuǎn)基因小鼠。⑷基因治療

⑸組織器官移植：

將人的標志基因移入豬，使其器官上具有了人的抗原標志，減小了排異反應。

3.轉(zhuǎn)基因動物的技術路線 ⑴經(jīng)典的技術路線

先從已交配的供體動物的輸卵管中采取受精卵；

顯微注射法向受精卵的雄性核導入人工構(gòu)建的藥物蛋白基因；

經(jīng)外科手術把已導入外源基因的受精卵移入同步發(fā)情的受體母羊輸卵管內(nèi)；

讓受精卵在“養(yǎng)母”體發(fā)育至分娩出生；

用分子生物學技術檢測出生小羊是否已整合了導入的外源基因。

該法的缺點：實驗周期長，注射的外源基因整合率低。

⑵整合胚胎移植技術路線

該技術是對前種方法的改進。它利用了生殖技術中的體外受精技術，使精子和卵子在體外受精；然后找到一個最佳時機向體外受精的細胞顯微注射藥物蛋白基因。然后在體對胚胎體進行整合的鑒定。從中挑選有目的基因整合的胚胎進行移植。采用經(jīng)陰道的非手術胚胎移植法，減少了對受精卵的損傷。

⑶核移植（克隆）技術路線

利用克隆技術進行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灐＜丛谶M行克隆之前，先目的基因注射到將進行移植的核中，在按克隆技術進行操作。其成功率比經(jīng)典技術路線高2.5倍。

⑷整合卵受精技術路線

即在受精之前先將藥物蛋白基因注射進入卵細胞，經(jīng)檢測已經(jīng)完成整合后，再進行體外受精和胚胎移植。

基因組學(genomics)功能基因組學(functional genomics)蛋白質(zhì)組學(proteomics)Genome這個述語是德國遺傳學家Winkler在1920年創(chuàng)造的。它的含義是指一個細胞中所含有的全套遺傳信息。也是泛指一個物種中所含的全部的遺傳信息。

基因組學(genomics)主要是研究一個物種的基因組的組成，包括DNA堿基的排列順序，基因的分布情況。

人類基因組計劃簡介(human genome project, HGP)HGP簡介

人類基因組計劃是由美國科學家于1985年率先提出、于1990年正式啟動的。美國、英國、法國、德國、日本和我國科學家共同參與了這一價值達30億美元的人類基因組計劃。這一計劃旨在為30多億個堿基對構(gòu)成的人類基因組精確測序，發(fā)現(xiàn)所有人類基因并搞清其在染色體上的位置，破譯人類全部遺傳信息。

基因組(Genome):基因組就是一個物種中所有基因的整體組成 人類基因組有兩層意義： ——遺傳物質(zhì) ——遺傳信息

從整體水平研究基因的存在、基因的結(jié)構(gòu)與功能、基因之間的相互關系

人類基因組計劃的目標：

1.測定人類基因組中32億個單核苷酸（堿基）的排列順序。

2.確定各個基因和功能元件在序列中的位置，也就通常說的基因定位。3.確定出與疾病相關的基因及找出有治療和藥用價值的基因。4.繪制出一個完整的人類基因圖譜。

HGP是如何進行的： 1.基因組測序概觀

基因組的測序的基本過程：

①選擇物種

②從細胞中提取DNA ③把經(jīng)純化的DNA隨機切割成大小合適的重疊片段

④指導DNA片段插入到載體中，并克隆

⑤測出第一DNA片段的堿基順序

⑥確定片段間的重疊，把序列組裝成最終的基因序列 敲碎基因組，分析研究內(nèi)容所處的染色體位置

2.DNA的測序方法

在發(fā)明自動測序技術之前，人們用手工進行測序，最常用的方法是末端終止法（后面專門介紹）。

手工測序是通過凝膠電泳的手段將DNA片段進行分離，然后在膠上“讀出”堿基的排列順序。這就決定了被測序的DNA片段不可能太大，而且效率很低，在20世紀80年代時，一天只能完成500bp片段的測序工作。

3.自動化測序

1985年Leroy Hood, Lioyd Smith, Mike Hunkapiller發(fā)明了第一臺自動測序儀，每天能測15 000個bp，1998年Hunkapiller領導的小組發(fā)明了一種新的測序列儀——ABI 3700G型DNA分析儀，每天可測多達400 000bp。測序的自動化推動了HGP的神速發(fā)展，研究人員僅用15個月的時間就完成了人類基因序列的90%。

技術的改進促進了測序的發(fā)展，每18個月全世界的測序總量翻一番，而測序成本則減少一半。從20世紀80年代末期到2001年，測序成本從10美元降到10美分。

4.測序用載體的改進

在進行基因組測序時，先要將提取的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶切成大小不等的片段，并使每個片段之間能夠出現(xiàn)部分的重疊，然后需將這些片段放入載體大量克隆后才能完成測序的需要。

分子生物學中常用的載體是質(zhì)粒，它一般能攜帶較小的DNA片段。但在HGP的測序中需要能攜帶更大片段的載體，人工染色體載體的出現(xiàn)解決了這一困難。現(xiàn)在用的人工染色體分為細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome BAC)或酵母人工染色體(yeast artificial chromosome YAC)。BAC能攜帶300 000bp的DNA，YAC能攜帶1 000 000bp 的DNA，但不夠穩(wěn)定。

5.組裝基因組的拼圖游戲

基因測序后，要將一個個小的DNA片段拼裝起來就象一個游戲，但是一個十困難的工作。一個原因是人的基因組過于龐大，32億個堿基對被切成小片段也要有上千萬個片段，把它們從頭到尾找到一起本身就是很困難的工作。加上人的基因組中存在著大量的重復順序，約占人基因組的一半以上，這樣在拼接時很容易把一個區(qū)誤認為另一個區(qū)域，因此在基因組測序和拼圖中常常會出現(xiàn)空洞和錯誤。要彌補這些空洞和錯誤，基因組的工作草圖的每一個堿基至少被測4-5次，人類基因組的最終目標是產(chǎn)生完全的序列，沒有空隙，準確率要達到99.99%。

6.目前進行基因組計劃的兩種策略： 霰彈法測序：

先將人的基因組制備成各級小片段，并且小片段間有重疊的關系 然后對每個小片段進行測序 通過重疊的關系將相互聯(lián)系著的小片段拼接成較大片段 當拼到比較大的片段時，就可用于構(gòu)建圖譜 最終全部基因的序列。

全基因組霰彈法測序：

將基因組分割成小片段 然后對小片段進行隨機的測序

通過計算機的程序?qū)⑺羞@些小片段組裝成連續(xù)的大片段，最終得到全基因組序列。

模式生物體的研究

通過對進化不同階段的生物體基因組序列的比較，發(fā)現(xiàn)基因組結(jié)構(gòu)組成和功能調(diào)節(jié)的規(guī)律。

人類基因組計劃的完成示標志著生命基礎科學的研究進入到后基因組時代。

HGP對人類的重要意義

1、HGP對人類疾病基因研究的貢獻

人類疾病相關的基因是人類基因組中結(jié)構(gòu)和功能完整性至關重要的信息。對于單基因病，采用“定位克隆”和“定位候選克隆”的全新思路，導致了亨廷頓舞蹈病、遺傳性結(jié)腸癌和乳腺癌等一大批單基因遺傳病致病基因的發(fā)現(xiàn)，為這些疾病的基因診斷和基因治療奠定了基礎。對于心血管疾病、腫瘤、糖尿病、神經(jīng)精神類疾病（老年性癡呆、精神分裂癥）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重點。健康相關研究是HGP的重要組成部分，1997年相繼提出：“腫瘤基因組解剖計劃”“環(huán)境基因組學計劃”。

2、HGP對醫(yī)學的貢獻

基因診斷、基因治療和基于基因組知識的治療、基于基因組信息的疾病預防、疾病易感基因的識別、風險人群生活方式、環(huán)境因子的干預

3、HGP對生物技術的貢獻

（1）基因工程藥物：分泌蛋白（多肽激素，生長因子，趨化因子，凝血和抗凝血因子等）及其受體。

（2）診斷和研究試劑產(chǎn)業(yè)：基因和抗體試劑盒、診斷和研究用生物芯片、疾病和篩藥模型。

（3）對細胞、胚胎、組織工程的推動：胚胎和成年期干細胞、克隆技術、器官再造。

4、HGP對制藥工業(yè)的貢獻

篩選藥物的靶點：與組合化學和天然化合物分離技術結(jié)合，建立高通量的受體、酶結(jié)合試驗為基礎的藥物設計：基因蛋白產(chǎn)物的高級結(jié)構(gòu)分析、預測、模擬—藥物作用“口袋”

個體化的藥物治療：藥物基因組學。

5、HGP對社會經(jīng)濟的重要影響

生物產(chǎn)業(yè)與信息產(chǎn)業(yè)是一個國家的兩大經(jīng)濟支柱；發(fā)現(xiàn)新功能基因的社會和經(jīng)濟效益；轉(zhuǎn)基因食品；轉(zhuǎn)基因藥物（如減肥藥，增高藥）

6、HGP對生物進化研究的影響

生物的進化史，都刻寫在各基因組的“天書”上；草履蟲是人的親戚發(fā)現(xiàn)了大約一百四十萬個單核苷酸多態(tài)性，并進行了精確的定位，初步確定了30多種致病基因。隨著進一步分析，我們不僅可以確定遺傳病、腫瘤、心血管病、糖尿病等危害人類生命健康最嚴重疾病的致病基因，尋找出個體化的防治藥物和方法，同時對進一步了解人類的進化產(chǎn)生重大的作用。

9、蛋白組的復雜性

人類基因組編碼的全套蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)組）比無脊椎動物編碼的蛋白質(zhì)組更復雜。人類和其他脊椎動物重排了已有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，形成了新的結(jié)構(gòu)。也就是說人類的進化和特征不僅靠產(chǎn)生全新的蛋白質(zhì)，更重要的是要靠重排和擴展已有的蛋白質(zhì)，以實現(xiàn)蛋白質(zhì)種類和功能的多樣性。有人推測一個基因平均可以編碼2-10種蛋白質(zhì)，以適應人類復雜的功能 ——13億年；人是由300～400萬年前的一種猴子進化來的；人類第一次“走出非洲”——200萬年的古猿；人類的“夏娃”來自于非洲，距今20萬年——第二次“走出非洲”？

7、HGP帶來的負面作用 侏羅紀公園不只是科幻故事 種族選擇性滅絕性生物武器 基因?qū)＠麘?zhàn)

基因資源的掠奪戰(zhàn) 基因與個人隱私。

人類基因組帶給我們的新發(fā)現(xiàn)

1、基礎數(shù)據(jù)

全部人類基因組約有2.91Gbp，約有39000多個基因；平均的基因大小有27kbp；其中G+C含量偏低，僅占38%，而2號染色體中G+C的含量最多；到目前仍有9%的堿基對序列未被確定，19號染色體是含基因最豐富的染色體，而13號染色體含基因量最少等等（具體信息可參見cmbi 特別報道：生命科學的重大進展）。

2、基因的分布情況

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和定位了26000多個功能基因，其中尚有42%的基因尚不知道功能，在已知基因中酶占10.28%，核酸酶占7.5%，信號傳導占12.2%，轉(zhuǎn)錄因子占6.0%，信號分子占1.2%，受體分子占5.3%，選擇性調(diào)節(jié)分子占3.2%，等。發(fā)現(xiàn)并了解這些功能基因的作用對于基因功能和新藥的篩選都具有重要的意義。

3、基因數(shù)量少得驚人：

一些研究人員曾經(jīng)預測人類約有14萬個基因，但Celera公司將人類基因總數(shù)定在2.6383萬到3.9114萬個之間，不超過40,000，只是線蟲或果蠅基因數(shù)量的兩倍，人有而鼠沒有的基因只有300個。如此少的基因數(shù)目，而能產(chǎn)生如此復雜的功能，說明基因組的大小和基因的數(shù)量在生命進化上可能不具有特別重大的意義，也說明人類的基因較其他生物體更'有效'，人類某些基因的功能和控制蛋白質(zhì)產(chǎn)生的能力與其他生物的不同。這將對我們目前的許多觀念產(chǎn)生重大的挑戰(zhàn)，它為后基因組時代中生物醫(yī)學的發(fā)展提供新的非凡的機遇。但由于基因剪切，EST數(shù)據(jù)庫的重復以及一些技術和方法上的誤差，將來亦可能人類的基因數(shù)會多于4萬。

4、不同各族間DNA的差異

人類單核苷酸多態(tài)性的比例約為1/1250bp，不同人群僅有140萬個核苷酸差異，人與人之間99.99％的基因密碼是相同的。并且發(fā)現(xiàn)，來自不同人種的人比來自同一人種的人在基因上更為相似。在整個基因組序列中，人與人之間的變異僅為萬分之一，從而說明人類不同“種屬”之間并沒有本質(zhì)上的區(qū)別。

5、人類基因組中存在大片“荒漠”。

在染色體上有基因成簇密集分布的區(qū)域，有大片的區(qū)域只有“無用DNA” ——不包含或含有極少基因的成分。基因組上大約有1／4的區(qū)域沒有基因的片段。在所有的DNA中，只有1%-1.5%DNA能編碼蛋白，在人類基因組中98%以上序列都是所謂的“無用DNA”，分布著300多萬個長片斷重復序列。這些重復的“無用”序列，決不是無用的，它一定蘊含著人類基因的新功能和奧秘，包含著人類演化和差異的信息。經(jīng)典分子生物學認為一個基因只能表達一種蛋白質(zhì)，而人體中存在著非常復雜繁多的蛋白質(zhì)，提示一個基因可以編碼多種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)比基因具有更為重要的意義

6、男女性別間基因的差異

男性的基因突變率是女性的兩倍，而且大部分人類遺傳疾病是在Y染色體上進行的。所以，可能男性在人類的遺傳中起著更重要的作用。

7、外來基因

人類基因組中大約有200多個基因是來自于插入人類祖先基因組的細菌基因。這種插入基因在無脊椎動物是很罕見的，說明是在人類進化晚期才插入我們基因組的。可能是在我們?nèi)祟惖拿庖叻烙到y(tǒng)建立起來前，寄生于機體中的細菌在共生過程中發(fā)生了與人類基因組的基因交換。

8、新的遺傳標記

蛋白質(zhì)組學(Proteomics)

proteome一詞于1994年提出，源于proteins和genome,意思是proteins expressed by a genome。研究細胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學

蛋白質(zhì)組的廣義含義：

指某種細胞或組織中基因組所表達的所有的蛋白質(zhì)。但與基因組不同的是，蛋白質(zhì)組是一個動態(tài)的概念，因此有人用功能蛋白質(zhì)組的概念，指的是細胞在一定階段或與某一生理現(xiàn)象相關的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組的狹義含義：

可以指不同類型細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化，如正常細胞和異常細胞之間、細胞用藥或不用藥之間的蛋白質(zhì)水平差異、不同組織細胞間的蛋白質(zhì)類型的差異。

蛋白質(zhì)組研究的意義和背景

蛋白組學可從另一方面來進行探索。即找到蛋白再來找其基因。

蛋白研究的困難性

蛋白質(zhì)與核酸相比，結(jié)構(gòu)更復雜

前者與后者殘基的比為20:4；后者能在體外進行合成、前者則不能；后者結(jié)構(gòu)和組成的差異不大、前者有著復雜的翻譯后修飾如磷酸化、甲基化等內(nèi)容。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)易被破壞

核酸在變性后能夠復性，并且結(jié)構(gòu)不被破壞(這一點正是人們所利用的)。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一旦變性則很難恢復。

蛋白質(zhì)組研究主要分兩個步驟

蛋白質(zhì)組分離技術 蛋白質(zhì)組分析技術 蛋白質(zhì)的分離

將各種蛋白進行分離是進行后續(xù)分析的基礎。分離的越細、分辨率越高將會為分析創(chuàng)造更好的條件。常用的蛋白質(zhì)分離手段有：

親和層析 分子篩 離子交換

毛細管電泳 一向電泳 雙向電泳

雙向電泳技術 樣品的制備

等電聚焦電泳(1向)SDS-PAGE電泳(2向)掃描保留圖象

強大的分析軟件進行數(shù)據(jù)分析 選定目標蛋白 切膠 后續(xù)分析 對膠的染色 圖象的采集 圖象分析和處理

切膠收集目標蛋白

基因診斷

(Gene Diagnosis)基因診斷是以DNA或RNA為實驗材料，通過對某種特異堿基序列的檢出來確定某種疾病的發(fā)生或某種病原體的存在。

基因診斷要達到的目的 對已知突變基因的檢出

臨床應用和基礎研究

對一些未知基因突變的篩選和分析。

對一些基因表達水平高低與某些疾病相關性的研究 對病原體基因的檢出。基因診斷早期的方法

分子雜交(hybridization)限制片段長度多態(tài)性的研究

(restriction fragment length polymorphism RFLP)分子雜交應用于基因診斷的基本原理

根據(jù)被檢測目標設計一個核酸探針，再用探針對來檢測具體的樣本，從而達到診斷的目的。

在實際應用中，常用southern blot的方法來進行突變基因的篩查。

PCR技術進行基因診斷的幾種基本設計：

1.根據(jù)突變位點來設計特異性的引物。通過有無擴增片段來進行定性的。

2.通過基因片段長度的多態(tài)性來進行鑒定。3.PCR結(jié)合限制片段長度多態(tài)性來進行鑒定。

4.通過PCR-SSCP來進行鑒定。

5.通過設計特異性的引物來診斷病原體的特異性基因。

基因診斷的應用 多態(tài)性分析

對遺傳病突變基因的診斷

已知突變位點的診斷

未知突變位點的篩查和定位 基因異常表達的診斷（定量表達）外源DNA的檢測

腫瘤標記物的確定和診斷 在法醫(yī)學中的應用

DNA多態(tài)性

序列多態(tài)性(SNPs – 單堿基多態(tài)性)同源染色體 5-GGTTTACACCTAA-同源染色體 5-GTTTTAAACCGAA-

長度多態(tài)性(VNTR-可變的串聯(lián)重復順序)同源染色體 5-AATCAATCAATC-

同源染色體 5-AATCAATCAATCAATCAATC-

核心序列較長者（如大于8bp）常稱為小衛(wèi)星DNA，或稱可變數(shù)目串聯(lián)重復序列（VNTR）核心序列較短者（如2-5bp）常稱為微衛(wèi)星DNA，或稱短串聯(lián)重復序列（STR）

微衛(wèi)星多態(tài)性 單堿基多態(tài)性

遺傳信息變異是所有基因組的共同特征。不同個體、群體在疾病易感性、對環(huán)境理、化、生、致病因子反應性和其他性狀上的差別，都與基因組序列中的變異有關，這些變異最常見的形式是單核苷酸多態(tài)性（SNP）。

人類基因組中SNP的數(shù)目約為3百萬－1千萬。人類遺傳多態(tài)性的意義 與性狀相關；

與疾病相關，可用于預測發(fā)病風險； 個體醫(yī)學發(fā)展的基礎；

可作為遺傳標志，用于疾病連鎖診斷； 作為個人身份識別標識用于法醫(yī)學。

遺傳性狀

遺傳多態(tài)性在身份識別方面的應用

公安司法系統(tǒng)——罪犯及受害人的身份識別及親子鑒定； 部隊 —— 傷亡士兵的身份識別；

保安 —— 個人DNA身份證，用于人員識別；

何為RFLP? 限制性片段長度多態(tài)性

(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)

何為DNA指紋？用一種或幾種限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA，用探針雜交并放射自顯影。

中國人群的遺傳學關系

主要成果：證實中國人群可分為南、北兩大組，兩者之間有明顯的基因融匯；提出了東亞人群可能起源于東南亞、而東亞現(xiàn)代智人與其他各大洲現(xiàn)代人群都起源于10－20萬年前“走出非洲”的群體的觀點。

基因治療Gene Therapy

依靠遺傳物質(zhì)來治療疾病，包括糾正人自身基因的結(jié)構(gòu)或功能上錯亂、阻止病變的進展，殺滅病變的細胞，或抑制外源原體遺傳物質(zhì)的復制，從而達到治病的目的。這就是基因治療的含義。基因工程與基因治療有相似的一面：

二者都需將“目的基因”（基因治療也可稱為治療基因）分離和純化；都需要將選擇合適的載體，并將“目的基因”與載體在體進行重組；都需要將重組體導入受體（靶）細胞。基因工程與基因治療有不同的一面：

基因工程的主要目的是將重組體導入宿主細胞，并使得外源基因在宿主細胞中表達、純化，最終獲得重組蛋白。

基因治療的主要目的是將具有治療價值的基因形成的重組體導入體細胞直接表達，并無需對表達產(chǎn)物進行純化。

基因工程的全部過程都在體外操作；而基因治療需將外源基因?qū)塍w細胞中，因此技術上具有很大難度，而且對其有效性和安全性方面提出了

苛刻的要求

基因治療有兩種途徑：

ex vivo in vivo ex vivo ：

將含有外源基因的載體在體外導入人體細胞或異體細胞（也稱基因工程化細胞），經(jīng)體外細胞擴增后，輸回人體。這種方法易于操作，并易于解決安全性的問題，但不易于工程化生產(chǎn)。in vivo途徑

將外源的治療基因裝配于合適的真核細胞表達載體，直接導入人體內(nèi)，這種方式的導入有利于在規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。但是，這種方式導入治療基因及其載體必須證明其安全性，而且導入體內(nèi)后需能進入靶細胞，有效地表達并達到治療的目的。因此，在技術上要求很高，其難度明顯高于前者。

致病基因的確定(定位)近日，來自國際上六個國家的科學家展開合作，通過分析全球不同人群之間的遺傳基因信息，初步繪制出首張人類DNA序列中變異基因片段的遺傳圖譜“HapMap”。這張圖譜對于基因治療來講，意義非凡。

所謂“HapMap計劃”，是由加拿大、中國、日本、尼日利亞、英國和美國共同資助并聯(lián)合展開的基因研究項目，全名為“國際人類基因組單體型圖計劃”(簡稱“HapMap計劃”)，項目旨在建立一個幫助研究者發(fā)現(xiàn)人類疾病及其對藥物反應相關基因的公眾資源。

反義技術 又稱反義寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides）技術，是指利用人工合成的反義RNA和反義DNA來阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或復制，控制細胞生長在中間階段,使編碼蛋白質(zhì)的基因能轉(zhuǎn)錄為mRNA，因而不能翻譯成相應的蛋白質(zhì)，以達治療某一疾病的目的、用反義RNA已對某些癌癥進行臨床試驗。這類反義技術只能認為是一種從基因水平進行治療的技術，它們以不同方式，在DNA復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平發(fā)揮作用。由于它們的分子量低，故而有潛力進入靶細胞，但其臨床穩(wěn)定性、毒性、細胞通透性等各方面都需要進一步研究。

藥物靶向治療（drugs targeting）此法機理可概括為病毒導向酶的藥物前體治療（virus directed enzyeme prodrug therapy,vdept），即用反轉(zhuǎn)錄病毒載體的外源基因轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi).該基因編碼一種酶，此酶可將一種無害的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎舅貜秃衔铩в羞@一基因的病毒載體只在特殊組織或腫瘤細胞中而不在正常細胞中表達

第五篇：分子生物學論文

分子生物學論文

姓名：

專業(yè)：藥學

班級：11級藥學三班 學號：

基因工程抗體治療白血病的研究進展

【摘要】目前采用基因工程藥物治療白血病逐漸成為熱點。研究表明白血病在獲得緩解后用基因工程藥物治療即可提高療效，又可減輕化療藥物的毒副反應，并可望達到治愈白血病的目的。

【關鍵詞】白血病；基因工程抗體；研究進展

引文

白血病是一類造血干細胞的克隆性疾病，在骨髓和其他造血組織中白血病細胞大量增生積聚，并浸潤其他器官和組織，而使正常造血受抑制。在兒童至35歲以下青壯年人群中因患惡性腫瘤致死的以白血病為首，故可稱為“第一殺手” [1]。治療白血病通常采用細胞毒藥物，雖然能使大部分患者病狀緩解和生存期延長，但治愈率仍很低。基因工程技術的發(fā)展為降低單克隆抗體的免疫源性提供了一個有力的手段。目前嵌合抗體、人源化抗體和全人抗體三種人源抗體很好地克服了HAMA反應的缺陷。2 正文

Campath一1H是在體內(nèi)外對大部分正常和惡性淋巴細胞都有溶解殺傷作用的人源化CD52抗體，但對造血干細胞沒有殺傷作用。起初，Campath一1H主要集中在對非霍奇金淋巴瘤(NHL)的臨床試驗中，但由于Campath一1H對血循環(huán)中的淋巴細胞有強力的清除作用，現(xiàn)已經(jīng)將其應用到CLL、T— PLL疾病中。

氟達拉濱等嘌呤類似物在各種慢性淋巴細胞白血病的治療中獲得較高的緩解率，但完全根除疾病的報道很少。將Campath一1H給予預先接受氟達拉濱治療的CLL患者，來清除微小殘留病變(MRD)，從而提高完全緩解率和持續(xù)時間，這可以使難治性CLL患者的總生存率(overall survival，OS)得到改善。Galimbeai[2] 等對8名CLL患者在氟達拉濱治療后給予Campath一1H治療。在Campath一1H治療后，5例患者獲得分子學緩解(62．5％)，其中4例在治療結(jié)束后一個月內(nèi)獲得。OR(overall response)率為72％，CR率為43％，因此Campath一1H對CLL的治療作用是顯著的。

另外，Keating[3]等 2002年對76例先前治療過的T—PLL患者給予Campath—IH治療的安全性和功效進行了回顧性的分析。接受Campath一1H治療的患者，其OR率為51％，CR為39．5％，CR中位持續(xù)時間8．7個月，0s率為7．5個月(CR者14．8個月)。作者認為Campath一1H是補救T—PLL一線治療失敗__的較好藥物。

在造血干細胞移植中，Campath一1H還能有效地清除供者的T淋巴細胞而不影響采集的干細胞的數(shù)目和功能，成為預防異基因移植中預防移植物抗宿主病(GVHD)較為理想的藥物。

隨著減輕強度的預處理(RIC)方案的發(fā)展，出現(xiàn)了“非清髓性”造血干細胞移植。這種方案主要是靠免疫活性細胞作用，目的是使供體干細胞既易于植入，又最終起到根除腫瘤的作用。通常是包括氟達拉濱等藥物的聯(lián)合應用，但仍然有較高的慢性GVHD的發(fā)生和死亡率。而Campath一1H能有效地清除供受者的T淋巴細胞，從而減少了排斥反應和GVHD的發(fā)生，為“非清髓性”移植提供了一種較為理想的免疫抑制效應。Faulkner[4] 等報道了65例接受BEAM+Campath一1H預處理方案進行異基因移植的患者，包括CLL、PLL，中位年齡為45．6歲。其中Campath—IH每天用10mg。11例發(fā)生了急性GVHD(I一Ⅱ)，9例發(fā)生了慢性GVHD。55例獲得了反應，其中41例為CR，6例復發(fā)。2年Os率為68．1％，無事件生存率(EFS)為57．7％。結(jié)果2年移植相關死亡率(TRM)為13．3％。3 結(jié)語

基因工程藥物治療白血病首先可以有效的避免治愈白血病過程中由于腫瘤的微小殘留病變(MRD)不能被徹底清除而引起的疾病復發(fā)；其次是避免單純化療帶來的毒副反應而引起機體的損傷以及機體對化療藥物的耐受性。因此用基因工程藥物治療白血病的方法成為了國內(nèi)外科學家研究熱點。我國與國外相比，雖起步較晚，但也獲得了較大的發(fā)展，取得了一定的科研成果。例如，已經(jīng)研制成功和正在研制的基因工程產(chǎn)品就有幾十種，有些已經(jīng)投產(chǎn)并開始使用，女ⅡIFN一、rhIL一

2、rhG—CSF、rhGM—CSF等。總之，基因工程藥物治療前景是十分誘人的，還有待于科研工作者的繼續(xù)努力，讓它為人類的健康作出更大的貢獻。

【參考獻文】

[1] 楊進．血液病中西醫(yī)結(jié)合治療學[M]．北京：科學技術文獻出版社，2005：65．

[2]Galimberti S，Cervetti G，Cecconi N，et a1．Quantitative molecular e．valuation of minimal residual disease in patients with chronic lym—phocytic leukemia：efficacy of in vivo purging by alemtuzumab(campath一1H)[J]．J Immunother，2004，27(5)：389—393．

[3]Keating MJ，Cazin B，Coutre S，et a1．Campatb一1H treatment of T—cell prolymphocytie leukemia in patients for whom at I east oneprior chemotherapy regimen has failed[J]．J Clin Oncol，2002，20(1)：205—213． [4] Faulkner RD，Craddock C，Byrne JI，et a1．BEAM—alemtuzumabreduced intensity allogeneic stem cell transplantation for lympho—proliferative diseases；GVHD，toxicity，and survival in 65patients[J]．Blood，2004，103(2)：428-434．