第一篇：眼電生理科普

一 什么是視覺電生理檢查？

視覺就是能看到東西的一種感覺，包括外界物質(zhì)的顏色和形態(tài)，是眼睛的生理功能，視覺電生理檢查是眼科臨床測試視覺功能的常規(guī)手段，具有客觀性，對視覺系統(tǒng)疾患的定位有重要意義。

如將視覺電生理檢查方法聯(lián)合應用，可對整個視覺系統(tǒng)疾患進行分層定位診斷，從功能上對視覺系統(tǒng)進行斷層掃描。它不僅適合于一般的患者，在不能進行主覺檢查的情況下也能客觀地評價視覺功能，如嬰幼兒、智力低下者和癔病患者；另對看不到眼底者，它可克服混濁的障礙，測定到視功能，如白內(nèi)障、玻璃體混濁。因而，視覺電生理檢查在眼科臨床已越來越廣泛地被使用。

二 那些項目是眼電生理檢查？

視誘發(fā)電位(VEP)

視網(wǎng)膜電圖(ERG)

三 什么是VEP檢查？

眼睛對光或圖形刺激后在大腦皮層產(chǎn)生的電活動，使用腦電圖技術在頭皮記錄的電生理信號，能夠提供關于視覺神經(jīng)系統(tǒng)傳導通路功能是否完好的重要診斷信息。

四 那些患者需作VEP檢查？

1.視路病變: 視神經(jīng)炎,多發(fā)性硬化,視乳頭水腫,視神經(jīng)萎縮,先天性視神經(jīng)病變, 缺血性視神經(jīng)病變,外傷性視神經(jīng)病變,中毒性視神經(jīng)病變,視路占位性病變等。

2.視網(wǎng)膜及黃斑病變：特發(fā)性黃斑裂孔，老年黃斑變性等。

3.弱視及斜視

4.青光眼

5.白內(nèi)障；玻璃體混濁；角膜混濁等

6.外傷性視神經(jīng)病變，工傷及司法鑒定。

五 什么是ERG檢查？

視網(wǎng)膜受到光刺激后而產(chǎn)生的綜合性電反應，用于臨床診斷和視網(wǎng)膜功能評定，是檢測視網(wǎng)膜功能的一個重要客觀指標。

六 那些患者需作ERG檢查？

1.遺傳性視網(wǎng)膜變性類疾病，如視網(wǎng)膜色素變性，先天性靜止性夜盲等。

2.黃斑部疾患；如視錐細胞營養(yǎng)不良，黃斑變性，黃斑裂孔等。

3.視網(wǎng)膜血管性病變；視網(wǎng)膜動脈或靜脈阻塞，糖尿病膜視網(wǎng)病變等。

4.白內(nèi)障；玻璃體混濁；角膜混濁等。

5.視網(wǎng)膜脫離，外傷性視網(wǎng)膜病變，工傷及司法鑒定等。

七 檢查用時

VEP檢查半小時以上。

ERG檢查在患者散瞳暗適應半小時后，檢查半小時左右。

八.眼電生理檢查前的需作什么準備？

1.患者須在眼科檢查預約處預約檢查日期，請準時前來；

2.檢查前日禁服鎮(zhèn)靜劑，并需要清洗頭部；散瞳后的患者當日不能作VEP檢查；

3.家屬在檢查室門外安靜等候；除患者外，陪人不必進入暗室，小兒、年齡較大、行動不便、語言交流困難的患者，經(jīng)工作人員允許后陪人方可進入；在進入暗室前，請關閉手機，以免干擾電生理信號；

4.檢查前需作皮膚準備，用酒精棉擦凈皮脂和污垢，直至皮膚阻抗達到檢查要求，皮膚擦拭后可能有些潮紅，偶有皮膚表面結痂，無需特殊處理，數(shù)日內(nèi)將自愈，不留疤痕；如有對酒精、鹽酸丙丙美卡因滴眼液（結膜表面麻藥）、氯霉素等藥物過敏者和有人工晶體植入、及青光眼病史者，均應向本室工作人員說明；

5.受檢者在檢查過程中要保持精力集中,盡量不說話,不咀嚼；并要注意放松, 包括心理的和軀體的放松,尤其是頸部要放松；檢查時,受檢者要主動配合，集中精神注視固視點,盡量控制眼睛不要動；光刺激時注意睜開眼睛,避免眨眼；

6.ERG 檢查結束后，患者要注意當天不要用手揉眼睛，并用氯霉素滴眼液1－2天。

第二篇：電生理基本技術

電生理基本技術

一電刺激。

二生物放大器正確選擇，植物性神經(jīng)沖動幅度多為50-100μV。不同組織，應采用不同的參 數(shù)。如 ECG：振幅0.1-2mV，靈敏度0.5-1mV，時間常數(shù)0.1-1.0s，高頻濾波1KHz 植物性神經(jīng)沖動：振幅50-150μV，靈敏度25-100μV，時間常數(shù)0.01-0.1s，高頻濾波3-5KHz 中樞神經(jīng)元單位放電振幅100-300μV, 靈敏度50-100μV，時間常數(shù)0.01-0.1s，高頻濾波5-10KHz

三玻璃微電極

常用尖端0.5-5μm，向細胞內(nèi)插入時，需小于0.5μm（細胞直徑的1/10~1/100），且尖端的傾斜度應相當緩和，一般微電極可分為金屬微電極和玻璃微電極兩類。

金屬微電極，現(xiàn)多用鍍鉑鎢絲電極（platinum-plated tungsten electrode），在鎢絲上鍍鉑，可極大改善電極的電學特性，噪聲可大大降低，加之機械強度大，適合長期體外記錄(paré D，Gaudreau H.Projection cells and interneurons of the lateral and basolateral amygdala: distinct firing patterns and differential relation to the thera and delta rhythms in conscious cats.J Neursci, 1996,16(10):3334-3350 現(xiàn)要也常用鍍銀碳纖維電極。玻璃微電極記錄易受機械位移的影響，加之尖端的電解質(zhì)會漏出或堵塞，不適合半小時以上的長時間記錄，玻璃微電極可分單管和多管微電極。

毛坯管在國外多用Pyrex管，國內(nèi)多用GG-17和95料玻管。細胞外記錄多采用外徑1.5-2mm玻璃，細胞內(nèi)記錄則采用外徑1mm細玻管，內(nèi)外徑之比約為2:3或5:6，長6-8cm。拉制前必須經(jīng)過清潔處理。

清潔液：用等量的(250ml)王水(可反復應用)。一般毛坯管捆成把放入清潔液中1-2h，取出自來水沖洗20-30min，再放入無水酒精中洗滌，再放入盛滿蒸餾水燒杯中加熱煮沸10min，倒去蒸餾水，再換新蒸餾水反復3次，再放入烤箱中烤干，備用，切不可用市售的洗滌劑，以防降低電極充灌液的表面張力而影響沖灌。

充灌液常用3mol/L KCl，為避免Cl-擴散，也可用2mol/L醋酸鉀或檸檬酸鉀充灌，也有人用 0.5-1mol/L NaCl(低濃度)充灌可降低噪音。細胞外記錄時，最后再用3-4mol/L NaCl +2%旁 胺天藍溶液定位。在膜片鉗中還常加鈣螯合劑，如EGTA。阻抗與不同組織相關。

四電生理實驗中噪聲和干擾的形成和排除。(一)來源。

1干擾信號與生物電生理信號的鑒別。準確區(qū)分生物電信號與干擾的偽跡是電生理實驗的先決條件。

2來源。主要有三個方面

其一。物理性干擾。1)靜電和電磁的干擾實驗室附近高壓電，室內(nèi)日光燈可產(chǎn)生50Hz的靜電干擾，尤其是交流電，尤其是50Hz頻率干擾最大(電子設備為50Hz)。其特點是幅度大，波形規(guī)則。

2)噪聲干擾電子元件本身產(chǎn)生雜亂無章電壓和電流稱噪聲，一般與放大器內(nèi)部元件的質(zhì)量與性能有關。

其二。接地不良。1)地線電阻應小。2)儀器故障。產(chǎn)生漏電電流，在地線上形成電位差，產(chǎn)生干擾。3)地線行走過程中打圈，形成線圈，易接受電場和磁場的干擾。4)各儀器設備應采用一點接地的方式，若采用多點接地，形成大地回路，也會引起干擾。5)地線過長與電源線形成交流環(huán)路。6)誤用市電三孔中性線作為大地線(中性線上有4-5A電流)。

其三。生理性干擾。1)大腦電活動時，眨眼、眼球運動均對腦電具有干擾作用。2)實驗中環(huán)境溫度過低，動物寒戰(zhàn)、抖動，引起肌電的發(fā)放而干擾記錄，或因呼吸運動引起記錄部位機械位移引起干擾信號。3)心電干擾，頻率與心電一致。(二)排除。

1物理性干擾。1)屏蔽法用于低頻電和靜電干擾，屏蔽線分布電容較大，線與線之間不可平行排列，更不可為了美觀而將多線扎在一起，這會加大分布電容，易偶合高頻干擾噪聲。2)遠離法。3)改變位置法。依電流方向相反，產(chǎn)生反向磁場的原理，改變各個儀器的位置或放大器輸入的方位，會使干擾磁場抵消，微電極放大器探頭阻抗高，易引入干擾，實驗前可反復調(diào)整其方向和位置。4)微電極記錄時盡量減少微電極本身的阻抗，減少輸入阻抗及干擾信號在這個阻抗上形成干擾電壓降，微電極到探頭的連線<5cm。5)用監(jiān)聽器監(jiān)聽噪聲，以便及時排除。

2儀器質(zhì)量，盡量改進。接地不良。地線應盡量短粗，不能與電源線平行或打圈，不 要接在電源線的中性線 上，地線單獨埋設，埋置處應較潮濕，附近無大型變壓電動機，并在坑內(nèi)加些食鹽。4檢查各儀器 是否漏電。

5慢生物電變化時用乏極化電極，實驗對象宜安靜，勿受振動。

(三)刺激偽跡過大及防止。1)盡量減少刺激脈沖的波寬和強度。2)在動物體或標本上，盡量延長刺激部位 的距離，在刺激電極 和引導電極之間加一接地電極，此電極離引導電極愈近，刺激偽跡就越小采用變換刺激極性，結合疊加處理，可抵消偽跡。

注微電極中高濃度充灌液易蒸發(fā)，造成電極回路的開路，因此常在微電極插入Ag-AgCl絲或鉑金絲后，在微電極尾部開口處涂上一層凡士林，防止水分蒸發(fā)。

動物麻醉和制動下，體溫會下降，故應保溫調(diào)節(jié)，加溫維持肛溫36-38℃.記錄脊髓背角或腹角神經(jīng)元將脊柱前后拉直以減小呼吸運動造成的位移。記錄腦神經(jīng)元應在表面用溫熱石蠟制成一油槽，防止血管博動和呼吸運動的影響。

五細胞內(nèi)微電極記錄

多用幼年離體標本，其原因1)幼年動物骨骼骨化不完全，結締組織少，神經(jīng)組織易于分離，標本耐缺氧能力強，有的標本可存活數(shù)小時至數(shù)天，但標本也可能發(fā)育不完全，如背根和腦干到脊髓的投射纖維要到三周動物才完全。神經(jīng)纖維髓鞘化不全，其藥理作用與成年動物也不同。從實驗角度上講，脊髓背腹根短，不利于電生理刺激記錄。小鼠一般應小于15g，制備標本才 有可能成功，而這樣小鼠背腹根神經(jīng)節(jié)不利于電生理實驗。最適合的動物是金黃地鼠(hamster)，介于大小鼠之間，制備標本活性很好，可能與其冬眠習性有關，而且其脊髓背腹根長達20-25mm，利于電生理記錄。動物選擇仍依實驗而定，同一標本，不同中樞結構對缺氧耐受力也不同。金黃地鼠，若觀察脊髓背角神經(jīng)元活動，可用150-160g體重的鼠均可，但要研究腹角神經(jīng)元，則體重不宜超過30g。離體標本的灌流注，如ACSF。其中緩沖液成分有兩種，一是重碳酸鹽(bicarbonate)溫度低(4℃)，配方有利于降低組織興奮性。二是磷酸鹽緩沖液和HEPES緩沖液其優(yōu)點是接近于 人體環(huán)境。各種緩沖液一般都先配母液，臨用前一天，或臨用前稀釋

腦片膜片鉗實驗方法

腦片膜片鉗實驗方法 文獻綜述一 1966年，Yamamoto和McIlwain首次在腦片上記錄了電生理活動(1966a, b)，證實了腦組織在體外也能存活，并保持很好的活性狀態(tài)。此后，該方法在生理學研究中的應用越來越廣泛，并為中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理和藥理學領域突飛猛進的發(fā)展奠定了基礎。1989年，Blanton將腦片電生理記錄與細胞的膜片鉗記錄結合起來，建立了腦片膜片鉗記錄技術，這為在細胞水平研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)離子通道或受體在神經(jīng)環(huán)路中的生理和藥理學作用及其機制提供了可能性。

在腦片電生理記錄中，實驗者可以按不同的實驗目的直接準確地改變腦片灌流液的成份和條 件，如溫度、酸度和滲透壓、通氧狀態(tài)、以及離子通道或細胞信號轉導通路的阻斷劑等另外，實驗者還能借助顯微鏡準確地放置記錄電極和刺激電極，同時，可借助一些特殊的加藥裝置，將一定濃度的藥物加到整個腦片或是腦片上的特定區(qū)域上，研究電信號沿神經(jīng)環(huán)路的傳遞規(guī)律。在電生理學實驗結束后，活性較好的腦片還可用于生物化學或解剖學的分析。這些優(yōu)點使實驗者能獲得準確的神經(jīng)生理學的研究結果，也是其應用較在位大腦廣泛的原因所在。

海馬腦片是中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究中應用最為廣泛標本之一。其原因有以下幾點:

1、海馬與腦的其它部位相對隔離，較易剝離，且剝離后受到的損傷較小

2、海馬具有高度分化的片層結構，一方面，海馬神經(jīng)環(huán)路在片層中的分布有一定的空間規(guī)律，如錐體細胞胞體分布在錐體細胞層，而雪氏側支突觸分布于輻射層，且海馬中存在一個三突觸聯(lián)系的回路，即穿通纖維-齒狀回顆粒細胞層、苔狀纖維-CA3區(qū)錐體細胞層、雪氏側支-CA1區(qū)錐體細胞層等，因此，在海馬中可以較準確地記錄到特定神經(jīng)元或突觸的反應另一方面，這種板層結構有利于解釋在某一部位記錄到的細胞外場電位的意義。這些都使海馬成為電生理學研究的理想標本。本文對海馬腦片膜片鉗的操作規(guī)程及注意事項總結如下。

一、海馬腦片的制備

腦片制備中，海馬分離應在斷頭后10分鐘內(nèi)完成，5~6分鐘為宜。在分離海馬時，還應注意不要扭轉或撕扯海馬，更不要損傷海馬。分離海馬的速度和質(zhì)量是保證海馬腦片制備成功的關鍵所在。

評價腦片活性最簡單的方法是記錄腦片上的群峰。在一個狀態(tài)良好的腦片上記錄到的群峰在一個很寬的刺激強度范圍內(nèi)始終是單峰的。出現(xiàn)多個群峰往往提示抑制性突觸功能已受損，這是腦片最早的病理生理學改變。如果僅存在突觸前纖維群峰(Fiber Volley, FV)，或FV峰大于突觸后反應，這提示腦片活性極差，有活性的突觸已所剩無幾，為激發(fā)突觸反應需要更多的突觸前纖維參與，需中止實驗。在活性較好的腦片中，F(xiàn)V峰幾乎探測不到，或遠遠小于突觸后反應。

有時會莫名其妙地出現(xiàn)一些問題，突觸標本中突觸后神經(jīng)元看上去狀態(tài)良好，但做了很多天甚至幾周都沒有得到有用的數(shù)據(jù)。在這種情況下，須要耐心地思考失敗的原因，并設法解決。首先，應該檢查溶液，用其它實驗室制備的標本或更換實驗動物。對于腦片的制備而言，切片機出現(xiàn)的機械故障會損壞腦片的質(zhì)量。總之，在實驗的全過程中能盡量注意每一個細節(jié)問題，出現(xiàn)問題后反復嘗試，實驗就會容易起來。

二、海馬腦片的膜片鉗記錄

1、將刺激電極放置在含突觸前纖維腦片區(qū)域附近

在突觸傳遞的研究中，應該同時記錄突觸前和突觸后神經(jīng)元的電信號，雖然，并不是所有突觸前神經(jīng)元胞體的動作電位均可傳導至突觸(Vincent, 1996)。由于在突觸前和突觸后兩個神經(jīng)元上同時做膜片鉗記錄較困難，因此，需要用其它的方法來誘發(fā)突觸前動作電位的發(fā)放。用刺激電極可在單個或多個突觸前細胞或軸突誘發(fā)動作電位。另外，還可以用局部施加神經(jīng) 遞質(zhì)的方法來誘導動作電位，如用短促的壓力、離子電泳或籠鎖谷氨酸光解等方法將谷氨酸加到突觸前胞體或軸突上，可以誘導出多個動作電位。

用電極刺激 在神經(jīng)元培養(yǎng)皿中，可以用連接了電源(通常是膜片鉗放大器)的微電極直接刺激突觸前神經(jīng)元。在這種情況下，通常需要用負壓吸引使突觸前的細胞貼緊刺激電極，防止刺激電流的逸出。通過膜片鉗放大器給脈沖刺激的優(yōu)點是，它可以記錄到突觸前細胞被激活的胞外電信號(Role, 1987)。從培養(yǎng)的神經(jīng)元和腦片上找到有突觸聯(lián)系的一對神經(jīng)元是很困難的，但在神經(jīng)元培養(yǎng)中有單個神經(jīng)元的Autapic突觸就會方便許多。

可以用膜片鉗電極或尖端較細的一對鎢電極給突觸前軸突纖維施加電壓脈沖。用電極刺激可將Ag/AgCl電極置于孵育槽中與其構成一電流回路。刺激電流一定要與膜片鉗放大器記錄電路隔離開，以防止刺激電流漏入記錄電極中，而使刺激尾跡變得很大。為此，施加刺激需要一個未接地的隔離器。隔離器可以用外界脈沖刺激或計算機來控制。另外，還需要將刺激尾跡縮小到最小，以排除其對突觸信號起始段的干擾。為達到該目的，需將刺激電路的回路電極置于合適的位置或用膜片鉗放大器提高串聯(lián)電阻補償?shù)男省?/p>

刺激電極的位置 通常將刺激微電極或刺激電極置于突觸前軸突通過的部位。但有時突觸前軸突在制備腦片時即被去除。如果腦片制備時局部神經(jīng)環(huán)路被破壞，實驗中就很難成功地記錄到突觸后電流。實際上，切腦片的角度是保存局部神經(jīng)環(huán)路最重要的因素之一，合適的角度既可使突觸后神經(jīng)元保存完好，也可保留部分較長的突觸前纖維用于電刺激。用胞外電極刺激激活的神經(jīng)纖維較多，而且，每次刺激激活的纖維數(shù)目也會不同。如果實驗目的是將不同的傳導通路分開，那么，必須要證明兩個刺激電極激活的纖維各不相同。

2、全細胞記錄

用可視化膜片鉗尋找清楚、且表面光滑、折光性較好的突觸后神經(jīng)元。在加了正壓后，將記錄電極移入腦片視野中，并接近事先選好的神經(jīng)元，然后，調(diào)整電極與神經(jīng)元的相對位置，利用負壓形成穩(wěn)定的高阻封接。用短簇的脈沖負壓使細胞破膜，穩(wěn)定2~3分鐘，觀察封接測試波形起始段與基線間的差值是否在100pA以內(nèi)，封接電阻是否大于200M，如果是，且較 穩(wěn)定，再迅速補償串聯(lián)電阻和慢電容，舍棄串聯(lián)電阻大于30M的細胞，且在記錄過程中監(jiān)測串聯(lián)電阻的變化，當變化大于20%時，中止記錄。如果細胞狀態(tài)不好，就馬上重新制備腦片，以提高實驗效率。

3、判斷突觸前纖維

在記錄電刺激的突觸反應時，可以驗證刺激電極是否放置在突觸前神經(jīng)元或軸突上，在實驗中，如果記錄不到突觸反應，說明刺激電極位置不正確，這時可以稍微移動刺激電極的位置。如果還記錄不到，這可能還與組織片活性較差有關，可以更換組織片或改進切片角度加以解決。電刺激方波時程一般設定為0.1~0.2ms，恒流條件下刺激強度一般為0.1~3mA，恒壓 條件下刺激強度為5~40V.4、突觸反應的判斷及其波幅穩(wěn)定性的評價

突觸信號的判斷 突觸信號樣的假象波有三個來源。第一、鄰近纖維的活動使靜止細胞產(chǎn)生電壓波動第二、如果恒流刺激強度過大，電流就可被注入突觸后神經(jīng)元，使其產(chǎn)生失活時間類似EPSP或EPSC的信號，其信號幅度隨刺激強度的變化而變化第三、直接刺激突觸后神經(jīng)元誘導出突觸樣的動作電位，這種反應緊接著刺激尾跡發(fā)生，沒有翻轉電位，使突觸后 神經(jīng)元膜電位超極化和向記錄電極內(nèi)液中加入10mM的QX-314，均可避免突觸后神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位。但QX-314可阻斷多種突觸激活的通道(Otis, 1993)，在某些情況下它還可以增加漏電流。

多突觸激活 通常情況下，刺激電流可激活多個突觸前纖維，在突觸后可記錄到多種突觸信號。因此，有必要用一些選擇性阻斷劑阻斷一些不在研究范圍內(nèi)的突觸活動。而且，刺激一束纖維，通常可激活多個同種的突觸前纖維。不同的刺激強度下，被激活的突觸前纖維數(shù)目不同，從而引起的突觸反應也會不同。因此，要仔細調(diào)節(jié)刺激部位和刺激強度以便能刺激到單一的軸突(Stevens, 1995;Zhang, 1994a)。

胞內(nèi)刺激突觸前細胞是刺激單個軸突最好且最穩(wěn)定的方法。甚至在單個突觸前神經(jīng)元被激活后，在突觸后記錄到的反應也是由多種神經(jīng)遞質(zhì)共同作用的結果。多突觸活動是突觸活動的疊加效應，這包括去極化和超級化反應。在一些標本中，這是不可避免的。通常可用藥物阻斷不在研究范圍內(nèi)的突觸活動。提高灌流液中鈣鎂等二價陽離子的濃度至5mM，以增加動作電位的閾值，就可以有效地減少多突觸活動。通常情況下，突觸反應是否來自單突觸可以根據(jù)如下條件來判斷潛伏時在0.5~1.5ms的范圍內(nèi)，高頻刺激時突觸反應立即消失，突觸 反應的上升支和下降支較平滑，且無長潛伏時成份(Berry, 1976)。

電刺激引起的突觸反應波幅在一定范圍內(nèi)的波動是一種正常現(xiàn)象，但記錄過程中有電流衰減發(fā)生，當記錄過程中電流衰減大于10~15%，就必須中止實驗。如果電流衰減不可避免，就需記錄較長時間確定電流衰減的速度。低頻刺激(0.1~1Hz)下，記錄幾分鐘，觀察突觸反應波幅的相對穩(wěn)定性。

電極內(nèi)液成份與受體敏感性 在形成全細胞記錄后，胞內(nèi)成份會被電極內(nèi)液成份所稀釋而發(fā)生改變，但在10分鐘內(nèi)即可達到平衡。因此，要記錄G蛋白耦聯(lián)受體的活性時，應向電極內(nèi)液中加入10~100uM 的GTP(Trussell, 1987)。離子通道耦聯(lián)的NMDA和GABAA受體的特性在全細胞記錄過程中也會隨時間的變化而衰減。在記錄時可用多種方法來避免或減小其衰減，如提高電極內(nèi)液EGTA的濃度或用BAPTA等快速絡合劑代替EGTA，使胞內(nèi)鈣濃度遠遠低于1μM；向電極內(nèi)液中加入mM級的ATP；采用穿孔膜片鉗記錄等。另外，電極的串聯(lián)電阻小于10MΩ或突觸距胞體較近時受體的敏感性會很快下降。

電壓鉗制是否準確 在電壓鉗制不足的情況下，記錄突觸后電流，雖然，可以為突觸藥理學和突觸效能的活動依賴性的改變提供很有用的信息，但這些數(shù)據(jù)不能用于突觸后電流幅度和時程的準確估計。那么，我們?nèi)绾闻袛嗝看斡涗洉r電壓鉗制的質(zhì)量呢？如果突觸后電流來自樹突遠端，那么，該突觸后電流的鉗制質(zhì)量就較低(Silver, 1996)。另外，還有一些判斷鉗制質(zhì)量的方法，如突觸電流的上升時間較長(如AMPA受體電流的上升時間大于1ms)；在某一突觸后電流的翻轉電位下可見到雙相的突觸后電流等。

評價電壓鉗制質(zhì)量最常用的方法就是在一次記錄后，繪制上升時間對下降時間曲線圖。如果上升和下降時間被樹突過濾過，則該曲線呈正相關關系，上升或下降時間與幅度間就會呈負相關關系。總之，上升時間受樹突過濾的影響要遠遠大于下降時間。因此，如果隨上升時間的變化，下降時間變化較小，這種情況下的下降時間是可靠(Hestrin, 1990)。需要注意的是，上升時間與下降時間相關性較差并不足以判斷電壓鉗制的質(zhì)量。Johnston等對樹突上突觸反應的鉗制效果做了深入的討論(Brown and Johnston, 1983;Spruston, 1993)。Husser(1997)等建議用突觸電導隨鉗制電位的變化來檢測樹突突觸反應的幅度和動力學特性。

在突觸后電流較大時也存在鉗制的偏差。這時，由電極串聯(lián)電阻引起的電壓降會影響到突觸后電流的幅度和形狀。若想驗證是否存在這個問題，可以向灌流液中加入少許受體的高親和力的阻斷劑，觀察突觸后電流的時程是否會隨其峰值的下降而變化，因為，受體的阻斷不會改變其動力學特性(Otis, 1996;Zhang, 1994b)另外，可以改變串聯(lián)電阻補償?shù)乃剑^ 察在不同的補償水平下突觸后電流會不會改變(Llano, 1991;Takahashi, 1995)。在許多情況下，有可能在發(fā)現(xiàn)偏差后更正突觸后電流的下降時間。值得注意的是，串聯(lián)電阻可以帶來其它的偏差，如對波形的濾波效應。盲法膜片鉗記錄中，串聯(lián)電阻通常要大于10MΩ，因此，這種影響是不可避免的。但可以用公式1/(2pRseriesCM)計算記錄系統(tǒng)的過濾水平，確定突觸后電流峰值和形狀受影響的程度。

5、突觸反應的記錄

現(xiàn)在許多實驗室都開始應用膜片鉗技術記錄培養(yǎng)神經(jīng)元間、組織片中和異體移植組織中的突觸傳遞。與尖電極記錄相比，它具有明顯的優(yōu)勢。如，記錄的成功率較高，較高的信噪比，能較準確地鉗制胞電位等。膜片鉗甚至可以應用于在位突觸活動的記錄(Covey, 1996)。

記錄自發(fā)突觸后反應 自發(fā)的突觸后反應有兩個來源。一是局部神經(jīng)環(huán)路中動作電位發(fā)放引起的遞質(zhì)釋放，另一個是突觸囊泡中遞質(zhì)的自發(fā)釋放，后者被稱為微突觸反應(miniature synaptic event)。由于動作電位依賴性的自發(fā)突觸反應幅度與微突觸反應差別并不大，因此沒有必要將兩者區(qū)分開來。為記錄到很純的微突觸反應，可以用TTX來阻斷動作電位依賴性 自發(fā)突觸反應，另外，去除灌流液中的鈣或向其中加入鈣通道阻斷劑鎘，即可以阻斷電刺激誘發(fā)的遞質(zhì)釋放。但如果多個囊泡在同一個突觸末梢中同步釋放，則以上兩種方法的效果就不同了(Korn, 1994)。

自發(fā)性突觸活動的發(fā)放頻率通常小于幾Hz。發(fā)育期標本上，自發(fā)性突觸活動的頻率就非常低(Edwards, 1990)，因此，需要記錄較長時間才能獲得足夠用于分析的突觸反應。如果自發(fā)性突觸反應的頻率很高，多個突觸的反應就會重疊在一起，就不能通過上升或下降支的時間來判斷是單個突觸反應或是多個突觸反應的疊加，從而，給數(shù)據(jù)分析帶來許多麻煩。突觸反應的頻率受溫度的影響較大(Fatt, 1952)，因此，在特定的實驗中，可以通過調(diào)節(jié)灌流液的溫度來調(diào)整合適的突觸反應頻率。局部施加去極化或超極化溶液也可以誘發(fā)自發(fā)突觸活動(Bekkers, 1992;Tang, 1994)。在一些標本中，在刺激誘發(fā)的突觸反應之后，自發(fā)性突觸反應的頻率會顯著增高，在含有鍶的灌流液中尤其如此(Dodge, 1969;Goda, 1994)。這一事實可用于檢測與特定突觸活動相關的量子大小(Otis, 1996)。

數(shù)據(jù)采集 突觸反應可用計算機軟件通過特定的采集卡采集到計算機硬盤上。記錄電刺激的突觸活動時，還須用計算機產(chǎn)生一個TTL脈沖以激活刺激器，并由隔離器經(jīng)刺激電極刺激突觸前纖維。

所需的數(shù)據(jù)量 電刺激所誘導的突觸信號的記錄中，其數(shù)據(jù)量取決于信噪比和信號的變異度。對電刺激誘導的全細胞電流記錄而言，高信噪比不是問題，但在記錄自發(fā)突觸信號時，信噪比就變得比較重要了。實驗前最好做預實驗，估計獲得準確的均數(shù)所需記錄的信號數(shù)。當然，也應了解給定的刺激頻率下突觸信號的穩(wěn)定性。對于電刺激誘導的突觸信號，其峰值的變異 系數(shù)較小，因此，以0.1Hz的刺激頻率記錄5~10次就足夠了。對于自發(fā)性突觸信號來說，信號峰值的變異度較大，通常大于20%，為得到較可靠的結果往往需要記錄100個以上的信號。實際上，要得出準確的變異，往往需要記錄成百上千次信號，這也是得到較可靠的信號峰值分布規(guī)律的必要條件。在低頻刺激下記錄突觸信號時，要控制系統(tǒng)誤差，使記錄保持穩(wěn)定，須要制備活性較好的標本，并要有配套的穩(wěn)定的實驗條件。精確的測量控制是保證實驗數(shù)據(jù)可靠性的基礎，而且，每次實驗都要對其進行嚴格的評價。

6、突觸反應的分析

(1)刺激誘發(fā)的突觸反應的分析

突觸反應的大小和形狀 突觸電流和電位的檢測指標有潛伏時(latency)、峰值(amplitude)、10~90%上升時間(10~90% rise time)、1/2峰值時的波寬(half width)、失活的指數(shù)擬合時間常數(shù)(exponential decay curve)(圖1)。潛伏時是刺激尾跡(stimulus artifact)的起始時間到突觸電流或電位峰值的5%間的時間間隔(Zhang, 1994a)，潛伏時包括幾部分的延遲突觸前軸突發(fā)放和傳播動作電位的時間、神經(jīng)末梢去極化到遞質(zhì)釋放的突觸延遲、遞質(zhì)擴散到突觸后并引起受體激活的時間。由于遞質(zhì)擴散和受體激活的速度相當快，因此，突觸延遲是突觸前神經(jīng)末梢發(fā)放動作電位和出現(xiàn)突觸后反應間的時間間隔(Isaacson, 1995;Katz, 1965;Zhang, 1994a)。

突觸反應的幅度是其峰值與反應前基線間的差值。信噪比較低時，須要計算突觸反應前多個點和突觸反應峰值前后多個點的均值，然后，以它們間的差值作為突觸反應的幅度。上升時間用從峰值的10%到90%的時間描述較為準確。由于潛伏時的存在，很難判斷突觸反應開始的時間和到達峰值的時間。當刺激尾跡嚴重地干擾了突觸反應起始的判斷時，也可以用20 ~80%上升段的時間來描述上升時間。突觸反應時程可以用以下幾種方法來描述：

1、1/2峰值間的時間，它包括了上升時間和下降時間；

2、突觸反應的下降支經(jīng)多種指數(shù)擬合(如單指數(shù)擬合、雙指數(shù)擬合和多指數(shù)擬合)產(chǎn)生一個或多個時間常數(shù)(decay time constant)。

圖2自發(fā)突觸反應的分析。A將膜電位鉗制于-70 mV時記錄的微小興奮性突觸后電流B 多個微小興奮性突觸后電流升支相重合的疊加圖及其波幅的直方圖。

雙脈沖易化(paired pulse facilitation, PPF)，即以較短的間隔重復刺激突觸前纖維兩次，第二次刺激誘發(fā)的突觸反應大于第一次刺激的現(xiàn)象，這是一種突觸前現(xiàn)象，它可反映突觸前遞質(zhì)釋放概率的變化。

最小刺激誘發(fā)的突觸反應 記錄最小刺激(僅能激活一個或少數(shù)幾個突觸前纖維的刺激)誘發(fā)的突觸反應可用于估計量子的大小，這種刺激有時可以誘發(fā)突觸反應(success)，而有時則不能(failure)，其誘導出的突觸反應的均值可用于估計單個量子的大小。

可分析電刺激誘發(fā)的突觸反應的軟件 有許多常規(guī)軟件均可用于突觸反應的分析，如Axon公司開發(fā)的pClAMP軟件包，WaveMetrics公司開發(fā)的Igor Pro等，均可用于電刺激誘發(fā)的突觸反應的分析。

(2)自發(fā)性突觸反應的分析

突觸反應的檢測 目前有三種方法判斷自發(fā)性突觸反應(Hwang，1999)。第一、峰值超過即定閾值，該方法受基線波動的影響較大，這可以通過基線加以彌補第二、峰值相對于基線的變化量超過閾值，它受高頻噪聲的干擾較大，而且，很難設定一個合適的閾值，為克服這些不足，可以在處理時對原始數(shù)據(jù)進行濾波處理，除去高頻噪聲第三、與即定的波形模板進行比較，然后，判斷是否突觸反應，該方法對符合模板的突觸反應具有很高的敏感性，但在設定模板前，必須知道所要研究的突觸反應的一系列參數(shù)的范圍，如果模板設計不合理，將大大降低探測的敏感性，而且這種方式尤其不適于有信號重疊或多個突觸成份數(shù)據(jù)的分析。

PCLAMP 9.0對自發(fā)突觸反應的分析基于波形模板，只要模板設計得當，探測概率也較高。另外，Copenhagen等用Igor Pro開發(fā)了一個分析程序minifit.ipf。該程序對第二種方法做了一些改進，分三步探測突觸反應。第一步，粗篩可能的突觸反應，包括它們的起始時間和峰值時間第二步，用突觸反應起始與峰值間的差值計算可能的突觸反應的波幅，去除波幅 小于閾值的波形第三步，對起始點之前數(shù)點和峰值時間后的多個點取平均值，以排除噪聲的影響，并計算兩者間的差值對突觸反應的峰值做更精確的估計，如果該波幅低于閾值，與會從數(shù)據(jù)庫中被刪除。除波幅閾值的判斷標準外，該程序還還引入了上升時間、下降時間和波形時程范圍等描述波形模板的參數(shù)來進一步判斷突觸反應。該程序還可用于測量突觸反應的生物物理學特征。它可計算10~90%上升時間，描述突觸反應的上升相的動力學。該程序調(diào)用了Levenberg-Marquardt非線性曲線擬合函數(shù)對突觸反應的下降相做單指數(shù)或雙指數(shù)擬合，通過雙指數(shù)擬合與單指數(shù)擬合的比較檢驗，計算其失活時間常數(shù)。該程序還提供了一個非常有用的功能，就是將所有記錄到的非連續(xù)的突觸反應以上升支的中點為基礎相疊加，做逐點平均，這樣，既可以降低噪聲，也可以計算其動力學特征參數(shù)。

總之，腦片膜片鉗記錄成功的前提是制備活性較好的腦片，記錄條件優(yōu)化后，實驗的穩(wěn)定性、可重復性和準確性均較高，在神經(jīng)科學領域應用較為廣泛。許多神經(jīng)毒物可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸傳遞功能，腦片膜片鉗技術將為實時、準確、高效地研究這些毒物作用的機制提供可靠的技術支持。

腦片技術(1)準備樣品。

(2)取大鼠，斷頭，在60s內(nèi)快速將腦取出并置于含95%氧和5%二氧化碳的冰冷生理鹽水中冷卻3-5min用清潔、鋒利的解剖刀清除軟膜等組織，在此過程中避免擠壓和使腦變形的動作。(3)用氰丙烯酸鹽膠(Cynoacrylate glue)將其按所需方向固定于切片裝置的皿槽中，并放一塊瓊脂。即刻用冰水傾倒其上直到浸埋為止。保持腦組織在低溫狀態(tài)下以減小由于缺氧而損傷是至關重要的，并持續(xù)通氣。

(4)用振動切片機切成400μm厚的切片，將切片移至內(nèi)含32-35℃生理鹽水的記錄槽內(nèi)，水中持續(xù)通以95%氧和5%二氧化碳氣

(5)腦片放于5% CO2和95%O2飽和的Krebs堿性緩沖液5ml，在37℃下孵育5-15min平衡。(6)在35℃生理鹽水中孵育30-60min后開始記錄電活動(也有不進入這步，而直接在SS中孵育30min以上。

不用任何消化酶、避免酶損傷離子通道。一般腦片多用于膜片鉗記錄和腦片在位的原位分子雜交。

(1)膜片鉗技術 常用方式有：吹打清潔后封接；盲插封接。第一種方法是用帶有正壓記錄的記錄微電極吹掉靶細胞周圍的神經(jīng)纖維網(wǎng)之后，再與細胞膜進行封接。這一過程是在紅外微分干涉相差顯微鏡直視下進行。這種方法可在較大神經(jīng)元上記錄，也可在較小的神經(jīng)元上記錄，甚至可在一個神經(jīng)元的不同部位插上不同電極。可以選擇不同的細胞類型進行封接。但盲插法只要一般解剖顯微鏡即可，不需清潔，又可免去吹打對細胞及突觸結構的傷害。但它不能選擇細胞。目前已將膜片鉗技術發(fā)展到與碳纖電極相結合的優(yōu)點。可以檢測到單個囊泡的釋放。而膜電容監(jiān)測方法難以測到胞吐和胞飲的過程。而碳纖電極原理是電化學方法，檢測碳纖電極的前端加上可使被檢測物質(zhì)快速氧化的電壓(如600-800mV)，使電極端面周圍產(chǎn)生很強的電場，當可被氧化的物質(zhì)接近這個電場時，就會被氧化釋放電子到碳纖電極從而產(chǎn)生電流。

根據(jù)測量的需要，通常在碳纖電極上加上恒 定電壓和周期電壓。采用恒定電壓的安培測量法具有最高的時間分辨率，而采用周期電壓的快循環(huán)電壓測定法(如采用周期三角波)則可區(qū)分被氧化物質(zhì)類別。一般碳纖電極為5-10μm，電極一端與放大器相連，周圍部分的浴液必需絕緣。碳纖電極必需牢固固定,以保持剛性減小振動。而且碳纖電極的電流放大器必需要有足夠的帶寬(3-5KHz)，一般膜片鉗放大器能滿足要求。普通的碳纖電極主要插于玻璃毛細管中用玻璃電極拉制器搠制。可用膠粘接碳纖維和玻璃管以保證二者緊密結合。但碳纖電極也有一個缺點即是記錄的是細胞局部活動而非全細胞。

(2)腦片雜交。

(3)腦片標記，使突觸攝入放射性標記神經(jīng)遞質(zhì)或前體，然后神經(jīng)腦片攝入，使神經(jīng)末梢遞質(zhì)貯存庫被選擇性標記。在37℃孵育30-60min，然后用灌流液沖洗腦片，將腦片移入小室中灌流。灌流小室由直徑5mm的玻管制面，兩 端用塞子，調(diào)整塞子位置，使小室內(nèi)的體積為0.25-0.3ml。兩頭為流入管和流出管，為使腦片去極化，可加入一根鉑金絲作為刺激電極。每小室中移入2-5片腦片，用37℃灌流液灌流小室，速度為0.25-0.3ml/min，收集灌流液(每2-5min收集一次，共20-30min)，測定基礎釋放量。然后用電極刺激或加入不同物質(zhì)，使之去極化，測定流出液的放射性活性。用液體閃爍記數(shù)儀或HPLC電化學檢測。℃℃

(4)舉例

海馬腦片神經(jīng)元中的K+濃度測定法 先準備好振動切片機，并將所有器械將要接觸大鼠腦部位的部分放于4℃的細胞外液中。切片機切片刀先放一塊瓊脂，后腦組織可用502膠水或其它的膠張貼)成年大鼠，體重120-200g，乙醚麻醉下切開頭皮，暴露顱骨，斷頭取腦。(幼年大鼠更好，則不必切開頭皮和麻醉，可直接斷頭取腦，取腦過程中，不斷地加4℃SS，并將枕葉和額葉切除，放于切片機通氣的4℃的SS液體中)。取腦后放置于4℃，95%O2，5%CO2混合氣體飽和ACSF中凈血降溫，然后將腦置于用人工腦脊髓液預先濕潤的濾紙上，沿正中線分開大腦半球，由腦腹內(nèi)側沿皮層邊緣剝離雙側海馬，在4℃供氧條件下，用刀片垂直于海馬長軸，用手切將其切成400-500μm的腦片，將全部腦片置于36℃ACSF中，并不斷通入混合氣，孵育2h，ACSF pH調(diào)節(jié)7.3-7.4。(或將腦組織放于振動切片機上，基本控制大致的位置。用切片機切成8片左右，再取其 中較好的幾片進行實驗，將腦片在SS中將丘腦部分去除，保留皮層和海馬，取海馬CA1區(qū)，可以皮層的嗅溝作為標記。再的取出切片放于孵育液中，通氣的孵育30min以上，再打碎所要部分的細胞，進行實驗。)

實驗時，將孵育腦片置于36℃恒溫浴槽內(nèi)的尼龍網(wǎng)上，液面略高于液氣交界面，并不斷通入混合氣體供氧，氣體流量控制在400/分鐘，ACSF由蠕動泵以2-4ml/min速度持續(xù)灌流。雙極不銹剛電極置于CA3區(qū)神經(jīng)纖維 上，刺激電流0.3-1nA，時間為50-150ms，Ag-AgCl作參考電極，一端連碚灌槽，另一端與離子計、示波器接地相連。用多維手動微電極推進器分別將普通及K+選擇性微電極刺入神經(jīng)細胞內(nèi)。兩電極尾部均經(jīng)Ag-AgCl絲與ISE-1型離子計探頭相連，從離子計數(shù)字監(jiān)控表測刺激前后細胞膜電位(Em)、離子電極電位(Ee)及反應離子活度的電位(Ek=Ee-Em)，并將Em, Ee顯示于示波器中，實驗后將刺激前后電極電位換算成相應神經(jīng)元K+活度，并加以校正。

在測量時，理想的配置方案是讓離子選擇性微電極和普通微電極兩者同時都在同一神經(jīng)元中。那么兩電極的Em值相同。若不能在同一神經(jīng)元，則多測幾次求其增均值。不過，用雙管微電極，則必須用兩個放大器。活度測定一般采取校正曲線法。

注意(1)拉制微電極時，頸部不能太長，以便于液膜和內(nèi)充液的灌注。

(2)電極硅化時，防止硅化層太厚而阻塞尖端。(3)選擇電極前，一定要先測量電極的穩(wěn)定性，選擇好的電極。(4)灌注離子交換劑時，若內(nèi)有氣泡，可用手拉伸玻璃針把它引出，但要在放大100倍顯微鏡下觀察進行.(5)鉀離子選擇性電極使用前，應將電極下端浸入0.1mol/L KCl溶液內(nèi)，靜置1-2h，否則電極可能會出現(xiàn)明顯 的電位漂移。(6)為避免電極污染，制成后不宜久放，宜于當天使用。(7)腦薄片制作時，要在冰浴中進行，以減少術中出血。且以快而不損傷組織為原則。注意盡可能剝凈腦膜，切片避免薄片變形，破裂或卷曲。(8)人工配制腦脊髓時，溶液用ddH2O及化學試劑新鮮配制。灌流液灌注速度以每分鐘灌注更新率達6-10次不宜。

附 離子選擇性微電極，即離子敏感性微電極(ISME)，其特點對細胞損傷小，可制成雙管微電極。當鉀離子選擇性微電極插入神經(jīng)元內(nèi)，產(chǎn)生電位Ee是反應細胞內(nèi)K+的電位和細胞膜電位Em之和，即Ee=E+Em。另一普通微電極插入神經(jīng)元內(nèi)，可記錄到細胞膜電位Em，通過減法器，可得到E=Ee=Em，再通過校正雙曲線法，可求得細胞內(nèi)K+離子活度。

1單管選擇性微電極的制作(1)微電極處理 選用硬度高(GG-17)、管壁厚、或電阻率較高的玻璃毛坯，經(jīng)1:1濃硫酸和濃硝酸浸泡，自來水沖洗，蒸餾水煮沸后烤干備用。用微電極拉制儀拉成小于1μm的微電極。直流電阻為50±10MΩ。

(2)電極尖端疏水化 潔凈玻璃表面具有親水性，故充灌的非水溶性離子交換劑將很快被水相物質(zhì)所取代。因而，在灌注離子交換劑前，需對電極尖端進行疏水化處理。即硅化。在直徑約15cm，高約3cm玻璃盤內(nèi)放入約10根玻璃微電極。上面加蓋，蓋上有一小孔。加溫到150℃，維持15-30min以烘干電極，在小孔中滴入六甲基二硅烷約300μl，維持在150℃約40-60min，用其蒸氣硅烷化。還可將少量15%六甲基二硅烷注射到微電極轉窄處。由于存在微絲，硅化溶液會自然充入微電極頂部。注入硅化液的微電極應在室溫下靜置1h，然后置250℃烘箱同烤1h。加熱蒸去未與玻璃鍵合的硅化液組分。

(3)離子交換劑和內(nèi)部電解質(zhì)溶液的灌注 將玻璃電極倒置在金屬框中，并放在250℃烘箱烘1h。冷卻后，用毛細玻璃管自尾部向硅烷化后的電極尖端注入相應的0.5mol/L KCl，至電極肩部為止。然后將玻璃管自尾部向硅烷化后的電極尖端注入相應的0.5mol/L KCl，至電極肩部為止。然后將玻璃微電極尖端1-2mm浸入Fluka K+-Cocktil 60031 10min左右，樹脂可在電極尖端形成100μm左右液柱，最后作尾部灌注時，如果硅化處理良好，樹脂注入后略加引導，會自動流向尖端，且樹脂與玻璃封接穩(wěn)定。

(4)尾端處理 為防止水分蒸發(fā)，在尾部封以礦物油，然后將Ag-AgCl絲導入。現(xiàn)在一般有固定的玻璃管，不必進行特殊處理了。一般拉微電極，分兩步，拉出的微電極尖端細，但尖端不長。一般第一步溫度為60.2℃，第二步為37℃。玻管應放直，否則可能拉出的玻管不正。

2雙管微電極制作。(1)將兩單管毛坯粘在一起或火焰中封在一起。(2)拉成雙管微電極(3)在加壓下用蒸餾水充注一管，使其防止硅烷化。(4)將別一管頂端于硅酮溶液中浸5-10s，使其從頂端起200-500μm內(nèi)硅化。(5)加熱干燥整個雙管電極，從20℃開始至200℃至少烤1h。(6)借助顯微鏡操縱器將其頂端頂著的瓷物撕開，通常使尖端為2-3μm。(7)用直接注射法，以0.15mol/L NaCl水溶液充注非離子選擇管。(8)將電極浸入離子交換樹劑內(nèi)約10-15s，以便液體離子交換劑灌入硅化管頂端。(9)用注射法以0.5mol/L KCl灌注此管的其余部分。(10)尾端封以礦物油。然后將Ag-AgCl絲導入。

3鉀離子選擇性微電極的保存。經(jīng)硅化后電極未充液前可保存數(shù)天，最好在干燥空氣中保存。微電極保存待用時，需將其頂端浸在0.5mol/L KCl中。

4K+選擇性微電極校準。每次測定前，要在各種不同濃度KCl(3-300mmol/L)溶液(150mmol/L NaCl作背景)測試各電極的靈敏度。KCl溶液濃度每變10倍，鉀離子選擇性微電極反映出電位斜率為50-55mV，斜率過低時，棄去不用。

注(1)微電極多次插入和拔出細胞，其尖端可能受損或污染上雜質(zhì)，使其輸出電位變得不穩(wěn)定。因而每次測量時，都要檢查插入細胞前和拔出細胞后的電位值是否一致，若不一致，則測量數(shù)據(jù)無效，應更換微電極。(2)離子選擇性微電機有測量的是離子活度，而不是離子濃度。離子活度(a)與離子濃度(c)之間關系：a=f?c。f為活度系數(shù)，主要決定于溶液的離子強度和離子電荷數(shù)，同時也在某種程度上決定于溶液的組分。因而在生物介質(zhì)高離子強度下，不能再用離子濃度代替活度。(3)整個測量應在恒溫和屏蔽下進行。(4)應維持細胞的正常生理狀況。

第三篇：神經(jīng)電生理進修總結

為期6個月的進修生活轉眼就要結束,收獲頗多，故而感覺時間過得真快。期間收獲令我受益匪淺并將受益終身。來安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院后，進入神經(jīng)電生理室學習肌電圖與誘發(fā)電位診療技術，期間我嚴格遵守醫(yī)院及科室的各項規(guī)章制度，尊敬師長，團結同事，嚴格律己，努力將理論知識結合實踐經(jīng)驗，不斷總結學習方法和經(jīng)驗，培養(yǎng)自己獨立思考、獨立解決問題的能力。

在6個月的進修學習，帶教老師仔細耐心的教導我，在帶教老師的指導和自己的努力下我對神經(jīng)電生理有了一個更全面的認識，了解掌握了肌電圖與誘發(fā)電位診療技術及相關注意事項，熟悉了解肌電圖與誘發(fā)電位檢查適應癥和禁忌癥，對一些常見病、多發(fā)病的肌電圖表現(xiàn)有了更直觀、詳細的了解，基本能夠獨立完成肌電圖與誘發(fā)電位檢查的操作與報告的書寫，基本完成了進修的學習任務。

進修結束后，我將繼續(xù)努力，不斷學習，將所學知識投入到全心全意為患者服務的工作當中去。

第四篇：實驗3 蟾蜍坐骨神經(jīng)干電生理實驗

生理科學實驗報告—實驗3 神經(jīng)干

李丹陽 2006.09.28 實驗3 蟾蜍坐骨神經(jīng)干電生理實驗

【摘要】 目的 運用電生理實驗技術測定蛙類坐骨神經(jīng)干的單相、雙相動作電位和其中Ａ類纖維沖動的傳導速度，并觀察機械損傷、藥物對神經(jīng)興奮和傳導的影響。方法 采用RM6240微機生物信號處理系統(tǒng)，通過電生理的方法來測定蛙坐骨神經(jīng)干的單相、雙相動作電位的電位和時程以及其中Ａ類纖維沖動的傳導速度。并采用夾傷神經(jīng)和加不同藥物等處理措施，記錄一定刺激強度下坐骨神經(jīng)動作電位的大小變化，從而分析坐骨神經(jīng)干動作電位的影響因素及機制。

結果 動作電位的傳導速度為31.76±3.63 m/s，閾刺激強度為0.28±0.03 V，最大刺激強度為1.21±0.36 V。中樞端引導動作電位正相和負相振幅分別為3.15±1.87mV和 2.11±1.46mV，末梢端引導動作電位正負相振幅分別為7.04±2.01 mV和 3.89±1.46 mV，與中樞端引導時的動作電位振幅比有顯著性差異（p<0.01）；夾傷神經(jīng)干后，動作電位振幅為8.49±2.48 mV，時程為 1.73±0.40 ms，與末梢端引導時正相波時程比有顯著性差異（p=0.002<0.01）。引導電極間距離分別等于10mm、20mm和30mm時，動作電位正相振幅：A110為 7.07±1.87 mV，A120為 9.57±3.08 mV，A130為 9.75±3.33 mV，負相振幅：A210為 3.87±1.19 mV，A220為 5.35±2.23 mV，A230為 4.44±2.39 mV，A120、A130分別與A110比均有顯著性差異（p<0.05），A220與A210比有顯著性差異（p<0.05），A230與A210以及A220與A230比沒有顯著性差異（p>0.05）。3mol/L KCl處理前Ac正相振幅為 2.57±0.75 mV，負相振幅為1.28±0.52 mV，處理后5min A5正相振幅為3.16±0.97 mV，負相振幅為0.12±0.18mV；Dc正負相時程分別為 1.30±0.26 ms和2.00±0.65 ms，處理后5min D5正負相時程分別為 1.94±0.44 ms和0.31±0.44 ms。A5與Ac相比以及D5與Dc相比均有顯著性差異（P<0.05）。3％procaine處理前Ac正相振幅為 7.43±0.92 mV，負相振幅為4.17±0.75 mV；處理后5min A5正相振幅為8.54±1.88 mV，負相振幅為2.92±1.76 mV。Dc正負相時程分別為 0.88±0.21 ms和1.99±0.50 ms，處理后5min D5正負相時程分別為 1.02±0.29 ms和 2.13±0.79 ms。A55與Acc相比以及D55與Dcc相比均有顯著性差異（p<0.05）。結論 神經(jīng)沖動在神經(jīng)纖維內(nèi)可以雙向傳導，傳導速度為

m/s。雙相動作電位是神經(jīng)沖動先后通過兩個引導電極形成的，為正相波與負相波疊加后的結果。坐骨神經(jīng)干的動作電位及傳導過程不表現(xiàn)“全或無”現(xiàn)象，當刺激電壓從閾刺激增加至最大刺激的過程中，神經(jīng)干動作電位振幅隨刺激電壓增加而增高。KCl處理神經(jīng)干過程中，由于阻滯了K+的外流，動作電位的振幅隨時間延長逐漸減小，至5min時已基本為0。procaine處理神經(jīng)干后，由于阻滯了Na+的內(nèi)流，動作電位的振幅逐漸變小。

【關鍵詞】神經(jīng)干 刺激 復合動作電位 單相動作電位 雙相動作電位 傳導速度

神經(jīng)纖維在接受閾上刺激后產(chǎn)生動作電位（全或無），產(chǎn)生后沿其神經(jīng)纖維以一定的速度傳導。神經(jīng)干由許多神經(jīng)纖維組成，從神經(jīng)干引導的動作電位是這些神經(jīng)纖維的復合動作電位。通過置于神經(jīng)干上的電極，可以引導出不同的單相、雙相動作電位。不同的神經(jīng)纖維傳導速度也不同，蟾蜍坐骨神經(jīng)干主要由Aα類纖維組成，傳導速度約為30-40m/s。神經(jīng)損傷以及藥物作用等對神經(jīng)的興奮、傳導都具有影響。本實驗通過測定不同條件下神經(jīng)干動作電位參數(shù)變化，探討其機制。

1.材料和方法

1.1實驗動物

蟾蜍（中華蟾蜍指名亞種，Zhuoshan Toad）生理科學實驗報告—實驗3 神經(jīng)干

李丹陽 2006.09.28 1.2藥品

任氏液、3%procaine、3mol/LKCl.1.3 器材

RM6240微機生物信號處理系統(tǒng)（成都儀器廠）、神經(jīng)標本屏蔽盒。1.4坐骨神經(jīng)干制備

蟾蜍毀腦脊髓，去上肢和內(nèi)臟，下肢剝皮浸于任氏液中。蟾蜍下肢背面向上置于蛙板上，剪去尾椎；標本腹面向上，用玻璃分針分離脊柱兩側神經(jīng)叢，用線在近脊柱處結扎，剪斷神經(jīng)；將神經(jīng)干從腹面移向背面。標本背面向上固定，從大腿至跟腱分離坐骨神經(jīng)。坐骨神經(jīng)標本置任氏液中備用。1.5儀器連接和參數(shù)

“實驗”菜單中選擇生理科學實驗中的“神經(jīng)干動作電位”進入實驗信號記錄狀態(tài)。儀器參數(shù)：

1、2通道時間常數(shù)0.02s、濾波頻率1KHz、靈敏度5mV，采樣頻率40kHz，掃描速度0.5ms/div。單刺激方式，刺激幅度1.0V，刺激波寬0.1ms，延遲5ms，同步觸發(fā)。1.6 動作電位引導

神經(jīng)干標本置于標本盒的電極上，神經(jīng)與電極接觸良好，調(diào)節(jié)刺激電壓，記錄動作電位。

2.觀察項目

2.1 蟾蜍坐骨神經(jīng)干復合動作電位參數(shù)測定

2.1.1 將神經(jīng)干中樞端置于刺激電極處，用刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms的方波刺激神經(jīng)干，測定第一對引導電極引導的雙相動作電位正相波與負相波的振幅（Ac1、Ac2）和時程（Dc1、Dc2）。

2.1.2 將神經(jīng)干末梢端置于刺激電極處，用刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms的方波刺激神經(jīng)干，測定第一對引導電極引導的雙相動作電位正相波與負相波的振幅（Ap1、Ap2）和時程（Dp1、Dp2）。

2.2 動作電位傳導速度測定

將神經(jīng)干中樞端置于刺激電極處，用刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms的方波刺激神經(jīng)干，記錄通道1、2產(chǎn)生動作電位起始時間之差，根據(jù)υ＝ S R1-R2 / Δt 計算出AP的傳導速度。

2.3 引導電極間距離的變化對動作電位振幅的影響

取下第二對引導電極，用刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms的方波刺激神經(jīng)干，分別記錄第一對引導電極間距離為10mm，20mm，30mm時的動作電位的正負相振幅（A1、A2）。2.4 單相動作電位引導

用鑷子將第一對引導電極之間的神經(jīng)夾傷，用刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms的方波刺激神經(jīng)干，測定第一對引導電極引導的單相動作電位的振幅（Am）和時程（Dm）。2.5 刺激強度（U）變化對動作電位振幅（A）的影響

用刺激波寬0.1ms，刺激電壓從0.1V按步長0.05V不斷增加，測定不同刺激電壓下動作電位振幅的變化，直到動作電位不再增大為止。記錄閾刺激強度（Uth）和最大刺激強度（Umax）以及所對應的動作電位振幅。2.6 3mol/L KCl溶液處理后的影響

將一小塊浸有3mol/L KCl 溶液的濾紙貼附在第2對引導電極的后一電極的神經(jīng)干上，用刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms的方波刺激神經(jīng)干，記錄KCl溶液處理前及處理后5min時，第一對引導電極引導的動作電位振幅（Ap）和時程（Dp）。2.7 3%procaine處理后的影響 生理科學實驗報告—實驗3 神經(jīng)干

李丹陽 2006.09.28 換一神經(jīng)干，將一小塊浸有3%procaine溶液的濾紙貼附在第1 對引導電極的后一電極的神經(jīng)干上，用刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms的方波刺激神經(jīng)干，記錄procaine處理前及處理后5min時，第一對引導電極引導的動作電位振幅（Ap）和時程（Dp）。

3.結果

3.1 刺激波寬0.1ms時，閾刺激Uth為0.28±0.03 V；最大刺激1.21±0.36 V，刺激電壓1.0V時，動作電位的傳導速度為31.76±3.63 m/s。（見表1）

表1 蟾蜍坐骨神經(jīng)干閾刺激、最大刺激和傳導速度

sample Uth(V)

Umax(V)

V(m/s)1 2 3 5 6 7 8 9 ?x±s 0.30 0.32 0.30 0.25 0.25 0.30 0.26 0.24 0.28±0.03 0.99 1.16 1.30 1.25 1.80 1.50 1.10 0.59 1.21±0.36* 30.77 31.75 28.17 28.17 34.48 31.25 30.30 39.22 31.76±3.63 *p＜0.01 vs閾刺激組。

刺激波寬0.1ms，刺激電壓從0.1V按步長0.05V不斷增加時，當刺激電壓小于閾刺激時，不產(chǎn)生動作電位；當刺激電壓大于閾刺激小于最大刺激時，動作電位振幅不斷增大；當刺激電壓大于最大刺激時，動作電位振幅不再增大。動作電位振幅與刺激電壓的變化關系見圖1。

圖1 不同強度刺激電壓對蟾蜍坐骨神經(jīng)干動作電位振幅的影響

65432100.000.250.500.751.001.25

3.2 刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms時，中樞端引導時動作電位，正相和負相振幅分別為3.15±1.87 mV和 2.11±1.46 mV，兩者有高度顯著性差異（p=0.001<0.01)；動作電位正 生理科學實驗報告—實驗3 神經(jīng)干

李丹陽 2006.09.28 負相時程分別 0.95±0.16 ms和 1.68±0.41 ms，兩者有高度顯著性差異（p=0.0004<0.01)；末梢端引導時動作電位正負相振幅分別為 7.04±2.01 mV和 3.89±1.46 mV，與中樞端引導時的動作電位振幅比有高度顯著性差異（p<0.01）；動作電位正負相時程分別為 0.98±0.18 ms和 2.02±0.48 ms，與中樞端引導時沒有顯著性差異（p>0.05)。（見表2）

表2 蟾蜍坐骨神經(jīng)干中樞和末梢引導的復合動作電位

sample Ac1(mv)Ac2(mv)

Dc1(ms)

Dc2(ms)

Ap1(mv)

Ap2(mv)

Dp1(ms)

Dp2(ms)1 2 3 4 5 6 7 8 9 x±s 4.98 2.86 4.64 1.69 6.23 1.81 0.99 1.27 3.92 3.15±1.87 3.03 2.15 2.72 1.10 5.23 1.27 0.56 0.72 2.20 2.11±1.46** 0.84 0.90 0.83 1.32 1.04 0.93 0.98 0.80 0.87 0.95±0.16 1.52 1.60 1.11 1.96 2.31 1.40 1.31 2.23 1.70 1.68±0.41** 8.02 7.00 8.99 5.35 9.86 8.11 3.31 5.79 6.91 7.04±2.01* 4.27 4.41 6.13 2.09 4.16 5.24 1.36 3.79 3.59 3.89±1.46* 0.94 0.84 0.88 1.37 1.13 1.04 1.02 0.81 0.80 0.98±0.18 1.97 1.69 1.19 2.56 2.67 1.97 1.59 2.41 2.09 2.02±0.48 *p<0.01 vs中樞端引導組；**p<0.01 vs正相波。

3.3 夾傷神經(jīng)干后，動作電位振幅為 8.49±2.48 mV；時程為 1.73±0.40 ms，與末梢端引導時正相波時程比有高度顯著性差異（p=0.002<0.01）。（見表3）

表3 蟾蜍坐骨神經(jīng)干雙相和單相復合動作電位

sample Ap1(mV)

Ap2(mV)

Dp1(ms)

Dp2(ms)

Am(mV)

Dm(ms)1 2 3 5 6 7 9 x±s 8.05 7.00 8.99 9.86 8.11 3.76 7.61 7.63±1.94 4.18 4.41 6.13 4.16 5.24 1.95 4.05 4.30±1.28 0.93 0.84 0.88 1.13 1.04 0.94 0.83 0.94±0.11 1.96 1.69 1.19 2.67 1.97 1.77 2.26 1.93±0.46 8.40 2.06 8.62 2.19 10.66 1.44 11.66 2.19 7.85 1.33 3.80 1.35 8.45 1.53 8.49±2.48 1.73±0.40* *p<0.01 vs末梢端引導時正相波。

3.4 刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms，第一對引導電極間距離分別等于10mm、20mm和30mm時，末梢端引導的動作電位正相振幅：A110為 7.07±1.87 mV，A120為 9.57±3.08 mV，A130為 9.75±3.33 mV，A120、A130分別與A110比有顯著性差異（p<0.05），A120與A130比沒有顯著性差異；負相振幅：A210為 3.87±1.19 mV，A220為 5.35±2.23 mV，A230為 4.44±2.39 mV，A220與A210比有顯著性差異（p<0.05），A230與A210以及A220與A230比沒有顯 生理科學實驗報告—實驗3 神經(jīng)干

李丹陽 2006.09.28 著性差異（p>0.05）。（見表4）

表4 引導電極間距離對坐骨神經(jīng)干動作電位振幅的影響(mV)sample 10mm A1

A2

A1

20mm

A2

A1

30mm

A2

x±s 8.38 6.92 7.94 5.26 10.06 8.02 3.76 5.96 7.32 4.18 4.46 4.08 2.15 4.42 5.83 1.95 3.96 3.83 3.87±1.19

7.07±1.87

12.19 8.11 8.83 6.35 14.97 11.68 5.02 8.54 10.48 9.57±

3.08* 7.74 4.65 3.68 3.49 7.82 7.40 1.45 5.26 6.69 5.35±2.23*

12.65 8.21 8.29 6.41 15.91 12.09 5.35 8.48 10.37 9.75±

3.33*,** 8.70 2.82 2.33 3.24 7.67 4.42 2.39 2.70 5.65 4.44±2.39#,** *p<0.05 vs 10mm組，#p>0.05 vs 10mm組，**p>0.05 vs 20mm組。

3.5 刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms，3mol/L KCl處理前Ac正相振幅為 2.57±0.75 mV，負

相振幅為1.28±0.52 mV。處理后5min A5正相振幅為3.16±0.97 mV，負相振幅為0.12±0.18mV。A5與Ac相比有顯著性差異（p<0.05)；Dc正負相時程分別為 1.30±0.26 ms和2.00±0.65 ms，處理后5min D5正負相時程分別為 1.94±0.44 ms和0.31±0.44 ms。D5與Dc相比有顯著性差異（P<0.05）。（見表5）

表5 3mol KCl 對坐骨神經(jīng)干動作電位振幅和時程的影響

sample Ap1(mV)5

Ap2(mV)c

c

Dp1(mS)

Dp2(mS)c

c

2.14 1.47 1.78 2.42 2.80 2.99 3.60 3.38 2.57±

0.75 1 2 3 4 5 7 8 9 x±s 2.87 1.80 2.26 2.50 4.41 3.24 3.92 4.31 3.16± 0.97*

1.54 1.42 1.21 0.84 2.33 1.27 0.70 0.89 1.28±

0.52 0.24 0.21 0.48 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.12± 0.18

1.40 1.32 1.10 1.72 1.35 1.30 1.40 0.82 1.30±

0.26 2.27 1.62 1.40 2.62 1.86 2.39 1.82 1.57 1.94± 0.44*

1.90 1.57 1.19 3.31 2.03 2.19 2.32 1.52 2.00±

0.65 1.03 0.66 0.78 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.31± 0.44 *p<0.05 vs處理前

3.6

刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms，3％procaine處理前Ac正相振幅為 7.43±0.92 mV，負相振幅為4.17±0.75 mV。處理后5min A5正相振幅為8.54±1.88 mV，負相振幅為2.92± 生理科學實驗報告—實驗3 神經(jīng)干

李丹陽 2006.09.28 1.76 mV。A55與Acc相比有顯著性差異（p<0.05)；Dc正負相時程分別為 0.88±0.21 ms和1.99±0.50 ms，處理后5min D5正負相時程分別為 1.02±0.29 ms和 2.13±0.79 ms。D55與Dcc相比有顯著性差異（p<0.05）。（見表6）

表6 3% procaine 對坐骨神經(jīng)干動作電位振幅和時程的影響

sample Ap1(mV)5`

Ap2(mV)c

5`

c

Dp1(mS)

5`

Dp2(mS)c

5`

c

7.66 9.03 7.88 6.40 7.65 6.50 6.86 7.43±

0.92 1 2 3 4 5 7 9 x±s 9.95 11.10 8.85 6.42 9.86 6.47 7.12 8.54±1.88*

4.42 5.03 5.06 3.40 3.86 3.15 4.26 4.17±

0.75 5.70 1.42 2.59 2.43 2.50 0.88 4.90 2.92±1.76

0.91 0.95 0.63 1.10 1.06 0.93 0.56 0.88±

0.21 0.95 1.23 0.80 1.22 1.25 1.21 0.50 1.02±0.29*

2.05 1.97 1.18 2.10 2.81 2.20 1.64 1.99±

0.50 3.34 1.43 1.35 2.52 2.82 1.40 2.05 2.13±0.79 *p<0.05 vs處理前

4.討論

4.1 中樞端引導和末梢端引導時均能產(chǎn)生動作電位，說明神經(jīng)沖動在神經(jīng)纖維內(nèi)可以雙向傳導。且中樞端引導和末梢端引導時產(chǎn)生的動作電位的時程沒有顯著性差異，說明神經(jīng)沖動的傳導速度與神經(jīng)沖動的傳導方向是沒有關系的。文獻資料顯示蛙類神經(jīng)沖動的傳導速度在20℃時約為30m/s。實驗中測得的蟾蜍坐骨神經(jīng)干動作電位傳導速度為27.61±8.19m/s，與文獻數(shù)據(jù)相比有意義，說明神經(jīng)干標本生理功能完好。

4.2

神經(jīng)傳導依靠局部電流來完成，要求神經(jīng)纖維在結構和功能上都是完整的。實驗中將兩引導電極間的神經(jīng)夾傷后，神經(jīng)沖動傳導被阻斷，可觀察到雙相動作電位的負相波消失，只形成一正相波。由此可見，雙相動作電位是神經(jīng)沖動先后通過兩個引導電極形成的。當沖動通過第1個電極時，產(chǎn)生第一次動作電位，即我們所觀察到的正相波；當沖動通過第2個電極時，產(chǎn)生第二次動作電位，即我們觀察到的負相波。我們所觀察到的雙相動作電位實際為正相波與負相波疊加后的結果。實驗中觀察到單相動作電位的時程顯著長于雙相動作電位正相波的時程；逐漸增加兩引導電極間距離，單相動作電位的振幅也逐漸增大。這些也都證明了觀察到的雙相動作電位為正相波與負相波疊加后的結果。

4.3 實驗中觀察到雙相動作電位的正相波振幅顯著大于負相波的振幅。因為一條神經(jīng)干是由許多條神經(jīng)纖維以及纖維間的結締組織組成的，神經(jīng)干的動作電位應為每一條神經(jīng)纖維動作電位疊加的結果。由4.2可知雙相動作電位是神經(jīng)沖動先后通過兩個引導電極形成的。當神經(jīng)沖動經(jīng)過第1個電極時，每條神經(jīng)纖維產(chǎn)生動作電位疊加后即為正相波的振幅；當神經(jīng)沖動經(jīng)過第2個電極時，由于某些神經(jīng)纖維處于不應期內(nèi)，從而產(chǎn)生第二次動作電位的神經(jīng)纖維數(shù)量減少，疊加后的值小于第一次，即正相波振幅大于負相波的振幅。

4.4 刺激電壓從閾刺激增加至最大刺激的過程中，神經(jīng)干動作電位振幅隨刺激電壓增加而增高，說明坐骨神經(jīng)干的動作電位及傳導過程不表現(xiàn)“全或無”現(xiàn)象。

4.5 動作電位的產(chǎn)生是由于Na+跨膜內(nèi)流和K+跨膜外流形成的，而離子跨膜流動的動力主 生理科學實驗報告—實驗3 神經(jīng)干

李丹陽 2006.09.28 要來自其濃度梯度。細胞在靜息狀態(tài)時膜內(nèi)[K+]高與膜外。當用KCl處理神經(jīng)干時，膜外[K+]增高，因此K+的濃度梯度減小，K+跨膜外流減少，導致動作電位振幅減小。隨著時間延長，膜外[K+]繼續(xù)增高，當增至膜內(nèi)外[K+]相同，即不再產(chǎn)生動作電位。因此KCl處理神經(jīng)干過程中，動作電位的振幅隨時間延長逐漸減小，至5min時已基本為0。

4.6

Procaine為局部麻醉藥，可作用于神經(jīng)細胞膜Na+通道，封閉Na+通道，阻滯Na+的內(nèi)流，從而使動作電位振幅下降，甚至完全喪失產(chǎn)生動作電位的能力。實驗中procaine處理神經(jīng)干后動作電位振幅逐漸變小，與理論相一致。

【參考文獻】

（1）姚泰.生理學.人民衛(wèi)生出版社.北京.2002.4第1版.（2）陸源,夏強等.生理科學實驗教程.杭州：浙江大學出版社，2004.

第五篇：兒童眼底病診斷與視覺電生理應用

兒童眼底病診斷與視覺電生理應用

陰

正

勤

第三軍醫(yī)大學西南眼科醫(yī)院，重慶

視覺電生理技術

在兒童的視覺電生理檢查中，常用的檢查方法

視網(wǎng)膜電圖（Electroretinogram , ERG)和視覺誘發(fā)電位(Visual evoked potential, VEP)

國內(nèi)目前在全視野ERG檢測中存在的問題：

1、全視野ERG臨床應用不夠：

有關視網(wǎng)膜電圖臨床應用和實驗研究的文章有237篇(2004,10-2009,10)其中有205篇是視網(wǎng)膜電圖臨床應用方面的文章，包括全視野ERG、圖形ERG、多焦ERG和局部視網(wǎng)膜電圖(Focal ERG)全視野ERG臨床應用和研究的文章只有51篇，占總數(shù)的1/4

2、全視野ERG檢測的病種偏少： 51篇10多種病變。

全視野ERG能診斷和鑒別診斷涉及以下各類約近100種視網(wǎng)膜視神經(jīng)病變：

1)彌漫性感光細胞營養(yǎng)不良；2)靜止性視錐功能障礙；3)靜止性夜盲；4）遺傳性黃斑營養(yǎng)不良；5）脈絡膜細胞營養(yǎng)不良；6）玻璃體視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良；7）炎癥性視網(wǎng)膜脈絡膜病變；8）視網(wǎng)膜血管性病變；9）藥物中毒性視網(wǎng)膜病變；10）維生素D和類視黃醇缺乏；11)視神經(jīng)和神經(jīng)節(jié)細胞病變；12）糖尿病視網(wǎng)膜病變；13)視網(wǎng)膜脫離；14）眼外傷；15）視網(wǎng)膜血管樣條紋；16）其它綜合征

全視野ERG是各類視網(wǎng)膜手術、藥物治療和臨床研究中療效評價的客觀指標

3、全視野ERG檢測方法不標準、結果描述不規(guī)范

來自不同醫(yī)院的研究者存在較大差異：綜合實力較強的單位的科研人員，全視野ERG檢測操作很正規(guī)，描述較詳細。具體包括：1）基本技術準備； 2）操作過程；3）結果的展示； 4）統(tǒng)計方法。

某些地方基層醫(yī)院的研究報告，存在很多不嚴謹和不規(guī)范的情況：如電極的安放位置，刺激光強度的選擇，間隔時間等。

特別是對于結果分析，很多基層研究者對統(tǒng)計技術不熟悉，采用均數(shù)和標準誤來描述非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，并用t檢驗和方差分析進行差異分析。所得出的結果，存在較大誤差。

一、視網(wǎng)膜電圖

視網(wǎng)膜電圖是視網(wǎng)膜受不同形式光刺激后產(chǎn)生的電位變化，它反映了視網(wǎng)膜的功能狀態(tài)，具有客觀性和無創(chuàng)性等優(yōu)點，已成為眼科臨床的重要輔助診斷工具。分類

閃光ERG（Flash ERG）圖形ERG（Pattern ERG）多焦ERG（Multifocal ERG）

（一）全視野視網(wǎng)膜電圖的國際標準

ISCEV – International Society for Clinical Electrophysiology of Vision國際臨床視覺電生理學會 1989年ISCEV首次建立全世界通行的ERG檢查規(guī)范，隨后不斷更新(1999,2004,2008)電生理符合ISCEV指導原則后必須達到： 可重復性

可對照性

具有實時波形 穩(wěn)定性以及安全性 ISCEV現(xiàn)有標準

視覺電生理診斷法的指導原則 臨床視網(wǎng)膜電圖標準 臨床眼電圖標準

臨床視覺誘發(fā)電位標準 臨床圖形視網(wǎng)膜電圖標準

基本的多焦ERG技術指導原則

1、標準的ERG檢查項目(閃光亮度 cd.s.m-2)暗視0.01 ERG(既往叫視桿細胞反應)暗視3.0 ERG(既往叫最大混合反應)暗視3.0 振蕩電位

明視3.0 ERG(既往叫視錐細胞反應）明視30Hz閃爍光反應

2、確定了背景和閃光刺激的強度

在原來刺激光、背景光強度范圍的基礎上，將光強度規(guī)范為固定值：①標準刺激光強度為3.0 cd·s·m-2 ②明適應時背景光強度為30.0 cd·m-2

③暗適應0.01 ERG，刺激光強度為：0.01 cd·s·m-2 ④暗適應3.0 ERG刺激光強度為：3.0 cd·s·m-2 ⑤暗適應3.0振蕩電位刺激光強度為：3.0 cd·s·m-2 ⑥明適應3.0ERG刺激光強度為：3.0 cd·s·m-2 ⑦明適應3.0閃爍ERG刺激光強度為：3.0 cd·s·m-2

3、增加的ERG檢查項目 黃斑或局部ERG 多焦ERG 圖形ERG

早期感受器電位(ERP)暗適閾值反應(STR)Direct-current ERG 長期間明適ERG(on-off反應)雙閃光ERG

（二）標準全視野ERG檢查中的注意事項

1、電極——記錄電極

角膜接觸電極或貼靠球結膜電極，包括 角膜接觸鏡電極 導電纖維電極 鉑金電極 結膜環(huán)狀電極 角膜絲電極

角膜接觸鏡電極最常用、最穩(wěn)定，幅值最高 中央透明區(qū)盡可能大 周邊分離眼瞼

采用非灌注、非變應原的、相對低粘度的離子導電液體（<0.5%甲纖）表麻僅應用于角膜接觸鏡電極

操作者須了解自己所選電極的眼部接觸狀況、電極阻抗、相應波形和幅度，建立自己實驗室參數(shù)

參考電極

最好摻合到角膜接觸鏡電極翼鏡，接觸結膜形成雙極電極，這樣電學上最穩(wěn)定 可置于眶緣、記錄眼顳側或前額，但會有眼交叉或皮層誘發(fā)電位信號干擾的風險

電極

應清潔皮膚，并采用合適的導電膏或凝膠 參考電極和地電極阻抗<5k?

在沒有光線刺激時電壓基線應保持平穩(wěn) 參考電極需由非極化材料做成 每次使用之后電極需清潔和消毒

電記錄設備

放大器：帶通應在0.3-300Hz，Ops和其他要求下帶通還需調(diào)整 前置放大器的輸入阻抗>10MΩ

需能處理交流耦合以及電極產(chǎn)生的補償電位

注意事項： 患者的隔離

患者應電學隔離，保證安全

3、數(shù)據(jù)顯示和平均

記錄的最終結果顯示沒有干擾

示波器或電腦數(shù)字系統(tǒng)分辨率都很好 數(shù)字儀器的采樣頻率應不低于1kHz 通過電腦ERG波形可以很快顯示，從而連續(xù)地監(jiān)視記錄的穩(wěn)定性并進行調(diào)整 ERG信號能很好地平均

所有單個閃光反應至少20ms以上 臨床操作程序

擴瞳：盡量放大瞳孔

暗適或明適前：記錄視桿ERG需暗適應20分鐘，明適記錄視錐反應需10分鐘 先明適或先暗適取決于操作者

戴角膜接觸鏡先暗適可減少時間，在微弱紅光下植入電極 盡量避免在ERG檢測前行FFA，否則要暗適1h 正常值

建議每個實驗室針對各自的設備和本地人群，建立自己的ERG正常值 檢查報告或文章發(fā)表需要附錄自己的正常值范圍 電極、設備和操作均會影響ERG幅值 ERG參數(shù)在嬰兒期迅速增高，隨后穩(wěn)定

（三）全視野ERG記錄和判讀中的影響因素

1、刺激持續(xù)時間(duration of stimulus)對全視野ERG反應的影響：

明適應全視野ERG最長刺激持續(xù)時間不超過20ms;暗適應FERG最長刺激持續(xù)時間不超過100ms。

如果保持刺激光持續(xù)時間恒定，增加強度，不僅使反應的幅度增加，而且使反應的潛伏期縮短；相反，如果保持刺激光強度不變，延長持續(xù)時間，則會使?jié)摲谘娱L

2、視網(wǎng)膜光照區(qū)域大小對全視野ERG反應的影響：

全視野ERG源于視網(wǎng)膜對光的散射和基本一致的均勻反應。無論刺激光的強度有多大，要得到ERG的反應，視網(wǎng)膜的光照面積（stimulus areas）至少要有20mm2

3、刺激的間隔時間對全視野ERG反應的影響：

全視野ERG檢查中，每項檢查的間隔時間是非常重要的，特別是記錄時間長、刺激強度大的情況下尤其如此。暗適應和明適應間檢查的間隔時間要足夠長，否則，反應的幅度和潛伏期都會降低

4、瞳孔大小對全視野ERG反應的影響：

全視野ERG記錄時瞳孔應充分散大。對青光眼用了縮瞳劑的病人，由于到達視網(wǎng)膜的刺激光減弱，因而，反應幅度可能會減少。

5、循環(huán)系統(tǒng)疾病和藥物對全視野ERG反應的影響

高血壓病人的全視野ERG反應幅度比正常人升高。一些血管擴張藥物，如罌粟堿，氯乙酰膽堿和妥拉蘇林亦可導致全視野ERG b波的反應幅度增加

6、麻醉對全視野ERG反應的影響：

麻醉對b波幅度有影響。一些麻醉藥物可降低暗視b波50%的反應，但對明視和暗視a波的影響很小。輕度麻醉時，可見b波幅度升高；但深度麻醉導致b波幅度下降。

7、年齡、性別和屈光不正對全視野ERG反應的影響

全視野ERG的一個重要特性是與年齡有關。出生后14小時的新生兒可記錄到明適應和暗適應反應，但視功能達到成年人水平一般在一歲后。

超過60歲的老年人，a波和b波的反應幅度降低、潛伏期延長。近視度數(shù)≥6D b波的幅度明顯降低，眼軸越長，b波幅度越低。

8、屈光介質(zhì)對全視野ERG反應的影響：

1）屈光介質(zhì)混濁，全視野ERG幅度減小，常伴潛伏期延長。有時甚至記錄不到全視野ERG反應。

2）置換玻璃體：玻璃體切術后用硅油置換玻璃體，其全視野ERG幅度還是顯著下降；在視網(wǎng)膜復位后取出硅油，幅度迅速恢復。這表明，ERG幅度的下降與硅油的絕緣性有一定關系。但ERG幅度下降的百分比與被置換的玻璃體百分比不成線性正比關系

9、晝夜節(jié)律對全視野ERG反應的影響：

同一天不同時間全視野ERG的幅度值也不相同。

兒童檢測的注意事項

嬰兒和不配合的兒童（2-6歲）：需鎮(zhèn)靜 麻醉會影響視桿ERG的b波 角膜接觸鏡電極不適用

金箔電極（暗適應振幅降到56%）：不常用 DTL纖維電極（暗適應振幅降到46%）：常用 皮膚電極（暗適應振幅降到12%）：常用 兒童視網(wǎng)膜電圖檢測的臨床應用

視網(wǎng)膜色素變性

先天性靜止性夜盲

Leber 先天性黑朦

視錐營養(yǎng)不良

視錐視桿營養(yǎng) Stargardts病

二、視覺誘發(fā)電位

視覺誘發(fā)電位：是大腦皮層對視覺刺激發(fā)生的一簇電信號，又稱為視誘發(fā)皮層電位（VECP）或 4 視誘發(fā)反應（VEP）。是反映視覺通路的傳遞信號；是研究視覺發(fā)育和功能變化的重要工具 分類（刺激形式）：

閃光視誘發(fā)電位（F VEP)圖形視誘發(fā)電位(PVEP)

掃描圖形視誘發(fā)電位(SPVEP)多焦視覺誘發(fā)電位（mfVEP）

兒童視覺誘發(fā)電位檢測注意事項

1、檢測前向患兒和家長進行良好的溝通，檢查時幼兒可由親屬抱著或坐在嬰兒車里進行。

2、必須在嬰幼兒清醒的狀態(tài)下行VEP檢查，注意檢查時眼有無偏離固視點及閉眼等情況，必要時暫停VEP 的迭加記錄，待注視刺激屏幕后再進行記錄。

3、嬰幼兒檢查需兩人，一位引導兒童的注意力；一位操作檢查儀（旁邊放置玩具或粘貼圖片）

4、所有受檢兒童的數(shù)據(jù)必須與相同年齡的正常兒童比較

5、對于沒有固視能力的幼兒不應選擇圖形VEP 檢查，可記錄閃光VEP。如選用低強度的閃光刺激要注意眼瞼有無睜開，高強度閃光刺激時則眼瞼的狀態(tài)對檢查結果影響不大

6、單眼記錄困難時，可用雙眼圖形刺激來粗略評估視功能 兒童視覺誘發(fā)電位檢測的臨床應用

嬰、幼兒的視覺系統(tǒng)發(fā)育與大腦發(fā)育是同步進行的，該階段視覺系統(tǒng)能否順利發(fā)育對一生的視功能狀況都有影響。由于受嬰、幼兒表達能力及合作程度的限制，如何對其視功能進行準確測定，長期以來一直是小兒眼科工作中的一個難點。VEP 為此提供了一種較為客觀及可行的方法 VEP 在小兒眼科方面主要有以下作用：

① 檢測正常及患各種先天性眼病嬰、幼兒的視力及視覺發(fā)育過程； ② 用于疾病的診斷或鑒別診斷 ③ 監(jiān)測病情發(fā)展及判定療效

展望

視覺電生理檢查技術對視覺功能發(fā)育特性的研究，以及兒童斜弱視和先天性視網(wǎng)膜疾病的診斷和治療評價具有非常重要的意義，針對兒童這一特殊群體，開發(fā)和應用兒童實用的更為方便、準確和靈敏的設備、檢查參數(shù)，使之成為臨床得力的診治工具！