第一篇：分子生物學(xué)電子教案第一章

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第一章 緒論

1．課程教學(xué)內(nèi)容

（1）十九世紀(jì)和二十世紀(jì)生命科學(xué)的回顧（2）分子生物學(xué)的概念

（3）二十一世紀(jì)分子生物學(xué)展望 2．課程重點(diǎn)、難點(diǎn)

分子生物學(xué)的概念、研究?jī)?nèi)容和發(fā)展歷史 3．課程教學(xué)要求

（1）理解分子生物學(xué)研究的內(nèi)容；

（2）掌握分子生物學(xué)領(lǐng)域一些具有里程碑意義的事件。

一、什么是分子生物學(xué)？

分子生物學(xué)：是研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性和規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)，是人類從分子水平上真正揭示生物世界的奧秘，由被動(dòng)地適應(yīng)自然界主動(dòng)地改造和重組自然界的基礎(chǔ)學(xué)科。創(chuàng)世說(shuō)與進(jìn)化論

?許多年來(lái)，人們反復(fù)提出的3個(gè)與生命和一切生物學(xué)現(xiàn)象有關(guān)的問(wèn)題：生命怎樣起源？為什么有其父必有其子？動(dòng)植物個(gè)體怎樣從一個(gè)受精卵發(fā)育而來(lái)？

?十九世紀(jì)初葉，對(duì)于這些問(wèn)題只能從宗教或迷信的角度進(jìn)行回答---上帝創(chuàng)造了一切。?1859年，偉大的英國(guó)生物學(xué)家達(dá)爾文發(fā)表了物種起源一書(shū)，確立了進(jìn)化論。

細(xì)胞學(xué)說(shuō)

?17世紀(jì)末葉，荷蘭籍顯微鏡專家 Leewenhoek 制作成功了世界第一架光學(xué)顯微鏡。?與Leewenhoek同時(shí)代的Hooke, 第一次用細(xì)胞這個(gè)概念來(lái)形容組成軟木的最基本單元。雖然這一概念到十九世紀(jì)中葉，才正式被科學(xué)界接受，但它對(duì)生物學(xué)的貢獻(xiàn)是不可估量的。?細(xì)胞學(xué)說(shuō)是由德國(guó)植物學(xué)家 Schleiden和動(dòng)物學(xué)家Schwann建立的。這一發(fā)現(xiàn)被稱為十九世紀(jì)的三大發(fā)現(xiàn)之一。

?Schleiden出生于德國(guó)漢堡，22歲就獲得了法學(xué)博士學(xué)位，但他并不喜歡當(dāng)律師，28歲時(shí)他到哥廷根和柏林學(xué)習(xí)植物學(xué)和醫(yī)學(xué)，36歲獲得醫(yī)學(xué)和哲學(xué)博士學(xué)位。

?Schwann是首飾匠的兒子，16歲高中畢業(yè)后，沒(méi)有按照父母的意愿學(xué)習(xí)神學(xué)，而是到柏林學(xué)醫(yī)，24歲獲得了博士學(xué)位。在柏林解剖博物館工作時(shí)結(jié)識(shí)了Schleiden.?他們雖然個(gè)性、經(jīng)歷迥然不同，但共同的志趣促成了他們多年的合作。Schleiden研究植物的囊胚，Schwann研究蛙類的胚胎組織，相同的研究方向，相似的研究方法，使他們?nèi)〉昧艘恢碌囊?jiàn)解，共同創(chuàng)立了生物科學(xué)色基礎(chǔ)理論。

?所有組織的最基本的單元是形狀非常相似而有高度分化的細(xì)胞。細(xì)胞的發(fā)生和形成是生物學(xué)界普遍和永久的規(guī)律。

?細(xì)胞學(xué)說(shuō)對(duì)生命現(xiàn)象實(shí)際上是細(xì)胞活動(dòng)的總和，所以細(xì)胞可以而且應(yīng)該成為生物學(xué)研究的主要對(duì)象。

經(jīng)典的生物化學(xué)和遺傳學(xué)

?進(jìn)化論和細(xì)胞學(xué)說(shuō)相結(jié)合，產(chǎn)生了作為主要實(shí)驗(yàn)科學(xué)之一的現(xiàn)代生物學(xué)，而以研究動(dòng)、植物遺傳變異規(guī)律為目標(biāo)遺傳學(xué)和以分離純化、鑒定細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)為目標(biāo)的生物化學(xué)則是這一學(xué)科的兩大支柱。

?在十九世紀(jì)中葉，人們發(fā)現(xiàn)動(dòng)物和植物細(xì)胞的提取液中主要是一些能受熱或酸變性形成纖維狀沉淀的物質(zhì)。DNA的發(fā)現(xiàn)

早在 1928年英國(guó)科學(xué)家Griffith等人就發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌使小鼠引起死亡的原因是引起肺炎。細(xì)菌的毒性是由細(xì)胞表面夾膜中的多糖所決定的。具有光滑外表的S型肺炎鏈球菌因?yàn)閹в袏A膜的多糖而能使小鼠發(fā)病，具有粗糙外表的R型細(xì)菌因?yàn)闆](méi)有夾膜多糖而失去致病力。首先實(shí)驗(yàn)證明基因就是DNA分子的是美國(guó)著名的微生物學(xué)家Avery.實(shí)驗(yàn)過(guò)程

? 首先將光滑型致病菌（S型）燒煮殺滅活性以后再侵染小鼠，發(fā)現(xiàn)這些死細(xì)菌自然喪失致病能力。? 再用活的粗糙型細(xì)菌來(lái)侵染小鼠，也不能使之發(fā)病，因?yàn)榇植谛图?xì)菌天然無(wú)致病力。

? 然而當(dāng)他們將經(jīng)燒煮殺死的S 型細(xì)菌和活的R型細(xì)菌在混合感染小鼠時(shí)，實(shí)驗(yàn)小鼠每次都死去。

? 解剖死亡的小鼠發(fā)現(xiàn)大量的活的S 型細(xì)菌。

Hershey和他的學(xué)生Chase的噬菌體侵染細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)

? 噬菌體用尾部的末端吸附細(xì)菌表面

? 噬菌體通過(guò)尾軸把DNA全部注入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，噬菌體的蛋白外客則留在細(xì)胞外面。

? 噬菌體的 電腦啊一旦進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，它就能利用細(xì)菌的生命過(guò)程合成噬菌體自身的DNA和蛋白質(zhì)

? 新合成的DNA和蛋白質(zhì)外殼，能組裝成許多與親代完全相同的子代噬菌體； ? 子代噬菌體由于細(xì)菌的解體而被釋放出來(lái)，再去侵染其他細(xì)菌。在整個(gè)過(guò)程中，DNA起了關(guān)鍵的作用。

二、分子生物學(xué)的發(fā)展簡(jiǎn)史

? 從1847年提出細(xì)胞學(xué)說(shuō)至今一百多年間，我們對(duì)生物大分子即細(xì)胞的組成有了深刻的認(rèn)識(shí)。為了全面了解分子生物學(xué)的的發(fā)展，我們不妨來(lái)看一看部分諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)和化學(xué)獎(jiǎng)作為紐帶的分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史。

? 1910年，德國(guó)科學(xué)家Kossel因?yàn)榈鞍踪|(zhì)、細(xì)胞和核酸化學(xué)的研究而獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，他首先分離出腺嘌呤、胸腺嘧啶和組氨酸

在量子力學(xué)家薛定諤的《生命是什么?》(1944年)一書(shū)的影響下，許多物理學(xué)家和化學(xué)家投身于生命的分子基礎(chǔ)和基因的自我復(fù)制這兩個(gè)生物學(xué)中心問(wèn)題的研究,將現(xiàn)代物理學(xué)和化學(xué)的最新成果、理論和方法帶入了生物學(xué)研究中。

(1)1953年4月25日出版的Nature雜志上，沃森(Watson)和物理學(xué)家克里克(Crick)提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，標(biāo)志著遺傳學(xué)以及整個(gè)生物學(xué)進(jìn)入分子水平的新時(shí)代。(2)50年代初，Barbara Mclintock 在玉米中發(fā)現(xiàn)可動(dòng)遺傳因子即轉(zhuǎn)座因子，但是這個(gè)過(guò)于超時(shí)代的發(fā)現(xiàn)當(dāng)時(shí)并未得到承認(rèn)，甚至受到譏笑。(3)1961年克里克等證明了他于1958年提出的關(guān)于遺傳三聯(lián)密碼的推測(cè)。1969年Nirenberg 等解譯出全部遺傳密碼。

(4)60年代，闡明mRNA、tRNA 及核糖體的功能、蛋白質(zhì)生物合成的過(guò)程、“中心法則”等。（5）70年代，發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶、人工分離和合成基因取得進(jìn)展，1972年P(guān).Berg 成功實(shí)現(xiàn)了DNA體外重組;1973年S.N.Cohen 通過(guò)DNA的體外重組成功地構(gòu)建了第一個(gè)有生物學(xué)功能的細(xì)菌雜交質(zhì)粒，從而興起以DNA重組技術(shù)為核心的基因工程研究。

（6）80年代，基因工程技術(shù)飛速發(fā)展，基因工程藥物和疫苗投入臨床使用，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物產(chǎn)品上市銷售，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物生物反應(yīng)器研究成為熱點(diǎn)并實(shí)現(xiàn)商品化。

（7）90年代，1992年“人類基因組計(jì)劃”開(kāi)始實(shí)施，投資30億美元旨在測(cè)定人類基因組全部30億個(gè)核苷酸對(duì)的堿基序列，是在破譯生物體全部遺傳密碼的征途上邁出的第一步，將為揭開(kāi)人類和生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、疾病、衰老和死亡的奧秘奠定基礎(chǔ)，其意義與原子彈研究曼哈頓計(jì)劃和載人登月阿波羅計(jì)劃相比有過(guò)之而無(wú)不及。克隆羊“多莉”(Dolly)誕生之后，克隆牛、羊、小鼠等動(dòng)物紛紛獲得成功。

（8）21世紀(jì)初人類基因組計(jì)劃提前完成，遺傳學(xué)面臨新的挑戰(zhàn)和使命，即進(jìn)入了“基因組后研究”時(shí)代，在搞清楚基因組的全部序列的基礎(chǔ)上，還要 徹底闡明基因組所包含的全部遺傳信息的生物學(xué)功能，及其所編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，所以又稱為“蛋白質(zhì)組”研究。同時(shí)，還要應(yīng)用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，改造蛋白質(zhì)，使人類對(duì)生命活動(dòng)的認(rèn)識(shí)和支配由必然王國(guó)進(jìn)入自由王國(guó)。

三、分子生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容

分子生物學(xué)的三條基本原理：構(gòu)成生物體各類有機(jī)體大分子的單體在不同生物中都是相同的；生物體內(nèi)一切有機(jī)大分子的建成都遵循共同的規(guī)則；某一特定生物體所擁有的核酸及蛋白質(zhì)分子決定了它的屬性。

分子生物學(xué)涉及的范圍極為廣泛，研究?jī)?nèi)容也似乎包羅萬(wàn)象，事實(shí)上它研究的內(nèi)容不外乎以下四個(gè)方面：DNA重組技術(shù)、基因表達(dá)與調(diào)控、生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能研究、基因組、功能基因組和生物信息學(xué)。1）DNA重組技術(shù) DNA重組技術(shù)（基因工程）是20世紀(jì)70年代初興起的技術(shù)科學(xué)，目的是將不同的DNA片段按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來(lái)，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生影響受體細(xì)胞的新的遺傳性狀。

DNA重組技術(shù)是核酸化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、酶工程及微生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)長(zhǎng)期深入研究的結(jié)果，而限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶及其他工具酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用則是這一技術(shù)得以建立的關(guān)鍵。

DNA重組技術(shù)的應(yīng)用：大量生產(chǎn)某些在正常細(xì)胞代謝中產(chǎn)量很低的多肽，如激素、抗生素、酶類及抗體等；可以定向改造某些生物的基因組結(jié)構(gòu)，是它們所具備的特殊經(jīng)濟(jì)價(jià)值或功能得以成百上千倍的提高。DNA重組技術(shù)還被用來(lái)進(jìn)行基礎(chǔ)研究。2）基因表達(dá)調(diào)控研究

? 基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究、轉(zhuǎn)錄因子研究和RNA剪輯3個(gè)方面。? 信號(hào)傳導(dǎo)是指外部信號(hào)通過(guò)細(xì)胞膜上的受體蛋白傳到細(xì)胞內(nèi)部、并激發(fā)諸如離子通透性、細(xì)胞形狀或其他細(xì)胞功能方面的應(yīng)答過(guò)程。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之所以能引起細(xì)胞功能的改變，主要是由于信號(hào)最后活化某些蛋白質(zhì)分子，使之發(fā)生構(gòu)型的變化，從而直接作為靶位點(diǎn)，打開(kāi)或關(guān)閉某些基因

? 轉(zhuǎn)錄因子是是一群能與基因5?端上游特定序列專一結(jié)合，從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。

? 真核基因轉(zhuǎn)錄成前體mRNA后，除了在5?端加帽及3?端加多聚A之外，還要切去隔開(kāi)各個(gè)相鄰編碼區(qū)的內(nèi)含子，使外顯子相連后成為成熟mRNA.3）生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究

? 生物大分子發(fā)揮生物學(xué)功能時(shí)，必須具備兩個(gè)前提：有特定的空間結(jié)構(gòu)；在發(fā)揮生物學(xué)功能過(guò)程中必定存在著結(jié)構(gòu)和和構(gòu)象的變化。

? 結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)就是研究生物大分子特定的空間結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)變化與其生物學(xué)功能關(guān)系的科學(xué)。

4）基因組、功能基因組與生物信息學(xué)研究 ? 基因組學(xué) ? 功能基因組學(xué) ? 蛋白組學(xué) ? 生物信息學(xué)

四、分子生物學(xué)展望

人類基因組計(jì)劃的開(kāi)展到其他生物的基因組測(cè)序。

基因工程----轉(zhuǎn)基因動(dòng)物植物，提高產(chǎn)量、質(zhì)量到生產(chǎn)藥物蛋白，轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)等。生物學(xué)在各個(gè)學(xué)科之間廣泛滲透，相互促進(jìn)，不斷深入和發(fā)展。科學(xué)家從分子水平、細(xì)胞水平、個(gè)體和群體等不同層次深入探索各種生物現(xiàn)象。

分子生物學(xué)與其他學(xué)科的融合：與細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、與遺傳學(xué)、與分類學(xué)和生物進(jìn)化研究、與發(fā)育生物學(xué)

1、生命科學(xué)可望成為21世紀(jì)的領(lǐng)銜學(xué)科

在科學(xué)發(fā)展的歷史上，各門學(xué)科并非齊頭并進(jìn)，總有一門或一組學(xué)科走在其他學(xué)科的前面，從理論觀念、思維方式或科研方法上對(duì)其他學(xué)科發(fā)揮重要的影響，人們稱之為帶頭學(xué)科。近代科學(xué)的帶頭學(xué)科是力學(xué)，現(xiàn)代科學(xué)的帶頭學(xué)科是物理學(xué)，21世紀(jì)的帶頭學(xué)科將是什么？人們看好生命科學(xué)。回顧科學(xué)的發(fā)展史，我們就能看到力學(xué)和物理學(xué)成為近代和現(xiàn)代科學(xué)的帶頭學(xué)科的必然性。

20世紀(jì)下半葉以來(lái)，生命科學(xué)文獻(xiàn)在科學(xué)文獻(xiàn)中的比重、從事生命科學(xué)研究的科學(xué)家人數(shù)在自然科學(xué)家中所占的比重都在迅速增長(zhǎng)。生命科學(xué)的發(fā)展對(duì)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生重要影響。

生命現(xiàn)象中還有狠多重大問(wèn)題需要人們?nèi)ソ忉尅＠缟矬w產(chǎn)生的有機(jī)分子為什么都有特定的結(jié)構(gòu)？遺傳密碼是怎樣形成的？當(dāng)代許多新興學(xué)科（系統(tǒng)論、信息論、控制論、耗散結(jié)構(gòu)理論等等）都是從生命科學(xué)知識(shí)中受到啟發(fā)，生命現(xiàn)象中的許多問(wèn)題的解決必將給科學(xué)的發(fā)展帶來(lái)新的啟迪。生命科學(xué)的發(fā)展必將促進(jìn)海洋科學(xué)、空間科學(xué)、能源科學(xué)、材料科學(xué)等當(dāng)代新興科學(xué)技術(shù)的發(fā)展。

2、分子生物學(xué)對(duì)社會(huì)發(fā)展的影響 1）與醫(yī)學(xué)

繁殖性克隆動(dòng)物克隆是指由一個(gè)動(dòng)物經(jīng)無(wú)性繁殖產(chǎn)生多個(gè)后代個(gè)體，同一克隆內(nèi)所有成員的遺傳信息是完全相同的。治療性克隆概念利用核重組技術(shù)培育早期胚胎及由此衍生的胚胎干細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)人類所需要的器官和組織。

基因是一種有限的資源，一個(gè)基因可成就一家企業(yè)，帶動(dòng)一個(gè)產(chǎn)業(yè)，下一個(gè)創(chuàng)造更大財(cái)富的人將有可能出現(xiàn)在基因領(lǐng)域？

PPL公司成功獲得GT-knockout 豬：2001年12月25日，PPL公司成功地獲得了5頭“Knock-out”（基因敲除）母豬，命名為Noel, Angel, Star, Joy 和 Mary。這些豬基因組上的alpha 1,3

galactosyl transferase 被敲除，而該酶是負(fù)責(zé)將糖基加入到豬細(xì)胞膜上，產(chǎn)生被人體免疫系統(tǒng)視為抗原的物質(zhì)，從而激發(fā)人體免疫系統(tǒng)對(duì)移植的豬器官產(chǎn)生超急性排斥反應(yīng)。因此，對(duì)豬阿爾法1,3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的敲除成功，是人類為實(shí)現(xiàn)異種器官移植邁進(jìn)了決定性的一步

2）分子生物學(xué)與農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展

轉(zhuǎn)基因植物（Transgenic Plants）；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（Transgenic Animals)；動(dòng)物克隆(Animal Cloning)

3）分子生物學(xué)與能源問(wèn)題

地球上的煤和石油化石能的枯竭指日可待，核燃料也有告罄之時(shí)。而利用太陽(yáng)能有條件的限制。

人們把希望寄托于生物技術(shù)來(lái)解決能源問(wèn)題：用農(nóng)副產(chǎn)品發(fā)酵生產(chǎn)酒精，代替汽油做燃料；培育含油量高的植物生產(chǎn)燃料用油；研究清楚植物光合作用中將水分子分解為氫氣與氧氣的機(jī)制及其催化劑酶的結(jié)構(gòu)，人工模擬光合作用，利用太陽(yáng)能分解水得到氫燃料。4）與倫理道德問(wèn)題It has been realized that it would also raise a number of complex ethical, legal and social issues.復(fù)習(xí)思考題

1.現(xiàn)代分子生物學(xué)的含義和包括的研究范圍? 2.分子生物學(xué)發(fā)展史史上的重大事件？ 3.談?wù)勀銓?duì)分子生物學(xué)在今后的生物科學(xué)有什么樣的重要意義？

第二篇：分子生物學(xué)電子教案第二章

第二章 核酸的結(jié)構(gòu)和功能

1、主要內(nèi)容

v 細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)

v 核酸的化學(xué)組成與共價(jià)結(jié)構(gòu)

v DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

v DNA分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)

v 真核生物的染色體及其組裝

v RNA的結(jié)構(gòu)與功能

v 核酸的變性、復(fù)性與分子雜交

2、教學(xué)要求

v 掌握遺傳物質(zhì)的只要特點(diǎn)和種類；

v 掌握DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，核酸的變性、復(fù)性和分子雜交原理；

v 熟悉核酸的物理化學(xué)性質(zhì)

v 熟悉DNA 多種高級(jí)結(jié)構(gòu)

第一節(jié) 細(xì)胞的遺傳物質(zhì)

一、DNA攜帶兩類不同的遺傳信息

1.遺傳物質(zhì)必須具有的特性

a.貯存并表達(dá)遺傳信息

b.能把信息傳遞給子代

c.物理和化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定

d.具有遺傳變化的能力

l DNA的特征

a)各異的堿基序列儲(chǔ)存大量的遺傳信息

b)堿基互補(bǔ)是其復(fù)制、轉(zhuǎn)錄表達(dá)遺傳信息的基礎(chǔ)

c)生理狀態(tài)下物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定

d)有突變和修復(fù)能力，可穩(wěn)定遺傳是生物進(jìn)化的基礎(chǔ)

！遺傳物質(zhì)核酸是如何被證明的？

2、DNA攜帶兩種遺傳信息

a、編碼蛋白質(zhì)和RNA的信息(編碼tRNA、rRNA)：64個(gè)三聯(lián)體密碼子：3個(gè)終止密碼子，編碼氨基酸的61個(gè)密碼子具有簡(jiǎn)并性、通用性

b、編碼基因選擇性表達(dá)的信息

¨原核生物的結(jié)構(gòu)基因占Genome的比例很大，Φx174phage 5386bp，結(jié)構(gòu)基因用去5169bp比例達(dá)96％。

¨真核生物的結(jié)構(gòu)基因占Genome的比例很小，哺乳動(dòng)物中結(jié)構(gòu)基因只占10％～15％。

¨其余80％以上的DNA起什么作用目前還無(wú)法精確解釋，但可以肯定其中大部分DNA序列是編碼基因選擇性表達(dá)的遺傳信息。

¨表現(xiàn)在：細(xì)胞周期的不同時(shí)相中

個(gè)體發(fā)育不同階段

不同的器官和組織

不同的外界環(huán)境下各種基因的表達(dá)與否以及量的差異

¨所以又稱－－調(diào)控序列

二、RNA也可作為遺傳物質(zhì)

n RNA病毒：傳染媒介是病毒顆粒（病毒基因組RNA、蛋白質(zhì)外殼）

n Tobacco Mosaic Virus

(TMV)

n 類病毒（viroid）: 使高等植物產(chǎn)生疾病的傳染性因子，只由RNA組成。

三、是否存在核酸以外的遺傳物質(zhì)

n Prion(proteinaccous infections particle)引起的**

n 朊病毒－－－蛋白質(zhì)樣的感染因子

1)羊搔癢病(scripie)

2)人類庫(kù)魯（kuru）病

3)牛海綿狀腦炎(瘋牛病)

n 均由傳染性病原蛋白顆粒引起，統(tǒng)稱Prion(朊病毒)資料：1982年，美國(guó)加利福尼亞大學(xué)教授斯坦利?普利西納提出雅克氏病的病原體是一種“蛋白質(zhì)性質(zhì)的感染顆粒”，并用prion（普利昂）一詞表示這種因子，國(guó)內(nèi)曾譯為朊病毒或鋸蛋白。但這種蛋白質(zhì)粒子缺乏核酸，稱為病毒并不妥當(dāng)，故現(xiàn)在稱為朊毒體。

瘋羊病、瘋牛病及人類所患的新型雅克氏癥等海綿狀腦病，都是由朊毒體發(fā)生變異引起的。包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物體內(nèi)都存在朊毒體，它在正常形態(tài)下呈折疊狀，但變異時(shí)會(huì)張開(kāi)如同鋸齒狀，在大腦中撐出大量的小洞，引起人或動(dòng)物患上癡呆型的傳染性海綿狀腦病。

朊毒體的致病過(guò)程是：首先經(jīng)一定傳播途徑（如進(jìn)食患病動(dòng)物的肉和內(nèi)臟）侵入機(jī)體并進(jìn)入腦組織，其后沉積于不同的神經(jīng)元溶酶體內(nèi)，導(dǎo)致被感染的腦細(xì)胞受損、壞死，釋出的朊毒體又侵犯其它腦細(xì)胞，使病變不斷發(fā)展；病變的神經(jīng)細(xì)胞死亡后，腦組織中留下大量小孔呈海綿狀，并出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀，這就是眾所周知的海綿狀腦病。

普利西納學(xué)說(shuō)公布之初，在學(xué)術(shù)界曾遭到猛烈反對(duì)，多數(shù)人持否定態(tài)度。因?yàn)榉肿由飳W(xué)的中心命題是“生物的遺傳基因以核糖核酸和脫氧核糖核酸為本體”，在此之前，人們普遍認(rèn)為，不存在沒(méi)有核酸的病原體，這已成為常識(shí)，但普利西納的學(xué)說(shuō)卻與這種認(rèn)識(shí)背道而馳。經(jīng)過(guò)10多年的研究和爭(zhēng)論，大量事實(shí)確證了朊毒體的存在，普利西納的學(xué)說(shuō)最終得到了認(rèn)可。鑒于這一發(fā)現(xiàn)的重大科學(xué)價(jià)值，普利西納榮獲1997諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

第二節(jié) 核酸的化學(xué)組成一、含氮堿基、核苷、核苷酸

l DNA is a nucleotide polymer with covalent bonds between the sugar and Phosphate groups.l A long molecular chain containing a sugar, a phosphate and one of four different nucleotide bases.l Chemical Composition（化學(xué)組成）:

Sugar(糖): Deoxyribose(ribose核糖in RNA)Phosphate(磷酸):-phosphodiester

Bases(堿基):(G)guanine

(C)cytosine

(A)adenine

(T)thymine！稀有堿基：假尿苷（?）、二氫尿嘧啶（DHU）、2`-O-甲基腺苷、N6，N6-二甲基腺苷。

名稱與縮寫(xiě)(1)? RNA：ribonucleic acid

核糖核酸

? DNA：deoxyribonucleic acid

脫氧核糖核酸

? pyrimidine：

cytosine(Cyt)

胞嘧啶

嘧啶

thymine(Thy)

胸腺嘧啶

uracil(Ura)

尿嘧啶

? purine：

adenine(Ade)

腺嘌呤

嘌呤

guanine(Gua)

鳥(niǎo)嘌呤

名稱與縮寫(xiě)(2)? ribonucleoside

核糖核苷（不帶磷酸）

adenosine(Ado)

腺(嘌呤核)苷

guanosine(Guo)

鳥(niǎo)(嘌呤核)苷

cytidine(Cyd)

胞(嘧啶核)苷

thymidine(Thd)

胸(腺嘧啶脫氧核)苷

uridine

(Urd)

尿(嘧啶核)苷

? ribonucleotide

核糖核苷酸（帶磷酸）

adenosine 5’-mono(di, tri)phosphaste；

AMP, ADP, ATP ? deoxyribonucleoside

脫氧核糖核苷

deoxyadenosine(dAdo)…… ? deoxyribonucleotide

脫氧核糖核苷酸

dAMP, dADP, dATP……dNTP

二、DNA分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)

1.多聚核苷酸鏈主鏈?zhǔn)呛颂呛土姿幔瑐?cè)鏈為堿基，由3’,5’磷酸二酯鍵連接

2.鏈的方向：同一個(gè)磷酸基的5’酯鍵到3’酯鍵的方向(5’→3’)

3、DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)

a.脫氧核糖是其顯著特點(diǎn)－－－－DNA極其穩(wěn)定的根本原因

b、磷酸呈四面體構(gòu)型，脫氧核糖呈折疊的五元環(huán)，堿基是平面的c、主鏈?zhǔn)怯H水的，側(cè)鏈（堿基）是疏水的

n 主鏈的脫氧核糖的羥基能與水形成氫鍵，而磷酸基團(tuán)在生理?xiàng)l件下離解為負(fù)離子, 這些特點(diǎn)保證了多核苷酸鏈可形成穩(wěn)定的構(gòu)象。

4、一級(jí)結(jié)構(gòu)的概念

n 指DNA分子中的核苷酸排列順序

n 不同生物借此貯存遺傳信息

n 決定DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)

第三節(jié) 核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)

一、DNA雙螺旋模型的提出

依據(jù)

n a.1938.W.T.Astbury 首次用X－射線分析DNA

n b.1950 Chargaff

A + G / T + C = 1

A+T ≠

G + C n c.1952 Alexander Todd

發(fā)現(xiàn)了核苷酸和核苷酸之間由磷酸二酯鍵聯(lián)接

n d.1952 M.H.F.Wilkins & Rosalind Franklin

得到了高度定向的DNA纖維的X-射線照片

發(fā)現(xiàn)原子長(zhǎng)軸存在0.34和3.4nm兩種周期性

n 此外，之前的密度測(cè)定表明螺旋由兩條多核苷酸鏈組成，且直徑恒定（2nm)。

Watson-Crick的DNA雙螺旋

n 兩條相互獨(dú)立的單鏈DNA分子以螺旋方式相互纏繞，形成右手雙螺旋；

n 帶有負(fù)電的戊糖-磷酸骨架在分子的外側(cè)；

n 堿基則平面堆積于螺旋的內(nèi)部；

n 由于骨架雙鏈在螺旋軸上的間距不相等，從而在分子表面形成大溝和小溝。大溝和小溝。雙螺旋表面的溝對(duì)DNA和蛋白質(zhì)的相互識(shí)別是很重要的，因?yàn)樵跍蟽?nèi)才能覺(jué)察到堿基的順序，而在雙螺旋的表面，是脫氧核糖和磷酸重復(fù)結(jié)構(gòu)，沒(méi)有信息可言。（蛋白質(zhì)

核酸，核酸

核酸、鋅指結(jié)構(gòu)）

n

雙螺旋模型參數(shù)

n 直徑20?

n 螺距為34?(任一條鏈繞軸一周所升降的距離)n 每圈有10個(gè)核苷酸(堿基)

n 兩個(gè)堿基之間的垂直距離是3.4?。螺旋轉(zhuǎn)角是36度。

n 有大溝和小溝，配對(duì)堿基并不充滿雙螺旋空間，且堿基對(duì)占據(jù)的空間不對(duì)稱。

二、影響雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素

氫鍵

范德華力（Van de waals force）

疏水作用力(Hydrophobic interaction)* 不穩(wěn)定因素

n 磷酸基團(tuán)間的靜電斥力

n 堿基內(nèi)能增加(溫度), 使氫鍵因堿基排列有序狀態(tài)的破壞而減弱

三、雙螺旋結(jié)構(gòu)多樣性

B-DNA：資料來(lái)自相對(duì)濕度為92％所得到的DNA鈉鹽纖維。

此外人們還發(fā)現(xiàn)了A、C、D、E等右手雙螺旋和左手雙螺旋Z構(gòu)象等形式。

DNA結(jié)構(gòu)的多態(tài)性：幾種不同的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以及同一種雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)參數(shù)存在差異的現(xiàn)象。

原因：多核苷酸鏈的骨架含有許多可轉(zhuǎn)動(dòng)的單鍵，磷酸二酯鍵的兩個(gè)P-O鍵、糖苷鍵、戊糖環(huán)各個(gè)鍵。

第四節(jié) DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)

1、反向重復(fù)序列與二級(jí)結(jié)構(gòu)

n 反向重復(fù)序列（inverted repeatitive sequence or inverted

repeats, IR）,又稱回文序列（廻文）：指兩段同樣的核苷酸序列同時(shí)存在于一個(gè)分子中，但具有相反的方向。有時(shí)也有不完全相同的情況。

¨RNA和DNA中都可能存在

n 此外還可有directed repeatitive sequence---正向重復(fù)序列

n 較短的回文序列可能是作為一種信號(hào)

n

如：限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)

n

一些調(diào)控蛋白的識(shí)別位點(diǎn)

n 例如限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ的識(shí)別位點(diǎn)

5′－－GAATTC－－3′

3′－－CTTAAG－－5′

2.DNA(Trible Helix DNA, T.S DNA)的三股螺旋結(jié)構(gòu)

（1）發(fā)現(xiàn)和證實(shí)

1953年，Watson & Crick D.S DNA model證明沿大溝存在多余的氫鍵給體與受體

潛在的專一與DNA(蛋白質(zhì))結(jié)合的能力

形成T.S DNA 可能性

1957 年Felsenfeld等發(fā)現(xiàn)一股為嘌呤，另一股為嘧啶的核苷酸雙鏈能夠形成三鏈

如： polyA/polyU

polydA/polydT

polyd(AG)/polyd(CT)——三螺旋DNA的概念提出

1987年Mirkin.S.M證明plasmid DNA在 pH= 4.3的溶液中, 有T.S DNA的存在，這些發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了三螺旋DNA的研究

（2）組成形式

a、D.S.DNA + D.S.DNA→T.S.DNA + S.S.DNA b、分子組成

☆ PY/PU + PU(偏堿性介質(zhì)中穩(wěn)定)

G＊G、A＊A、G＊C＋

☆ PY/PU + PY(偏酸性介質(zhì)中穩(wěn)定)常見(jiàn)類型

G＊C＋

A＊T

3、四股螺旋DNA(tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：基本結(jié)構(gòu)單元－－鳥(niǎo)嘌呤四聯(lián)體

可能的功能：

A、穩(wěn)定真核生物染色體結(jié)構(gòu)

B、保證DNA末端準(zhǔn)確復(fù)制

C、與DNA分子的組裝有關(guān)

D、與染色體的meiosis & mitosis 有關(guān)

4、DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)

⑴超螺旋(superhelix

OR

supercoil)的形成和類型

l形成

松馳態(tài)DNA（relax form）

低能量

常態(tài)

超螺旋（Supercoied）DNA

正超螺旋

負(fù)超螺旋

DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)

正超螺旋（positive supercoiled）緊纏overwinding(右旋)負(fù)超螺旋（Negative Supercoiled）

松纏unwinding(左旋)原核生物DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)：

n 絕大多數(shù)原核生物的DNA都是共價(jià)封閉的環(huán)狀雙螺旋。如果再進(jìn)一步盤繞則形成麻花狀的超螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)。

⑵超螺旋的定量描述

n White方程： L=T+W

n 連接數(shù)L（Linking nnmber）：指cccDNA中一條鏈繞另一條鏈的總次數(shù)。其特點(diǎn)是

(1)L是整數(shù)；

(2)在cccDNA的任何拓?fù)鋵W(xué)狀態(tài)中其值保持不變；

(3)右手螺旋對(duì)L取正值。

n T（Twisting number）：盤繞數(shù)，即DNA分子中Watson-Crick螺旋數(shù)，初級(jí)螺旋圈數(shù)。其特點(diǎn)是：

(1)可以是非整數(shù)；

(2)是變量；

(3)右手螺旋時(shí)T為正值。

n W（Writhing number）：超盤繞數(shù)，即超螺旋數(shù)，直觀上為雙螺旋在空間的轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)。其特點(diǎn)是：

(1)可以是非整數(shù)；

(2)是變量；

l(3)右手螺旋時(shí)，W取負(fù)值。

l 拓?fù)洚悩?gòu)酶解超螺旋的特點(diǎn)。

第五節(jié) 真核生物的染色體及其組裝

一、真核細(xì)胞染色體組成

1、組成：DNA和蛋白質(zhì),以及少量的 RNA.2、染色體體和染色質(zhì)的概念

v 染色質(zhì)(chromatin)：是指細(xì)胞周期間期細(xì)胞核內(nèi)由DNA、組蛋白、非組蛋白和少量RNA組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，因其易被堿性染料染色而得名。

v 染色體(chromosome)：是指在細(xì)胞分裂期出現(xiàn)的一種能被堿性染料強(qiáng)烈染色，并具有一定形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征的物體。攜帶很多基因的分離單位。只有在細(xì)胞分裂中才可見(jiàn)的形態(tài)單位。

！分類：

v 常染色質(zhì)(euchromatin)

（間期纖絲的包裝密度度比分裂期染色體的要小很多）

v 異染色質(zhì)(heterochromatin)

（間期纖絲染色質(zhì)區(qū)的包裝密度十分致密，可與有絲分裂期染色體相比）

組成型異染色質(zhì)(constitutive

heterochromatin)

兼性異染色質(zhì)(facultative heterochromatin)

3、染色體中的蛋白質(zhì)

組蛋白分為H1、H2A、H2B、H3和H4。其特性：

v 進(jìn)化上的極端保守性

不同種生物組蛋白的氨基酸組成是十分相似的，特別是H3和H4。

v 無(wú)組織特異性

到目前為止，僅發(fā)現(xiàn)鳥(niǎo)類、魚(yú)類及兩棲類紅細(xì)胞不含H1而帶有H5，精細(xì)胞染色體的組蛋白是魚(yú)精蛋白兩個(gè)例外。

v 肽鏈上氨基酸分布不對(duì)稱性

堿性氨基酸集中分布在N端的半條鏈上。

v 組蛋白的修飾作用

包括甲基化、乙酰化、磷酸化及ADP核糖基化等。

v 富含賴氨酸的組蛋白H5

非組蛋白：

(1)HMG 蛋白（high mobility group protein）, 這類蛋白可能與DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。

(2)DNA結(jié)合蛋白

可能是一些與DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶或調(diào)節(jié)物質(zhì)。

(3)A24非組蛋白

位于核小體內(nèi)功能不詳。

4、核小體的形成

八聚體在中間，DNA盤繞在外而H1則在核小體的外面，每個(gè)核小體只有一個(gè)H1。所以核小體中組蛋白和DNA的比例是每200bpDNA有H2A，H2B，H3，H4各兩個(gè)，H1各一個(gè)。

5、染色體的高級(jí)包裝

v 核小體的形成是染色體壓縮的第一階段，約1/7；

v 螺旋管的每個(gè)螺旋包含6個(gè)核小體，壓縮比為6；

v 中期的染色質(zhì)是一個(gè)細(xì)長(zhǎng)中空的圓筒，為400nm, 由30nm螺旋管纏繞而成，壓縮比為40;

v 這個(gè)超螺旋圓筒進(jìn)一步壓縮1/5便成為染色單體，總壓縮比是7x6x40x5，將近10000倍。

第六節(jié) RNA的結(jié)構(gòu)與功能

一、RNA 的功能：

l 信息分子

遺傳信息由DNA到蛋白質(zhì)的中間體 的核心作用。

l 功能分子

1.作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成的主要參與者，參與在蛋白質(zhì)合成中核蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)組成和功能發(fā)揮；

2.具有生物催化的功能，作用于初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪接加工；

3.與生物機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，參與基因的表達(dá)調(diào)控；

4.與生物體的進(jìn)化有很大的關(guān)系。

5.核糖體

6.信息體

7.拼接體

8.編輯體

二、RNA的分類

v mRNA的結(jié)構(gòu)

v tRNA的結(jié)構(gòu)

v rRNA的結(jié)構(gòu)

v snRNA v snoRNA

v 非編碼mRNA！每種RNA的基本結(jié)構(gòu)和功能！！！

第七節(jié) 核酸的物理化學(xué)性質(zhì)

DNA雙股鏈的互補(bǔ)是其結(jié)構(gòu)和功能上的一個(gè)基本特征，也是DNA研究中一些實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基礎(chǔ)。

一、DNA分子的變性

1、條件：加熱，極端pH，有機(jī)溶劑（尿素、酰胺)，低鹽濃度等

2、變性過(guò)程的表現(xiàn)

¤ 是一個(gè)爆發(fā)式的協(xié)同過(guò)程，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍

¤ 導(dǎo)致一些理化性質(zhì)發(fā)生劇烈變化

3、熔解曲線與Tm值

緩慢而均勻地增加DNA 溶液的溫度（現(xiàn)可做到 0.1 ℃／分）可根據(jù)各點(diǎn)的A260值繪制成DNA的熔解曲線。

Tm=℃ of Ct = C0/2 = OD增加值的中點(diǎn)溫度(一般為85-95℃)或DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)的溫度

這也是一般PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中把變性溫度定為94 ℃的原因。

4、影響 Tm值的因素

（1）在 A, T, C, G 隨機(jī)分布的情況下，決定于GC含量

n GC%愈高

→

Tm值愈大

n GC%愈低

→

Tm 值愈小

（2）GC%含量相同的情況下

AT形成變性核心，變性加快，Tm 值小。

堿基排列對(duì)Tm值具有明顯影響

?生物體內(nèi)僅UAA為最有效的終止密碼子

n 因?yàn)椋篣AA、AUU的Tm值是最低的一個(gè)，即使生理溫度下也不穩(wěn)定。

二、DNA分子的復(fù)性

（anneal or renaturation）

n 概念：變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條彼此分開(kāi)的鏈又可以 重新地合成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程（退火）。

根據(jù)復(fù)性動(dòng)力學(xué)公式我們可以知道什么？

(1)單鏈濃度隨著時(shí)間的增大而減小；

(2)反應(yīng)速率取決于初始的單鏈濃度Co；

(3)以反應(yīng)濃度和COt1/2為座標(biāo)可繪復(fù)性曲線;(4)通過(guò)COt1/2值可測(cè)原核生物基因組的大小;

已知大腸桿菌的基因組為4.2x106bp, COt1/2 = 9M.Sec

則

(5)原核生物基因組大小不同，復(fù)性曲線也不同;(6)可用以區(qū)分真核生物和原核生物基因組。

在復(fù)性反應(yīng)中如何知道單鏈已經(jīng)結(jié)合成雙鏈了呢？可以通過(guò)哪些法來(lái)檢測(cè)？

(1)減色效應(yīng)（hpochromic effcef）

測(cè)定光密度，即OD值(optical density），DNA從單鏈變成雙鏈，OD260減少30%(2)羥基磷灰石柱層析

羥基磷灰石對(duì)雙鏈DNA吸附較牢，不易吸附單鏈。

四、核酸分子雜交（hybridization）※ 雜交形式：

n 液相雜交

n 固相雜交(濾膜雜交)¨1975 E.M.Southern ¨Southern blot

S.S.DNA × S.S.DNA ¨1977.J.C.Alwine ¨Northern blot

S.S.RNA × S.S.DNA ¨1978.Hany Towbin ¨Western blot

Protein(antigen)× antibody ＊固相分子雜交(1975 E.M.Southern)

！復(fù)習(xí)思考題

1、堿基、核苷、核苷酸的化學(xué)組成2、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)

書(shū)寫(xiě)方向

3、Watson ＆ Crick 的Double Helix Model

參數(shù)

大小溝

二級(jí)結(jié)構(gòu)的多態(tài)性

4、影響二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力：

穩(wěn)定因素

不穩(wěn)定因素

5、DNA的不尋常結(jié)構(gòu)：

反向重復(fù)序列

三螺旋DNA

四鏈DNA

6、真核生物的染色體：核小體的組成和組裝

染色體的多級(jí)包裝

7、RNA的種類及其相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能與及應(yīng)用

8、變性：溶解曲線

Tm

影響因素（GC、化學(xué)試劑、鹽、pH）

9、復(fù)性

C0t曲線

C0t（1／2）

10、核酸分子雜交的類型

11、DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)

形成、類型

組蛋白和非組蛋白

第三篇：分子生物學(xué)電子教案第六章

第六章 遺傳重組

1．課程教學(xué)內(nèi)容(1)同源重組(2)位點(diǎn)特異性重組(3)轉(zhuǎn)座重組(4)逆轉(zhuǎn)座子 2．課程重點(diǎn)、難點(diǎn) 幾種重組的機(jī)理。3．課程教學(xué)要求

（1）理解重組產(chǎn)生的遺傳效應(yīng)；（2）掌握不同重組產(chǎn)生的機(jī)理。

一、概述

重組是完整DNA分子的斷裂和重接

1930年，細(xì)胞學(xué)觀察：染色單體斷裂，重接，發(fā)生交換。

1955年，遺傳學(xué)家發(fā)現(xiàn)交換可以發(fā)生在基因內(nèi)部，推測(cè)重組是在復(fù)制時(shí)發(fā)生的，拷貝選擇（copy choice）。

結(jié)論：重組是DNA分子斷裂后重新連接形成的。更進(jìn)一步研究證明末復(fù)制的DNA分子也可以發(fā)生重組。

遺傳重組 廣義地說(shuō)，任何造成基因型變化的基因交流過(guò)程都稱為遺傳重組。狹義上的遺傳重組指涉及到DNA分子內(nèi)斷裂-復(fù)合的基因交流。

根據(jù)對(duì)DNA序列和所需蛋白質(zhì)因子的要求，可以分為四類包括：

– 同源重組（homologous recombination）

– 位點(diǎn)專一性重組（site-specific recombination）

– 轉(zhuǎn)座重組（transposition），被移動(dòng)的DNA片段叫轉(zhuǎn)座子（transposon）– 異常重組

同源重組 發(fā)生在DNA的同源序列之間。真核生物非姊妹染色子體的交換、細(xì)菌及某些低等真核生物的轉(zhuǎn)化、細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、噬菌體的重組都屬于這種類型。大腸桿菌的同源重組需要RecA蛋白。

位點(diǎn)特異性重組 發(fā)生在兩條DNA的特異性位點(diǎn)上，λ噬菌體DNA通過(guò)其attp位點(diǎn)和大腸桿菌DNA的attB 之間的位點(diǎn)特異性重組而實(shí)現(xiàn)整合過(guò)程 轉(zhuǎn)座過(guò)程中，轉(zhuǎn)座成分從染色體的一個(gè)區(qū)段轉(zhuǎn)移到另一個(gè)區(qū)段或從一條染色體的轉(zhuǎn)移到另一條染色體。轉(zhuǎn)座作用既不依靠轉(zhuǎn)座成分和插入?yún)^(qū)段的同源性，又不需要RecA蛋白質(zhì)。由于轉(zhuǎn)座作用總是伴隨著轉(zhuǎn)座成分的復(fù)制，故又稱為復(fù)制重組。

異常重組不需要DNA序列的同源性和RecA蛋白質(zhì)，而且它也不需要轉(zhuǎn)座酶。

二、同源重組的機(jī)制

同源重組的行為本身是DNA序列的交換：兩個(gè)同源的DNA雙螺旋分子相互接近，接觸，然后有關(guān)的部分發(fā)生交換。它的特征是任意一對(duì)同源系列都可以作為底物由有關(guān)的酶催化重組。這些酶對(duì)DNA無(wú)堿基序列的特異性，只要兩個(gè)DNA序列相同或接近相同，就可催化重組。

同源重組發(fā)生在染色體上具有相同或相近序列的DNA區(qū)域 重組的起動(dòng)需要DNA分子上有斷裂或缺口

事實(shí)表明，DNA斷裂能夠大大提高重組率。因此紫外照射、X光和一些能夠使DNA斷裂的化學(xué)物質(zhì)可大大提高重組率。在大腸桿菌中，DNA 聚合酶Ⅰ和連接酶基因的突變也有同樣作用。酵母整合載體，若是線狀則可提高整合率1000倍。

RecA 蛋白使單鏈DNA與染色體上互補(bǔ)序列配對(duì)。RecA蛋白: – 依賴于DNA的水解三磷酸核苷的功能 – 在兩條互補(bǔ)的單鏈間促進(jìn)配對(duì)的功能 – 依賴于ATP和寡聚核苷酸的蛋白水解酶的

Rec A蛋白能專一性地識(shí)別單鏈DNA，使它與同源染色體雙鏈DNA的互補(bǔ)序列退火，替換原來(lái)的互補(bǔ)鏈。

Rec A蛋白以一定比例與單鏈DNA結(jié)合，一般1個(gè)蛋白多肽5個(gè)核苷酸，形成DNA-蛋白絲。在ATP存在時(shí)，Rec A可使雙鏈解旋，形成新的雜種DNA。

在有些噬菌體，如T7和λ噬菌體中，僅有核酸酶和SSB，隨機(jī)碰撞可重組。高等生物的重組需要Rec A蛋白。Rec BCD和其它蛋白在重組中的作用

若沒(méi)有Rec BC，在細(xì)菌接合過(guò)程中重組率可降低100倍，這種復(fù)合酶大約300kd，具有DNA解旋和核酸酶的活性。它可以幫助有游離末端的DNA形成單鏈DNA片段，從而有利于RecA 蛋白作用。它識(shí)別并切割Chi序列：5'GCTGGTGG-3' 在大腸桿菌接合過(guò)程中易形成雙鏈DNA游離末端，在P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)和λDNA侵染的細(xì)胞中RecBC對(duì)重組率影響極大。

一種核酸酶切開(kāi)霍利迪結(jié)合點(diǎn)，從而完成重組。霍利迪結(jié)構(gòu) 它是DNA重組過(guò)程中的一個(gè)中間體，重組時(shí)兩個(gè)DNA雙鏈體以四股DNA在連結(jié)點(diǎn)形成的十字形DNA分子構(gòu)象。

異源雙鏈體(Heteroduplexes)：異源雙鏈體是指重組DNA分子上兩條鏈不完全互補(bǔ)的區(qū)域。

分支遷移（Branch migration）：一旦兩個(gè)重組的DNA分子形成霍利迪結(jié)構(gòu)，交叉連接點(diǎn)很容易像拉鏈一樣移動(dòng)，從而擴(kuò)大異源雙鏈體區(qū)域，這一程 叫分支遷移。

三、位點(diǎn)專一性重組

是指噬菌體基因組插到細(xì)菌的染色體中，這個(gè)過(guò)程也叫整合（integrate），需要噬菌體DNA與細(xì)菌DNA的專一序列。

在位點(diǎn)專一性重組中沒(méi)有DNA的合成，每條DNA鏈上的斷裂和重接十分精確。λ噬菌體的整合和解離

λ 噬菌體：裂解周期和溶源化周期。

附著位點(diǎn)（attachment site，Att）：大腸桿菌23bp；噬菌體 240bp，相同的核心序列。

整合需要整合酶(integrase，int)和一種細(xì)菌蛋白integration Host factor(IHF)；解離需要Xis gene產(chǎn)物，int和IHF。

在溶源lysogenic周期中，噬菌體λ DNA是細(xì)菌染色體的一個(gè)整合部分，成為原噬菌體prophage。

在裂解lytic周期中，λDNA以獨(dú)立的環(huán)狀分子存在于被侵染的細(xì)菌中。兩種狀態(tài)的改變就包括了位點(diǎn)專一性重組。要進(jìn)入溶源狀態(tài)，游離的λDNA必須被整合(integrate)進(jìn)寄主DNA；要從整合的溶源狀態(tài)釋放，進(jìn)入裂解狀態(tài)，原噬菌體DNA必須從染色體上剪切下來(lái)excise。

整合作用 整合與剪切發(fā)生在噬菌體和細(xì)菌的特殊位點(diǎn)上，這個(gè)位點(diǎn)叫附著點(diǎn)attachment site（att）。細(xì)菌的位點(diǎn)叫attB，由BOB’組成。噬菌體的位點(diǎn)叫attP，由POP’組成。序列O是att B和att P的共同序列，叫核心序列core sequence，重組就發(fā)生在這里。側(cè)翼的序列B、B’、P、P’是臂，序列各不相同。原噬菌體由重組產(chǎn)生的新位點(diǎn)界定。左邊的位點(diǎn)叫att L，由BOP’組成，右邊的位點(diǎn)叫att R，由POB’組成。整合作用發(fā)生在att B和att P之間（att B×att P），而剪切作用發(fā)生在att L和attR之間（att L×attR），四、轉(zhuǎn)座子重組（Recombination via transposon）重組不依賴DNA的序列，使一段DNA序列從染色體的一個(gè)位置移動(dòng)到另一個(gè)位置，甚至從一個(gè)染色體移動(dòng)到另一個(gè)染色體，這種重組叫轉(zhuǎn)座重組（transposition），被移動(dòng)的DNA片段叫轉(zhuǎn)座子（transposon）。

轉(zhuǎn)座子（或transposalole elements）：可以轉(zhuǎn)移到新位置的DNA序列。

轉(zhuǎn)座因子可以直接或間接造成基因組重排： ① 直接造成缺失一倒位或序列移位。② 作為小的同源區(qū)域在細(xì)胞同源重組體系作用下，相互重 組造成缺失、插入、倒位和易位(translocation)。1 細(xì)菌中的轉(zhuǎn)座重組

簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子、復(fù)合轉(zhuǎn)座子、轉(zhuǎn)座的機(jī)制、TnA家族的轉(zhuǎn)座子 1）簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子

? 最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子就叫插入序列(Insertion sequences ,IS)。λ:IS1表示IS1插入λ噬菌體的基因組。

? IS序列可以編碼自己轉(zhuǎn)座所需的轉(zhuǎn)座酶.IS兩端帶有反向重復(fù)序列，中間是一個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因，不帶其它標(biāo)記基因。

? 在IS 轉(zhuǎn)座時(shí)，插入位點(diǎn)的DNA序列重復(fù)了(正向重復(fù))。不同IS插入位點(diǎn)不同，但重復(fù)序列大多為5-9bp。

? 每個(gè)插入序列的末端都是短的反向末端重復(fù)序列inverted terminal repeats，兩個(gè)反向末端重復(fù)序列往往很相似但不一定相同。不同IS序列轉(zhuǎn)座率不同，一般每代為10-3—10-4。

? 轉(zhuǎn)座完成后，靶位點(diǎn)形成兩個(gè)拷貝，位于轉(zhuǎn)座子的兩端，形成同向重復(fù)序列direct repeats。

2）復(fù)合轉(zhuǎn)座子Composite Transposons ? 有些轉(zhuǎn)座子除了與轉(zhuǎn)座有關(guān)的功能外，還帶有抗藥性或其它標(biāo)記，這些轉(zhuǎn)座子命名為Tn加數(shù)字。復(fù)合轉(zhuǎn)座子是一種大的轉(zhuǎn)座子，中間區(qū)帶有抗藥標(biāo)記，兩邊各帶一個(gè)由IS因子組成的臂，這兩個(gè)臂可以是同向或反向的。

? 由于IS序列成為復(fù)合轉(zhuǎn)座子的一個(gè)組成部分，所以又把IS序列稱為IS元件module。因?yàn)槊總€(gè)元件都有一對(duì)反向末端重復(fù)，所以整個(gè)復(fù)合轉(zhuǎn)座子的末端也是反向重復(fù)序列。? 轉(zhuǎn)座使靶位點(diǎn)加倍。

? Tn5的兩個(gè)邊界IS50R序列只差一個(gè)堿基，IS50R是有功能的，IS50L無(wú)轉(zhuǎn)座功能

3）TnA家族的轉(zhuǎn)座子

? Tn A家族的轉(zhuǎn)座子不與IS元件復(fù)合，只含有長(zhǎng)度為37－38bp的反向末端重復(fù)。? 這類轉(zhuǎn)座子在靶位點(diǎn)上產(chǎn)生5bp的同向重復(fù)。

? TnA家族轉(zhuǎn)座子的運(yùn)動(dòng)需要轉(zhuǎn)座 酶的作用，解離需要一個(gè)特殊解離位點(diǎn)，這是TnA家族的特征。

? 這類轉(zhuǎn)座子含有3個(gè)基因，beta-內(nèi)酰胺酶，解離酶，轉(zhuǎn)座酶。4）轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移機(jī)制

① 轉(zhuǎn)座子能夠精確的轉(zhuǎn)座，帶著在原來(lái)位置上的所有DNA序列，而不帶任何相鄰序列，這可能就涉及到轉(zhuǎn)座酶能夠準(zhǔn)確地識(shí)別兩個(gè)轉(zhuǎn)座子的末端。② 在目標(biāo)DNA的位置有3-12 個(gè)堿基(決定于轉(zhuǎn)座子)被精確地復(fù)制了，在轉(zhuǎn)座子兩端各有一個(gè)拷貝。所以，在轉(zhuǎn)座子過(guò)程中一定有DNA的合成。③ 雖然大部分轉(zhuǎn)座子可插入基因組任何區(qū)域，但它們的移動(dòng)也不是完全隨機(jī)的，而是更易于插入某些區(qū)段。5）轉(zhuǎn)座作用的遺傳效應(yīng)

? 轉(zhuǎn)座引起插入突變 各種IS, Tn 都可以引起插入突變

? 轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新基因 如果轉(zhuǎn)座子上帶有抗藥性基因，它一方面造成靶DNA序列上的插入突變，同時(shí)也使這個(gè)位點(diǎn)帶有抗藥性

? 轉(zhuǎn)座產(chǎn)生染色體畸變 當(dāng)復(fù)制性轉(zhuǎn)座發(fā)生在縮主染色體DNA原有的位置附近時(shí)，往往導(dǎo)致轉(zhuǎn)座子兩個(gè)拷貝的重組，引起DNA的缺失和倒位。當(dāng)重組發(fā)生在兩個(gè)正向重復(fù)轉(zhuǎn)座區(qū)之間，就導(dǎo)致宿主染色體缺失。如果重組發(fā)生在兩個(gè)反向重復(fù)轉(zhuǎn)座區(qū)，則引起染色體DNA 倒位。? 轉(zhuǎn)座引起生物的進(jìn)化 6）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的特征

? 轉(zhuǎn)座不依賴于靶序列的同源性 ? 轉(zhuǎn)座后靶序列重復(fù) ? 轉(zhuǎn)座子的插入具有專一性 ? 轉(zhuǎn)座子具有排它性 ? 轉(zhuǎn)座具有極性效應(yīng) ? 活化鄰近的的沉默基因 ? 區(qū)域性優(yōu)先 2真核生物中的轉(zhuǎn)座 1）玉米的轉(zhuǎn)座子

四十年代玉米遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在體細(xì)胞分裂過(guò)程中所發(fā)生的變異是由一些控制因子(controlling elements)決定的，這些因子可以從一個(gè)位置移動(dòng)到另外一個(gè)位置。這些控制因子是由McClintock 鑒定的，現(xiàn)在都可以認(rèn)為是轉(zhuǎn)座子。

? 自主成分autonomous elements：它們具備使自身切除或轉(zhuǎn)座的能力，它們可在任意位點(diǎn)插入并產(chǎn)生不穩(wěn)定的或可變化的等位基因。? 非自主成分nonautonomous elements：它們只有在同家族的自主成分存在時(shí)才能切除或轉(zhuǎn)座，它們自身很穩(wěn)定，不能單獨(dú)移動(dòng)。非自主成分由自主成分衍生而來(lái)，當(dāng)自主成分丟失了某些對(duì)轉(zhuǎn)座必需的功能后，就形成了非自主成分。

玉米有幾組不同的控制因子，每組又都有自主型和非自主型（autonomous and nonautonomous elements）。

2）果蠅的轉(zhuǎn)座子

果蠅的P轉(zhuǎn)座子引起的雜種不育

3）逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子

? 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座：將從DNA到DNA的轉(zhuǎn)移過(guò)程稱為轉(zhuǎn)座，從DNA到RNA到DNA的轉(zhuǎn)移過(guò)程稱為逆轉(zhuǎn)座子。

? 經(jīng)RNA中間體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座是真核生物所特有的過(guò)程。逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠?qū)NA病毒基因組的DNA拷貝整合到宿主細(xì)胞染色體中。

? 逆轉(zhuǎn)錄子：一類移動(dòng)因子在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中需要以RNA為中間體，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄再分散到基因組中。? 酵母的Ty轉(zhuǎn)座子 ? 果蠅的copia轉(zhuǎn)座子 逆轉(zhuǎn)錄子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：

? 逆轉(zhuǎn)錄子轉(zhuǎn)座關(guān)鍵酶是逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶 ? 逆轉(zhuǎn)錄子自身編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和（或）整合酶 ? 結(jié)構(gòu)特征：

具有與逆轉(zhuǎn)錄病毒類似的長(zhǎng)末端重復(fù)，并有g(shù)ag和pol基因。如酵母的Ty, 果蠅的copia和gypsy,人類的THEI。不具有LTR，但有3polyA,中心區(qū)含有g(shù)ag，pol類似序列。如果蠅I因子，哺乳類的長(zhǎng)分散因子L1.

第四篇：分子生物學(xué)電子教案第九章剖析

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第九章 分子生物學(xué)研究方法

1．課程教學(xué)內(nèi)容

(1)核酸技術(shù)1—基本操作(2)核酸技術(shù)2—克隆技術(shù)(3)核酸技術(shù)3—測(cè)序

(4)基因表達(dá)和表達(dá)分析基因定點(diǎn)誘變(5)蛋白質(zhì)與核酸的相互作用(6)其他（熱點(diǎn)）技術(shù) 2．課程重點(diǎn)、難點(diǎn)

基因克隆技術(shù)、雜交技術(shù)、測(cè)序技術(shù)、蛋白質(zhì)與核酸的相互作用檢測(cè)技術(shù) 3．課程教學(xué)要求

掌握基因克隆技術(shù)、雜交技術(shù)、測(cè)序技術(shù)、蛋白質(zhì)與核酸的相互作用檢測(cè)等各種技術(shù)的原理。

本章內(nèi)容

? 核酸的凝膠電泳 ? DNA分子的酶切割 ? 核酸的分子雜交 ? 基因擴(kuò)增

? 基因的克隆和表達(dá) ? 細(xì)菌的轉(zhuǎn)化 ? DNA核苷酸序列分析 ? 蛋白質(zhì)的分離與純化

? 研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法

一、核酸的凝膠電泳

基本原理：當(dāng)一種分子被放置在電場(chǎng)當(dāng)中時(shí)，它們會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。電泳的遷移率：電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，它同電場(chǎng)的強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷成正比。

由于在電泳中使用了一種無(wú)反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，如瓊脂糖和丙烯酰胺，從而降低了對(duì)流運(yùn)動(dòng)，故電泳的遷移率又同分子的摩擦系數(shù)成反比。在生理?xiàng)l件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，是呈離子化狀態(tài)的。從這個(gè)意義上講，DNA和RNA的多核苷酸鏈可叫做多聚陰離子，因此，當(dāng)核酸分子放置在電場(chǎng)中時(shí)，它就會(huì)向正極移動(dòng)。

在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的這種遷移率，取決于核酸分子本身大小和構(gòu)型。分子量較小的DNA 分子，比分子量較大的 分子，具有較緊密的構(gòu)型，所以其電泳遷移率也就比同等分子量的松散型的開(kāi)環(huán)DNA分子或線性DNA分子要快些。

Gel matrix(膠支持物)is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose(瓊脂糖):(1)a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kb DNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide(EB 溴化乙錠)Polyacrylamide(聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differ from each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range(1 to a few hundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis(脈沖電泳)(1)The electric field is applied in pulses that are oriented orthogonally(直角地)to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as well as to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up to several Mb in length.二、DNA分子的酶切割

Restriction endonucleases(限制性內(nèi)切酶)cleave DNA molecules at particular sites Restriction endonucleases(RE)are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize(識(shí)別)short(4-8bp)target sequences that are usually palindromic(回文結(jié)構(gòu)), and cut(切割)at a defined sequence within those sequences.e.g.EcoRI The random occurrence of the hexameric(六核苷酸的)sequence: 1/4096(4-6=1/46)(1)Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2)Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3)Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends(平末端), sticky/staggered ends(粘性末端).(4)Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子雜交

原理：帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。如果彼此退火的核酸來(lái)自不同的生物有機(jī)體，那么如此形成的雙鏈分子就叫做雜種核酸分子。

在大多數(shù)的核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過(guò)凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過(guò)毛細(xì)血管作用或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地吸印上去。

常用的濾膜有尼龍膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙和二乙氨基乙基纖維素濾膜

核酸雜交通常包括兩個(gè)步驟：

第一，將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個(gè)過(guò)程稱為核酸印跡轉(zhuǎn)移

第二，將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。Southern Blotting：

根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的 DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過(guò)同標(biāo)記的單鏈DNA 或RNA探針的雜交作用檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做DNA 印跡雜交技術(shù)。是由E.Southern于1975年首先設(shè)計(jì)出來(lái)的，故又叫做Southern DNA印跡技術(shù)。Northern Blotting 1979年，J.C.Alwine 等人發(fā)展出的一種用于RNA雜交的新方法。將電泳凝膠中的RNA轉(zhuǎn)移到疊氮化的或其它化學(xué)修飾的活性濾紙上，通過(guò)共價(jià)交聯(lián)作用而使它們永久地結(jié)合在一起。稱為Northern Blotting 將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移并結(jié)合到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射同位素標(biāo)記的特定蛋白的抗體反應(yīng)，這種技術(shù)叫做Western Blotting.定義：將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。

斑點(diǎn)印跡雜交（dot Blotting）：基本原理和操作步驟是通過(guò)抽真空的方式將加在多孔過(guò)濾進(jìn)樣器上的核酸樣品，直接轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾s交濾膜上，然后同Southern 印跡一樣的方式同核酸探針?lè)肿与s交。菌落（噬菌斑）雜交：

1975 年，Mgrunstein和D Hogness根據(jù)檢測(cè)重組體DNA分子的核酸雜交技術(shù)原理，對(duì)Southern 吸引技術(shù)做了一些修改，發(fā)展出了一種雜交技術(shù)。

在1977年，W.D.Benton和R.W.Davis又發(fā)展出了與此類似的篩選含有克隆DNA噬菌體的雜交技術(shù)。

菌落雜交或噬菌斑雜交有時(shí)也叫做原位雜交，因?yàn)樯L(zhǎng)在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑，按其原來(lái)的位置不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交。

四、基因擴(kuò)增

基因擴(kuò)增的五個(gè)方面的內(nèi)容：

第一，在體外應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）技術(shù)和合成的寡核苷酸引物，導(dǎo)致特定基因的拷貝數(shù)發(fā)生快速大量的擴(kuò)增。

第二，通過(guò)體外 DNA重組，將目的基因插入到高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體分子上，并轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞，于是在體內(nèi)隨著載體分子的大量復(fù)制，目的基因的拷貝數(shù)也得到了有效的擴(kuò)增。

第三，在有些外界環(huán)境因子的脅迫下，真核生物的有關(guān)細(xì)胞被誘發(fā)產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，從而導(dǎo)致相應(yīng)的保衛(wèi)基因的產(chǎn)生和明顯的擴(kuò)增。

第四，程序基因擴(kuò)增

第五，在生物的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生的基因加倍與擴(kuò)增，結(jié)果使相關(guān)基因在基因組上聚集成簇。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：是美國(guó)Cetus公司人類遺傳研究室的科學(xué)家K B Mullis于1983年發(fā)明的一種在體外快速擴(kuò)增特定基因 或DNA序列的方法。

PCR技術(shù) 的 基本原理：首先使雙鏈的DNA分子變性為單鏈DNA分子

然后DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的四種脫氧核苷三磷酸合成新生 DNA 互補(bǔ)鏈。

DNA聚合酶需要有一小段雙鏈DNA來(lái)啟動(dòng)新鏈的合成。因此新合成的DNA鏈的起點(diǎn)，是由加入在反應(yīng)混合物中的一對(duì)寡核苷酸引物在模板DNA鏈兩端的退火決定的。在為每一條鏈均提供一段寡核苷酸引物的情況下，兩條單鏈都可以作為合成新生互補(bǔ)鏈的模板。

在每一條新合成的DNA鏈上都具有新的引物結(jié)合位點(diǎn)，然后反應(yīng)混合物經(jīng)再次加熱使新舊鏈分開(kāi)，并加入下輪的反應(yīng)循環(huán)，即引物雜交、DNA合成和鏈的分離。

PCR反應(yīng)的最后結(jié)果是，經(jīng)過(guò)幾次循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)，即兩條引物結(jié)合位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的拷貝數(shù)2n.PCR技術(shù)的兩個(gè)特點(diǎn)：第一，能夠知道特定DNA序列的合成；第二，特定的DNA區(qū)段得到了迅速大量的擴(kuò)增。例如，經(jīng)過(guò)30次循環(huán)，便可使靶DNA得到109 倍的擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)及多次重復(fù)進(jìn)行的溫度周期，而每一個(gè)溫度循環(huán)周期均是由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等三個(gè)步驟：首先是將含有待擴(kuò)增DNA樣品的反應(yīng)混合物放置在高溫環(huán)境加熱1分鐘，使雙鏈 DNA發(fā)生變性，分離出單鏈的模板DNA；然后降低反應(yīng)溫度使專門設(shè)計(jì)的一對(duì)寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA發(fā)生退火作用，結(jié)合在靶DNA區(qū)段兩端的互補(bǔ)序列位置上；最后，將反應(yīng)混合物的溫度上升到72度左右保溫1.5分鐘,這時(shí) 在DNA 聚合酶的作用下，鏈得到延伸。寡核苷酸引物：

引物長(zhǎng)度：通常在15-30mers 簡(jiǎn)并引物：是一類由寡核苷酸組成的混合物，彼此僅有一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的差異。嵌套引物

Taq DNA聚合酶：Klenow片段熱敏感，易失活；反應(yīng)溫度低，出現(xiàn)錯(cuò)配堿基；1986年，從75度的熱泉中的細(xì)菌中分離純化出Taq酶。與大腸桿菌DNA聚合酶相比，Taq酶使PCR的特異性和敏感性高

PCR 技術(shù)的應(yīng)用：基因組克隆、反向PCR和染色體步移、不對(duì)稱 PCR 與DNA序列測(cè)定、RT-PCR 與RNA分析、基因的體外誘變、基因組的比較研究

五、基因的克隆和表達(dá)

Processes(過(guò)程)of DNA cloning：

1）Form the recombinant DNA molecules(重組DNA)by inserting your interested DNA fragments into a proper vector(載體).(Require restriction enzymes and ligase)2）Transform(轉(zhuǎn)化)the recombinant DNA molecules into competent cells(感受態(tài)細(xì)胞).3）Propagation of the cells containing the recombinant DNA to form a clone(克隆), a set of identical cells containing the same recombinant DNA.4）Select the desired clones using the selective marker.5）Host organisms/cells（宿主）: where the plasmids get multiplied and propagated faithfully, which is crucial for DNA cloning.---Prokaryotic host(原核宿主): E.coli(most cases)---Eukaryotic host（真核宿主）: Yeast Saccharomyces cerevisiae(large fragments of human genome)General features of a Vector（作為載體的一般特征）：1）They contain an origin of replication and can autonomously replicating DNA independent of host’s genome.2）Easily to be isolated from the host cell.Most are circular, some are linear(e.g.YAC vector).3）Contains at least one selective marker, which allows host cells containing the vector to be selected amongst those which do not.4）Contains a multiple cloning site(MCS)to be cut by restriction enzymes for DNA manipulation.Cloning vectors(克隆載體): allowing the exogenous DNA to be inserted, stored, and manipulated at DNA level.E.coli cloning vector(circular): plasmids(質(zhì)粒)、bacteriophages(l and M13)(噬菌體)、plasmid-bacteriophage l hybrids(cosmids)(考斯質(zhì)粒－質(zhì)粒和噬菌體雜和體)。

Yeast cloning vector: yeast artificial(Linear)。

Plasmids: small, extrachromosomal circular molecules, from 2 to ~200 kb in size, which exist in multiple copies within the host cells.Contain an origin of replication（復(fù)制起點(diǎn)）, at least one selective marker（選擇標(biāo)記）and multiple cloning site（多克隆位點(diǎn)）.Example of selective marker: ampr gene encoding the enzyme b-lactamse which degrades penicillin antibiotics such as ampicillin.（抗氨芐）The commonly used plasmid are small in size(~ 3 kb)Libraries of DNA molecules can be created by cloning(Genomic library and cDNA library)：

A DNA library(DNA文庫(kù))is a population of identical vectors that each contains a different DNA insert.Genomic Library(基因組文庫(kù)): the DNA inserts in a DNA library is derived from restriction digestion or physical shearing of the genomic DNA.cDNA library(cDNA文庫(kù)): the DNA inserts in a DNA library is converted from the mRNAs of a tissue, a cell type or an organism.cDNA stands for the DNA copied from mRNA.chromosomes(YACs，酵母人工染色體)cDNA library generation：The mRNAs are firstly reverse transcript into cDNA, and these cDNA, both full length and partial, are cloned to make the cDNA library.Colony screening ：

1）Antibiotic screening(抗生素選擇)： only the recombinant plasmids grow on the antibiotic-containing plate.2）Blue-white screening(藍(lán)白斑選擇): DNA insertion in the vector shuts down the LacZ gene expression, and turns the colony（菌落）to white.3）Colony hybridization screening(菌落雜交篩選)from a library.Analysis of a clone ：1）Restriction mapping: digestion of the plasmid prepared from a clone with restriction enzymes to investigate if the interested DNA is inserted the recombinant plasmid.2）Sequencing the cloned DNA to see if the inserted DNA maintains the correct sequence.六、細(xì)菌的轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化：指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳性改變的生命過(guò)程。

感受態(tài)：處于感受態(tài)的細(xì)胞，某種蛋白能夠同核酸作用的復(fù)合形式。

大腸桿菌的轉(zhuǎn)化：1）用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞，制備感受態(tài)細(xì)胞；2）將正在生長(zhǎng)的大腸桿菌在0度下加入到低滲的氯化鈣溶液中，便會(huì)造成細(xì)胞膨脹（形成原生質(zhì)球）；3）同加入在轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒DNA形成一種粘著在細(xì)胞表面上的對(duì)Dnase抗性的復(fù)合物。4）轉(zhuǎn)移到42 度下作短暫的熱應(yīng)激，這種復(fù)合物便會(huì)被細(xì)菌吸收；5）在富裕培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段時(shí)間，再涂布在選擇性的培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率

影響細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率的因素：DNA濃度、純度和構(gòu)型，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生理狀態(tài)及其在 CaCl2處理和貯藏之后的成活率，以及轉(zhuǎn)化的環(huán)境條件（溫度、PH值、離子濃度）。

環(huán)型的質(zhì)粒DNA分子進(jìn)入細(xì)胞，能夠抗御細(xì)胞中固有的核酸酶的作用，而線性的DNA分子，則對(duì)自由末端的降解作用是極其敏感的，環(huán)型DNA比線性的高出10-100倍。

對(duì)于同樣的轉(zhuǎn)化DNA而言，大分子量的轉(zhuǎn)化效率要比小分子量的低一些。以每微克質(zhì)粒DNA 出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化子菌落數(shù)表示的轉(zhuǎn)化頻率。

應(yīng)用與大腸桿菌轉(zhuǎn)化程序相類似的方法，也可以成功地轉(zhuǎn)化各種真核細(xì)胞，將酵母用酶處理消化細(xì)胞壁之后，就會(huì)變成原生質(zhì)體

在具有PEG和CaCl2的轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中，讓酵母原生質(zhì)體同轉(zhuǎn)化DNA接觸，那么由于原生質(zhì)體在生理上得到恢復(fù)并再生出細(xì)胞壁后，將其涂布在選擇性培養(yǎng)基上便可以鑒定出轉(zhuǎn)座子。

七、DNA核苷酸序列分析

1、Sanger 雙脫氧鏈終止法：

利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測(cè)定DNA核苷酸順序的方法，是由英國(guó)科學(xué)家 Sanger 等1977年發(fā)明的。

其基本原理是利用了DNA聚合酶所具有的兩種酶催化反應(yīng)的特性：第一，DNA聚合酶能夠利用單鏈的DNA作模板，合成出其互補(bǔ)鏈；第二，DNA聚合酶能夠利用2 ’,3’-雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之參入到寡核苷酸鏈的3’末端，從而終止 鏈的生長(zhǎng)。2）Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法：

原理：用化學(xué)試劑處理具末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割，由此產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的 鏈的反應(yīng)混合物，經(jīng)凝膠電泳按大小分離和放射自顯影后，便可根據(jù)x光片底版上所顯現(xiàn)的相應(yīng)譜帶，直接讀出待測(cè)DNA片段的核苷酸序列。3）DNA雜交測(cè)序：

步驟：將待測(cè)定的靶 DNA分子同一組已知其核苷酸順序的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交；對(duì)能夠同靶 DNA分子形成完全雙鏈體分子之間的堿基重疊關(guān)系比較分析，并據(jù)此推算 靶DNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)。

八、蛋白質(zhì)相關(guān)技術(shù)

Protein purification(蛋白質(zhì)純化)、Affinity chromatography can facilitate more rapid protein purification(親和層析純化)、Protein separation by PAGE gel electrophoresis(蛋白質(zhì)分離)and identification by Western analysis、Protein sequencing(蛋白質(zhì)測(cè)序)、Proteomics(蛋白質(zhì)組學(xué))。

九、研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法 凝膠阻滯試驗(yàn) DNaseI足跡實(shí)驗(yàn) 甲基化干擾實(shí)驗(yàn)

凝膠阻滯試驗(yàn)：又叫 DNA遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)（DNA mobility shift assay）,是1980年代初出現(xiàn)的用于體外研究與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的電泳技術(shù)。

當(dāng)DNA 分子結(jié)合上一種蛋白質(zhì),由于分子量加大在凝膠中的遷移作用便會(huì)受到阻滯，朝正極移動(dòng)的距離相應(yīng)的縮短了。所以當(dāng)特定的 DNA片段同細(xì)胞提取物混合之后，如果其在凝膠中的距離縮小了說(shuō)明它同細(xì)胞提取物中的某種特殊的蛋白質(zhì)分子發(fā)生了結(jié)合作用。

DNaseI足跡實(shí)驗(yàn)

是一類用于檢測(cè)與特定的蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列及特性的專門技術(shù) 足跡實(shí)驗(yàn)的一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)是可以形象地展示出一種特殊的蛋白因子同特定 DNA 片段之間的結(jié)合區(qū)域。

甲基化干擾實(shí)驗(yàn)（methylation interference assay）

根據(jù)DMS能夠使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理還設(shè)計(jì)出另一種研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法。

甲基化干擾試驗(yàn)的具體操作：先用DMS處理靶DNA，并控制反應(yīng)條件，使之達(dá)到平均每條DNA分子只有一個(gè)G殘基被甲基化；而后將這些局部甲基化的DNA群體同含有DNA結(jié)合蛋白的適當(dāng)?shù)募?xì)胞提取物一道溫育，并做凝膠阻滯試驗(yàn)。

第五篇：分子生物學(xué)電子教案第三章

第三章 基因的結(jié)構(gòu)和功能

第3章 基因與基因組的結(jié)構(gòu)

1．主要內(nèi)容

1）斷裂基因 構(gòu)成 性質(zhì) 2）重疊基因 種類 3）C值矛盾

4）原核生物與真核生物基因組的區(qū)別 5）真核生物染色體的結(jié)構(gòu)

6）真核生物DNA序列的4種類型

7）基因家族、基因簇、衛(wèi)星DNA、分散重復(fù)DNA 序列 8）人類基因組計(jì)劃 2．教學(xué)要求

1)掌握基因，斷裂基因，順?lè)醋樱珻值矛盾，重疊基因，基因家族，重復(fù)序列，衛(wèi)星DNA等基本概念；

2)熟悉原核生物和真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與功能； 3)了解人類基因組的重復(fù)順序、人類基因組計(jì)劃。第1節(jié) 基因的概念 第2節(jié) 基因命名簡(jiǎn)介

第3節(jié) 真核生物的斷裂基因

第4節(jié) 基因及基因組的大小與C值矛盾 第5節(jié) 重疊基因 第6節(jié) 基因組

第7節(jié) 真核生物DNA序列組織 第8節(jié) 基因家族

第9節(jié) 人類基因組研究進(jìn)展

第1節(jié) 基因的概念

基因：帶有特定遺傳信息的核酸分子片段。包括?

結(jié)構(gòu)基因：編碼蛋白質(zhì) tRNA rRNA 調(diào)控基因：

基因研究的發(fā)展 染色體 分子 ? 反向生物學(xué)

基因位于染色體和細(xì)胞器的DNA分子上? ? 基因和順?lè)醋?/p>

? 1955，Benzer用以表述 T4 具溶菌功能的區(qū)的2個(gè)亞區(qū): rⅡA rⅡB ? 現(xiàn)代分子生物學(xué)文獻(xiàn)中，順?lè)醋雍突蜻@兩個(gè)術(shù)語(yǔ)互相通用。第2節(jié) 基因命名簡(jiǎn)介

? 表示基因 3個(gè)小寫(xiě)斜體字母，lac ? 表示基因座 3個(gè)小寫(xiě)斜體字母 + 1個(gè)大寫(xiě)斜體字母。lacZ ? 表示質(zhì)粒

自然質(zhì)粒 3 個(gè)正體字母，首字母大寫(xiě)

重組質(zhì)粒 在2個(gè)大寫(xiě)字母前面加小寫(xiě)p ? 基因?yàn)樾斌w，蛋白質(zhì)為正體 ? 人類基因?yàn)榇髮?xiě)斜體

第3節(jié) 真核生物的斷裂基因 ?

一、割裂基因的發(fā)現(xiàn)

? 1977，通過(guò)成熟mRNA（或cDNA）與編碼基因的DNA雜交試驗(yàn)而發(fā)現(xiàn)

? 真核生物的基因是不連續(xù)的，大大改變了原來(lái)對(duì)基因結(jié)構(gòu)的看法，現(xiàn)在知道大多數(shù)真核生物的基因都是不連續(xù)基因或割裂基因(split gene)。

? 割裂基因的概念——是編碼序列在DNA分子上不連續(xù)排列而被不編碼的序列所隔開(kāi)的基因。? 割裂基因的構(gòu)成

? 構(gòu)成割裂基因的DNA序列被分為兩類：

? 基因中編碼的序列稱為外顯子(exon)，外顯子是基因中對(duì)應(yīng)于信使RNA序列的區(qū)域； ? 不編碼的間隔序列稱為內(nèi)含子(intron)，內(nèi)含子是從信使RNA中消失的區(qū)域。

? 割裂基因由一系列交替存在的外顯子和內(nèi)含子構(gòu)成，基因兩端起始和結(jié)束于外顯子，對(duì)應(yīng)于其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的5’和3’端。如果一個(gè)基因有n個(gè)內(nèi)含子，則相應(yīng)地含有n+1個(gè)外顯子。

割裂基因的性質(zhì)?

? Splitting Gene 的普遍性 ? 外顯子和內(nèi)含子各有特點(diǎn) ? Splitting gene 概念的相對(duì)性 Splitting Gene 的普遍性?

a)真核生物（Eukaryots）中 ? 絕大部分結(jié)構(gòu)基因

? tDNA, rDNA ? mtDNA, cpDNA b)原核生物（Prokaryots）中 ? SV40 大T 抗原gene ? 小t 抗原 gene

? Splitting gene 并非真核生物所特有

外顯子和內(nèi)含子各有特點(diǎn)?

? 割裂基因的外顯子在基因中的排列順序和它在成熟mRNA產(chǎn)物中的排列順序是相同的；

? 某種割裂基因在所有組織中都具有相同的內(nèi)含子成分；

? 核基因的內(nèi)含子通常在所有的可讀框中都含有無(wú)義密碼子(nonsense codon)，因此一般沒(méi)有編碼功能。

? 內(nèi)含子上發(fā)生的突變不能影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，所以其突變往往對(duì)生物體是沒(méi)有影響的；

? 但也有例外，例如一些發(fā)生在內(nèi)含子上的突變可通過(guò)抑制外顯子的相互剪接阻止信使RNA的產(chǎn)生。

? 利用結(jié)構(gòu)基因的特殊DNA限制片段作為探針，我們可以檢測(cè)基因組中與之有親緣關(guān)系的序列，結(jié)果表明一個(gè)基因的外顯子常與其他基因的外顯子有親緣關(guān)系。

? 兩個(gè)相關(guān)基因內(nèi)含子之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如其外顯子之間的親緣關(guān)系緊密。? 這是因?yàn)樵谶M(jìn)化過(guò)程中，相關(guān)基因的內(nèi)含子比外顯子變化得更快。

Splitting gene 概念的相對(duì)性? a)Intron 并非―含而不露‖ Yeast 細(xì)胞色素b基因 Intron II 編碼成熟酶 b)Exon 并非―表里如一‖

人類尿激酶原基因 Exon I 不編碼 氨基酸序列 c)并非真核生物所有的結(jié)構(gòu)基因均為splitting gene

Histone gene family 干擾素

Yeast 中多數(shù)基因（ADH…）

第4節(jié) 基因及基因組的大小與C值矛盾

? 由于割裂基因的存在，人們認(rèn)識(shí)到基因比實(shí)際編碼蛋白質(zhì)的序列要大得多。? 外顯子的大小與基因的大小沒(méi)有必然的聯(lián)系。

? 不同種類的生物體中外顯子的大小并沒(méi)有明顯的不同，基因可能是由一些小的、編碼較小的獨(dú)立蛋白質(zhì)分區(qū)的單位在進(jìn)化過(guò)程中加合起來(lái)的。

基因的大小取決于它所包含的內(nèi)含子的長(zhǎng)度?

? 內(nèi)含子之間有很大不同，它們的大小從200個(gè)堿基對(duì)左右到上萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)。在一些極端的例子里，甚至有50-60 kb的內(nèi)含子。

? 由于基因的大小取決于內(nèi)含子的長(zhǎng)度和數(shù)目，導(dǎo)致酵母和高等真核生物的基因大小有很大的不同。? 大多數(shù)酵母基因小于2 kb，很少有超過(guò)5 kb的。

? 與此相反，在高等的真核生物中，開(kāi)始出現(xiàn)長(zhǎng)的基因，蠅類和哺乳動(dòng)物基因很少小于2 kb，大多數(shù)長(zhǎng)度在5~100 kb之間。

? 但當(dāng)基因的長(zhǎng)度大到一定程度后，DNA的復(fù)雜性與生物體的復(fù)雜性之間開(kāi)始失去必然的聯(lián)系。? 例如雖然屬于同一個(gè)門，果蠅細(xì)胞的DNA總量較小而家蠅細(xì)胞的DNA總量卻是它的6倍。

基因組?

? 狹義：?jiǎn)伪扼w細(xì)胞中的全套染色體（人：22條常染色體 + X，Y + 線粒體DNA）。? 廣義：一物種的全部遺傳物質(zhì)及其攜帶的遺傳信息。

基因組大小與C值矛盾?

? 一個(gè)單倍體基因組的全部DNA含量總是恒定的。這是物種的一個(gè)特征，通常稱為該物種的C值。? 不同物種的C值差異很大，最小的枝原體只有直106bp，而最大的如某些顯花植物和兩棲動(dòng)物可達(dá)lO11bp。

Range of genome size in different phyla門

? 由圖表可見(jiàn)，隨著生物的進(jìn)化，生物體的結(jié)構(gòu)和功能越來(lái)越復(fù)雜，其C值就越大，例如真菌和高等植物同屬于真核生物，而后者的C值就大得多。這一點(diǎn)是不難理解的，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)和功能越復(fù)雜，需要的基因產(chǎn)物的種類越多，也就是說(shuō)需要的基因越多，因而C值越大。

? 然而另一方面，隨著進(jìn)一步的進(jìn)化，生物體復(fù)雜性和DNA含量之間的關(guān)系變模糊了，出現(xiàn)了很多令人不解的現(xiàn)象。一些生物類群基因組大小的變化范圍很窄，而另一些類群的變化范圍則很寬。

? 突出的例子是兩棲動(dòng)物，C值小的可以低至109bp以下，C值大的可以高達(dá)1011bp。而哺乳動(dòng)物的C值均為109bp的數(shù)量級(jí)。人們很難相信不同的兩棲動(dòng)物，所需基因的數(shù)量會(huì)有100倍的差別，而且兩棲動(dòng)物的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)比哺乳動(dòng)物更復(fù)雜。

? 由于人們無(wú)法用已知功能來(lái)解釋基因組的DNA含量，所以產(chǎn)生了C值矛盾(C value paradox，又稱C值悖理)。

? 它表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一個(gè)方面是，與預(yù)期的編碼蛋白質(zhì)的基因的數(shù)量相比，基因組DNA的含量過(guò)多。另一個(gè)方面是一些物種之間的復(fù)雜性變化范圍并不大，但是C值卻有很大的變化范圍。這些問(wèn)題的解決有待于進(jìn)一步的研究。

第5節(jié) 重疊基因

蓮人在綠楊津? 采 一 玉漱聲歌新闕

采蓮人在綠楊津，在綠楊津一闕新；?

一闕新歌聲漱玉，歌聲漱玉采蓮人。

一、原核生物的重疊基因(overlapping gene)? 在細(xì)胞基因中，一般一段DNA序列只以三種蛋白質(zhì)可讀框的一種被閱讀，但是在一些病毒或線粒體基因中，兩個(gè)鄰近的基因以一種巧妙的方式發(fā)生重疊，并以不同的可讀框被閱讀并表達(dá)，因此一段相同的DNA序列可以編碼兩個(gè)非同源蛋白質(zhì)。

φXl74的DNA序列組織上有重疊基因(overlap-ping gene)和基因內(nèi)基因

重疊基因有以下幾種情況：

①一個(gè)基因完全在另一個(gè)基因內(nèi)部 如：B和A＊ E和D

其讀碼結(jié)構(gòu)互不相同 重疊基因

基因內(nèi)基因 部分重疊基因 一個(gè)堿基重疊

二、真核生物的重疊基因

? 通常割裂基因的每個(gè)外顯子編碼一段單一的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于整個(gè)蛋白質(zhì)上的相應(yīng)部分，而內(nèi)含子不在最終的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中表達(dá)，二者的作用是迥然不同的。但是有些基因中內(nèi)含子和外顯子的定義是相對(duì)的，與它表達(dá)的途徑有關(guān)。

? 在這些基因中，選擇性的基因表達(dá)模式引起了外顯子連接途徑的轉(zhuǎn)變。

? 一個(gè)特定的外顯子可能選擇性地與不同的外顯子連接形成信使RNA。

? 這種選擇性形式產(chǎn)生的兩種蛋白質(zhì)中，一部分相同而其他部分不同。一段區(qū)域以一種途徑表達(dá)時(shí)作為外顯子，而以另一種途徑表達(dá)時(shí)作為內(nèi)含子。

? 因?yàn)榇藭r(shí)一段DNA序列通常以多種方式起作用，所以不能被簡(jiǎn)單地稱為外顯子或內(nèi)含子。

第6節(jié) 基因組

一、原核生物的染色體基因組

二、真核生物基因組

一、原核生物的染色體基因組

（一）細(xì)菌染色體基因組結(jié)構(gòu)的一般特點(diǎn)

1.細(xì)菌的染色體基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成，細(xì)菌的染色體相對(duì)聚集在一起，形成一個(gè)較為致密的區(qū)域，稱為類核（nucleoid）。類核無(wú)核膜與胞漿分開(kāi)，類核的中央部分由RNA和支架蛋白組成，外圍是雙鏈閉環(huán)的DNA超螺旋。染色體DNA通常與細(xì)胞膜相連，連接點(diǎn)的數(shù)量隨細(xì)菌生長(zhǎng)狀況和不同的生活周期而異。Fig.Typical bacterial cell E.coli genome is a single double-stranded DNA molecule of 1.? 6 mm.m in length? But E.coli is only ~ 2 ?

DNA is ~ 1000 larger than? the size of the cell!This is achieved by super-coiling the DNA.?

DNA? gyrase旋轉(zhuǎn)酶 introduces negative-superhelical twists into the DNA.The degree of supercoiling of the chromosome is strictly regulated.Fig.The structure of E.coli nucleoid(圖大腸桿菌擬核的結(jié)構(gòu))

2.具有操縱子(trnascriptional operon)結(jié)構(gòu), 其中的結(jié)構(gòu)基因?yàn)槎囗樂(lè)醋?polycistron)，即數(shù)個(gè)功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，受同一個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)。數(shù)個(gè)操縱子還可以由一個(gè)共同的調(diào)節(jié)基因（regulatorygene）即調(diào)節(jié)子（regulon）所調(diào)控。

X174? D-E-J-F-G-H mRNA 外殼蛋白J、F、G、H 組裝蛋白D 裂解蛋白E

E.coli 色氨酸操縱子 9個(gè)順?lè)醋?9個(gè)酶

真核很少，如18s 5.8s 及28s rRNA 基因

3.在大多數(shù)情況下，結(jié)構(gòu)基因在細(xì)菌染色體基因組中都是單拷貝。4.不編碼的DNA部份所占比例比真核細(xì)胞基因組少得多。

5.具有編碼同工酶的同源基因（isogene）例如，在大腸桿菌基因組中有兩個(gè)編碼分支酸（chorismicacid）變位酶的基因，兩個(gè)編碼乙酰乳酸（acetolactate）合成酶的基因。

6.細(xì)菌基因組編碼順序一般不會(huì)重疊，和病毒基因組不同的。

7.在DNA分子中具有各種功能的識(shí)別區(qū)域 如復(fù)制起始區(qū)OriC，復(fù)制終止區(qū)TerC,轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)和終止區(qū)等。這些區(qū)域往往具有特殊的順序，并且含有反向重復(fù)順序。

8.在基因或操縱子的終末往往具有特殊的終止順序,它可使轉(zhuǎn)錄終止和RNA聚合酶從DNA鏈上脫落。例如大腸桿菌色氨酸操縱子后尾含有40bp的GC豐富區(qū)，其后緊跟AT豐富區(qū)，這就是轉(zhuǎn)錄終止子的結(jié)構(gòu)。

圖 Prokaryotic Chromosomes ? Haploid僅一對(duì)染色體 ? DNA is compacted緊湊的

– E.g.E.coli packs 1.5 mm chromosome into a cell that is only 1um in length ? No histones or nucleosomes無(wú)組蛋白和核小體

– Small basic proteins MAY serve a similar function ? Genes usually do not contain introns ? Single origin of replication單一復(fù)制起點(diǎn)

（二）質(zhì)粒基因組

? 指細(xì)菌的染色體外基因組，大約幾十種。? 質(zhì)粒DNA呈線狀或環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)

? 大小約1×103~300×103bp，相對(duì)分子質(zhì)量1×106~200×106。? 質(zhì)粒基因可通過(guò)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯而賦予寄主細(xì)胞某種性狀。質(zhì)粒基因組

二、真核生物基因組

（一）真核染色體

（二）真核染色體基因組

（三）線粒體基因組

（四）葉綠體基因組

（一）真核染色體(Eukaryotic chromosome)1.概述

2.組蛋白（Histone）

3.核小體（Nuclearsome）

4.染色體結(jié)構(gòu)的形成

5.著絲粒（centromere或中心粒)和端粒(telomere)1.概述：

Chromatin structure enables the chromosomes to alter their compactness as the cell progress the cell cycle.2.組蛋白（Histone）

3.核小體（Nuclearsome）

Mononucleosomes typically have ~200 bp DNA.End-trimming reduces the length of DNA first to ~165 bp, and then generates core particles with 146 bp.The 10 nm fiber is a continuous string of nucleosomes.4.染色體結(jié)構(gòu)的形成

（1）首先若干個(gè)核小體形成念珠狀結(jié)構(gòu)

（2）30nm纖絲的構(gòu)成－－

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的第二層次

5.著絲粒（centromere或中心粒)和端粒(telomere)有絲分裂中期的染色體

（二）真核染色體基因組(Eukaryotic chromosome genome)? 為真核生物單倍體染色體所含有的一整套基因。

1.真核生物基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點(diǎn) 1）含兩份同源的基因組

2）結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基因數(shù)龐大，具有許多復(fù)制起點(diǎn)，每個(gè)復(fù)制子大小不一。3）真核基因由一個(gè)結(jié)構(gòu)基因與相關(guān)的調(diào)控區(qū)組成，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順?lè)醋印?）含有大量重復(fù)序列。

5）非編碼序列（non-coding sequence NCS)占90%以上。

6）斷裂基因（split gene)。基因與基因間的非編碼序列為間隔DNA（spacer DNA).7）功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族，可串聯(lián)在一起，也可相距很遠(yuǎn)。8）可移動(dòng)因素（mobile genetic element),又稱為自私基因（selfish DNA).2.真核生物基因組的結(jié)構(gòu) ? 結(jié)構(gòu)基因

– 編碼蛋白質(zhì) tRNA rRNA ? 順式作用元件（cis-acting element)指與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)、能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列。并非都位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、上游啟動(dòng)子元件、反應(yīng)元件、加尾信號(hào)等。

? 反式作用因子（trans-acting elements): 可通過(guò)結(jié)合順式作用元件而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子。

3.真核生物與原核生物基因組特點(diǎn)的異同

1）真核生物基因分布在多個(gè)染色體上，而原核生物只一個(gè)染色體； 2）真核生物基因組遠(yuǎn)大于原核生物基因組；

3）真核生物細(xì)胞中DNA與組蛋白和大量非組蛋白結(jié)合，并有核膜將其與細(xì)胞質(zhì)隔離，結(jié)果真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯在時(shí)間上和空間上都是分離的，而原核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯是同步的；

4）真核生物的基因是不連續(xù)的，中間存在不被翻譯的內(nèi)含子序列，而原核生物幾乎每一個(gè)基因都是完整的連續(xù)的DNA片段；

5）基因組中非編碼序列遠(yuǎn)多于編碼序列；

6）存在著重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)從幾次到幾百萬(wàn)次不等；

7）真核生物基因組的復(fù)制起點(diǎn)多，缺少明顯的操縱子結(jié)構(gòu)，而原核生物的基因組一般是一個(gè)復(fù)制子； 8）真核生物基因組與原核相同，存在轉(zhuǎn)座因子。

（三）線粒體基因組(mitochondrial genome, mtDNA)? 雙鏈環(huán)狀分子

? 相對(duì)分子質(zhì)量約1×103~2×105,動(dòng)物＜植物，大小為15.4—16.3kb； ? 含有編碼2個(gè)核糖體RNA（12S rRNA, 16S rRNA）、22個(gè)tRNA、1個(gè)細(xì)胞色素b、3個(gè)細(xì)胞色素氧化酶(COⅠ、COⅡ、COⅢ)、6個(gè)NADH 降解酶(ND1～6)和2個(gè)ATP酶（6和8）的基因（Flook, 1995）。

? 線粒體是半自主性的細(xì)胞器，只能編碼部分所需產(chǎn)物，需與核基因互作編碼一些重要物質(zhì)。? 遺傳密碼與核DNA的不完全一致。

圖1-1 線粒體DNA 結(jié)構(gòu)示意圖

（四）葉綠體基因組

? 也是半自主性的細(xì)胞器，需與核基因互作編碼一些重要物質(zhì)。? 葉綠體基因組較大，在高等植物中通常為140kb。

第7節(jié) 真核生物DNA序列組織

1、單拷貝序列：大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因?qū)龠@一類。

2、輕度重復(fù)序列：2~10個(gè)拷貝。如組蛋白基因，酵母tRNA基因。

3、中度重復(fù)序列：重復(fù)次數(shù)為101~105。不編碼，在基因表達(dá)調(diào)控起重要作用。

4、高度重復(fù)序列：重復(fù)次數(shù)>105的DNA序列，如衛(wèi)星DNA，反向重復(fù)序列，rRNA，某些tRNA 第8節(jié) 基因家族（gene family)

一、基因家族和基因簇

? 基因家族指核苷酸序列或編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有一定程度同源性的一組基因。

? 假基因（pseudogene): 在多基因家族中有的成員并不能表達(dá)出有功能的產(chǎn)物，用ψ表示。基因家族的特點(diǎn)

1、核酸序列相同：即為多拷貝基因如rRNA基因家族，tRNA基因家族，組蛋白基因家族。

2、核酸序列高度同源：如人類生長(zhǎng)激素基因家族包括三種激素的基因，人生長(zhǎng)激素、人胎盤促乳素和催乳素，它們之間高度同源。

3、編碼產(chǎn)物有同源功能：基因序列的相似性可能較低，但基因編碼的產(chǎn)物具有高度保守的功能區(qū)。如src癌基因家族

4、編碼產(chǎn)物具有小段保守基序：有些基因家族中各成員的DNA序列可能不明顯相關(guān)，而所編碼的產(chǎn)物卻有共同的功能特征，存在小段保守的氨基酸基序。

? 基因超家族（gene superfamily)指一組由多基因家族及單基因組成的更大的基因家族，它們的結(jié)構(gòu)有不同的同源性，但功能并不一定相同。如免疫球蛋白基因超家族。

基因簇(gene? cluster)是指基因家族中的各成員緊密成簇排列成大段的串聯(lián)重復(fù)單位，定位于染色體的特殊區(qū)域。它們屬于同一個(gè)祖先的基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

二、基因外的DNA重復(fù)序列

? 除了基因家族外，染色體上還有大量無(wú)轉(zhuǎn)錄活性的重復(fù)DNA序列家族。

? 與在基因家族中的組織形式類似，它們也有兩種組織形式：

– 串聯(lián)重復(fù)DNA（衛(wèi)星DNA），成簇存在于染色體的特定區(qū)域。

– 分散重復(fù)的DNA，重復(fù)單位并不成簇存在，而是分散于染色體的各個(gè)位點(diǎn)上。

1．衛(wèi)星DNA

(1)概念：衛(wèi)星DNA 有些高度重復(fù)DNA序列的堿基組成和浮力密度同主體DNA有區(qū)別，在浮力密度梯度離心時(shí)，可形成不同于主DNA帶的衛(wèi)星帶。衛(wèi)星DNA的名稱由此而來(lái)。

(2)衛(wèi)星DNA的分類

– 衛(wèi)星DNA(satellite DNA)

– 小衛(wèi)星DNA(minisatellite DNA)– 微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)

? 大衛(wèi)星DNA（macrosatellite DNA)又稱為經(jīng)典DNA。總長(zhǎng)度100kb~幾個(gè)Mb。根據(jù)浮力密度的不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和α、β衛(wèi)星DNA。各類型都由不同的重復(fù)順序家族組成。

? 小衛(wèi)星DNA（minisatellite DNA)由中等大小的串聯(lián)重復(fù)序列構(gòu)成，總長(zhǎng)約0.1~20 kb，分布在所有染色體，往往近于端粒處。高度可變的衛(wèi)星DNA、端粒DNA（串聯(lián)的短片段重復(fù)序列（TTAGGGG)n）? 微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA):重復(fù)單位為1~5 bp, 重復(fù)次數(shù)為10~60次，總長(zhǎng)度小于150bp，常見(jiàn)以(AC)n和(TG)n二聚核苷酸為重復(fù)單位，由Miesfeld 1981年發(fā)現(xiàn)。

2.分散重復(fù)的DNA序列

? 在高度分散的重復(fù)DNA家族中含有少量轉(zhuǎn)座元件，根據(jù)其大小不同，可分為 – 短散在核元件（short interspersed nuclear elements，SINEs), – 長(zhǎng)散在核元件（long interspersed nuclear elements, LINEs)。

1）短散在核元件（short interspersed nuclear elements，SINEs), 主要是Alu 重復(fù)序列家族。序列中有限制酶Alu的酶切位點(diǎn)（AGCT）而得名。重復(fù)次數(shù)30~50萬(wàn)，散在分布于基因組中，與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)。

2）長(zhǎng)散在核元件（long interspersed nuclear elements, LINEs): KpnⅠ重復(fù)順序。第9節(jié) 人類基因組研究進(jìn)展

一、人類基因組的基本特點(diǎn)

二、重復(fù)序列

三、人類基因組計(jì)劃（HGP）

一、人類基因組的基本特點(diǎn) ? 斷裂基因；

? 主要由大量的非編碼序列和少量的編碼序列構(gòu)成； ? 存在多基因家族；

? 含有多種類型的重復(fù)序列。人類基因組概況 基因組大小 2.91Gbp A+G含量 54% G+C含量 38% 重復(fù)序列（不含異染色質(zhì)）35% 編碼序列數(shù)目 26588 功能未知基因比例 42% 外顯子最多的基因 Titin（234）SNP數(shù)量 300萬(wàn)個(gè) SNP密度 1/1250bp 最長(zhǎng)的染色體 2（240 Mbp）最短的染色體 Y（19Mbp）基因最多的染色體 1（2453）基因最少的染色體 Y（104）

基因密度最大的染色體 19（23/Mb）基因密度最小的染色體 13，Y（5/Mb）重復(fù)序列含量最高的染色體 19（57%）

重復(fù)序列含量最低的染色體 2，8，10，13，18（36%）

二、重復(fù)序列

? 基因組中有多個(gè)拷貝，但不編碼蛋白質(zhì)的序列，是人類基因中的主要成分； ? 分為串聯(lián)和散布重復(fù)序列

? 衛(wèi)星DNA——高度重復(fù)的串聯(lián)重復(fù)序列； ? 重復(fù)序列是一種重要的分子標(biāo)記。圖人類基因組中的散布重復(fù)序列

? SINE：short interspersed nuclear elements.? Alu: 含AGCT.? MIR：mammalian-wide interspersed repeats.? LINE：long interspersed nuclear elements.? LTR：long terminal repeat.? HERV：human endogenous retroviruses.? RTLV：retrovirus-like elements.? MER：medium reiteration frequency sequence.? THE：transposable human element.三、人類基因組計(jì)劃（HGP）

? 1986年Dulbecco提出、1990啟動(dòng)的人類基因組計(jì)劃(Human Genome Project，HGP)，被譽(yù)為生命科學(xué)的―登月‖計(jì)劃。1990年10月美國(guó)政府決定出資30億美元，用15年時(shí)間（1991—2005年）完成―人類基因組計(jì)劃‖。―人類基因組計(jì)劃‖是生物學(xué)有史以來(lái)最巨大和意義深遠(yuǎn)的一項(xiàng)科學(xué)工程。

? 2003年4月14日美國(guó)聯(lián)邦國(guó)家人類基因組研究項(xiàng)目負(fù)責(zé)人弗朗西斯?柯林斯博士隆重宣布，美、英、日、法、德和中國(guó)科學(xué)家經(jīng)過(guò)13年努力共同繪制完成了人類基因組序列圖。? 由30億個(gè)堿基對(duì)（3×109 bp）組成的人類基因組，蘊(yùn)藏著生命的奧秘。科學(xué)家發(fā)現(xiàn)人類基因數(shù)目約為3.4萬(wàn)至3.5萬(wàn)個(gè)，僅比果蠅多2萬(wàn)個(gè)，遠(yuǎn)小于原先10萬(wàn)個(gè)基因的估計(jì)。HGP目標(biāo)(1990-2003)內(nèi)容 目標(biāo)

（93－98）完成情況 98－2003 遺傳圖譜 2－5 cM 1cM 完成（1cM）

物理圖譜 30，000STSs 52，000STSs 完成 序列圖譜 80Mb 人：180，其它：111 完成 基因圖譜 30，000ESTs 測(cè)序技術(shù) 大規(guī)模測(cè)序 YAC，全自動(dòng)測(cè)序，基因組信息學(xué) 多態(tài)性 SNPs 模式生物 5種

? 人類基因組的研究帶動(dòng)了相關(guān)技術(shù)的突破和發(fā)展 – 完成數(shù)十種生物基因組全序列的測(cè)定 ? 后基因組時(shí)代來(lái)臨

本 章 小 結(jié)

1.斷裂基因 構(gòu)成 性質(zhì) 2.重疊基因 種類 3.C值矛盾

4.原核生物與真核生物基因組的區(qū)別 5.真核生物染色體的結(jié)構(gòu)

6.真核生物DNA序列的4種類型

7.基因家族、基因簇、衛(wèi)星DNA、分散重復(fù)DNA 序列 8.人類基因組計(jì)劃