第一篇：分子生物學課程教學講義 朱玉賢

分子生物學課程教學講義 朱玉賢

第一講 序論

二、現代分子生物學中的主要里程碑

分子生物學是研究核酸、蛋白質等所有生物大分子的形態、結構特征及其重要性、規律性和相互關系的科學，是人類從分子水平上真正揭開生物世界的奧秘，由被動 地適應自然界轉向主動地改造和重組自然界的基礎學科。當人們意識到同一生物不同世代之間的連續性是由生物體自身所攜帶的遺傳物質所決定的，科學家為揭示這 些遺傳密碼所進行的努力就成為人類征服自然的一部分，而以生物大分子為研究對像的分子生物學就迅速成為現代社會中最具活力的科學。

從1847年Schleiden和Schwann提出“細胞學說”，證明動、植物都是由細胞組成的到今天，雖然不過短短一百多年時間，我們對 生物大分子--細胞的化學組成卻有了深刻的認識。孟德爾的遺傳學規律最先使人們對性狀遺傳產生了理性認識，而Morgan的基因學說則進一步將“性狀”與 “基因”相耦聯，成為分子遺傳學的奠基石。Watson和Crick所提出的脫氧核糖酸雙螺旋模型，為充分揭示遺傳信息的傳遞規律鋪平了道路。在蛋白質化 學方面，繼Sumner在1936年證實酶是蛋白質之后，Sanger利用紙電泳及層析技術于1953年首次闡明胰島素的一級結構，開創了蛋白質序列分析 的先河。而Kendrew和Perutz利用X射線衍射技術解析了肌紅蛋白（myoglobin）及血紅蛋白（hemoglobin）的三維結構，論證了 這些蛋白質在輸送分子氧過程中的特殊作用，成為研究生物大分子空間立體構型的先驅。1910年，德國科學家Kossel第一個分離了腺嘌呤，胸腺嘧啶和組氨酸。

1959年，美國科學家Uchoa第一次合成了核糖核酸，實現了將基因內的遺傳信息通過RNA翻譯成蛋白質的過程。同年，Kornberg實現了試管內細菌細胞中DNA的復制。

1962年，Watson（美）和Crick（英）因為在1953年提出DNA的反向平行雙螺旋模型而與Wilkins共獲Noble生理醫學獎，后者通過X射線衍射證實了Watson-Crick模型。

1965年，法國科學家Jacob和Monod提出并證實了操縱子（operon）作為調節細菌細胞代謝的分子機制。此外，他們還首次推測存在一種與DNA序列相互補、能將它所編碼的遺傳信息帶到蛋白質合成場所（細胞質）并翻譯產生蛋白質的mRNA（信使核糖核酸）。

1972年，Paul Berg（美）第一次進行了DNA重組。

1977年，Sanger和Gilbert（英）第一次進行了DNA序列分析。1988年，McClintock由于在50年代提出并發現了可移動遺傳因子（jumping gene或稱mobile element）而獲得Nobel獎。

1993年，美國科學家Roberts和Sharp因發現斷裂基因（introns）而獲得Nobel獎。Mullis由于發明PCR儀而與加拿大學者Smith（第一個設計基因定點突變）共享Nobel化學獎。

此外，Griffith（1928）及Avery（1944）等人關于致病力強的光滑型（S型）肺炎鏈球菌DNA導致致病力弱的粗糙型（R型）細菌發生遺 傳轉化的實驗；Hershey和Chase（1952）關于DNA是遺傳物質的實驗；Crick于1954年所提出的遺傳信息傳遞規律（即中心法則）: Meselson和Stahl（1958）關于DNA半保留復制的實驗以及Yanofsky和Brener（1961）年關于遺傳密碼三聯子的設想都為分 子生物學的發展做出了重大貢獻。

我國生物科學家吳憲20世紀20年代初回國后在協和醫科大學生化系與汪猷、張昌穎等人一道完成了蛋白質變性理論、血液生化檢測和免疫化學等一系列有重大影 響的研究，成為我國生物化學界的先驅。20世紀60年代、70年代和80年代，我國科學家相繼實現了人工全合成有生物學活性的結晶牛胰島素，解出了三方二 鋅豬胰島素的晶體結構，采用有機合成與酶促相結合的方法完成了酵母丙氨酸轉移核糖核酸的人工全合成，在酶學研究、蛋白質結構及生物膜結構與功能等方面都有 世所矚目的建樹。

三、分子生物學的主要研究內容

所有生物體中的有機大分子都是以碳原子為核心，并以共價鍵的形式與氫、氧、氮及磷以不同方式構成的。不僅如此，一切生物體中的各類有機大分子都是由完全相 同的單體，如蛋白質分子中的20種氨基酸、DNA及RNA中的8種堿基所組合而成的，由此產生了分子生物學的3條基本原理: 1.構成生物體有機大分子的單體在不同生物中都是相同的； 2.生物體內一切有機大分子的建成都遵循著各自特定的規則； 3.某一特定生物體所擁有的核酸及蛋白質分子決定了它的屬性。分子生物學研究內容: DNA重組技術------基因工程 基因表達調控-------核酸生物學

生物大分子結構功能----結構分子生物學 DNA重組技術（又稱基因工程）

這是20世紀70年代初興起的技術科學，目的是將不同DNA片段（如某個基因或基因的一部分）按照人們的設計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時 復制并得到表達，產生影響受體細胞的新的遺傳性狀。嚴格地說，DNA重組技術并不完全等于基因工程，因為后者還包括其他可能使生物細胞基因組結構得到改造 的體系。DNA重組技術是核酸化學、蛋白質化學、酶工程及微生物學、遺傳學、細胞學長期深入研究的結晶，而限制性內切酶DNA連接酶及其他工具酶的發現與 應用則是這一技術得以建立的關鍵。DNA重組技術有著廣闊的應用前景

NA 重組技術可用于定向改造某些生物基因組結構，使它們所具備的特殊經濟價值或功能得以成百 上千倍的地提高。DNA重組技術還被用來進行基礎研究。如果說，分子生物學研究的核心是遺傳信息的傳遞和控制，那么根據中心法則，我們要研究的就是從 DNA到RNA，再到蛋白質的全過程，也即基因的表達與調控。在這里，無論是對啟動子的研究（包括調控元件或稱順式作用元件），還是對轉錄因子的克隆及分 析，都離不開重組DNA技術的應用。

基因表達調控研究

因為蛋白質分子參與并控制了細胞的一切代謝活動，而決定蛋白質結構和合成時序的信息都由核酸（主要是脫氧核糖核酸）分子編碼，表現為特定的核苷酸序列，所 以基因表達實質上就是遺傳信息的轉錄和翻譯。在個體生長發育過程中生物遺傳信息的表達按一定的時序發生變化（時序調節），并隨著內外環境的變化而不斷加以 修正（環境調控）。

原核生物的基因組和染色體結構都比真核生物簡單，轉錄和翻譯在同一時間和空間內發生，基因表達的調控主要發生在轉錄水平。真核生物有細胞核結構，轉錄和翻 譯過程在時間和空間上都被分隔開，且在轉錄和翻譯后都有復雜的信息加工過程，其基因表達的調控可以發生在各種不同的水平上。基因表達調控主要表現在信號傳 導研究、轉錄因子研究及RNA剪輯3個方面。

轉錄因子是一群能與基因5'端上游特定序列專一結合，從而保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的蛋白質分子。

真核基因在結構上的不連續性是近10年來生物學上的重大發現之一。當基因轉錄成pre-mRNA后，除了在5'端加帽及3'端加多聚A[polyA]之 外，還要將隔開各個相鄰編碼區的內含子剪去，使外顯子（編碼區）相連后成為成熟mRNA。研究發現，有許多基因不是將它們的內含子全部剪去，而是在不同的 細胞或不同的發育階段有選擇地剪接其中部分內含子，因此生成不同的mRNA及蛋白質分子。

結構分子生物學

生物大分子的結構功能研究（又稱結構分子生物學）一個生物大分子，無論是核酸、蛋白質或多糖，在發揮生物學功能時，必須具備兩個前提:首先，它擁有特定的空間結構（三維結構）；其次，在它發揮生物學功能的過程中必定存在著結構和構象的變化。

結構分子生物學就是研究生物大分子特定的空間結構及結構的運動變化與其生物學功能關系的科學。它包括結構的測定、結構運動變化規律的探索及結構與功能相互 關系的建立3個主要研究方向。最常見的研究三維結構及其運動規律的手段是X射線衍射的晶體學（又稱蛋白質晶體學），其次是用二維核磁共振和多維核磁研究液 相結構，也有人用電鏡三維重組、電子衍射、中子衍射和各種頻譜學方法研究生物高分子的空間結構。

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第二講 染色體與DNA

一、DNA的組成與結構

Avery在1944年的研究報告中寫道:“當溶液中酒精的體積達到9/10時，有纖維狀物質析出。如稍加攪拌，它就會象棉線在線軸上一樣繞在硬棒上，溶 液中的其它成份則呈顆粒狀沉淀。溶解纖維狀物質并重復數次，可提高其純度。這一物質具有很強的生物學活性，初步實驗證實，它很可能就是DNA（誰能想 到！）”。對DNA分子的物理化學研究導致了現代生物學翻天覆地的革命，這更是Avery所沒有想到。

所謂DNA的一級結構，就是指4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了該DNA分子的化學構成。核苷酸序列對DNA高級結構的形成有很大影響，如B-DNA 中多聚（G-C）區易出現左手螺旋DNA（Z-DNA），而反向重復的DNA片段易出現發卡式結構等。DNA不僅具有嚴格的化學組成，還具有特殊的高級結 構，它主要以有規則的雙螺旋形式存在，其基本特點是:

1、DNA分子是由兩條互相平行的脫氧核苷酸長鏈盤繞而成的。

2、DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側，構成基本骨架，堿基排列在內側。

3、兩條鏈上的堿基通過氫鍵相結合，形成堿基對，它的組成有一定的規律。這就是嘌呤與嘧啶配對，而且腺嘌呤（A）只能與胸腺嘧啶（T）配對，鳥嘌呤（G）只能與胞嘧啶（C）配對。如一條鏈上某一堿基是C，另一條鏈上與它配對的堿基必定是G。堿基之間的這種一一對應的關系叫堿基互補配對原則。組成DNA分子 的堿基雖然只有4種，它們的配對方式也只有A與T，C與G兩種，但是，由于堿基可以任何順序排列，構成了DNA分子的多樣性。例如，某DNA分子的一條多 核苷酸鏈有100個不同的堿基組成，它們的可能排列方式就是4100。

二、DNA聚合酶與DNA的合成

The accuracy of translation relies on the specificity of base pairing.The actual rate in bacteria seems to be--10-8-10-10.This corresponds to-1 error per genome per 1000 bacterial replication cycles, or-10-6 per gene per generation.DNA polymerase might improve the specificity of complementary base selection at either(or both)of two stages: 1，It could scrutinize the incoming base for the proper complementarity with the template base;for example, by specifically recongnizing matching chemical features.This would be a presynthetic error control.2，Or it could scrutinize the base pair after the new base has been added to the chain, and, in those cases in which a mistake has been made, remove the most recently added base.This would be a proofreading control.三、DNA的生理意義及成分分析

早在1928年英國科學家Griffith等人就發現肺炎鏈球菌使小鼠殘廢的原因是引起肺炎。細菌的毒性（致病力）是由細胞表面莢膜中的多糖所決定的。具 有光滑外表的S型肺炎鏈球菌因為帶有莢膜多糖而都能使小鼠發病，而具有粗糙外表的R型因為沒有莢膜多糖而失去致病力（莢膜多糖能保護細菌免受運動白細胞攻 擊）。

首先用實驗證明基因就是DNA分子的是美國著名的微生物學家Avery。Avery等人將光滑型致病菌（S型）燒煮殺滅活性以后再侵染小鼠，發現這些死細 菌自然喪失了致病能力。再用活的粗糙型細菌（R型）來侵染小鼠，也不能使之發病，因為粗糙型細菌天然無致病力。當他們將經燒煮殺死的S型細菌和活的R型細 菌混合再感染小鼠時，實驗小鼠每次都死了。解剖死鼠，發現有大量活的S型（而不是R型）細菌。他們推測，死細菌中的某一成分棗轉化源（transforming principle）將無致病力的細菌轉化成病原細菌。

美國冷泉港卡內基遺傳學實驗室科學家Hershey和他的學生Chase在1952年從事噬菌體侵染細菌的實驗。噬菌體專門寄生在細菌體內。它的頭、尾外 部都有由蛋白質組成的外殼，頭內主要是DNA。噬菌體侵染細菌的過程可以分為以下5個步驟:1噬菌體用尾部的末端（基片、尾絲）吸附在細菌表面；2噬菌體 通過尾軸把DNA全部注入細菌細胞內，噬菌體的蛋白質外殼則留在細胞外面；3噬菌體的DNA一旦進入細菌體內，它就能利用細菌的生命過程合成噬菌體自身的 DNA和蛋白質；④新合成的DNA和蛋白質外殼，能組裝成許許多多與親代完全相同的子噬菌體；⑤子代噬菌體由于細菌的解體而被釋放出來，再去侵染其他細 菌。他們發現被感染的細菌中帶有70%的噬菌體DNA，但只帶有20%的噬菌體蛋白質。子代噬菌體中帶有50%標記的DNA，卻只有1%的標記蛋白質。四.C-value和Cot1/2 The total amount of DNA in the haploid genome is a characteristic of each living species known as C-value.Cot1/2 is the product of concentration and time required for 50% reassociation given in nucleotide-moles × second/liter.五、染色體結構

DNA molecules are the largest macromolecules in the cell and are commonly packaged into structures called “chromosomes”, most bacteria & viruses have a single chromosome where as Eukaryotic cells usually contain many.任何一條染色體上都帶有許多基因，一條高等生物的染色體上可能帶有成千上萬個基因，一個細胞中的全部基因序列及其間隔序列統稱為genomes（基因 組）。如果設想將人體細胞中的DNA分子繞地球一周，那么，每個堿基大約只占1－5厘米，而一個2－3kb的基因只相當于地球上一條數十米長，數厘米寬的線段！

Genotype(基因型): The genetic constitution of a given organism(指某個特定生物體細胞內的全部遺傳物質)。

Phenotype(表現型): Visible property of any given organism(某個特定生物體中可觀察到的物理或生理現象)。

Mutations: 染色體DNA中可遺傳的核苷酸序列變化。

六、染色體的組成1.染色質和核小體

染色質DNA的Tm值比自由DNA高，說明在染色質中DNA極可能與蛋白質分子相互作用；在染色質狀態下，由DNA聚合酶和RNA聚合酶催化的DNA復制 和轉錄活性大大低于在自由DNA中的反應；DNA酶I（DNaseI）對染色質DNA的消化遠遠慢于對純DNA的作用。染色質的電子顯微鏡圖顯示出由核小 體組成的念珠狀結構，可以看到由一條細絲連接著的一連串直徑為10nm的球狀體。

核小體是由H2A、H2B、H3、H4各兩個分子生成的八聚體和由大約200bpDNA組成的。八聚體在中間，DNA分子盤繞在外，而H1則在核小體的外面。每個核小體只有一個H1。在核小體中DNA盤繞組蛋白八聚體核心，從而使分子收縮成1/7，200bpDNA的長度約為68nm，卻被壓縮在10nm的核小體中。但是，人中期染色 體中含3.3×109堿基對，其理論長度應是180cm，這么長的DNA被包含在46個51μm長的圓柱體（染色體）中，其壓縮比約為104。

2.染色體中的核酸組成

⑴不重復序列 在單倍體基因組里，這些序列一般只有一個或幾個拷貝，它占DNA總量的40%－80%。不重復序列長約750－2000dp，相當于一個結構基因的長度。單拷貝基因通過基因擴增仍可合成大量的蛋白質，如一個蠶絲心蛋白基因可作為模板合成104個絲心蛋白mRNA，每個mRNA可存活4d，共合成105個絲 心蛋白，這樣，在幾天之內，一個單拷貝絲心蛋白基因就可以合成109個絲心蛋白分子。

⑵中度重復序列 這類重復序列的重復次數在10－104之間，占總DNA的10%－40%。各種rRNA、tRNA 及組蛋白基因等都屬這一類。

非洲爪蟾的18S、5.8S及28SrRNA基因是連在一起的，中間隔著不轉錄的間隔區，這些單位在DNA鏈上串聯重復約5000次。在卵細胞形成過程中 這些基因可進行幾千次不同比例的復制，產生2×106個拷貝，使rDNA占卵細胞DNA的75%，從而使該細胞能積累1012個核糖體。

⑶高度重復序列——衛星DNA 這類DNA只在真核生物中發現，占基因組的10%—60%，由6—100個堿基組成，在DNA鏈上串聯重復幾百萬次。由于堿基的組成不同，在CsCl密度 梯度離心中易與其他DNA分開，形成含量較大的主峰及高度重復序列小峰，后者又稱衛星區帶（峰）。

高等真核生物DNA無論從結構還是功能看都極為復雜，以小鼠為例: 1.小鼠總DNA的10％是小于10bp的高度重復序列，重復數十萬到上百萬次/genome。

2.總DNA的20％是重復數千次、長約數百bp的中等重復序列。

3.總DNA的70％是不重復或低重復序列,絕大部分功能基因都位于這類序列中。

Centromere:是細胞有絲分裂期間紡錘體蛋白質與染色體的結合位點（attachment point），這種結合對于染色體對在子細胞中的有序和平均分配至關重要。在酵母中，centromere的功能單位長約130 bp，富含AT 堿基對。在高等真核細胞中，centromere都是由長約5－10 bp、方向相同的高度重復序列所組成。

Telomeres are sequences at the ends of eukaryotic Chromosomes that help stabilize them。酵母Telomeres一般以100 bp左右不精確重復序列所組成。5’(TxGy)n 3’(AxCy)n

其中X、Y一般為1－4，單細胞真核生物中n常為20－100，高等真核生物中>1500。染色體末端的線性重復序列不能被DNA polymarase 所準確復制，它們一般在DNA復制完成以后由telomarase合成后加到染色體末端。

Alu（長約300bp）是人類高度重復序列,因為該序列中帶有AluI的識別序列而得名。數十萬個Alu重復序列散布于整個人類基因組中，達到總序列的1－3％。Alu與其它高度重復序列共占人類DNA的10％以上。

3.染色體中的蛋白質

染色體上的蛋白質包括組蛋白和非組蛋白。組蛋白是染色體的結構蛋白，它與DNA組成核小體。通常可以用2mol/L NaCl或0.25mol/L的HCl/H2SO4處理使組蛋白與DNA分開。組蛋白分為H1、H2A、H2B、H3及H4。這些組蛋白都含有大量的賴氨 酸和精氨酸，其中H3、H4富含精氨酸，H1富含賴氨酸；H2A、H2B介于兩者之間。⑴組蛋白的一般特性

進化上的極端保守性。牛、豬、大鼠的H4氨基酸序列完全相同。牛的H4序列與豌豆序列相比只有兩個氨基酸的差異（豌豆H4中的異亮氨基酸60→纈氨酸60，精氨酸→賴氨酸）。H3的保守性也很大，鯉魚與小牛胸腺的H3只差一個氨基酸，小牛胸腺與豌豆H3只差4個氨基酸。

無組織特異性。到目前為止，僅發現鳥類、魚類及兩棲類紅細胞染色體不含H1而帶有H5，精細胞染色體的組蛋白是魚精蛋白。

肽鏈上氨基酸分布的不對稱性。堿性氨基酸集中分布在N端的半條鏈上。例如，N端的半條鏈上凈電荷為+16，C端只有+3，大部分疏水基團都分布在C端。

組蛋白的修飾作用。包括甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。

⑵非組蛋白的一般特性

染色體上除了存在大約與DNA等量的組蛋白以外，還存在大量的非組蛋白。非組蛋白的多樣性。非組蛋白的量大約是組蛋白的60%～70%，但它的種類卻很多，約在20-100種之間，其中常見的有15-20種。非組蛋白的組織專一性和種屬專一性。

(3)幾類常見的非組蛋白

a.HMG蛋白（high mobility group protein）。這是一類能用低鹽（0.35mol/L NaCl）溶液抽提、能溶于2%的三氯乙酸、相對分子質量較低的非組蛋白，相對分子質量都在3.0×104以下。b.DNA結合蛋白。用2mol/L NaCl除去全部組蛋白和70%非組蛋白后，還有一部分蛋白必須用2mol/L NaCl和5mol/L尿素才能與DNA解離。這些蛋白分子量較低，約占非組蛋白的20%，染色質的8%。

七.原核與真核染色體DNA比較

原核生物中一般只有一條染色體且大都帶有單拷貝基因，只有很少數基因〔如rRNA基因〕是以多拷貝形式存在；

整個染色體DNA幾乎全部由功能基因與調控序列所組成；

幾乎每個基因序列都與它所編碼的蛋白質序列呈線性對應狀態。

Viral DNA molecules are relatively small HIV = 9000 nt RNA Qβ = 4200 nt

Bactaria DNA is 100 times > than viral E.coli 4639221 bp double-stranded Contour length = 1.7mm, 850倍細菌本身長度。細菌中常常帶有質粒DNA。Eucaryotic cells 果蠅帶有25倍于E.Coli 的DNA,人類帶有600倍于E.Coli 的DNA.Eucaryotic DNA 中基因密度明顯低于原核和病毒。如人DNA中平均每毫米只帶有50個基因,而E.Coli中基因密度每毫米DNA帶有2400個基因！一個人細胞中所帶有的DNA約有2m/1.7mm細菌。成人帶有1X10^14個細胞，成人體內全部 DNA的總長度（Contour Length）＝ 2X10^11Km第三講 蛋白質合成

一.基因與基因表達的一般概念

基因作為唯一能夠自主復制、永久存在的單位，其生理學功能以蛋白質形式得到表達。DNA序列是遺傳信息的貯存者，它通過自主復制得到永存，并通過轉錄生成mRNA，翻譯生成蛋白質的過程控制所有生命現象。

編碼鏈（coding strand）又稱sense strand，是指與mRNA序列相同的那條鏈。非編碼鏈（anticoding strand），又稱antisense strand，是指那條根據堿基互補原則指導mRNA生物合成的DNA鏈。Genetic information is perpetuated by replication（復制）in which a double-stranded nucleic acid is duplicated to give identical copies.基因表達包括轉錄（transcription）和翻譯（translation）兩個階段。轉錄是指拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同（除了T→U之 外）的RNA單鏈的過程，是基因表達的核心步驟。翻譯是指以新生的mRNA為模板，把核苷酸三聯子遺傳密碼翻譯成氨基酸序列、合成蛋白質多肽鏈的過程，是 基因表達的最終目的。

只有mRNA所攜帶的遺傳信息才被用來指導蛋白質生物合成，所以人們一般用U、C、A、G這4種核苷酸而不是T、C、A、G的組合來表示遺傳性狀。所謂翻 譯是指將mRNA鏈上的核苷酸從一個特定的起始位點開始，按每3個核苷酸代表一個氨基酸的原則，依次合成一條多肽鏈的過程。

二.遺傳密碼——三聯子

mRNA上每3個核苷酸翻譯成蛋白質多肽鏈上的一個氨基酸，這3個核苷酸就稱為一個密碼，也叫三聯子密碼。翻譯時從起始密碼子AUG開始，沿mRNA5’→3’的方向連續閱讀直到終止密碼子，生成一條具有特定序列的多肽鏈。

mRNA中只有4種核苷酸，而蛋白質中有20種氨基酸，若以一種核苷酸代表一種氨基酸，只能代表4種(41=4)。若以兩種核苷酸作為一個密碼（二聯 子），能代表42=16種氨基酸。而假定以3個核苷酸代表一個氨基酸，則可以有43=64種密碼，滿足了編碼20種氨基酸的需要。

50-60年代破譯遺傳密碼方面的三項重要成果:（1）Paul Zamecnik等人證實細胞中蛋白質合成的場所。他們把放射性標記的氨基酸注射到大鼠體內，經過一段時間后收獲其肝臟，進行蔗糖梯度沉淀并分析各種細胞成份中的放射性蛋白質。

如果注射后經數小時（或數天）收獲肝臟，所有細胞成份中都帶有放射性標記的蛋白質;如果注射后幾分鐘內即收獲肝臟，那么，放射性標記只存在于含有核糖體顆粒的細胞質成份中。

（2）Francis Crick等人第一次證實只有用三聯子密碼的形式才能把包含在由AUGC四個字母組成遺傳信息（核酸）準確無誤地翻譯成由20種不同氨基酸組成的蛋白質序列，實現遺傳信息的表達。實驗1: 用吖啶類試劑（誘導核苷酸插入或丟失）處理T4噬菌體rII位點上的兩個基因，使之發生移碼突變（frame-shift），就生成完全不同的、沒有功能的蛋白質。實驗2: 研究煙草壞死衛星病毒發現，其外殼蛋白亞基由400個氨基酸組成，相應的RNA片段長1200個核苷酸，與密碼三聯子體系正好相吻合。實驗3: 以均聚物為模板指導多肽的合成。在含有tRNA、核糖體、AA-tRNA合成酶及其它蛋白質因子的細胞抽提物中加入mRNA或人工合成的均聚物作為模板以及ATP、GTP、氨基酸等成分時又能合成新的肽鏈，新生肽鏈的氨基酸順序由外加的模板來決定。

1961年，Nirenberg等以poly（U）作模板時發現合成了多聚苯丙氨酸，從而推出UUU代表苯丙氨酸（Phe）。以poly（C）及poly（A）做模板分別得到多聚脯氨酸和多聚賴氨酸。實驗4: 以特定序列的共聚物為模板指導多肽的合成。以多聚二核苷酸作模板可合成由2個氨基酸組成的多肽，5'?UGU GUG UGU GUG UGU GUG?3',不管讀碼從U開始還是從G開始，都只能有UGU（Cys）及GUG（Val）兩種密碼子。實驗5: 以共聚三核苷酸作為模板可得到有3種氨基酸組成的多肽。如以多聚（UUC）為模板，可能有3種起讀方式: 5’?UUC UUC UUC UUC UUC?3’或 5’?UCU UCU UCU UCU UCU?3’或 5'?CUU CUU CUU CUU CUU?3'分別產生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu）.多聚三核苷酸為模板時也可能只合成2種多肽:5’?GUA GUA GUA GUA GUA?3’或5’?UAG UAG UAG UAG UAG?3’

或5’?AGU AGU AGU AGU AGU?3’由第二種讀碼方式產生的密碼子UAG是終止密碼，不編碼任何氨基酸，因此，只產生GUA（Val）或AGU（Ser）。實驗6: 以隨機多聚物指導多肽合成。Nirenberg等及Ochoa等又用各種隨機的多聚物作模板合成多肽。例如，以只含A、C的多聚核苷酸作模板，任意排列時 可出現8種三聯子，即CCC、CCA、CAC、ACC、CAA、ACA、AAC、AAA，獲得由Asn、His、Pro、Gln、Thr、Lys等6種氨 基酸組成的多肽。

（3）氨基酸的“活化”與核糖體結合技術。

如果把氨基酸與ATP和肝臟細胞質共培養，氨基酸就會被固定在某些熱穩定且可溶性RNA分子（transfer RNA，tRNA）上。現將氨基酸活化后的產物稱為氨基酰-tRNA（aminoacyl-tRNA），并把催化該過程的酶稱為氨基酰合成酶（aminoacyl-tRNA Synthetase）。

以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等為模板，在含核糖體、AA-tRNA的反應液中保溫后通過硝酸纖維素濾膜，只有游離的AA-tRNA因相 對分子質量小而通過濾膜，而核糖體或與核糖體結合的AA-tRNA則留在濾膜上，這樣可把已結合與未結合的AA-tRNA分開。當體系中帶有多聚核苷酸模板時，從大腸桿菌中提取的核糖體經常與特異性氨基酰-tRNA相結合。如果把核糖體與poly（U）和Phe-tRNAPhe共溫育，核糖體就能同時與poly（U）和Phe-tRNAPhe相結合。

4種核苷酸組成61個編碼氨基酸的密碼子和3個終止密碼子，它們不能與tRNA的反密碼子配對，但能被終止因子或釋放因子識別，終止肽鏈的合成。由一種以 上密碼子編碼同一個氨基酸的現象稱為簡并（degeneracy），對應于同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子（synonymous codon）。

三.密碼子和反密碼子的相互作用

蛋白質生物合成過程中，tRNA的反密碼子通過堿基的反向配對與mRNA的密碼子相互作用。1966年，Crick根據立體化學原理提出擺動假說（wobble hypothesis），解釋了反密碼子中某些稀有成分如I以及許多有2個以上同源密碼子的配對問題。Wobble hypothesis 1 任意一個密碼子的前兩位堿基都與tRNA anticodon中的相應堿基形成Watson-Crick堿基配對。反密碼子第一位是A或C時，只能識別一個密碼子。當反密碼子第一位是U或G時，能識別兩個密碼子。當Inosine（I）作為反密碼子第一位時，能識別三個密碼子。3 如果數個密碼子同時編碼一個氨基酸，凡是第一、二位堿基不相同的密碼子都對應于各自的tRNA。

④ 根據上述規則，至少需要32種不同的tRNA才能翻譯61個密碼子。

四.tRNA tRNA在蛋白質合成中處于關鍵地位，被稱為第二遺傳密碼。它不但為將每個三聯子密碼翻譯成氨基酸提供了接合體，還為準確無誤地將所需氨基酸運送到核糖體 上提供了載體。所有的tRNA都能夠與核糖體的P位點和A位點結合，此時，tRNA分子三葉草型頂端突起部位通過密碼子:反密碼子的配對與mRNA相結 合，而其3’末端恰好將所轉運的氨基酸送到正在延伸的多肽上。代表相同氨基酸的tRNA稱為同工tRNA。在一個同工tRNA組內，所有tRNA均專一于 相同的氨基酰-tRNA合成酶。

1、tRNA的三葉草型二級結構

受體臂（acceptor arm）主要由鏈兩端序列堿基配對形成的桿狀結構和3’端末配對的3-4個堿基所組成，其3’端的最后3個堿基序列永遠是CCA，最后一個堿基的3’或 2’自由羥基（—OH）可以被氨酰化。TφC臂是根據3個核苷酸命名的，其中φ表示擬尿嘧啶，是tRNA分子所擁有的不常見核苷酸。反密碼子臂是根據位于 套索中央的三聯反密碼子命名的。D臂是根據它含有二氫尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。最常見的tRNA分子有76個堿基，相對分子質量約為2.5×104。不同的tRNA分子可有74-95個核苷酸不等，tRNA分子長度的不同主要是由其 中的兩條手臂引起的。tRNA的稀有堿基含量非常豐富，約有70余種。每個tRNA分子至少含有2個稀有堿基，最多有19個，多數分布在非配對區，特別是 在反密碼子3'端鄰近部位出現的頻率最高，且大多為嘌呤核苷酸。這對于維持反密碼子環的穩定性及密碼子、反密碼子之間的配對是很重要的。2.tRNA的L形三級結構

酵母和大腸桿菌tRNA的三級結構都呈L形折疊式。這種結構是靠氫鍵來維持的，tRNA的三級結構與AA-tRNA合成酶的識別有關。受體臂和TφC臂的桿狀區域構成了第一個雙螺旋，D臂和反密碼子臂的桿狀區域形成了第二個雙螺旋。

tRNA的L形高級結構反映了其生物學功能，因為它上所運載的氨基酸必須靠近位于核糖體大亞基上的多肽合成位點，而它的反密碼子必須與小亞基上的mRNA相配對，所以兩個不同的功能基團最大限度分離。3.tRNA的功能

轉錄過程是信息從一種核酸分子（DNA）轉移至另一種結構上極為相似的核酸分子（RNA）的過程，信息轉移靠的是堿基配對。翻譯階段遺傳信息從mRNA分子轉移到結構極不相同的蛋白質分子，信息是以能被翻譯成單個氨基酸的三聯子密碼形式存在的，在這里起作用的是解碼機制。

4.tRNA的種類

（1）起始tRNA和延伸tRNA 能特異地識別mRNA模板上起始密碼子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA統稱為延伸tRNA。原核生物起始tRNA攜帶甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA攜帶甲硫氨酸（Met）。（2）同工tRNA 代表同一種氨基酸的tRNA稱為同工tRNA，同工tRNA既要有不同的反密碼子以識別該氨基酸的各種同義密碼，又要有某種結構上的共同性，能被AA-tRNA合成酶識別。（3）校正tRNA 校正tRNA分為無義突變及錯義突變校正。在蛋白質的結構基因中，一個核苷酸的改變可能使代表某個氨基酸的密碼子變成終止密碼子（UAG、UGA、UAA），使蛋白質合成提前終止，合成無功能的或無意義的多肽，這種突變就稱為無義突變。

五.AA-tRNA合成酶 是一類催化氨基酸與tRNA結合的特異性酶，其反應式如下: 它實際上包括兩步反應: 第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸復合物。AA+ATP+酶（E）→E-AA-AMP+PPi 第二步是氨酰基轉移到tRNA 3’末端腺苷殘基上，與其2’或3’-羥基結合。E-AA-AMP+ tRNA→AA-tRNA +E+AMP 蛋白質合成的真實性主要決定于AA-tRNA合成酶是否能使氨基酸與對應的tRNA相結合。AA-tRNA合成酶既要能識別tRNA，又要能識別氨基酸，它對兩者都具有高度的專一性。不同的 tRNA有不同堿基組成和空間結構，容易被tRNA合成酶所識別，困難的是這些酶如何識別結構上非常相似的氨基酸。有兩道關口: The first filter is the initial binding of the amino acid to the enzyme and its activation to aminoacyl-AMP.The second filter is the binding of incorrect aminoacyl-AMP products to a separate active site on the enzyme.核糖體像一個能沿mRNA模板移動的工廠，執行著蛋白質合成的功能。它是由幾十種蛋白質和幾種核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）組成的亞細胞顆粒。一個細菌細胞內約有20000個核糖體，而真核細胞內可達106個，在未成熟的蟾蜍卵細胞內則高達1012。核糖體 和它的輔助因子為蛋白質合成提供了必要條件。

1.核糖體的組成

原核生物核糖體由約2/3的RNA及1/3的蛋白質組成。真核生物核糖體中RNA占3/5，蛋白質占2/5。核糖體是一個致密的核糖核蛋白顆粒，可以解離為兩個亞基，每個亞基都含有一個相對分子質量較大的rRNA和許多不同的蛋白質分子。大腸桿菌核糖體小亞基由21種蛋白質組成，分別用S1??S21表示，大亞基由33種蛋白質組成，分別用L1??L33表示。真核生物細胞核糖體大亞基含有49種蛋白質，小亞基有33種蛋白質。

2、rRNA 3.核糖體的功能

核糖體包括至少5個活性中心，即mRNA結合部位、結合或接受AA-tRNA部位（A位）、結合或接受肽基tRNA的部位、肽基轉移部位（P位）及形成肽鍵的部位（轉肽酶中心），此外還有負責肽鏈延伸的各種延伸因子的結合 位點。小亞基上擁有mRNA結合位點，負責對序列特異的識別過程，如起始位點的識別和密碼子與反密碼子的相互作用。大亞基負責氨基酸及tRNA攜帶的功 能，如肽鍵的形成、AA-tRNA、肽基-tRNA的結合等。A位、P位、轉肽酶中心等主要在大亞基上。

核糖體可解離為亞基或結合成70S/80S顆粒。翻譯的起始階段需要游離的亞基，隨后才結合成70S/80S顆粒，繼續翻譯進程。體外反應體系中，核糖體 的解離或結合取決于Mg2+離子濃度。在大腸桿菌內，Mg2+濃度在10-3mol/L以下時，70S解離為亞基，濃度達10-2mol/L時則形成穩定 的70S顆粒。細胞中大多數核糖體處于非活性的穩定狀態，單獨存在，只有少數與mRNA一起形成多聚核糖體。它從mRNA的5'末端向3'末端閱讀密碼 子，至終止子時合成一條完整的多肽鏈。mRNA上核糖體的多少視mRNA的長短而定，一般40個核苷酸有一個核糖體。

七.信使核糖核酸

mRNA messenger ribonucleic acidDNA deoxyribonucleic acid.雖然mRNA在所有細胞內執行著相同的功能，即通過三聯子密碼翻譯生成蛋白質，其生物合成的具體過程和成熟mRNA的結構在原核和真核生物細胞內是不同的。

八、蛋白質的生物合成

核糖體是蛋白質合成的場所，mRNA是蛋白質合成的模板，tRNA是模板與氨基酸之間的接合體。此外，有20種以上的AA-tRNA及合成酶、10多種起 始因子、延伸因子及終止因子，30多種tRNA及各種rRNA、mRNA和100種以上翻譯后加工酶參與蛋白質合成和加工過程。蛋白質合成消耗了細胞中90%左右用于生物合成反應的能量。細菌細胞中的2萬個核糖體，10萬個蛋白質因子和20萬個tRNAs 約占大腸桿菌干重的35%。在大腸桿菌中合成一個100個氨基酸的多肽只需5分鐘。

1.蛋白質生物合成的主要步驟: 翻譯的起始——核糖體與mRNA結合并與氨基酰-tRNA生成起始復合物。肽鏈的延伸——核糖體沿mRNA5’端向3’端移動，導致從N端向C端的多肽合成。肽鏈的終止以及肽鏈的釋放——核糖體從mRNA上解離，準備新一輪合成反應。主要分為五步

1、Activation of Amino Acids(This reaction takes place in the cytosol, not on the ribosome).2、Initiation.The mRNA bearing the code for the polypeptide binds to the small ribosomal subunit and to the initiating aminoacyl-tRNA.3、Elongation.Peptide bonds are formed in this stage.4、Termination and Release.Completion of the polypeptide chain is signaled by a termination codon in the mRNA.5、Folding and Post translational Processing.肽鏈延伸分為三步 Binding of an incoming aminoacyl-tRNA.2 Peptide bond formation.3 Translocation.2.與蛋白質合成有關的因子

起始因子Initiation factor（IF）延伸因子Elongation factor（EF）終止因子。原核中有RF1-3。RF-1 識別 UAA和UAG;RF-2 識別 UAA和UGA;RF-3 僅能促進RF-1和RF-2的功能。終止因子行使功能時需要GTP。真核生物中只有一個RF，能識別3個終止子。

3、蛋白質合成的起始 蛋白質合成的起始復合物: 30S 核糖體小亞基 模板mRNA fMet-tRNAfMet 起始因子 GTP 50S 核糖體大亞基 Mg2+ 合成的起始可分為三步: 1、30S 核糖體小亞基與起始因子IF –1和IF-3相結合，誘發模板mRNA與小亞基結合。

2、由30S 小亞基、起始因子IF –1和IF-3及模板mRNA所組成的復合物立即與GTP-IF-2及fMet-tRNAfMet相結合。反密碼子與密碼子配對。

3、上述六組分復合物再與50S大亞基結合，水解GTP生成并釋放GDP和Pi。釋放三個起始因子。

表27-9 真核細胞中參與翻譯起始的蛋白質因子及其功能

真核因子 功能

eIF2 促進Met-tRNAMet與核糖體40S小亞基結合。eIF2B eIF3 是最早與核糖體40S小亞基結合的促進因子，蛋白質合成反應的正常進行。eIF4A 具有RNA解旋酶活性，解除mRNA模板的次級結構并使之與40S小亞基結合，形成eIF4F復合物。

eIF4B 與mRNA模板相結合，協助核糖體掃描模板序列，定位AUG。eIF4E 與mRNA 5'的帽子結構相結合，形成eIF4F復合物。

eIF4G 與eIF4E和poly（A）結合蛋白（PAB）相結合，形成eIF4F復合物。eIF5 促使多個蛋白因子與40S小亞基解體，以此幫助大小亞基結合形成80核糖體，形成翻譯起始復合物。

eIF6 促進沒有蛋白質合成活性的80S核糖體解離成40S和60S兩個亞基。

4、肽鏈的延伸

肽鏈延伸的基本要求是 : 有完整的起始復合物，有氨基酰-tRNA，有延伸因子EF-Tu, EF-Ts和EF-G，有GTP。

肽鏈延伸也可被分為三步: 第一步，與新進來的氨基酰-tRNA相結合。氨基酰-tRNA首先必須與GTP-EF-Tu復合物相結合，形成氨基酰-tRNA-GTP-EF-Tu復合物并與70S中的A位點相結合。此時，GTP水解并釋放GDP-EF-Tu復合物。

第二步，肽鍵形成。肽鍵形成之初，兩個氨基酸仍然分別與各自的tRNA相結合，仍然分別位于A位點和P位點上。A位點上的氨基酸（第二個氨基酸）中的α-氨基作為親核基團取 代了P位點上的tRNA，并與起始氨基酸中的COOH基團形成肽鍵。本反應可能由peptidyl transferase 催化。

第三步，移位（translocation）。核糖體向mRNA的3’方向移動一個密碼子，使得帶有第二個氨基酸（現已成為二肽）的tRNA從A位進入P位，并使第一個tRNA從P位進入E位。此時模 板上的第三個密碼子正好在A位上。核糖體的移位需要EF-G（translocase）和另一分子GTP水解提供能量。

5、肽鏈的終止

當終止密碼子進入核糖體A位點時，在釋放因子RF1-3的作用下:（1）水解末端肽基tRNA；（2）釋放新生肽和tRNA；

（3）使70S核糖體解離成30S和50S兩個亞基。

6、蛋白質合成的抑制劑

抗菌素對蛋白質合成的作用可能是阻止mRNA與核糖體結合（氯霉素），或阻止AA-tRNA與核糖體結合（四環素類），或干擾AA-tRNA與核糖體結合而產生錯讀（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等），或作為競爭性抑制劑抑制蛋白質合成。鏈霉素是一種堿性三糖，干擾fMet-tRNA與核糖體的結合，從而阻止蛋白質合成的正確起始，并導致mRNA的錯讀。若以poly（U）作模板，則除苯丙氨酸（UUU）外，異亮氨酸（AUU）也會摻入。對鏈霉素敏感位點在30S亞基上。

嘌呤霉素是AA-tRNA的結構類似物，能結合在核糖體的A位上，抑制AA-tRNA的進入。它所帶的氨基與AA-tRNA上的氨基一樣，能與生長中肽鏈上的羧基生成肽鍵，這個反應的產物是一條3'羧基端掛了一嘌呤霉素。

青霉素、四環素和紅霉素只與原核細胞核糖體發生作用，從而阻遏原核生物蛋白質的合成，抑制細菌生長。氯霉素和嘌呤霉素既能與原核細胞核糖體結合，又能與真 核生物核糖體結合，妨礙細胞內蛋白質合成，影響細胞生長。因此，前3種抗生素被廣泛用于人類醫學，后兩種則很少在醫學上使用

第四講 DNA、RNA和蛋白質代謝

DNA是貯藏遺傳信息的最重要的生物大分子。DNA分子中的核苷酸排列順序不但決定了胞內所有RNA及蛋白質的基本結構，還通過蛋白質（酶）的功能間接控 制了細胞內全部有效成份的生產、運轉和功能發揮。貯藏在任何基因中的生物信息都必須首先被轉錄生成RNA，才能夠得到表達。DNA和RNA雖然很相似，只 有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同，但它們的生物學活性卻很不同。RNA主要以單鏈形式存在于生物體內，其高級結構很復雜；RNA既擔負著貯藏及轉移遺傳信息的功能，又能作為核酶直接在細胞內發揮代謝功能。

蛋白質是生物信息通路上的終產物，一個活細胞在任何發育階段都需要數千種不同的蛋白質。因此，活細胞內時刻進行著各種蛋白質的合成、修飾、運轉和降解反應。

一、核苷酸的合成與代謝

核苷酸是DNA和RNA的前體是細胞內化學能流通領域中的載體（ATP，GTP）,是NAD、FAD、S-adenosylmethionine及 Coenzyme A等的重要成份。在糖代謝中也有重要作用，如生成UDPG和 CDP-diacylglycerol等。cAMP, cGMP還是第二信使。

1、De Novo嘌呤核苷酸的生物合成始于PRPP（Phosphoribosyl 1-pyrophosphate）

這一途徑的第一步是由谷氨酰胺捐獻一個氨基到PRPP的C-1位上，生成5-phosphoribosylamine。

其次，把甘氨酸中的三個基團加到PRA上。第三，由N10-甲基四氫葉酸提供一個甲基。第四，谷氨酰胺提供另一個N。第五，脫水環化形成咪唑環。第六，羧基化

第七，通過分子重排將羧基從咪唑第4碳的環外氨基上轉移到第5位碳原子上。第八-九，由天門冬酰胺把另一個氨基加到第5位碳原子上。第十，再由N10-甲基四氫葉酸提供一個甲基。第十一，脫水環化，形成嘌呤IMP。

參與合成AMP的是1腺苷琥珀酸合成酶和2腺苷琥珀酸裂解酶。參與合成GMP的是3IMP脫氫酶和④XMP-谷氨酰胺酰胺轉移酶。

2.嘌呤核苷酸合成中的反饋調節

3.嘧啶核苷酸是由天門冬酰胺、PRPP和氨基甲酰磷酸等共同形成的

嘧啶從頭合成途徑不同于嘌呤的合成，6-原子嘧啶環首先被合成，然后才與核糖-5-磷酸相連。這個反應需要氨基甲酰磷酸（Carbamoyl phosphate）。4.核苷單磷酸轉化為核苷三磷酸

反應生成的ADP可通過糖酵解酶或氧化磷酸化途徑被進一步磷酸化。ATP能夠把磷酸基團加到其它所有核苷單磷酸上生成核苷三磷酸。

核苷二磷酸可通過一個公用的核苷二磷酸激酶被進一步磷酸化生成核苷三磷酸。

5.核糖核苷酸（ribonucleotides）是脫氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleotides）的前體。所有dNTP都直接來自于 NTP（其實是NDP）。這個反應很特殊，因為核糖上的還原反應發生于一個沒有活化的碳原子上。催化該反應的酶是核糖核苷酸還原酶。大腸桿菌核苷酸還原酶有兩大特征，它的生物學活性和底物特異性同時受效應子（effector molecules）的影響。每個R1亞基上都有兩個調節位點，當影響整體酶活性的那個位點與ATP相結合時，酶活性增加；而當它與dATP結合時，酶活性消失。第二個調節位點控制了底物特異性。當dATP與該位點相結合時，UDP和CDP的還原反應優先進行。當dTTP與該位點相結合時，GDP的還原反應優先進行。核糖核苷酸還原反應的主要過程 1.還原酶R2亞基處于氧化態-X˙，向核糖3'位碳原子上的H發起攻擊，生成3'位自由基。2.R1亞基上的-SH基團為2'-OH提供一個H原子，使之生成-OH2基團。3.脫水后，3'位自由基幫助維持2'位O+基團。

4.R1亞基上的另一個-SH基團為2'-CH+提供一個H原子 5.2'上的C˙-OH向R2亞基上的X-H發起攻擊。6.2'上的C-OH失去氧原子，生成dNDP。其中，dTMP（thymidylate）來自于dCDP和dUMP，其直接前體是dUMP，由胸苷酸合酶（thymidylate synthase）將dUMP轉化為dTMP；反應中的甲基來自于N5，N10-Methylene-tetrahydrofolate。

7、嘌呤和嘧啶降解后分別生成Uric Acid和Urea。嘌呤核苷酸降解

第一步是在5'-核苷酸酶（5'-nucleotidase）的作用下消去磷酸基團，由Adenosine-monophosphate變成Adenosine，或從GMP變成Guanosine。

二、在Adenosine deaminase的作用下生成Inosine；

三、在nucleosidase的作用下生成Hypoxanthine或由Guanosine生成Guanine；

四、在Xanthine oxidase或Guanine deaminase作用下生成Xanthine；

五、在Xanthine oxidase的作用下生成Uric acid。嘌呤代謝突變會引起重要疾病。

如人體內缺失adenosine deaminase，會引發嚴重的免疫缺失性疾病，因為此時T-淋巴和B-淋巴細胞不能正常發育。AD缺失后，細胞內dATP的含量將高達正常細胞中的 100倍，而過量的dATP則抑制了其余dNTP在T-淋巴細胞中的合成。許多化療（chemotherapy）藥劑都針對核苷酸合成途徑。如 Azaserine和Acivicin都是Glutamine類似物，被用于阻斷核苷酸的生物合成。

胸苷合成中的主要抑制劑有fluorouracil（氟脲）、methotrexate（氨甲基葉酸）和aminopterin（氨喋呤）。氟脲本身不是 thymidylate synthase 抑制劑，但它在細胞中被轉化為FdUMP以后，就能直接與TS相結合并使之失活。氨甲基葉酸和氨喋呤都是dihydrofolate reductase的抑制劑，氨甲基葉酸與該酶的親和力比底物dihydrofolate高100倍。

二、氨基酸代謝

按所占的質量比例計算，N在生物體內的重要性排在CHO之后，列第4位。大量N元素都是有機氮，被結合于氨基酸或核苷酸分子中。

地球上的動植物共含氮約1.5×1010t，而每年通過硝化細菌以氣態氮的形式釋放到大氣中的氮就有2×108—5×108t。全世界氮肥廠每年生產的化肥僅含氮約108t，所以，如果沒有生物固氮，生命很快就不復存在了。

1.銨通過谷氨酸→谷氨酰胺被結合到有機物質中。主要有兩步反應: ⑴Glutamate+ATP→γ-glutamylphosphate+ADP ⑵γ-Glutamyl phosphate+NH4+→glutamine+Pi+H+ 總結: Glutamyl+NH4++ATP→glutamine+ ADP+Pi+H+

因此，谷氨酰胺合成酶是氮代謝中的主要調控位點。

在大腸桿菌中，GS由12個相同的亞基（50kDa）聚合而成，其活性既通過構象變化，也能通過共價修飾的方式得到調節。Alanine，Glycine 和其它至少6種gln代謝產物都是GS活性的變構抑制劑，每個抑制劑都只有部分抑制作用。除變構抑制之外，GS活性還受共價修飾調節。當第397位酪氨酸 被腺苷化后（加上AMP），該酶更容易受變構抑制劑的反饋調節。

2.氨基酸的生物合成

高等動物不能合成大約一半氨基酸，只能從食物中直接獲取這些必需氨基酸（Essential）。表18-1 人體必需氨基酸(*.哺乳期至幼兒期必需)表22-1 氨基酸合成的六條主要途徑 3.氨基酸脫羧基化后生成有機胺。許多重要的神經遞質都是胺或其次生代謝產物。Tyrosine降解產物有dopamine（多巴胺），epinephrine（腎上腺素），norepinephrine，統稱為Catecholamines（兒茶酚胺）。

4.精氨酸降解產生NO˙(Nitric Oxide)。

本世紀80年代，科學家發現NO是人體內重要的信號分子，它參與神經傳遞、凝血和血壓調控等一系列生理反應。雖然它是氣體，極易擴散，但由于它十分活躍，其擴散半徑一般只有1mm。

三、氨基酸及功能蛋白質合成后的修飾 1.蛋白質剛剛被合成時，都以fMet（原核）或Met（真核）開始，多肽合成后，N端的formyl group、Met殘基，有時還包括N揣多個殘基或C端的殘基都會被切除。50%的真核蛋白中，N-端殘基的氨基酸會被N-乙基化。

2.切除信號肽。許多蛋白質都帶有15-30個殘基的signal peptides，負責指導蛋白質在細胞中的精確定位。3.特定氨基酸的修飾。4.氨基酸的糖苷化

5.氨基酸的異戊烯化（Addition of Isoprenyl Groups）6.有些蛋白質還要與輔基(prosthetic groups)相結合； Cytochrome C只有與血紅素（heme）相結合才有功能。此外，Acetyl-CoA羧化酶常與Biotin分子相結合。有些蛋白質必須經蛋白酶切割后才有功能。有些蛋白質只有在形成二硫鍵之后才有功能。

四、蛋白質的運輸和降解

1、絕大部分被運入ER內腔的蛋白質都帶有一個Signal peptide。該序列常常位于蛋白質的氨基末端，長度一般在13-36個殘基之間，有三個特點:（1）一般帶有10-15個疏水氨基酸；（2）常常在靠近該序列N-端疏水氨基酸區上游帶有1個或數個帶正電荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位點處常常帶有數個極性氨基酸，離切割位點最近的那個氨基酸往往帶有很短的側鏈（Ala或Gly）。

研究發現，信號肽把Ribosome牽引到ER上。蛋白質合成之初，一旦信號肽序列的N端暴露在核糖體外，該序列（包括核糖體）就迅速與SRP（signal recognition particle）相結合，誘發SRP與GTP相結合，停止新生肽的進一步延伸（此時新生肽一般長約70個殘基左右）。

受位于ER外膜上的SRP-receptor及ribosome-receptor的牽引，這個復合物（GTP-SRP-ribosome-mRNA-新生肽）立即向ER外膜靠攏，并通過peptide transport complex進入ER內腔。

5.Rough ER上的蛋白質常常通過運轉載體將經過修飾的蛋白質送入高爾基體，再分別送到各個亞細胞位點。

6.蛋白質中的核定位序列一般不被切除。

蛋白質的核定位是通過多個蛋白的共同作用來實現的。Importin(α,β亞基)的作用有點像SRP受體。NLS蛋白-Importin復合物停留在核孔上，并在Ran-GTPase的作用下通過核孔。細菌細胞內也存在類似的蛋白質運轉系統。

7、蛋白質降解是一個有序的過程。

在大腸桿菌中，許多蛋白質的降解是通過一個依賴于ATP的蛋白酶（稱為Lon）來實現的。當細胞中存在有錯誤或半衰期很短的蛋白質時，該蛋白酶就被激活。每切除一個肽鍵要消耗兩分子ATP。

在真核生物中，蛋白質的降解需要Ubiquitin，一個有76個氨基酸殘基組成極為保守的蛋白參與。與Ubiquitin相連的蛋白將被送到一個依賴于ATP的蛋白質降解系統（Proteasome，Mr.1×106）。

成熟多肽N-端第一個殘基對蛋白質的穩定性有重要影響。

五、DNA代謝

無論是只含有一對染色體的原核細胞還是帶有多對染色體的真核細胞，只有整個基因組得到了完整準確的復制，細胞分裂才能順利發生。所以說，DNA復制的起始，標志了細胞進入一個新的周期。㈠、DNA復制

根據反應階段和所需的不同酶類，DNA的復制可被分為三個階段，即復制起始、延伸和終止。每個DNA復制的獨立單元被稱為復制子（replicon），主 要包括復制起始位點（Origine of replication）和終止位點（terminus）。原核生物的整個染色體上一般只有一個復制起始位點。

大腸桿菌DNA的復制需要有20種左右的酶和蛋白質因子參與，整個DNA復制機器被稱之為DNA replicase system或replisome。

Helicase，任何DNA在被復制前都必須解開雙鏈，這個過程是由helicase來完成的，它可在ATP的作用下將DNA母鏈不斷解開形成單鏈。

Topoisomerase，主要功能是消除DNA解鏈過程中所產生的扭曲力。DNA結合蛋白，使新解鏈的DNA保持穩定結構。Primases，為DNA復制提供RNA引物。

DNA polymerases，合成新生DNA鏈，切除RNA引物。

DNA Ligases，使新生DNA鏈上的缺口（3'-OH, 5'-p）生成磷酸二酯鍵。1.DNA復制的起始

大腸桿菌中的復制起始位點是Ori C，全長245Bp，該序列在所有細菌復制起始位點中都是保守的。

DNA復制起始中的主要步驟

a.大約20個左右的DnaA蛋白首先與OriC中的4個9堿基重復區相結合； b.識別并使3個13堿基串聯重復區DNA形成開環結構；

c.DnaB蛋白在DnaC的幫助下與未解鏈序列結合。每六個DnaB蛋白形成一組并與一條DNA母鏈結合，可在不同方向同時起始DNA的復制。當細胞中存在足夠的SSB和DNA gyrase時，DnaB的解鏈效率非常高。整個DNA復制過程中，只有復制起始受細胞周期的嚴格調控。“Once in each cell cycle。” DNA甲基化與DNA復制起始密切相關。OriC中有11個GATC回文結構（一般說來，256bp才應有一個GATC重復）。DNA子鏈被合成后，母鏈 立即被甲基化（稱為hemimethylated）。此時，oriC與細胞原生質膜相結合。只有當oriC被從膜上釋放出來，子鏈被Dam甲基化后，才能 有效地與DnaA蛋白結合，起始新一輪的DNA復制。復制起始可能還受ATP水解過程調控，因為DnaA只有與ATP相結合時才能與oriC區DNA相結 合。2.DNA子鏈的延伸

主要包括兩個不同但相互有聯系的事件，即前導鏈和滯后鏈的合成。由DNA helicase解開雙螺旋，由拓樸異構酶消除DNA鏈上的扭曲力，SSB結合使DNA單鏈穩定。

前導鏈的合成:由DnaG（primase）在復制起始位點附近合成一個10-60 nt的RNA引物，然后由polII把dNTP加到該引物上。

滯后鏈的合成:產生Okazaki fragments，消除RNA引物并由DNA pol I補上這一小段DNA序列，由DNA Ligase把兩個片段相連。3.DNA鏈的終止

當子鏈延伸達到terminus region（ter，帶有多個20bp序列）時，DNA復制就終止了。Ter有點像一個陷井（trap），使復制叉只能進入，不能出來。Ter的功能主 要是由Ter-Tus復合物（ter utilization substance）來完成的。4.真核細胞DNA的復制比大腸桿菌更復雜

真核生物的origin of replication被稱為ARS-autonomously replicating sequences或者被稱為replicators。Yeast replicators長約150dp，有多個保守重復區，共有約500個replicators分布于酵母的17條染色體中。

㈡、DNA的損傷修復

1.錯配修復（mismatch Repair）

錯配修復對DNA復制忠實性的貢獻力達102-103，DNA子鏈中的錯配幾乎完全都被修正，充分反映了母鏈的重要性。

2.堿基切除修復（Base-Excision Repair）

DNA gylcosylases能特異性識別常見的DNA損傷（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨酰化產物）并將受損害堿基切除。去掉堿基后的核苷酸被稱為AP位點（apurinic or apyrimidinic）。細胞中最常見的Uracil Glycosylase就能特異性切除細胞中的去氨基胞嘧啶。3.核苷酸切除修復（nucleotide-excision repair）當DNA鏈上相應位置的核苷酸發生損傷，導致雙鏈之間無法形成氫鍵，由核苷酸切除修復系統負責進行修復。

4.DNA的直接修復（Direct repair）

㈢、DNA的轉座

DNA的轉座，或稱移位（transposition），是由可移位因子（transposable element）介導的遺傳物質重排現象。已經發現“轉座”這一命名并不十分準確，因為在轉座過程中，可移位因子的一個拷貝常常留在原來位置上，在新位點 上出現的僅僅是拷貝。因此，轉座有別于同源重組，它依賴于DNA的復制。1.轉座子的分類和結構特征 a.簡單轉座子

轉座子（transposon，Tn）是存在于染色體DNA上可自主復制和移位的基本單位。最簡單的轉座子不含有任何宿主基因而常被稱為插入序列（insertion sequence，IS），它們是細菌染色體或質粒DNA的正常組成部分。一個細菌細胞常帶有少于10個IS序列。轉座子常常被定位到特定的基因中，造成 該基因突變。IS序列都是可以獨立存在的單元，帶有介導自身移動的蛋白。

b.復合式轉座子（composite transposon）是一類帶有某些抗藥性基因（或其他宿主基因）的轉座子，其兩翼往往是兩個相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某個功能基 因兩端時就可能產生復合轉座子。一旦形成復合轉座子，IS序列就不能再單獨移動，因為它們的功能被修飾了，只能作為復合體移動。

2、轉座作用的機制

轉座時發生的插入作用有一個普遍的特征，那就是受體分子中有一段很短的（3-12bp）、被稱為靶序列的DNA會被復制，使插入的轉座子位于兩個重復的靶 序列之間。不同轉座子的靶序列長度不同，但對于一個特定的轉座子來說，它所復制的靶序列長度都是一樣的，如IS1兩翼總有9個堿基對的靶序列，而Tn3兩 端總有5bp的靶序列。轉座可被分為復制性和非復制性兩大類。在復制性轉座中，所移動和轉位的是原轉座子的拷貝。轉座酶（transposase）和解離酶（resolvase）分別作用于原始轉座子和復制轉座子。TnA類轉座主要是這種形式。在非復制性轉座中，原始轉座子作為一個可移動的實體直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以這種方式進行轉座。3.轉座作用的遺傳學效應 轉座引起插入突變;2 轉座產生新的基因;3 轉座產生的染色體畸變;④ 轉座引起的生物進化.六、RNA代謝

除了某些RNA病毒之外，所有RNA分子都來自于DNA。基因組DNA通過一個被稱為轉錄的過程把貯存在雙鏈DNA分子中的遺傳信息轉換到與模板DNA鏈相互補的RNA單鏈上。

mRNA，編碼了一個或多個蛋白質序列；tRNA，把mRNA上的遺傳信息變為多肽中的氨基酸信息；rRNA，是合成蛋白質的工廠核糖體中的主要成份。1.依賴于DNA的RNA合成 從DNA合成反應的化學本質、極性和模板的使用這三方面來說，轉錄與復制是相同的。但是，也存在三個主要不同點: A.轉錄中不需要RNA引物；

B.轉錄反應一般只用一小段DNA做模板；

C.在轉錄區，一般都只有一條DNA鏈可以作為模板。2.RNA合成的終止

一旦RNA聚合酶啟動了基因轉錄，它就會沿著模板5'→3'方向不停地移動，合成RNA鏈，直到遇到終止信號時才釋放新生的RNA鏈，并與模板DNA脫離。

研究RNA鏈終止時遇到最常見的問題是3'端核苷酸的定位，因為活細胞內部根據終止信號正確終止的RNA與一個經過剪接的RNA在3'端沒有兩樣，都是-OH基團。模板DNA上都有終止轉錄的特殊信號--終止子，每個基因或操縱子都有一個啟動子，一個終止子。在新生RNA中出現發卡式結構會導致RNA聚合 酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5'端的正常結構。寡聚U的存在使雜合鏈的3'端部分出現不穩定的rU·dA區域。a.依賴于ρ因子的終止

ρ因子是一個相對分子質量為2.0×105的六聚體蛋白，它能水解各種核苷三磷酸，實際上是一種NTP酶。由于催化了NTP的水解，ρ因子能促使新生的RNA鏈從三元轉錄復合物中解離出來，從而終止轉錄。有人認為，在RNA合成起始以后，ρ因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產生的能量，沿著5'→3'方向朝RNA聚合酶移動，到達RNA的3'-OH端后取代了暫停在終止位點上的RNA聚合酶，并從模板和酶上釋放RNA，完成轉錄過程。終止過程需要消耗能量，所以，ρ因子具有終止轉錄和核苷三磷酸 酶兩種功能。b、不依賴于ρ 因子的終止

若終止點上游存在一個富含GC堿基的二重對稱區，由這段DNA轉錄產生的RNA容易形成發卡式結構；在終止點前面有一段由4-8個A組成的序列，導致轉錄產物的3‘端為寡聚U。這兩種結構特征的存在同樣決定了轉錄的終止。

在新生RNA中出現發卡式結構會導致RNA聚合酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5'端的正常結構。寡聚U的存在使雜合鏈的3'端部分出現不穩定的rU·dA區域。3.RNA聚合酶II及轉錄因子在啟動子上的裝配

TFⅡH還參與DNA的損傷修復。當RNA polⅡ轉錄過程中碰到受損傷的核苷酸時，TFⅡH能及時啟動核苷酸切除修復系統，將損傷修復。Actinomycin D和Acridine阻斷RNA鏈的延伸 4.RNA的加工成熟

所以，RNA加工成熟主要包括:5’加帽子結構；3’加多聚A；切除內含子。在Group I內含子切除體系中，鳥苷或鳥苷酸的3'-OH 作為親核基團向Intron 5'的磷酸二酯鍵發起進攻。

Group II內含子切除體系

核內mRNA原始轉錄產物的剪輯方式可能是最常見的。在這一模式中，RNA的剪輯需要特異性RNA-protein-復合物small nuclear rebonucleoproteins（snRNP）和small nuclear RNAs（snRNAs）。已經發現至少有5種snRNAs--U1，U2，U4，U5，U6。第五講 分子生物學研究法

一、重組DNA技術發展史上的重大事件

1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質，解決了遺傳的物質基礎問題；

2.50年代提示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半 保留復制機制,解決了基因的自我復制和世代交替問題；

3.50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達。年份 事 件

1869 F Miescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。

1944 O.T.Avery證實DNA是遺傳物質。

1952 A.D.Hershey和M.Chase再次證實和噬菌體的遺傳物質是DNA。

1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子結構的雙螺旋模型。M.Wilkins用X-射線衍射法證實了這一結構。

1957 A.Kornberg從大腸桿菌中發現了DNA聚合酶I。

1958 M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留復制模型。

1959-1960 S.Ochoa發現RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質分子中的氨基酸序列。

1961 Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；F.Jacob和J.Monod提出了調節基因表達的操縱子模型。

1964 C.Yanofsky和S.Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關系。1965 S.W.Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列測定；科學家證明細菌的抗藥性通常由“質粒”DNA所決定。

1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破譯了全部遺傳密碼。

1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸內切酶。H.M.Temin和D.Baltimore從RNA腫瘤病毒中發現反轉錄酶。

1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人發展了DNA重組技術，于72年獲得第一個重組DNA分子，73年完成第一例細菌基因克隆。

1975-1977 F.Sanger與A.Maxam、W.Gilbert等人發明了DNA序列測定技術。1977年完成了全長5387bp的噬菌體φ174基因組測定。

1978 首次在大腸桿菌中生產由人工合成基因表達的人腦激素和人胰島素。

1980 美國聯邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。

1981 R.D.Palmiter和R.L.Brinster獲得轉基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到轉基因果蠅。

1982 美、英批準使用第一例基因工程藥物--胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測定。

1983 獲得第一例轉基因植物。

1984 斯坦福大學獲得關于重組DNA的專利。

1986 GMO首次在環境中釋放。

1988 J.D.Watson出任“人類基因組計劃”首席科學家。

1989 DuPont公司獲得轉腫瘤基因小氧--“Oncomouse”。

1992 歐共體35個實驗室聯合完成酵母第三染色體全序列測定(315kb)1994 第一批基因工程西紅柿在美國上市。

1996 完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測定。

1997 英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。

基因工程中常見的名詞: 遺傳工程--genetic engineering，基因操作--gone manipulation，基因克隆--gone cloning，重組DNA技術--recombinant DNA technology，分子克隆--molecular cloning。基因工程的主要內容或步驟: 1.從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。

2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。

3.將重組DNA分子轉移到適當的受體細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖。

4.從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經得到擴增的目的基因。

5.將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現功能表達，產生出人類所需要的物質。

二、基因操作的主要技術原理

1.核酸的凝膠電泳(Agarose & Polyacrylamide)將某種分子放到特定的電場中，它就會以一定的速度向適當的電極移動。某物質在電場作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場強度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數成正比，而與分子的磨擦系數成反比（分子大小、極性、介質的粘度系數等）。

在生理條件下，核酸分子中的磷酸基團是離子化的，所以，DNA和RNA實際上呈多聚陰離子狀態（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場中，它就會由負極→正極移動。在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（EB）--ethidium bromide染色，此時，核酸分子在紫外光下發出熒光，肉眼能看到約50ng DNA所形成的條帶。DNA的脈沖電泳技術 FGE-Pulse-field gel electrophoresis 2.核酸的分子雜交技術

在大多數核酸雜交反應中，經過凝膠電泳 分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過毛細管作用或電導作用按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印” 轉移到濾膜上的。常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）等。

核酸分子雜交實驗包括如下兩個步驟: 將核酸樣品轉移到固體支持物濾膜上，這個過程特稱為核酸印跡(nucleic acid blotting)轉移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點和狹線印跡法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印跡法(colony and plaque blotting)；

將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標記或其它標記的DNA或RNA探針進行雜交。所以有時也稱這類核酸雜交為印跡雜交。3.細菌的轉化

所謂細菌轉化，是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA，而導致性狀特征發生遺傳改變的生命過程。這種提供轉化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉化DNA的寄主菌株則稱做受體菌株。大腸桿菌是最廣泛使用的實驗菌株。在加入轉化DNA之前，必須預先用CaCl2處理大腸桿菌細胞，使之呈感受 態（Competent Cells）。Mg2+對維持外源DNA的穩定性起重要作用，質粒DNA中的抗生素是篩選標記。對絕大多數hsdR-，hsdM-突變體菌株（k12），每ug DNA可得107-108個轉化子。4.DNA序列分析

a.Sanger的雙脫氧鏈終止法

Cambridge的F.Sanger在1977年發明用雙脫氧鏈終止法測定單鏈DNA的序列，其基本原理如下: 1DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準確的DNA互補鏈；2該酶能夠用2'，3'--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3'-末端，從而終止其延伸反應。在DNA測序反應中，加入模板DNA，引物（特異性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC 和一種ddNTP。常用Klenow大片段，無5'→3'外切酶活性。b.Maxam-Gilbert化學修飾法(哈佛大學)該方法的基本原理是用化學試劑處理具有末端放射性標記的DNA片段，造成堿基的特異性切割并產生一組具有不同長度的DNA鏈降解產物，經凝膠電泳分離和放射自顯影之后，可直接讀出待測DNA片段的核苷酸序列。

該反應的關鍵在于使DNA的4種核苷酸中，只有1-2種發生特異性的化學切割反應: 堿基的特異性修飾；

被修飾的堿基從核糖環上轉移；

失去堿基的糖環部位發生DNA鏈斷裂。

專門用來對核苷酸作化學修飾，并打斷磷酸二酯鍵的化學試劑有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。

硫酸二甲酯是堿性化學試劑，能使DNA鏈中鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位發生甲基化，在中性PH環境中就能使糖苷鍵發生水解，并引起DNA鏈的斷裂。在堿性條件下，肼能特異性切割C和T。如果加入1 mol/L的Nacl，那么，只有C被特異性切割。

c.DNA序列分析自動化

用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作為熒光劑標記DNA引物，帶有這種引物的DNA片段能在激光誘導下發出熒光。按照標準的雙脫氧終止法或化學終止法進行測序反應，跑DNA凝膠后用計算機檢測。

d.DNA雜交測序法(SBH-Sequencing by hybridization)

如果一段較短的DNA探針能與較長的DNA片段雜交，并形成完全的雙鏈結構，我們就推測在靶DNA上存在著相應的互補序列，這就是DNA雜交測序法的基本 原理。如果將一種12-mer的靶DNA與完全隨機合成的8-mer寡核苷酸控針混合雜交，在總數為48=65536種8-mer的控針群體中，僅有5種 探針會與靶DNA雜交，形成完全互補的雙鏈分子。

當靶DNA與標記探針形成G-T或G-A末端堿基錯配的雙鏈體時，檢測有一定難度。寡核苷酸探針越短，堿基錯配造成的去穩定效應越明顯，較易與完全的雙鏈 體分子相區分。但是，探針短，雜交產物的總體穩定性下降，信/噪比下降，影響結果的可靠性。所以，6-mer寡核苷酸矩陣芯片只能用于測定500bp的靶 DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。

SBH的應用: 1 可有效檢測靶DNA中的單堿基突變； 2 可用于不同DNA片段之間的序列比較； 可用于檢測不同生長發育狀態下細胞中特定基因的表達狀況； ④ 可用于檢驗傳統測序技術的準確性。

5.基因的定點誘變（site-directed mutagenesis）

使已克隆基因或DNA片段中的任何一個特定堿基發生取代、插入或缺失變化的過程叫作基因的定點誘變，是基因工程和蛋白質工程的重要手段。

a.盒式誘變(cassette mutagenesis)，包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。

b.寡核苷酸引物誘變

應用化學合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段做引物，進行DNA復制，使寡核苷酸引物成為新合成的DNA子鏈的一個部分。

C.PCRG與PCR誘變

6.利用DNA與蛋白質的相互作用進行核酸研究.a.凝膠滯緩實驗(Gel retardation assay)，又稱DNA遷移率變化試驗(DNA mobility shift assay--EMSA)。

b.DNase I 印跡試驗（DNase I foot printing）

主要步驟: 1 用32P標記DNA雙鏈末端，并用RE切去一端； 2 加入細胞特定周期蛋白質提取物，溫育； 加入適量DNaseI或硫酸二甲酯-六氫吡啶，使DNA鏈發生斷裂。

這一反應中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常關鍵，要保證一條鏈只發生一次斷裂！④沉淀DNA（包括與DNA相結合的蛋白質）； ⑤進行DNA凝膠分析。

如果某個蛋白質已經與DNA的特定區段相結合，那么，它就會保證該區段DNA免受消化或降解作用。在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應于蛋白質結合的部位不產生放射性標記的條帶。

c.甲基化干擾試驗(Methylation interference assay)

用DMS處理靶DNA，使平均每條鏈上只有一個G被甲基化。將局部甲基化的DNA與含DNA結合蛋白的細胞提取物共溫育后進行凝膠滯緩試驗。分離各種 DNA條帶，并用六氫吡啶切割甲基化的殘基。如果因某個G殘基的甲基化作用而阻止了蛋白質與DNA的結合，那么，六氫吡啶對這個甲基化G殘基的切割作用，就只能在沒有蛋白質結合的DNA中觀察到。

d.體內足跡試驗

用適量DMS處理完整的游離細胞，使染色質中的G殘基甲基化，提取DNA并加入六氫吡啶切割DNA鏈。與對照的裸露DNA經甲基化處理后形成的梯度相對照，就能發現DNA鏈上的蛋白質結合區。

三、分子克隆技術

1、高質量mRNA的制備

應用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分離Poly(A)RNA。將Biotinylated Oligo(dT)引物與細胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的Streptavidin，用磁場吸附與PMP相連的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。2.反轉錄成cDNA 可同時在反轉錄系統中加入Oligo（dT）12-18-mer及隨機引物R6，以保證得到全長cDNA； 應選用活性較高的反轉錄酶（Reverse transcriptase）； 應選用甲基化dCTP；

應保證所獲得雙鏈cDNA的方向性。

Super Script Choice cDNA合成系統中所用的poly（dT）引物

因為絕大多數大腸桿菌細胞都會切除帶有5'-methyl C的外源DNA，所以，應選用mcrA-mcrB-菌株。

3.分子克隆的主要方法

（1）構建cDNA、核DNA文庫，應用現有核酸探針分離新的目的基因；（2）差式雜交(differential screen)和扣除雜交(subtractive hybridization)技術；（3）DD-RT-PCR法及差別顯示技術；

（4）差別分析法(RDA法，即Representational difference analysis）；（5）酵母雙雜交體系Two-hybrid system；

（6）圖位克隆法（map-based cloning）與染色體步移（genomic DNA Walking）。

習慣上，人們用克隆表示由同一物種具有相同基因型的兩個或多個個體組成的群體。所以，從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotic twins）便屬于同一克隆。細胞學上，克隆是指由同一個祖細胞（progenitor cell）分裂而來的具有同一遺傳背景的子細胞群體。分子生物學上，把將外源DNA插入具有自主復制能力的載體DNA中，使之得以自主復制和永久保存的過 程叫做分子克隆。

文庫篩選與基因豐度有關。高豐度基因，如蠶絲心蛋白，卵清蛋白等在某些特定組織中可占細胞總mRNA量的50-90%，非常容易被分離。低豐度基因，一般 在細胞中只有10-20個拷貝，哺乳動物細胞中可含10,000到40,000種不同的mRNA，如果要達到99%的期望值，大約需要篩選150,000-170,000個克隆子。一般情況下，每微克cDNA可產生10萬-60萬個克隆子。

A.差式雜交或扣除雜交克隆技術 B.cRNA差式顯示法

除了極少數特例(如組蛋白基因)之外，幾乎所有的真核基因mRNA分子的3'-末端，都帶有一段多聚的腺苷酸結構，即通常所說的poly(A)尾巴。

P.Liang等人設計合成了全部12種不同的引物，用以反轉錄mRNA，合成第一鏈cDNA。這種引物通常叫作3'-端錨定脫氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M為除了T以外的任何一種核苷酸（即A、G或C），而N則為任何一種核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有 12種不同的排列組合方式。

DDRT-PCR的主要步驟: Ⅰ.從不同發育階段或不同基因型的細胞群體中分離mRNA，并以3'錨定引物作為反轉錄的引物，合成第一鍵cDNA；

Ⅱ.用5'隨機引物和某個3'端錨定引物對擴增第一鏈(摻入32p-dNTP)； Ⅲ.用DNA變性測序膠分離擴增產物，X光片曝光后檢測差別條帶； Ⅳ.回收特異性差別條帶；

Ⅴ.用同一引物對擴增已回收的DNA條帶；

Ⅵ.用Northern，Southern及測序法分析所得的條帶； Ⅶ.以該DNA片段做探針，篩選全長cDNA或核基因。

C.cDNA差式分析法(Representational ditterence analysis)

RDA法充分發揮了PCR以指數形式擴增雙鏈DNA模板的特性，通過降低cDNA群體復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴增了目的基因片段。因為 試驗對象（Tester）和供試探針（Driver）在接受差式分析前均經一個4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群（representation）保證絕大部分遺傳信息能被擴增。每次T減D反應后僅設置72℃復性與延伸，94℃復性這兩個參數共20個PCR循環，PCR產物的特異性和所得探針的純度非常高。

D.酵母雙雜交體系

Two-hybrid system也叫interaction trap（相互作用陷井），是90年代初發展起來的分離基因的新方法，可用于分離能與已知靶蛋白質（target protein）相互作用的基因。

基本原理: 真核生物的轉錄因子大多是由兩個結構上分開、功能上獨立的結構域組成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA結合域（BD），其C端768-881aa是轉錄激活域（AD）。一般情況下，AD能與GAL4效應基因啟動子上游的特定DNA區段（UAS）相結合，而此時，AD則推動了轉錄起始。

若用基因工程的方法，將GAL4 AD和BD分別克隆到不同的載體上，導入同一細胞株中表達，效應基因無法被激活,但可把來自不同轉錄因子的AD或BD區域連成一個功能基因。

主要實驗過程: a.選擇缺失GAL4編碼基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c； b.構建帶有GAL1 UAS-啟動子-lac Z（His3）的轉化載體;c.把已知的靶蛋白質編碼基因克隆到pGBT9的多克隆位點上，把所有cDNA都克隆到pGAD424載體上，構成cDNA表達文庫。

d.從大腸桿菌中分別提取這兩種重組質粒DNA，共轉化感受態釀酒酵母菌株。

e.將共轉化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培養基上，篩選表達相互作用的雜種蛋白的陽性菌落。

E.基因的圖位克隆法

Map-based cloning是分離未知性狀目的基因的一種好方法。從理論上說，所有具有某種表現型的基因都可以通過該方法克隆得到。首先，將目的基因定位到某個染色體 的特定位點，并在其兩側確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標記。

二、利用與目的基因最緊密連鎖的一對分子標記作探針，通過染色體步移技術將位于這兩個 標記之間的基因片段克隆并分離出來。

三、根據基因功能互作原理鑒定目的基因。

通過對許多不同的生態型及大量限制性內切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標記。在RFLP作圖中，連鎖距離是根據重組率來計算的，1cm（厘米）相當于1%的重組率。人類基因組中，1cm≈1000kb;擬南芥菜中，1cm≈290kb;小麥中，1cm≈3500kb。

四、DNA的Microarray 只要事先除去高度及中等重復序列，任何DNA都可以被用于Microarray。最簡單的例子是用機械手把極微量（nanoliters）的DNA點到玻 片或其它載體上，照射UV light使之永久固定，用不同細胞周期發育階段的cDNA作探針系統性地研究細胞中任意時期特異表達的基因；若把某一生物體內全部全部已知基因分別點到 DNA微列陣或者基因芯片上，再用不同發育階段的cDNA與之雜交，就能了解某些基因對特定生長發育階段的重要性；基因芯片還可用于進行基因診斷，可建立 正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標準雜交信號圖。用可疑病人的cDNA做探針與之雜交，檢查哪些基因的表達受抑制或激活。第六講 原核基因表達調控

原核生物和單細胞真核生物直接暴露在變幻莫測的環境中，食物供應毫無保障，只有能根據環境條件的改變合成各種不同的蛋白質，使代謝過程適應環境的變化，才 能維持自身的生存和繁衍。自然選擇傾向于保留高效率的生命過程。在一個每30min增殖一倍的109細菌群體中，若有一個細菌變成了29.5min增殖一 倍，大約經過80天的連續生長后，這個群體中的99.9%都將具有29.5min增殖一倍的生長速度。

一個大腸桿菌細胞中約有2500-3000個基因。估計正常情況下，可帶有107個蛋白質，平均每個基因產生3000多個蛋白質分子。但大腸桿菌中一般帶 有15,000-30,000個核糖體，有50余種核糖體結合蛋白，數量也很驚人。此外，負責糖酵解系統的蛋白質數量也很大。而象半乳糖苷酶等誘導酶，其 含量可少至每細胞僅1-5個分子。

一個體系在需要時被打開，不需要時被關閉。這種“開-關”（on-off）活性是通過調節轉錄來建立的，也就是說mRNA的合成是可以被調節的。當我們說 一個系統處于“off”狀態時，也有本底水平的基因表達，常常是每世代每個細胞只合成1或2個mRNA分子。所謂“關”實際的意思是基因表達量特別低，很 難甚至無法檢測。

科學家把這個從DNA到蛋白質的過程稱為基因表達(gene expression)，對這個過程的調節就稱為基因表達調控(gene regulation或gene control)。要了解動、植物生長發育的規律、形態結構特征和生物學功能，就必須弄清楚基因表達調控的時間和空間概念，掌握了基因表達調控的秘密，我 們手中就有了一把揭示生物學奧妙的金鑰匙。

基因表達調控主要表現在以下幾個方面: 1 轉錄水平上的調控(transcriptional regulation)； mRNA加工成熟水平上的調控(differential processing of RNA transcript)； 3 翻譯水平上的調控(differential translation of mRNA).原核生物中，營養狀況(nutritionalstatus)和環境因素(environmental factor)對基因表達起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormone level)和發育階段(developmental stage)是基因表達調控的最主要手段，營養和環境因素的影響力大為下降。

一、乳糖操縱子的調控模式

大腸桿菌乳糖操縱子(lactose operon)包括3個結構基因:Z、Y和A，以及啟動子、控制子和阻遏子等。轉錄時，RNA聚合酶首先與啟動區(promoter,P)結合，通過操縱 區(operator,O)向右轉錄。轉錄從O區的中間開始，按Z→Y→A方向進行，每次轉錄出來的一條mRNA上都帶有這3個基因。轉錄的調控是啟動區 和操縱區進行的。

Z編碼β-半乳糖苷酶；Y編碼β-半乳糖苷透過酶；A編碼β-半乳糖苷乙酰基轉移酶。β-半乳糖苷酶是一種β-半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖水解成葡 萄糖和半乳糖外，還能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透過酶的作用是使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透過大腸桿菌細胞壁和原生質 膜進入細胞內。β-半乳糖苷乙酰基轉移酶的作用是把乙酰輔酶A上的乙酰基轉到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。

1.酶的誘導-lac體系受調控的證據

在不含乳糖及β-半乳糖苷的培養基中，lac+基因型每個大腸桿功細胞內大約只有1-2個酶分子。如果在培養基中加入乳糖，酶的濃度很快達到細胞總蛋白量的6%或7%，每個細胞中可有超過105個酶分子。

科學家把大腸桿菌細胞放在加有放射性35S標記的氨基酸但沒有任何半乳糖誘導物的培養基中繁殖幾代，然后再將這些帶有放射活性的細菌轉移到不含35S、無 放射性的培養基中，隨著培養基中誘導物的加入，β-半乳糖苷酶便開始合成。分離β-半乳糖苷酶，發現這種酶無35S標記。說明酶的合成不是由前體轉化而來 的，而是加入誘導物后新合成的。

已經分離在有誘導物或沒有誘導物的情況下都能產生lacmRNA的突變體，這種失去調節能力的突變體稱為永久型突變體，為分兩類:I型和O型。

I型:野生型為I+，突變型為I-O型:野生型為O+，突變型為Oc。

I+→I-或O+→Oc后，Z、Y、A結構基因均表現為永久表達，所以I基因被稱為調節基因(regulatory gene)。研究發現，I基因是一個產生阻遏物的調節基因，其產物使體系關閉。I-突變體由于不能產生阻遏物，使細胞成為lac永久表達型。I-/I+局 部二倍體由于帶有一個正常阻遏物，使細胞中的lac仍然被抑制。

遺傳學圖譜分析指出，Oc突變位于I與Z之間，所以，lac體系的4個基因的序列為IOZY。通過這些觀察，Jacob和Monod推斷Oc突變代表 DNA鏈上的一個位點或一個非編碼區域，而不是一個基因，因為可編碼的基因具有互補性，而Oc沒有這一特性。O決定相鄰Z基因的產物是誘導型合成還是永久 型合成，O區域稱為操縱基因。

2.操縱子模型

Jacob和Monod認為誘導酶（他們當時稱為適應酶）現象是個基因調控問題，可以用實驗方法進行研究，因此選為突破口，終于通過大量實驗及分析，建立了該操縱子的控制模型。Z、Y、A基因的產物由同一條多順反子的mRNA分子所編碼。這個mRNA分子的啟動子緊接著O區，而位于I與O之間的啟動子區（P），不能單獨起動合成β-半乳糖苷酶和透過酶的生理過程。操縱基因是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結合位點。④當阻遏物與操縱基因結合時，lacmRNA的轉錄起始受到抑制。

⑤誘導物通過與阻遏物結合，改變它的三維構象，使之不能與操縱基因結合，從而激發lacmRNA的合成。當有誘導物存在時，操縱基因區沒有被阻遏物占據，所以啟動子能夠順利起始mRNA的合成。

3.Lac操縱子的本底水平表達

因為誘導物需要穿過細胞膜才能與阻遏物結合，而運轉誘導物需要透過酶。在非誘導狀態下有少量（1-5個mRNA分子）lac mRNA合成--本底水平永久型合成。

4.葡萄糖對lac操縱子的影響--代謝物阻遏效應

研究表明，葡萄糖對lac操縱子表達的抑制作用是間接的，因為存在一種大腸桿菌突變株，它正常的糖酵解過程受阻，葡萄糖-6-磷酸不能轉化為下一步代謝中間物，該菌株能在有葡萄糖存在的情況下被誘導合成lac mRNA。

5.cAMP與代謝物激活蛋白

當葡萄糖和乳糖同時存在于培養基中時，lac啟動子表達受阻，沒有β-半乳糖苷酶活性；當葡萄糖消耗完以后（圖中箭頭處），細胞內cAMP濃度增加，β-半乳糖苷酶活性被誘導，一度停止生長的細胞又恢復分裂。如果將細菌放在缺乏碳源的培養基中，細胞內cAMP濃度就很高；若在含葡萄糖的培養基中培養，細菌 中的cAMP濃度就會很低；如果將細菌置于甘油或乳糖等不進行糖酵解的碳源培養基中，細菌中cAMP的濃度也會很高。

研究證實，葡萄糖所引起的代謝物抑制(Catabolite repression)現象的實質是該代謝物降低了細胞中cAMP的含量.事實上，cAMP-CAP復合物是lac體系的positive regulator，它們不能代替lacI和lacO的功能(negative regulator)。

cAMP-CAP不但能與DNA相結合，造成雙螺旋彎曲，易于形成三元轉錄起始復合物，它還能直接影響RNA聚合酶的活性。Dominant negative（Trans-dominant）lacI-d，只要有這個“環”的亞基存在，lacI+基因產物（阻遏物）無法與O區相結合lac operon得到表達。

6.lac操縱子DNA的調控區域--P.O.區

lac P（啟動子區）從I基因結束到mRNA轉錄起始位點止，共長82bp（-82～+1）O區就是阻遏物結合區，位于P區后半部分和轉錄起始區（-7～+ 28），該區序列有對稱性，其對稱中心點在+11位。P區的CAMP-CAP結合區（-67～-52）也有對稱性，其對稱位點在-60～-59之間。

在一個完全被誘導的細胞中，β-半乳糖苷酶、透過酶及乙酰基轉移酶的拷貝數比例為1:0.5:0.2，這個比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作為唯一碳源時細胞的需要。不同的酶在數量上的差異是由于在翻譯水平上受到調節所致。

1lac mRNA可能與翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質鏈的翻譯。這種現象發生的頻率取決于每一個后續的AUG密碼子再度起始翻譯的概率。2在lac mRNA分子內部，A基因比Z基因?

第二篇：分子生物學課程教學講義 朱玉賢

分子生物學課程教學講義 朱玉賢

第一講 序論

二、現代分子生物學中的主要里程碑

分子生物學是研究核酸、蛋白質等所有生物大分子的形態、結構特征及其重要性、規律性和相互關系的科學，是人類從分子水平上真正揭開生物世界的奧秘，由被動地適應自然界轉向主動地改造和重組自然界的基礎學科。當人們意識到同一生物不同世代之間的連續性是由生物體自身所攜帶的遺傳物質所決定的，科學家為揭示這些遺傳密碼所進行的努力就成為人類征服自然的一部分，而以生物大分子為研究對像的分子生物學就迅速成為現代社會中最具活力的科學。

從1847年Schleiden和Schwann提出“細胞學說”，證明動、植物都是由細胞組成的到今天，雖然不過短短一百多年時間，我們對生物大分子--細胞的化學組成卻有了深刻的認識。孟德爾的遺傳學規律最先使人們對性狀遺傳產生了理性認識，而Morgan的基因學說則進一步將“性狀”與“基因”相耦聯，成為分子遺傳學的奠基石。Watson和Crick所提出的脫氧核糖酸雙螺旋模型，為充分揭示遺傳信息的傳遞規律鋪平了道路。在蛋白質化學方面，繼Sumner在1936年證實酶是蛋白質之后，Sanger利用紙電泳及層析技術于1953年首次闡明胰島素的一級結構，開創了蛋白質序列分析的先河。而Kendrew和Perutz利用X射線衍射技術解析了肌紅蛋白（myoglobin）及血紅蛋白（hemoglobin）的三維結構，論證了這些蛋白質在輸送分子氧過程中的特殊作用，成為研究生物大分子空間立體構型的先驅。1910年，德國科學家Kossel第一個分離了腺嘌呤，胸腺嘧啶和組氨酸。

1959年，美國科學家Uchoa第一次合成了核糖核酸，實現了將基因內的遺傳信息通過RNA翻譯成蛋白質的過程。同年，Kornberg實現了試管內細菌細胞中DNA的復制。

1962年，Watson（美）和Crick（英）因為在1953年提出DNA的反向平行雙螺旋模型而與Wilkins共獲Noble生理醫學獎，后者通過X射線衍射證實了Watson-Crick模型。

1965年，法國科學家Jacob和Monod提出并證實了操縱子（operon）作為調節細菌細胞代謝的分子機制。此外，他們還首次推測存在一種與DNA序列相互補、能將它所編碼的遺傳信息帶到蛋白質合成場所（細胞質）并翻譯產生蛋白質的mRNA（信使核糖核酸）。

1972年，Paul Berg（美）第一次進行了DNA重組。

1977年，Sanger和Gilbert（英）第一次進行了DNA序列分析。1988年，McClintock由于在50年代提出并發現了可移動遺傳因子（jumping gene或稱mobile element）而獲得Nobel獎。

1993年，美國科學家Roberts和Sharp因發現斷裂基因（introns）而獲得Nobel獎。Mullis由于發明PCR儀而與加拿大學者Smith（第一個設計基因定點突變）共享Nobel化學獎。

此外，Griffith（1928）及Avery（1944）等人關于致病力強的光滑型（S型）肺炎鏈球菌DNA導致致病力弱的粗糙型（R型）細菌發生遺傳轉化的實驗；Hershey和Chase（1952）關于DNA是遺傳物質的實驗；Crick于1954年所提出的遺傳信息傳遞規律（即中心法則）:Meselson和Stahl（1958）關于DNA半保留復制的實驗以及Yanofsky和Brener（1961）年關于遺傳密碼三聯子的設想都為分子生物學的發展做出了重大貢獻。

我國生物科學家吳憲20世紀20年代初回國后在協和醫科大學生化系與汪猷、張昌穎等人一道完成了蛋白質變性理論、血液生化檢測和免疫化學等一系列有重大影響的研究，成為我國生物化學界的先驅。20世紀60年代、70年代和80年代，我國科學家相繼實現了人工全合成有生物學活性的結晶牛胰島素，解出了三方二鋅豬胰島素的晶體結構，采用有機合成與酶促相結合的方法完成了酵母丙氨酸轉移核糖核酸的人工全合成，在酶學研究、蛋白質結構及生物膜結構與功能等方面都有世所矚目的建樹。

三、分子生物學的主要研究內容

所有生物體中的有機大分子都是以碳原子為核心，并以共價鍵的形式與氫、氧、氮及磷以不同方式構成的。不僅如此，一切生物體中的各類有機大分子都是由完全相同的單體，如蛋白質分子中的20種氨基酸、DNA及RNA中的8種堿基所組合而成的，由此產生了分子生物學的3條基本原理：

1． 構成生物體有機大分子的單體在不同生物中都是相同的； 2． 生物體內一切有機大分子的建成都遵循著各自特定的規則； 3． 某一特定生物體所擁有的核酸及蛋白質分子決定了它的屬性。分子生物學研究內容: DNA重組技術------基因工程 基因表達調控-------核酸生物學

生物大分子結構功能----結構分子生物學 DNA重組技術（又稱基因工程）

這是20世紀70年代初興起的技術科學，目的是將不同DNA片段（如某個基因或基因的一部分）按照人們的設計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產生影響受體細胞的新的遺傳性狀。嚴格地說，DNA重組技術并不完全等于基因工程，因為后者還包括其他可能使生物細胞基因組結構得到改造的體系。DNA重組技術是核酸化學、蛋白質化學、酶工程及微生物學、遺傳學、細胞學長期深入研究的結晶，而限制性內切酶DNA連接酶及其他工具酶的發現與應用則是這一技術得以建立的關鍵。

DNA重組技術有著廣闊的應用前景:DNA重組技術可用于定向改造某些生物基因組結構，使它們所具備的特殊經濟價值或功能得以成百 上千倍的地提高。DNA重組技術還被用來進行基礎研究。如果說，分子生物學研究的核心是遺傳信息的傳遞和控制，那么根據中心法則，我們要研究的就是從DNA到RNA，再到蛋白質的全過程，也即基因的表達與調控。在這里，無論是對啟動子的研究（包括調控元件或稱順式作用元件），還是對轉錄因子的克隆及分析，都離不開重組DNA技術的應用。

基因表達調控研究

因為蛋白質分子參與并控制了細胞的一切代謝活動，而決定蛋白質結構和合成時序的信息都由核酸（主要是脫氧核糖核酸）分子編碼，表現為特定的核苷酸序列，所以基因表達實質上就是遺傳信息的轉錄和翻譯。在個體生長發育過程中生物遺傳信息的表達按一定的時序發生變化（時序調節），并隨著內外環境的變化而不斷加以修正（環境調控）。

原核生物的基因組和染色體結構都比真核生物簡單，轉錄和翻譯在同一時間和空間內發生，基因表達的調控主要發生在轉錄水平。真核生物有細胞核結構，轉錄和翻譯過程在時間和空間上都被分隔開，且在轉錄和翻譯后都有復雜的信息加工過程，其基因表達的調控可以發生在各種不同的水平上。基因表達調控主要表現在信號傳導研究、轉錄因子研究及RNA剪輯3個方面。

轉錄因子是一群能與基因5'端上游特定序列專一結合，從而保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的蛋白質分子。

真核基因在結構上的不連續性是近10年來生物學上的重大發現之一。當基因轉錄成pre-mRNA后，除了在5'端加帽及3'端加多聚A[polyA]之外，還要將隔開各個相鄰編碼區的內含子剪去，使外顯子（編碼區）相連后成為成熟mRNA。研究發現，有許多基因不是將它們的內含子全部剪去，而是在不同的細胞或不同的發育階段有選擇地剪接其中部分內含子，因此生成不同的mRNA及蛋白質分子。

結構分子生物學

生物大分子的結構功能研究（又稱結構分子生物學）一個生物大分子，無論是核酸、蛋白質或多糖，在發揮生物學功能時，必須具備兩個前提:首先，它擁有特定的空間結構（三維結構）；其次，在它發揮生物學功能的過程中必定存在著結構和構象的變化。

結構分子生物學就是研究生物大分子特定的空間結構及結構的運動變化與其生物學功能關系的科學。它包括結構的測定、結構運動變化規律的探索及結構與功能相互關系的建立3個主要研究方向。最常見的研究三維結構及其運動規律的手段是X射線衍射的晶體學（又稱蛋白質晶體學），其次是用二維核磁共振和多維核磁研究液相結構，也有人用電鏡三維重組、電子衍射、中子衍射和各種頻譜學方法研究生物高分子的空間結構。

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第二講 染色體與DNA

一、DNA的組成與結構

Avery在1944年的研究報告中寫道：“當溶液中酒精的體積達到9/10時，有纖維狀物質析出。如稍加攪拌，它就會象棉線在線軸上一樣繞在硬棒上，溶液中的其它成份則呈顆粒狀沉淀。溶解纖維狀物質并重復數次，可提高其純度。這一物質具有很強的生物學活性，初步實驗證實，它很可能就是DNA（誰能想到！）”。對DNA分子的物理化學研究導致了現代生物學翻天覆地的革命，這更是Avery所沒有想到。

所謂DNA的一級結構，就是指4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了該DNA分子的化學構成。核苷酸序列對DNA高級結構的形成有很大影響，如B-DNA中多聚（G-C）區易出現左手螺旋DNA（Z-DNA），而反向重復的DNA片段易出現發卡式結構等。DNA不僅具有嚴格的化學組成，還具有特殊的高級結構，它主要以有規則的雙螺旋形式存在，其基本特點是：

1、DNA分子是由兩條互相平行的脫氧核苷酸長鏈盤繞而成的。

2、DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側，構成基本骨架，堿基排列在內側。

3、兩條鏈上的堿基通過氫鍵相結合，形成堿基對，它的組成有一定的規律。這就是嘌呤與嘧啶配對，而且腺嘌呤（A）只能與胸腺嘧啶（T）配對，鳥嘌呤（G）只能與胞嘧啶（C）配對。如一條鏈上某一堿基是C，另一條鏈上與它配對的堿基必定是G。堿基之間的這種一一對應的關系叫堿基互補配對原則。組成DNA分子的堿基雖然只有4種，它們的配對方式也只有A與T，C與G兩種，但是，由于堿基可以任何順序排列，構成了DNA分子的多樣性。例如，某DNA分子的一條多核苷酸鏈有100個不同的堿基組成，它們的可能排列方式就是4100。

二、DNA聚合酶與DNA的合成

The accuracy of translation relies on the specificity of base pairing.The actual rate in bacteria seems to be--10-8-10-10.This corresponds to-1 error per genome per 1000 bacterial replication cycles, or-10-6 per gene per generation.DNA polymerase might improve the specificity of complementary base selection at either(or both)of two stages: 1，It could scrutinize the incoming base for the proper complementarity with the template base;for example, by specifically recongnizing matching chemical features.This would be a presynthetic error control.2，Or it could scrutinize the base pair after the new base has been added to the chain, and, in those cases in which a mistake has been made, remove the most recently added base.This would be a proofreading control.三、DNA的生理意義及成分分析

早在1928年英國科學家Griffith等人就發現肺炎鏈球菌使小鼠殘廢的原因是引起肺炎。細菌的毒性（致病力）是由細胞表面莢膜中的多糖所決定的。具有光滑外表的S型肺炎鏈球菌因為帶有莢膜多糖而都能使小鼠發病，而具有粗糙外表的R型因為沒有莢膜多糖而失去致病力（莢膜多糖能保護細菌免受運動白細胞攻擊）。

首先用實驗證明基因就是DNA分子的是美國著名的微生物學家Avery。Avery等人將光滑型致病菌（S型）燒煮殺滅活性以后再侵染小鼠，發現這些死細菌自然喪失了致病能力。再用活的粗糙型細菌（R型）來侵染小鼠，也不能使之發病，因為粗糙型細菌天然無致病力。當他們將經燒煮殺死的S型細菌和活的R型細菌混合再感染小鼠時，實驗小鼠每次都死了。解剖死鼠，發現有大量活的S型（而不是R型）細菌。他們推測，死細菌中的某一成分棗轉化源（transforming principle）將無致病力的細菌轉化成病原細菌。

美國冷泉港卡內基遺傳學實驗室科學家Hershey和他的學生Chase在1952年從事噬菌體侵染細菌的實驗。噬菌體專門寄生在細菌體內。它的頭、尾外部都有由蛋白質組成的外殼，頭內主要是DNA。噬菌體侵染細菌的過程可以分為以下5個步驟：①噬菌體用尾部的末端（基片、尾絲）吸附在細菌表面；②噬菌體通過尾軸把DNA全部注入細菌細胞內，噬菌體的蛋白質外殼則留在細胞外面；③噬菌體的DNA一旦進入細菌體內，它就能利用細菌的生命過程合成噬菌體自身的DNA和蛋白質；④新合成的DNA和蛋白質外殼，能組裝成許許多多與親代完全相同的子噬菌體；⑤子代噬菌體由于細菌的解體而被釋放出來，再去侵染其他細菌。他們發現被感染的細菌中帶有70%的噬菌體DNA，但只帶有20%的噬菌體蛋白質。子代噬菌體中帶有50%標記的DNA，卻只有1%的標記蛋白質。四.C-value和Cot1/2 The total amount of DNA in the haploid genome is a characteristic of each living species known as C-value.Cot1/2 is the product of concentration and time required for 50% reassociation given in nucleotide-moles × second/liter.五、染色體結構

DNA molecules are the largest macromolecules in the cell and are commonly packaged into structures called “chromosomes”, most bacteria & viruses have a single chromosome where as Eukaryotic cells usually contain many.任何一條染色體上都帶有許多基因，一條高等生物的染色體上可能帶有成千上萬個基因，一個細胞中的全部基因序列及其間隔序列統稱為genomes（基因組）。如果設想將人體細胞中的DNA分子繞地球一周，那么，每個堿基大約只占1－5厘米，而一個2－3kb的基因只相當于地球上一條數十米長，數厘米寬的線段！

Genotype(基因型)： The genetic constitution of a given organism(指某個特定生物體細胞內的全部遺傳物質)。Phenotype(表現型)： Visible property of any given organism(某個特定生物體中可觀察到的物理或生理現象)。Mutations： 染色體DNA中可遺傳的核苷酸序列變化。

六、染色體的組成1．染色質和核小體

染色質DNA的Tm值比自由DNA高，說明在染色質中DNA極可能與蛋白質分子相互作用；在染色質狀態下，由DNA聚合酶和RNA聚合酶催化的DNA復制和轉錄活性大大低于在自由DNA中的反應；DNA酶I（DNaseI）對染色質DNA的消化遠遠慢于對純DNA的作用。染色質的電子顯微鏡圖顯示出由核小體組成的念珠狀結構，可以看到由一條細絲連接著的一連串直徑為10nm的球狀體。

核小體是由H2A、H2B、H3、H4各兩個分子生成的八聚體和由大約200bpDNA組成的。八聚體在中間，DNA分子盤繞在外，而H1則在核小體的外面。每個核小體只有一個H1。在核小體中DNA盤繞組蛋白八聚體核心，從而使分子收縮成1/7，200bpDNA的長度約為68nm，卻被壓縮在10nm的核小體中。但是，人中期染色體中含3.3×109堿基對，其理論長度應是180cm，這么長的DNA被包含在46個51μm長的圓柱體（染色體）中，其壓縮比約為104。

2．染色體中的核酸組成

⑴不重復序列 在單倍體基因組里，這些序列一般只有一個或幾個拷貝，它占DNA總量的40%－80%。不重復序列長約750－2000dp，相當于一個結構基因的長度。單拷貝基因通過基因擴增仍可合成大量的蛋白質，如一個蠶絲心蛋白基因可作為模板合成104個絲心蛋白mRNA，每個mRNA可存活4d，共合成105個絲心蛋白，這樣，在幾天之內，一個單拷貝絲心蛋白基因就可以合成109個絲心蛋白分子。

⑵中度重復序列 這類重復序列的重復次數在10－104之間，占總DNA的10%－40%。各種rRNA、tRNA 及組蛋白基因等都屬這一類。

非洲爪蟾的18S、5.8S及28SrRNA基因是連在一起的，中間隔著不轉錄的間隔區，這些單位在DNA鏈上串聯重復約5000次。在卵細胞形成過程中這些基因可進行幾千次不同比例的復制，產生2×106個拷貝，使rDNA占卵細胞DNA的75%，從而使該細胞能積累1012個核糖體。

⑶高度重復序列——衛星DNA 這類DNA只在真核生物中發現，占基因組的10%—60%，由6—100個堿基組成，在DNA鏈上串聯重復幾百萬次。由于堿基的組成不同，在CsCl密度梯度離心中易與其他DNA分開，形成含量較大的主峰及高度重復序列小峰，后者又稱衛星區帶（峰）。

高等真核生物DNA無論從結構還是功能看都極為復雜，以小鼠為例：

1.小鼠總DNA的10％是小于10bp的高度重復序列，重復數十萬到上百萬次/genome。

2.總DNA的20％是重復數千次、長約數百bp的中等重復序列。

3.總DNA的70％是不重復或低重復序列,絕大部分功能基因都位于這類序列中。

Centromere：是細胞有絲分裂期間紡錘體蛋白質與染色體的結合位點（attachment point），這種結合對于染色體對在子細胞中的有序和平均分配至關重要。在酵母中，centromere的功能單位長約130 bp，富含AT 堿基對。在高等真核細胞中，centromere都是由長約5－10 bp、方向相同的高度重復序列所組成。

Telomeres are sequences at the ends of eukaryotic Chromosomes that help stabilize them。酵母Telomeres一般以100 bp左右不精確重復序列所組成。5’(TxGy)n 3’(AxCy)n 其中X、Y一般為1－4，單細胞真核生物中n常為20－100，高等真核生物中>1500。染色體末端的線性重復序列不能被DNA polymarase 所準確復制，它們一般在DNA復制完成以后由telomarase合成后加到染色體末端。

Alu（長約300bp）是人類高度重復序列,因為該序列中帶有AluI的識別序列而得名。數十萬個Alu重復序列散布于整個人類

如果注射后經數小時（或數天）收獲肝臟，所有細胞成份中都帶有放射性標記的蛋白質;如果注射后幾分鐘內即收獲肝臟，那么，放射性標記只存在于含有核糖體顆粒的細胞質成份中。

（2）Francis Crick等人第一次證實只有用三聯子密碼的形式才能把包含在由AUGC四個字母組成遺傳信息（核酸）準確無誤地翻譯成由20種不同氨基酸組成的蛋白質序列，實現遺傳信息的表達。實驗1: 用吖啶類試劑（誘導核苷酸插入或丟失）處理T4噬菌體rII位點上的兩個基因，使之發生移碼突變（frame-shift），就生成完全不同的、沒有功能的蛋白質。實驗2: 研究煙草壞死衛星病毒發現，其外殼蛋白亞基由400個氨基酸組成，相應的RNA片段長1200個核苷酸，與密碼三聯子體系正好相吻合。實驗3: 以均聚物為模板指導多肽的合成。在含有tRNA、核糖體、AA-tRNA合成酶及其它蛋白質因子的細胞抽提物中加入mRNA或人工合成的均聚物作為模板以及ATP、GTP、氨基酸等成分時又能合成新的肽鏈，新生肽鏈的氨基酸順序由外加的模板來決定。

1961年，Nirenberg等以poly（U）作模板時發現合成了多聚苯丙氨酸，從而推出UUU代表苯丙氨酸（Phe）。以poly（C）及poly（A）做模板分別得到多聚脯氨酸和多聚賴氨酸。實驗4: 以特定序列的共聚物為模板指導多肽的合成。以多聚二核苷酸作模板可合成由2個氨基酸組成的多肽，5'?UGU GUG UGU GUG UGU GUG?3',不管讀碼從U開始還是從G開始，都只能有UGU（Cys）及GUG（Val）兩種密碼子。實驗5: 以共聚三核苷酸作為模板可得到有3種氨基酸組成的多肽。如以多聚（UUC）為模板，可能有3種起讀方式：

5’?UUC UUC UUC UUC UUC?3’或 5’?UCU UCU UCU UCU UCU?3’或 5'?CUU CUU CUU CUU CUU?3'分別產生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu）.多聚三核苷酸為模板時也可能只合成2種多肽：5’?GUA GUA GUA GUA GUA?3’或5’?UAG UAG UAG UAG UAG?3’ 或5’?AGU AGU AGU AGU AGU?3’由第二種讀碼方式產生的密碼子UAG是終止密碼，不編碼任何氨基酸，因此，只產生GUA（Val）或AGU（Ser）。實驗6: 以隨機多聚物指導多肽合成。Nirenberg等及Ochoa等又用各種隨機的多聚物作模板合成多肽。例如，以只含A、C的多聚核苷酸作模板，任意排列時可出現8種三聯子，即CCC、CCA、CAC、ACC、CAA、ACA、AAC、AAA，獲得由Asn、His、Pro、Gln、Thr、Lys等6種氨基酸組成的多肽。

（3）氨基酸的“活化”與核糖體結合技術。

如果把氨基酸與ATP和肝臟細胞質共培養，氨基酸就會被固定在某些熱穩定且可溶性RNA分子（transfer RNA，tRNA）上。現將氨基酸活化后的產物稱為氨基酰-tRNA（aminoacyl-tRNA），并把催化該過程的酶稱為氨基酰合成酶（aminoacyl-tRNA Synthetase）。以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等為模板，在含核糖體、AA-tRNA的反應液中保溫后通過硝酸纖維素濾膜，只有游離的AA-tRNA因相對分子質量小而通過濾膜，而核糖體或與核糖體結合的AA-tRNA則留在濾膜上，這樣可把已結合與未結合的AA-tRNA分開。

當體系中帶有多聚核苷酸模板時，從大腸桿菌中提取的核糖體經常與特異性氨基酰-tRNA相結合。如果把核糖體與poly（U）和Phe-tRNAPhe共溫育，核糖體就能同時與poly（U）和Phe-tRNAPhe相結合。

4種核苷酸組成61個編碼氨基酸的密碼子和3個終止密碼子，它們不能與tRNA的反密碼子配對，但能被終止因子或釋放因子識別，終止肽鏈的合成。由一種以上密碼子編碼同一個氨基酸的現象稱為簡并（degeneracy），對應于同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子（synonymous codon）。

三．密碼子和反密碼子的相互作用

蛋白質生物合成過程中，tRNA的反密碼子通過堿基的反向配對與mRNA的密碼子相互作用。1966年，Crick根據立體化學原理提出擺動假說（wobble hypothesis），解釋了反密碼子中某些稀有成分如I以及許多有2個以上同源密碼子的配對問題。Wobble hypothesis ① 任意一個密碼子的前兩位堿基都與tRNA anticodon中的相應堿基形成Watson-Crick堿基配對。

② 反密碼子第一位是A或C時，只能識別一個密碼子。當反密碼子第一位是U或G時，能識別兩個密碼子。當Inosine（I）作為反密碼子第一位時，能識別三個密碼子。

③ 如果數個密碼子同時編碼一個氨基酸，凡是第一、二位堿基不相同的密碼子都對應于各自的tRNA。

④ 根據上述規則，至少需要32種不同的tRNA才能翻譯61個密碼子。

四．tRNA tRNA在蛋白質合成中處于關鍵地位，被稱為第二遺傳密碼。它不但為將每個三聯子密碼翻譯成氨基酸提供了接合體，還為準確無誤地將所需氨基酸運送到核糖體上提供了載體。所有的tRNA都能夠與核糖體的P位點和A位點結合，此時，tRNA分子三葉草型頂端突起部位通過密碼子：反密碼子的配對與mRNA相結合，而其3’末端恰好將所轉運的氨基酸送到正在延伸的多肽上。代表相同氨基酸的tRNA稱為同工tRNA。在一個同工tRNA組內，所有tRNA均專一于相同的氨基酰-tRNA合成酶。

1、tRNA的三葉草型二級結構

受體臂（acceptor arm）主要由鏈兩端序列堿基配對形成的桿狀結構和3’端末配對的3-4個堿基所組成，其3’端的最后3個堿基序列永遠是CCA，最后一個堿基的3’或2’自由羥基（—OH）可以被氨酰化。TφC臂是根據3個核苷酸命名的，其中φ表示擬尿嘧啶，是tRNA分子所擁有的不常見核苷酸。反密碼子臂是根據位于套索中央的三聯反密碼子命名的。D臂是根據它含有二氫尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。最常見的tRNA分子有76個堿基，相對分子質量約為2.5×104。不同的tRNA分子可有74-95個核苷酸不等，tRNA分子長度的不同主要是由其中的兩條手臂引起的。tRNA的稀有堿基含量非常豐富，約有70余種。每個tRNA分子至少含有2個稀有堿基，最多有19個，多數分布在非配對區，特別是在反密碼子3'端鄰近部位出現的頻率最高，且大多為嘌呤核苷酸。這對于維持反密碼子環的穩定性及密碼子、反密碼子之間的配對是很重要的。2．tRNA的L形三級結構 酵母和大腸桿菌tRNA的三級結構都呈L形折疊式。這種結構是靠氫鍵來維持的，tRNA的三級結構與AA-tRNA合成酶的識別有關。受體臂和TφC臂的桿狀區域構成了第一個雙螺旋，D臂和反密碼子臂的桿狀區域形成了第二個雙螺旋。

tRNA的L形高級結構反映了其生物學功能，因為它上所運載的氨基酸必須靠近位于核糖體大亞基上的多肽合成位點，而它的反密碼子必須與小亞基上的mRNA相配對，所以兩個不同的功能基團最大限度分離。3．tRNA的功能

轉錄過程是信息從一種核酸分子（DNA）轉移至另一種結構上極為相似的核酸分子（RNA）的過程，信息轉移靠的是堿基配對。翻譯階段遺傳信息從mRNA分子轉移到結構極不相同的蛋白質分子，信息是以能被翻譯成單個氨基酸的三聯子密碼形式存在的，在這里起作用的是解碼機制。4．tRNA的種類

（1）起始tRNA和延伸tRNA 能特異地識別mRNA模板上起始密碼子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA統稱為延伸tRNA。原核生物起始tRNA攜帶甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA攜帶甲硫氨酸（Met）。（2）同工tRNA 代表同一種氨基酸的tRNA稱為同工tRNA，同工tRNA既要有不同的反密碼子以識別該氨基酸的各種同義密碼，又要有某種結構上的共同性，能被AA-tRNA合成酶識別。（3）校正tRNA 校正tRNA分為無義突變及錯義突變校正。在蛋白質的結構基因中，一個核苷酸的改變可能使代表某個氨基酸的密碼子變成終止密碼子（UAG、UGA、UAA），使蛋白質合成提前終止，合成無功能的或無意義的多肽，這種突變就稱為無義突變。

五．AA-tRNA合成酶 是一類催化氨基酸與tRNA結合的特異性酶，其反應式如下： 它實際上包括兩步反應：

第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸復合物。AA+ATP+酶（E）→E-AA-AMP+PPi 第二步是氨酰基轉移到tRNA 3’末端腺苷殘基上，與其2’或3’-羥基結合。E-AA-AMP+ tRNA→AA-tRNA +E+AMP

蛋白質合成的真實性主要決定于AA-tRNA合成酶是否能使氨基酸與對應的tRNA相結合。AA-tRNA合成酶既要能識別tRNA，又要能識別氨基酸，它對兩者都具有高度的專一性。不同的tRNA有不同堿基組成和空間結構，容易被tRNA合成酶所識別，困難的是這些酶如何識別結構上非常相似的氨基酸。

有兩道關口: The first filter is the initial binding of the amino acid to the enzyme and its activation to aminoacyl-AMP.The second filter is the binding of incorrect aminoacyl-AMP products to a separate active site on the enzyme.核糖體像一個能沿mRNA模板移動的工廠，執行著蛋白質合成的功能。它是由幾十種蛋白質和幾種核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）組成的亞細胞顆粒。一個細菌細胞內約有20000個核糖體，而真核細胞內可達106個，在未成熟的蟾蜍卵細胞內則高達1012。核糖體和它的輔助因子為蛋白質合成提供了必要條件。

1.核糖體的組成

原核生物核糖體由約2/3的RNA及1/3的蛋白質組成。真核生物核糖體中RNA占3/5，蛋白質占2/5。核糖體是一個致密的核糖核蛋白顆粒，可以解離為兩個亞基，每個亞基都含有一個相對分子質量較大的rRNA和許多不同的蛋白質分子。

大腸桿菌核糖體小亞基由21種蛋白質組成，分別用S1??S21表示，大亞基由33種蛋白質組成，分別用L1??L33表示。真核生物細胞核糖體大亞基含有49種蛋白質，小亞基有33種蛋白質。

2、rRNA 3.核糖體的功能

核糖體包括至少5個活性中心，即mRNA結合部位、結合或接受AA-tRNA部位（A位）、結合或接受肽基tRNA的部位、肽基轉移部位（P位）及形成肽鍵的部位（轉肽酶中心），此外還有負責肽鏈延伸的各種延伸因子的結合位點。小亞基上擁有mRNA結合位點，負責對序列特異的識別過程，如起始位點的識別和密碼子與反密碼子的相互作用。大亞基負責氨基酸及tRNA攜帶的功能，如肽鍵的形成、AA-tRNA、肽基-tRNA的結合等。A位、P位、轉肽酶中心等主要在大亞基上。

核糖體可解離為亞基或結合成70S/80S顆粒。翻譯的起始階段需要游離的亞基，隨后才結合成70S/80S顆粒，繼續翻譯進程。體外反應體系中，核糖體的解離或結合取決于Mg2+離子濃度。在大腸桿菌內，Mg2+濃度在10-3mol/L以下時，70S解離為亞基，濃度達10-2mol/L時則形成穩定的70S顆粒。細胞中大多數核糖體處于非活性的穩定狀態，單獨存在，只有少數與mRNA一起形成多聚核糖體。它從mRNA的5'末端向3'末端閱讀密碼子，至終止子時合成一條完整的多肽鏈。mRNA上核糖體的多少視mRNA的長短而定，一般40個核苷酸有一個核糖體。

七.信使核糖核酸

mRNA messenger ribonucleic acidDNA deoxyribonucleic acid.雖然mRNA在所有細胞內執行著相同的功能，即通過三聯子密碼翻譯生成蛋白質，其生物合成的具體過程和成熟mRNA的結構在原核和真核生物細胞內是不同的。

八、蛋白質的生物合成

核糖體是蛋白質合成的場所，mRNA是蛋白質合成的模板，tRNA是模板與氨基酸之間的接合體。此外，有20種以上的AA-tRNA及合成酶、10多種起始因子、延伸因子及終止因子，30多種tRNA及各種rRNA、mRNA和100種以上翻譯后加工酶參與蛋白質合成和加工過程。蛋白質合成消耗了細胞中90%左右用于生物合成反應的能量。細菌細胞中的2萬個核糖體，10萬個蛋白質因子和20萬個tRNAs 約占大腸桿菌干重的35%。在大腸桿菌中合成一個100個氨基酸的多肽只需5分鐘。

1.蛋白質生物合成的主要步驟：

翻譯的起始——核糖體與mRNA結合并與氨基酰-tRNA生成起始復合物。肽鏈的延伸——核糖體沿mRNA5’端向3’端移動，導致從N端向C端的多肽合成。肽鏈的終止以及肽鏈的釋放——核糖體從mRNA上解離，準備新一輪合成反應。主要分為五步

1、Activation of Amino Acids(This reaction takes place in the cytosol, not on the ribosome).2、Initiation.The mRNA bearing the code for the polypeptide binds to the small ribosomal subunit and to the initiating aminoacyl-tRNA.3、Elongation.Peptide bonds are formed in this stage.4、Termination and Release.Completion of the polypeptide chain is signaled by a termination codon in the mRNA.5、Folding and Post translational Processing.肽鏈延伸分為三步

① Binding of an incoming aminoacyl-tRNA.② Peptide bond formation.③ Translocation.2.與蛋白質合成有關的因子

起始因子Initiation factor（IF）延伸因子Elongation factor（EF）終止因子。原核中有RF1-3。RF-1 識別 UAA和UAG;RF-2 識別 UAA和UGA;RF-3 僅能促進RF-1和RF-2的功能。終止因子行使功能時需要GTP。真核生物中只有一個RF，能識別3個終止子。

3、蛋白質合成的起始 蛋白質合成的起始復合物: 30S 核糖體小亞基 模板mRNA fMet-tRNAfMet 起始因子 GTP 50S 核糖體大亞基 Mg2+ 合成的起始可分為三步: 1、30S 核糖體小亞基與起始因子IF –1和IF-3相結合，誘發模板mRNA與小亞基結合。

2、由30S 小亞基、起始因子IF –1和IF-3及模板mRNA所組成的復合物立即與GTP-IF-2及fMet-tRNAfMet相結合。反密碼子與密碼子配對。

3、上述六組分復合物再與50S大亞基結合，水解GTP生成并釋放GDP和Pi。釋放三個起始因子。

表27-9 真核細胞中參與翻譯起始的蛋白質因子及其功能

真核因子 功能

eIF2 促進Met-tRNAMet與核糖體40S小亞基結合。

eIF2B eIF3

是最早與核糖體40S小亞基結合的促進因子，蛋白質合成反應的正常進行。

eIF4A 具有RNA解旋酶活性，解除mRNA模板的次級結構并使之與40S小亞基結合，形成eIF4F復合物。

eIF4B 與mRNA模板相結合，協助核糖體掃描模板序列，定位AUG。

eIF4E 與mRNA 5'的帽子結構相結合，形成eIF4F復合物。eIF4G 與eIF4E和poly（A）結合蛋白（PAB）相結合，形成eIF4F復合物。

eIF5 促使多個蛋白因子與40S小亞基解體，以此幫助大小亞基結合形成80核糖體，形成翻譯起始復合物。

eIF6 促進沒有蛋白質合成活性的80S核糖體解離成40S和60S兩個亞基。

4、肽鏈的延伸

肽鏈延伸的基本要求是 ： 有完整的起始復合物，有氨基酰-tRNA，有延伸因子EF-Tu, EF-Ts和EF-G，有GTP。

肽鏈延伸也可被分為三步：

第一步，與新進來的氨基酰-tRNA相結合。氨基酰-tRNA首先必須與GTP-EF-Tu復合物相結合，形成氨基酰-tRNA-GTP-EF-Tu復合物并與70S中的A位點相結合。此時，GTP水解并釋放GDP-EF-Tu復合物。

第二步，肽鍵形成。肽鍵形成之初，兩個氨基酸仍然分別與各自的tRNA相結合，仍然分別位于A位點和P位點上。A位點上的氨基酸（第二個氨基酸）中的α-氨基作為親核基團取代了P位點上的tRNA，并與起始氨基酸中的COOH基團形成肽鍵。本反應可能由peptidyl transferase 催化。

第三步，移位（translocation）。核糖體向mRNA的3’方向移動一個密碼子，使得帶有第二個氨基酸（現已成為二肽）的tRNA從A位進入P位，并使第一個tRNA從P位進入E位。此時模板上的第三個密碼子正好在A位上。核糖體的移位需要EF-G（translocase）和另一分子GTP水解提供能量。

5、肽鏈的終止

當終止密碼子進入核糖體A位點時，在釋放因子RF1-3的作用下：

（1）水解末端肽基tRNA；（2）釋放新生肽和tRNA；

（3）使70S核糖體解離成30S和50S兩個亞基。

6、蛋白質合成的抑制劑

抗菌素對蛋白質合成的作用可能是阻止mRNA與核糖體結合（氯霉素），或阻止AA-tRNA與核糖體結合（四環素類），或干擾AA-tRNA與核糖體結合而產生錯讀（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等），或作為競爭性抑制劑抑制蛋白質合成。

鏈霉素是一種堿性三糖，干擾fMet-tRNA與核糖體的結合，從而阻止蛋白質合成的正確起始，并導致mRNA的錯讀。若以poly（U）作模板，則除苯丙氨酸（UUU）外，異亮氨酸（AUU）也會摻入。對鏈霉素敏感位點在30S亞基上。

嘌呤霉素是AA-tRNA的結構類似物，能結合在核糖體的A位上，抑制AA-tRNA的進入。它所帶的氨基與AA-tRNA上的氨基一樣，能與生長中肽鏈上的羧基生成肽鍵，這個反應的產物是一條3'羧基端掛了一嘌呤霉素。

青霉素、四環素和紅霉素只與原核細胞核糖體發生作用，從而阻遏原核生物蛋白質的合成，抑制細菌生長。氯霉素和嘌呤霉素既能與原核細胞核糖體結合，又能與真核生物核糖體結合，妨礙細胞內蛋白質合成，影響細胞生長。因此，前3種抗生素被廣泛用于人類醫學，后兩種則很少在醫學上使用。

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第四講 DNA、RNA和蛋白質代謝

DNA是貯藏遺傳信息的最重要的生物大分子。DNA分子中的核苷酸排列順序不但決定了胞內所有RNA及蛋白質的基本結構，還通過蛋白質（酶）的功能間接控制了細胞內全部有效成份的生產、運轉和功能發揮。貯藏在任何基因中的生物信息都必須首先被轉錄生成RNA，才能夠得到表達。DNA和RNA雖然很相似，只有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同，但它們的生物學活性卻很不同。

RNA主要以單鏈形式存在于生物體內，其高級結構很復雜；RNA既擔負著貯藏及轉移遺傳信息的功能，又能作為核酶直接在細胞內發揮代謝功能。

蛋白質是生物信息通路上的終產物，一個活細胞在任何發育階段都需要數千種不同的蛋白質。因此，活細胞內時刻進行著各種蛋白質的合成、修飾、運轉和降解反應。

一、核苷酸的合成與代謝

核苷酸是DNA和RNA的前體是細胞內化學能流通領域中的載體（ATP，GTP）,是NAD、FAD、S-adenosylmethionine及 Coenzyme A等的重要成份。在糖代謝中也有重要作用，如生成UDPG和 CDP-diacylglycerol等。cAMP, cGMP還是第二信使。

1、De Novo嘌呤核苷酸的生物合成始于PRPP（Phosphoribosyl 1-pyrophosphate）

這一途徑的第一步是由谷氨酰胺捐獻一個氨基到PRPP的C-1位上，生成5-phosphoribosylamine。

其次，把甘氨酸中的三個基團加到PRA上。第三，由N10-甲基四氫葉酸提供一個甲基。第四，谷氨酰胺提供另一個N。第五，脫水環化形成咪唑環。第六，羧基化

第七，通過分子重排將羧基從咪唑第4碳的環外氨基上轉移到第5位碳原子上。第八-九，由天門冬酰胺把另一個氨基加到第5位碳原子上。第十，再由N10-甲基四氫葉酸提供一個甲基。第十一，脫水環化，形成嘌呤IMP。

參與合成AMP的是①腺苷琥珀酸合成酶和②腺苷琥珀酸裂解酶。參與合成GMP的是③IMP脫氫酶和④XMP-谷氨酰胺酰胺轉移酶。

2.嘌呤核苷酸合成中的反饋調節

3．嘧啶核苷酸是由天門冬酰胺、PRPP和氨基甲酰磷酸等共同形成的 嘧啶從頭合成途徑不同于嘌呤的合成，6-原子嘧啶環首先被合成，然后才與核糖-5-磷酸相連。這個反應需要氨基甲酰磷酸（Carbamoyl phosphate）。4．核苷單磷酸轉化為核苷三磷酸

反應生成的ADP可通過糖酵解酶或氧化磷酸化途徑被進一步磷酸化。ATP能夠把磷酸基團加到其它所有核苷單磷酸上生成核苷三磷酸。

核苷二磷酸可通過一個公用的核苷二磷酸激酶被進一步磷酸化生成核苷三磷酸。

5．核糖核苷酸（ribonucleotides）是脫氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleotides）的前體。所有dNTP都直接來自于NTP（其實是NDP）。這個反應很特殊，因為核糖上的還原反應發生于一個沒有活化的碳原子上。催化該反應的酶是核糖核苷酸還原酶。

大腸桿菌核苷酸還原酶有兩大特征，它的生物學活性和底物特異性同時受效應子（effector molecules）的影響。每個R1亞基上都有兩個調節位點，當影響整體酶活性的那個位點與ATP相結合時，酶活性增加；而當它與dATP結合時，酶活性消失。

第二個調節位點控制了底物特異性。當dATP與該位點相結合時，UDP和CDP的還原反應優先進行。當dTTP與該位點相結合時，GDP的還原反應優先進行。核糖核苷酸還原反應的主要過程

1.還原酶R2亞基處于氧化態-X˙，向核糖3'位碳原子上的H發起攻擊，生成3'位自由基。2.R1亞基上的-SH基團為2'-OH提供一個H原子，使之生成-OH2基團。3.脫水后，3'位自由基幫助維持2'位O+基團。

4.R1亞基上的另一個-SH基團為2'-CH+提供一個H原子 5.2'上的C˙-OH向R2亞基上的X-H發起攻擊。6.2'上的C-OH失去氧原子，生成dNDP。其中，dTMP（thymidylate）來自于dCDP和dUMP，其直接前體是dUMP，由胸苷酸合酶（thymidylate synthase）將dUMP轉化為dTMP；反應中的甲基來自于N5，N10-Methylene-tetrahydrofolate。

7、嘌呤和嘧啶降解后分別生成Uric Acid和Urea。嘌呤核苷酸降解

第一步是在5'-核苷酸酶（5'-nucleotidase）的作用下消去磷酸基團，由Adenosine-monophosphate變成Adenosine，或從GMP變成Guanosine。

二、在Adenosine deaminase的作用下生成Inosine；

三、在nucleosidase的作用下生成Hypoxanthine或由Guanosine生成Guanine；

四、在Xanthine oxidase或Guanine deaminase作用下生成Xanthine；

五、在Xanthine oxidase的作用下生成Uric acid。嘌呤代謝突變會引起重要疾病。

如人體內缺失adenosine deaminase，會引發嚴重的免疫缺失性疾病，因為此時T-淋巴和B-淋巴細胞不能正常發育。AD缺失后，細胞內dATP的含量將高達正常細胞中的100倍，而過量的dATP則抑制了其余dNTP在T-淋巴細胞中的合成。許多化療（chemotherapy）藥劑都針對核苷酸合成途徑。如Azaserine和Acivicin都是Glutamine類似物，被用于阻斷核苷酸的生物合成。

胸苷合成中的主要抑制劑有fluorouracil（氟脲）、methotrexate（氨甲基葉酸）和aminopterin（氨喋呤）。氟脲本身不是thymidylate synthase 抑制劑，但它在細胞中被轉化為FdUMP以后，就能直接與TS相結合并使之失活。氨甲基葉酸和氨喋呤都是dihydrofolate reductase的抑制劑，氨甲基葉酸與該酶的親和力比底物dihydrofolate高100倍。

二、氨基酸代謝 按所占的質量比例計算，N在生物體內的重要性排在CHO之后，列第4位。大量N元素都是有機氮，被結合于氨基酸或核苷酸分子中。地球上的動植物共含氮約1.5×1010t，而每年通過硝化細菌以氣態氮的形式釋放到大氣中的氮就有2×108—5×108t。全世界氮肥廠每年生產的化肥僅含氮約108t，所以，如果沒有生物固氮，生命很快就不復存在了。

1.銨通過谷氨酸→谷氨酰胺被結合到有機物質中。主要有兩步反應：

⑴Glutamate+ATP→γ-glutamylphosphate+ADP ⑵γ-Glutamyl phosphate+NH4+→glutamine+Pi+H+ 總結：

Glutamyl+NH4++ATP→glutamine+ ADP+Pi+H+ 因此，谷氨酰胺合成酶是氮代謝中的主要調控位點。

在大腸桿菌中，GS由12個相同的亞基（50kDa）聚合而成，其活性既通過構象變化，也能通過共價修飾的方式得到調節。Alanine，Glycine和其它至少6種gln代謝產物都是GS活性的變構抑制劑，每個抑制劑都只有部分抑制作用。除變構抑制之外，GS活性還受共價修飾調節。當第397位酪氨酸被腺苷化后（加上AMP），該酶更容易受變構抑制劑的反饋調節。2.氨基酸的生物合成

高等動物不能合成大約一半氨基酸，只能從食物中直接獲取這些必需氨基酸（Essential）。表18-1 人體必需氨基酸(*.哺乳期至幼兒期必需)表22-1 氨基酸合成的六條主要途徑

3.氨基酸脫羧基化后生成有機胺。許多重要的神經遞質都是胺或其次生代謝產物。Tyrosine降解產物有dopamine（多巴胺），epinephrine（腎上腺素），norepinephrine，統稱為Catecholamines（兒茶酚胺）。

4.精氨酸降解產生NO˙(Nitric Oxide)。

本世紀80年代，科學家發現NO是人體內重要的信號分子，它參與神經傳遞、凝血和血壓調控等一系列生理反應。雖然它是氣體，極易擴散，但由于它十分活躍，其擴散半徑一般只有1mm。

三、氨基酸及功能蛋白質合成后的修飾

1.蛋白質剛剛被合成時，都以fMet（原核）或Met（真核）開始，多肽合成后，N端的formyl group、Met殘基，有時還包括N揣多個殘基或C端的殘基都會被切除。50%的真核蛋白中，N-端殘基的氨基酸會被N-乙基化。

2.切除信號肽。許多蛋白質都帶有15-30個殘基的signal peptides，負責指導蛋白質在細胞中的精確定位。

3.特定氨基酸的修飾。4.氨基酸的糖苷化

5.氨基酸的異戊烯化（Addition of Isoprenyl Groups）6.有些蛋白質還要與輔基(prosthetic groups)相結合；

Cytochrome C只有與血紅素（heme）相結合才有功能。此外，Acetyl-CoA羧化酶常與Biotin分子相結合。有些蛋白質必須經蛋白酶切割后才有功能。有些蛋白質只有在形成二硫鍵之后才有功能。

四、蛋白質的運輸和降解

1、絕大部分被運入ER內腔的蛋白質都帶有一個Signal peptide。該序列常常位于蛋白質的氨基末端，長度一般在13-36個殘基之間，有三個特點：（1）一般帶有10-15個疏水氨基酸；（2）常常在靠近該序列N-端疏水氨基酸區上游帶有1個或數個帶正電荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位點處常常帶有數個極性氨基酸，離切割位點最近的那個氨基酸往往帶有很短的側鏈（Ala或Gly）。

研究發現，信號肽把Ribosome牽引到ER上。蛋白質合成之初，一旦信號肽序列的N端暴露在核糖體外，該序列（包括核糖體）就迅速與SRP（signal recognition particle）相結合，誘發SRP與GTP相結合，停止新生肽的進一步延伸（此時新生肽一般長約70個殘基左右）。受位于ER外膜上的SRP-receptor及ribosome-receptor的牽引，這個復合物（GTP-SRP-ribosome-mRNA-新生肽）立即向ER外膜靠攏，并通過peptide transport complex進入ER內腔。

5.Rough ER上的蛋白質常常通過運轉載體將經過修飾的蛋白質送入高爾基體，再分別送到各個亞細胞位點。

6.蛋白質中的核定位序列一般不被切除。

蛋白質的核定位是通過多個蛋白的共同作用來實現的。Importin(α,β亞基)的作用有點像SRP受體。NLS蛋白-Importin復合物停留在核孔上，并在Ran-GTPase的作用下通過核孔。

細菌細胞內也存在類似的蛋白質運轉系統。

7、蛋白質降解是一個有序的過程。

在大腸桿菌中，許多蛋白質的降解是通過一個依賴于ATP的蛋白酶（稱為Lon）來實現的。當細胞中存在有錯誤或半衰期很短的蛋白質時，該蛋白酶就被激活。每切除一個肽鍵要消耗兩分子ATP。

在真核生物中，蛋白質的降解需要Ubiquitin，一個有76個氨基酸殘基組成極為保守的蛋白參與。與Ubiquitin相連的蛋白將被送到一個依賴于ATP的蛋白質降解系統（Proteasome，Mr.1×106）。

成熟多肽N-端第一個殘基對蛋白質的穩定性有重要影響。

五、DNA代謝

無論是只含有一對染色體的原核細胞還是帶有多對染色體的真核細胞，只有整個基因組得到了完整準確的復制，細胞分裂才能順利發生。所以說，DNA復制的起始，標志了細胞進入一個新的周期。㈠、DNA復制

根據反應階段和所需的不同酶類，DNA的復制可被分為三個階段，即復制起始、延伸和終止。每個DNA復制的獨立單元被稱為復制子（replicon），主要包括復制起始位點（Origine of replication）和終止位點（terminus）。原核生物的整個染色體上一般只有一個復制起始位點。大腸桿菌DNA的復制需要有20種左右的酶和蛋白質因子參與，整個DNA復制機器被稱之為DNA replicase system或replisome。

Helicase，任何DNA在被復制前都必須解開雙鏈，這個過程是由helicase來完成的，它可在ATP的作用下將DNA母鏈不斷解開形成單鏈。

Topoisomerase，主要功能是消除DNA解鏈過程中所產生的扭曲力。DNA結合蛋白，使新解鏈的DNA保持穩定結構。Primases，為DNA復制提供RNA引物。

DNA polymerases，合成新生DNA鏈，切除RNA引物。

DNA Ligases，使新生DNA鏈上的缺口（3'-OH, 5'-p）生成磷酸二酯鍵。1.DNA復制的起始 大腸桿菌中的復制起始位點是Ori C，全長245Bp，該序列在所有細菌復制起始位點中都是保守的。

DNA復制起始中的主要步驟

a.大約20個左右的DnaA蛋白首先與OriC中的4個9堿基重復區相結合； b.識別并使3個13堿基串聯重復區DNA形成開環結構； c.DnaB蛋白在DnaC的幫助下與未解鏈序列結合。每六個DnaB蛋白形成一組并與一條DNA母鏈結合，可在不同方向同時起始DNA的復制。當細胞中存在足夠的SSB和DNA gyrase時，DnaB的解鏈效率非常高。

整個DNA復制過程中，只有復制起始受細胞周期的嚴格調控。”Once in each cell cycle。“ DNA甲基化與DNA復制起始密切相關。OriC中有11個GATC回文結構（一般說來，256bp才應有一個GATC重復）。DNA子鏈被合成后，母鏈立即被甲基化（稱為hemimethylated）。此時，oriC與細胞原生質膜相結合。只有當oriC被從膜上釋放出來，子鏈被Dam甲基化后，才能有效地與DnaA蛋白結合，起始新一輪的DNA復制。復制起始可能還受ATP水解過程調控，因為DnaA只有與ATP相結合時才能與oriC區DNA相結合。2.DNA子鏈的延伸

主要包括兩個不同但相互有聯系的事件，即前導鏈和滯后鏈的合成。由DNA helicase解開雙螺旋，由拓樸異構酶消除DNA鏈上的扭曲力，SSB結合使DNA單鏈穩定。

前導鏈的合成：由DnaG（primase）在復制起始位點附近合成一個10-60 nt的RNA引物，然后由polII把dNTP加到該引物上。

滯后鏈的合成：產生Okazaki fragments，消除RNA引物并由DNA pol I補上這一小段DNA序列，由DNA Ligase把兩個片段相連。3.DNA鏈的終止

當子鏈延伸達到terminus region（ter，帶有多個20bp序列）時，DNA復制就終止了。Ter有點像一個陷井（trap），使復制叉只能進入，不能出來。Ter的功能主要是由Ter-Tus復合物（ter utilization substance）來完成的。4.真核細胞DNA的復制比大腸桿菌更復雜

真核生物的origin of replication被稱為ARS-autonomously replicating sequences或者被稱為replicators。Yeast replicators長約150dp，有多個保守重復區，共有約500個replicators分布于酵母的17條染色體中。

㈡、DNA的損傷修復

1． 錯配修復（mismatch Repair）

錯配修復對DNA復制忠實性的貢獻力達102-103，DNA子鏈中的錯配幾乎完全都被修正，充分反映了母鏈的重要性。

2.堿基切除修復（Base-Excision Repair）

DNA gylcosylases能特異性識別常見的DNA損傷（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨酰化產物）并將受損害堿基切除。去掉堿基后的核苷酸被稱為AP位點（apurinic or apyrimidinic）。細胞中最常見的Uracil Glycosylase就能特異性切除細胞中的去氨基胞嘧啶。3.核苷酸切除修復（nucleotide-excision repair）

當DNA鏈上相應位置的核苷酸發生損傷，導致雙鏈之間無法形成氫鍵，由核苷酸切除修復系統負責進行修復。

4.DNA的直接修復（Direct repair）

㈢、DNA的轉座

DNA的轉座，或稱移位（transposition），是由可移位因子（transposable element）介導的遺傳物質重排現象。已經發現”轉座“這一命名并不十分準確，因為在轉座過程中，可移位因子的一個拷貝常常留在原來位置上，在新位點上出現的僅僅是拷貝。因此，轉座有別于同源重組，它依賴于DNA的復制。1． 轉座子的分類和結構特征 a.簡單轉座子

轉座子（transposon，Tn）是存在于染色體DNA上可自主復制和移位的基本單位。最簡單的轉座子不含有任何宿主基因而常被稱為插入序列（insertion sequence，IS），它們是細菌染色體或質粒DNA的正常組成部分。一個細菌細胞常帶有少于10個IS序列。轉座子常常被定位到特定的基因中，造成該基因突變。IS序列都是可以獨立存在的單元，帶有介導自身移動的蛋白。

b.復合式轉座子（composite transposon）是一類帶有某些抗藥性基因（或其他宿主基因）的轉座子，其兩翼往往是兩個相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某個功能基因兩端時就可能產生復合轉座子。一旦形成復合轉座子，IS序列就不能再單獨移動，因為它們的功能被修飾了，只能作為復合體移動。

2、轉座作用的機制

轉座時發生的插入作用有一個普遍的特征，那就是受體分子中有一段很短的（3-12bp）、被稱為靶序列的DNA會被復制，使插入的轉座子位于兩個重復的靶序列之間。不同轉座子的靶序列長度不同，但對于一個特定的轉座子來說，它所復制的靶序列長度都是一樣的，如IS1兩翼總有9個堿基對的靶序列，而Tn3兩端總有5bp的靶序列。轉座可被分為復制性和非復制性兩大類。在復制性轉座中，所移動和轉位的是原轉座子的拷貝。轉座酶（transposase）和解離酶（resolvase）分別作用于原始轉座子和復制轉座子。TnA類轉座主要是這種形式。在非復制性轉座中，原始轉座子作為一個可移動的實體直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以這種方式進行轉座。3.轉座作用的遺傳學效應

① 轉座引起插入突變;② 轉座產生新的基因;③ 轉座產生的染色體畸變;④ 轉座引起的生物進化.六、RNA代謝

除了某些RNA病毒之外，所有RNA分子都來自于DNA。基因組DNA通過一個被稱為轉錄的過程把貯存在雙鏈DNA分子中的遺傳信息轉換到與模板DNA鏈相互補的RNA單鏈上。

mRNA，編碼了一個或多個蛋白質序列；tRNA，把mRNA上的遺傳信息變為多肽中的氨基酸信息；rRNA，是合成蛋白質的工廠核糖體中的主要成份。

1． 依賴于DNA的RNA合成

從DNA合成反應的化學本質、極性和模板的使用這三方面來說，轉錄與復制是相同的。但是，也存在三個主要不同點： A． 轉錄中不需要RNA引物；

B．轉錄反應一般只用一小段DNA做模板；

C．在轉錄區，一般都只有一條DNA鏈可以作為模板。

2.RNA合成的終止

一旦RNA聚合酶啟動了基因轉錄，它就會沿著模板5'→3'方向不停地移動，合成RNA鏈，直到遇到終止信號時才釋放新生的RNA鏈，并與模板DNA脫離。研究RNA鏈終止時遇到最常見的問題是3'端核苷酸的定位，因為活細胞內部根據終止信號正確終止的RNA與一個經過剪接的RNA在3'端沒有兩樣，都是-OH基團。模板DNA上都有終止轉錄的特殊信號--終止子，每個基因或操縱子都有一個啟動子，一個終止子。在新生RNA中出現發卡式結構會導致RNA聚合酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5'端的正常結構。寡聚U的存在使雜合鏈的3'端部分出現不穩定的rU·dA區域。

a.依賴于ρ因子的終止

ρ因子是一個相對分子質量為2.0×105的六聚體蛋白，它能水解各種核苷三磷酸，實際上是一種NTP酶。由于催化了NTP的水解，ρ因子能促使新生的RNA鏈從三元轉錄復合物中解離出來，從而終止轉錄。

有人認為，在RNA合成起始以后，ρ因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產生的能量，沿著5'→3'方向朝RNA聚合酶移動，到達RNA的3'-OH端后取代了暫停在終止位點上的RNA聚合酶，并從模板和酶上釋放RNA，完成轉錄過程。終止過程需要消耗能量，所以，ρ因子具有終止轉錄和核苷三磷酸酶兩種功能。

b、不依賴于ρ 因子的終止

若終止點上游存在一個富含GC堿基的二重對稱區，由這段DNA轉錄產生的RNA容易形成發卡式結構；在終止點前面有一段由4-8個A組成的序列，導致轉錄產物的3‘端為寡聚U。這兩種結構特征的存在同樣決定了轉錄的終止。

在新生RNA中出現發卡式結構會導致RNA聚合酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5'端的正常結構。寡聚U的存在使雜合鏈的3'端部分出現不穩定的rU·dA區域。

3.RNA聚合酶II及轉錄因子在啟動子上的裝配

TFⅡH還參與DNA的損傷修復。當RNA polⅡ轉錄過程中碰到受損傷的核苷酸時，TFⅡH能及時啟動核苷酸切除修復系統，將損傷修復。

Actinomycin D和Acridine阻斷RNA鏈的延伸

4.RNA的加工成熟

所以，RNA加工成熟主要包括：5’加帽子結構；3’加多聚A；切除內含子。

在Group I內含子切除體系中，鳥苷或鳥苷酸的3'-OH 作為親核基團向Intron 5'的磷酸二酯鍵發起進攻。

Group II內含子切除體系

核內mRNA原始轉錄產物的剪輯方式可能是最常見的。在這一模式中，RNA的剪輯需要特異性RNA-protein-復合物small nuclear rebonucleoproteins（snRNP）和small nuclear RNAs（snRNAs）。已經發現至少有5種snRNAs--U1，U2，U4，U5，U6。

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第五講 分子生物學研究法

一、重組DNA技術發展史上的重大事件

1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質，解決了遺傳的物質基礎問題；

2.50年代提示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半 保留復制機制,解決了基因的自我復制和世代交替問題；

3.50年代末至60年代，相繼提出了”中心法則“和操縱子學說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達。年份 事 件 1869 F Miescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。

1944 O.T.Avery證實DNA是遺傳物質。

1952 A.D.Hershey和M.Chase再次證實和噬菌體的遺傳物質是DNA。

1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子結構的雙螺旋模型。M.Wilkins用X-射線衍射法證實了這一結構。

1957 A.Kornberg從大腸桿菌中發現了DNA聚合酶I。

1958 M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留復制模型。

1959-1960 S.Ochoa發現RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質分子中的氨基酸序列。

1961 Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；F.Jacob和J.Monod提出了調節基因表達的操縱子模型。

1964 C.Yanofsky和S.Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關系。

1965 S.W.Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列測定；科學家證明細菌的抗藥性通常由”質粒“DNA所決定。

1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破譯了全部遺傳密碼。

1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸內切酶。H.M.Temin和D.Baltimore從RNA腫瘤病毒中發現反轉錄酶。

1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人發展了DNA重組技術，于72年獲得第一個重組DNA分子，73年完成第一例細菌基因克隆。

1975-1977 F.Sanger與A.Maxam、W.Gilbert等人發明了DNA序列測定技術。1977年完成了全長5387bp的噬菌體φ174基因組測定。

1978 首次在大腸桿菌中生產由人工合成基因表達的人腦激素和人胰島素。

1980 美國聯邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。

1981 R.D.Palmiter和R.L.Brinster獲得轉基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到轉基因果蠅。

1982 美、英批準使用第一例基因工程藥物--胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測定。

1983 獲得第一例轉基因植物。

1984 斯坦福大學獲得關于重組DNA的專利。

1986 GMO首次在環境中釋放。

1988 J.D.Watson出任”人類基因組計劃“首席科學家。

1989 DuPont公司獲得轉腫瘤基因小氧--”Oncomouse“。

1992 歐共體35個實驗室聯合完成酵母第三染色體全序列測定(315kb)1994 第一批基因工程西紅柿在美國上市。

1996 完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測定。

1997 英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。

基因工程中常見的名詞: 遺傳工程--genetic engineering，基因操作--gone manipulation，基因克隆--gone cloning，重組DNA技術--recombinant DNA technology，分子克隆--molecular cloning。基因工程的主要內容或步驟: 1.從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。

2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。

3.將重組DNA分子轉移到適當的受體細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖。

4.從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經得到擴增的目的基因。

5.將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現功能表達，產生出人類所需要的物質。

二、基因操作的主要技術原理

1． 核酸的凝膠電泳(Agarose & Polyacrylamide)將某種分子放到特定的電場中，它就會以一定的速度向適當的電極移動。某物質在電場作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場強度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數成正比，而與分子的磨擦系數成反比（分子大小、極性、介質的粘度系數等）。

在生理條件下，核酸分子中的磷酸基團是離子化的，所以，DNA和RNA實際上呈多聚陰離子狀態（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場中，它就會由負極→正極移動。

在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（EB）--ethidium bromide染色，此時，核酸分子在紫外光下發出熒光，肉眼能看到約50ng DNA所形成的條帶。DNA的脈沖電泳技術 :PFGE-Pulse-field gel electrophoresis 2． 核酸的分子雜交技術

在大多數核酸雜交反應中，經過凝膠電泳 分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過毛細管作用或電導作用按其在凝膠中的位置原封不動地”吸印“ 轉移到濾膜上的。常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）等。

核酸分子雜交實驗包括如下兩個步驟：

將核酸樣品轉移到固體支持物濾膜上，這個過程特稱為核酸印跡(nucleic acid blotting)轉移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點和狹線印跡法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印跡法(colony and plaque blotting)；

將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標記或其它標記的DNA或RNA探針進行雜交。所以有時也稱這類核酸雜交為印跡雜交。3． 細菌的轉化

所謂細菌轉化，是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA，而導致性狀特征發生遺傳改變的生命過程。這種提供轉化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉化DNA的寄主菌株則稱做受體菌株。大腸桿菌是最廣泛使用的實驗菌株。在加入轉化DNA之前，必須預先用CaCl2處理大腸桿菌細胞，使之呈感受態（Competent Cells）。Mg2+對維持外源DNA的穩定性起重要作用，質粒DNA中的抗生素是篩選標記。對絕大多數hsdR-，hsdM-突變體菌株（k12），每ug DNA可得107-108個轉化子。4． DNA序列分析

a.Sanger的雙脫氧鏈終止法

Cambridge的F.Sanger在1977年發明用雙脫氧鏈終止法測定單鏈DNA的序列，其基本原理如下： ①DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準確的DNA互補鏈；②該酶能夠用2'，3'--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3'-末端，從而終止其延伸反應。在DNA測序反應中，加入模板DNA，引物（特異性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一種ddNTP。常用Klenow大片段，無5'→3'外切酶活性。b． Maxam-Gilbert化學修飾法(哈佛大學)該方法的基本原理是用化學試劑處理具有末端放射性標記的DNA片段，造成堿基的特異性切割并產生一組具有不同長度的DNA鏈降解產物，經凝膠電泳分離和放射自顯影之后，可直接讀出待測DNA片段的核苷酸序列。

該反應的關鍵在于使DNA的4種核苷酸中，只有1-2種發生特異性的化學切割反應： 堿基的特異性修飾；

被修飾的堿基從核糖環上轉移；

失去堿基的糖環部位發生DNA鏈斷裂。

專門用來對核苷酸作化學修飾，并打斷磷酸二酯鍵的化學試劑有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。

硫酸二甲酯是堿性化學試劑，能使DNA鏈中鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位發生甲基化，在中性PH環境中就能使糖苷鍵發生水解，并引起DNA鏈的斷裂。在堿性條件下，肼能特異性切割C和T。如果加入1 mol/L的Nacl，那么，只有C被特異性切割。

c． DNA序列分析自動化

用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作為熒光劑標記DNA引物，帶有這種引物的DNA片段能在激光誘導下發出熒光。按照標準的雙脫氧終止法或化學終止法進行測序反應，跑DNA凝膠后用計算機檢測。

d.DNA雜交測序法(SBH-Sequencing by hybridization)

如果一段較短的DNA探針能與較長的DNA片段雜交，并形成完全的雙鏈結構，我們就推測在靶DNA上存在著相應的互補序列，這就是DNA雜交測序法的基本原理。如果將一種12-mer的靶DNA與完全隨機合成的8-mer寡核苷酸控針混合雜交，在總數為48=65536種8-mer的控針群體中，僅有5種探針會與靶DNA雜交，形成完全互補的雙鏈分子。

當靶DNA與標記探針形成G-T或G-A末端堿基錯配的雙鏈體時，檢測有一定難度。寡核苷酸探針越短，堿基錯配造成的去穩定效應越明顯，較易與完全的雙鏈體分子相區分。但是，探針短，雜交產物的總體穩定性下降，信/噪比下降，影響結果的可靠性。所以，6-mer寡核苷酸矩陣芯片只能用于測定500bp的靶DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。

SBH的應用：

① 可有效檢測靶DNA中的單堿基突變； ② 可用于不同DNA片段之間的序列比較；

③ 可用于檢測不同生長發育狀態下細胞中特定基因的表達狀況； ④ 可用于檢驗傳統測序技術的準確性。

5． 基因的定點誘變（site-directed mutagenesis）

使已克隆基因或DNA片段中的任何一個特定堿基發生取代、插入或缺失變化的過程叫作基因的定點誘變，是基因工程和蛋白質工程的重要手段。

a.盒式誘變(cassette mutagenesis)，包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。

b．寡核苷酸引物誘變

應用化學合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段做引物，進行DNA復制，使寡核苷酸引物成為新合成的DNA子鏈的一個部分。

C．PCRG與PCR誘變

6． 利用DNA與蛋白質的相互作用進行核酸研究.a.凝膠滯緩實驗(Gel retardation assay)，又稱DNA遷移率變化試驗(DNA mobility shift assay--EMSA)。

b． DNase I 印跡試驗（DNase I foot printing）

主要步驟：

① 用32P標記DNA雙鏈末端，并用RE切去一端； ② 加入細胞特定周期蛋白質提取物，溫育；

③ 加入適量DNaseI或硫酸二甲酯-六氫吡啶，使DNA鏈發生斷裂。

這一反應中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常關鍵，要保證一條鏈只發生一次斷裂！④沉淀DNA（包括與DNA相結合的蛋白質）； ⑤進行DNA凝膠分析。

如果某個蛋白質已經與DNA的特定區段相結合，那么，它就會保證該區段DNA免受消化或降解作用。在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應于蛋白質結合的部位不產生放射性標記的條帶。

c． 甲基化干擾試驗(Methylation interference assay)

用DMS處理靶DNA，使平均每條鏈上只有一個G被甲基化。將局部甲基化的DNA與含DNA結合蛋白的細胞提取物共溫育后進行凝膠滯緩試驗。分離各種DNA條帶，并用六氫吡啶切割甲基化的殘基。如果因某個G殘基的甲基化作用而阻止了蛋白質與DNA的結合，那么，六氫吡啶對這個甲基化G殘基的切割作用，就只能在沒有蛋白質結合的DNA中觀察到。

d． 體內足跡試驗

用適量DMS處理完整的游離細胞，使染色質中的G殘基甲基化，提取DNA并加入六氫吡啶切割DNA鏈。與對照的裸露DNA經甲基化處理后形成的梯度相對照，就能發現DNA鏈上的蛋白質結合區。

三、分子克隆技術

1、高質量mRNA的制備

應用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分離Poly(A)RNA。將Biotinylated Oligo(dT)引物與細胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的Streptavidin，用磁場吸附與PMP相連的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。2． 反轉錄成cDNA 可同時在反轉錄系統中加入Oligo（dT）12-18-mer及隨機引物R6，以保證得到全長cDNA； 應選用活性較高的反轉錄酶（Reverse transcriptase）； 應選用甲基化dCTP；

應保證所獲得雙鏈cDNA的方向性。

Super Script Choice cDNA合成系統中所用的poly（dT）引物

因為絕大多數大腸桿菌細胞都會切除帶有5'-methyl C的外源DNA，所以，應選用mcrA-mcrB-菌株。

3．分子克隆的主要方法

（1）構建cDNA、核DNA文庫，應用現有核酸探針分離新的目的基因；（2）差式雜交(differential screen)和扣除雜交(subtractive hybridization)技術；（3）DD-RT-PCR法及差別顯示技術；

（4）差別分析法(RDA法，即Representational difference analysis）；（5）酵母雙雜交體系Two-hybrid system；

（6）圖位克隆法（map-based cloning）與染色體步移（genomic DNA Walking）。

習慣上，人們用克隆表示由同一物種具有相同基因型的兩個或多個個體組成的群體。所以，從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotic twins）便屬于同一克隆。細胞學上，克隆是指由同一個祖細胞（progenitor cell）分裂而來的具有同一遺傳背景的子細胞群體。分子生物學上，把將外源DNA插入具有自主復制能力的載體DNA中，使之得以自主復制和永久保存的過程叫做分子克隆。

文庫篩選與基因豐度有關。高豐度基因，如蠶絲心蛋白，卵清蛋白等在某些特定組織中可占細胞總mRNA量的50-90%，非常容易被分離。低豐度基因，一般在細胞中只有10-20個拷貝，哺乳動物細胞中可含10,000到40,000種不同的mRNA，如果要達到99%的期望值，大約需要篩選150,000-170,000個克隆子。一般情況下，每微克cDNA可產生10萬-60萬個克隆子。

A.差式雜交或扣除雜交克隆技術 B.cRNA差式顯示法

除了極少數特例(如組蛋白基因)之外，幾乎所有的真核基因mRNA分子的3'-末端，都帶有一段多聚的腺苷酸結構，即通常所說的poly(A)尾巴。

P.Liang等人設計合成了全部12種不同的引物，用以反轉錄mRNA，合成第一鏈cDNA。這種引物通常叫作3'-端錨定脫氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M為除了T以外的任何一種核苷酸（即A、G或C），而N則為任何一種核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12種不同的排列組合方式。

DDRT-PCR的主要步驟：

Ⅰ.從不同發育階段或不同基因型的細胞群體中分離mRNA，并以3'錨定引物作為反轉錄的引物，合成第一鍵cDNA；

Ⅱ.用5'隨機引物和某個3'端錨定引物對擴增第一鏈(摻入32p-dNTP)； Ⅲ.用DNA變性測序膠分離擴增產物，X光片曝光后檢測差別條帶； Ⅳ.回收特異性差別條帶；

Ⅴ.用同一引物對擴增已回收的DNA條帶；

Ⅵ.用Northern，Southern及測序法分析所得的條帶； Ⅶ.以該DNA片段做探針，篩選全長cDNA或核基因。

C.cDNA差式分析法(Representational ditterence analysis)

RDA法充分發揮了PCR以指數形式擴增雙鏈DNA模板的特性，通過降低cDNA群體復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴增了目的基因片段。因為試驗對象（Tester）和供試探針（Driver）在接受差式分析前均經一個4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群（representation）保證絕大部分遺傳信息能被擴增。每次T減D反應后僅設置72℃復性與延伸，94℃復性這兩個參數共20個PCR循環，PCR產物的特異性和所得探針的純度非常高。

D.酵母雙雜交體系

Two-hybrid system也叫interaction trap（相互作用陷井），是90年代初發展起來的分離基因的新方法，可用于分離能與已知靶蛋白質（target protein）相互作用的基因。

基本原理：

真核生物的轉錄因子大多是由兩個結構上分開、功能上獨立的結構域組成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA結合域（BD），其C端768-881aa是轉錄激活域（AD）。一般情況下，AD能與GAL4效應基因啟動子上游的特定DNA區段（UAS）相結合，而此時，AD則推動了轉錄起始。

若用基因工程的方法，將GAL4 AD和BD分別克隆到不同的載體上，導入同一細胞株中表達，效應基因無法被激活,但可把來自不同轉錄因子的AD或BD區域連成一個功能基因。

主要實驗過程：

a.選擇缺失GAL4編碼基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c； b.構建帶有GAL1 UAS-啟動子-lac Z（His3）的轉化載體;c.把已知的靶蛋白質編碼基因克隆到pGBT9的多克隆位點上，把所有cDNA都克隆到pGAD424載體上，構成cDNA表達文庫。

d.從大腸桿菌中分別提取這兩種重組質粒DNA，共轉化感受態釀酒酵母菌株。

e.將共轉化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培養基上，篩選表達相互作用的雜種蛋白的陽性菌落。

E.基因的圖位克隆法

Map-based cloning是分離未知性狀目的基因的一種好方法。從理論上說，所有具有某種表現型的基因都可以通過該方法克隆得到。首先，將目的基因定位到某個染色體的特定位點，并在其兩側確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標記。

二、利用與目的基因最緊密連鎖的一對分子標記作探針，通過染色體步移技術將位于這兩個標記之間的基因片段克隆并分離出來。

三、根據基因功能互作原理鑒定目的基因。

通過對許多不同的生態型及大量限制性內切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標記。在RFLP作圖中，連鎖距離是根據重組率來計算的，1cm（厘米）相當于1%的重組率。人類基因組中，1cm≈1000kb;擬南芥菜中，1cm≈290kb;小麥中，1cm≈3500kb。

四、DNA的Microarray 只要事先除去高度及中等重復序列，任何DNA都可以被用于Microarray。最簡單的例子是用機械手把極微量（nanoliters）的DNA點到玻片或其它載體上，照射UV light使之永久固定，用不同細胞周期發育階段的cDNA作探針系統性地研究細胞中任意時期特異表達的基因；若把某一生物體內全部全部已知基因分別點到DNA微列陣或者基因芯片上，再用不同發育階段的cDNA與之雜交，就能了解某些基因對特定生長發育階段的重要性；基因芯片還可用于進行基因診斷，可建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標準雜交信號圖。用可疑病人的cDNA做探針與之雜交，檢查哪些基因的表達受抑制或激活。

第六講 原核基因表達調控

原核生物和單細胞真核生物直接暴露在變幻莫測的環境中，食物供應毫無保障，只有能根據環境條件的改變合成各種不同的蛋白質，使代謝過程適應環境的變化，才能維持自身的生存和繁衍。自然選擇傾向于保留高效率的生命過程。在一個每30min增殖一倍的109細菌群體中，若有一個細菌變成了29.5min增殖一倍，大約經過80天的連續生長后，這個群體中的99.9%都將具有29.5min增殖一倍的生長速度。

一個大腸桿菌細胞中約有2500-3000個基因。估計正常情況下，可帶有107個蛋白質，平均每個基因產生3000多個蛋白質分子。但大腸桿菌中一般帶有15,000-30,000個核糖體，有50余種核糖體結合蛋白，數量也很驚人。此外，負責糖酵解系統的蛋白質數量也很大。而象半乳糖苷酶等誘導酶，其含量可少至每細胞僅1-5個分子。

一個體系在需要時被打開，不需要時被關閉。這種”開-關“（on-off）活性是通過調節轉錄來建立的，也就是說mRNA的合成是可以被調節的。當我們說一個系統處于”off“狀態時，也有本底水平的基因表達，常常是每世代每個細胞只合成1或2個mRNA分子。所謂”關“實際的意思是基因表達量特別低，很難甚至無法檢測。

科學家把這個從DNA到蛋白質的過程稱為基因表達(gene expression)，對這個過程的調節就稱為基因表達調控(gene regulation或gene control)。要了解動、植物生長發育的規律、形態結構特征和生物學功能，就必須弄清楚基因表達調控的時間和空間概念，掌握了基因表達調控的秘密，我們手中就有了一把揭示生物學奧妙的金鑰匙。

基因表達調控主要表現在以下幾個方面：

① 轉錄水平上的調控(transcriptional regulation)；

② mRNA加工成熟水平上的調控(differential processing of RNA transcript)； ③ 翻譯水平上的調控(differential translation of mRNA).原核生物中，營養狀況(nutritionalstatus)和環境因素(environmental factor)對基因表達起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormone level)和發育階段(developmental stage)是基因表達調控的最主要手段，營養和環境因素的影響力大為下降。

一、乳糖操縱子的調控模式

大腸桿菌乳糖操縱子(lactose operon)包括3個結構基因：Z、Y和A，以及啟動子、控制子和阻遏子等。轉錄時，RNA聚合酶首先與啟動區(promoter,P)結合，通過操縱區(operator,O)向右轉錄。轉錄從O區的中間開始，按Z→Y→A方向進行，每次轉錄出來的一條mRNA上都帶有這3個基因。轉錄的調控是啟動區和操縱區進行的。

Z編碼β-半乳糖苷酶；Y編碼β-半乳糖苷透過酶；A編碼β-半乳糖苷乙酰基轉移酶。β-半乳糖苷酶是一種β-半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，還能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透過酶的作用是使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透過大腸桿菌細胞壁和原生質膜進入細胞內。β-半乳糖苷乙酰基轉移酶的作用是把乙酰輔酶A上的乙酰基轉到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。

1． 酶的誘導-lac體系受調控的證據 在不含乳糖及β-半乳糖苷的培養基中，lac+基因型每個大腸桿功細胞內大約只有1-2個酶分子。如果在培養基中加入乳糖，酶的濃度很快達到細胞總蛋白量的6%或7%，每個細胞中可有超過105個酶分子。

科學家把大腸桿菌細胞放在加有放射性35S標記的氨基酸但沒有任何半乳糖誘導物的培養基中繁殖幾代，然后再將這些帶有放射活性的細菌轉移到不含35S、無放射性的培養基中，隨著培養基中誘導物的加入，β-半乳糖苷酶便開始合成。分離β-半乳糖苷酶，發現這種酶無35S標記。說明酶的合成不是由前體轉化而來的，而是加入誘導物后新合成的。

已經分離在有誘導物或沒有誘導物的情況下都能產生lacmRNA的突變體，這種失去調節能力的突變體稱為永久型突變體，為分兩類：I型和O型。

I型：野生型為I+，突變型為I-O型：野生型為O+，突變型為Oc。

I+→I-或O+→Oc后，Z、Y、A結構基因均表現為永久表達，所以I基因被稱為調節基因(regulatory gene)。研究發現，I基因是一個產生阻遏物的調節基因，其產物使體系關閉。I-突變體由于不能產生阻遏物，使細胞成為lac永久表達型。I-/I+局部二倍體由于帶有一個正常阻遏物，使細胞中的lac仍然被抑制。

遺傳學圖譜分析指出，Oc突變位于I與Z之間，所以，lac體系的4個基因的序列為IOZY。通過這些觀察，Jacob和Monod推斷Oc突變代表DNA鏈上的一個位點或一個非編碼區域，而不是一個基因，因為可編碼的基因具有互補性，而Oc沒有這一特性。O決定相鄰Z基因的產物是誘導型合成還是永久型合成，O區域稱為操縱基因。

2.操縱子模型

Jacob和Monod認為誘導酶（他們當時稱為適應酶）現象是個基因調控問題，可以用實驗方法進行研究，因此選為突破口，終于通過大量實驗及分析，建立了該操縱子的控制模型。

① Z、Y、A基因的產物由同一條多順反子的mRNA分子所編碼。

② 這個mRNA分子的啟動子緊接著O區，而位于I與O之間的啟動子區（P），不能單獨起動合成β-半乳糖苷酶和透過酶的生理過程。③ 操縱基因是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結合位點。④當阻遏物與操縱基因結合時，lacmRNA的轉錄起始受到抑制。

⑤誘導物通過與阻遏物結合，改變它的三維構象，使之不能與操縱基因結合，從而激發lacmRNA的合成。當有誘導物存在時，操縱基因區沒有被阻遏物占據，所以啟動子能夠順利起始mRNA的合成。

3.Lac操縱子的本底水平表達

因為誘導物需要穿過細胞膜才能與阻遏物結合，而運轉誘導物需要透過酶。在非誘導狀態下有少量（1-5個mRNA分子）lac mRNA合成--本底水平永久型合成。

4.葡萄糖對lac操縱子的影響--代謝物阻遏效應

研究表明，葡萄糖對lac操縱子表達的抑制作用是間接的，因為存在一種大腸桿菌突變株，它正常的糖酵解過程受阻，葡萄糖-6-磷酸不能轉化為下一步代謝中間物，該菌株能在有葡萄糖存在的情況下被誘導合成lac mRNA。

5.cAMP與代謝物激活蛋白

當葡萄糖和乳糖同時存在于培養基中時，lac啟動子表達受阻，沒有β-半乳糖苷酶活性；當葡萄糖消耗完以后（圖中箭頭處），細胞內cAMP濃度增加，β-半乳糖苷酶活性被誘導，一度停止生長的細胞又恢復分裂。如果將細菌放在缺乏碳源的培養基中，細胞內cAMP濃度就很高；若在含葡萄糖的培養基中培養，細菌中的cAMP濃度就會很低；如果將細菌置于甘油或乳糖等不進行糖酵解的碳源培養基中，細菌中cAMP的濃度也會很高。

研究證實，葡萄糖所引起的代謝物抑制(Catabolite repression)現象的實質是該代謝物降低了細胞中cAMP的含量.事實上，cAMP-CAP復合物是lac體系的positive regulator，它們不能代替lacI和lacO的功能(negative regulator)。

cAMP-CAP不但能與DNA相結合，造成雙螺旋彎曲，易于形成三元轉錄起始復合物，它還能直接影響RNA聚合酶的活性。Dominant negative（Trans-dominant）lacI-d，只要有這個”環"的亞基存在，lacI+基因產物（阻遏物）無法與O區相結合lac operon得到表達。

6.lac操縱子DNA的調控區域--P.O.區

lac P（啟動子區）從I基因結束到mRNA轉錄起始位點止，共長82bp（-82～+1）O區就是阻遏物結合區，位于P區后半部分和轉錄起始區（-7～+28），該區序列有對稱性，其對稱中心點在+11位。P區的CAMP-CAP結合區（-67～-52）也有對稱性，其對稱位點在-60～-59之間。

在一個完全被誘導的細胞中，β-半乳糖苷酶、透過酶及乙酰基轉移酶的拷貝數比例為1:0.5:0.2，這個比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作為唯一碳源時細胞的需要。不同的酶在數量上的差異是由于在翻譯水平上受到調節所致。

①lac mRNA可能與翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質鏈的翻譯。這種現象發生的頻率取決于每一個后續的AUG密碼子再度起始翻譯的概率。②在lac mRNA分子內部，A基因比Z基因?

第三篇：分子生物學實驗講義

實驗 質粒DNA的堿裂解法提取與純化

一、實驗原理

細菌質粒是一類雙鏈、閉環的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質粒都是存在于細胞質中、獨立于細胞染色體之外的自主復制的遺傳成份，通常情況下可持續穩定地處于染色體外的游離狀態，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。

質粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質粒DNA的提取，本實驗采用堿裂解法提取質粒DNA。堿裂解法是一種應用最為廣泛的制備質粒DNA的方法，其基本原理為：當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質與DNA發生變性，當加入中和液后，質粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態，離心時留在上清中；蛋白質與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。

純化質粒DNA的方法通常是利用了質粒DNA相對較小及共價閉環兩個性質。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費時。對于小量制備的質粒DNA，經過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質和RNA，所得純化的質粒DNA已可滿足細菌轉化、DNA片段的分離和酶切、常規亞克隆及探針標記等要求，故在分子生物學實驗室中常用。

二、實驗試劑

1、溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高壓滅菌15min，貯存于4℃。

2、溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置。

3、溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存備用。

4、TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存備用。

5、苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）

6、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）7、5×TBE：Tris 堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存備用。

8、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

9、RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free)RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20℃。

10、6×loading buffer（上樣緩沖液）：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11、1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5μg/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5×TBE），即可上樣。

三、實驗操作

1、挑取LB固體培養基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB（含相應抗生素）液體培養基中，37℃、250g振蕩培養過夜（約12-14hr）。

2、取1.0ml培養物入微量離心管中，室溫離心8000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。

3、將細菌沉淀重懸于100μl預冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。

4、加200μl新鮮配制的溶液Ⅱ，顛倒數次混勻（不要劇烈振蕩），并將離心管放置于冰上2-3min，使細胞膜裂解（溶液Ⅱ為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

5、加入150μl預冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時質粒DNA復性，染色體和蛋白質不可逆變性，形成不可溶復合物，同時K+使SDS-蛋白復合物沉淀,4℃離心8000g × 10min, 小心移出上清于一新微量離心管中。

6、加入450μl的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4℃離心8000g × 10min。

7、小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.0倍體積（1ml）預冷的無水乙醇，混勻，室溫放置５min，4℃離心12000g×10min，棄上清。

8、加入1ml預冷的70%乙醇洗滌沉淀1次，4℃離心8000g×7min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干或吹干（不能過于干燥，造成溶解困難）。

9、沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），-20℃保存備用。

四、質粒DNA的電泳檢測

觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色。該物質含有一個可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個平面基團，這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導致染料與DNA結合并呈現熒光，其熒光產率比游離染料溶液有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區的590nm處重新發射出來。因此，當凝膠中含有游離溴化乙錠時即可以檢測到少量的DNA。

取制備的質粒DNA 1-2μl，加適當loading buffer混勻上樣,采用 1-5V/cm的電壓，使DNA分子從負極向正極移動至合適位置，取出凝膠置紫外燈下檢測，攝片。

五、注意事項

本裂解法小量制備質粒 DNA重復性好，一般無麻煩。若所提取質粒 DNA不能被限制性內切酶切割，可通過酚/氯仿再次抽提，以清除雜質來解決問題。

六、習題：

1、什么是質粒？質粒有什么主要用途？

2、分子生物學實驗中用的質粒是由野生型改建而來的，它必須具備哪三個基本要素？

3、制備的質粒DNA在瓊脂糖凝膠上通常以三種形式條帶存在，它們分別是什么？

實驗 瓊脂糖凝膠電泳實驗

一、實驗目的

（1）學習瓊脂糖凝膠電泳的基本原理；

（2）掌握使用水平式電泳儀的方法；

二、實驗原理

瓊脂糖凝膠電泳是基因工程實驗室中分離鑒定核酸的常規方法。核酸是兩性電解質，其等電點為pH2-2.5，在常規的電泳緩沖液中（pH約8.5），核酸分子帶負電荷，在電場中向正極移動。核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，具有電荷效應和分子篩效應，但主要為分子篩效應。因此，核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定：

（1）DNA的分子大小。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動，因而遷移得越慢。

（2）DNA分子的構象。當DNA分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋質粒DNA在瓊脂糖凝膠中移動的速度是不一樣的，超螺旋DNA移動得最快，而開環狀DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。

（3）電源電壓。在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率達到最大，所加電壓不得超過5v/cm。

（4）離子強度影響。電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時（如誤用蒸餾水配制凝膠），電導率最小，DNA幾乎不移動；在高離子強度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導很高并明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。

溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1）能插入DNA分子中形成復合物，在波長為254nm紫外光照射下EB能發射熒光，而且熒光的強度正比于核酸的含量，如將已知濃度的標準樣品作電泳對照，就可估算出待測樣品的濃度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以現在也開發出了安全的染料，如Sybergreen。

常規的水平式瓊脂糖凝膠電泳適合于DNA和RNA的分離鑒定；但經甲醛進行變性處理的瓊脂糖電泳更適用于RNA的分離鑒定和Northern 雜交，因為變性后的RNA是單鏈，其泳動速度與相同大小的DNA分子量一樣，因而可以進行RNA分子大小的測定，而且染色后條帶更為銳利，也更牢固結合于硝酸纖維素膜上，與放射性或非放射性標記的探針發生高效雜交。

三、試劑與器材

（一）材料

電泳儀、水平電泳槽、樣品梳子、瓊脂糖等

（二）試劑 1、50*TAE(1000mL)：242g Tris, 57.1mL 冰醋酸，18.6g EDTA。

2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力攪拌數小時以確保其完全溶解，分裝，室溫避光保存。

3、DNA加樣緩沖液：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。

4、DNA分子量標準

四、操作方法

常規的水平式瓊脂糖電泳：

制備瓊脂糖凝膠：按照被分離DNA分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量；一般情況下，可參考下表：

瓊脂糖的含量（%）分離線狀DNA分子的有效范圍（Kb）

0.3 60-5

0.6 20-1

0.7 10-0.8

0.9 7-0.5

1.2 6-0.4

1.5 4-0.2

2.0 3-0.1

1、制備瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖，加入1x電泳緩沖液，待水合數分鐘后，置微波爐中將瓊脂糖融化均勻。在加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液；加熱時應蓋上封口膜,以減少水份蒸發。

2、膠板的制備：將膠槽置于制膠板上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙，待膠溶液冷卻至50℃左右時，加入最終濃度為0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分鐘)，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡；待凝膠冷卻凝固后，垂直輕拔梳子；將凝膠放入電泳槽內，加入1x電泳緩沖液，使電泳緩沖液液面剛高出瓊脂糖凝膠面；

3、加樣：點樣板或薄膜上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數應不小于1X。用10 μL微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內，每加完一個樣品，應更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序和點樣量）。

4、電泳：加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。當瓊脂糖濃度低于0.5%，電泳溫度不能太高。樣品由負極（黑色）向正極（紅色）方向移動。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當溴酚藍移動到距離膠板中央時，停止電泳。

5、觀察和拍照：電泳完畢，取出凝膠。在波長為254nm的紫外燈下觀察染色后（2）的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。于凝膠成像系統中拍照并保存之。

五、注意事項

1、EB是強誘變劑并有中等毒性，易揮發，配制和使用時都應戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經專門處理后才能清洗或丟棄。簡單處理方法為：加入大量的水進行稀釋（達到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍體積新鮮配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍體積新鮮配制的0.5mol/L 的亞硝酸鈉，混勻，放置1天后，加入過量的1mol/L碳酸氫鈉。如此處理后的EB的誘變活性可降至原來的1/200左右。

2、由于EB會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA，使DNA遷移率降低。因此，如果要準確地測定DNA的分子量，應該采用跑完電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。

六、實驗報告要求與思考題

1、附上電泳結果的圖片并進行正確的標注（如下圖）

M：1Kb DNA ladder；1：質粒DNA

2、瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響？

3、如果樣品電泳后很久都沒有跑出點樣孔，你認為有哪幾方面的原因？

4、為什么分子生物學實施時要擔心EB？

5、瓊脂糖凝膠電泳時膠中DNA是靠什么發出熒光的？為什么？

電泳流程圖：

實驗 PCR擴增eGFP基因

一、PCR技術的基本原理

PCR類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。(Plateau)。到達平臺期所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

PCR 技術應用廣泛，不可能有這樣一套條件滿足所有的實驗，但本實驗所介紹的方法可適應于大多數DNA 擴增反應，即使有的不適應，至少也確定了一個共同的起點，在此基礎上可以作多種變化。不過下列因素在實驗應用時應予以特別注意，以求取得滿意結果。

1、模板：單、雙鏈DNA 和RNA都可以作為PCR樣品，若起始材料是RNA，須先通過逆轉錄得取第一條cDNA。雖然PCR 可以僅用極微量的樣品，但為了保證反應的特異性，一般宜用ng 量級的克隆DNA，ug 級的染色體DNA，待擴增樣品質量要求較低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制劑以及能結合DNA 的蛋白質。

2、引物：引物是決定PCR 結果的關鍵，下列原則有助于引物的合理設計。（1）盡可能選擇堿基隨機分布，GC 含量類似于被擴增片段的引物，盡量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它異常序列的引物。（2）避免具有明顯二級結構（尤其是在引物3'—末端）的序列。

3、防止引物間的互補，特別要注意避免具有3'末端重疊的序列。

4、引物的長度約為20個堿基，較長引物較好，但成本增加，短引物則特異性降低。

5、引物濃度不宜偏高，過高易形成二聚體解鏈；然后冷卻至37—55℃，使引物與模板退

二、實驗試劑

（一）儀器與器皿

PRC 擴增儀，瓊脂糖凝膠電泳設備，微量取樣器，一次性eppendorf管，凝膠成像儀

（二）試劑與材料

1、瓊脂糖凝膠電泳試劑

1）電泳緩沖液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0 0.002mol/L EDTA

2）加樣緩沖液：0.25%溴酚蘭40% w/v蔗糖

3）溴化乙錠溶液：0.05mg/ml溴化乙錠/水

4）瓊脂糖

2、TaqDNA 多聚酶3、5′反應緩沖液：

125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/ml gelatin；125mmol/L(NH4)2SO4； Formamide 25%

4、混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2.5 mmol/L)

5、DNA 模板

6、引物 1（10μmol/L）

7、引物 2（10μmol/L）

8、無菌水

三、實驗步驟

1、按順序在200μl 指形管中加入以下試劑與樣品：（因購入的試劑批次不同，加樣時有所差別，以預實驗結果為準。

1）ddH2O 37μl

2）10*Buffer 5μl(含有MgCL2)

3）dNTP ２μl

4）引物1(上游)２μl

5）引物2（下游）２μl

6）模板 1μl（pEGFP質粒）

7）TaqDNA聚合酶１μl（2.5U）總體積共50μl

2、在PCR 擴增儀上按以下反應條件編入程序：（以下為參考值，因擴增的DNA片段不同，各類PCR 擴增儀程序設定各不相同，編程過程視擴增的DNA 片段的要求及儀器而定參數。）

1)預變性 94℃ 3 分種

2)循環條件（30 次）

變性 94℃ 30 秒

復性 55℃ 30 秒

延伸 72℃ 1分

3)延長延伸 72℃ 7 分鐘

編完反應程序，置反應管于PCR擴增儀的反應孔中，開動機器，擴增循環反應開始。

3、PCR 擴增完畢，配1.5%瓊脂糖凝膠，電泳觀察結果。

4、凝膠成像儀或紫外燈下觀察實驗結果，是否已擴增到實驗設計的DNA片段

四、習題

1、PCR反應液中主要成分是哪些？在PCR反應過程中各起什么作用？

2、為什么在PCR反應過程中，使用三個不同的溫度變化？

3、用PCR擴增目的基因，要想得到特異性產物需注意哪些事項？

實驗 從動物組織（豬肝）中提取DNA

一、實驗內容

采用SDS裂解和蛋白酶K消化法從豬肝中提取DNA，并進行瓊脂糖凝膠電泳分析。目的

(1)掌握SDS裂解法從豬肝中的原理和方法；(2)鞏固DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析實驗。

二、實驗原理

DNA是一切生物細胞的重要組成成分，主要存在于細胞核中。通過研磨和SDS作用破碎細胞；苯酚和氯仿可使蛋白質變性，用其混合液（酚：氯仿：異戊醇）重復抽提，使蛋白質變性，然后離心除去變性蛋白質；RNase降解RNA，從而得到純凈的DNA分子。

三、實驗材料

新鮮豬肝

TES 緩沖液 ： pH8.0 Tris-HCl 10 mmoL/L , EDTA 1mmoL/ L , SDS 0.1 mmoL/ L

四、實驗步驟

1、剪取約0.5g肝臟組織，放入到研缽中磨碎；

2、向研缽中再加入1 ml TES輕輕研磨，將TES與破碎的組織混勻；

3、吸取535 μl組織勻漿液于2 ml EP管中，再加入60 μl SDS（10%），5.0 μl蛋白酶K，充分混勻后，于56°C保溫1 h，每30分鐘輕搖1次；

4、放置到室溫，加入等體積飽和酚（600μl），顛倒混勻，11000 rpm，離心10 min，吸取400 μl水相，并轉移至一個新的1.5 ml離心管中；

5、加入2倍體積（1000 μl）的無水乙醇和1/10倍體積（40 μl）3 M 醋酸鈉沉淀DNA，12000 rpm離心10 min，棄乙醇；

6、加入適量TE溶解DNA和RNAse A（具體依DNA的多少而定），并利用0.7%的瓊 脂溏進行電泳分析。

五、注意事項

1、在將豬肝剪碎前要將豬肝清洗干凈，除去脂肪及系膜成分。

2、抽提每一步用力要柔和，防止機械剪切力對DNA的損傷。

3、取上層清液時，注意不要吸起中間的蛋白質層。

4、乙醇漂洗去乙醇時，不要蕩起DNA。

5、離心后，不要晃動離心管，拿管要穩。

6、在乙醇沉淀后，經離心要觀察留在EP管中的小白點，其主要成分就是DNA，在以后的實驗中都要細心觀察，防止因將小白點丟失。

六、習題

1、為了獲得高質量的肝臟DNA，在實驗過程中應注意什么。

2、結合本人操作體會，總結在提取過程中如何避免大分子DNA的降解。

3、核酸提取中，去除蛋白質的方法有哪些？ 實驗 限制性內切酶切割DNA

一、實驗目的

1． 通過對DNA的酶切，學會設計構建體外重組DNA分子； 2． 根據目的基因合理選擇載體與限制性內切酶； 3． 掌握DNA的酶切技術。

二、實驗原理

限制性內切酶是從細菌中分離出來的一種能在特異位點切割DNA分子的核酸內切酶，目前已從多種細菌中分離出超過400種，識別各自不同的核苷酸順序，這一順序大多為具有一對稱中心的回文序列，如從大腸桿菌中分離的 EcoR I識別?GAATTC? 切割后產生?CTTAAG?、?G 和

AATTC?的末端，?CTTAAG?該末端由于有一段小的能互補配對的單鏈突出，故稱為粘性末端。切割后的末端為3’-OH和5’-磷酸基團，即?G-OH和?CTTAA-P。

有的限制性酶識別四堿基對的順序，如 San3A識別?GATC ?；有的識別六

堿基對，如上述的ECOR I。識別四堿基對的內切酶由于識別順序在DNA出現的頻率更高（四堿基酶為44=256，六堿基酶為46＝4096），因而可將DNA切割成更小的片段，而識別八堿基對的Not I?GCGGCCGC?、?CGCCGGCG? 則識別和切割位點更少（48＝65536），但堿基并不以均等的概率出現，因而切割后產生的片段變化范圍很大。

＋

限制性內切酶作用的溫度一般為37℃，反應體系中以Mg2為唯一的輔助因子，且要求pH緩沖在7.5左右。

商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃貯存，活性通常較高，5u/μl（每單位即最適條件下1小時內完全酶解1μg DNA的酶量）。

三、實驗材料

待酶切的DNA樣品

四、實驗儀器、器皿及試劑

1、儀器：可調微量加樣器、恒溫水浴箱、電泳儀、電泳槽、紫外檢測燈

2、器皿：Eppendorf管、Tip、試管架

3、試劑：標準DNA(Marker)

EcoRI限制性內切酶

10×buffer：50mmol/l NaCl

10mmol/l Tris-HCl(pH7.5)

10mmol/l MgCl2

lmmol/l

DTT（二硫蘇糖醇）

五、實驗步驟

1、將DNA樣品8.5μl(質粒pEGFP, 1μg)

2、加入1μl 10×buffer，酶解buffer由廠家提供。

3、加入1u（0.5μl）的限制性內切酶EcoRI（限制性酶很昂貴，從-20℃取出要置于冰上，吸取要新的Tip頭，以免污染雜質，吸完后盡快放回冰箱）。

4、混勻反應液后，稍離心使液體聚集，置37℃溫育１小時。

5、進行電泳檢查酶切結果，100V 25分鐘。

6、紫外燈下觀察消化效果。

六、注意事項

1、分子生物學實驗大多為微量操作，DNA樣品與限制性內切酶的用量都極少，必須嚴格注意吸樣量的準確性以保證酶切效果最佳。現介紹三種微量取樣方法：

(1)吸樣時，將Tip尖剛剛接觸到液面時，輕輕吸取。此法可吸取0.2~0.5μl的樣品，注意不要將Tip尖全部插入溶液，這樣Tip壁上會沾上很多的樣品，導致吸樣不準。

(2)用1cm長的塑料毛細管代替Tip吸樣，此法也可吸取0.2~0.5μl的樣量。

(3)目前也有細長Tip出售，專門用于吸取微量樣品。

2、限制性內切酶價格比較貴，因此要注意不使其污染而導致浪費。這就要求每次吸酶時要用新的無菌Tip。另一個造成限制性內切酶浪費的因素就是限制性內切酶的失活。因此，要注意加樣次序，即各項試劑加好后，最后才加酶，并要在冰上操作，且操作要盡可能快，以使限制性內切酶拿出冰箱的時間盡可能短。

若用同一酶消化很多樣品時，可先計算出所需酶量（可稍多計一點），取出此量的酶與1×緩沖液混合，然后再分裝至各個反應管內。這樣可節約用酶且縮短操作過程、減少污染機會。

3、開啟Eppendorf管時，手不要接觸到管蓋內面，以防雜酶污染。

4、樣品在37℃與65℃保溫時，要注意將Eppendorf管蓋嚴，以防水進入管內造成實驗失敗。

5、無實驗必要應盡量避免長時間酶消化樣品。因長時間消化，限制酶溶液中可能存在的雜酶會影響試驗結果。

七、習題

1、限制性核酸內切酶天然存在于什么生物體內？

2、什么是細菌的限制-修飾系統？限制-修飾系統對細菌有什么用途？

3、限制性內切酶有幾類？這幾類限制性內切酶各有什么特點？可作為工具酶的限制性內切酶是哪一類？為什么？

4、限制性內切酶的識別序列有什么特點？稱為什么序列？

5、酶通常在什么溫度中保存？為什么酶在該溫度下保存不會結凍？酶最后工作的時候其甘油濃度必須低于多少？ 6、1個單位（1 U）的限制性內切酶代表什么意思？

實驗 質粒的轉化

一、實驗目的

掌握熱激法或電轉化法轉化大腸桿菌感受態細胞及轉化子的鑒定方法。實驗材料：質粒DNA；大腸桿菌感受態細胞。

二、實驗原理

質粒的轉化是指將質粒或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。將連接產物轉化到感受態細胞中，實現重組克隆的增殖，便于后續分子操作。可以采用多種方法篩選和鑒定目的克隆。

（1）熱激法：大腸桿菌在0℃ CaCl2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基－鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經42℃短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收DNA復合物，在豐富培養基上生長數小時后，球狀細胞復原并分裂增殖。在被轉化的細胞中，重組子基因得到表達，在選擇性培養基平板上可挑選所需的轉化子。

（2）電轉化法：外加于細胞膜上的電場造成細胞膜的不穩定，形成電穿孔，不僅有利于離子和水進入細菌細胞，也有利于孔DNA等大分子進入。同時DNA在電場中形成的極性對于它運輸進細胞也是非常重要的。

三、實驗步驟

1、制備選擇性培養基平板：在融化的250ml LB固體培養基中（冷卻止55攝氏度以下）加入Amp至終濃度50μg/ml，混勻后倒入滅菌培養皿中；

2、取出1管制備好的感受態細胞，放在冰上融化；

3、每100μl感受態細胞加入約20ng質粒DNA，輕輕混勻，在冰上放置30分鐘；

4、熱擊：將離心管放置42℃水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動離心管；

5、冰鎮：快速將離心管轉移至冰浴，放置1－2分鐘；

6、復蘇：每管加400 μl LB培養基，在37℃搖床溫和搖動溫育45分鐘，使細菌復蘇；

7、布皿：取適當體積均勻涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；

8、培養：倒置培養皿，于37℃培養12－16小時即可觀察到白色的菌落，即為轉化子。

四、結果與分析

計算轉化效率

菌落數/DNA質量（μg）*稀釋倍數

五、習題

1、制備感受態細胞的關鍵是什么？

2、如果DNA轉化后，沒有得到轉化子或者轉化子很少，分析原因。

3、如何提高轉化效率？

第四篇：分子生物學課程教學大綱

《分子生物學》課程教學大綱（理論學時：16學時）

使用教材： 醫學分子生物學

（供8年制及7年制臨床醫學等專業用）

分子生物學是一門從分子水平研究生命現象、生命的本質、生命活動及其規律的科學。醫學分子生物學是分子生物學的一個重要分支，是從分子水平研究人體在正常及疾病狀態下生命活動及其規律的一門科學。它主要研究人體生物大分子和大分子體系的結構、功能、相互作用及其同疾病發生、發展的關系。作為一門課程，醫學分子生物學涵蓋了醫學各專業學生必須學習的分子生物學基礎知識，以及分子生物學在醫學領域中形成的專門研究領域及相關知識。

醫學分子生物學既要較系統地了解分子生物學的基礎理論知識和技術理論知識，同時也要了解分子生物學在醫學領域的應用和相關研究進展。

本書共二十三章，包括5個方面內容。第二章至第十章介紹分子生物學基本知識，主要介紹基因和基因組的基本概念和基本特點，基因組核酸復制與損傷修復、基因表達和功能蛋白形成與降解、基因表達調控、細胞間通訊與信號轉導的基本概念和基本理論，細胞增殖與凋亡的相關分子生物學機制。第十一章至第十三章介紹基因操作的基本知識，包括基因分析、基因功能研究和基因克隆與表達的相關基本知識和研究策略。第十四章至第十八章介紹疾病分子生物學機制，介紹了基因和基因組、細胞間通訊和信號與人類健康和疾病之間關系。第十九章至第二十一章介紹分子生物學理論與技術在醫學中應用，包括基因診斷和基因治療概念與相關研究。最后兩章介紹分子生物學新興研究領域、生物信息學在基因和蛋白質研究中的應用。

本大綱正是從上述目的出發，在要求學生掌握分子生物學基本知識與基本技術，同時了解分子生物學在醫學領域的應用與相關研究。使學生們在分子水平上研究人體在正常及疾病狀態下生命活動及其規律，為從事臨床醫學打下深厚的基礎。

緒 論

一、目的要求

了解分子生物學的定義、研究對象和研究內容；分子生物學發展簡史；生物遺傳物質的發現；現代分子生物學的建立和深入發展；分子生物學與相關學科的關系；分子生物學在醫學和生物學中的應用。

二、主要內容

分子生物學則是從分子水平研究生命現象及其規律的一門新興學科。它以核酸和蛋白質等生物大分子的結構與功能為研究對象

（一）、分子生物學的研究內容

分子生物學主要研究生物大分子的結構、功能、生物大分子之間的相互作用及其與疾病發生、發展的關系。

研究內容主要包括以下三個方面。1.核酸分子生物學 2.蛋白質分子生物學 3.細胞信號轉導

（二）、分子生物學發展簡史

1、生物遺傳物質的發現

2、現代分子生物學的建立

3、現代分子生物學的深入發展

（三）、分子生物學與相關學科的關系

由于生命本質的高度一致性，分子生物學已經對生物學和醫學的各個領域產生了全面而深刻的影響，并逐步形成了一系列的分子學科。可以使用同一套理論、同一套技術，來解釋和研究不同的病理、生理現象，甚至治療不同的疾病。

1、分子生物學與生物化學

2、細胞生物學與分子生物學

3、分子生物學與遺傳學

4、分子生物學與生物技術

（四）、分子生物學與醫學未來

分子生物學的發展和滲透從根本上改變了醫學（包括臨床和基礎醫學）各個學科的格局, 使醫學各學科進入了一個更高的水平——分子水平。

1、分子生物學在醫學和生物學中的應用

2、分子生物學與基礎醫學

3、分子生物學和病理學

4、分子生物學和疾病診斷

5、分子生物學和疾病治療

基因治療技術的發展與整個醫學科學的發展以及許多分子生物學新理論、新技術、新方法的應用密切相關。

所謂基因治療，就是用正常基因置換致病基因以糾正患者基因結構和功能異常的一種疾病治療的方法。

狹義的基因治療是指目的基因導入靶細胞后與宿主細胞內的基因發生整合、成為宿主基因組的一部分，目的基因的表達產物起治療疾病的作用。廣義的基因治療則包括通過基因轉移技術，使目的基因得到表達，封閉、剪切致病基因的mRNA，或自殺基因產物催化藥物前體轉化為細胞毒性物質，殺死腫瘤細胞，從而達到治療疾病的目的。

三、學時安排 1學時

第二章 基因與基因組

一、目的要求：

（一）掌握：基因的概念及結構特點；中心法則；基因轉錄調控相關序列；多順反子，單順反子；真核基因與原核基因的結構特點。基因組的概念；病毒、細菌及真核生物基因組的結構特征。

（二）熟悉：基因突變的意義，基因組變異的生理和病理學意義。

（三）了解：基因的命名法，基因組學；人類基因組計劃。

二、主要內容

基因是負責編碼RNA或一條多肽鏈的DNA片段，包括編碼序列、編碼序列外的側翼序列及插入序列。編碼RNA或蛋白質的DNA序列稱為結構基因。原核生物的結構基因是連續的，其RNA合成后不需要經過剪接加工。而大多數真核生物基因在編碼區內有非編碼的插入序列。基因中含有與轉錄有關調控序列。真核生物基因中調控序列一般稱為順式作用元件。

大多數生物的遺傳信息都是以特定的核苷酸排列順序貯存在DNA分 子中。但在一些病毒中，RNA作為遺傳物質。多數生物信息按照從DNA到RNA再到蛋白質的方向流。但是對RNA病毒是以RNA為模板，合成單鏈DNA，然后再合成雙鏈DNA。

mRNA將DNA中信息傳遞給蛋白質。在mRNA編碼區內每三個連續核苷酸，對應多肽鏈一個氨基酸，指導蛋白質合成。原核生物mRNA稱多順反子mRNA，而真核生物mRNA稱單順反子mRNA。

基因突變在進化上具有重要意義，它是形成生物多樣性主要因素之一。同時基因突變可以改變遺傳信息，導致疾病。導致基因突變因素有自發、物理、化學因素等，基因突變可直接影響蛋白質一級結構和空間結構，導致疾病或對疾病易感。

基因命名的基本原則是簡明、獨特、能夠表達基因的特征或功能。基因符號的命名也應遵循獨特、簡短、僅含有大寫拉丁字母或大寫字母和阿拉伯數字、不應含有標點符號的基本原則。

1．重點內容：基因轉錄調控相關序列；多順反子，單順反子；基因組的概念；病毒、細菌及真核生物基因組的結構特征。

2．難點內容：基因的結構特點，真核生物基因組的結構特征。

三、學時安排

5學時

第三章 基因表達與基因表達調控

一、目的要求：

（一）掌握：遺傳信息表達，轉錄，翻譯，有意義鏈，轉錄模板鏈，開放閱讀框，遺傳密碼等基本概念。基因表達，管家基因，組成性基因表達，誘導表達，阻遏表達，協調表達，表達調控，反式作用因子，表達組織特異性等基本概念；乳糖操縱子的結構及其調節機制。

（二）熟悉：原核生物RNA和蛋白質的生物合成基本過程，真核生物RNA和蛋白質合成特點；真核生物基因表達調控的各個水平，DNA水平調控的不同方式，反式作用因子的主要特點和調節方式，轉錄后調控的不同環節，翻譯水平和翻譯后水平調控的基本環節

（三）、了解：了解轉錄和翻譯后的加工。反式作用因子結構域模式和反式作用因子的作用方式，基因表達的組織特異性和時相性。

二、主要內容

原核生物基因表達調控主要是在轉錄水平和翻譯水平。轉錄水平的調控涉及啟動子、S因子、阻遏蛋白、正調控蛋白等多種因素，翻譯水平的調控則涉及SD序列、mRNA的穩定性及翻譯產物的調控。

真核生物基因表達調控環節較多，在DNA水平可通過染色體丟失、基因擴增、基因重排、DNA甲基化以及染色質結構改變影響基因表達；在轉錄水平則主要通過反式作用因子的作用調控轉錄因子與TATA盒的結合、RNA聚合酶與轉錄因子-DNA復合物的結合以及轉錄起始復合物的形成；在轉錄后水平主要通過RNA修飾、剪接及mRNA運輸的控制來影響基因表達；影響翻譯水平的因素有影響翻譯起始的陰遏蛋白、5`AUG、5` 端非編碼區的長度等，另外還存在小分子反義RNA對翻譯調控。翻譯后蛋白質修飾和定位也是表達調控的重要環節。

同時近年提出的有關基因表達的統一理論慚被認識。從而形成一個完整的調控網絡。

1、重點內容：

原核生物轉錄水平的調控機制；真核生物轉錄水平的調控機制；真核生物轉錄后水平的調控機制。

2、難點內容：

原核生物轉錄水平的調控機制。

三、學時安排

4學時

第四章 基因分析的基本策略

一、目的要求

（一）掌握：Southern 雜交和PCR等技術原理及在分析基因拷貝數的應用；Northern blot和RT-PCR技術原理及在基因轉錄水平變化分析中的應用；

（二）熟悉：Western blot 原理及在特定基因產物-蛋白質分析中的應用。

（三）了解：DNA序列測定的原理及其主要應用；RNA酶保護試驗原理及應用；原位雜交技術；DNA微陣列技術原理； 流式細胞術的應用；免疫 組化方法的應用。

二、主要內容

基因分析是一種策略性很強的工作，有許多技術可以用于基因分析，正確選擇實驗技術方法和基因分析切入點是進行基因分析首先要考慮的問題。根據信息中心法則，DNA是遺傳信息的攜帶者，RNA是基因的轉錄產物，蛋白質是結構基因的最終產物，因此，分析基因可從DNA、RNA、蛋白質水平上進行。同時研究者善于將各種技術有機結合起來，根據研究目的篩選適當技術方法，也可先制定研究策略，再進行實驗技術路線設計。

1、重點內容：Southern 雜交和PCR等技術原理及應用；Northern blot和RT-PCR技術原理及應用Western blot 原理及應用。

2、難點內容：RNA酶保護試驗原理及應用。

三、學時安排

3學時

第五章基因功能分析的基本策略

一、目的要求

（一）掌握：轉基因模型研究基因的功能原理、基因敲除技術原理、利用基因沉默技術對基因功能進行分析的原理

（二）了解；三種實驗技術的操作過程及注意事項

二、主要內容

基因功能分析可以在DNA、RNA和蛋白質水平上采用不同的技術和模 型來實現。模式生物是研究基因功能不可缺少的工具，轉基因小鼠和基因敲除技術是目前研究特定基因功能最常用的動物模型，轉染細胞是利用轉基因技術建立的細胞模型。RNA干涉技術能夠實現在RNA水平上暫時關閉特定基因的方法。各種方法都具有各自的特點及局限性，研究者可根據不同目的篩選最合適方法與模型，實現對特定基因功能的研究目的。

1、重點內容：轉基因技術、基因敲除技術及RNA干涉技術原理

2、難點內容：轉基因技術、基因敲除技術及RNA干涉技術各自優點及局限性

三、學時安排

3學時

第六章 基因工程與體外表達

一、目的要求：

（一）、掌握：常用克隆載體；基因克隆的基本過程；外源基因在大腸桿菌和哺乳動物細胞中表達的原理和方法。

（二）、熟悉：限制性核酸內切酶和其他常用工具酶的概念和特點；定點誘變技術原理。

（三）、了解：昆蟲表達系統；酵母表達系統。

二、主要內容：

基因工程指在體外對DNA分子按照既定的目的與方案進行剪切和重新連接，或將DNA中某個位點進行人工替換或刪除，改造基因結構，然 后利用轉化、轉染、感染等方法將重組DNA導入宿主細胞，使DNA片段得到擴增。DNA的體外剪切和重新連接是在限制性核酸內切酶、邊接酶以及其他修飾酶的參與下進行的。不同目的的克隆基因需要不同的載體，常用的載體有質粒、噬菌體和粘性質粒等。載體可與外源DNA在體外連接，構成重組DNA分子，導入相應的宿主細胞，能在宿主細胞中自行復制與表達。

克隆的基因可進一步用于表達有關基因的產物，進行DNA序列分析，基因治療，研究基因表達的調節因子以及基因的功能等。還可通過寡核苷酸介導法、含U模板法、PCR介導的定點誘變法等技術，定向改變克隆基因的序列結構，從而改造相應蛋白的結構。

基因工程在得到重組體后，通常利用大腸桿菌、哺乳動物細胞、昆蟲、酵母等表達系統進行克隆基因的體外表達。

1、重點內容：基因克隆的基本操作過程。

2、難點內容：α－互補篩選；陽性轉染細胞的篩選；定點誘變技術原理。

三、學時安排：

6學時

第七章 基因診斷(自學)

一、目的要求：

（一）掌握：基因診斷的基本概念；掌握基因診斷中常用的分子生物學技術——核酸分子雜交、聚合酶鏈式反應（PCR）、單鏈構象多態性（SSCP）檢測、限制性酶酶譜分析、DNA序列測定、DNA 芯片技術；

（二）熟悉基因診斷的基本方法；

（三）了解遺傳病、感染性疾病以及腫瘤的基因診斷的策略；了解基因診斷在法醫學中的應用。

二、主要內容：

基因診斷已成為臨床實驗醫學的一個重要組成部分。PCR擴增和分子雜交是現代基因診斷技術的基本方法，基因診斷的基本操作流程是：樣本抽提、樣本擴增、分子雜交和信號檢測。遺傳病的基因診斷主要是針對DNA分子的遺傳分析技術，其基本方法學包括連鎖分析和直接診斷。用作連鎖分析的遺傳標志物主要有RFLP、STR、SNP。用于遺傳分析的代表性直接診斷技術有：用于DNA制圖的Southern印跡法、用于檢測點突變的ASO分子雜交法以及用于識別STR序列的PCR直接擴增法等。同時基因診斷技術已經成為現代法醫學的重要內容。

1、重點內容：各種檢測方法原理

2、難點內容：各自優點及缺點

三、學時安排

3學時

第八章 基因治療(自學)

一、目的要求：

（一）掌握：基因治療、基因標記、基因置換、基因添加、基因干預、反義RNA、核酶等基本概念；

（二）熟悉：基因轉移技術，逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒載體的特點；熟悉腫瘤基因治療思路，理解抑癌基因治療原理、實驗研究和臨床試驗及腫瘤的免疫基因治療；理解反義RNA在基因治療中的意義和應用；

（三）了解：了解其它基因轉移方法；了解核酶及三鏈DNA在基因治療中的意義和基本原理；了解基因治療的前景與問題。

二、主要內容

基因治療是指以改變人類遺傳物質為基礎的生物醫學學治療，即通過一定方式將人正常或野生型基因或有治療作用的DNA順序導入人體靶細胞，以矯正或轉換致病基因的治療方法。目前開展基因治療方案采取的策略包括：用正常基因置換染色體上致病基因，將正常基因轉移至患者的宿主細胞，使治療基因代替致病基因表達正常蛋白質而發揮作用；向患者體內或腫瘤細胞內導入腫瘤抑制基因，以抑制其表達；也可用反義RNA、SiRNA、核酶、肽核酸抑制或封閉有害基因mRNA表達；也可將抗體、細胞因子等基因導入腫瘤細胞以激活體內免疫細胞活力，增強患者免疫力。

治療基因導入體內方法有非病毒方法與病毒方法，非病毒方法包括直接注射法、電穿孔法、脂質體轉運法，其方法安全性好但效率低。與病毒方法各具有不同優缺點。

1、重點內容：基因治療概念、基因治療策略方法、2、難點內容：治療基因導入體內方法，各自優缺點、病毒載體結構特點；核酶及三鏈DNA在基因治療的原理

三、學時安排

3學時

第九章 基因組學與醫學(自學)

一、目的求：

（一）掌握：基因組學、人類基因組計劃、基因病和SNP的概念；結構基因組學、功能基因組學的概念及研究內容。

（二）熟悉：比較基因組學的概念；疾病相關基因的鑒定策略。

（三）了解：基因組學與醫學的關系。

二、主要內容

人類基因組計劃的研究目標是闡明構成人類基因組的全部DNA的結構；闡明基因的編碼方式和分布特點；理解基因及其調控序列之間的相互關系；理解DNA全部序列所蘊藏的意義。該計劃包括為遺傳圖譜、物理圖譜、序列圖譜、轉錄圖譜分析。

功能基因組學是研究基因組中所有基因功能的學科。功能基因組學是從基因整體水平對基因的活動規律進行探討，其研究內容主要包括基因組的表達、蛋白質產物的功能、基因組多樣性的研究、基因組功能注釋。

1、重點內容：人類基因組計劃、功能基因組學的研究內容。

2、難點內容：功能基因組學的研究內容。

三、學時安排 2學時

四、實驗內容及學時安排

1大腸桿菌質粒DNA的提取 3學時 2瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 3學時 3 DNA純度、濃度和分子量的測定 4學時 4大腸桿菌感受態細胞的制備與轉化 4學時 5動植物基因組DNA的提取與純化 4學時

第五篇：分子生物學課程教學改革初探

分子生物學課程教學改革初探

摘要：文章總結了在十余年分子生物學教學過程中，不斷開展的對教師自身綜合素質和能力、教學內容、教學方法和教學手段的改革探索，旨在提高分子生物學的教學效果。實踐證實，新的教學模式，在傳授學生專業知識的同時，激發了學生的學習興趣，改進了學生的學習方法，也逐步提高了學生的自主學習能力，從而滿足了社會對高素質創新型生物人才的需求。

關鍵詞：分子生物學；課程教學；改革研究；創新生物學人才

中圖分類號：G642.0 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2016）26-0128-03

前言：

分子生物學的目標是在分子水平上闡明細胞活動的規律，從而揭示生命的本質[1]。雖然它在生物類專業課程體系中充當著重要角色，對生命科學的發展起著至關重要的作用，但是分子生物學的教學卻因為課程內容多，學科交叉廣，理解難度高，信息量大，知識更新快而使教學效果差強人意，集中表現為教師授課難和學生學習難。這種現狀不但困擾著老師和同學，也與大學培養高素質創新型人才的目標不相適應。如何克服分子生物學課堂教學的“瓶頸”？本人在從事十多年的分子生物學教學過程中，努力研究和探索多種形式的教學改革，力求提升教學效果和教學質量。

一、教學內容的合理組織

分子生物學的教學除了選用好的教材，制定完善的教學大綱，如何組織教學內容是教學的一個非常重要環節[2]。教學內容呈現給學生的應該是完整、清晰的、有層次、條理的知識。我們在組織教學的過程中，首先從提高自身學科素養著手。“一本教材書，數種參考書”，除分子生物學國內、國外各類版本外，與分子生物學相互交叉和滲透的其他學科，如細胞生物學、生物化學、遺傳學，我們也都進行了系統的學習和強化，不斷夯實專業知識、拓展專業領域，基本構建了分子生物學完整的知識體系，具備了對教材處理的前提。既避免了教學中各學科的重復，也進一步凝練了知識。此外，我們還通過網絡教學平臺向全國優秀教師學習，在不斷的探索中總結出了教學內容合理組織的一些思路。

1.思維導學模式。在DNA復制教學環節，知識點多，并且較分散，很容易在教學中造成學習困難和知識混淆的現象，針對這章教學的特點，我們采用了思維導學模式，收到了非常好的教學效果。

2.重點、難點解讀。本科教學形式多樣化，也更提倡學生的自主學習，但并不是淡化了教師的教學，反而對教師提出了更高的要求[3]。教師必須圍繞每堂課的教學目的，合理組織和引導學生理解并掌握教學的重點和難點內容。

比如在講解染色體端粒末端修復機制中，教師首先要從教材的知識結構中梳理出重點。染色體端粒末端修復機制的知識點包括：（1）引物切除造成的遺傳信息缺失；（2）端粒末端的特點；（3）體細胞和性細胞末端修復機制的不同；（4）DNA結構的變化；（5）端粒酶的修復機制。梳理知識點后，總結教學重點：一是引物切除后損傷修復在體細胞和性細胞中的不同；二是四鏈DNA結構；三是端粒酶的修復機制。其中端粒酶修復機制的講授是學生學習的難點。難點集中在端粒酶的性質和修復發生的過程。

經過對教學內容中重點和難點的準確把握和合理組織，教師才能在課堂教學中突出重點、突破難點，讓學生的課堂學習無障礙。

二、教學方法和手段的改進

教學方法的推陳出新，是教學改革的重要內容[4]。為發揮學生作為教學主體的能動性，我們根據具體的教學內容設置了啟發式、聯想式、探究式等多種教學方法[5]，讓學生參與到教學過程中，不僅活躍了課堂氣氛，而且在分享知識的同時，更注重教會學生靈活掌握學習的方法。

1.啟發式教學。啟發的目的在于舉一反三，觸類旁通。針對每一次的課堂教學，設計一些拋磚引玉的問題，供學生思考與討論，這成為了分子生物學理論教學的重要組成部分。如進行到真核生物基因表達調控學習環節，提出甲基化修飾的生物學意義，這個問題覆蓋范圍廣，涉及到了DNA復制的調節、蛋白質和DNA甲基化修飾對基因表達的調控，以及Epigenetic（表觀遺傳學）方面的知識。通過提出問題―討論分析―不斷啟發―再討論分析―歸納總結―解決問題這一系列的互動教學活動，充分調動了學生課堂學習的主動性和積極性，在不斷的討論分析中通過展示不同的思維、發表各自的觀點，不但有利于促進學生在學習中發現問題、解決問題，而且有利于學生通過對基礎知識的消化、理解來達到理論的升華、拓展[4]。

2.聯想式教學。分子生物學是在生物化學、細胞生物學和遺傳學的基礎上發展而來[6]，因此知識相互交叉、相互滲透。在授課的過程中，教師一方面要避免重復，一方面要通過聯想知識點適時培養學生的發散性思維，提高學生對知識的遷移能力和整合能力。如在講解化學修飾對基因的表達調控時，將細胞生物學中的信號轉導有機結合，使學生了解基因表達調控對細胞信號轉導的作用機制。

3.探究式教學。在分子生物學教學中，每一個理論知識的背后都是科學研究的重大突破。如確定遺傳物質是DNA的兩大經典實驗，我們以探究的形式呈現教學內容，從實驗設計，到結果顯示，再經過討論分析并得出結論，以課題研究的角度，研究人員的身份引導學生進入學習角色，將學科概念、理論產生的起因和過程展示給學生，啟發學生努力探索，走近科學，讓學生從中領悟知識形成的探究性和科學性，逐漸培養具有創新意識和能力的高素質研究型人才。

4.多媒體多樣化教學。分子生物學的教學內容具有微觀性、復雜性、抽象性和動態性。傳統的教學手段無法滿足教學的需求，而多媒體技術則具有聲像俱佳、動靜皆宜的特點[7]，是傳統教學無法比擬的。多年來我們不斷補充和完善教學手段，逐漸形成了獨具特色的多媒體教學課件。

多媒體圖像處理清晰直觀，文字表述簡潔明了、主題突出。課件中的圖像來源于國內外的網絡數據平臺。如講述DNA半保留復制機理時[8]，首先將DNA可能存在的幾種復制方式用圖像展現，并利用Meselson和Stahl設計的DNA復制同位素示蹤實驗和密度梯度離心實驗來進行結果驗證，引導學生明確掌握DNA半保留復制特點，并結合文字，通過圖文并茂的多媒體課件，將教學內容中的背景知識、基本概念、基本理論，以及靜態、抽象的微觀知識清晰講解。

多媒體課件動靜結合、聲像互動。對于生命過程中動態的知識點，比如DNA的復制、RNA的轉錄、蛋白質的翻譯過程，可以將這些復雜的生命過程利用多媒體手段做成動畫并配以文字和聲像，形象直觀地展現給學生，既加深了學生對知識的理解，也提高了其學習效率。

三、知識領域的拓展

分子生物學的教學內容除包含基礎理論知識外，還有大量理論應用的研究方法部分。我們在教學中不僅僅將知識局限在教材中，利用課堂教學不斷引導學生去了解本學科相關領域內的研究熱點、最新進展、發展趨勢[8]，以及生物技術在生產實踐中的廣泛應用。

1.專題講座與專題討論。專題講座是教師根據教學內容，自己組織參考資料對教學內容的延伸與拓展。比如在講授“SNP技術”時，先從遺傳標記分析的發展著手，把一代、二代的標記分析做知識性的回顧，再將納入教材的第三代標記分析“SNP”做詳細的講解，引導大家理解什么是單核苷酸多態性，核苷酸多態性研究的生物學意義以及在醫學、農業、畜牧等多種領域的發展與應用。通過這種方式激發了學生的學習熱情和求知欲，也使教師不斷地進行知識的更新，及時了解本學科當前發展的趨勢、研究的熱點以及爭論的問題。

專題討論則是以學生為主體，根據課程教學內容，組織學生就某一個專題自行查閱、組織文獻資料，并在課堂上展開討論[9]。比如在講授基因重組的教學內容時，設計“轉基因的利與弊”供學生討論。引導學生思考基因工程藥物和轉基因動植物對社會產生的巨大影響，讓知識離開課本走進生活，從而喚起學生學習的興趣和探索未知領域的欲望。這不僅使學生更加深入、系統地理解所學知識，并且培養了學生靈活運用知識的能力[10]。

2.生物信息技術與數據庫。生物信息技術已經發展成為分子生物學研究方法中不可分割的一部分，比如在“PCR技術”的專題講座中，不僅要對實驗目的、原理、操作以及應用進行講解，還要特別對引物設計的生物信息技術進行補充，介紹學生對一些常規的生物信息技術軟件Primer6.0、DNAman、Olig6.0、DNAStar、Cluster等有一個基本的認知度。

在整個分子生物學的教學中，學生需要自行查閱和組織各種文獻資料，因此，必須特別強調互聯網資源運用的重要性。教師通過介紹中國知網、維普、清華同方、NCBI等幾個常用資源庫，使學生了解如何利用資源庫進行查詢，對互聯網資源的熟練應用使學生的知識體系得以完善，學生通過自身的努力來提高信息收集和辨別的能力，培養了學生的自學能力。

四、教學改革中應該注意的問題

1.教師的專業修養與教學基本功。教師在教學中具有雙重身份，既是一名導演，又是一名演員。作為導演，首先需要有最新的教學理念，整個教學過程中適時設問、適時討論、適時啟發。其次要有較強的課堂組織能力，根據學生的學習情況，把握課堂節奏，調動學生課堂學習激情，使教學有的放矢。否則會在教學中出現“啟而不發”和論證條理不清的現象；作為演員，還要有良好的課程駕馭能力，通過教師扎實的專業知識、廣泛的認知領域、全面的知識結構，呈現給學生的是一個豐盛的知識大餐，而不是一鍋夾生飯。因此作為教師，必須從理論水平、科研水平、思維水平這3個方面提高教師自身的專業素質，此外，還要掌握適合自己的各項教學技能。

2.多媒體教學的合理應用。多媒體教學只是一種提高教學效果的輔助手段，是為教師的教學和學生的學習服務的，只有運用合理才可能達到好的效果。因此盡量避免在多媒體教學課件上出現過多的文字，否則多媒體成了教學活動中的主體，老師由照本宣科轉變為扮演放映員和播音員的角色。學生的學習興趣不高，教學效果也就適得其反。多媒體和傳統教學只有合理地結合，取長補短，才能在課堂教學中體現出其真正的價值。

總之，教學改革的目標是幫助學生建立學科知識體系，培養學生良好的科學素養，提升學生后繼學習的能力。正如葉圣陶先生所說：“教師的教學，不在于給學生搬去可以致富的金子。而在于給學生點金的指頭。”目前，我們關于分子生物學課堂教學改革還處于不斷探索和實踐階段，除了需要不斷地提高教師自身的學科修養和科研素質外，也以“夯實基礎、拓展知識、增強能力、提高素質”[8]作為教學的目的和人才培養目標，努力在今后把教學工作開展得更加有生有色，為社會培養更多高素質創新型人才。

參考文獻：

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