第一篇：分子生物學教案

分子生物學教案

第一章 緒 論

本單元或章節的教學目的與要求

主要介紹分子生物學定義、研究內容和發展簡史及未來發展方向等。授課主要內容及學時分配 2 學時 第一章 緒 論

1.分子生物學定義：是研究核酸等生物大分子的形態、結構、功能、及其重要性和規律性的科學，是人類從分子水平上真正揭開生物世

界的奧秘，由被動地適應自然界轉向主動地改造和重組自然界的基礎學科。

分子生物學主要研究核酸在細胞生命過程中的作用，包括核酸本身的復制、保存以及基因的表達與調控規律，所以，這門學科其實應該

叫做核酸生物學（biology of nucleic acid）。

2.生物學大事年表 1859 年達爾文出版《物種起源》，提出了自然選擇原則。但他無法解釋生物

為什么能將性狀遺傳給下一代。

1865 年孟德爾通過他的豌豆發現了統一規律和分離規律。（Gregor Mendel,1822-1884）: 遺傳學的奠基人

1869 年米歇爾(Friedrich Miescher)分離出核酸。

1879 年弗萊明(Walter Flemming)發現染色體，并描述了細胞分裂過程中染色體的行為。1900 年孟德爾的成果被重新發現。

1903 年薩頓(Walter Sutton)發現染色體是成對的，并攜帶遺傳信息。

1905 年加洛德(Archibald Garrod)提出了人類先天代謝疾病的概念，這是人類自身遺傳研究的開始。

1911 年摩爾根(Thomas Hunt Morgan)提出基因學說，闡釋基因在染色體上的分布，以及繁殖過程中染色體重組形成獨特新個體的過程。

1913 年斯特提萬特(Alfred Henry Sturtevant)繪制出第一張線式基因圖譜。1928 年格里菲斯(Frederick Griffith)發現了一種可以在細菌之間轉移的遺傳分子。1929 年列文(Phoebus Levene)提出 DNA 的化學成分和基本結構。

1944 年 Oswald Avery, Colin Macleod 和 Maclyn McCarty 指出，Griffith 發現的遺傳分子就是 DNA。

1948 年鮑林(Linus Pauling)提出蛋白質為螺旋形的理論。

1950 年查加夫(Edwin Chargaff)發現核酸中四種堿基的含量比例是一定的。1951 年富蘭克林(Rosalind Franklin)拍攝到了核酸的 X 射線衍射照片。

1952 年 Alfred Hershey 和 Martha Chase 利用病毒證實，傳遞遺傳信息的是 DNA 而不是蛋白質。赫爾希也由于這一研究而榮獲 1969 年的諾貝爾醫學生理學獎。

1953 年沃森(James Watson)和克里克(Francis Crick)在《自然》雜志上發表 DNA 雙螺旋結構的論文。J.Watson，美國冷泉港研

究所科學家； F.Crick，英國劍橋大學教授。1953 年他們創立了 DNA 的雙螺旋結構模型，獲得 1958 年諾貝爾獎。

1956 年 Joe Hin Tjio 和 Albert Levan Hereditas 確定人類共有 23 對染色體。Arthur Kornberg 分離出 DNA 聚合酶。

1957 年 Francis Crick 發表《論蛋白質合成》的演講，提出 DNA 制造蛋白質的概念。1959 年 Jerome Lejeune 發現唐氏綜合癥（先

天愚型）是由于人體的第 21 對染色體變異造成的。唐氏綜合征是人類最早發現的因染色體缺陷造成的疾病。

1960 年 Sydney Brenner, Francis Crick，Francois Jacob 和 Jaque Monod 發現信使 RNA(mRNA)。

1961 年 Francois Jacob 和 Jacques Monod 提出在分子水平上特定基因被激活或抑制的機制。J.Monod ； F.Jacob，法國科學家。由于他們提出了乳糖操縱子學說和在酶合成的遺傳調控方面的重大貢獻獲得 1966 年諾貝爾獎。

1966 年 Marshall Nirenberg，Har Gobind Khorana 和 Robert Holley 闡明遺傳密碼。D.Baltimore ； H.Temin，美國科學家。由于他們各自發現了逆轉錄酶，打破了中心法則，該酶能使 mRNA 反轉錄成 cDNA，使真核基

因的克隆表達成為可能，為病毒學、遺傳學、基因工程作出了重大貢獻，他們獲得 1965 年諾貝爾獎。

1967 年 Mary Weiss 和 Howard Green 使用體細胞雜合技術推進人類基因圖譜繪制。1969 年 Jonathan Beckwith 分離出一個細菌基因。

1970 年 Hamilton O.Smith 發現了限制性內切酶，對核苷酸的排列順序的研究及 DNA 重組技術的研究提供了幫助。

D.Nathans，美國霍普金斯大學醫學院教授。由于他在限制性核酸內切酶方面的開創性成就獲得 1978 年諾貝爾獎。

W.Arber，瑞士巴塞爾生物研究中心教授。1968 年他第一個指出了限制性核酸內切酶的存在并分離了 I 型酶 EcoB，獲得了 1978 年 獲諾貝爾獎。

H Smith，美國霍普金斯大學教授。1970 年他首次分離純化了Ⅱ型限制性核酸內切酶 Hind Ⅱ，并闡明了其切點的專一性，為基因工

程的誕生奠定了基礎，獲得 1978 年諾貝爾獎。1972 年 Paul Berg 創造出第一個重組 DNA 分子。

1973 年 Herbert Boyer 和 Stanley Cohen 發展了重組 DNA 技術，發現改造后的 DNA 分子可在外來細胞中復制。

S.Cohen，美國斯坦福大學分子生物學教授。他在質粒的研究中作出了開創性的研究，1973 年他又第一個實現了細菌間抗藥性基因的轉移，創立了基因工程重組模式。科學界把這一年定為基因工程誕生之年，以紀念這位基 因工程的創始人。

1974 年美國發表 Belmont 報告，確立科研中進行人體實驗的政策。

1975 年 Mary-Claire King 和和 Allan C.Wilson 發現，人類和猩猩的基因相似度達到 99%。1975 年 Georges Kohler 和 Cesar Milstein 開發出生產單克隆抗體的技術。

1977 年 Walter Gilbert，Allan M.Maxam 和 Frederick Sanger 開發出 DNA 測序技術。F.Sanger，英國劍橋大學教授。由于他在蛋白質一級結構和核酸序列分析方面的天才創造和震驚世界的成果，在 1958 年和 1980 年先

后兩次獲得諾貝爾獎。他是生物醫學科學領域里唯一兩次獲得這一最高榮譽的人，是一位謙虛謹慎、沉默寡言的偉大科學家。

1978 年 David Botstein 開創核酸限制性片段長度多態性分析技術，用于標志不同個體間的基因差別。

1978 年美國開始借助基因技術用大腸桿菌批量生產人類胰島素。

P.Berg，美國斯坦福大學化學教授。他首次用 SV40 作載體與λ噬菌體實現了兩種病毒 DNA 的重組。由于他在重組 DNA 技術方面的功 績獲得 1980 年諾貝爾獎。

H.Boyer，美國加州大學生化教授，美國基因工程公司董事長。1977 年，他首次用細菌合成生長激素釋放抑制素，是基因工程第一塊

金牌的獲得者。接著，1980 年，他又與華盛頓大學的學者合作，用酵母生產了人干擾素。他籌建了美國基因工程公司，是基因工程研 究中的權威科學家。

1982 年 GeneBank 數據庫建立。

W.Gilbert，美國哈佛大學教授。他與瑞士蘇黎世大學和生物基因 公司 教授 Weissmann 合作，用細菌生產了人干擾素。W.Gilbert 也是測定 DNA 序列的化學直讀法創始人。由于他對科學的巨大貢獻，獲 1980 年諾貝爾獎。1983 年 Kary Mullis 發展聚合酶鏈式反應（PCR）技術

1983 年辯認出與亨廷頓氏癥有關的基因，這是科學家發現的第一個人類疾病基因。

1984 年 Alec Jeffreys 發明了基因指紋技術，可以用人的頭發、血液和精液等來鑒定身份。1984 年關于人類基因組測序的第一次公開討論開始。1986 年 Leroy Hood 開發自動測序機。1988 年人類基因組組織(HUGO)成立。

1990 年美國正式啟動人類基因組計劃。隨后，德國、日本、英國、法國和中國也相繼加入該計劃。1991 年 Craig Venter 開發出新的測序技術。1994 年美國一公司推出新的轉基因西紅柿罐頭，其保質期比普通西紅柿更長，成為人類歷史上第一個轉基因食品。

1995 年 7 月，美國人類基因組研究所繪出了流感嗜血桿菌的基因圖譜； 3 個月后，科學家又繪制出了生殖器支原體的基因圖譜。1996 酵母基因組測序完成。

1997 年蘇格蘭羅斯林研究所培育出世界上第一例體細胞克隆動物綿羊“多莉”。1997 年大腸桿菌基因組測序完成。

1997 年參加人類基因組計劃的科學家決定將研究成果無償向全世界公開。1998 年結核性分枝桿菌以及梅毒螺旋體基因組測序完成。線蟲基因組測序完成。

日本科學家用一頭成年牛的體細胞克隆出 8 頭克隆牛犢。

1999 年人類第 22 號染色體測序完成，這是第一個完成測序的人類染色體。2000 年果蠅和擬南芥的基因組測序完成。

Craig Venter 和 Celera 公司和人類基因組計劃相繼宣布，人類基因組草圖完成。2001 年 Craig Venter 公布了繪制人類蛋白質組圖譜的計劃。2002 年水稻、小鼠、瘧原蟲和按蚊基因組測序完成

2003 年人類基因組計劃宣布，人類基因組序列圖繪制成功，人類基因組計劃的所有目標全部實現。3.DNA 的發現

首先，40 年代發現了生物的遺傳物質是 DNA。Avery 在美國 1934 年的一次學術會議上，首次報導了肺炎球菌(Djprococcus pneumonas)的轉化。超越時代的科學成就往往不容易很快被人們接受，Avery 成就的命運也是一樣，當時并沒有引起陣陣掌聲。事隔 年，他的論文才公開發表； Avery 的工作意義深遠，他不僅證明 DNA 是遺傳物質、還證明 DNA 可以把一個細菌的性狀轉給另一個

細菌，理論意義十分重大。正如諾貝爾獎金獲得者 Lederberg 指出的，Avery 的工作是現代生物學科學性的革命開端、也可以說是基 因工程的先導。

早在 1928 年，Griffith 等人就發現，肺炎鏈球菌使小鼠死亡的原因是引起肺炎。細菌的毒力（致病力）是由細胞表面夾膜中的多糖

所決定的。具有光滑外表的 S 型肺炎鏈球菌因為帶有夾膜多糖而能使小鼠發病，具有粗糙外表的 R 型細菌因為沒有夾膜多糖而失去致 病力。

Avery 用實驗方法證實了 Griffith 的發現。Avery 第一個用實驗方法證明了基因就是 DNA 分子。其次，50 年代搞清了生物遺傳物

質的分子機制。1953 年，Watson 利 Crick 提出了 DNA 結構的雙螺旋模型。這一成就對于生命科學的發展，作出了可與達爾文學說 媲美、與孟德爾定律齊名的貢獻。

1952 年 Alfred Hershey 和 Martha Chase 利用病毒證實，傳遞遺傳信息的是 DNA 而不是蛋白質。

美國冷泉港卡內基遺傳學實驗室的科學家 Hershey 和他的學生 Chase 在 1952 年從事噬菌體侵染細菌的實驗。噬菌體專門寄生在細菌 體內。噬菌體感染細菌時，1）先是其尾部吸附在細菌表面；）隨后像注射器那樣由尾部將頭部的 DNA 注入細菌體內，蛋白質外殼并不侵入； 3）進入菌的 DNA 借助宿主細菌的原料和能量，合成噬菌體自身的 DNA 和蛋白質； 4）新合成的 DNA 和蛋白質外殼，能組裝成許許多多與親代完全相同的子代噬菌體； 5）細菌細胞因噬菌體的大量增殖而破裂，結果釋放出幾十甚至幾百個既有蛋白質外殼又有頭部 DNA 的完整結構的噬菌體。

第三，60 年代確定了遺傳信息的傳遞方式。從 1961 年開始，以 Nirenberg 等為代表的一批科學家，經過不倦的努力，確定遺傳信息

是以密碼方式傳遞的，每三個核苷酸組成一個密碼子，代表一種氨基酸。

到 1966 年全部破譯了 64 個密碼，編排了一個震驚世界的密碼字典，闡述了中心法則，提出的遺傳信息流是 DNA → RNA →蛋白質。

從此，千百年來使人迷惑不解的種瓜得瓜、種豆得豆的遺傳現象，在分子水平上得到了合理解釋。

4.分子生物學的研究內容： 1）DNA 重組技術 2）基因表達調控研究 3）生物大分子的結構功能研究）基因組、功能基因組與生物信息學研究

4.1 DNA 重組技術 DNA 重組技術（又稱基因工程），它是將不同的 DNA 片段（某個基因或基因的一部分）按照人們的設計定向連接起

來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產生影響受體細胞的新的遺傳性狀。嚴格地說，DNA 重組技術并不完全等于基因工程，因為后者還包括其他可能使生物細胞基因組結構得到改進的體系。

DNA 重組技術有著廣闊的應用前景）可用于大量生產某些正常細胞代謝中產量很低的多肽，如激素、抗生素、酶類及抗體等，提高產量，降低成本，使許多有價值的多 肽類物質得到廣泛應用。）可用于定向改造某些生物的基因結構，使它們所具備的特殊經濟價值得到成百上千倍地提高。如用在分解石油、生產避孕疫苗及在 實驗室生產蜘蛛絲等。）可用于基礎研究。如對啟動子的研究、增強子及對轉錄因子的克隆與分析的研究等。4.2 基因表達調控研究

蛋白質分子參與被控制了細胞的一切代謝活動，而決定蛋白質結構和合成時序的信息都由核酸（主要是 DNA）分子編碼，表現為特定的

核苷酸序列，所以基因表達實質上就是遺傳信息的轉錄和翻譯。

在個體生長發育過程中生物遺傳信息的表達按一定的時序發生變化（時序調節），并隨著內外環境的變化而不斷加以修正（環境控制）

基因表達的調控主要發生在轉錄水平和翻譯水平上。原核生物的基因組和染色體結構比真核生物簡單，轉錄和翻譯在同一時間和空間內發生，基因表達的調控主要發生在轉錄水平上。

真核生物有細胞核結構，轉錄和翻譯在時間和空間上是分開進行的，并且在轉錄和翻譯后都有復雜的信息加工過程，其基因表達的調控 可以發生在各種不同的水平上。

基因表達調控主要表現在信號轉導研究、轉錄因子研究及 RNA 剪接 3 個方面。

信號傳導是指外部信號通過細胞膜上的受體蛋白傳到細胞內部，并激活諸如離子通透性、細胞形狀或其它細胞功能方面的應答過程。

當信號分子（配體）與相應的受體作用后，可以引發受體分子的構型變化，使之形成專一性的離子通道，也可以引發受體分子的蛋白激

酶或磷酸酯酶活性，還可以通過受體分子指導合成 cGMP、cAMP、肌醇三磷酸等第二信使分子。信號傳導引起細胞功能的改變，主要是由于信號最后活化了某些蛋白質分子，使之發生構型變化，從而直接作用于靶位點，打開或關閉 某些基因。

轉錄因子是一群能與基因 5 '端上游特定序列專一結合，從而保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的蛋白質分子。

在對植物的某些性狀進行遺傳分析時發現，某些基因的突變會影響其它基因的表達。例如，有 20 多個基因參與玉米花青素的生物合成，但其中的 Cl、r、pl、或 b 基因發生突變后，則這個代謝途徑中的結構酶基 因全部被關閉。

真核基因在結構上的不連續性是近10 年來生物學上的重大發現之一。當基因轉錄成 pre-mRNA 后，在 5 '端加帽，3 '端加 poly（A），還要切去內含子，使外顯子（編碼區）相連后成為成熟 mRNA。

研究發現，許多基因中的內含子并不是一次全部切去，而是在不同的細胞或不同的發育階段選擇性剪切其中部分內含子，生成不同的 mRNA 及蛋白質分子。

RNA 選擇性剪切是真核基因表達調控中一種比較靈活的方式。4.3 生物大分子的結構功能研究——結構分子生物學

一個生物大分子，包括核酸、蛋白質、多糖，具有生物活性的條件有兩個： 1）具有特定的空間結構（三維結構）；）在它發揮生物學功能的過程中必定存在著結構和構象的變化。

結構分子生物學就是研究生物大分子特定的空間結構及結構的運動變化與其生物學功能關系的科學。

它包括結構的測定、結構運動變化規律的探索及結構與功能間的相互關系 3 個主要研究方向。4.4 基因組、功能基因組與生物信息學

2001 年 2 月，Nature 和 Science 同時發表了人類基因組全序列，是人類歷史上最偉大的成就之一。

現已有數十種原核生物、酵母、果蠅、擬南芥等真核生物的基因組基本被破譯了，為人類認識自然、改造自然打下了堅實的基礎。

測定基因組序列是了解基因的第一步，只有知道了基因所編碼的蛋白質的功能和活性，才能指導人們利用這些基因產物。

于是，又提出了“蛋白組”計劃（又稱“后基因組計劃”或“功能基因組計劃”）, 目的是快速、高效、大規模鑒定基因的產物和功

能。基因組信息量龐大，如人細胞中攜帶 29 億多個堿基對。

依靠計算機快速高效運算并進行統計分類和結構功能預測的生物信息學相應誕生了。有了生物信息學知識，人們可以最大限度地開發和運用基因組學所產生的龐大數據。5.分子生物學展望）綿羊多利是核轉移克隆技術的第一次大的成功。在這一技術中，一個細胞的 DNA 被轉移到失去自身遺傳物質的空的卵細胞中。然

后，卵細胞在轉移 DNA 的控制下進行發育。成為克隆技術發展的一個里程碑。）Kind 的研究組在牛和豬的細胞中成功地使用了基因打靶技術的技術，并稱他們計劃培育“敲除”豬----這種豬將攜帶的一種

蛋白質來幫助人體免疫系統接受移植的豬器官。3）人類基因組計劃與生物制藥產業發展前景。

———人類基因組計劃（HGP）是人類科學史上的偉大工程，人類基因組序列的“工作框架圖”的繪就，是該計劃實施進程中的一個重

要里程碑；——— HGP 從整體上解決腫瘤等疾病的分子遺傳學問題，6 千多種單基因遺傳病和多種多基因疾病的致病基因和相關基因 的定位、克隆和功能鑒定是 HGP 的核心部分，它將徹底改變傳統新藥開發的模式，并賦予基因技術的商業價值；

——— HGP 將進一步深化生物制藥的產業結構，引發基因診斷、基因疫苗、基因治療、基因芯片等新興產業；

——— HGP 完成后，人類基因序列將全部輸入公共基因數據庫，使我國的制藥工業在一個新的起點上與國外制藥企業展開競爭，從我國自主克隆的人類基因和公共數據庫的人類基因中開發出具有自主知識產權的基因組藥物，成為我國生物制藥擺脫困境的有效途徑；

———國內上市公司已進軍基因技術的相關產業，但尚處于初級階段，HGP 是國內生物制藥公司進行企業模式調整的重要契機，未來生

物制藥公司的競爭力主要取決于推出自主知識產權新藥的速度、數量和質量。）人類基因組學的前途有關基因組的大量知識將擴大我們對生物學過程的認識，并帶來可評價患病危險性的新診斷手段，創立個人化

醫療學。基因組信息的利用會增進對生物學過程的了解而變革生命科學，使科學家可以針對著影響健康和疾病的具體過程。

獲得利益的商業領域有藥物發現和開發、醫學診斷、農業，等等。

影響新藥開發的一個最重要的因素是可以用于開發新藥的已知目標分子數量有限。疾病目標分子可以受一種藥物影響并在人體內引起后

續的所希望的生物學反應。歷史上，發現新目標分子的過程極慢，極費錢，因為它依賴于做出發現的試驗和糾正方法。基因組學研究將

使藥物設計人員直接針對有利害關系的分子，所以減少上述依賴。這樣不僅是生產出新的更好的藥物，而且縮短新藥上市周期，并降低 成本。

由于藥物的嚴重副作用，美國每年有 220 萬人入院，因這些副作用而死亡者超過 10 萬人。已有具體器官對藥物的基因表達分布圖，研

究人員可以更精確地研究新藥化合物的毒性。此外，基因表達數據與代謝途徑多態性信息結合起來，將為個別患者對不同劑量的反應方

式提供重要指標，因而明顯減少治療中產生的意外副作用。

受人類基因組數據影響的另一領域是制藥基因組學。這個學科的重點是找出患者內可能影響藥療功效即個人對一具體藥物的吸收與代謝 的遺傳變異，發展更加個人化的藥物療法。因為越來越多的證據說明，某一藥物并非對所有的人有同樣的作用，所以制藥基因組學對于

制藥和生物技術界來說已變得非常重要，以致幾乎所有制藥公司都在成立制藥基因組學機構。以基因組學為基礎的新治療學將集中確定

某個人患某一種病的危險性，而留意該患者的具體基因以及與疾病相關的任何變化。這些新診斷手段可能對一患者患一具體病癥的潛在

危險性做出更準確評價，給予更好的預防性治療。

農業是可能得益于基因組學研究的另一領域。對動植物疾病進行診斷并針對那些疾病發展處治方法的能力，應能使農產品品質改善，產

量提高。例如，來自疾病的遺傳信息的比較或抗蟲害植物品系和不抗蟲品質的對比以及選育計劃中有利試驗的運用，將使可在世界各個

不同農業區種植的新品系數量和成功率明顯增加。這樣不僅會增加食物數量，也提高其營養質量。5）基因療法的典型例子是半乳糖血癥病人的基因治療。這種病人由于細胞內缺少基因 G，不能產生半乳糖-1-磷酸干擾素基因，每 106 個細胞能生產干擾素 5x106 單位，并且 95 ％分泌至細胞外。

1985 年，美國加州大學 Maeda 用桿狀病毒作載體，家蠶作表達系統，合成α干擾素基因在家蠶細胞及家蠶中的高表達”研究。他們用 PCR 技術從人染色體中擴增出了 566bp α 1-干擾素基因，用

家蠶核型多角體病毒(BmNPV)轉移載體 pBF5 介導，在多角體基因強啟動子驅動下，分別在家蠶細胞和蟲體中實現了高效表達。采用微

載體 Cytodex3 高密度培養家蠶細胞(10L 規模)，α 1-干擾素效價達到 6.4x106 單位／ m1 ；當用重組病毒注射感染 5 齡家蠶

時(3 萬條蟲規模)，表達效價平均達到 1x107 單位／條蠶。

α模板-dNMP 高能復合物。DNA 聚

合酶具有對此復合物核對的能力，看摻入的核苷酸是否正確。這個核苷酸（dNMP）這時可能被釋放的機會遠遠高于正確核苷酸。這 就是動力學校對模型。）DNA 聚合酶具有聚合酶活性，還具有 5 ' → 3 ' 和 3 ' → 5 ' 的外切酶活性。DNA 聚合酶的 3 ' → 5 ' 外切酶活性可以

隨時將已經摻入的錯配的脫氧核糖核苷酸從生長的多核苷酸鏈上去除，保證了 DNA 復制的忠實性和準確性。

1.DNA 的半保留復制機理

DNA 的復制是分別以親代 DNA 鏈為模板合成兩條子代 DNA 鏈；在子代 DNA 雙鏈中，一條是新合成的，一條是親代的，稱為 DNA 的半保留復制。

2.3.2 復制的起點、方向和速度

復制時，雙鏈 DNA 要解開兩股鏈分別進行，所以這個復制起點呈現叉子的形式 , 稱為復制叉。復制子（replicon）定義： DNA 分子上一個獨立的復制單位。一個復制子只含有一個復制起點（origin,ori）。

通常，細菌、病毒和線粒體的 DNA 分子都是作為單個復制子完成復制的，而真核生物基因組可以同時在多個復制起點上進行雙向復制。

復制叉以 DNA 分子上某一特定順序為起點，向兩個方向等速生長前進。一個復制原點連接到任一 DNA 分子上都支持其復制的能力。復

制原點一般由 A-T 豐富區組成。在真核細胞中，DNA 的復制屬于細胞周期的一部分。細菌中，DNA 復制與細胞生長相協調。首先是

復制周期的起始頻率被調整到與細胞生長 的速率相適應，其次是復制周期的完成與細胞分裂相聯系。2.3.3 復制的幾種主要方式 2.3.3.1 線性 DNA 雙鏈的復制線性 DNA 先

在 ori 處形成復制眼，從復制眼開始可以單向或雙向復制，真核生物都是多復制眼起始的雙向復制。2.3.3.2 環狀 DNA 雙鏈的復制 1）θ型復制

環形 DNA 大多采用θ型復制，如 E.coli。

特點：從原點 ori 開始，通常采用雙向等速復制，不斷擴大復制泡，形成θ環。2）滾環型復制（rollingcircle）

某些環形的病毒 DNA，如θ x174、λ噬菌體都是以這種方式復制。這是一種單向復制類型。）D 環復制雙鏈環在固定點解開進行復制。但兩條鏈的合成是高度不對稱的，一條鏈上迅速合成出互補鏈，另一條鏈則成為游離的 單鏈環（D-環）。

2.4 原核生物和真核生物 DNA 的復制特點 2.4.1 原核生物 DNA 的復制特點 2.4.1.1DNA 雙螺旋的解旋

DNA 復制時，雙鏈首先解開，形成復制叉

復制叉的形成過程有多種酶和蛋白質參與。將主要的酶和蛋白質介紹如下。1）單鏈結合蛋白（SSB 蛋白）SSB 蛋白可牢固地結合在單鏈 DNA 上，在原核生物中表現出協同效應，如第一個 SSB 蛋白結合到

DNA 上去的能力為 1，第二個 SSB 蛋白結合能力則高達 103。SSB 蛋白的作用是保證被解鏈酶解開的單鏈在復制完成前能保持單

鏈結構，它以四聚體形式存在于復制叉處，待單鏈復制后才掉下，重新循環。所以，SSB 蛋白只保持單鏈的存在，并不起解鏈的作用。

SSB 沒有催化功能，它可以特異性地結合在單鏈區，使之免被核酸酶水解，起到保護和維持單鏈的作用。2）DNA 解鏈酶（DNAhelicase）

用于把 DNA 雙鏈解開形成單鏈。具有 ATPase 活性，利用水解 ATP 釋放的能量，催化雙鏈 DNA 解鏈。大部分 DNA 解鏈酶（包括大腸

桿菌解鏈酶 II、III、T4 噬菌體 dda 基因、T4 基因 41 和人解鏈酶等）可沿滯后鏈模板的 5 '→ 3 '方向并隨著復制叉的前進

而移動，只有另一種解鏈（Rep 蛋白）是沿前導鏈模板的 3 '→ 5 '方向移動。因此推測 Rep 蛋白和特定 DNA 解鏈酶分別在 DNA 的

兩條母鏈上協同作用，以解開雙鏈 DNA。

DNA 的解鏈過程，首先是在拓撲異構酶 I 的作用下解開負超螺旋，并與解鏈酶共同作用，在復制起點處解開雙鏈。

參與解鏈的除一組解鏈酶外，還有 DNA 蛋白等。

一旦局部解開雙鏈，就必須有 SSB 蛋白來穩定解開的單鏈，以保證局部結構不會恢復成雙鏈。接著，由引發酶組成的引發體迅速作用

于兩條單鏈 DNA 上。不論是前導鏈還是滯后鏈，都需要一段 RNA 引物以開始子鏈 DNA 的合成 2.4.1.2 岡崎片段與半不連續復制在

DNA 的復制過程中，前導鏈是連續復制的，而滯后鏈是通過岡崎片段的連接來合成的，是不連續的，稱之為 DNA 的半不連續復制。所有

DNA 聚合酶的方向都是 5 '→ 3 '，而不是 3 '→ 5 '。為了解釋 3 '→ 5 '是如何合成滯后鏈的，岡崎提出了 DNA 的半不連續復制。

現在已知，一般原核生物的岡崎片段要長些，真核生物中的要短些。這種前導鏈的連續復制和滯后鏈的不連續復制在生物界是有普遍性 的，因而稱之為 DNA 的半不連續復制。2.4.1.3 復制的引發和終止

復制起始時發生的事件：①雙鏈 DNA 在一個很小的區域內打開，這是 oriC 區域特有的；②由解旋酶催化，開始解螺旋，并持續進行

下去；③形成引物，第一個核苷酸裝配到引物上；這些事件對前導鏈只發生一次，而后滯鏈上每次開始合成岡崎片段時都要發生。

目前已知的 DNA 聚合酶都只能延長已存在的 DNA 鏈，而不能從頭合成 DNA 鏈。

研究發現，DNA 復制時，往往先由 RNA 聚合酶在 DNA 模板上合成一段 RNA 引物，再由 DNA 聚合酶從 RNA 引物 3 '端開始合成新的

DNA 鏈。對于前導鏈來說，這一引發過程比較簡單，只要有一段 RNA 引物，DNA 聚合酶就能以此為起點一直合成下去。但對于滯后鏈

來說，引發過程就十分復雜，需要多種蛋白質和酶的協同作用，還牽涉到岡崎片段的形成和連接。滯后鏈的引發過程：

引發體：后滯鏈的引發過程往往由引發體（primosome）來完成。先是由 6 種蛋白： n,n ' ,n '' ,dnaB,C 和 I 構成引發前體，而

后與引發酶（primase）結合進一步組裝成引發體。

引發體像火車頭一樣在滯后鏈分叉的方向上前進，并在模板上斷斷續續地引發生成滯后鏈的引物 RNA 短鏈，再由 DNA 聚合酶 III 作

用合成 DNA，直到遇到下一個引物或岡崎片段為止。由 RNaseH 降解 RNA 引物，并由 DNA 聚合酶 I 將缺口補齊，再由 DNA 連接酶

將兩個岡崎片段連在一起形成大分子 DNA。總結

前導鏈的連續合成和后滯鏈的不連續合成

a.旋轉酶（topoII）改變雙螺旋的構象，解螺旋酶解開雙鏈。b.SSB 結合到解開的單鏈上。c.引發體合成 RNA 引物。d.DNA 聚合酶Ⅲ作用下合成先導鏈。e.滯后鏈開始合成，形成第一個岡崎片段。f.復制叉繼續前進，前導鏈連續合成，滯后鏈上合成新 的 RNA 引物。g.第二個岡崎片段形成，DNA 聚合酶Ⅰ切去引物，并加上脫氧核苷三磷酸。h.間隙被 DNA 連接酶封閉。鏈的終止

除 Tus 蛋白以外，鏈的終止看起來不需要太多的蛋白質參與。當復制叉前移，遇到 20bp 重復性終止子序列（Ter）時，Ter-Tus 復合物能阻擋復制叉的繼續前移，等到相反方向的復制叉到達后在 DNA 拓撲異構酶 IV 的作用下使復制叉解體，釋放子鏈（圖 2-23）。2.4.1.4DNA 聚合酶

現已發現在大腸桿菌中存在 DNA 聚合酶 I、II、III。

1)DNA 聚合酶Ⅰ主要負責 DNA 損傷的修復和岡崎片段之間間隙的填補。用枯草桿菌蛋白酶處理 DNA 聚合酶Ⅰ可得兩個片段，大片段

分子量 76kd，被叫作 klenow 片段，廣泛用于 DNA 序列分析中。

① 5' → 3' 聚合活性要求有雙鏈 DNA 模板和具有 3' 羥基的引物，活性很高，可達 1000 核苷酸 /min。② 3' → 5' 外切活性可

以對不配對的局部單鏈進行識別，切除不配對堿基，又稱“校正功能”。③ 5' → 3' 外切活性主要功能是切除復制過程中的引物。

pol Ⅰ的 5' → 3' 外切活性有三個特點： a.必須有 5'-P 末端。b.被切除的核苷酸必須是氫鍵配對的。c.可以切除脫氧核糖

核苷酸，也可以切除核糖核苷酸。此酶被認為在切除由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體中起著重要作用。它也可用以除去岡崎片段 5 '端 RNA 引物，使岡崎片段間缺口消失，保證連接酶將此片段連接起來。DNA 聚合酶 II 是一條 120kD 的肽鏈，催化 5 '→ 3 '方

向合成 DNA，也具有 3 '→ 5 '外切酶活性但沒有 5 '→ 3 '外切酶活性。可能在當細胞 DNA 受到化學或物理損傷時，DNA 聚合酶 II 在修復過程中起特殊作用。DNA 聚合酶Ⅲ pol Ⅲ是體內 DNA 復制的主要承擔者，是復制的主要酶類。全酶由多亞基

組成，至少有 10 種，共 22 個亞基：α 2 ε 2 θ 2 δ 2 γ 2 η 2 δ '2 χ 2 θ 2 β 2 其中α、ε、θ三種亞基組成核心酶，其它為輔助蛋白。

rRNA 的功能與蛋白質生物合成相關，可分別與 mRNA、tRNA 作用，催化肽鍵的形成。引物酶和 RNA 聚合酶引物酶：用于合成引物 的酶。利福平：抑制 RNA 的轉錄，使細菌無法繁殖。用利福平處理發現：先導鏈不能合成，而后隨鏈能合成。

解螺旋酶用于把 DNA 雙鏈解開形成單鏈。具有 ATPase 活性，利用水解 ATP 釋放的能量，催化雙鏈 DNA 解鏈。

2.4.2 真核生物 DNA 的復制特點

真核生物 DNA 的復制與原核生物 DNA 的復制有很多不同。真核生物每條染色體上可以有多處復制起點，而原核生物只有一個起始點。

真核生物的染色體在全部完成復制之前，各個起點上 DNA 的復制不能再開始，而在快速生長的原核生物中，復制起點上可以連續開始

新的 DNA 復制，表現為雖只有一個復制單元，但可有多個復制叉。真核生物 DNA 的復制子稱為 ARS（autonomouslyreplicatingsequences），長約 150bp 左右，包括數個復制起始必需的保守區。真核生物 DNA 復制的起始需

要起始原點識別復合物（ORC）參與。真核生物 DNA 復制叉的移動速度大約只有 50bp/s，還不到大腸桿菌的 1/20，因此，人類

DNA 中每隔 3000 ～ 300000bp 就有一個復制起始位點。真核生物 DNA 復制必需的成份 1.染色體 DNA 復制必需三種核苷酸序列①復制起點②著絲粒③端粒。2.RNA 引物(RNAPrimer)，一般 8 ～ 14nt，帶游離 3'-OH 末端。

3.參加 DNA 復制的主要酶和蛋白質。① DNA 聚合酶(DNAPolymerase)真核 DNA 復制的主要酶 DNAPola/ δ。功能 : 從 5' → 3'

方向延伸與模板互補的子代鏈。②引發酶(Primase)與其他多種蛋白組成多蛋白復合體-引發體(Primosome)，催化 RNA 引物合成

和復制起始。③ DNA 連接酶(DNALigase)，催化一個雙鏈 DNA 的 5 ' 磷酸與另一雙鏈 DNA 的 3 '-OH 形成磷酸二酯鍵。④ DNA

解鏈酶(DNAHelicase), 打開 DNA 雙鏈。⑤增殖細胞核抗原(Proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)，輔助催化前導鏈合成。

⑥端粒酶(Telomerase)末端復制問題。端粒酶負責染色體末端(端粒)復制 , 是由 RNA 和蛋白質組成的核糖核蛋白。其中的 RNA 成分是端粒復制的模板(因此端粒是逆轉錄酶)。作用 : 維持端粒長度。端粒酶活性可用基于 PCR 的“ TRAP ”（Telomeraserepeatamplificationprotocol）法測定（Kim,Netal.,science,266,2011-2014(1994)端粒與細胞壽命。端粒、端

粒酶與腫瘤的關系：絕大多數惡性腫瘤具有端粒酶活性但端粒縮短，但也有約 5% 的腫瘤無端粒酶活性且端粒較長。

端粒酶作為新的腫瘤標志和腫瘤治療靶點。

真核生物中發現有 5 種 DNA 聚合酶，分別是：α、β、γ、δ、ε。

⑴ DNA 聚合酶α是 DNA 復制的主要酶類，由 4 個亞基組成。原因是：①所有強烈抑制α酶的抑制劑都能抑制細胞的復制。②α酶的

溫度敏感突變株使該細胞的 DNA 復制成呈溫度敏感型。③顯微注射α酶的抗體可以抑制 DNA 的復制。④α酶的活性隨細胞周期而變化，S 期活性最高。⑵ DNA 聚合酶δ具有 3 '→ 5 '外切酶活性，對于復制的真實性十分重要。同是也是前導鏈合成的主要酶類。聚合 酶γ負責線粒體基因組的復制。

目前認為：α酶和δ酶都是真核 DNA 復制酶。δ酶在復制中合成前導鏈，α酶合成后滯鏈。δ和ε都具有 3 ‘→ 5 '外切核酸酶的

活性，說明二者都有校對功能。δ和ε之間的差別是：在催化持續的 DNA 合成時，δ需要一個輔助蛋白因子－－增值細胞核抗原

（proliferatingcellnuclearantigen,PCNA）, 而ε則不需要。β可能主要在 DNA 損傷的修復中起作用。ε的主要功能可能是在 去掉 RNA 引物后把缺口補全。2.4.3 DNA 復制的調控

原核細胞的生長和增殖速度取決于培養條件，但在生長、增殖速度不同的細胞中，DNA 鏈延伸的速度幾乎是恒定的，只是復制叉的數 量不同。

迅速分裂的細胞具有較多復制叉，而分離緩慢的細胞復制叉較少并出現復制的間隙。細胞內復制叉的多少決定了復制起始頻率的高低，這可能是原核細胞復制的調控機制。復制起始頻率的直接調控因子是蛋白質和 RNA。2.4.3.1 大腸桿菌染色體 DNA 的復制調控 原核生物 DNA 鏈的延伸速度是恒定的。與生長、增殖相配合協調的 DNA 的合成，主要依靠復制叉數量的不同。迅速分裂的細胞具有

較多的復制叉，分裂緩慢的細胞復制較細胞復制叉的多少取決于復制起始的頻率，這是原核細胞復制的調控點。復制子的調控由復制

起始因子和起始位點兩部分組成。E.coli 的起始位點主要是 oriC，與蛋白相互作用來啟動復制。主要的起始因子有 dnaA、dnaH 等蛋白質，它們通過與始位點形成復合物相互作用，確定復制的起始頻率。研究發現： dnaA 對復制起正調控作用。

2.4.3.2ColE1 質粒 DNA 的復制

ColE1DNA 復制不依賴于其本身編碼的蛋白質，而完全依靠宿主 DNA 聚合酶。質粒 DNA 編碼兩個負調控因子 Rop 蛋白和反義 RNA（RNA1），它們控制了起始 DNA 復制所必須的引物合成.細胞內 RNA1 的濃度決定了 ColE1 質粒的復制起始頻率。Rop 蛋白能

提高 RNA1 與引物前體的相互作用，從而加強了 RNA1 的負調控作用。（圖 2-24）

2.4.3.3 真核細胞 DNA 復制的調控真核細胞中 DNA 復制有三個調控點：①細胞生活周期水平的調控 也稱為限制點調控，即決定細胞停留在 G1 還是進入 S 期。許多外部因素和細胞因子參與限制點調控。促細胞分裂劑、致癌劑、外科

切除、細胞質因子等可誘發 G1 進入 S 期。②染色體水平的調控

決定不同染色體或同一染色體不同部位的復制子按一定順序在 S 期起始復制，這種有序復制的機理還不清楚。

③復制子水平的調控。

決定復制的起始與否。這種調控從單細胞生物到高等生物是高度保守的。

此外，真核生物復制的起始還包括轉錄活化、復制起始復合物的合成和引物合成等階段，許多參與復制起始蛋白的功能與原核生物中類

似。2.5DNA 的修復 DNA 修復(DNArepairing)是細胞對 DNA 受損傷后的一種反應，這種反應可能使 DNA 結構恢復原樣，重新能執 行它原來的功能。2.5.1 回復修復

這是較簡單的修復方式，一般都能將 DNA 修復到原樣。

1.光修復 這是最早發現的 DNA 修復方式。修復是由細菌中的 DNA 光復活酶來完成，此酶能特異性識別紫外線造成的核酸鏈上相

鄰嘧啶共價結合的二聚體，并與其結合，這步反應不需要光；結合后如受 300 － 600nm 波長的光照射，則此酶就被激活，將二聚體

分解為兩個正常的嘧啶單體，然后酶從 DNA 鏈上釋放，DNA 恢復正常結構。后來發現類似的修復酶廣泛存在于動植物中，人體細胞 中也有發現。

2.單鏈斷裂的重接 DNA 單鏈斷裂是常見的損傷，其中一部分可僅由 DNA 連接酶(ligase)參與而完全修復。此酶在各類生物各種

細胞中都普遍存在，修復反應容易進行。但雙鏈斷裂幾乎不能修復。

3.堿基的直接插入 DNA 鏈上嘌呤的脫落造成無嘌呤位點，能被 DNA 嘌呤插入酶(insertase)識別結合，在 K ＋存在的條件下，催化游離嘌呤或脫氧嘌呤核苷插入生成糖苷鍵，且催化插入的堿基有高度專一性、與另一條鏈上的堿基嚴格配對，使 DNA 完全恢復。

2.5.2 切除修復(excisionrepair)是修復 DNA 損傷最為普遍的方式，對多種 DNA 損傷包括堿基脫落形成的無堿基位點、嘧啶二聚

體、堿基烷基化、單鏈斷裂等都能起修復作用。這種修復方式普遍存在于各種生物細胞中，也是人體細胞主要的 DNA 修復機制。修

復過程需要多種酶的一系列作用，基本步驟包括：

①首先由核酸內切酶識別 DNA 的損傷位點，在損傷部位的 5 ′側切開磷酸二酯鍵。不同的 DNA 損傷需要不同的特殊核酸內切酶來識

別和切割。②由 DNA 解鏈酶將有損傷的 DNA 片段解離。③在 DNA 聚合酶的催化下，以完整的互補鏈為模板，按 5 ′→ 3 ′方向合

成 DNA 鏈，填補已切除的空隙。④由 DNA 連接酶將新合成的 DNA 片段與原來的 DNA 斷鏈連接起來。這樣完成的修復能使 DNA 恢復

原來的結構。2.5.3 重組修復(recombinationalrepair)主要用于 DNA 復制時的損傷修復。DNA 重組修復方式： ①受損傷的 DNA 鏈復制時，產生的子代 DNA 在損傷的對應部位出現缺口。

②另一條母鏈 DNA 與有缺口的子鏈 DNA 進行重組交換，將母鏈 DNA 上相應的片段填補子鏈缺口處，而母鏈 DNA 出現缺口。

③以另一條子鏈 DNA 為模板，經 DNA 聚合酶催化合成一新 DNA 片段填補母鏈 DNA 的缺口，最后由 DNA 連接酶連接，完成修補。重

組修復不能完全去除損傷，損傷的 DNA 段落仍然保留在親代 DNA 鏈上，只是重組修復后合成的 DNA 分子是不帶有損傷的，但經多次

復制后，損傷就被“沖淡”了，在子代細胞中只有一個細胞是帶有損傷 DNA 的。2.5.4 SOS 修復

SOS 修復是指 DNA 受到嚴重損傷、細胞處于危急狀態時所誘導的一種 DNA 修復方式，修復結果只是能維持基因組的完整性，提高細

胞的生成率，但留下的錯誤較多，故又稱為錯誤傾向修復(error  pronerepair)，使細胞有較高的突變率。當 DNA 兩條鏈的損

傷鄰近時，損傷不能被切除修復或重組修復，這時在核酸內切酶、外切酶的作用下造成損傷處的 DNA 鏈空缺，再由損傷誘導產生的一

整套的特殊 DNA 聚合酶-SOS 修復酶類，催化空缺部位 DNA 的合成，這時補上去的核苷酸幾乎是隨機的，但仍然保持了 DNA 雙鏈的

完整性，使細胞得以生存。但這種修復帶給細胞很高的突變率。應該說目前對真核細胞的 DNA 修復的反應類型、參與修復的酶類和修

復機制了解還不多，但 DNA 損傷修復與突變、壽命、衰老、腫瘤發生、輻射效應、某些毒物的作用都有密切的關系。人類遺傳性疾病

已發現 4000 多種，其中不少與 DNA 修復缺陷有關，這些 DNA 修復缺陷的細胞表現出對輻射和致癌劑的敏感性增加。DNA 修復小結

環境和生物體內的因素都經常會使 DNA 的結構發生改變。DNA 的復制會發生堿基的配對錯誤；體內 DNA 會有自發性結構變化，包括

DNA 鏈上的堿基異構互變、脫氨基、堿基修飾、DNA 鏈上的堿基脫落等。外界射線的照射等物理因素，烷化劑、堿基類似物、修飾

劑等化學因素都能損傷 DNA 的結構，變化包括有相鄰嘧啶共價二聚體的形成、堿基、脫氧核糖和磷酸基團的烷基化和其它修飾、堿 基脫落、DNA 單鏈斷裂、雙鏈斷裂、DNA 鏈內交聯、鏈間交聯、DNA 與周圍的蛋白質交連等。最后能導致 DNA 的點突變、DNA 核苷酸的缺失、插入或轉位、DNA 鏈的斷裂等，結果可能影響生物細胞的功能和遺傳特性，這些改

變可能會導致細胞死亡、也有機會使細胞獲得新的功能或進化，也可能細胞只有 DNA 結構的遺傳性改變而沒有表型變化，視 DNA 結

構變化的部位、類型和范圍不同而異。

生物在進化過程中獲得的 DNA 修復功能，對生物的生存和維持遺傳的穩定性是至關重要的。對有些 DNA 的損傷，細胞能將其完全修

復到原樣，如可將嘧啶二聚體切開、DNA 單鏈斷裂可重新連接、堿基缺失可再配對插入、加成的烷基可以移除、一條鏈上的堿基或核

苷酸的錯誤可以切除并依賴互補鏈作模板而復制重新修復等。對 DNA 較嚴重的損傷，細胞可采取重組修復、SOS 修復等方式進行反

應，以期提高細胞的存活率，但不能完全消除 DNA 的損傷，會帶給細胞較高的突變率。DNA 的損傷和修復與遺傳、突變、壽命、衰

老、輻射效應、腫瘤發生、某些毒劑的作用、以及某些遺傳性疾病等有密切的關系。目前對 DNA 損傷修復的認識還不透徹。2.6 DNA 的轉座

DNA 的轉座，或稱移位（transposition），是由可移位因子（transposableelement）介導的遺傳物質重排現象。與 DNA 的同源

重組相比，轉座作用發生的頻率雖然要低得多，但它仍然有著十分重要的生物學意義

1.轉座子（transposon,Tn）是存在于染色體 DNA 上可自主復制和位移的基本單位。插入序列（insertionsequence，IS）它

們是不含宿主基因的最簡單的轉座子，它們是細菌染色體或質粒 DNA 的正常組成部分。轉座子常常被定位到特定的基因中，造成該基 因的突變。

插入序列對插入點后的基因產生極性效應。IS 序列都是可以獨立存在的單元 , 帶有介導自身移動的蛋白。IS 除帶有編碼轉座酶的 基因外，不帶任何其它遺傳信息。IS 的結構特點：①長度在 1000bp 左右。②末端具有倒置重復序列，轉座時常復制靶位點附近的一小段 DNA（4 ～ 15bp），形

成位于 IS 兩端的正向重復區。③具有編碼轉座酶的基因。復合式轉座子（compositetransposon）是由兩個重復序列夾著一個或多個結構基因組成的轉座單位，往往存在于 R 因子及其它

質粒中。有的復合轉座子的重復序列就是 IS。

IS 序列插入到某個功能基因兩端時就可能產生復合式轉座子。

除了末端帶有 IS 序列的復合式轉座子以外，還存在一些沒有 IS 序列、體積龐大的轉座子—— TnA 家族，一般長 4500~200000bp。3 轉座機制

轉座時發生的插入作用有一個普遍的特征，即受體分子中有一段很短的（3 ～ 12bp）、被稱為靶序列的 DNA 會被復制，使插入的

轉座子位于兩個重復的靶序列之間。轉座可分為復制性和非復制性兩大類：）在復制性轉座中，整個轉座子被復制了，所移動和轉位的僅僅是原轉座子的拷貝。轉座酶（transposase）和解離酶

（resolvase）分別作用于原始轉座子和復制轉座子。TnA 類轉座主要是這種形式。2）在非復制性轉座中，原始轉座子作為

一個可移動的實體直接被轉位，IS 序列、Mu 及 Tn5 等都以這種方式進行轉座。2.6.3 轉座作用的遺傳學效應 1）轉座引起插入突變

如果插入位于某操縱子的前半部分，就可能造成極性突變，導致該操縱子后半部分結構基因表達失活。2）轉座產生新的基因 3）轉座產生染色體畸變 4）轉座引起生物的進化

重點、難點及對學生的要求（掌握、熟悉、了解、自學）掌握 DNA 的組成及結構結構，了解核小體的裝配，了解原核生物基因組的特點和真核生物基因組的結構特點。掌握 DNA 分子復

制的一般特點。掌握真核生物 DNA 復制必需的成份。掌握 DNA 復制的調控。了解 DNA 的修復，掌握 DNA 的轉座的機理。

輔助教學情況（多媒體課件、板書、繪圖、標本、示教等）復習思考題 1.核酸的組成 2.何為 C 值矛盾

3.真核細胞 DNA 序列大致上可分為哪 4 類

4.為什么說細胞對 DNA 損傷的修復能力對細胞的生存是至關重要的 ? 5.體內那些因素會導致 DNA 結構的變化 ? 細胞能采取那些辦法保持 DNA 結構的穩定性 ? 6.那些環境因素容易損傷生物體內的 DNA? 損傷有那些方式和類型 ? 結果對生物細胞會有些什么影響 ? 7.現在所知生物細胞對 DNA 損傷修復有那些方式 ? 修復反應的結果會如何 ?8..真核生物基因組的結構特點

9.原核生物基因組的特點 10.描述 DNA 的二級結構

11.DNA 分子復制的一般特點是什么 12.DNA 的半保留復制機理 13.真核生物 DNA 的復制特點

14.為什么說細胞對 DNA 損傷的修復能力對細胞的生存是至關重要的 ? 15.體內那些因素會導致 DNA 結構的變化 ? 細胞能采取那些辦法保持 DNA 結構的穩定性 ? 16.那些環境因素容易損傷生物體內的 DNA? 損傷有那些方式和類型 ? 結果對生物細胞會有些什么影響 ? 17.現在所知生物細胞對 DNA 損傷修復有那些方式 ? 修復反應的結果會如何 ? 第三章 生物信息的傳遞（上）－轉錄

本單元或章節的教學目的與要求：掌握轉錄的基本過程、機制 授課主要內容及學時分配 8 學時

DNA 序列是遺傳信息的貯存者，它通過自主復制得到永存，并通過轉錄生成信使 RNA、翻譯成蛋白質的過程來控制生命現象。基因表達

包括轉錄（transcription）和翻譯（translation）兩個階段。轉錄是指以 DNA 的一條鏈為模板在 RNA 聚合酶催化下，按照堿基

配對原則，合成一條與 DNA 鏈的一定區段互補的 RNA 鏈的過程稱為轉錄。翻譯是指以新生的 mRNA 為模板，把核苷酸三聯遺傳密碼子

翻譯成氨基酸序列、合成多肽的過程，是基因表達的最終目的。

編碼鏈（有義鏈）：我們把與 mRNA 序列相同的那條 DNA 鏈稱為編碼鏈（coding strand）。反義鏈（無意義鏈，負鏈）：在 RNA 的轉錄中，用作模板的 DNA 鏈稱為反義鏈（antisense 3.1RNA 的轉錄 3.1.1 轉錄的基本過程

無論是原核細胞還是真核細胞，轉錄的基本過程都包括：模板的識別、起始、延伸和終止。

啟動子：與 RNA 聚合酶特異性結合以起始轉錄的一段 DNA 序列。終止子：引起轉錄終止的一段 DNA 序列。增強子：調節啟動子，增強轉錄效率的一段 DNA 序列。）模板識別階段主要指 RNA 聚合酶與啟動子 DNA 雙鏈相互作用并與之相結合的過程。

轉錄起始前，啟動子附近的 DNA 雙鏈分開形成轉錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板 DNA 的配對。轉錄起始就是 RNA 鏈上第一個核苷酸 鍵的產生。）轉錄起始后直到形成 9 個核苷酸短鏈，是通過啟動子階段，此時 RNA 聚合酶一直處于啟動子區，新生的 RNA 鏈與 DNA 鏈的結合

不夠牢固，很容易從 DNA 鏈上掉下來并導致轉錄重新開始。一旦 RNA 酶成功地合成 9 個以上核苷酸并離開啟動子區，轉錄就進入正

常的延伸階段。所以，通過啟動子的時間代表一個啟動子的強弱。一般來說，通過啟動子的時間越短，該基因轉錄起始的頻率也越高。3）延伸階段：當 RNA 聚合酶離開啟動子，沿 DNA 鏈移動并使新生 RNA 鏈不斷伸長的過程就是延伸階段。大腸桿菌 RNA 聚合酶的

活性一般是每秒鐘合成 50 ～ 60 個核苷酸）終止：當終止反應 包括識別特定的終止位點，堿基不再加到鏈上，轉錄復合物停止移動，酶和 RNA 從模板上釋放。當 RNA 鏈延

伸到轉錄終止位點時，RNA 聚合酶不再形成磷酸二酯鍵，RNA-DNA 雜合物分離，轉錄泡瓦解，DNA 恢復成雙鏈狀態，而 RNA 聚合

酶和 RNA 鏈都被從模板上釋放出來，這就是轉錄的終止。真核細胞中模板的識別與原核細胞不同。

真核生物 RNA 聚合酶不能直接識別基因的啟動子區，所以，需要一些被稱為轉錄調控因子的輔助蛋白質按特定順序結合于啟動子上，RNA 聚合酶才能與之相結合并形成復雜的前起始復合物（preinitiation transcription complex，PIC）以保證有效地起始轉錄。

轉錄和翻譯的速度基本相等，37 ℃ 時，轉錄生成 mRNA 的速度大約是每分鐘 2 500 個核苷酸，即每秒鐘合成 14 個密碼子，而蛋

白質的合成速度大約是每秒鐘 15 個氨基酸。

正常情況下，從一個基因開始表達到細胞中出現其 mRNA 的間隔約為 2.5 分鐘，而再過 0.5 分鐘就能在細胞內檢測到相應的蛋白質。3.1.2 轉錄機器的主要成分 3.1.2.1 RNA 聚合酶

RNA 聚合酶主要以雙鏈 DNA 為模板（若以單鏈 DNA 為模板，則活性大大降低），以四種核苷三磷酸為活化前體，并以 Mg2+/Mn2+ 為

輔助因子，催化 RNA 的起始、延伸和終止，它不需要任何引物。RNA 聚合酶是轉錄過程中的關鍵酶。

原核和真核生物的 RNA 聚合酶雖然都能催化 RNA 的合成，但在分子組成、種類和生化特性上不同。1.原核生物的 RNA 聚合酶

E.coliRNA 聚合酶的組成及各亞基的功能 E.coli 和其它原核細胞一樣，只有一種 RNA 聚合酶。大腸桿菌的 RNA 聚合酶全酶由 5 種亞基α 2 ββ' w ζ組成，ζ因子與其它

部分的結合不是十分緊密，它易于與β'βα 2 分離，含有α 2 ββ' w 的酶稱為核心酶，加上ζ亞基則成為全酶。五種亞基的功能

分別為：α亞基：可能與核心酶的組裝及啟動子識別有關，并參與 RNA 聚合酶和部分調節因子的相互作用。β亞基：含催化部位，起

催化作用，催化形成磷酸二酯鍵。w 亞基：在全酶中存在，功能不清楚。β'亞基：與 DNA 模板結合功能。ζ亞基：識別起始位點。

它負責模板鏈的選擇和轉錄的起始。

不同的原核生物，具有基本相同的核心酶，但其ζ亞基有所差別，決定了原核基因的選擇性表達。2.真核生物的 RNA 聚合酶真核生物中已發現有三種細胞核的 RNA 聚合酶，分別稱為 RNA 聚合酶 I、II、III，分子量大致都 在 50 萬道爾頓左右。

它們專一性地轉錄不同的基因，因此由它們催化的轉錄產物也各不相同。RNA 聚 I 合成 RNA 的活性最顯著，它位于核仁中，負責轉

錄編碼 rRNA 的基因。而細胞內絕大部分 RNA 是 rRNA。

RNA 聚合酶 II，位于核質中，負責核內不均一 RNA 的合成，而 hnRNA 是 mRNA 的前體。RNA 聚合酶 III 負責合成 tRNA 和許多小的核內 snRNA。

鵝膏蕈堿是真核生物 RNA 聚合酶特異性抑制劑，三種真核生物 RNA 聚合酶對鵝膏蕈堿的反應不同。不同生物 3 類聚合酶的亞基種類和大小各異，但共性是： 1）聚合酶中含有兩個相對分子質量超過 1 × 105 的大亞基 ；）同種生物 3 類聚合酶有“共享”小亞基的傾向，即有幾個小亞基是其中 3 類或 2 類聚合酶所共有的。3.1.2.2 轉錄復合物

轉錄可被分成 4 個階段： 啟動子的選擇（起始位點的識別）轉錄起始 鏈的延伸 轉錄終止 啟動子的選擇包括 RNA 聚合酶全酶對啟動子的識別，聚合酶與啟動子可逆性結合形成封閉復合物（closed complex）。此時，DNA 仍處于雙鏈狀態。

伴隨著 DNA 構象上的重大變化，封閉復合物轉變成開放復合物（open complex），聚合酶全酶所結合的 DNA 序列中有一小段雙鏈 被解開。

對于強啟動子來說，從封閉復合物到開放復合物的轉變是不可逆的，是快反應。開放復合物與最初的兩個 NTP 相結合并在這兩個核苷

酸之間形成磷酸二酯鍵后，即轉變成包括 RNA 聚合酶、DNA 和新生 RNA 的三元復合物。除了 RNA 聚合酶之外，真核生物轉錄過程中至少還需要 7 種輔助因子參與。因為不少輔助因子本身就包含多個亞基，所以轉錄起始復合物的分子量特別大。見表 3-4 真核生物 RNA 聚合酶 II 所形成的轉錄起始復合物（p69）。一般情況下，該復合物可以進入兩條不同的反應途徑：

* 一是合成并釋放 2 ～ 9 個核苷酸的短 RNA 轉錄物，即所謂的流產式起始；

* 二是盡快釋放ζ亞基，轉錄起始復合物通過上游啟動子區并產生由核心酶、DNA 和新生 RNA 所組成的轉錄延伸復合物。

ζ因子的作用只是起始而已，一旦轉錄開始，它就脫離了起始復合物，而由核心酶負責 RNA 鏈的延伸。因此，聚合酶全酶的作用是啟動子的選擇和轉錄的起始，而核心酶的作用是鏈的延伸。

轉錄延伸復合物是轉錄循環中十分重要的環節。與轉錄起始復合物相比，延伸復合物極為穩定，可長時間地與 DNA 模板相結合而不解

離。只有當它遇到轉錄終止信號時，RNA 聚合酶才停止加入新的核苷酸，RNA-DNA 雜合物解離，釋放轉錄產物并導致聚合酶本身從 模板 DNA 上掉下來。

TF Ⅱ D 介導形成轉錄前起始復合物(pre intitiationcomplex, PIC)RNA 聚合酶Ⅱ轉錄前起始復合體的形成示意圖轉錄前先是 TF Ⅱ－ D 與 TATA 盒結合① TF Ⅱ－ A 結合在 TF Ⅱ－ D 上游② TF Ⅱ－ B 結合在轉錄起始位點附近③ RNA 聚合酶Ⅱ與 TF Ⅱ－ F 偶聯形成復合體結合到轉錄起始位點④ TF Ⅱ－ E 結合在 RNA 聚合酶Ⅱ的下游⑤ TF Ⅱ－ H 和 TF Ⅱ－ J 結合上去，形成完整的

轉錄起始復合物和 TF Ⅱ－ J 結合上去，形成完整的轉錄起 3.2 啟動子與轉錄起始

大腸桿菌 RNA 聚合酶與啟動子的相互作用主要包括啟動子區的識別、酶與啟動子的結合及ζ因子的結合與解離。

3.2.1 啟動子區的基本結構

啟動子：是一段位于結構基因 5 '端上游區的 DNA 序列，在轉錄起始之前被 RNA 聚合酶結合的 DNA 部位稱為啟動子。

轉錄的起始是基因表達的關鍵階段，而這一階段的重要問題是 RNA 聚合酶與啟動子的相互作用。啟動子的結構影響了它與 RNA 聚合酶的親和力，從而影響了基因表達的水平。

轉錄單元（transcription unit）是一段從啟動子開始到終止子（terminator）結束的 DNA 序列，RNA 聚合酶從轉錄起點開始

沿著模板前進，直到終止子為止，轉錄出一條 RNA 鏈。在細菌中，一個轉錄單元可以是一個基因，也可以是幾個基因。

轉錄起點是指與新生 RNA 鏈第一個核苷酸相對應 DNA 鏈上的堿基，研究證實通常為一個嘌呤。常把起點前面，即 5 '末端的序列稱為上游（upstream）;而把其后面即 3 '末端的序列稱為下游（downstream）。

在描述堿基的位置時，起點為＋ 1，下游方向依次為＋ 2，＋ 3 ??，上游方向依次為－ 1，－ 2，－ 3 ??。

Pribnow 框（-10 序列）在轉錄開始位點上游-10 區域，大致在-4~-13 之間有一個典型的 6bp 序列，大多為 TATAAT 或稍有變化 的形式，稱為 Pribnow 框或-10 序列（TATA 區）。該共同序列的頻度為： T 89A 89T 50A 65A 65T100 目前認為，Pribnow 框決

定著轉錄的方向，是 RNA 聚合酶牢固結合的位置。

-35 序列（Sexfama box）在轉錄開始位點上游-35 區域也有一段保守序列，共同序列是 TTGACA，稱為-35 區。其保守頻度為： T85T 83G 81A 61C 69A 52 下降突變：啟動子里核苷酸的改變造成啟動子效率降低。突變后的-10 區和-35 區越接近共同序列，轉

錄的 RNA 就越多；越遠離共同序列，轉錄的 RNA 就越少。

在真核生物中，Hogness 等先在珠蛋白基因中發現了類似 Pribnow 區的 Hogness 區（Hogness box），這是位于轉錄起始位點上

游－ 25 ～－ 30bp 處的共同序列 TATAAA，也稱為 TATA 區。

另外，在起始位點上游－ 70 ～－ 78bp 處還有另一段共同序列 CCAAT，這是與原核生物－ 35bp 區相對應的序列，稱為 CAAT 區（CAAT box）。3.2.2 啟動子區的識別

一般認為，RNA 聚合酶并不直接識別堿基對本身，而是通過氫鍵互補的方式加以識別。

在啟動子區 DNA 雙螺旋結構中，腺嘌呤分子上的 N6、鳥嘌呤分子上的 N2、胞嘧啶分子上的 N4 都是氫鍵供體，而腺嘌呤分子上 的 N7、N3，胸腺嘧啶分子上的 O4、O2，鳥嘌呤分子上的 N7、O6、N3 和胞嘧啶分子上的 O2 都是氫鍵受體。

由于它們分別處于 DNA 雙螺旋的大溝和小溝內，因此都具有特定的方位，而酶分子中也有處于特定空間構象的氫鍵受體與供體，當它

們與啟動子中對應的分子在一定距離內互補時，就形成氫鍵，相互結合。這種氫鍵互補學說較為圓滿地解釋了啟動子功能既受 DNA 序

列的影響，又受其構象影響這一事實。3.2.3 酶與啟動子區的結合

在 RNA 聚合酶與啟動子相互作用過程中，聚合酶首先與啟動子區閉合雙鏈 DNA 相結合，形成二元閉合復合物，然后經過解鏈得到二

元開鏈復合物（圖 3-8，p74）。

解鏈區一般在－ 9 ～＋ 13 之間，而酶與啟動子結合的主要區域在其上游。一旦開鏈區解鏈，酶分子能以正確的取向與解鏈后的有關 單鏈相互作用，形成復合物。

因此，RNA 聚合酶既是雙鏈 DNA 結合蛋白，又是單鏈 DNA 結合蛋白。DNA 開鏈是按照 DNA 模板序列正確引入核苷酸底物的必要條件。3.2.4 － 10 區和－ 35 區的最佳距離

在原核生物中，－ 35 區和－ 10 區的距離大約是 16 ～ 19bp，小于 15bp 或大于 20bp 都會降低啟動子的活性。

保持啟動子這兩段序列以及它們之間的距離是十分重要的，否則就會改變它所控制的基因表達水平。在細菌中常見兩種啟動子突變：

下降突變（down mutation）：如果把 Pribnow 其從 TATAAT 變成 AATAAT，就會大大降低其結構基因的轉錄水平；

上升突變（up mutation）: 即增加 Pribnow 區共同序列的同一性。

突變后的-10 區和-35 區越接近共同序列，轉錄的 RNA 就越多；越遠離共同序列，轉錄的 RNA 就越少。例如，在乳糖操縱子的啟動子中，將其 Pribnow 區從 TATGTT 變成 TATATT，就會提高啟動子的效率，提高乳糖操縱子基因的轉錄水平。3.2.5 增強子及其功能

增強子（enhancer）：能強化轉錄起始的序列稱為增強子或強化子

在 SV40 的轉錄單元上存在增強子，它位于轉錄起始位點上游約 200bp 處，為兩段 72bp 的重復序列，它們不是啟動子的一部分，但

能增強或促進轉錄的起始，除去這兩段序列會大大降低這些基因的轉錄水平，若保留其中一段或將其取出插在 DNA 分子的任何部位，就能保持基因的正常轉錄。

除 SV40 外，還在反轉錄病毒基因、免疫球蛋白基因、胰島素基因、胰麋蛋白酶基因等許多基因的啟動子區中陸續發現了增強子的存在

增強子很可能通過影響染色質 DNA-蛋白質結構或改變超螺旋的密度而改變模板的整體結構，從而使得 RNA 聚合酶更容易與模板 DNA 相結合，起始基因轉錄。

增強子的作用有以下特點： ①增強效應 非常明顯②增強子提高同一條 DNA 鏈上基因轉錄效率，可以遠距離作用，通常可距離 ～ 4kb、個別情況下離開所調控的基因 30kb 仍能發揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。③增強子作用與其序列的正反 方向無關，將增強子方向倒置依然能起作用。④增強子要有啟動子才能發揮作用，沒有啟動子存在，增強子不能表現活性。⑤但增強

子對啟動子沒有嚴格的專一性，同一增強子可以影響不同類型啟動子的轉錄。⑥增強子必須與特定的蛋白質因子結合后才能發揮增強

轉錄的作用。⑦增強子一般具有組織或細胞特異性。⑧大多為重復序列。沉默子 最早在酵母中發現，以后在 T 淋巴細胞的

T 抗原受體基因的轉錄和重排中證實這種負調控順式元件的存在。目前對這種在基因轉錄降低或關閉中起作用的序列研究還不多，但

從已有的例子看到：沉默子的作用可不受序列方向的影響，也能遠距離發揮作用，并可對異源基因的表達起作用。

3.2.6 真核生物啟動子對轉錄的影響

啟動子是指確保轉錄精確而有效地起始的 DNA 序列。

它是在 DNA 序列 5 '上游區有一段與原核生物 Pribnow 區相似的富含 TA 的保守序列。由于該序列前 4 個堿基為 TATA 區，所以又 稱為 TATA 區（TATA box）。

真核基因的啟動子在－ 25 ～－ 35 區含有 TATA 序列，在－ 70 ～－ 80 區含有 CCAAT 序列（CAAT box），在－ 80 ～－ 110 含有 GCCACACCC 或 GGGCGGGG 序列（GC box）。

習慣上，將 TATA 區上游的保守序列稱為上游啟動子元件(upstream promoter element，UPE)或稱上游激活序列（upstream activating sequence，UAS）。

原核和真核基因轉錄起始位點上游區的結構有很大差別（圖 3-9，p76）：）原核基因啟動區范圍很小，一般情況下，TATAAT（Pribnow 區）的中心位于－ 7 ～－ 10，上游－ 30 ～－ 70 區為正調控

因子結合序列，＋ 1 ～－ 20 區為負調控因子結合序列；

真核基因的調控區較大，TATAA/TA 區位于－ 20 ～－ 30，而上游－ 40 ～－ 110 區為上游激活區。2）除 Pribnow 區之外，原核基因啟動子上游只有 TTGACA 區（－ 30 ～－ 40）作為 RNA 聚合酶的主要結合位點，參與轉錄調控； 而真核基因除了含有可與之相對應的 CAAT 區之外，大多數基因還擁有 GC 區和增強子區。TATA 區和其它兩個 UPE 區的作用有所不同： TATA 區：使轉錄精確地起始

UPE 區：對啟動子的生物活性有很大影響

CAAT 區和 GC 區主要控制轉錄起始頻率，基本不參與起始位點的確定。

CAAT 區對轉錄起始頻率的影響最大，該區任一堿基的改變都將極大地影響靶基因的轉錄強度。TATA 區和相鄰的 UPE 區之間插入核苷酸也會使轉錄減弱。

GC 區、CAAT 區和 TATA 區都有重要功能，但不不是每個基因的啟動子區都包含這三種序列。（表 3-5，p77）

基因轉錄實際上是 RNA 聚合酶、轉錄調控因子和啟動子區各種調控元件相互作用的結果。3.3 原核生物和真核生物 mRNA 的特征比較

信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）在大腸桿菌細胞中占總 RNA 的 2 ％左右（tRNA 占 16 ％，rRNA80 ％以上）。

許多基因的 mRNA 在體內還是相當穩定的，半衰期從幾個小時到幾天不等。原核和真核細胞內 mRNA 的生物合成過程和成熟的 mRNA 的結構不同：

真核細胞 mRNA 的最大特點是它往往以一個較大相對分子質量的前體 RNA 出現在核內，只有成熟的、相對分子質量明顯變小并經過化

學修飾的 mRNA 才能進入細胞質，參與蛋白質的合成。所以，真核細胞 mRNA 的合成和功能表達發生在不同的空間和時間范疇內。

原核生物中，mRNA 的轉錄和翻譯不僅發生在同一個細胞空間里，而且這兩個過程幾乎是同步進行的，蛋白質合成往往在 mRNA 剛 開始轉錄時就被引發了。

一個原核細胞的 mRNA（包括病毒）有時可以編碼幾個多肽，而一個真核細胞的 mRNA 最多只能編碼一個多肽。

原核生物常以 AUG（有時 GUG，甚至 UUG）作為起始密碼子，而真核生物幾乎永遠以 AUG 作為起始密碼子。3.3.1 原核生物 mRNA 的特征）原核生物 mRNA 的半衰期短：轉錄開始 1min 后，降解就開始了，即當一個 mRNA 的 5 ' 端開始降解時，其 3 ' 端可能仍在合 成或被翻譯。

mRNA 降解的速度大概只有轉錄或翻譯速度的一半。

因為基因轉錄和多肽鏈延伸的速度基本相同，所以細胞內某一基因產物（蛋白質）的多少決定于轉錄和翻譯的起始效率。）許多原核生物 mRNA 以多順反子的形式存在： 細菌 mRNA 可以同時編碼不同的蛋白質。

單順反子（monocistronic mRNA）: 只編碼一個蛋白質的 mRNA。多順反子（polycistronic mRNA）：編碼多個蛋白質的 mRNA。

操縱子（operon）：多順反子 mRNA 是一組相鄰或相互重疊基因的轉錄產物，這樣的一組基因稱為一個操縱子，它是生物體內的重 要遺傳單位。

幾乎所有 mRNA 都可以被分成 3 部分：編碼區、位于 AUG 之前的 5 '端上游非編碼區以及位于終止密碼子之后不翻譯的 3 '端下游 非編碼區。

對于第一個順反子來說，一旦 mRNA 的 5 '端被合成，翻譯起始位點即可與核糖體相結合，而后面幾個順反子翻譯的起始就會受到 其上游順反子結構的調控。

一種情況是，第一個蛋白質合成終止以后，核糖體分解成大、小亞基，脫離 mRNA 模板，第二個蛋白的翻譯必須等到新的小亞基和大

亞基與該蛋白起始密碼子相結合后才可能開始（圖 3-12a,p80）。

另一種情況是，當前一個多肽翻譯完成后，核糖體分解成大、小亞基，小亞基也可能不離開 mRNA 模板，而是迅速與游離的大亞基結

合，啟動第二個多肽的合成（圖 3-12b,p80）。）原核生物 mRNA 的 5 ' 端無帽子結構，3 ' 端沒有或只有較短的 poly（A）結構。原核生物起始密碼子 AUG 上游 7 ～ 12 個核苷酸處有一個 SD 序列（Shine-DNAlgarno sequence）的保守區，因為該序列與

16SrRNA3 '端反相互補，所以被認為在核糖體-mRNA 的結合過程中起作用。

所有已知大腸桿菌 mRNA 的翻譯起始區都含有 4 ～ 5 個（至少 3 個）對應于 SD 序列的核苷酸。表 3-6 SD 序列的例子（p80）。

細菌 16SrRNA 的 3 '末端既非常保守，又高度自我互補，能形成“發卡”結構（圖 3-14，p82）。3.3.2 真核生物 mRNA 的特征

“基因”的分子生物學定義：產生一條多肽鏈或功能 RNA 所必須的全部核苷酸序列。真核生物 mRNA 結構上的最大特征是 5 '端的帽子及 3 '端的 poly（A）結構。）真核生物 mRNA 的 5 ' 端的帽子結構，真核生物 mRNA 的 5 ' 端大多具有 m7GPPPN 的帽子結構。5 ' 終端是在一個 mRNA 轉

錄后加上去甲基化的鳥嘌呤（G）。

mRNA 5 ' 端加“ G ”的反應是由腺苷酸轉移酶完成的，這個反應非常迅速。

據測算，在新生的 mRNA 鏈達到 50 個核苷酸之前，甚至可能在 RNA 聚合酶 II 離開轉錄起始位點之前，帽子結構就已加到 mRNA 的

第一個核苷酸上了。這就是說，mRNA 幾乎一出生就戴上了帽子。

一般認為，帽子結構是 GTP 和原 mRNA5 '三磷酸腺苷（或鳥苷）縮合反應的產物，新加上的 G 與 mRNA 鏈上所有其它核苷酸方向

正好相反，像一頂帽子倒扣在 mRNA 鏈上，故而得名。

帽子結構可能使 mRNA 免遭核酸酶的破壞，而且，有帽子結構的 mRNA 更容易被蛋白質合成的起始因子所識別，從而促進蛋白質的

合成。mRNA 的帽子結構常常被甲基化，由尿苷酸-7-甲基轉移酶來催化。帽子結構的功能： ? 對翻譯起識別作用。②可以保護 mRNA 免遭核酸酶降解。不是所有的真核生物 mRNA 都有 5 '端帽子結構。2）絕大多數真核生

物 mRNA 具有 poly（A）尾巴。除組蛋白基因外，真核生物 mRNA 的 3 '末端都有 poly（A）序列，長度為 40 ～ 200bp。幾 乎所有真核基因的 3 '末端轉錄終止位點上游 15 ～ 30bp 處的保守序列 AAUAAA 對于初級轉錄產物的準確切割及加 poly（A）是

必須的。poly（A）是 mRNA 由細胞核進入細胞質所必須的形式，它大大提高了 mRNA 在細胞質中的穩定性。當 mRNA 剛從細胞核

進入細胞質時，其 poly（A）尾巴一般較長，隨著 mRNA 在細胞質內逗留時間的延長，poly（A）逐漸變短消失，mRNA 進入

降解過程。真核生物 mRNA 大都有 poly（A）尾巴這一特性，廣泛用于分子克隆。反轉錄反應。盡管大部分真核 mRNA 大都有

poly（A）尾巴，細胞中仍有多達 1/3 沒有 poly（A）尾巴的 mRNA。真核 mRNA 中 poly(A)化必要的 2 個序列信號和切斷位點：

human α-globin UUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAGCCUGUGUGUGCCUGGGUUCUCU human β-globin CCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCAAUGAUGUAUUUAAAUUAU human growth hormoneCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAUUGUCUGACUAGGUGUCCUC 真核基因大多是斷裂的，也就是說，一個基因可由多個內含子和外顯子間隔排列而成。研究表明，內含子在真核基因中所占的比例很高，甚至超過 99 ％。

由 DNA 轉錄產生的原始轉錄產物－－核不均一 RNA（hnRNA,heterogeneous nuclear RNA），即 mRNA 的前體，經過 5 '加帽

和 3 '酶切加 poly（A）尾，再經 RNA 的剪接，編碼蛋白質的外顯子部分就連接成為一個連續的可讀框（open reading frame, ORF），通過核孔進入細胞質，就能作為蛋白質合成的模板了。3.4 終止和抗終止

一般情況下，RNA 聚合酶起始基因轉錄后，它就會沿著模板 5 '→ 3 '方向不停地移動，合成 RNA 鏈，直到碰上終止信號時才與模

板 DNA 相脫離并釋放新生 RNA 鏈。

終止發生時，所有參與形成 RNA-DNA 雜合體的氫鍵都必須被破壞，模板 DNA 鏈才能與有義鏈重新組合成 DNA 雙鏈。

3.4.1 不依賴于ρ因子的終止

模板 DNA 上存在終止轉錄的特殊信號－－終止子，每個基因或操縱子都有一個啟動子和一個終止子。

第二篇：分子生物學教案

《分子生物學》教案

一、課程性質

必修課

二、教學目的要求

分子生物學是一門近年來發展迅速并且在生命科學領域里應用越來越廣泛、影響越來越深遠的一個學科。從學科角度來講，分子生物學函蓋面非常廣，與生物化學和細胞生物學等生命科學主干課程有一些交叉。在學習本課程之前，要求學生已掌握了必要的數、理、化知識，并學習了植物學、動物學、微生物學與生物化學等基礎課程。

通過對本課程的學習，使學生掌握基因概念在分子水平上的發展與演變、基因的分子結構和特點、基因的復制、基因表達（在轉錄、翻譯水平）的基本原理、基因表達調控的基本模式、基因發生突變與交換及DNA遺傳多型性檢測的分子生物學原理，了解新興起的基因組學和后基因組學研究現狀。通過與實驗課相結合，系統地介紹與基因克隆相關的DNA技術，使學生們掌握一些基本的分子生物學技術。

三、教材及有關參考書

朱玉賢等，《現代分子生物學》高等教育出版社，2002 Benjamin Lewin編著

余龍等主譯，《Gene Ⅷ》科學出版社，2005 趙壽元等，《現代遺傳學》高等教育出版社，2001 孫乃恩等，《分子遺傳學》南京大學出版社，1990

四、適用專業

生物科學、生物技術、生物工程、科學教育等專業

五、授課學時

36學時

六、課程內容

第一章

緒論

教學目的：使學生對分子生物學的發展簡史、分子生物學的研究內容及發展前景有較全面的了解。

教學重點、難點：基因概念的發展與演變；對現代遺傳學各發展階段的認識。課時安排：4學時 教學內容：

一、什么是分子生物學？

分子生物學是研究核酸、蛋白質等所有生物大分子的形態、結構特征及其重要性、規律性和相互關系的科學。

二、分子生物學的發展簡史

從1847年Schleiden和Schwann提出“細胞學說”，證明動、植物都是由細胞組成的到今天，雖然不過短短一百多年時間，我們對生物大分子--細胞的化學組成卻有了深刻的認識。孟德爾的遺傳學規律最先使人們對性狀遺傳產生了理性認識，而Morgan的基因學說則進一步將“性狀”與“基因”相耦聯，成為分子遺傳學的奠基石。Watson和Crick所提出的脫氧核糖酸雙螺旋模型，為充分揭示遺傳信息的傳遞規律鋪平了道路。在蛋白質化學方面，繼Sumner在1936年證實酶是蛋白質之后，Sanger利用紙電泳及層析技術于1953年首次闡明胰島素的一級結構，開創了蛋白質序列分析的先河。而Kendrew和Perutz利用X射線衍射技術解析了肌紅蛋白（myoglobin）及血紅蛋白（hemoglobin）的三維結構，論證了這些蛋白質在輸送分子氧過程中的特殊作用，成為研究生物大分子空間立體構型的先驅。

總結與分子生物學相關的諾貝爾獎。

三、分子生物學的主要研究內容 1． DNA重組技術------基因工程

基因工程指將不同DNA片段（如某個基因或基因的一部分）按照人們的設計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產生影響受體細胞的新的遺傳性狀。

DNA重組技術有著廣闊的應用前景：

① 在生物技術制藥領域中的應用。如：利用基因工程技術改造傳統的制藥工業；利用克隆的基因表達生產有用的肽類和蛋白質藥物或疫苗。

②定向改造某些生物的基因組結構，使它們具備某些特殊的經濟價值。③在基礎研究中的應用。如：基因的克隆與分析；啟動子分析。2．基因表達調控

因為蛋白質分子參與并控制了細胞的一切代謝活動，而決定蛋白質結構和合成時序的信息都由核酸（主要是脫氧核糖核酸）分子編碼，表現為特定的核苷酸序列，所以基因表達實質上就是遺傳信息的轉錄和翻譯。在個體生長發育過程中生物遺傳信息的表達按一定的時序發生變化（時序調節），并隨著內外環境的變化而不斷加以修正（環境調控）。

原核生物的基因組和染色體結構都比真核生物簡單，轉錄和翻譯在同一時間和空間內發生，基因表達的調控主要發生在轉錄水平。真核生物有細胞核結構，轉錄和翻譯過程在時間和空間上都被分隔開，且在轉錄和翻譯后都有復雜的信息加工過程，其基因表達的調控可以發生在各種不同的水平上。基因表達調控主要表現在信號傳導研究、轉錄因子研究及RNA剪輯3個方面。

3．生物大分子結構功能----結構分子生物學

生物大分子的結構功能研究（又稱結構分子生物學）一個生物大分子，無論是核酸、蛋白質或多糖，在發揮生物學功能時，必須具備兩個前提:首先，它擁有特定的空間結構（三維結構）；其次，在它發揮生物學功能的過程中必定存在著結構和構象的變化。

結構分子生物學就是研究生物大分子特定的空間結構及結構的運動變化與其生物學功能關系的科學。它包括結構的測定、結構運動變化規律的探索及結構與功能相互關系的建立3個主要研究方向。最常見的研究三維結構及其運動規律的手段是X射線衍射的晶體學（又稱蛋白質晶體學），其次是用二維核磁共振和多維核磁研究液相結構，也有人用電鏡三維重組、電子衍射、中子衍射和各種頻譜學方法研究生物高分子的空間結構。

4．功能基因組學與生物信息學研究

先后完成了包括從大腸桿菌、釀酒酵母到線蟲等十余種模式生物基因組全序列的測定工作，并于2002年2月12日完成人類基因組測序工作。世界兩大最著名的學術刊物－nature和science同時發表了人類基因組全序列。

基因組測序工作的進展是非常令人振奮的。但是也隨之產生了新問題。大

量涌出的新基因數據迫使我們不得不考慮這些基因編碼的蛋白質有什么功能這個問題。在這些基因組中通常有一半以上基因的功能是未知的。因此讀懂基因組稱為后基因組時代的生命科學領域面臨的巨大的挑戰。

在功能基因組時代，應用生物信息學方法，高通量地注釋基因組所有編碼產物的生物學功能是一個重要的特征。生物信息學是在各種“組學”研究的推動下發展起來的.傳統的研究方法是只研究某一個基因或蛋白質或轉錄產物，而“組學“的研究是采用高通量的技術分析細胞中全部的基因和蛋白質，這樣勢必會產生海量的信息，因此，人們必須尋求一種高速度、高效率、大規模的方式積累數據處理分析方法。

四、分子生物學展望 未來的發展方向：

不同模式生物基因調控網絡的比較分析；RNA介導的基因表達調控網絡；表觀遺傳（epigenetic）信息的整合；從數據整合到系統生物學（systems biology）。

第二章 遺傳的物質基礎－DNA 教學目的：使學生了解并掌握DNA的結構與功能

教學重點、難點：DNA的一級結構的測定，DNA的二級結構及超螺旋結構。課時安排：4學時 教學內容：

第一節DNA的一級結構 一、一級結構的構成

所謂DNA的一級結構，就是指4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了該DNA分子的化學構成。核苷酸序列對DNA高級結構的形成有很大影響，如B-DNA中多聚（G-C）區易出現左手螺旋DNA（Z-DNA），而反向重復的DNA片段易出現發卡式結構等。

二、一級結構的序列測定

目前所用的DNA測序方法是在末端終止法的基礎上發展起來的。由英國科學家Sanger提出的。Sanger在生物大分子的序列測定方面做出了杰出貢獻。他曾在1953年利用小片段重迭法成功測定了胰島素51個氨基酸序列，并獲得諾貝爾獎。1977年又利用末端終止法測定了?X174噬菌體得DNA序列，第二次獲得諾貝爾獎。

末端終止法又稱為雙脫氧法，基本原理是模擬體內DNA的復制過程在體外合成DNA，通過測定DNA片段的相對長度來推斷核苷酸序列。

至于成分大家不要死記，可以回憶一下DNA復制過程需要哪幾種組分：模板、dNTP、引物、DNA聚合酶，其中一種dNTP的磷酸基團用P32標記。除此之外還需要每個管中分別加入一種ddNTP。DDNTP是雙脫氧核苷酸，由于在3?位上缺少-OH，無法與下一個單體之間形成磷酸二酯鍵，因此，一旦摻入DNA鏈的延伸后，便終止DNA的合成這樣，在DNA聚合酶的作用下核苷酸鏈不斷延伸，我們可以調整dNTP和ddNTP的濃度，使ddNTP在每個位置上都有一個摻入的機會。每個管都會產生一系列長短不一的DNA片段，其共同特征是末端的最后一個堿基是相同的。我們將所得的所有DNA片段進行凝膠電泳，長度不同，泳動的速度不同。8%-20%的聚丙烯酰胺可將相差一個堿基的DNA片段區

分開，由于dCTP是放射性標記的，我們將凝膠放射自顯影后，有DNA片段的位置就會顯示出相應的信號帶。自下而上依次將堿基序列讀出。

第二節DNA的二級結構 一、二級結構的特點

DNA不僅具有嚴格的化學組成，還具有特殊的高級結構，它主要以有規則的雙螺旋形式存在，其基本特點是：

1、DNA分子是由兩條互相平行的脫氧核苷酸長鏈盤繞而成的；

2、DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側，構成基本骨架，堿基排列在內側；

3、兩條鏈上的堿基通過氫鍵相結合，形成堿基對，它的組成有一定的規律。這就是嘌呤與嘧啶配對，而且腺嘌呤（A）只能與胸腺嘧啶（T）配對，鳥嘌呤（G）只能與胞嘧啶（C）配對。如一條鏈上某一堿基是C，另一條鏈上與它配對的堿基必定是G。堿基之間的這種一一對應的關系叫堿基互補配對原則。組成DNA分子的堿基雖然只有4種，它們的配對方式也只有A與T，C與G兩種，但是，由于堿基可以任何順序排列，構成了DNA分子的多樣性。例如，某DNA分子的一條多核苷酸鏈有100個不同的堿基組成，它們的可能排列方式就是4100。

二、變性、復性及雜交

變性：指雙螺旋區氫鍵斷裂，空間結構破壞，只涉及次級鍵的破壞。常用的DNA變性方法：熱變性和用變性劑處理。

如何判斷DNA是否發生變性了呢？常用的方法是測定DNA的光吸收值。在堿基的嘌呤環和嘧啶環中存在共扼雙鍵，在240－290nm波長有一強烈的吸收峰，最大吸收值在260nm。（蛋白質由于存在肽鍵，在280nm有明顯的吸收峰）當DNA變性時，有序的堿基排列被破壞，光吸收值顯著增加，該現象稱為增色效應。當緩慢增加DNA溶液的溫度時，記錄不同溫度下的A260的數值，即繪制成DNA的變性曲線。以溫度為橫坐標，以A260為縱坐標。當A260增加到最大值的一半時，這時的溫度稱為DNA的溶解溫度或熔點，Tm表示。

除此之外，光吸收法也是實驗室定量測定DNA和RNA濃度和純度的一種方法。從某種樣品中提取了基因組DNA，可根據A260/A280的比值判斷其純度。

復性：變性核酸的互補鏈在適當條件下重新締合成雙螺旋的過程。

雜交：在退火條件下，帶有互補核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應的互補區段會形成雙鏈結構。分子雜交是分子生物學常用的技術，可用來檢測某一特定基因的時空表達情況和在基因組中的。

分子雜交最初是由Southern設計出來的。當時是用DNA探針檢測的DNA，也就是DNA與DNA的雜交，人們就將這種方法稱為是Southern blotting。在此基礎上，人們設計出DNA探針檢測RNA，稱為Northern blotting。

基因芯片的工作原理與經典的核酸分子雜交方法（southern、northern）是一致的，都是探針和互補的靶基因結合，通過隨后的信號檢測進行定性與定量分析。基因芯片（DNA microarray）指將N個目的DNA用自動化設備點在固體支持物上，DNA經固化后，用不同顏色的熒光標記的探針對這些DNA同時進行雜交，根據雜交結果呈現的不同顏色，經計算機分析后得到關于N個基因表達情況的數據。

第三節DNA的高級結構

一、超螺旋結構及拓撲異構體

雙螺旋DNA進一步扭曲盤繞則形成其三級結構，超螺旋是DNA三級結構的主要形式。自從1965年Vinograd等人發現多瘤病毒的環形DNA的超螺旋以來，現已知道絕大多數原核生物都是共價封閉環(covalently closed circle,CCC)分子，這種雙螺旋環狀分子再度螺旋化成為超螺旋結構(superhelix或supercoil)。有些單鏈環形染色體(如φ×174)或雙鏈線形染色體(如噬菌體入)，在其生活周期的某一階段，也必將其染色體變為超螺旋形式。對于真核生物來說，雖然其染色體多為線形分子但其DNA均與蛋白質相結合，兩個結合點之間的DNA形成一個突環(loop)結構，類似于CCC分子，同樣具有超螺旋形式。超螺旋按其方向分為正超螺旋和負超螺旋兩種。真核生物中，DNA與組蛋白八聚體形成核小體結構時，存在著負超螺旋。研究發現，所有的DNA超螺旋都是由DNA拓撲異構酶產生的。

二、拓撲異構變化的生物學意義

DNA拓撲異構的變化是DNA的復制和轉錄過程所必須的。

一個閉合的DNA 分子可以用其連環數進行描述，連環數(Linking number)

是指一條鏈空間跨越另一條鏈的次數。順序相同的閉合DNA 分子可能有不同的連環數，這反映了超螺旋程度的差異。連環數不同的相同DNA 分子稱為拓撲異構體(Topological isomers)。

連環數由兩個成分組成：纏繞數(Writhing number ,W)和扭轉數(Twisting number, T)。扭轉數T 是雙鏈螺旋結構自身的一種性質，代表一條鏈繞另一條鏈旋轉的雙螺旋總圈數。它由每一圈配對的堿基數決定。對于平放在平面上的一個松弛的閉合環狀DNA 來說，用堿基對的總數除以每一圈的堿基對數就是它的扭轉數。

纏繞數W 代表雙螺旋軸在空間上的彎曲，在直觀上與超螺旋的概念相對應，但并非具有完全相同的數量上的定義或衡量。對于一個松弛分子，W=0 時連環數等于扭轉數。我們經常用下面的公式計算連環數的變化量：

ΔL=ΔW+ΔT

第三章 染色體和基因

教學目的：使學生掌握基因組的概念、原核生物基因組的特點和真核生物染色體及基因組特點。

教學重點、難點：真核生物染色體的基本特征；衛星DNA及在分子標記中的應用；斷裂基因；基因家族及串連重復基因簇。

課時安排：4學時 教學內容：

第一節基因組大小與C值矛盾

一、基因組概念

一個物種單倍體的染色體的數目，稱為基因組。基因組中DNA 的總量是物種所特有的，稱為C 值(C-value)。C 值的范圍變化很大，從微生物中的<106 到一些植物和兩棲類的>1011。圖3.1 總結了進化中不同門類生物的C 值范圍。隨著復雜度增加，每組中最小基因組大小也會隨著增加。

三、C值矛盾現象

單倍體基因組DNA 含量在低等真核生物中與形態復雜性有一定的正相關，但在高等真核生物中卻非如此，它們的單倍體基因組DNA 含量變化不定。基因組大小與遺傳復雜性并非線性相關，稱為C 值矛盾(Paradox)。它涉及到真核基因組絕對和相對的DNA 數量。例如，蟾蜍Xenopus 和人類基因組大小差不多，但是人類遺傳發育上更為復雜。在表面復雜程度相似的種屬間(見圖)也存在C 值矛盾，這個問題局限于一些種族內，昆蟲、兩棲和植物最為明顯。在兩棲中，最小的基因組<109bp，但是最大的基因組大約1011bp。這些兩棲類間的差別似乎并不需要基因間這么大的差別，表明在大的基因組中有非編碼DNA 的大量增加。目前我們并不清楚為什么自然選擇允許這些DNA 的聚集(在其他種族中這種情況并不發生，基因組的分布是窄的。鳥類、爬蟲類和哺乳類只允許小的偏差，其差異在基因組大小兩倍范圍之內)。

第二節原核生物染色體及基因

原核生物的DNA與稀疏的蛋白質結合，存在于類核體上，沒有核膜包被。原核生物DNA分子小，基因排列緊密，空間利用率高。

1．功能上相關的幾個結構基因前后相連，再加上一個共同的調節基因和一組共同的控制位點（啟動子promoter、操縱子operator），在基因轉錄時協同動作，組成操縱元（operon）。介紹乳糖操縱元的結構、調控機制。2．絕大部分為編碼基因，并通常以單拷貝形式存在。3．重疊基因

第三節真核生物的染色體

一、染色體的基本組成單位－核小體

真核生物的染色體(chromasome)在細胞生活周期的大部分時間里都是以染色質(chromatin)的形式存在的。

核小體是構成染色質的基本結構單位，使得染色質中DNA、RNA和蛋白質組織成為一種致密的結構形式。核小體由核心顆粒(core particle)和連接區DNA(linker DNA)二部分組成，在電鏡下可見其成捻珠狀，前者包括組蛋白H2A，H2B，H3和H4各兩分子構成的致密八聚體(又稱核心組蛋白)，以及纏繞其上一又四分之三圈長度為146bp的DNA鏈；后者包括兩相鄰核心顆粒間約60bp的連接DNA和位于連接區DNA上的組蛋白H1(見圖），連接區使染色質纖維獲得彈性。核小體是DNA緊縮的第一階段，在此基礎上，DNA鏈進一步折疊成每圈六個核小體，直徑30nm的纖維狀結構，這種30nm纖維再扭曲成襻，許多襻環繞染色體骨架(Scaffold)形成棒狀的染色體，最終壓縮將近一萬倍。這樣，才使每個染色體中幾厘米長(如人染色體的DNA分子平均長度為4cm)的DNA分子容納在直徑數微米(如人細胞核的直徑為6－7μm)的細胞核中。

二、染色體的基本特征－端粒、著絲粒 1．著絲粒

在有絲分裂中，姊妹染色單位向細胞相反的兩極移動。它們的運動依賴于染色體與微管(Microtubule)的接觸，在另一端與極相連接(微管組成細胞的纖絲體系，在有絲分裂期間它們把染色體與細胞的極相連)。在微管端部的兩個區域連接著微管組織中心(Microtubule organizing centers，MTOCs)，它位于染色體中心粒附近和兩個極上。染色體上負責其在有絲分裂和減數分裂時分離的區域稱為著絲粒

著絲粒的DNA順序稱為CEN順序。CEN 區域中存在三種類型的序列元件(圖)： CDE-Ⅰ是所有中心粒左側邊界變化很少的9bp 保守序列。CDE-Ⅱ是所有中心粒中都存在的A?T 比例大于90% 的80-90bp 長序列，其功能依賴于其長度而非準確序列，其成份是一些真核生物中短的隨機重復(衛星)DNA 序列的遺跡，其堿基成分可能產生一些DNA 雙螺旋結構上的特征性的彎曲。CDE-Ⅲ是所有中心粒右側邊界的11bp 長的高度保守序列，此類元件的兩側序列保守性較低，對于中心粒功能可能是必需的(CDE-Ⅲ在側翼序列必需的情況下可能長于11bp)。2．端粒

通過斷裂產生的染色體末端，會與其它染色體發生作用，然而天然染色體是穩定的，因此，染色體末端一定具有某種特殊結構，可以穩定染色體，該結構稱為端粒。

我們可以用兩個性質來定義端粒序列：必需存在于染色體的端部(或至少在線性DNA 分子的末端)；它必需賦予線性分子穩定性。

許多低等真核生物基因組中的線性DNA 分子，其端粒結構都是已知的。同樣類型的序列也在植物和人類中發現，所以端粒的構建似乎遵循著普遍的規律。每個端粒由一系列短的隨機重復序列組成。所有端粒序列能寫成Cn(A/T)m 的一般形式，其中n>1 而m 為1-4 ；3?端具有單鏈尾，且富含GT。

端粒一方面可保護線性DNA免受核酸酶攻擊，另一方面，利用用從頭合成的方式加入重復，能抵消在染色體端部無法復制所導致的重復丟失。

討論端粒與壽命的關系。

第四節真核生物的基因

一、真核生物基因組中包含非重復序列和重復序列

1．重復序列 在單倍體基因組里，這些序列一般只有一個或幾個拷貝，它占DNA總量的40%－80%。多為結構基因。

2．中度重復序列 這類重復序列的重復次數在10－104之間，占總DNA的10%－40%。各種rRNA、tRNA 及組蛋白基因等都屬這一類。該類基因一般不編碼。3．高度重復序列——衛星DNA 這類DNA只在真核生物中發現，占基因組的10%—60%，由6—100個堿基組成，在DNA鏈上串聯重復幾百萬次。由于堿基 的組成不同，在CsCl密度梯度離心中易與其他DNA分開，形成含量較大的主峰及高度重復序列小峰，后者又稱衛星區帶（峰）。該類基因一般不轉錄。

小衛星和微衛星序列是由比衛星序列的重復序列單位更短的單位構成，其重復單位的長度分別為10~100bp和10bp，而重復序列單位的數目通常為5~50個，不同個體間重復序列單位數目變化很大。

在人類中小衛星位點是1－5kb的順序，此順序由長15-100nt的重復單位組成。當將人類的總DNA提出后，用限制性內切酶切成不同長度的片斷（各種小衛星上都沒有酶切位點），然后以小衛星DNA中的特異順序為探針進行Southern雜交，可發現陽性片斷的長度各不相同。由于不同個體的這種串聯重復的數目和位置都不相同，所以小衛星DNA的Southern雜交帶譜就具有高度的個體特異性，人們就稱其為DNA指紋分析技術（DNA fingerprints）。

二、斷裂基因

大多數真核生物的基因（包括編碼蛋白質、rRNA、tRNA的基因）由間隔的外顯子（表現在最終RNA產物中的序列）和內含子（從初始轉錄物中去除的序列）組成。

“一條基因，一種蛋白質”應修正為“一種蛋白質，一條基因”。因為一些DNA序列編碼一種以上蛋白質。

三、基因家族與基因簇

真核生物的基因組中有許多來源相同、結構相似、功能相關的基因，這樣一組基因稱為基因家族（gene family）。

同一基因家族的不同成員緊密排列在一起，稱為基因簇（gene cluster）。但更多情況下是散布在不同染色體上。如：珠蛋白基因α、β、γ、δ。同一家族成員是由同一個祖先基因經過復制和變異傳遞下來的。

四、串連重復基因簇

串連重復基因出現在其產物被極度需要的情況下，如組蛋白基因、rRNA基因和tRNA基因。如：組蛋白基因，編碼H1/H2A/H2B/H3/H4五種組蛋白的基因彼此靠近構成一個重復單位，這樣的重復單位串連在一起。rRNA基因，真核生物中的5.8S/18S/28S rRNA（主體rRNA）基因組成重復單位，轉錄出一個45S

rRNA前體，然后通過轉錄后處理。此外，還有，tRNA基因也是串連重復排列，但各重復單位中的各tRNA可以不同。

五、假基因

基因組中因突變而失活的基因，它和同一家族的活躍基因在結構和DNA序列上有相似性。

第三章DNA復制

教學目的：使學生掌握DNA復制的機理及一般過程、復制的各階段的主要生物學事件、復制的方式、復制的調控、DNA修復系統。

教學重點、難點：復制的機理；復制的起始；端粒的復制。課時安排：6學時 教學內容：

第一節DNA復制的機理及一般過程

一、半保留復制

半保留復制：Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結構模型時即推測，DNA在復制時首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂兩條鏈分開，然后以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，這樣新合成的子代DNA分子中一條鏈來自親代DNA，另一條鏈是新合成的，這種復制方式為半保留復制。

1957年，梅塞爾和斯塔爾利用大腸桿菌（E．Coli）研究遺傳物質DNA。在這項經典實驗中，他們先將大腸桿菌放入只含有既氮15（氮14的同位素）的營養基中培養，然后將這些大腸桿菌轉移到只含氮14的營養基中。提取不同培養代數細菌的DNA，用CsCl密度梯度離心。實驗結果表明：在全部由15N標記的培養基中得到的15N-DNA顯示為一條重密度帶位于離心管的管底。當轉入14N標記的培養基中繁殖后第一代，得到了一條中密度帶，這是15N-DNA和14N-DNA的雜交分子。第二代有中密度帶及低密度帶兩個區帶，這表明它們分別為15N14N－DNA和14N14N-DNA。隨著以后在14N培養基中培養代數的增加，低密度帶增強，而中密度帶逐漸減弱，離心結束后，從管底到管口，CsCl溶液密度分布從高到低形成密度梯度，不同重量的DNA分子就停留在與其相當的CsCl密度處，在紫外光下可以看到DNA分子形成的區帶。為了證實第一代雜交分子確實是一半15N-DNA－半14N－DNA，將這種雜交分子經加熱變性，對于變性前后的DNA分別進行CsCl密度梯度離心，結果變性前的雜交分子為一條中密度帶，變性后則分為兩條區帶，即重密度帶(15N－DNA)及低密度帶(14N－DNA)。它們的實驗只有用半保留復制的理論才能得到圓滿的解釋。

二、半不連續復制

DNA雙螺旋的兩條鏈是反向平行的，因此，在復制起點處兩條DNA鏈解開

成單鏈時，一條是5'→3'方向，另一條是3'→5'方向。當以這兩條鏈為模板時，新生鏈延伸方向一條為3'→5'，另一條為5'→3'。但生物細胞內所有催化DNA聚合酶都只能催化5'→3'延伸，這是一個矛盾。岡崎片段(Okaxaki fragments)的發現使這個矛盾得以解決。在復制起點兩條鏈解開形成復制泡(replication bubbles)，DNA向兩側復制形成兩個復制叉(replication forks)。以復制叉移動的方向為基準，一條模板鏈是3'→5'，以此為模板而進行的新生DNA鏈的合成沿5'→3'方向連續進行，這條鏈稱為前導鏈(leading strand)。另一條模板鏈的方向為5'→'3'，以此為模板的DNA合成也是沿5'→3'方向進行，但與復制叉前進的方向相反，而且是分段，不連續合成的，這條鏈稱為滯后鏈(lagging strand)，合成的片段即為岡崎片段。這些岡崎片段以后由DNA連接酶連成完整的DNA鏈。這種前導鏈的連續復制和滯后鏈的不連續復制在生物是普遍存在的，稱為DNA合成的半不連續復制。

第二節復制的過程

復制的過程總的說來包括起始、延伸和終止三個階段。

一、復制的起始

1．復制的起始原點

很多實驗都證明：復制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復制起始點(originof replication)常用ori或O表示。細胞中的DNA復制一經開始就會連續復制下去，直至完成細胞中全部基因組DNA的復制。DNA復制從起始點開始直到終點為止，每個這樣的DNA單位稱為復制子或復制單元(replicon)。在原核細胞中，每個DNA分子只有一個復制起始點，因而只有一個復制子，而在真核生物中，DNA的復制是從許多起始點同時開始的，所以每個DNA分子上有許多個復制子。

DNA復制起始點有結構上的特殊性，例如：大腸桿菌染色體DNA復制起始點Oric由422個核苷酸組成，是一系列對稱排列的反向重復序列，即回文結構(palindrome)，其中有9個核苷酸或13個核苷酸組成的保守序列，這些部位是大腸桿菌中DnaA蛋白識別的位置，大腸桿菌染色體DNA是環狀雙鏈DNA，它的復制是典型的“ζ”型復制(由于形狀像希臘字母ζ，見下圖)。從一個起點開始，同時向兩個方向進行復制，當兩個復制方向相遇時，復制就停止。而有些生物的DNA復制起始區是一段富含A·T的區段。這些特殊的結構對于在DNA復制起

始過程中參與的酶和許多蛋白質分子的識別和結合都是必須的。

2．復制的方向

3．DNA復制起始引發體的形成及所參與的酶和蛋白質

解鏈酶：DNA開始復制時首先在起始點處解開雙鏈，反應是在一種解鏈酶(helicase)的催化下進行的。解鏈酶需要ATP分解供給能量。大腸桿菌中DnaB蛋白就有介鏈酶活性，與隨從鏈的模板DNA結合，沿5'→3'方向移動，還有一種叫做Rep蛋白和前導鏈的模板DNA結合沿3'→5'方向移動。解鏈酶的作用就是打開DNA雙鏈之間的氫鍵。

單鏈結合蛋白質：它與解開的單鏈DNA結合，使其穩定不會再度螺旋化并且避免核酸內切酶對單鏈DNA的水解，保證了單鏈DNA做為模板時的伸展狀態，SSBP可以重復利用。

DNA復制起始的關健步驟是前導鏈DNA的合成，一旦前導鏈DNA的聚合作用開始，隨從鏈DNA的合成也隨著開始。由于前導鏈的合成是連續進行的，所以它的起始相對簡單，而隨從鏈的合成是不連續進行的，所以引發階段比較復雜。大腸桿菌的引發前體由DnaB.DnaC和單鏈結合蛋白組成。

引物酶

是一種特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。這種短RNA片段一般十幾個至數十個核苷酸不等，它們在DNA復制起始處做為引物。RNA引物的3'-OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一個磷酸二酯鍵的位置。高度解鏈的模板DNA與多種蛋白質因子形成的引發前體促進引物酶結合上來，共同形成引發體，引發體主要在DNA隨從鏈上開始，它連續地與引物酶結合并解離，從而在不同部位引導引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3'-OH末端接下去合成DNA片段，這就是隨從鏈不連續合成的開始。

二、DNA的延伸

由DNA聚合酶催化完成。1957年，Arthur kornberg首次在大腸桿菌中發現DNA聚合酶Ⅰ，(DNA polymerase Ⅰ,簡寫DNA polⅠ)后來又相繼發現了DNA聚合酶Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，其中主要的復制酶是DNA聚合酶Ⅲ。當聚合酶的一個亞基連續合成先導鏈時，另一個亞基在模板鏈所形成的大單鏈環中，循環式起始、終止后隨鏈上岡崎片段的合成。真核生物的NA聚合酶可分為復制所需的

酶如：α、δ、ε、γ和損傷修復所需的酶β、δ、ε、η、θ，其中，DNA聚合酶α起始DNA鏈的合成，DNA聚合酶δ延伸先導鏈，另一個DNA聚合酶δ或ε延伸后隨鏈。DNA聚合酶γ負責線粒體DNA的復制。

真核生物線性DNA末端的端粒是怎樣合成的呢？四膜蟲抽提物中有一種酶，稱端粒酶(Telomerase)，它使用端粒鏈的G+T 的3?-OH 作為引物合成隨機的TTGGGG 重復。此反應只需要dGTP 與dTTP。端粒酶是一個大的核糖核蛋白，它含有一個短RNA 組分，四膜蟲中長159nt 而在Euplotes 中長192nt。每個RNA 都含有一個15-22nt 的序列和一個富含C 的重復序列的重復相同。這種RNA 為合成富含G 的重復序列提供模板。

三、復制的終止

當子鏈延伸達到terminus region（ter，帶有多個20bp序列）時，DNA復制就終止了。Ter有點像一個陷井（trap），使復制叉只能進入，不能出來。Ter的功能主要是由Ter-Tus復合物（ter utilization substance）來完成的。

第三節 復制的方式

一、線狀DNA的復制方式 1．中間起始：如前所述.2．末端起始：腺病毒的形態是特征性的二十面體病毒殼體，腺病毒基因組是一個線性的雙鏈DNA，其5’端與一種末端蛋白（TP）共價結合（Rekosh et al., 1977），5’端上還具有末端反向重復序列（ITRs）。

在腺病毒的每個5?末端都共價連接一個55Kda的蛋白質，該蛋白質稱為末端蛋白質（terminal protein TP），以其絲氨酸羥基通過磷酸二酯鍵與5?端的胞嘧啶共價連接。TPC核苷酸的自由末端3-OH通過DNA聚合酶引導延伸反應。這就產生了一條新鏈，其5‘末端與起始核苷酸C共價相連。

二、環狀DNA的復制方式

1．?復制：具有雙鏈環狀DNA分子的細菌和病毒所采用的復制方式。DNA在復制原點解開成單鏈狀態，分別作為模板，合成其互補鏈，則出現兩個叉子狀的生長點，叫做復制叉，因此也稱為復制叉式復制。可雙向or單向，若是雙向，可等速or不等速。

2．滾環復制：隨后缺口產生的自由3’-OH末端被聚合酶延伸。新合成的鏈取代

原母鏈。

這種結構被稱為滾環，因為延伸點圍繞環形模板鏈滾動，形成一個多聚單鏈的尾巴。當這條鏈甩到一定程度時開始以半不連續的方式合成其互補鏈。

滾環復制在噬菌體中普遍存在。例如：噬菌體φX174含有單鏈環形DNA，稱為正（+）鏈。在復制前首要合成其互補鏈即負（-）鏈，產生了雙鏈環形DNA分子，以滾環方式復制。

噬菌體的基因組編碼的A蛋白結合在復制原點，在正鏈上產生切斷磷酸二酯鍵。切割后A蛋白仍然與5’末端相連，而3’末端則在DNA聚合酶的作用下延伸。SSB蛋白不斷地結合到甩出的單鏈上，并改變其構型，趨向環化。當被置換鏈達到一個單位長度時，A蛋白可識別復制原點，將鏈切斷，進一步將切下的單位的長度的DNA環化。A蛋白釋放，開始另一循環。環化后被取代的正（＋）鏈可以作為模板合成互補負（—）鏈或被包裹到病毒體中。

另外，滾環復制為基因擴增提供了一種方式。見《分子遺傳學》P109-110。3．D環復制：

真核生物線粒體DNA的復制方式。線粒體的H和L鏈上各有一個復制原點，在復制開始時，H鏈起始位點的復制像通常一樣通過轉錄激活過程。RNA聚合酶轉錄出的RNA可作為引物，再由DNA聚合酶在引物的3’末端進行DNA聚合反應。隨著鏈的延伸，新合成的L鏈取代了親本L鏈，而產生一個替換環，稱為D環。D環不斷伸展，當伸展到環三分之二處時，被取代的L鏈上的復制起始點暴露出來，隨后由特異的引發酶在該位點合成一段RNA引物，開始H鏈的復制。由于啟動的延遲，當新L鏈合成結束時，新H鏈合成僅繞環三分之一圈。這樣就釋放出一個完整的雙鏈環和一個開環結構。

第四節 復制的調控

一、原核生物復制的調控

原核生物復制的起始主要是由起始位點的甲基化狀態來控制的。起始位點的A可被Dam甲基化酶所甲基化。在復制之前，起始位點的兩條鏈都被甲基化，而復制后產生的DNA是半甲基化的。半甲基化的子鏈起始點只有在它們重新全部甲基化后才有起始功能。

二、真核生物復制的調控

在真核生物中，DNA的復制同樣受到細胞周期的嚴格控制。在每一個起始點都需要執照因子來起始復制。執照因子是一種特殊的蛋白質，不能隨意的穿越核膜。它在復制之前就已存在于細胞核中，一輪復制就會將這個因子失活或破壞。而細胞質中的執照因子也不能進入，因此DNA的復制不會被重復起始。只有在細胞發生有絲分裂期間，核膜發生破裂，執照因子才趁機進入核內，DNA的復制才可被起始。這樣，就保證了復制的起始必須在經歷整個細胞分裂過程之后才能重新發生。

第五節DNA的修復系統一、復制修復

1、錯配修復系統：錯配矯正酶、Pol Ⅰ、DNA連接酶

2、尿嘧啶糖基酶系統：尿嘧啶－N－糖基酶、AP內切酶、Pol Ⅰ、DNA連接酶

二、損傷修復

1、光復活：在可見光的活化之下由光復活酶催化胸腺嘧啶二聚體分解成單體的過程。

2、切除修復：修復內切酶能識別引起DNA雙螺旋變性的損傷，由UvrA、UvrB和UvrC三種亞基構成

3、重組修復：RecA具有催化DNA分子之間同源聯會和交換單鏈的功能。

4、SOS修復：允許新生的DNA鏈越過TT二聚體而生長，其代價時保真度極大降低。SOS修復是導致突變的修復,它的介入時紫外線誘導突變的主要原因。

第五章 轉錄

教學目的：使學生掌握RNA合成的酶學特征、啟動子的結構、轉錄的過程、轉錄后加工過程及逆轉錄。

教學重點、難點：啟動子結構；RNA的剪接；核酶。課時安排：6學時 教學內容：

第一節RNA合成的酶學

執行生命功能、表現生命特征的主要物質是蛋白質分子。DNA貯存著決定生物特征的遺傳信息，只有通過蛋白質才能表達出它的生命意義，直接決定蛋白質合成及蛋白質特征的不是RNA而是DNA，因而人們確定DNA是遺傳信息貯存者后就推測DNA是通過RNA去決定蛋白質合成的。50年代末RNA聚合酶的發現開始證實了這一推測。

以DNA為模板合成RNA的過程稱為轉錄（transcription），由RNA聚合酶催化完成。

一、RNA合成的基本特征

RNA的轉錄合成從化學角度來講類似于DNA的復制，多核苷酸鏈的合成都是以5'→3'的方向，在3'-OH末端與加入的核苷酸磷酸二酯鍵，但是，由于復制和轉錄的目的不同，轉錄又具有其特點：（1）對于一個基因組來說，轉錄只發生在一部分基因，而且每個基因的轉錄都受到相對獨立的控制；（2）轉錄是不對稱的；（3）轉錄時不需要引物，而且RNA鏈的合成是連續的；（4）都以四種三磷酸核苷的底物；（4）RNA聚合酶缺乏3'→5'外切酶活性，所以沒有校正功能。

二、原核生物的RNA聚合酶

大腸桿菌RNA聚合酶的研究得比較透徹的，這是一個分子量達50多萬，全酶由五咱亞基組成，去掉δ亞基的部分稱為核心酶，核心酶本身就能催化苷酸間磷酸二酸鍵形成。利福平和利福霉素能結合在β亞基上而對此酶發生強烈的抑制作用。β亞基似乎是酶和核苷酸底物結合的部位。細胞內轉錄是在DNA特定的起始點上開始的，δ亞基的功能是辨認轉錄起始點的。β'亞基是酶與DNA模板結合的主要成分。α亞基可能與轉錄基因的類型和種類有關。

二、真核生物的RNA聚合酶

真核生物中已發現有四種RNA聚合酶，分別稱為RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和線粒體RNA聚合酶，分子量大致都在50萬道爾頓左右，它們專一性地轉錄不同的基因，因此由它們催化的轉錄產物也各不相同。RNA聚Ⅰ合成RNA的活性最顯著，它位于核仁中，負責轉錄編碼rRNA的基因。而細胞內絕大部分RNA是rRNA是RNA。RNA聚合酶Ⅱ，位于核質中，負責核內不勻一RNA的合成，而hnRNA是mRNA的前體。RNA聚合酶Ⅲ負責合成tRNA和許多小的核內RNAs。鵝膏蕈堿是真核生物RNA聚合酶特異性抑制劑，三種真核生物RNA聚合酶對鵝膏蕈堿的反應不同。原核生物靠RNA聚合酶就可完成從起始、延長、終止的轉錄全過程，真核生物轉錄除RNA聚合酶外還需另一此叫做轉錄因子的蛋白質分子參與轉錄的全過程，第二節控制轉錄起始的DNA序列－啟動子的結構

一、原核生物啟動子的結構

Pribnow框：在起始點上游，幾乎在所有啟動子都存在一個6 bp富含A/T區域TATAAT。通常位于－18位到－9位，稱為Pribnow框。該區域是RNA聚合酶牢固結合位點，RNA聚合酶結合后，這一富含A/T的DNA雙鏈解開。

Sextama框：位于－35區附近有一TTGACA序列，是RNA聚合酶中的ζ因子識別位點。以上這兩個位點對于轉錄起始都是非常重要的。ζ因子識別－35區并與之結合。由于RNA聚合酶分子覆蓋面積能達到70bp，因此酶分子上的一個合適部位能接觸－10區。酶分子一旦與－10區結合以后，就從識別位點上解離下來。此外，－35序列的重要性還在于在很大程度上決定了啟動子的強度。

在－35區和－10區之間的堿基序列不特別重要，但是這兩個序列之間的距離卻十分重要，是決定啟動子強度的因素之一大多為15 bp～20 bp。

二、真核生物啟動子的結構

有三種類型的啟動子，其中Ⅱ類啟動子最為復雜。

Ⅱ類啟動子由核心元件（core element）和上游啟動子元件（upstream promoter element，UPE）組成。核心元件包括TATA框和轉錄起始位點。mRNA的第一個堿基傾向A，另一側翼由Py組成。TATA框合又稱Hogness框，Goldberg-Hogness框，其一致序列是：T85A97T93A85A63A83A50，常在起始位點的上游-25左右，相當于原核的-10序列。

上游元件包括CAAT box、GC box、等。如CAAT box一般位于上游-75bp左右，緊靠-80，其功能是控制轉錄起始活性。遠端調控區較常見的是增強子。

啟動子Ⅲ位于起始位點的下游的轉錄區內，因此稱為下游啟動子（downstream promoter）或基因內啟動子（intragenenic promoter）。轉錄需要轉錄因子TFⅢA、B和C的參與。

三、鑒定啟動子的方法

1、足跡法：是一種測定ＤＮＡ結合蛋白在ＤＮＡ上的結合位點的實驗方法，其根據是ＤＮＡ的這些區域在結合有蛋白質時可被保護而免受核酸內切酶的作用．酶切后產生片段與對照的酶切片段經凝膠電泳分離后進行比較，即找出ＤＮＡ與蛋白質結合的位點。

2、缺失分析和點突變：對以上所獲得的DNA與蛋白質結合的位點進一步做缺失分析和點突變。

第三節轉錄的過程

一、轉錄起始

轉錄是從DNA分子的特定部位開始的，這個部位也是RNA聚合酶全酶結合的部信這就是啟動子。為什么RNA聚合酶能夠僅在啟動子處結合呢？顯然啟動子處的核苷酸序列具有特殊性，為了方便，人們將在DNA上開始轉錄的第一個堿基定為+1，沿轉錄方向順流而下的核苷酸序列均用正值表示；逆流而上的核苷酸序列均用負值表示。

在原核生物中，當RNA聚合酶的δ亞基發現其識別位點時，全酶就與啟動子的-35區序列結合形成一個封閉的啟動子復合物。由于全酶分子較大，其另一端可在到-10區的序列，在某種作用下，整個酶分子向-10序列轉移并與之牢固結合，在此處發生局部DNA12-17r 的解鏈形成全酶和啟動子的開放性復合物。在開放性啟動子復合物中起始位點和延長位點被相應的核苷酸前體充滿，在RNA聚合酶β亞基催化下形成RNA的第一個磷酸二酸鍵。RNA合成的第一個核苷酸總有GTP或ATP，以GTP常見，此時δ因子從全酶解離下來，靠核心酶在DNA鏈上向下游滑動，而脫落的δ因子與另一個核心酶結合成全酶反復利用。

真核生物轉錄起始十分復雜，往往需要多種蛋白因子的協助，已經知道，在

所有的細胞中有一類叫做轉錄因子的蛋白質分子，它們與RNA聚合酶Ⅱ形成轉錄起始復合物，共同參與轉錄起始的過程。真核生物基因中，有專門為蛋白質編碼的基因，這些基因由RNA聚合酶Ⅱ負責進行轉錄起始關鍵性作用。根據這些轉錄因子的作用特點可大致分為二類；第一類為普遍轉錄因子它們與RNA聚合酶Ⅱ共同組成轉錄起始復合物，轉錄才能在正確的位置上開始。普遍轉錄因子是由多種蛋白質分子組成的，其中包括特異結合在TATA盒上的蛋白質，叫做TATA盒結合蛋白，還有至成一組復合物叫做轉錄因子ⅡD。TFⅡD再與RNA聚合酶Ⅱ結合完成轉錄起始復合物的形成。除TFⅡD以外，在細胞核提取物中還發現TFⅡA，TFⅡF，TFⅡE，TFⅡH等，它們在轉錄起始復合物組裝的不同階段起作用。從中也不難看出真核細胞中基因轉錄的起始是基因的表達調控的關鍵，這么多蛋白質分子之間相互作用，以及這些蛋白質分子DNA調控無件相結合，構成控制基因轉錄開始的復雜體系。第二類轉錄因子為組織細胞特異性轉錄因子或者叫可誘導性轉錄因子，這些TF是在特異的組織細胞或是受到一些類固醇激素，生長因子或其它刺激后，開始表達某些特異蛋白質分子時，才需要的一類轉錄因子。

二、轉錄延伸

RNA鏈的延長靠核心酶的催化，在起始復合物上第一個GTP的核糖3'-OH上與DNA模板能配對的第二個三磷酸核苷起反應形成磷酸二酯鍵。聚合進去的核苷酸又有核糖3'-OH游離，這樣就可按模板DNA的指引，一個接一個地延長下去。因此RNA鏈的合成方面也是5'→3'。由于DNA鏈與合成的RNA鏈具有反平行關系，所以RNA聚合酶是沿著DNA鏈3'→5'方向移動。整個轉錄過程是由同一個RNA聚合酶來完成的一個連續下斷的反應，轉錄本RNA生成后，暫時與DNA模板鏈形成DNA·RNA雜交體，長度約為12個堿基對，形成一個轉錄泡（見圖）。

轉錄速度大允是每秒鐘30-50個核苷酸，但并不是以恒定速度進行的。

三、轉錄終止

提供終止信號的序列稱為終止子（terminator）。內源性終止子的回文結構中富含GC，且回文結構的下游有連續6～8個AT堿基對；弱終止子有回文結構，但不具有強終止子的兩點特征，需要依賴于ρ因子實現終止作用。

ρ因子（終止因子）：是協助RNA聚合酶識別終止信號的輔助因子，屬于ATP依賴的解旋酶家族，具有一個RNA結合域和ATP水解域。

第四節轉錄后加工

轉錄后加工是指將各種前體RNA分子加工成各種成熟RNA的過程。

一、真核生物mRNA的5?Cap 真核生物細胞mRNA的5 ￠端加帽是在鳥苷轉移酶的催化下通過5?－ 5?鍵把一個G加到轉錄物的末端堿基形成的，隨后，進行甲基化產生Cap0，Cap1，Cap2。

5?帽子的生物學功能：在翻譯過程中起識別作用以及對mRNA起穩定作用。

二、真核生物mRNA的3?Tail 有這種特征的mRNA 稱為poly(A)+，不具有的稱為poly(A)－。mRNA 3?端的多聚A是由poly(A)聚合酶所催化添加的。注意：多聚A尾巴不是添加在轉錄終止的3?端。

三、RNA的拼接

內含子剪接和剪切（clearvage）是mRNA轉錄后加工中最為復雜的一環，也是近年來發展很快的研究領域之一。不同內含子的剪切和剪接，其機制，類型和酶都不完全相同，現分述如下。

1、Ⅰ類內含子的結構特點是：①其邊界序列為5′ U↓?? G↓3′（↓表示剪切位點）；②具有中部核心結構（Central core strucature）。③具有內部引導序列（internal guide sequence IGS）。

首先是GTP進入G結合位點，左邊外顯子的3′端通過和引導序列的互補配對進入底物位點。GTP的3′-OH作用左邊外顯子和內含子交界處的磷酸二酯鍵，本身結合到內含子的5′末端，被切下的5′外顯子仍保持在底物位點上，并未游離。第二步內含子的G414（即3′交界序列上的G）又進入了G-結合位點，切下的外顯子的3′-OH又對G-結合位點上的G與3′外顯子之間的磷酸二酯鍵發動親核進攻，切開磷酸二酯鍵，而其3′-OH和3′外顯子的P重新形成磷酸二酯鍵而連接起來，這樣就完成內含子的剪接。內含子成為線形的413nt的RNA分子。第三步，內含子5′端和引導序列相鄰的序列通過引導序列互補配對，進入底物位點。仍然留在G結合位點上的G414其3′-OH再作用底物位點

上的序列，切下19nt的內含子5′端，并和余下內含子的5′-P形成二酯鍵，形成414nt的環狀內含子。

2、Ⅱ型內含子在植物和低等真核生物的細胞器基因組中發現。Ⅱ類內含子的剪接和I類內含子不同。

結構特點是列為5′↓GUGCG??YnAG↓，符合GT-AG法則，在內含子的近3′端具有分支點順序（branch-point seguence），內部具有二級結構。

II型內含子的剪切無需鳥苷的輔助，但需鎂離子的存在。首先是分枝點A的2′-OH對5′端外顯子和內含子交界處的磷酸二酯鍵發動親核進攻（圖13-28）切下外顯子1，內含子5′的邊界序列上的G與5′磷酸和分枝點A的2′-OH形成磷酸二酯鍵，從而產生了套索（lariat）結構；第二步是切下的外顯子1，其3′-OH繼續對內含子3′端的交界序列進行親核進攻，切下的外顯子2′的5′磷酸和外顯子1的3′-OH形成磷酸二酯鍵，連接在一起，同時釋放出套索狀的內含子。

通過對以上兩種內含子的研究，提出“核酶”概念。

核酶(Ribozyme)有的譯成為核糖擬酶，核酶等，目前尚無統一的譯法，暫以核酶稱之，既簡單明確，也能反映其酶的本質。核酶是T.Cech等（1981年）在研究四膜蟲rRNA時發現的，1982年T.Cech將核糖核酸（ribonucleic acid）和酶（enzyme）這兩個詞“重組”成一個新的詞：“Ribozyme”,它是指本質為RNA或以RNA為主含有蛋白質輔基的一類物質，這類物質具有催化功能，但和酶又有區別，主要表明在兩個方面：①一般的酶是純的蛋白質，而核酶是RNA或帶有蛋白的RNA；②核酶既是催化劑又是底物，隨著反應的進行，本身也消失了。而酶卻不同，僅催化反應，反應前后其本身的質和量都不發生改變。

3、核mRNA的剪接

結構和Ⅱ類內含子十分相似，符合GU-AG法則，具有分支位點。但根本的不同點是核mRNA前體的剪接本身不能形成二級結構，必需依賴于snRNP（U1，U2，U4，U5，U6）的幫助才能形成剪接體，進行自我剪接。它們自己本身不能象I類及Ⅱ類內含子那樣依賴核心結構，形成莖環，將5′和3′剪切點拉在一起。和snRNA的結合是相當復雜的，但剪接反應的第一步5′位點的剪接是由U6催化的，3′位點是由5′外顯子1的3′-OH對內含子3′端切點進行轉酯

反應來完成。

4．相關概念

可變剪接；反式剪接；RNA編輯

第五節逆轉錄

逆轉錄：RNA指導的DNA合成，在逆轉錄酶的作用下完成，如AMV, MLV。主要存在于RNA病毒中。

第六章 翻譯

教學目的：使學生掌握tRNA的結構、遺傳密碼的特征、核糖體的結構及肽鏈的合成過程。

教學重點、難點：肽鏈的合成過程；rRNA在肽鏈合成中的催化作用。課時安排：6學時 教學內容：

基因的遺傳信息在轉錄過程中從DNA轉移到mRNA，再由mRNA將這種遺傳信息表達為蛋白質中氨基酸順序的過程叫做翻譯。翻譯的過程也就是蛋白質分子生物合成的過程，在此過程中需要200多種生物大分子參加，其中包括核糖體、mRNA、tRNA及多種蛋白質因子。

第一節tRNA和遺傳密碼

一、tRNA的結構

tRNA在蛋白質生物合成過程中起關鍵作用。mRNA推帶的遺傳信息被翻譯成蛋白質一級結構，但是mRNA分子與氨基酸分子之間并無直接的對應關系。這就需要經過第三者“介紹”，而tRNA分子就充當這個角色。tRNA是類小分子RNA，長度為73-94個核苷酸，tRNA分子中富含稀有堿基和修飾堿基，tRNA分子3'端均為CCA序列，氨基酸分子通過共價鍵與A結合，此處的結構也叫氨基酸臂。每種氨基酸都有2-6種各自特異的tRNA，它們之間的特異性是靠氨基酰tRNA合成酶來識別的。這樣，攜帶相同氨基酸而反密碼子不同的一組tRNA稱為同功tRNA，它們在細胞內合成量上有多和少的差別，分別稱為主要tRNA和次要tRNA。主要tRNA中反密碼子識別tRNA中的高頻密碼子，而次要tRNA中反密碼子識別mRNA中的低頻密碼子。每種氨基酸都只有一種氨基酰tRNA合成酶。因此細胞內有20種氨基酰tRNA合成酶。

tRNA分子中還有一個反密碼環，此環上的三個反密碼子的作用是與mRNA分子中的密碼子靠堿基配對原則而形成氫鍵，達到相互識別的目的。但在密碼子與反密碼子結合時具有一定擺動性，即密碼子的第3位堿基與反密碼子的第1位堿基酸對時并不嚴格。配對擺動性完全是由tRNA反密碼子的空間結構所決定的。反密碼的第1位堿基常出現次黃嘌呤I，與A、C、U之間皆可形成氫鍵而結合，這是最常見的擺動現象。這種擺動現象使得一個tRNA所攜帶的氨基酸可

排列在2-3個不同的密碼子上，因此當密碼子的第3位堿基發生一定程度的突變時，并不影響tRNA帶入正確的氨基酸。

在蛋白質生物合成過程中，特異識別mRNA上起始密碼子的tRNA被稱為起始tRNA，它們參加多肽鏈合成的起始，其它在多肽鏈延伸中運載氨基酸的tRNA，統稱為延伸tRNA。

二、遺傳密碼的特征

mRNA分子上以5'→3'方向,從AUG開始每三個連續的核苷酸組成一個密碼子,mRNA中的四種堿基可以組成64種密碼子。這些密碼不僅代表了20種氨基酸，還決定了翻譯過程的起始與終止位置。每種氨基酸至少有一種密碼子，最多的有6種密碼子。

遺傳密碼具有以下幾種特點：

1、起始密碼子與終止密碼子（Initiation codon and termination codon）密碼子AUG是起始密碼，代表合成肽鏈的第一個氨基酸的位置，它們位mRNA5′末端，同時它也是蛋氨酸的密碼子，因此原核生物和真核生物多肽鏈合成的第一個氨基酸都是蛋氨酸，當然少數細菌中也用GUG做為起始碼。在真核生物CUG偶爾也用作起始蛋氨酸的密碼。密碼子UAA，UAG，UGA是肽鏈成的終止密碼，不代表任何氨基酸，它們單獨或共同存在于mRNA3'末端。因此翻譯是沿著mRNA分子5′→3′方向進行的。

2、密碼的簡并性（Degemeracy）

一種氨基酸有幾組密碼子，或者幾組密碼子代表一種氨基酸的現象稱為密碼子的簡并性，這種簡并性主要是由于密碼子的第三個堿基發生擺動現象形成的，也就是說密碼子的專一性主要由前兩個堿基決定，即使第三個堿基發生突變也能翻譯出正確的氨基酸，這對于保證物種的穩定性有一定意義。如：GCU，GCC，GCA，GCG都代表丙氨酸。

3、密碼的通用性

大量的事實證明生命世界從低等到高等，都使用一套密碼，也就是說遺傳密碼在很長的進化時期中保持不變。因此這張密碼表是生物界通用的。然而，出乎人們預料的是，真核生物線粒體的密碼子有許多不同于通用密碼，例如人線粒體中，UGA不是終止碼，而是色氨酸的密碼子，AGA，AGG不是精氨酸的密碼子，而是終止密碼子，加上通用密碼中的UAA和UAG，線粒體中共有四組終止碼。

內部甲硫氨酸密碼子有兩個，即AUG和AUA；而起始甲硫氨酸密碼子有四組，即AUN。

第二節肽鏈的合成

一、核糖體的活性部位

任何生物的核糖體都是由大、小兩個亞基組成。1968年已在體外對大腸桿菌小亞基進行了自我裝配研究，加入16s rRNA和21種蛋白質，即可形成有天然活性的30s小亞基。通過這些研究使人們能夠進一步認識小亞基和大亞基中rRNA與蛋白質的特異功能。核糖體是高度復雜的體系，它的任何個別組分或局部組分都不能起整體的作用，因此必須研究核糖體中蛋白質和RNA的空間結構和位置，才能更完全地了解蛋白質合成的具體過程。核蛋白體作為蛋白質的合成場所具有以下結構特點和作用：

1、具有mRNA結合位點

位于30s小亞基頭部，此處有幾種蛋白質構成一個以上的結構域，負責與mRNA的結合，特別是16srRNA3'端與mRNA AUG之前的一段序列互補是這種結合必不可少的。

2、具有P位點（peptidyl tRNA site）

又叫做肽酰基-tRNA位或P位。它大部分位于小亞基，小部分位于大亞基，它是結合起始 tRNA 并向A位給出氨基酸的位置。

3、具有A位點（Aminoacyl-tRNA site）

又叫做氨基酰-tRNA 位或受位。它大部分位于大亞基而小部分位于小亞基，它是結合一個新進入的氨基酰 tRNA 的位置。

5、結合參與蛋白質合成的因子

如起始因子（Initiation Factor,IF）、延長因子(Elengation Factor,EF)和終止因子或釋放因子(Release Factor,RF)。

二、肽鏈的合成過程

1、起始階段：

起始tRNA：合成的起始密碼子是AUG，對應的氨基酸是Met。原核細胞中存在兩種攜帶Met的tRNAfMettRNAmMet，真核細胞tRNAiMettRNAmMet

起始因子：IF1、IF2、IF3

過程：IF3+30S亞基

16SrRNA結合SD序列，使P位點正好對準起始密碼子AUG。（真核生物識別帽子結構）

在IF2的協助下起始tRNA（甲硫氨酰tRNA）進入P位點。GTP結合，50S亞基結合，GTP水解，改變亞基構象，促進70S核糖體形成，同時釋放IF2和IF3。在IF1的作用下，IF2釋放，因此IF1是IF2的循環因子。這時，P位點被tRNA占據，而A位點空著。

2、延伸階段：

EF-Tu+GTP，＋氨酰基tRNA，三元復合物進入A位點（GTP是必須的）。GTP水解，EF-Tu釋放，這時肽基轉移酶將甲酰甲硫氨酰基轉移到A位，形成第一個肽鍵。當肽鍵在A位形成之后，EF-G與GTP結合，將A位形成的肽基轉移到P位，同時將原來P位的tRNA逐出核糖體。由此可見，延伸因子是交替進入核糖體的。EF-Ts使EF-Tu—GDP轉變為EF-Tu+GTP。

3、終止

終止因子：RF1/2/3 經過運輸、定位和翻譯后處理后才能稱為有功能的蛋白質。

三、rRNA在肽鏈合成中的作用 1、16SrRNA的作用：rRNA 的3?端在起始時與mRNA 直接相互作用； 16S rRNA 上的專一區域與A 位點及P 位點上tRNA 反密碼子區直接相互作用；與23S rRNA 相互作用。2、23SrRNA的作用：具有肽基轉移酶的活性

第七章 原核生物基因表達調控

教學目的：使學生掌握原核生物基因表達在轉錄水平和翻譯水平的主要方式。

教學重點、難點：操縱子；衰減子；反義RNA；RNA干擾。課時安排：4學時 教學內容：

第一節轉錄水平的調控

一、操縱元

操縱元是原核基因表達調控的一種重要的組織形式，大腸桿菌的基因多數以操縱元的形式組成基因表達調控的單元。

操縱元中被調控的編碼蛋白質的基因可稱為結構基因(structural gene, SG)。一個操縱元中含有2個以上的結構基因，多的可達十幾個。每個結構基因是一個連續的開放讀框(open reading frame)，5'端有翻譯起始碼(DNA存儲鏈上是ATG，轉錄成mRNA就是AUG)，3'端有翻譯終止碼(DNA存儲鏈上是TAA、TGA或TAG，轉錄成mRNA就是UAA、UGA或UAG)。各結構基因頭尾銜接、串連排列，組成結構基因群。至少在第一個結構基因5'側具有核糖體結合位點(ribosome binding site, RBS)，因而當這段含多個結構基因的DNA被轉錄成多順反子mRNA，就能被核糖體所識別結合、并起始翻譯。核糖體沿mRNA移動；在合成完第一個編碼的多肽后，核糖體可以不脫離mRNA而繼續翻譯合成下一個基因編碼的多肽，直至合成完這條多順反子mRNA

二、基因轉錄的翻譯調控－衰減子

色氨酸是構成蛋白質的組分，一般的環境難以給細菌提供足夠的色氨酸，細菌要生存繁殖通常需要自己經過許多步驟合成色氨酸，但是一旦環境能夠提供色氨酸時，細菌就會充分利用外界的色氨酸、減少或停止合成色氨酸，以減輕自己的負擔。細菌所以能做到這點是因為有色氨酸操縱元(trp operon)的調控。

合成色氨酸所需要酶類的基因E、D、C、B、A等頭尾相接串連排列組成結構基因群，受其上游的啟動子Ptrp和操縱子o的調控，調控基因trpR的位置遠離P-O-結構基因群，在其自身的啟動子作用下，以組成性方式低水平表達分子量為47000的調控蛋白R。R并沒有與o結合的活性，當環境能提供足夠濃度的

色氨酸時，R與色氨酸結合后構象變化而活化，就能夠與o特異性親和結合，阻遏結構基因的轉錄，因此這是屬于一種負性調控的、可阻遏的操縱元(repressible operon)，即這操縱元通常是開放轉錄的，當有效應物(色氨酸為阻遏劑)作用時，則阻遏關閉轉錄。細菌不少生物合成系統的操縱元都屬于這種類型，其調控可使細菌處在生存繁殖最經濟最節省的狀態。

實驗觀察表明：當色氨酸達到一定濃度，但還沒有高到能夠活化R使其起阻遏作用的程度時，產生色氨酸合成酶類的量已經明顯降低，而且產生的酶量與色氨酸濃度呈負相關。仔細研究發現這種調控現象與色氨酸操縱元特殊的結構有關。

在色氨酸操縱元Ptrp-O與第一個結構基因trpE之間有162bp的一段先導序列(leadingsequence, L)。實驗證明當色氨酸達一定濃度時，RNA聚合酶的轉錄會終止在這里。這段序列中含有編碼由14個氨基酸組成的短肽的開放讀框，其序列中有2個色氨酸相連，在此開放讀框前有核糖體識別結合位點(RBS)序列，提示這段短開放讀框在轉錄后是能被翻譯的。在先導序列的后半段含有3對反向重復序列(見圖)，在被轉錄生成mRNA時都能夠形成發夾式結構，但由于B的序列分別與A和C重疊，所以如果B形成發夾結構，A和C都不能再形成發夾結構；相反，當A形成發夾結構時，B就不能形成發夾結構，卻有利于C生成發夾結構。C后面緊跟一串A(轉錄成RNA就是一串U)，C實際上是一個終止子，如果轉錄mRNA時它形成發夾結構，就能使RNA聚合酶停止轉錄而從mRNA上脫離下來

在色氨酸未達到能起阻遏作用的濃度時，從Ptrp起始轉錄，RNA聚合酶沿DNA轉錄合成mRNA，同時核糖體就結合到新生成的mRNA核糖體結合位點上開始翻譯。當色氨酸濃度低時，生成的tRNAtrp色氨酸量就少，能擴散到核糖體mRNA形成的翻譯復合體中供給合成短肽的幾率低，使核糖體沿mRNA翻譯移動的速度慢，趕不上RNA聚合酶沿DNA移動轉錄的速度，這時核糖體占據短開放讀框的機會較多，使A不能生成發夾結構，于是B就形成發夾結構，阻止了C生成終止信號的結構，RNA聚合酶得以沿DNA前進，繼續去轉錄其后trpE等基因，trp操縱元就處于開放狀態。當色氨酸濃度增高時，tRNAtrp色氨酸濃度隨之升高，核糖體沿mRNA翻譯移動的速度加快，占據到B段的機會增加，B生

成發夾結構的機會減少，C形成終止結構的機會增多，RNA聚合酶終止轉錄的的幾率增加，于是轉錄減弱。如果當其他氨基酸短缺(注意：短開放讀框編碼的14肽中多數氨基酸能由環境充分供應的機會是不多的)或所有的氨基酸都不足時，核糖體翻譯移動的速度就更慢，甚至不能占據A的序列，結果有利于A和C發夾結構的形成，于是RNA聚合酶停止轉錄，等于告訴細菌：“整個氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能合成蛋白質，不如不合成以節省能量 ”。

由此可見，先導序列起到隨色氨酸濃度升高降低轉錄的作用，這段序列就稱為衰減子attenuator)。在trp操縱元中，對結構基因的轉錄阻遏蛋白的負調控起到粗調的作用，而衰減子起到細調的作用。細菌其他氨基酸合成系統的許多操縱元(如組氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸等操縱元)中也有類似的衰減子存在。

第二節 翻譯水平的調控

一、反義RNA的調控作用

反義RNA通過與特定的mRNA結合，結合位點通常是mRNA上的SD序列及N端的密碼子，從而抑制mRNA的翻譯。

二、mRNA自身的二級結構影響翻譯過程

終止子、衰減子和反義RNA 都是mRNA通過二級結構的改變在不同水平上對基因表達進行調控。除此之外，mRNA自身的二級結構還能影響核糖體的結合以及mRNA的壽命從而影響翻譯。

三、四、蛋白質合成的自體調控 嚴謹反應

細菌處于極差的生長條件下，由于缺乏足夠的氨基酸，蛋白質合成受到抑制，因而會關閉大量的代謝過程，這就是應急反應(Stringent response)或應急調控。

第八章 真核生物基因表達調控

教學目的：讓學生理解真核生物基因表達調控的復雜性，并掌握在各水平上的調控機制。

教學重點、難點：染色質結構對基因轉錄的影響；轉錄水平的調控。課時安排：4學時 教學內容：

盡管我們現在對真核基因表達調控知道還不多，但與原核生物比較它具有一些明顯的特點。

第一節真核生物基因調控的特點

一、真核基因表達調控的環節更多

如前所述，基因表達是基因經過轉錄、翻譯、產生有生物活性的蛋白質的整個過程。同原核生物一樣，轉錄依然是真核生物基因表達調控的主要環節。但真核基因轉錄發生在細胞核(線粒體基因的轉錄在線粒體內)，翻譯則多在胞漿，兩個過程是分開的，因此其調控增加了更多的環節和復雜性，轉錄后的調控占有了更多的分量。

真核細胞在分化過程中會發生基因重排(gene rearrangement)，即胚原性基因組中某些基因會再組合變化形成第二級基因。例如編碼完整抗體蛋白的基因是在淋巴細胞分化發育過程中，由原來分開的幾百個不同的可變區基因經選擇、組合、變化，與恒定區基因一起構成穩定的、為特定的完整抗體蛋白編碼的可表達的基因。這種基因重排使細胞可能利用幾百個抗體基因的片段，組合變化而產生能編碼達108種不同抗體的基因，其中就有復雜的基因表達調控機理。

此外，真核細胞中還會發生基因擴增(gene amplification)，即基因組中的特定段落在某些情況下會復制產生許多拷貝。最早發現的是蛙的成熟卵細胞在受精后的發育過程中其rRNA基因(可稱為rDNA)可擴增2000倍，以后發現其他動物的卵細胞也有同樣的情況，這很顯然適合了受精后迅速發育分裂要合成大量蛋白質，需要有大量核糖體。又如MTX(methotrexate)是葉酸的結構類似物，一些哺乳類細胞會對含有利用葉酸所必需的二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)基因的DNA區段擴增40-100倍，使DHFR的表達量顯著增加，從而提高對MTX的抗性。基因的擴增無疑能夠大幅度提高基因表達產物的量，但這種調控機理至今還不清楚。

真核基因組DNA絕大部分都在細胞核內與組蛋白等結合成染色質，染色質的結構、染色質中NA1、染色質結構影響基因轉錄

細胞分裂時染色體的大部分到間期時松開分散在核內，稱為常染色質(euchromatin)，松散的染色質中的基因可以轉錄。染色體中的某些區段到分裂期后不像其他部分解旋松開，仍保持緊湊折疊的結構，在間期核中可以看到其濃集的斑塊，稱為異染色質(heterochromatin)，其中從未見有基因轉錄表達；原本在常染色質中表達的基因如移到異染色質內也會停止表達；哺乳類雌體細胞2條X染色體，到間期一條變成異染色質者，這條X染色體上的基因就全部失活。可

2、組蛋白的作用

早期體外實驗觀察到組蛋白與DNA結合阻止DNA上基因的轉錄，去除組蛋基因又能夠轉錄。組蛋白是堿性蛋白質，帶正電荷，可與DNA鏈上帶負電荷的磷酸基相結合，從而遮蔽了DNA分子，妨礙了轉錄，可能扮演了非特異性阻遏蛋白的作用；染色質中的非組蛋白成分具有組織細胞特異性，可能消除組蛋白

發現核小體后，進一步觀察核小體結構與基因轉錄的關系，發現活躍轉錄的染色質區段，有富含賴氨酸的組蛋白(H1組蛋白)水平降低，H2A·H2B組蛋白二聚體不穩定性增加、組蛋白乙酰化(acetylation)和泛素化(ubiquitination)，以及H3組蛋白巰基化等現象，這些都是核小體不穩定或解體的因素或指征。轉錄活躍的3、轉錄活躍區域對核酸酶作用敏感度增加

染色質DNA受DNase Ⅰ作用通常會被降解成100、400??bp的片段，反映了完整的核小體規則的重復結構。但活躍進行轉錄的染色質區域受DNase Ⅰ消化常出現100－200bp的DNA片段，且長短不均一，說明其DNA受組蛋白掩蓋的結構有變化，出現了對DNase Ⅰ高敏感點(hypersensitive site)。這種高敏感點常出現在轉錄基因的5′側區(5′ flanking region)、3′末端或在基因上，多在調控蛋白結合位點的附近，分析該區域核小體的結構發生變化，可能有利于調控

蛋白

4、DNA拓撲結構變化

天然雙鏈DNA的構象大多是負性超螺旋。當基因活躍轉錄時，RNA聚合酶轉錄方向前方DNA的構象是正性超螺旋，其后面的DNA為負性超螺旋。正性超螺旋會拆散核小體，有利于RNA聚合酶向前移動轉錄；而負性超螺旋則有利于核

5、DNA堿基修飾變化

真核DNA中的胞嘧啶約有5%被甲基化為5-甲基胞嘧啶(5-methylcytidine,m5C)，而活躍轉錄的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常較低。這種甲基化最常發生在某些基因5'側區的CpG序列中，實驗表明這段序列甲基化可使其后的基因不能轉錄，甲基化可能阻礙轉錄因子與DNA特定部位的結合從而影響轉錄。如果用基因打靶的方法除去主要的DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常發育而死亡，可見DNA

由此可見，染色質中的基因轉錄前先要有一個被激活的過程，但目前對激活機制還缺乏認識。

真核RNA聚合酶對啟動子的親和力很低，基本上不依靠自身來起始轉錄，需要依賴多種激活蛋白的協同作用。真核基因調控中雖然也發現有負性調控元件，但其存在并不普遍；真核基因轉錄表達的調控蛋白也有起阻遏和激活作用或兼有兩種作用者，但總的是以激活蛋白的作用為主。即多數真核基因在沒有調控蛋白作用時是不轉錄的，需要表達時就要有激活的蛋白質來促進轉錄。換言之：真核基因表達以正性調控為主導。

第二節 真核基因轉錄水平的調控

真核細胞的三種RNA聚合酶(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)中，只有RNA聚合酶Ⅱ能轉錄生成mRNA，以下主要討論RNA聚合酶Ⅱ的轉錄調控。

一、順式作用元件(cis－acting elements)

真核基因的順式調控元件是基因周圍能與特異轉錄因子結合而影響轉錄的DNA序列。其中主要是起正性調控作用的順式作用元件，包括啟動子(promoter)、增強子(enhancer)；近年又發現起負性調控作用的元件如沉默子(silencer)

1、啟動子

與原核啟動子的含義相同，是指RNA聚合酶結合并起動轉錄的DNA序列。但真核同啟動子間不像原核那樣有明顯共同一致的序列，而且單靠RNA聚合酶難以結合DNA而起動轉錄，而是需要多種蛋白質因子的相互協調作用，不同蛋白質因子又能與不同DNA序列相互作用，不同基因轉錄起始及其調控所需的蛋白因子也不完全相同，因而不同啟動子序列也很不相同，要比原核更復雜、序列也更長。真核啟動子一般包括轉錄起始點及其上游約100－200bp序列，包含有若干具有獨立功能的DNA序列元件，每個元件約長7－30bp。

啟動子中的元件可以分為兩種：核心啟動子元件(core promoter element)和上游啟動子元件(upstream promoter element)（見第五章）。

2、增強子

增強子是一種能夠提高轉錄效率的順式調控元件，最早是在SV40病毒中發現的長約200bp的一段DNA，可使旁側的基因轉錄提高100倍，其后在多種真核生物，甚至在原核生物中都發現了增強子。增強子通常占100－200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構成，基本核心組件常為8－12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。增強子的作用有以下特點：

1）增強子提高同一條DNA鏈上基因轉錄效率，可以遠距離作用，通常可距離1－4kb、個別情況下離開所調控的基因30kb仍能發揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。

2）增強子作用與其序列的正反方向無關，將增強子方向倒置依然能起作用。

3）增強子要有啟動子才能發揮作用，沒有啟動子存在，增強子不能表現活性。但增強子對動子沒有嚴格的專一性，同一增強子可以影響不同類型啟動子的轉錄。例如當含有增強子的病毒基因組整合入宿主細胞基因組時，能夠增強整合區附近宿主某些基因的轉錄；當增強子隨某些染色體段落移位時，也能提高移到的新位置周圍基因的轉錄。使某些癌基因轉錄表達增強，可能是腫瘤發生的因素

4）增強子的作用機理雖然還不明確，但與其他順式調控元件一樣，必須與特定的蛋白質因結合后才能發揮增強轉錄的作用。增強子一般具有組織或細胞特

異性，許多增強子只在某些細胞或組織中表現活性，是由這些細胞或組織中具有

3、沉默子

最早在酵母中發現，以后在T淋巴細胞的T抗原受體基因的轉錄和重排中證實這種負調控順式元件的存在。目前對這種在基因轉錄降低或關閉中起作用的序列研究還不多，但從已有的例子看到：沉寂子的作用可不受序列方向的影響，也能遠距離發揮作用，并可對異源基因的表達起作用。

二、反式作用因子

以反式作用影響轉錄的因子可統稱為轉錄因子(transcription factors, TF)。RNA聚合酶是一種反式作用于轉錄的蛋白因子。在真核細胞中RNA聚合酶通常不能單獨發揮轉錄作用，而需要與其他轉錄因子共同協作。與RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ相應的轉錄因子分別稱為TFⅠ、TFⅡ、TFⅢ，對TFⅡ研究最多。

以前認為與TATA盒結合的蛋白因子是TFⅡ－D，后來發現TFⅡ－D實際包括兩類成分：與TATA盒結合的蛋白是TBP(TATAbox binding protein)，是唯一能識別TATA盒并與其結合的轉錄因子，是三種RNA聚合酶轉錄時都需要的；其他稱為TBP相關因子(TBP

associated factors TAF)，至少包括8種能與TBP緊密結合的因子。轉錄前先是TFⅡ－D與TATA盒結合；繼而TFⅡ－B以其C端與TBP－DNA復合體結合，其N端則能與RNA聚合酶Ⅱ親和結合，接著由兩個亞基組成的TFⅡ－F加入裝配，TFⅡ－F能與RNA聚合酶形成復合體，還具有依賴于ATP供給能量的DNA解旋酶活性，能解開前方的DNA雙螺旋，在轉錄鏈延伸中起作用。這樣，啟動子序列就與TFⅡ－D、B、F及RNA聚合酶Ⅱ結合形成一個“最低限度”能有轉錄功能基礎的轉錄前起始復合物(preintitiation complex, PIC)，能轉錄mRNA。TFⅡ－H是多亞基蛋白復合體，具有依賴于ATP供給能量的DNA解旋酶活性，在轉錄鏈延伸中發揮作用；TFⅡ－E是兩個亞基組成的四聚體，不直接與DNA結合而可能是與TFⅡ－B聯系，能提高ATP酶的活性；TFⅡ－E和TFⅡ－H的加入就形成完整的轉錄復合體，能轉錄延伸生成長鏈RNA，TFⅡ－A能穩定TFⅡ－D與TATA盒的結合，提高轉錄效率，但不是轉錄復合體一定需要的。

以上所述是典型的啟動子上轉錄復合體的形成，但有的真核啟動子不含

TATA盒或不通過TATA盒開始轉錄。例如有的無TATA盒的啟動子是靠TFⅡ－I和TFⅡ－D共同組成穩定的轉錄起始復合體開始轉錄的。由此可以看到真核轉錄起始的復雜性。

不同基因由不同的上游啟動子元件組成，能與不同的轉錄因子結合，這些轉錄因子通過與基礎的轉錄復合體作用而影響轉錄的效率。現在已經發現有許多不同的轉錄因子，看到的現象是：同一DNA序列可被不同的蛋白因子所識別；能直接結合DNA序列的蛋白因子是少數，但不同的蛋白因子間可以相互作用，因而多數轉錄因子是通過蛋白質－蛋白質間作用與DNA序列聯系并影響轉錄效率的。轉錄因子之間或轉錄因子與DNA的結合都會引起構象的變化，從而影響轉錄的效率。

作為蛋白質的轉錄因子從功能上分析其結構可包含有不同區域：1）DNA結合域(DNA binding domain)，多由60－100個氨基酸殘基組織的幾個亞區組成；2）轉錄激活域(activating domain)，常由30－100氨基酸殘基組成，這結構域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同種類，以酸性結構域最多見；3）連接區，即連接上兩個結構域的部分。不與DNA直接結合的轉錄因子沒有DNA結合域，但能通過轉錄激活域直接或間接作用于轉錄復合體而影響轉錄效率。

與DNA結合的轉錄因子大多以二聚體形式起作用，與DNA結合的功能域常見有以下幾種：

1、螺旋-轉角-螺旋(helix-turn-helix, HTH)及螺旋-環-螺旋(helix-loop-helix，HLH)

這類結構至少有兩個α螺旋，其間由短肽段形成的轉角或環連接，兩個這樣的motif結構以二聚體形式相連，距離正好相當于DNA一個螺距(3.4nm)，兩個α螺旋剛好分別嵌入DNA的深溝。

2、鋅指(zinc finger)

每個重復的“指”狀結構約含23個氨基酸殘基，鋅以4個配價鍵與4個半胱氨酸、或2個半胱氨酸和2個組氨酸相結合。整個蛋白質分子可有20個這樣的鋅指重復單位。每一個單位可以其指部伸入DNA雙螺旋的深溝，接觸5個核苷酸。例如與GC盒結合的轉錄因子SP1中就有連續的3個鋅指重復結構。）堿性－亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper, bZIP)，該結構的特點是蛋白質分子的肽鏈上每隔6個氨基酸就有一個亮氨酸殘基，結果就導致這些亮氨酸殘基都在α螺旋的同一個方向出現。兩個相同結構的兩排亮氨酸殘基就能以

疏水鍵結合成二聚體，該二聚體的另一端的肽段富含堿性氨基酸殘基，借其正電荷與DNA雙螺旋鏈上帶負電荷的磷酸基團結合。若不形成二聚體則對DNA的親和結合力明顯降低。在肝臟、小腸上皮、脂肪細胞和某些腦細胞中有稱為C/EBP家族的一大類蛋白質能夠與CAAT盒和病毒增強子結合，其特征就是能形成bZIP二聚體結構（如右圖）。

從上述可見：轉錄調控的實質在于蛋白質與DNA、蛋白質與蛋白質之間的相互作用，構象的變化正是蛋白質和核酸“活”的表現。但對生物大分子間的辨認、相互作用、結構上的變化及其在生命活動中的意義，人們的認識和研究還只在起步階段，其中許多內容甚至重要的規律我們可能至今還一無所知，有待于努力探索。

第三節 轉錄后水平的調控

一、hnRNA的選擇性加工運輸

二、mRNA前體的選擇性拼接

第三節翻譯水平的調控

一、mRNA的穩定性二、三、mRNA翻譯起始的調控

真核生物蛋白質合成的自體調控

第三篇：《分子生物學》教案(精)

《分子生物學》教案

O

RNA加工與核糖核蛋白復合體 教學目的和要求 了解RNA加工類型

2理解真核生物mRNA加工

3掌握原核生物rRNA和 tRNA的加工 O1 rRNA加工與核糖體

RNA加工類型

常見的類型有：內切核酸酶和外切核酸酶對核苷酸的切除；3/ 端和5/ 端添加核苷酸；對堿基或糖苷的修飾

原核生物的 rRNA加工

轉錄物形成莖環結構并與蛋白質結合成核糖核蛋白復合物（RNP），然后進行修飾（如對A的甲基化修飾），隨之由RNA聚合酶Ⅲ剪切釋放5S、16S、23S前體分子，再由RNA酶M5、M16、M23分別在每一前體分子的3/ 端和5/ 端進行進一步剪切，釋放出成熟的全長RNA分子

真核生物的 rRNA加工

哺乳動物47S前 rRNA經歷了一系列剪切，先切去外部轉錄間隔區，再切去內部轉錄間隔區，釋放32S和20S兩個前RNA，最后釋放18S、5.8S、28S rRNA。嗜熱四膜蟲 rRNA在加工過程中，其內含子可被自身RNA所切除，這種具有酶活性的RNA稱為核酶

核糖核蛋白復合體（RNP）特定蛋白與特定RNA形成的復合體叫RNP 原核生物核糖體

大腸桿菌70S核糖體由30S（21種蛋白質和5S rRNA）小亞基和50S（31種蛋白質和 23S、5S rRNA）大亞基構成

真核生物核糖體

80S核糖體包含60S大亞基（45種蛋白質、一個5S rRNA、一個5.8S rRNA和一個28S rRNA）和40S小亞基（30種蛋白質和18S rRNA）O2 tRNA的加工、RNA酶P和核酶

原核生物的 tRNA加工

轉錄物前體形成莖環結構→RNase E、F切割3/ 端→RNase D對3/ 端修剪→RNaseP 對5/ 端切除→RNase D再除去3/端的兩個核苷酸→ tRNA進行堿基修飾

真核生物的 tRNA加工

內切酶先切去5/ 端的前導區和2個額外的3/ 端核苷酸，再由 tRNA核苷酸轉移酶將5/-CCA-3/ 序列加到3/ 端，切除內含子

核糖核酸酶P 剪切前 tRNA產生成熟的5/ 端。其RNA組分可單獨行使內切核酸酶功能

核酶

可催化特定生化反應的RNA。RNaseP是可使 tRNA成熟的核酶。O3 mRNA加工、hnRNP、snRNP

mRNA加工

原核生物的 mRNA不需要加工。真核生物的RNA聚合酶Ⅱ轉錄的基因大小長度不一，其轉錄產物的群體統稱為核內不均一RNA（hnRNA），將被加工的 mRNA為前RNA，其加工包括：5/ 端加帽；3/ 端剪切及加polyA尾；剪接和甲基化

hnRNP 前RNA被蛋白質（主要是A、B、C）包裹形成核內不均一RNP（hnRNP）snRNP顆粒

富含U的核內小分子RNA與蛋白質形成snRNP顆粒，大部分參與前rRNA加工的甲基化位點定位

5/ 端加帽

5/ 端加上7-甲基鳥苷，GMP以反方向加到RNA轉錄物上，形成5/-5/ 三磷酸橋。帽子結構對5/ 外切核酸酶形成屏障

3/ 端剪切和加尾

3/ 端經過剪切再由聚腺苷酸聚合酶（PAP）加上poly（A）尾。可抵抗3/-外切核酸酶的攻擊，也助于 mRNA的翻譯

剪接

切除內含子將外顯子連接一起的過程，由U1、U2、U4、U5、U6snRNP催化。內含子有5/ GC和AG-3/及一端分支點序列

前 mRNA的甲基化

常見的是A上N6的甲基化 O4 可變 mRNA加工

可變加工

在特定前mRNA上形成一種以上的mRNA。它包括可變剪接和可變poly（A）加工

可變poly（A）位點

采用不同的poly（A）位點可導致采用不同的剪接方式 可變剪接

利用不同的5/位、3/位剪接位點產生不同的mRNA RNA編輯

改變、插入或刪除初始轉錄物特定部位的堿基而改變其核苷酸序列。

P 遺傳密碼與tRNA 教學目的和要求

1了解遺傳密碼的特性 掌握tRNA的結構和功能 P1 遺傳密碼

特性

4種核苷酸組成的三聯體密碼有64種，氨基酸只有20種，大多數氨基酸有多個密碼子，因此遺傳密碼具有簡并性

破譯

利用隨機共聚物加入無細胞體系來合成mRNA，可以確定密碼子的構成 特征

編碼同一氨基酸的密碼子為同義密碼子（蛋氨酸和色氨酸只有一個密碼子），通常只是第3個堿基不同

突變效應

第3位的轉換通常不改變氨基酸，第3位的顛換一半以上也是無效的。第2位的轉換導致相似氨基酸的轉變，顛換則改變氨基酸類型 通用性

密碼子在所有生物都通用

可讀框

始于ATG止于終止密碼的連續密碼子區域，沒有已知的蛋白產物，該區域為可讀框，確定有蛋白產物時叫編碼區

重疊基因

一個基因的編碼區和另一個編碼區重疊，病毒可利用該方式增加基因組的編碼能力

P2 tRNA的結構和功能

tRNA的一級結構

含有許多修飾堿基，常見有4種：胸苷，假尿苷，二氫尿苷和肌苷。從5/ 到3/ 端分別形成D環、反密碼子環、T環和接受臂

tRNA的二級結構

三葉草結構：氨基酸結合臂與氨基酸結合；D環—含二氫尿嘧啶；反密碼子環—肌苷（I）可與同義密碼子配對；可變臂；TψC臂和環；3/ 端有CCA結構 tRNA的三級結構 倒L 型

功能及氨酰化

tRNA與氨基酸結合為氨酰-tRNA，由氨酰-tRNA合成酶催化 氨酰tRNA合成酶 依賴

tRNA上的鑒別元件來識別不同

tRNA

第四篇：分子生物學原理教案

核酸的結構與功能

教學要求：

1．掌握核苷酸的分子結構，了解連接鍵及分子表達式 2．重點掌握DNA、RNA的結構特征及主要功能 3．了解DNA的理化性質與結構的關系 4．了解DNA的高級結構

課時安排：總學時 4.0

第一節

核酸的化學組成及一級結構

1.0 第二節

DNA的空間結構與功能

1.0 第三節

RNA的結構和功能

1.0 第四節

核酸的理化性質

0.8 第五節

核酸酶

0.2

重點：

1． 核酸的化學組成 2． DNA的雙螺旋結構 3． RNA的結構和功能 4． 核酸的理化性質

難點：

1． DNA的雙螺旋結構 2． 核酸的理化性質

教學內容：

一、核酸的化學組成及一級結構

1．核苷酸

嘌呤與嘧啶，DNA和RNA分子中核苷酸組成上的特點，核苷酸各組分之間的連接方式 2．脫氧核苷酸的連接 3．核苷酸的連接 4．核酸的一級結構

二、DNA的空間結構與功能

1．DNA的雙螺旋結構

Chargaff規則、B-雙螺旋結構模型和Z-DNA。2．DNA的超螺旋結構

染色質、核小體、組蛋白、基因 3．DNA是遺傳信息的物質基礎

三、RNA的結構和功能

1．mRNA 模板、hnRNA 2．tRNA

稀有堿基、莖環結構、反密碼環 3．rRNA

核糖體、多核糖體

四、核酸的理化性質

紫外吸收、變性、復性、增色效應、減色效應、解鏈溫度、雜交、探針。

五、核酸酶

思考題：

1． 核酸紫外測定的分子基礎是什么？

2． DNA和RNA的紫外測定結果有何不同？為什么？ 3． DNA的雙螺旋結構的要點是什么？

核苷酸代謝

教學要求：

1．了解食物核酸的消化吸收和體內核苷酸合成的途徑。

2．掌握嘌呤和嘧啶核苷酸的合成原料，合成反應特點，分解代謝的產物。

3．掌握核糖單核苷酸向脫氧核糖核苷酸的轉變。

4．了解核苷酸類抗代謝作用的生化環節。

課時安排：總學時 4.0 第一節

嘌呤核苷酸的合成與分解代謝

2.0 第二節

嘧啶核苷酸的合成與分解代謝

2.0 重點：

1．嘌呤和嘧啶核苷酸的合成原料 2．嘌呤和嘧啶核苷酸分解代謝的產物

3．脫氧核糖核苷酸的生成 難點：

嘌呤和嘧啶核苷酸的合成過程 教學內容：

一、嘌呤核苷酸的合成與分解代謝

1．嘌呤核苷酸的從頭合成IMP的合成原料及關鍵酶，AMP和GMP的轉變，嘌呤核苷酸合成的調節，嘌呤核苷酸的的補救合成和相互轉變，脫氧核苷酸的生成，嘌吟核苷酸的抗代謝物。

2．嘌呤核苷酸的分解代謝

磷酸核苷、核苷及嘌呤的降解，尿酸的生成。

二、嘧啶核苷酸的合成與分解代謝

1．嘧啶核苷酸的從頭合成UMP的合成原料及關鍵酶，UMP向CTP和TMP的轉變，嘧啶核苷酸補救合成，嘧啶核苷酸的抗代謝物。2．嘧啶核苷酸的分解代謝

α-氨基異丁酸的排泄。

思考題：

1． 核苷酸抗代謝物分幾類？試分析其抗腫瘤作用的分子基礎。2． 試小結嘌呤環和嘧啶環中個原子的分子來源。

DNA的生物合成

教學要求：

1．熟悉遺傳信息流向的中心法則。

2．掌握DNA復制方式、逆轉錄作用及相關酶系的特征。

3．了解DNA修復系統及特點。

課時安排：總學時 4.0 第一節

復制的基本規律

0.5 第二節

DNA復制的酶學和拓撲學變化

1.0 第三節

DNA生物合成過程

1.5第四節

逆轉錄和其他復制方式

0.5 第五節

DNA損傷(突變)與修復

0.5

重點： 1．遺傳信息流向的中心法則。

2．原核生物DNA半保留復制方式及相關酶系。難點：

1． 真核生物的DNA生物合成 2． 端粒和端粒酶 教學內容：

一、復制的基本規律

1．半保留復制的實驗依據及意義

2．雙向復制

3．半不連續復制

二、DNA復制的酶學和拓撲學變化

1．復制的化學反應

2．DNA聚合酶

原核生物與真核生物的DNA聚合酶

3．復制高保真性的酶學依據

4．復制中的解鏈伴有DNA分子拓撲學變化

解螺旋酶、拓撲酶、SSB。

引物酶和引發體。

5．DNA連接酶連接DNA雙鏈中的單鏈缺口

三、DNA生物合成過程

1．原核生物的DNA生物合成復制的起始：DNA解成單鏈，引發體的形成；復制的延長：復制延長的生化過程，復制的半不連續性及岡崎片段；復制的終止：切除引物、填補空缺和連接切口。

2．真核生物的DNA生物合成復制的起始與原核基本相似；復制的延長發生DNA聚合酶α/δ轉換；復制的終止：端粒和端粒酶。

四、逆轉錄和其他復制方式

1．逆轉錄病毒的基因組是RNA，其復制方式是逆轉錄 2．逆轉錄的發現發展了中心法則 3．滾環復制和D環復制

五、DNA損傷(突變)與修復

1．突變的意義。

2．引發突變的因素。

3．突變分子改變的類型

錯配，缺失、插入和框移突變，重排。

4．DNA損傷的修復：光修復、切除修復、重組修復、SOS修復。思考題：

1．試簡述DNA復制的特征和參與DNA復制的酶系。

2．什么是逆轉錄？試簡述逆轉錄的基本過程。

3．試簡述DNA突變的類型及DNA損傷的修復類型。

RNA的生物合成

教學要求：

1．掌握轉錄是RNA生物合成及信息流動的重要環節。

2．掌握轉錄的特點及三類RNA轉錄后的加工。

3．了解轉錄酶的特征。

4．熟悉核酶及其功能。

課時安排：總學時 4.0 第一節

原核生物轉錄的模板和酶

1.0 第二節

原核生物的轉錄過程

1.0 第三節

真核生物RNA的生物合成1.0

第四節

真核生物RNA的加工

1.0 重點：

1． 原核生物轉錄的模板和酶 2． 原核生物的轉錄過程 3． 真核生物RNA的加工

難點：

真核生物mRNA的加工中內含子的剪接方式、mRNA編輯。

教學內容：

一、原核生物轉錄的模板和酶

1．原核生物轉錄的模板

2．RNA聚合酶

全酶、核心酶

3．RNA聚合酶結合到DNA的啟動子上啟動轉錄

二、原核生物的轉錄過程

1．轉錄起始

轉錄起始復合物，開放轉錄復合體。

2．原核生物轉錄延長時蛋白質的翻譯也同時進行。

3．轉錄終止

依賴ρ因子、非依賴ρ因子兩大類。

三、真核生物RNA的生物合成1．真核生物有三種DNA依賴性RNA聚合酶

2．轉錄起始需要啟動子、RNA聚合酶和轉錄因子的參與 3．真核生物轉錄延長過程中沒有轉錄與翻譯同步的現象 4．真核生物轉錄終止和加尾修飾同時進行

四、真核生物RNA的加工

1．真核生物mRNA的加工

首尾修飾及剪接、內含子的其它剪接方式及功能、斷裂基因、mRNA編輯。

2．真核前體rRNA的加工

3．真核生物前體tRNA的加工包括把核苷酸的堿基修飾為稀有堿基。

思考題：

1． 試比較原核生物與真核生物RNA聚合酶有何區別？ 2． 試舉例說明什么是mRNA編輯？ 3． 試小結真核生物mRNA的加工過程。

蛋白質的生物合成

教學要求：

1．掌握遺傳信息、遺傳密碼與mRNA的關系，遺傳密碼的特征。

2．掌握蛋白質生物合成體系中主要RNA、三種酶和多種蛋白質因子的功能和作用特點，生物合成過程及能量變化。

3．了解翻譯后蛋白質的加工方式。

4．了解蛋白質合成的干擾和抑制。

課時安排：總學時 4.0 第一節

蛋白質生物合成體系

1.0 第二節

氨基酸的活化

1.0 第三節

蛋白質的生物合成過程

1.0

第四節

蛋白質翻譯后修飾和靶向運輸

0.6 第五節

蛋白質生物合成的干擾和抑制

0.4

重點： 1.遺傳密碼與mRNA的關系及其特征

2.蛋白質生物合成體系 3.氨基酸的活化

難點： 蛋白質的生物合成過程 教學內容：

一、蛋白質生物合成體系

1．mRNA是蛋白質生物合成的直接模板

遺傳密碼的方向性、連續性、簡并性、通用性和擺動性。

2．核糖體是蛋白質生物合成的場所。

3．tRNA是氨基酸的運載工具及蛋白質生物合成的適配器

氨基酸臂、反密碼子

4．蛋白質生物合成需要酶類、蛋白質因子等

二、氨基酸的活化

1．氨基酰tRNA 氨基酰tRNA合成酶

2．真核生物起始氨基酰tRNA是Met-tRNAiMet

三、蛋白質的生物合成過程

1．原核生物的肽鏈合成過程

起始：起始因子；延長：延長因子，注冊、成肽、轉位，核糖體循環；終止：終止密碼子。2．真核生物的肽鏈合成過程

四、蛋白質翻譯后修飾和靶向運輸

1．多肽鏈折疊為天然構象的蛋白質

分子伴侶、蛋白質二硫鍵異構酶、肽-脯氨酸順反異構酶。

2．蛋白質一級結構修飾主要是肽鍵水解和化學修飾

3．蛋白質空間結構修飾包括亞基聚合和輔基連接 4．合成后蛋白質可被靶向輸送至細胞特定部位

五、蛋白質生物合成的干擾和抑制 1．抗生素對翻譯的抑制作用

2．其他干擾蛋白質生物合成的物質

思考題：

1．試簡述蛋白質生物合成體系及3種RNA在蛋白質生物合成中的作用。2．試小結原核生物復制、轉錄和翻譯的基本過程。

基因表達調控

教學要求：1．掌握原核生物轉錄水平的調控方式和機理。

2．熟悉基因表達調控基本概念與原理。3．了解真核生物的基因轉錄調控方式。

課時安排：總學時 4.0 第一節

基因表達調控的基本概念

1.0 第二節

基因表達調控的基本原理

1.0 第三節

原核基因表達調節

1.5第四節

真核基因表達調節

0.5 重點： 原核生物轉錄水平的調控方式

乳糖操縱子調控模式

難點： 真核生物的基因轉錄調控方式 教學內容：

一、基因表達調控的基本概念

1．基因表達是指基因轉錄及翻譯的過程

2．基因表達具有時間特異性和空間特異性

3．基因表達的方式及調節存在很大的差異

組成性表達、誘導和阻遏表達。

4．基因表達調控為生物體學生長、發育所必需

適應環境、維持生長和增殖、維持個體發育與分化。

二、基因表達調控的基本原理

1．基因表達調控呈現多層次和復雜性

2．基因轉錄激活受到轉錄調節蛋白與啟動子相互作用的調節

三、原核基因表達調節

1．原核基因轉錄調節特點

σ因子決定RNA聚合酶識別特異性、操縱子調控模型和阻遏蛋白與阻遏機制的普遍性。

2．操縱子調控模式在原核基因轉錄起始調節中具有普遍性

乳糖操縱子結構、阻遏蛋白的負調節、cAMP-CAP的正調節、協調調節。3．原核生物具有不同的轉錄終止調節機制

4．原核生物在翻譯水平同樣受到多個環節的調節

四、真核基因表達調節

1．真核基因組具有獨特的結構特點

2．真核基因表達調控更為復雜

3．RNA PolI和PolIII轉錄體系的調節相對簡單

4．RNA PolII轉錄起始的調節非常復雜

順式作用元件、反式作用因子、mRNA轉錄激活及其調節。

5．RNA PolII轉錄終止的調節機制尚不清楚

6．轉錄后水平的調節也是基因表達調控的重要環節

7．基因表達在翻譯水平以及翻譯后階段仍然可以受到調節

思考題：

1．原核生物基因表達調控的基本原理是什么？ 2．乳糖操縱子是如何實現基因表達調控的？

3．順式作用元件、反式作用因子在真核基因表達調節中的作用是什么？

基因重組與基因工程

教學要求：

1．掌握自然界的基因轉移和重組。

2．熟悉重組DNA技術的相關概念。

3．掌握重組DNA技術的基本原理。

4．了解重組DNA技術與醫學的關系。

課時安排：總學時 4.0 第一節

自然界DNA重組和基因轉移是經常發生的1.5 第二節

重組DNA技術

2.0 第三節

重組DNA技術與醫學的關系

0.5

重點：

1． 自然界的基因轉移和重組

2． 重組DNA技術的基本原理及步驟

難點：

重組DNA技術的基本原理

教學內容：

一、自然界DNA重組和基因轉移是經常發生的 1．同源重組

2．細菌的基因轉移與重組

3．特異位點重組

4．轉座重組。

二、重組DNA技術

1．重組DNA技術相關概念

DNA克隆，工具酶，基因載體。

2．重組DNA技術基本原理及操作步驟

目前基因的獲取、克隆載體的選擇和構建、外源基因與載體的連接、重組DNA導入受體菌、重組體篩選、克隆基因的表達。

三、重組DNA技術與醫學的關系

1．疾病基因的發現 2．生物制藥

3．基因診斷與治療 4．遺傳病的預防

思考題：

1． 簡述基因工程的基本條件和基本過程。

2． 舉例說明基因工程在工業、農業和醫學中的應用。

細胞信息轉導

教學要求：

1．掌握細胞間的信號轉導的概念。

2．掌握各種受體的分子結構及其信號轉導通路。

3．了解信息傳遞途徑的交互聯系。

4．了解細胞信號轉導與醫學的關系。

課時安排：總學時 4.0 第一節

細胞信息轉導概述

1.0 第二節

細胞內信號轉導相關分子

1.0 第三節

各種受體介導的細胞內基本信號轉導通路

1.5第四節

細胞信號轉導與醫學

0.5 重點：

1． 細胞間的信號轉導的概念

2． 各種受體的分子結構及其信號轉導通路

難點：

1． 各種受體介導的細胞內基本信號轉導通路 2． G蛋白的結構

教學內容：

一、細胞信息轉導概述

1．細胞外化學信號有可溶性和膜結合型兩種形式 2．細胞經由特異性受體接受細胞外信號

3．細胞內信號分子結構、含量和分布變化是信號轉導網絡工作的基礎

二、細胞內信號轉導相關分子

1．第二信使的濃度和分布變化是重要的信號轉導方式

2．蛋白質作為細胞內信號轉導分子

三、各種受體介導的細胞內基本信號轉導通路

1．細胞內受體多屬于轉錄因子

2．離子通道型膜受體是化學信號與電信號轉換器 3．七跨膜受體依賴G蛋白轉導信號

4．單跨膜受體依賴酶的催化作用傳遞信號 5．細胞信號轉導過程的特點和規律

四、細胞信號轉導與醫學

1．信號轉導分子的結構改變是許多疾病發生發展的基礎 2．細胞信號轉導分子是重要的藥物作用靶位

思考題：

1．按照作用方式的不同，細胞內信號分子有哪些？各有何特點？ 2．試述信號分子與受體結合的特點。

3．各類型的膜受體結構和功能上有什么特點？

4．簡述G蛋白的結構，并說明其活化型和非活化型如何互變。

糖蛋白、蛋白聚糖和細胞外基質

教學要求：

1．掌握糖蛋白、蛋白聚糖和細胞外基質的概念及糖蛋白的分類。2．熟悉膠原蛋白的結構與功能。3．熟悉糖蛋白寡糖鏈的功能。

4．了解纖連蛋白和層粘連蛋白的結構與功能。

課時安排：總學時 4.0 第一節

糖蛋白

2.0 第二節

蛋白聚糖

1.0 第三節

細胞外基質

1.0

重點： 糖蛋白、蛋白聚糖和細胞外基質的概念

糖蛋白的分類 難點：糖蛋白分子中聚糖的功能 教學內容：

一、糖蛋白

1．糖蛋白的結構

N連接糖蛋白：高甘露糖型、復雜型、雜合性；O連接糖蛋白。

2．糖蛋白分子中聚糖的功能

二、蛋白聚糖

1．重要的糖胺聚糖。

2．核心蛋白。

3．蛋白聚糖的生物合成。

4．蛋白聚糖的功能。

三、細胞外基質

1．膠原。

2．纖連蛋白。

3．層粘連蛋白。

思考題：

1． 試簡述糖蛋白N連接聚糖的分類及其結構特點。2． 試簡要說明糖蛋白分子中聚糖的功能。

癌基因、抑癌基因與生長因子

教學要求：

1．掌握癌基因、抑癌基因及生長因子的基本概念。2．熟悉原癌基因產物及其功能。

3．了解癌基因活化機制及抑癌基因作用機制。

課時安排：總學時 4.0 第一節

癌基因

2.0 第二節

抑癌基因

1.0 第三節

生長因子

1.0

重點：

1． 癌基因、抑癌基因及生長因子的基本概念 2． 原癌基因產物及其功能

難點：

癌基因活化機制及抑癌基因作用機制

教學內容：

一、癌基因

1．病毒癌基因

DNA病毒、RNA病毒

2．細胞癌基因

src家族、ras家族、myc家族、sis家族、myb家族。

3．癌基因活化的機制

獲得啟動子、染色體易位、原癌基因擴增、點突變。

4．原癌基因的產物與功能

生長因子、跨膜生長因子受體、細胞內信號傳導體、核內轉錄因子。

二、抑癌基因

1．抑癌基因的基本概念

2．常見的抑癌基因

3．抑癌基因的作用機制

三、生長因子

1．概述

2．生長因子的作用機制

3．生長因子與疾病

細胞凋亡、心血管疾病

思考題：

1． 什么是病毒癌基因？什么是細胞癌基因？兩者有何區別？ 2． 什么是生長因子？是舉例說明其作用機制。

常用分子生物學技術的原理及應用

教學要求：

1．掌握分子雜交、印跡技術及PCR原理。

2．熟悉印跡技術的類別及應用，PCR基本過程。3．了解核酸序列分析。

4．熟悉基因診斷的概念，常用技術方法及其應用。5．了解基因治療的概念及其應用。

課時安排：總學時 6.0 第一節

分子雜交與印跡技術

1.0 第二節

PCR技術的原理及應用

1.0 第三節

核酸序列分析

0.4 第四節

基因文庫

0.4 第五節

生物芯片技術

0.4 第六節

生物大分子相互作用研究技術

1.0 第七節

遺傳修飾動物模型的建立與應用

0.4 第八節

疾病相關基因的克隆與鑒定

0.4 第九節

基因診斷和基因治療

1.0 重點：

1．分子雜交、印跡技術的分類及應用。2．PCR原理及PCR基本過程。

3．基因診斷的概念，常用技術方法及其應用。

難點：

1． 核酸序列分析

2． 疾病相關基因的克隆與鑒定

教學內容：

一、分子雜交與印跡技術

1．分子雜交和印跡技術的原理

印跡技術、探針技術

2．印跡技術的類別及應用

DNA印跡、RNA印跡、蛋白質的印跡分析

二、PCR技術的原理及應用

1．PCR技術的工作原理。

2．PCR技術的的主要用途。

3．幾種重要的PCR衍生技術

逆轉錄PCR、原位PCR、實時PCR、三、核酸序列分析

1．DNA鏈末端終止法化學裂解法

2．DNA自動測序

四、基因文庫

1．基因組DNA文庫 2．c DNA文庫

五、生物芯片技術 1．基因芯片 2．蛋白質芯片

六、生物大分子相互作用研究技術 1．蛋白質相互作用研究技術

2．DNA-蛋白質相互作用分子分析技術

七、遺傳修飾動物模型的建立與應用 1．轉基因技術 2．核轉移技術 3．基因剔除技術

4．基因轉移和基因剔除技術在醫學發展中的作用

八、疾病相關基因的克隆與鑒定 1．功能克隆 2．定位克隆

九、基因診斷和基因治療

1．基因診斷

DNA序列分析、PCR技術、基因芯片。2．基因治療

基因治的基本策略、基因治療的基本程序

思考題：

1．印跡技術有哪幾類？試比較他們在原理及操作過程中的不同點。2．PCR的原理是什么？試小結其基本過程。3．什么是基因診斷？常用的技術方法有哪些？

第五篇：分子生物學電子教案第二章

第二章 核酸的結構和功能

1、主要內容

v 細胞內的遺傳物質

v 核酸的化學組成與共價結構

v DNA的二級結構

v DNA分子的高級結構

v 真核生物的染色體及其組裝

v RNA的結構與功能

v 核酸的變性、復性與分子雜交

2、教學要求

v 掌握遺傳物質的只要特點和種類；

v 掌握DNA雙螺旋結構特點，核酸的變性、復性和分子雜交原理；

v 熟悉核酸的物理化學性質

v 熟悉DNA 多種高級結構

第一節 細胞的遺傳物質

一、DNA攜帶兩類不同的遺傳信息

1.遺傳物質必須具有的特性

a.貯存并表達遺傳信息

b.能把信息傳遞給子代

c.物理和化學性質穩定

d.具有遺傳變化的能力

l DNA的特征

a)各異的堿基序列儲存大量的遺傳信息

b)堿基互補是其復制、轉錄表達遺傳信息的基礎

c)生理狀態下物理、化學性質穩定

d)有突變和修復能力，可穩定遺傳是生物進化的基礎

！遺傳物質核酸是如何被證明的？

2、DNA攜帶兩種遺傳信息

a、編碼蛋白質和RNA的信息(編碼tRNA、rRNA)：64個三聯體密碼子：3個終止密碼子，編碼氨基酸的61個密碼子具有簡并性、通用性

b、編碼基因選擇性表達的信息

¨原核生物的結構基因占Genome的比例很大，Φx174phage 5386bp，結構基因用去5169bp比例達96％。

¨真核生物的結構基因占Genome的比例很小，哺乳動物中結構基因只占10％～15％。

¨其余80％以上的DNA起什么作用目前還無法精確解釋，但可以肯定其中大部分DNA序列是編碼基因選擇性表達的遺傳信息。

¨表現在：細胞周期的不同時相中

個體發育不同階段

不同的器官和組織

不同的外界環境下各種基因的表達與否以及量的差異

¨所以又稱－－調控序列

二、RNA也可作為遺傳物質

n RNA病毒：傳染媒介是病毒顆粒（病毒基因組RNA、蛋白質外殼）

n Tobacco Mosaic Virus

(TMV)

n 類病毒（viroid）: 使高等植物產生疾病的傳染性因子，只由RNA組成。

三、是否存在核酸以外的遺傳物質

n Prion(proteinaccous infections particle)引起的**

n 朊病毒－－－蛋白質樣的感染因子

1)羊搔癢病(scripie)

2)人類庫魯（kuru）病

3)牛海綿狀腦炎(瘋牛病)

n 均由傳染性病原蛋白顆粒引起，統稱Prion(朊病毒)資料：1982年，美國加利福尼亞大學教授斯坦利?普利西納提出雅克氏病的病原體是一種“蛋白質性質的感染顆粒”，并用prion（普利昂）一詞表示這種因子，國內曾譯為朊病毒或鋸蛋白。但這種蛋白質粒子缺乏核酸，稱為病毒并不妥當，故現在稱為朊毒體。

瘋羊病、瘋牛病及人類所患的新型雅克氏癥等海綿狀腦病，都是由朊毒體發生變異引起的。包括人在內的哺乳動物體內都存在朊毒體，它在正常形態下呈折疊狀，但變異時會張開如同鋸齒狀，在大腦中撐出大量的小洞，引起人或動物患上癡呆型的傳染性海綿狀腦病。

朊毒體的致病過程是：首先經一定傳播途徑（如進食患病動物的肉和內臟）侵入機體并進入腦組織，其后沉積于不同的神經元溶酶體內，導致被感染的腦細胞受損、壞死，釋出的朊毒體又侵犯其它腦細胞，使病變不斷發展；病變的神經細胞死亡后，腦組織中留下大量小孔呈海綿狀，并出現相應的臨床癥狀，這就是眾所周知的海綿狀腦病。

普利西納學說公布之初，在學術界曾遭到猛烈反對，多數人持否定態度。因為分子生物學的中心命題是“生物的遺傳基因以核糖核酸和脫氧核糖核酸為本體”，在此之前，人們普遍認為，不存在沒有核酸的病原體，這已成為常識，但普利西納的學說卻與這種認識背道而馳。經過10多年的研究和爭論，大量事實確證了朊毒體的存在，普利西納的學說最終得到了認可。鑒于這一發現的重大科學價值，普利西納榮獲1997諾貝爾生理學或醫學獎。

第二節 核酸的化學組成一、含氮堿基、核苷、核苷酸

l DNA is a nucleotide polymer with covalent bonds between the sugar and Phosphate groups.l A long molecular chain containing a sugar, a phosphate and one of four different nucleotide bases.l Chemical Composition（化學組成）:

Sugar(糖): Deoxyribose(ribose核糖in RNA)Phosphate(磷酸):-phosphodiester

Bases(堿基):(G)guanine

(C)cytosine

(A)adenine

(T)thymine！稀有堿基：假尿苷（?）、二氫尿嘧啶（DHU）、2`-O-甲基腺苷、N6，N6-二甲基腺苷。

名稱與縮寫(1)? RNA：ribonucleic acid

核糖核酸

? DNA：deoxyribonucleic acid

脫氧核糖核酸

? pyrimidine：

cytosine(Cyt)

胞嘧啶

嘧啶

thymine(Thy)

胸腺嘧啶

uracil(Ura)

尿嘧啶

? purine：

adenine(Ade)

腺嘌呤

嘌呤

guanine(Gua)

鳥嘌呤

名稱與縮寫(2)? ribonucleoside

核糖核苷（不帶磷酸）

adenosine(Ado)

腺(嘌呤核)苷

guanosine(Guo)

鳥(嘌呤核)苷

cytidine(Cyd)

胞(嘧啶核)苷

thymidine(Thd)

胸(腺嘧啶脫氧核)苷

uridine

(Urd)

尿(嘧啶核)苷

? ribonucleotide

核糖核苷酸（帶磷酸）

adenosine 5’-mono(di, tri)phosphaste；

AMP, ADP, ATP ? deoxyribonucleoside

脫氧核糖核苷

deoxyadenosine(dAdo)…… ? deoxyribonucleotide

脫氧核糖核苷酸

dAMP, dADP, dATP……dNTP

二、DNA分子的一級結構

1.多聚核苷酸鏈主鏈是核糖和磷酸，側鏈為堿基，由3’,5’磷酸二酯鍵連接

2.鏈的方向：同一個磷酸基的5’酯鍵到3’酯鍵的方向(5’→3’)

3、DNA一級結構的特點

a.脫氧核糖是其顯著特點－－－－DNA極其穩定的根本原因

b、磷酸呈四面體構型，脫氧核糖呈折疊的五元環，堿基是平面的c、主鏈是親水的，側鏈（堿基）是疏水的

n 主鏈的脫氧核糖的羥基能與水形成氫鍵，而磷酸基團在生理條件下離解為負離子, 這些特點保證了多核苷酸鏈可形成穩定的構象。

4、一級結構的概念

n 指DNA分子中的核苷酸排列順序

n 不同生物借此貯存遺傳信息

n 決定DNA的二級結構和高級結構

第三節 核酸二級結構

一、DNA雙螺旋模型的提出

依據

n a.1938.W.T.Astbury 首次用X－射線分析DNA

n b.1950 Chargaff

A + G / T + C = 1

A+T ≠

G + C n c.1952 Alexander Todd

發現了核苷酸和核苷酸之間由磷酸二酯鍵聯接

n d.1952 M.H.F.Wilkins & Rosalind Franklin

得到了高度定向的DNA纖維的X-射線照片

發現原子長軸存在0.34和3.4nm兩種周期性

n 此外，之前的密度測定表明螺旋由兩條多核苷酸鏈組成，且直徑恒定（2nm)。

Watson-Crick的DNA雙螺旋

n 兩條相互獨立的單鏈DNA分子以螺旋方式相互纏繞，形成右手雙螺旋；

n 帶有負電的戊糖-磷酸骨架在分子的外側；

n 堿基則平面堆積于螺旋的內部；

n 由于骨架雙鏈在螺旋軸上的間距不相等，從而在分子表面形成大溝和小溝。大溝和小溝。雙螺旋表面的溝對DNA和蛋白質的相互識別是很重要的，因為在溝內才能覺察到堿基的順序，而在雙螺旋的表面，是脫氧核糖和磷酸重復結構，沒有信息可言。（蛋白質

核酸，核酸

核酸、鋅指結構）

n

雙螺旋模型參數

n 直徑20?

n 螺距為34?(任一條鏈繞軸一周所升降的距離)n 每圈有10個核苷酸(堿基)

n 兩個堿基之間的垂直距離是3.4?。螺旋轉角是36度。

n 有大溝和小溝，配對堿基并不充滿雙螺旋空間，且堿基對占據的空間不對稱。

二、影響雙螺旋結構穩定性的因素

氫鍵

范德華力（Van de waals force）

疏水作用力(Hydrophobic interaction)* 不穩定因素

n 磷酸基團間的靜電斥力

n 堿基內能增加(溫度), 使氫鍵因堿基排列有序狀態的破壞而減弱

三、雙螺旋結構多樣性

B-DNA：資料來自相對濕度為92％所得到的DNA鈉鹽纖維。

此外人們還發現了A、C、D、E等右手雙螺旋和左手雙螺旋Z構象等形式。

DNA結構的多態性：幾種不同的DNA雙螺旋結構以及同一種雙螺旋結構內參數存在差異的現象。

原因：多核苷酸鏈的骨架含有許多可轉動的單鍵，磷酸二酯鍵的兩個P-O鍵、糖苷鍵、戊糖環各個鍵。

第四節 DNA的高級結構

1、反向重復序列與二級結構

n 反向重復序列（inverted repeatitive sequence or inverted

repeats, IR）,又稱回文序列（廻文）：指兩段同樣的核苷酸序列同時存在于一個分子中，但具有相反的方向。有時也有不完全相同的情況。

¨RNA和DNA中都可能存在

n 此外還可有directed repeatitive sequence---正向重復序列

n 較短的回文序列可能是作為一種信號

n

如：限制性內切酶的識別位點

n

一些調控蛋白的識別位點

n 例如限制性內切酶 EcoRⅠ的識別位點

5′－－GAATTC－－3′

3′－－CTTAAG－－5′

2.DNA(Trible Helix DNA, T.S DNA)的三股螺旋結構

（1）發現和證實

1953年，Watson & Crick D.S DNA model證明沿大溝存在多余的氫鍵給體與受體

潛在的專一與DNA(蛋白質)結合的能力

形成T.S DNA 可能性

1957 年Felsenfeld等發現一股為嘌呤，另一股為嘧啶的核苷酸雙鏈能夠形成三鏈

如： polyA/polyU

polydA/polydT

polyd(AG)/polyd(CT)——三螺旋DNA的概念提出

1987年Mirkin.S.M證明plasmid DNA在 pH= 4.3的溶液中, 有T.S DNA的存在，這些發現促進了三螺旋DNA的研究

（2）組成形式

a、D.S.DNA + D.S.DNA→T.S.DNA + S.S.DNA b、分子組成

☆ PY/PU + PU(偏堿性介質中穩定)

G＊G、A＊A、G＊C＋

☆ PY/PU + PY(偏酸性介質中穩定)常見類型

G＊C＋

A＊T

3、四股螺旋DNA(tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA 結構特點：基本結構單元－－鳥嘌呤四聯體

可能的功能：

A、穩定真核生物染色體結構

B、保證DNA末端準確復制

C、與DNA分子的組裝有關

D、與染色體的meiosis & mitosis 有關

4、DNA的超螺旋結構

⑴超螺旋(superhelix

OR

supercoil)的形成和類型

l形成

松馳態DNA（relax form）

低能量

常態

超螺旋（Supercoied）DNA

正超螺旋

負超螺旋

DNA的超螺旋結構

正超螺旋（positive supercoiled）緊纏overwinding(右旋)負超螺旋（Negative Supercoiled）

松纏unwinding(左旋)原核生物DNA的三級結構：

n 絕大多數原核生物的DNA都是共價封閉的環狀雙螺旋。如果再進一步盤繞則形成麻花狀的超螺旋三級結構。

⑵超螺旋的定量描述

n White方程： L=T+W

n 連接數L（Linking nnmber）：指cccDNA中一條鏈繞另一條鏈的總次數。其特點是

(1)L是整數；

(2)在cccDNA的任何拓撲學狀態中其值保持不變；

(3)右手螺旋對L取正值。

n T（Twisting number）：盤繞數，即DNA分子中Watson-Crick螺旋數，初級螺旋圈數。其特點是：

(1)可以是非整數；

(2)是變量；

(3)右手螺旋時T為正值。

n W（Writhing number）：超盤繞數，即超螺旋數，直觀上為雙螺旋在空間的轉動數。其特點是：

(1)可以是非整數；

(2)是變量；

l(3)右手螺旋時，W取負值。

l 拓撲異構酶解超螺旋的特點。

第五節 真核生物的染色體及其組裝

一、真核細胞染色體組成

1、組成：DNA和蛋白質,以及少量的 RNA.2、染色體體和染色質的概念

v 染色質(chromatin)：是指細胞周期間期細胞核內由DNA、組蛋白、非組蛋白和少量RNA組成的復合結構，因其易被堿性染料染色而得名。

v 染色體(chromosome)：是指在細胞分裂期出現的一種能被堿性染料強烈染色，并具有一定形態、結構特征的物體。攜帶很多基因的分離單位。只有在細胞分裂中才可見的形態單位。

！分類：

v 常染色質(euchromatin)

（間期纖絲的包裝密度度比分裂期染色體的要小很多）

v 異染色質(heterochromatin)

（間期纖絲染色質區的包裝密度十分致密，可與有絲分裂期染色體相比）

組成型異染色質(constitutive

heterochromatin)

兼性異染色質(facultative heterochromatin)

3、染色體中的蛋白質

組蛋白分為H1、H2A、H2B、H3和H4。其特性：

v 進化上的極端保守性

不同種生物組蛋白的氨基酸組成是十分相似的，特別是H3和H4。

v 無組織特異性

到目前為止，僅發現鳥類、魚類及兩棲類紅細胞不含H1而帶有H5，精細胞染色體的組蛋白是魚精蛋白兩個例外。

v 肽鏈上氨基酸分布不對稱性

堿性氨基酸集中分布在N端的半條鏈上。

v 組蛋白的修飾作用

包括甲基化、乙酰化、磷酸化及ADP核糖基化等。

v 富含賴氨酸的組蛋白H5

非組蛋白：

(1)HMG 蛋白（high mobility group protein）, 這類蛋白可能與DNA的超螺旋結構有關。

(2)DNA結合蛋白

可能是一些與DNA復制或轉錄有關的酶或調節物質。

(3)A24非組蛋白

位于核小體內功能不詳。

4、核小體的形成

八聚體在中間，DNA盤繞在外而H1則在核小體的外面，每個核小體只有一個H1。所以核小體中組蛋白和DNA的比例是每200bpDNA有H2A，H2B，H3，H4各兩個，H1各一個。

5、染色體的高級包裝

v 核小體的形成是染色體壓縮的第一階段，約1/7；

v 螺旋管的每個螺旋包含6個核小體，壓縮比為6；

v 中期的染色質是一個細長中空的圓筒，為400nm, 由30nm螺旋管纏繞而成，壓縮比為40;

v 這個超螺旋圓筒進一步壓縮1/5便成為染色單體，總壓縮比是7x6x40x5，將近10000倍。

第六節 RNA的結構與功能

一、RNA 的功能：

l 信息分子

遺傳信息由DNA到蛋白質的中間體 的核心作用。

l 功能分子

1.作為細胞內蛋白質生物合成的主要參與者，參與在蛋白質合成中核蛋白復合物的結構組成和功能發揮；

2.具有生物催化的功能，作用于初始轉錄產物的剪接加工；

3.與生物機體的生長發育密切相關，參與基因的表達調控；

4.與生物體的進化有很大的關系。

5.核糖體

6.信息體

7.拼接體

8.編輯體

二、RNA的分類

v mRNA的結構

v tRNA的結構

v rRNA的結構

v snRNA v snoRNA

v 非編碼mRNA！每種RNA的基本結構和功能！！！

第七節 核酸的物理化學性質

DNA雙股鏈的互補是其結構和功能上的一個基本特征，也是DNA研究中一些實驗技術的基礎。

一、DNA分子的變性

1、條件：加熱，極端pH，有機溶劑（尿素、酰胺)，低鹽濃度等

2、變性過程的表現

¤ 是一個爆發式的協同過程，變性作用發生在一個很窄的溫度范圍

¤ 導致一些理化性質發生劇烈變化

3、熔解曲線與Tm值

緩慢而均勻地增加DNA 溶液的溫度（現可做到 0.1 ℃／分）可根據各點的A260值繪制成DNA的熔解曲線。

Tm=℃ of Ct = C0/2 = OD增加值的中點溫度(一般為85-95℃)或DNA雙螺旋結構失去一半時的溫度

這也是一般PCR實驗技術中把變性溫度定為94 ℃的原因。

4、影響 Tm值的因素

（1）在 A, T, C, G 隨機分布的情況下，決定于GC含量

n GC%愈高

→

Tm值愈大

n GC%愈低

→

Tm 值愈小

（2）GC%含量相同的情況下

AT形成變性核心，變性加快，Tm 值小。

堿基排列對Tm值具有明顯影響

?生物體內僅UAA為最有效的終止密碼子

n 因為：UAA、AUU的Tm值是最低的一個，即使生理溫度下也不穩定。

二、DNA分子的復性

（anneal or renaturation）

n 概念：變性DNA在適當條件下，兩條彼此分開的鏈又可以 重新地合成雙螺旋結構的過程（退火）。

根據復性動力學公式我們可以知道什么？

(1)單鏈濃度隨著時間的增大而減小；

(2)反應速率取決于初始的單鏈濃度Co；

(3)以反應濃度和COt1/2為座標可繪復性曲線;(4)通過COt1/2值可測原核生物基因組的大小;

已知大腸桿菌的基因組為4.2x106bp, COt1/2 = 9M.Sec

則

(5)原核生物基因組大小不同，復性曲線也不同;(6)可用以區分真核生物和原核生物基因組。

在復性反應中如何知道單鏈已經結合成雙鏈了呢？可以通過哪些法來檢測？

(1)減色效應（hpochromic effcef）

測定光密度，即OD值(optical density），DNA從單鏈變成雙鏈，OD260減少30%(2)羥基磷灰石柱層析

羥基磷灰石對雙鏈DNA吸附較牢，不易吸附單鏈。

四、核酸分子雜交（hybridization）※ 雜交形式：

n 液相雜交

n 固相雜交(濾膜雜交)¨1975 E.M.Southern ¨Southern blot

S.S.DNA × S.S.DNA ¨1977.J.C.Alwine ¨Northern blot

S.S.RNA × S.S.DNA ¨1978.Hany Towbin ¨Western blot

Protein(antigen)× antibody ＊固相分子雜交(1975 E.M.Southern)

！復習思考題

1、堿基、核苷、核苷酸的化學組成2、核酸的一級結構

書寫方向

3、Watson ＆ Crick 的Double Helix Model

參數

大小溝

二級結構的多態性

4、影響二級結構的作用力：

穩定因素

不穩定因素

5、DNA的不尋常結構：

反向重復序列

三螺旋DNA

四鏈DNA

6、真核生物的染色體：核小體的組成和組裝

染色體的多級包裝

7、RNA的種類及其相關結構和功能與及應用

8、變性：溶解曲線

Tm

影響因素（GC、化學試劑、鹽、pH）

9、復性

C0t曲線

C0t（1／2）

10、核酸分子雜交的類型

11、DNA的超螺旋結構

形成、類型

組蛋白和非組蛋白