第一篇：PCR實驗中的幾點體會

PCR實驗中的幾點體會

PCR實驗是一項對儀器設備、環境設施及操作步驟要求非常嚴格的實驗，實驗過程中檢測目的成份會被擴增放大到千百萬倍。因而實驗過程中很小的一點誤差、非常微量的污染都可能導致結果錯誤甚至實驗失敗。我們在實際工作中，從環境控制到儀器維護及工作流程的每一步做到嚴格要求細致入微，樣本檢測、室內質控及室間質評都取得了滿意成績，在此次PCR實驗室復審中得到專家老師的肯定，現將我們在工作中認為需地注意的地方提出來，以供商榷：

一、環境控制 為控制溫度而使用空調時必須特別注意避免污染。我們的做法是清潔空調過濾網，待干，紫外線消毒30分鐘，正反面相同。開機之前用1：100“84”消毒液浸濕的紗布包住出風口，運行30分鐘，使吸附空調機內的灰塵。

二、試劑配制

所有的試劑都盡可能平衡到室溫后再使用。HBV-DNA檢測中的濃縮液及質控物，融化后定量分裝離心管中，一次用不完的凍存到下次使用，避免反復凍融。

三、樣本制備

吸取上清液 吸頭不要接觸到離心管內壁，盡量在離心管中央，懸停在液面下隨液面下降而逐漸下移，盡量吸凈上清液。

沉淀處理 HBV-DNA濃縮過程中的沉淀，用振蕩器很難完全分散也可能影響核酸的提取，導致測定結果偏低。我們的做法是用一只小鑷子輕敲離心管底部使沉淀盡可能分散，充分混勻，然后點離一下。

提取 提取液是一種混懸液，易沉淀，加取過程中要不斷抽吸混勻。加樣 核酸的提取液2ul加入反應管中，這一步移液器使用非常關鍵。首先保證移液器和吸頭是配套的，再就是吸頭是垂直于液面吸取樣本，移液時用力要均勻，盡可能一次性移出全部樣本。2ul移液器校正困難，當標準曲線線性關系不好時，可以考慮是否是移液器使用時間過久，應該及時更換。

四、擴增分析 擴增儀最好先預熱一下，再使用。擴增開始后應注意觀察溫度曲線。不符合溫度變化規律的曲線如升溫曲線變得平坦提示儀器部分或全部加熱模塊功能損壞，從而導致結果錯誤。在結果判定時應注意分析擴增曲線，曲線出現倒“S”形，常提示病毒含量較高，必須稀釋后復查。

第二篇：PCR實驗常見問題

【實驗】PCR常見問題總結

作者: gene121(站內聯系TA)發布: 2005-07-04 PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。一.假陰性，不出現擴增條帶

PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及活性 ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。1假陽性

出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或 器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。2出現非特異性擴增帶

PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設計引物。②減低酶量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。3出現片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：①減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環次數。二.PCR污染與對策

PCR反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。污染原因

(一)標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。

(二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三)PCR擴增產物污染:這是PCR反應中最主要最常見的污染問題，因為PCR產物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物 污染，就可造成假陽就可形成假陽性。

還有一種容易忽視，最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由 其造成的污染是一個值得特別重視的問題.(四)實驗室中克隆質粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。污染的監測

一個好的實驗室，要時刻注意污染的監測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。對照試驗

1.陽性對照:在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好，經各種鑒定是該產物的標本，如以重組質粒為陽性對照，其含量宜低不宜高(100個拷貝以下)，但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經自己使用穩定，檢驗人員心中有數時，在以后的實驗中可免設陽性對照。

2.陰性對照:每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。②試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以監測試劑是否污染。

3.重復性試驗

4.選擇不同區域的引物進行PCR擴增 防止污染的方法

(一)合理分隔實驗室:將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環擴增及PCR產物的鑒定等步驟分區或分室進行，特別注意樣本處理及PCR產物的鑒定應與其它步驟嚴格分開。最好能劃分①標本處理區;②PCR反應液制備區;③PCR循環擴增區;④PCR產物鑒定區。其實驗用品及吸樣槍應專用，實驗前應將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。

(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產生氣溶膠污染。

(三)預混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應小量分裝，如有可能，PCR反應液應預先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復加樣次數，避免污染機會。另外，PCR試劑，PCR反應液應與樣品及PCR產物分開保存，不應放于同一冰盒或同一冰箱。

(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用。(五)設立適當的陽性對照和陰性對照，陽性對照以能出現擴增條帶的最低量的標準病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。

(六)減少PCR循環次數，只要PCR產物達到檢測水平就適可而止。

(七)選擇質量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內液體濺出。

第三篇：PCR實驗室認證體會

一、申請臨床基因擴增實驗實驗收的目的

臨床基因擴增實驗室近年來在我國發展很快，基因診斷技術在疾病的預防、診斷、治療方面起到了積極的作用。由于、基因擴增檢測技術的應用對、實驗室的環境條件、儀器設備、試劑耗材、人員技術能力和質量控制等方面要求嚴格，而一些實驗人員對此不甚了解，加之利益的驅使，曾經在20世紀80年代，某些沿海省份的實驗室未按要求規范設置，出現氣溶膠污染，導致大規模假陽性結果報出，為臨床診斷造成了極大的困難。臨床基因擴增實驗室為了規范實驗室，保證基因擴增技術有效應用，防止假陰性、假陽性結果的報出，為臨床出具合格而可靠的報告，申請臨床基因擴增實驗室的驗收是必然而且也是必要的。

二、開展臨床基因擴增實驗的必備條件

根據衛生部2002年1月14日發布了衛醫發[2002]10號《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》（以下簡稱《辦法》）及其附件《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》，及同年2月20日衛生部臨床檢驗中心發布《臨床基因擴增實驗室工作規范》，明確規定臨床基因擴增檢驗實驗室開展PCR技術必需具備的條件：

（1）二級以上醫院實驗室，經衛生部臨床檢驗中心驗收合格；（2）從事基因擴增實驗操作的人員必須經過培訓并取得上崗證；

（3）使用經國家藥品監督管理局批準的允許進入市場銷售的商品試劑盒；

（4）開展衛生部允許開展的項目。具備了以上幾條后，我們從事臨床基因檢測任務才是符合要求和規定并對臨床出具的報告有保障的。

三、臨床基因擴增實驗室驗收準備工作 1.硬件準備

（1）實驗室整體布局：

根據《辦法》要求，臨床基因擴增檢驗室原則上分為四個單獨的工作區域：試劑貯存和準備區，標本制備區，擴增產物分析區。由于我實驗室使用的是羅氏公司的Lightcycler實時熒光定量擴增儀，擴贈后產物不需開蓋處理直接檢測，所以擴增區和擴增產物分析區合為一室，此區為負壓。實驗室設計時按照《辦法》規定，三個區域相互獨立，并有各自的緩沖區域（見圖1）（2）各工作區域儀器設備

各工作區域的儀器設備及物品，包括椅子、辦公用品、清潔用品等均不能拿出本區域，所有可移動物品均應有本區域的標示。

各區域應具備的設備配置為：屋頂紫外燈、近臺紫外燈、一次性手套、一次性鞋套、工作服、廢液缸、掃帚、拖把、廢紙褸簍、微量加樣器（覆蓋1-1000μl），經高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）、筆、紙等。各工作區域的特殊配置包括：

（1）試劑貯存和準備區：2～8oC冰箱、漩渦震蕩器、超凈工作臺。

（2）標本制備：2～8oC冰箱、-20oC冰箱、高速臺式冷凍離心機、漩渦震蕩器、金屬加熱模塊、超凈工作臺。

（3）擴增及產物分析區：羅氏Lightcycler熒光定量核酸擴增儀、電腦、打印機。

同時：進入各工作區域必須嚴格按照單一流向，并用明顯的箭頭表示，個區域用不同的顏色以示區別。即試劑貯存和設備區（藍色）→標本制備區（白色）→擴增及產物分析區（粉色）。2.軟件準備：

（1）臨床基因擴增實驗室文件編寫： 本實驗診斷中心正在進行ISO15189實驗室的認可工作，故質量手冊同中心統一，其它文件包括：程序文件、標準操作程序（SOP）、相關圖表等由本實驗自己制定。制定的原則根據衛生部下發的兩個文件，并結合本實際情況編寫適合本實驗實際情況編寫適合本實驗室的切實可行的文件，做到“寫你所做的，做你所寫的，記錄你已做的”。具體編寫內容如下：

①程序性文件：PCR實驗室管理制度，PCR實驗室人員管理制度，儀器設備的管理程序，PCR實驗室儀器設備操作程序，PCR實驗室儀器設備校準程序，PCR檢驗實驗操作程序，實驗室消耗品購買、驗收及儲存程序，PCR試劑購買、驗收及儲存程序，PCR檢測標本的管理程序，PCR實驗室記錄控制程序，PCR檢驗結果報告的控制程序，PCR實驗室室內質量控制程序，抱怨處理程序，實驗室生物防護錯施，實驗室的清潔程序，實驗室廢棄物處理程序等。

②標準操作程序（SOP）：試劑準備區工作制度，樣本準備區工作制度，PCR擴增區工作制度，半自動型蒸汽壓力滅菌器標準操作程序，高速離心機的標準操作程序，恒溫金屬浴使用規程，漩渦震蕩器標準操作程序，潔凈工作臺的標準操作程序，可調式加樣器標準操作程序，恒溫金屬浴的校準程序，標本采集、運送、接收、保存的標準操作程序試劑準備的標準操作程序，核酸提取的標準操作程序，Lightcycler使用的標準操作程序，統計學者質量控制的標準操作程序，消耗品驗收質檢的標準操作程序。試劑質檢的標準操作程序等。

③相關圖表：PCR實驗室工作人員一覽表，實驗室主要負責人簡歷表，PCR實驗室工作人員檔案，PCR實驗室人員培訓計劃，儀器設備一覽表，儀器設備損壞、故障、修理記錄，儀器設備的報表申請表，儀器維護保養記錄，Lightcycler熒光定量擴增儀維護保養記錄，恒溫金屬校準記錄，采購申請單，試劑領取驗收記錄，試劑質檢記錄，消耗品質檢記錄，消耗性材料領取驗收記錄，標本接收等記表，不合格標本記錄，報告單發放接收登記表，特殊報告要求登記表，抱怨情況登記表，抱怨處理登記表，PCR實驗室日常工作核查表，Lightcycler儀器使用記錄，試劑使用記錄，PCR實驗室室內質量控制失控原因及糾正錯施記錄，樣本處理記錄，冰箱溫度記錄-試劑準備區，冰箱溫度記錄-樣本準備區，環境溫度記錄-試劑準備區，環境溫濕度記錄-樣本準備區，環境溫度記錄-PCR擴增區，PCR實驗室日常工作核查表，紫外燈使用登記表，溫度計校準記錄，PCR實驗室平面圖等。（2）人員管理：

文件要在臨床基因擴增實驗室工作的實驗人員必須經過培訓并取得上崗證，所以在申請實驗室驗收前，要至少一名人員參加衛生部檢驗中心舉辦的臨床基因擴贈實驗室上崗培訓班并取得上崗證。同時實驗室還應該制定自己的培訓計劃，保證實驗室人員能不斷得到培訓。（3）實驗方面：

使用經國家藥品監督管理批準的允許開展的項目。

四、臨床基因擴增實驗室驗收申請

如果以上方面準備就緒后，就可以進行臨床基因擴增實驗室驗收申請了，但以本人的經驗，建議在實驗室設計好后，先請驗收專家進入實地看一下，并提出他們的寶貴意見，以免在驗收時因離要求有差距而成耽誤了驗收，同時編寫好的程序性文件和SOP文件也應請才、專家過目，得到認可后再提交申請，內容包括： 1.基因擴增檢驗實驗室基本情況：

（1）實驗室所屬法人單位名稱、地址、電話、聯系人等。（2）實驗室人呀情況和職稱比例。2.應提供的資料

（1）《醫療機構職業許可證》復印件；

（2）擬設置基因擴增檢驗實驗室醫院的醫療衛生資源狀況，對臨床基因擴增檢驗的需求情況以及實驗室運行的預測分析；

（3）擬設基因擴增檢驗實驗室的設置平面圖；（4）實驗室主要負責人簡歷表；（5）實驗室工作人員一覽表；（6）主要儀器設備表；

（7）擬開展的臨床基因診斷項目；

（8）實驗室相關程序文件和標準操作程序（SOP）；（9）檢驗報告樣單； 3.希望驗收時間 4.聲明

本實驗室自愿申請衛生部臨床檢驗中心組織的技術驗收，并愿意承擔下列義務：遵守《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》和《臨床基因診斷實驗室工作規范》及與關規定；不論能否獲得通過驗收，預付驗收階段的全部費用。

五、現場技術驗收

當提交臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收申請表后，大約兩周時間內（視具體情況而定）衛生部臨床檢驗中心會將臨床基因擴增檢驗實驗室收通知傳真或郵寄至你處，告知驗收工作的具體時間、專家組成員、驗收程序及驗收費用等。

在驗收當天，專家組成員將對實驗室布局、實驗室設置及儀器設備配備情況、實驗室表示、程序文件標準操作文件的編寫、試驗記錄等情況進行驗收，同時還會現場讓實驗室技術人員進行臨床標本的操作，實驗結果的正確與否也是實驗室驗收合格的依據之一。現場提問時專家會對你所編寫的文件進行提問，主要涉及實驗室污染、是內質控、標本的收集及保存等。驗收結束后，專家會填寫臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收報告，對驗收結果進行總結，提出整改要求和意見。

六、臨床基因擴增檢驗實驗室收體會 1.認真學習和領會衛生部頒發的《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》及其附件《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》，及衛生部臨床檢驗中心發布《臨床基因擴增實驗室工作規范》的內容，并將以上兩個文件的內容落室到自己所編寫的程序文件和標準操作程序中。

2.實驗室布局設計好后一定要請專家實地進行一下檢查，如果條件不具備，也可以將實驗室設計平面圖寄給專家，因為每個實驗室都有自己的具體情況，如果是新建的實驗室可以按照衛生部臨檢中心提供的標準實驗設計圖來設計，如果是在老的實驗室基礎上改造，就應該多聽一些專家的意見，以免在驗收的時候因實驗室設計不合理而耽誤驗收以至延誤臨床工作的開展。

3.程序性文件和標準操作程序編寫時，最主要的是可操作性要強，尤其是SOP文件，使用頻率很高，與實驗室的日常工作密切相關，寫的要具體一些，格式并不是很重要，主要是讓第依次接觸該SOP的人也能夠按其完成相關操作。同時還要集注，該文件不是用來驗收的。而是給自己實驗室人員用的，要認識到文件對保證檢驗質量的重要性，這樣在編寫時就能更細化，更具體，更實用。文件的編寫是整個實驗室驗收工作任務重要的一個環節，也是驗收工作時檢查的重點，所以在編寫文件時要讓每一個實驗室的人員都參與進來，對所寫的內容、程序和要求都要知道，并能遵守執行。在驗收的時候，專家會對你所寫的文件內容進行提問，如果一個實驗室操作人員對其應該遵循的管理制度和SOP一無所知之甚少，這樣對日常檢驗的質量控制也是沒有好出的。文件編寫好后，建議也請專家過目，得到首背后再提交認可申請。

4.文件編寫好后，應該按其執行，做到“記錄你所做的”簡單的說就是將常規工作中所做的記錄下來，一般說，需要記錄的有臨床標本接收中的餓患者個人資料、標本接收日期、標本狀態、唯一編號等；檢測前實驗室的清潔；檢測中實驗記錄，試劑廠家、批號、檢測日期、檢測結果、質控記錄及分析、檢測人（簽字）、儀器運轉情況等；檢測后實驗臺面、儀器設備等的消毒和清潔、紫外線照射等。依次兩次的記錄并不難，難的是持之以恒。所以許多記錄我們多記錄我們可以把做到成表格的形式，記錄時在相應的條款上打“√”就行了。

5.實驗過程嚴把質量關。我們編寫的質量手冊的木的的是規格實驗操作整個過程，做到實驗過程有章可循，實驗記錄有據可查，保證實驗結果的可靠性和準則性。由于基因擴增技術特殊性，即使嚴格按質量手冊進行操作，也難免出現錯誤結果，因此包括試劑空白對照，陰性標本對照、臨界值陽性標本對照等，分別監測試劑配制與加樣過程中是否存在污染，標本核酸模板提取過程紅是否存在污染，標本檢測過程中是否在假陰性結果和結果是否準確等。

6.工作量少影響質量保證系實施。嚴格按臨床基因擴增檢驗實驗室技術要求通過驗收的實驗室，存在一定運行成本，需要有一定臨床標本量的支持；如果某一醫院醫療資源不足，標本來源不足以支持運行成本時，就會想方設法去減少運行成本（包括試劑成本和勞務成本），導致檢驗質量難以得到保證。因此建立了臨床基因擴增檢驗實驗室后，應根據本醫院的情況，制定可行的試驗方案（如實驗周期、合理接受外來標本等），做到既保證臨床標本結果的質量又不浪費成本。以上只是本人對臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收及日常工作的一點體會，望和大家多多交流。參考文獻

1.申子瑜，李金明.《臨床基因擴增檢驗技術》，人民衛生出版社。

第四篇：PCR實驗技術總結

PCR實驗技術總結點擊次數：422 作者：佚名 發表于：2008-06-15 20:53 轉載請注明來自丁香園

來源：互聯網

PCR技術簡史

一、PCR的最早設想

核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術，Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想：“經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。

二、PCR的實現

1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內復制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。

三、PCR的改進與完善

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優點，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫學界的足夠重視。

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環一次，仍需加入新酶。

1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發現使PCR廣泛的被應用。

PCR技術的基本原理

類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

（一）模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

（二）模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

（三）引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。(Plateau)。到達平臺期所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

PCR的反應動力學

PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA 片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現“停滯效應” 這種效應稱平臺期數、PCR 擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素。大多數情況下，平臺期的到來是不可避免的。

PCR反應體系與反應條件

一、標準的PCR反應體系：

10×擴增緩沖液10ul 4種dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA0.1～2ug Taq DNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/L 加雙或三蒸水至100ul

二、PCR反應五要素

參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

（一）引物

引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

設計引物應遵循以下原則：

1、引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

2、引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

3、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

4、避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

5、引物3'端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

6、引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。

7、引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

（二）酶及其濃度

目前有兩種Taq DNA聚合酶供應，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2。5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

（三）dNTP的質量與濃度

dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。

（四）模板(靶基因)核酸

模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

（五）Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。

三、PCR反應條件的選擇

PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。

（一）溫度與時間的設置

基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。

1、變性溫度與時間

變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。

2、退火(復性)溫度與時間

退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)復性溫度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

3、延伸溫度與時間

Taq DNA聚合酶的生物學活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時，DNA合成幾乎不能進行。

PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。

（二）循環次數 循環次數決定PCR擴增程度。PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環次數選在30～40次之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。

PCR反應特點

一、特異性強

PCR反應的特異性決定因素為：

（一）引物與模板DNA特異正確的結合；

（二）堿基配對原則；

（三）Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；

（四）靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能

保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。

二、靈敏度高

PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。

三、簡便、快速 PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

四、對標本的純度要求低

不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測。

PCR擴增產物

可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5'端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由于引物所結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3'端開始延伸，其5'端是固定的，3' 端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產物片段”。進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即“長產物片段”)結合。引物在與新鏈結時，由于新鏈模板的5'端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3'端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內、形成長短一致的“短產物片段”。不難看出“短產物片段”是按指數倍數增加，而“長產物片段”則以算術倍數增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。

PCR擴增產物的分析

PCR產物是否為特異性擴增，其結果是否準確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定，才能得出正確的結論。PCR產物的分析，可依據研究對象和目的不同而采用不同的分析方法。

一、凝膠電泳分析 PCR產物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產物的特異性。PCR產物片段的大小應與預計的一致，特別是多重PCR，應用多對引物，其產物片斷都應符合預訐的大小，這是起碼條件。

（一）瓊脂糖凝膠電泳： 通常應用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。

（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測分析。

二、酶切分析： 根據PCR產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。

三、分子雜交： 分子雜交是檢測PCR產物特異性的有力證據，也是檢測PCR 產物堿基突變的有效方法。

（一）Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記后做探針，與PCR產物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。

（二）斑點雜交： 將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用于PCR產物特異性鑒定及變異分析。

四、核酸序列分析： 是檢測PCR產物特異性的最可靠方法。

PCR產物克隆方法

一、平端連接

通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能在兩6條DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為3'突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產物的效率通過較高。在采用大量T4DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率。對于較短PCR產物，用PUS19的HincⅡ位點進行克隆，以X－gal和IPTG篩選，?？傻玫阶懔恐亟M子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將PCR產物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產物。

二、粘端連接

（一）引物中設計入限制酶位點

由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互補堿基，因此可以在兩引物的5'末端設計單限制酶或雙限制酶切位點。這樣得到的PCR產物用限制酶消化產生粘性末端，即可與有互補粘端的載體DNA重組。這種克隆方法效率較高，且當兩引物中設計不同酶切位點時，可有效地定向克隆PCR產物。其缺點是需要加長PCR引物，除限制酶識別序列外，還需要在其5'端多合成3-4個堿基以利于限制性內切酶與PCR產物末端的穩定結合。即使如此，其酶切效率也不夠高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等較為難切。采用突變PCR方法可克服上述缺點。該方法是通過在兩PCR引物序列中改變1至數個核苷酸創造出一個限制性內切酶位點。鑒于PCR引物的3'末端序列的互補性是PCR成功的關鍵，在PCR引物的中部或近5'端改變1個或幾個堿基對PCR擴增效果影響不大。這種方法不需要增加PCR引物的長度，而且酶切效果優于5'加端法。對于特定DNA片段的克隆，此方法較為經濟、實用。但對于基因診斷PCR產物的克隆，似乎5'加端法更為適宜。

（二）T4DNA聚合回切產生粘端

如PCR兩引物的5'末端是A或T，則可在其5'端分別加上CG和CCGG。用此二引物擴增的PCR產物在dATP和dTTP存在的情況下，用T4DNA聚合酶進行處理，則T4DNA聚合酶因具有3'→5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，產生AccI和XmaI粘性末端。此DNA片段直接與用AccI和XmaI切開的載體進行連接。這種方法只需在PCR引物的5'端加2-4個堿基，但其可選擇的限制酶類有限。

三、T－vector法

TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3'末端加一個堿基，所加堿基幾乎全是腺苷。據此，Marchuk等人采用3'端突出一個胸苷的質粒DNA來克隆PCR產物，其克隆效率比平端的連接至少高出100倍。他們用EcoRV將pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的兩個3'末端各加一處胸苷。因為在4種dNTP都存在時，Taq聚合酶選擇性參入dATP，而當僅一種dNTP存在時，它只能參入該種堿基。因此，在只加入ddTTP時，用TaqDNA聚合酶可使平端載體DNA轉變成3'末端突出一個胸苷的T尾載體，稱為T－vector。用這種T－vectorsk可以較有效地直接克隆PCR產物。Hotton等人也報道了另一種制備T－vector的方法。他們使用脫氧核苷酸末端轉移酶在切成平端的載體DNA的3'末端加上一個胸苷。由于末端轉移酶可以催化多個堿基（ddTTP）作為底物，使平端載體DNA分子的兩個3'末端各加上一個T。用這種方法制備的T－vector的不同之處在于前者3'末端不能與待克隆PCR產物的5'末端連接，僅5'末端可與PCR產物的3'末端形成磷酸二脂鍵。

四、共環消解法

最近，Jung等人報道了一種有效的PCR產物克隆方法。用磷酸化的PCR引物擴增得到的PCR產物，先用T4DNA連接酶催化連接反應，使5'端帶有限制酶切位點的擴增DNA片段連接成共環結構。然后再用相應的限制酶進行消化，產生粘端DNA片段。對于對稱性限制酶位點，只需在引蛾的5'末端加上一關識別序列，因為在串接成共環后能恢復限制酶切位點難于切開的缺點，且可用于雙限制酶切位點的設計，只不過有PCR產物共環化后，僅約1/4的限制酶切點得以恢復。故此法較適用于單限制酶位點的克隆。

五、無連接酶亞克隆法

無連接酶克隆法（ligase-free subcloning，LFS）是利用引物5'末端附加堿基修飾法，修飾堿基不是酶切位點，而是與某一質粒兩端分別互補的堿基。兩引物的3'端約20-25個核苷酸分別與待擴增DNA兩翼互補，5'端各有約24個核苷酸分別與線性化質粒的3'端相同的附加序列。由于線性化質粒的3'端序列各不相同，PCR片段可以通過選擇各引物的合適5'附加序列與引物3'端定向雜交。由此物a和b產生的兩端有附加序列的PCR產物與未反應引物分離后，分別加入兩只含有線性化質粒的反應管中進行第二次PCR。第1管中用引物a和c，引物a即為第一PCR擴增的上游引物a，引物c為下游引物，與緊鄰5'端附加序列內測的質粒（+）鏈互補。同樣，第2管的引物為b和d，引物b與第一次PCR擴增的下游引物b相同，引物d為上游引物，與緊鄰5'附加序列內側的質粒（-）鏈互補。

第二次PCR的第一循環中，PCR產物與質粒均變性與復性。除自身復性產物（這種復性產物不被擴增）外，PCR產物與質?？赏ㄟ^各自3'端互補序列雜交成部分異源雙鏈，延伸時，重疊的3'端互為此物沿各自互補鏈延伸，結果可產生PCR片段與線性質粒的“連接”。然后兩管中PCR擴增各進行15-20個循環。這便可產生大量一端管1）或另一端連接有PCR插入片段的質粒。第二次PCR后將第1管與第2管反應液混合，用堿變性雙鏈，中和后稀釋變性的DNA。反應管中的單鏈DNA可以復性或幾種不同的產物，除各自本身復性產物外，管1產物ssDNA與管2中ssDNA可形成部分異源雙鏈DNA，并各自有一較長的5'或3'懸端，這種長的5'或3'懸端相互互補，在低DNA濃度時可復性產生環化DNA。

盡管這種環化的DNA有兩個缺口，但它們可以直接用來轉化受體大腸直桿菌。一旦進入體內，兩個缺口便共價連接，修復的質粒即可復制，下面以從λ噬菌體DNA中擴增-500bp片段，并克隆入pGem4Z載體中為例說明LFS法。

這種方法同樣適于復雜基因組中基因片段的克隆。需注意的是第一次PCR時兩引物的5'附加序列不應太短以免影響第二次PCR時異源雙鏈的形成，以24個核苷酸較為合適。擴增時若形成，引物二聚體，一定要去除，否則會嚴重影響轉化率。用LFS法已成功地克隆了長達1.7kb的基因片段。這種方法的優點是：①可用于常規方法無法進行亞克隆的片段；②適于任何PCR產物和任何質粒；③可亞克隆特殊目的（如含點突變、缺失或插入等）片段；④在某些情況下，對已構建了啟動子或增強子等序列的載體，可使待表達片段插入定向合適位置；⑤較快，可在1d內完成，較常規方法可靠，不需DNA連接酶。

DNA克隆是分子生物學的重要內容。特定基因的克隆常因兩端缺乏合適限制酶切點而受因，cDNA的克隆通常也效率不高、篩選因難。采用PCR技術行DNA和cDNA的克隆，則可大大縮短克隆時間，比之全基因合成更為經濟和方便，因而愈來愈受重視。用PCR方法進行傳染性疾病和遺傳性疾病的診斷常遇到產物的異性問題和分型問題，采用產物克隆和測序方法，比之寡核苷酸探針雜交方法更為準確。隨著PCR技術的不斷發展和推廣，新的PCR產物的克隆方法也將不斷出現。

PCR基礎的檢測工具的優缺點

首先，PCR反應是快速的。整個DNA提取，擴增和檢測的過程通常少于6小時，如果反應利用嵌套的引物，過程可能長些。對于一些樣本來說，比如來自糞便和表皮，就需要在DNA提取中增加步驟。這樣就延長了整個檢測的時間到14小時。

用購買的核苷酸提取工具就能縮短檢測時間，機械進行提取，使PCR方案最優化或使用加快熱循環技術。有了優化的樣本，快速提取和光循環熱循環，整個檢測時間能縮短到2小時。但通常是6-8小時。

于培養基基礎的方法2-5天的時間相比較，這是巨大的進展了。這也比一些需要有精確計算結果的培養基濃縮的抗體檢測實驗要快。當購買的實用抗體基礎的檢測工具比PCR基礎的方法快時，大部分這樣的化驗只能用于非常有限的生物體上。

第二，PCR不需要培養。這是與PCR基礎的檢測的速度密切相關的。既然PCR是十分靈敏的（少到10 cfus的樣本就能被檢測），培養通常是沒必要的。大多數最新的實用PCR檢測工具需要有選擇性的濃縮，特別是當樣本包括大量的PCR抑制劑時。用核苷酸提取方法能夠避免培養，核苷酸提取方法產生了PCR質量的DNA并且優化了PCR反應。如果在大量樣本中檢測少量的病原體或者病源有機體在PCR靈敏度的極限以下的情況下，將需要使用培養。在一般情況下，使用培養的情況是很少的，去除了培養的步驟，時間將被節省下來。

比節省時間更重要的是，去除了培養，那些難以或不能培養的生物體就可以進行檢測。這些生物體包括某種病毒、真菌、厭氧性生物和支原體。

第三，PCR的花費合理。與培養或抗體基礎的化驗相比，PCR基礎的診斷是十分經濟的?？紤]到細菌的培養，有較昂貴的花費。大多數樣本為了正確的鑒定需要培養和重復培養。這需要大量的手工時間（加上化驗的花費），也增加了污染的危險。

作為比較，大多數抗體化驗所需的手工時間很少但化驗本身很昂貴。

PCR反應的成分（引物，酶，dNTPs和緩沖液）的花費比每次化驗的花費少40%，而反應的時間包括核苷酸分離，通常在一小時以內。當然這依賴于樣本、技術員和用于分離核苷酸的技術。既然PCR所用的時間少，它的花費也少。

但是，PCR需要熱循環，UV來源和一些類型的圖象捕獲裝置，因此PCR實驗室的最初花費是很高的。

這里討論另外一些在臨床領域的PCR使用的基本原理

第一，PCR不是抗原基礎的。

抗體基礎的檢測工具（ELISA和其他）不僅檢測直接抗病原體的人類抗體，而且能檢測病原體上的表面抗原。人類抗體檢測工具因此需要免疫反應的存在，以及在正確檢測抗原存在之前抗體濃度的測定。在新近感染的情況下，這種測試不能檢測針對病原體的人類抗體，可能不能正確反映是否有感染。事實上，被感染的病人，沒有充足的時間來提高用于檢測的濃度。這是HIV抗體基礎檢測的通常的問題。由于相同的原因，這種類型的測試對檢測無免疫應答患者的病原體存在困難。反過來講，抗體基礎的測試也會給出錯誤相反的結果。

然而抗體基礎的檢測最大的問題是它不能檢測新的病原體亞型，由于表面抗原發生改變，而導致了錯誤的陰性結果。（PCR基礎的檢驗也可能由于DNA的變化、突變而遇到相似的問題。但PCR基礎的檢驗能夠進行設計，使這些錯誤的陰性結果最小化。）盡管有這些缺點，抗原基礎的檢測工具是十分重要的檢測方法，在大多數情況下比PCR檢測要迅速。

第二，檢驗易按客戶的要求設置，以適合特殊的需要

通過簡單使用不同的特殊目標引物，工具能迅速設計，用于許多檢測。

第三，PCR容易使用，是由時間證實的技術

通過使用有商業價值的核苷酸提取產物，用于病原體檢測的樣本能在少于十分鐘的時間內被例行操作。一旦進行操作，樣本被加入反應體系中，進入熱循環。反應完成后，樣本能被自動系統或凝膠電泳所分析。

少數的PCR檢測將能完全自動化。儀器將進行所有操作，從樣品的準備到分析結果。這樣的系統將十分昂貴，可能只能適應制造商的平臺。這對大多數臨床實驗室無吸引力，但當價格下降后，將最終使PCR診斷自動化。

第五篇：PCR實驗檢測標準操作規范

PCR檢測實驗室操作規范

一、PCR 實驗室的設置及管理

1．目的：建立實驗室的合理設置和科學管理，防止實驗污染，保證檢測結果的可靠性。2．適用范圍：本程序適用于分子診斷室的設置、工作流程和日常管理等。3．負責人： 4．細則：

4．1流感實驗室為急傳所的專業實驗室，從事臨床標本的基因擴增檢測及相關科研工作等。4．2 本實驗室采用實時熒光定量（定性）PCR 技術作為病毒基因診斷的主要手段，實驗室分為三個區：試劑準備區（第一區）、標本處理區（第二區）、擴增分析區（第三區）。每一工作區配備專用的設備、儀器、輔助設施、耗材、清潔用品、辦公用品、專用工作服，并有明顯的區分標識。標本的接收則在檢驗科標本接收處進行。

4．3 各工作區專用的儀器設備、辦公用品、工作服、實驗耗材和清潔用具等，不可混用。4．4 各工作區配置、功能和內務管理見各相關SOP 文件。

4．5 嚴格遵守從“試劑準備區→標本處理區→擴增分析區”的單一流向制度，不得逆向進入前一工作區。

4．6 非本實驗室工作人員，未經許可不得入內；進修、實習或其他科室人員因科研活動需要，進入實驗區域（試劑準備區、標本處理區、擴增分析區）需首先熟悉本程序的各項規定并嚴格遵守執行，在本實驗室人員監督指導下進行。4．7 實驗完畢后做好清潔消毒工作。

二、PCR 實驗室工作制度

1．目的 ：保持良好的工作環境，以確保檢測結果的可靠性，防止交叉污染，防止差錯、事故及糾紛的發生。

2．適用范圍：所有本實驗室人員。3．負責人： 4．細則： 4．1 本實驗室進行臨床基因擴增檢測及相關實驗工作，不得進行其它實驗操作。4．2 各區的用品不得混用。

4．3 在各區的實驗操作過程中，操作者必須戴手套和帽子，嚴格按照操作規程。4．4 試劑準備區只能進行試劑的貯存及配制等相關操作（見相關SOP 文件）。

4．5 標本處理區只能進行臨床標本的保存，核酸提取、保存及其加入至擴增反應管和測定RNA 時cDNA 的合成（見相關SOP 文件）。

4．6 擴增分析區只能進行DNA 或cDNA 的擴增、實時熒光PCR 擴增產物的分析（見相關SOP 文件）。

4．7 進行實驗時嚴格執行本實驗室的各項操作規程，及時做好各種操作記錄，力求準確、可靠。實驗完畢，做好清潔、整理及分析統計等工作。

4．8 室內儀器由專人負責，未經許可，不得隨意使用或挪用；愛護使用儀器，定期進行保養與維修。

4．9 愛護科室財產，注意安全；離開實驗室前應關好門窗，檢查水、電等。

三、PCR 實驗室內務管理制度

1．目的：保證實驗室日常內務管理及清潔工作順利進行。2．適用范圍：實驗室相關人員及相關清潔工人。3．負責人： 4．細則：

4．1 非本室工作人員未經允許不得進入實驗室。4．2 各區的用品不得混用。

4．3 實驗人員要有強烈的時間觀念，按時上下班，不遲到、早退。

4．4 進入實驗室的工作人員必須遵守實驗室的單一流向的規定，禁止逆向走動。

4．5 所有儀器（如PCR 擴增儀）須有專人負責，并有使用維護記錄；實驗人員必須熟悉儀器性能后方允許操作，并嚴格遵守操作規程。

4．6 所有試劑進購、配制、質檢、使用均要有記錄，未經允許不得隨意帶出本實驗室。4．7 每天了解儀器運轉情況及試劑使用情況，確保儀器整潔安全，試劑合格使用。4．8 各區的各種清潔消毒均應有記錄，工作衣消毒時注意各區應分開進行處理。4．9 注意保持實驗室衛生整潔，嚴禁在室內抽煙、吃零食，非實驗操作人員應盡量少入。4.10下班前檢查門、窗、水、電，節假日應指定人員負責檢查實驗室的儀器、設備。

四、PCR 實驗室人員的配置及管理

1．目的：保證實驗室有足夠數量的合格的具備開展該類實驗能力的實驗人員。2．適用范圍：適用于實驗室人員配置、管理、培訓及考核。3．負責人： 4．細則： 4．1 人員要求

4．1．1 本實驗室工作人員應為醫學檢驗專業或相關專業畢業，具有中級以上技術職稱或?？埔陨蠈W歷。

4．1．2 實驗室工作人員應參加衛生部或省臨檢中心舉辦的PCR 技術培訓，并取得合格證。4．1．3 對于新進入本室的人員，如尚未取得PCR 技術培訓合格證，應在實驗室有培訓合格證的上級技術人員的指導下進行實驗工作，實驗報告由有資格人員出具，并應在最短的時間內取得上崗培訓合格證。4．2 人員配置

4．2．1 實驗室應根據工作需要配備足夠的工作人員。4．2．2 各級技術人員履行相應的工作職責。4．3 人員培訓及考核

4．3．1 實驗室負責人或負責人指定人員參加每年衛生部PCR 室間質評總結會。

4．3．2 實驗室工作人員每1～2 年至少參加1 次PCR 技術的省級或國家級繼續教育項目，參加相關學術交流會議。

4．3．3 安排未取得上崗培訓合格證的工作人員在合適的時間內參加技術培訓。

4．3．4 科室不定期組織實驗室內部實驗人員學習、更新核酸擴增方面的相關知識，提升自身的理論學習水平。特別是在標本接收區采血、接收標本的人員，需定期對其進行有關核酸擴增技術，標本采集、保存、運輸等知識的培訓。一些科室的送檢標本由該科室的人員送到標本接收區，對這些臨床醫護人員也要定期進行有關核酸擴增技術，標本采集、保存、運輸等知識的培訓。

4．3．5 本實驗室工作人員每年進行考核一次,考核內容: a)日常工作質量 b)室內質控測評 c)室間質控測評 d)在抱怨處理中的表現

4．3．6 本實驗室工作人員實行嚴格獎懲制度,有下列表現者可受獎: a)工作質量高, 質控測評成績優秀者

b)有科研能力,并有一定數量和質量的論文發表 c)有獨創性工作成果,經鑒定認可者 d)受到有關部門或群眾嘉獎者 有下列情況者將受到懲處: a)工作質量問題較多，質控測評成績不合格； b)不遵守規章制度并造成一定影響； c)不求上進。

4．3．7 本實驗室工作人員獎懲方法分精神及物質兩類,經實驗室上報及有關部門批準后執行。

4．3．8 本實驗室工作人員均建立業績檔案,實行能進能出制度,不斷吸收高質量人員,加強培訓和提高,對于不適合本室工作的人員要及時調離。4．4 人員管理

4．4．1 實驗室建立所有工作人員的技術檔案，包括：學歷、任職資格、發表論文、研究成果、培訓等相關材料復印件。

4．4．2 技術檔案分文本檔案和電子檔案，文本檔案每年更新1 次，電子檔案隨時更新。

五、PCR 實驗室清潔程序

1．目的：保證實驗室環境的整潔，防止污染。

2．適用范圍：適于實驗室工作環境、實驗臺面、工作服、移液器等的清潔消毒工作。3．負責人： 操作人： 4．細則：

4．1 實驗室地面必須平整、干凈，通道要利于通行，沒有無用的物品阻礙。

4．2 合理規劃實驗室內物品，做到擺放整齊、有序，無用的或使用效率低的物品放置到儲存處，常用的物品要容易尋找到。

4．3 抽屜、柜子、文件類物品要作好標記，以方便識別。4．4 實驗結束后用2%戊二醛對臺面進行清潔，并用移動紫外燈進行消毒。

4．5 每天對使用過的移液器用75%酒精進行擦拭。每周1 次對移液器咀進行75%酒精浸泡15 分鐘左右，若使用過程中發生污染應隨時浸泡處理。

4．6 實驗過程中如發生標本或試劑外濺，應立即用2%戊二醛滴上，濾紙蓋上半小時，然后用酒精擦洗，并用移動紫外燈消毒。

4．7 每天實驗前開啟各區的通風系統，各區實驗結束后，分別打開傳遞窗紫外燈、移動紫外燈（對實驗臺面消毒）、天花板紫外燈消毒實驗室，每次開啟 30～60 分鐘。4．8 待紫外燈消毒時間足夠后，依次關閉各區紫外燈并記錄。

4．9 依次清潔三個區的實驗臺面和地面，各區清潔消毒工具均專用，不可混用，注意按照單一方向流程的原則來進行清潔。4．10 處理好各區廢棄物。

4．11 每周將工作服洗滌消毒，不同實驗區的工作服隔開洗滌。

六、PCR 標本唯一標識編號規則

1．目的：保證標本編號的唯一性，也是準確發放報告的基礎。

2．適用范圍：使用核酸擴增熒光檢測實驗室所開展的病毒以及基因檢測項目： 3．負責人： 操作人： 4．程序：

4．1 按檢測日期分類標記

根據標本送檢的日期，每天的標本對應標記一種唯一的代號。4．2 按檢測類型分類標記

根據檢測項目的不同，每種檢測項目對應標記一種唯一的代號。4．3 按驗單接收順序編號

在同種檢測類型的驗單中，按驗單順序編號。4．4 特殊標本的編號

如有特殊情況，應在標記前面增加特異字母區別開。4．5 編號步驟 a）對當天送來的標本，根據編號的基本原則編號，每個樣本的每個檢測項目對應一個唯一的編號。

b）用筆在每張檢驗申請單和對應的樣品管上作好相同的標記。

c）做好標本的接收記錄，每個樣本的記錄都應包括以下信息：接收時間、醫院、科室、送檢醫生、患者姓名、性別、年齡、標本類別、標本狀態、送標本者、接收人、檢驗單號、標本唯一統編號等。

d）處理好樣品、點樣后，將反應管放入擴增儀上開始擴增。

f）擴增得到結果后，先在統計簿上填入結果，作好記錄，再一一把實驗結果填入相應申請單。

g）發放檢驗報告單。

七、PCR 基因擴增實驗室的要求

1．目的：規定在各區內所進行的工作及其操作。2．適用范圍：所有在本區內進行的工作。3．負責人： 操作人： 4．程序：

一、臨床基因擴增檢驗實驗室的設計

（一）臨床基因擴增檢驗實驗室區域設計原則。原則上臨床基因擴增檢驗實驗室應當設置以下區域：試劑儲存和準備區、標本制備區、擴增區、擴增產物分析區。這4個區域在物理空間上必須是完全相互獨立的，各區域無論是在空間上還是在使用中，應當始終處于完全的分隔狀態，不能有空氣的直接相通。根據使用儀器的功能，區域可適當合并。例如使用實時熒光PCR儀，擴增區、擴增產物分析區可合并；采用樣本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，則標本制備區、擴增區、擴增產物分析區可合并。各區的功能是：

1.試劑儲存和準備區：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應混合液的準備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。

2.標本制備區：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴增反應管。對于涉及臨床樣本的操作，應符合生物安全二級實驗室防護設備、個人防護和操作規范的要求。

3.擴增區：cDNA合成、DNA擴增及檢測。

4.擴增產物分析區：擴增片段的進一步分析測定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。

（二）臨床基因擴增檢驗實驗室的空氣流向。臨床基因擴增檢驗實驗室的空氣流向可按照試劑儲存和準備區→標本制備區→擴增區→擴增產物分析區進行，防止擴增產物順空氣氣流進入擴增前的區域。可按照從試劑儲存和準備區→標本制備區→擴增區→擴增產物分析區方向空氣壓力遞減的方式進行。可通過安裝排風扇、負壓排風裝置或其他可行的方式實現。

（三）工作區域儀器設備配置標準。

1.試劑儲存和準備區。

（1）2～8℃和-20℃以下冰箱。

（2）混勻器。

（3）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl）。

（4）可移動紫外燈（近工作臺面）。

（5）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭。

（6）專用工作服和工作鞋(套)。

（7）專用辦公用品。

2.標本制備區。

（1）2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱。

（2）高速離心機。

（3）混勻器。

（4）水浴箱或加熱模塊。

（5）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl）。

（6）可移動紫外燈（近工作臺面）。

（7）生物安全柜。

（8）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）。

（9）專用工作服和工作鞋(套)。

（10）專用辦公用品。

（11）如需處理大分子DNA，應當具有超聲波水浴儀。

3.擴增區。

（1）核酸擴增儀。

（2）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl），（視情況定）。

（3）可移動紫外燈（近工作臺面）。

（4）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）。

（5）專用工作服和工作鞋。

（6）專用辦公用品。

4.擴增產物分析區。

視檢驗方法不同而定，基本配置如下：

（1）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl）。

（2）可移動紫外燈（近工作臺面）。

（3）消耗品：一次性手套、加樣器吸頭（帶濾芯）。

（4）專用工作服和工作鞋。

（5）專用辦公用品。

上述各區域儀器設備配備為基本配備，實驗室應當根據自己使用的擴增檢測技術或試劑的特點，對儀器設備進行必要的增減。

二、臨床基因擴增檢驗實驗室工作基本原則

(一)進入各工作區域應當嚴格按照單一方向進行，即試劑儲存和準備區→標本制備區→擴增區→ 擴增產物分析區。

(二)各工作區域必須有明確的標記，不同工作區域內的設備、物品不得混用。

(三)不同的工作區域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區域時，不得將工作服帶出。

(四)實驗室的清潔應當按試劑貯存和準備區→標本制備區→擴增區→擴增產物分析區的方向進行。不同的實驗區域應當有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

(五)工作結束后，必須立即對工作區進行清潔。工作區的實驗臺表面應當可耐受諸如次氯酸鈉的化學物質的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應當方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關鍵，因此可使用可移動紫外燈（254nm波長），在工作完成后調至實驗臺上60～90cm內照射。由于擴增產物僅幾百或幾十堿基對（bp），對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間，最好是照射過夜。

(六)實驗室的安全工作制度或安全標準操作程序，所有操作符合《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。

三、臨床基因擴增檢驗實驗室各區域工作注意事項

(一)試劑儲存和準備區。貯存試劑和用于標本制備的消耗品等材料應當直接運送至試劑貯存和準備區，不能經過擴增檢測區，試劑盒中的陽性對照品及質控品不應當保存在該區，應當保存在標本處理區。

(二)標本制備區。由于在樣本混合、核酸純化過程中可能會發生氣溶膠所致的污染，可通過在本區內設立正壓條件，避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應混合液的反應管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須在生物安全柜內開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。

(三)擴增區。為避免氣溶膠所致的污染，應當盡量減少在本區內的走動。必須注意的是，所有經過檢測的反應管不得在此區域打開。

(四)擴增產物分析區。核酸擴增后產物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板或芯片上探針雜交方法（放射性核素標記或非放射性核素標記）、直接或酶切后瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉移、核酸測序方法、質譜分析等。本區是最主要的擴增產物污染來源，因此必須注意避免通過本區的物品及工作服將擴增產物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴增產物時，必須使用洗板機洗板，廢液必須收集至1 mol/L HCl中，并且不能在實驗室內傾倒，而應當至遠離PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1 mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。

由于本區有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，故應當注意實驗人員的安全防護。

八、PCR 廢棄物的處理程序

1．目的：保證實驗室、實驗人員和外部環境的安全。

2．適用范圍：核酸擴增熒光檢測實驗室常用化學試劑（NaOH、EDTA、乙醇、生理鹽水等）、實驗室廢棄物的處理； 3．負責人： 操作人： 4．細則：

4.1 科室職責應對本室工作人員講明本程序在預防交叉、實驗室污染及切斷傳播途徑中的重 要性，并要求嚴格執行。

4.2 實驗室所有垃圾，裝入專用污物袋內，各區備有：生活垃圾袋（黑色）及生物污染垃圾 袋（黃色）。使用過的一次性消耗品(如試管、吸頭、離心管、等)，先放入10%次氯酸鈉溶 液中浸泡2～4 小時后，再放入黃色垃圾袋內，使用過的手套、鞋套等直接放入黃色垃圾袋 內集中處理。

4.3 夾取標本的工具，如鉗、鑷、接種環、吸管等，用后均應消毒清潔，進行微生物檢驗時，應重新滅菌，金屬工具可燒灼滅菌或消毒液浸泡；玻璃制品干熱或壓力蒸汽滅菌。4.4 一次性塑料痰盂，用2%戊二醛液浸泡2～4小時后，放入黃色垃圾袋內集中處理。4.5 廢棄標本如血、尿、胸水、腹水、腦脊液、唾液、胃液、腸液、關節腔液等用10%的84 液浸泡2～4小時后，集中處理。

4.6 盛標本的容器，若為一次性使用的紙質容器及其外面包被的廢紙，放入污物袋里 處理；對可再次使用的玻璃、塑料或搪瓷容器，煮沸15 分鐘或加入10%次氯酸鈉溶液浸泡2～4 小時，消毒液每日更換，消毒后用洗滌劑及流水刷洗，瀝干，用于微生物培養采樣者，用壓力蒸汽滅菌后備用。

4.7 廢棄標本及其容器裝入黃色垃圾袋內、封閉，污物處理中心處理。

九、基因擴增檢測實驗及結果分析

1、目的：保證擴增及結果分析的標準化、規范化。2．適用范圍：適用于本室使用的普通離心機。3．負責人： 操作人：

4、標準程序：

4.2.8 發放報告：及時登記檢測結果記錄，發放臨床報告。

4.3 實驗結果無效的判斷標準：出現下述四種情況中的任何一種或多種，當次實驗結果不可 發，查找原因，重做實驗。4.3.1 陰性對照出現擴增。4.3.2 陽性對照無擴增。

4.3.3 大批甚至所有的標本都擴增了。4.3.4 室內質控血清檢測結果出現失控情況，實驗失控的具體標準詳見室內質控標準操作程 序。

4.4 實驗結果有效的判斷標準：達到下列要求后，當次實驗有效，可以發放結果。4.4.1 陰性對照沒有擴增，陽性對照擴增。

4.4.2 陽性標準品梯度曲線平滑均勻，斜率、截距和相關系數三個參數的數值均在范圍內。4.4.3 室內質控血清檢測結果處于在控狀態，具體標準詳見

十、臨床標本的保存操作程序

1．目的：臨床標本正確保存，以便必要時復查。2．適用范圍：分子診斷室的所有臨床檢測標本。3．負責人： 操作人： 4．程序：

4．1 處理前的標本保存

a）全血標本可4℃下短期（24h 內）保存，長期保存則需分離出血清（血漿），保存于-20℃下。

b）咽拭子、痰或胸腹水、腦脊液、膿液標本短保存于-70℃下。4．2 報告發出后的標本保存：

a）提取的核酸標本當天檢測可置4℃保存，如當天不檢測應置-20℃保存。報告發出后第二天丟棄。

b）原始血清/血漿樣本在報告發出后放入低溫冰箱-20℃保存1 個星期，以備復查。超過1 個星期保存期的標本由室負責人酌情處理，一般按生物傳染性物品統一處理。

c）血清/血漿標本放置低溫冰箱保存時須有記錄，按編號順序存放，并由專人負責管理。4．3 特殊標本的處理：

對暫不檢測的項目和規定時間外收到的零散樣本，要隨時登記和交班，以免漏檢，遺失和延誤檢驗。對特殊樣本或特殊病人的樣本，實行“首接”負責制，所謂特殊樣本是指難于采集的樣本，以及特殊病人的樣本一律實行“首接”負責制，無論那位工作人員，一旦收到樣本后，均須負其責任，不得以任何借口推托，及時和正確保管和轉送樣本到有關實驗室或有關人員，同時作交班記錄和雙簽名。

十一、臨床標本的采集、運送、接收程序

1．目的：規范臨床待檢標本的正確采集、送檢和處理。2．適用范圍：分子診斷室的所有臨床檢測標本。3．負責人： 操作人： 4．程序： 4．1 標本的采集

4．1．1 標本由臨床各科室接受過臨床基因擴增檢測有關標本采集、保存、運輸知識培訓的醫護人員采集并送至實驗室。4．1．2 標本采集要求

a）血液標本：用2ml 真空采集管或1.5ml 高壓滅菌離心管采集血液標本，血標本采集后在2 小時內送達實驗室。離心（檢驗單與標本一道）后用一次性吸管吸取血清或血漿加入經消毒的1.5ml 的離心管中，編號。

b）痰標本：用帶蓋的無菌一次性塑料瓶收集清晨第一口痰標本送檢。（對于無痰或少痰的患者，可用45℃加溫的100g/L NaCl 水溶液霧化吸入或改變體位以使痰液易于咳出；對于小兒可以輕壓胸骨柄上方以誘導咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集標本。）標本在室溫下保存不能超過24 小時。4．2 標本的運送

標本采集后，密閉、標（貼）姓名，應盡可能快的送至檢測實驗室，如運送時間需2 小時以上，必須用冰盒送至實驗室。4．5 接收

4．5．1 嚴格對各類樣本的查對和雙簽制度，對病房各樣本及時進行驗收，查對，不符合要求的樣本一律退回，并有書面記錄。

十二、PCR 生物安全防護措施

1．目的：預防工作人員在實驗過程中被感染或污染。2．適用范圍：適用于本室所有工作人員。3．負責人： 操作人： 4．細則： 4．1 實驗人員在實施生物防護措施時，應嚴格遵守各項相應的規章制度，建立起強烈的生物防護意識。

4．2 每天更換廢液缸的2%戊二醛溶液，并保證2%戊二醛溶液用量為廢液缸內總液量的五分之一左右。

配置消毒液時，正確量取足量的消毒劑（用量杯，保證濃度），水的用量也要正確，缸體密封性良好。

4．3 實驗臺面日常清潔時使用75%的酒精擦拭。

4．4 每區每次實驗后紫外燈照射30～60 分鐘，如有需要可延長照射時間。

4．5 所有來自病人的血液或體液標本均應視作傳染源，因此在標本的采集、運輸過程中，標本容器應完好無泄漏。

4．6 處理標本時應穿工作服、戴手套，以免沾上皮膚。如手或其它部位的皮膚沾上血液或體液標本以及試劑，應立即沖洗干凈。有下列情況之一者，需另外消毒：手接觸有傳染性的微生物，水龍頭、水池肥皂可能被污染，工作服可能被大量細菌污染。消毒劑可用“84”消毒液。4．7 在實驗過程中，病人標本（血液、體液）或試劑不慎濺入眼內應立即用清水洗。4．8 實驗過程中在使用針具等銳器時，盡量小心防止受傷。若被銳器刺破時，應立即脫下手套，盡量擠壓傷處，使血流出，然后用碘酒、酒精消毒，必要時進行預防補救措施。4．9 在實驗過程中病人標本（血液、體液）外漏時，應立即用2%戊二醛滴上，濾紙或紗布蓋上半小時，然后用酒精擦洗，并用紫外燈消毒。

4．10 實驗完畢離開時，應脫下所有該實驗區個人防護裝備。4．11 實驗完畢后應對實驗室進行紫外消毒。

4．12 遇有意外事故應立即報告科室負責人，當事人應立即注射相關疫苗或進行預防性治療，并進行醫學觀察，嚴重者應報告技術負責人。

十三、PCR 實驗室化學試劑配制程序

1．目的：保證實驗中用到的各種溶液符合實驗要求。

2．適用范圍：核酸擴增熒光檢測實驗室常用溶液：4%NaOH 溶液、75%酒精、消毒劑（三氯異氰尿酸或 二氯異氰尿酸鈉）、2%戊二醛溶液等。3．負責人： 操作人： 4．程序： 4．4 化學試劑的配制：

4．4．1 用具：干燥潔凈的250ml 量桶一只，1000ml 量桶一只，1000ml 燒杯一只，三角燒瓶兩只，天平一架，100ml 塑料試劑瓶、2000ml 廣口瓶各一只。4．4．2 配制步驟：

4．4．2．1 配制4%NaOH 溶液: a）用天平稱取4 克分析純的NaOH 固體，置于一只三角燒瓶中。

b）用250ml 量桶準確取100ml 水，緩緩注入盛放NaOH 固體的三角燒瓶中。c）搖蕩三角燒瓶使NaOH 固體充分溶解。

d）然后緩緩傾倒入100ml 塑料試劑瓶中密封保存備用。4．4．2．2 配制消毒劑: a）一般桌面、器具和地面的消毒只要使有效氯達到500mg/L，即可達到消毒作用。

b）消毒劑為粉狀（20 克/袋），如配制一升的消毒劑溶液，則取500g，倒入燒杯中，緩緩加入1000ml水充分溶解，備用。

c）如需加大消毒力度，則有效氯濃度加大。4．4．2．3 配制2%戊二醛溶液: a）準確量取戊二醛原液20ml 倒入1000ml 燒杯中。

b）量取980ml 水，緩緩倒入1000ml 燒杯中，混勻，加至2000ml 廣口瓶中備用。注意事項：每份配制好的溶液保質期為14 天

十四、PCR 應急處理程序

1．目的：在實際工作中，儀器設備發生故障、試劑盒發生質量問題時，為保證檢驗結果的準確性、及時，應正確采取應急措施，最大程度上避免或減輕不利影響。

2．適用范圍：適用于滿足核酸擴增熒光檢測實驗室檢測需要并可能對檢驗結果造成誤差的儀器設備和試劑盒。3．負責人： 4．細則： 4．1 核酸擴增熒光檢測實驗室工作人員在職責范圍內均有責任熟悉各種儀器和相關設備的性能、要求、維護和保養、常見故障的排除、尤其要嚴格按照操作規程操作。

4．2 工作人員在職責范圍內均有責任有意識地注意以求及時發現并報告儀器設備和試劑盒的異常情況。

4．3 作為應急處理，潛在著一定的可能影響檢測質量的不確定因素。室負責人負責在第一時間檢查核實應急措施的有效性。4．4 儀器設備故障

4．4．1 室負責人接到異常情況報警后，立即現場確認異常情況的性質：觀察有誤、誤操作、偶發現象或確屬不能立即排除的故障。

4．4．2 用紅牌故障標志標示故障儀器，以防被錯誤使用。

4．4．3 有滿足要求的替用設備的，啟用替用設備（準用儀器）。借用其他部門儀器設備時，及時聯系借用并核實該設備的使用狀態。替用、借用或備用設備的使用在滿足質量要求的同時，必須同時滿足實驗室管理措施（特別是防污染）的要求。

4．4．4 不能解決的問題，應及時與供應方會同解決。根據雙方合同約定，及時通知供應方。供應方技術支持人員將在規定的時間內隨身攜帶備用設備到達現場。

4．4．5 儀器維修后，必須經驗收合格并供需雙方簽字，調試實驗通過后才能重新啟用。取下紅色故障標示（暫停使用），換上藍色正常標示（正常使用）。4．4．6 科室主任須檢查并隨時跟蹤所采取措施的有效性。

4．4．7 對未能及時排除故障時，必須及時上報科室，在科主任批準下，應積極聯系附近的其他已得到衛生部臨檢中心認證的臨床基因擴增檢驗實驗室檢驗，以滿足病人和臨床或科研需求。

4．5 試劑盒質量發生問題，經核實后，及時通知供貨商迅速更換另一批次試劑，使用前需先作質量檢測，合格后方可使用。

4．6 儀器設備故障或試劑質量問題不能得到解決，預期將會影響到檢測報告的及時發出，可將標本送至其它已得到衛生部臨檢中心認證的臨床基因擴增檢驗實驗室檢。4．7 影響到檢測報告發出的情況，應在應急處理記錄表作記錄。

十五、試劑的質檢標準操作程序 1．目的：保證每批用于臨床實驗的試劑的質量良好，符合要求。2．適用范圍：各種用于臨床實驗的核酸擴增熒光檢測試劑。3．負責人： 操作人： 4．程序：

4．1 收到試劑后，目測試劑是否處在凍存狀態。

4．2 核對試劑品種和數量并檢查包裝：外包裝（廠名廠址、、批準文號、批號和有效期等）；內包裝（試劑瓶完整性、試劑配備品種完整性、使用說明書有否等）。4．3 及時將試劑轉入－20℃冰箱保存。將上述檢測核對情況在記錄本上登記。

4．4 最遲在前批次試劑存量尚可維持常規實驗一周時，按如下要求對新批號試劑進行效驗實驗。

4．5 效驗實驗：

4．5．1 要求設置：空白對照、陰性對照、陽性對照、室內質控各一，陽性標準品梯度（104、105、106、108）。

4．5．2 出現如下情況中任何一種的，判斷為試劑不合格，不能用于臨床檢測： a）空白對照出現擴增。如擴增曲線CT 值大于25，需重復實驗確證試劑污染。

b）陽性對照和陽性標準品均未檢出，或陽性對照未檢出而陽性標準品檢出率大幅下降，表示試劑失效或檢測靈敏度大幅下降。

4．5．3 陽性對照未檢出，陽性標準品檢測正常，提示樣品提取液可能存在問題。重復新舊提取液陽性對照實驗，確定提取液失效問題。更換提取液后該批試劑方可使用。

4．5．4 空白對照無擴增，陰性對照有擴增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。單獨用提取液點樣上機，出現擴增，需更換提取液后方可使用該批試劑。

4．5．5 陽性對照檢出，陽性標準品未檢出或擴增曲線明顯系統性CT 值偏大5 個循環以上。提示陽性標準品存在問題。更換陽性標準品后該批試劑方可投入使用。

4．5．6 空白對照、陰性對照無擴增，陽性對照正常檢出，陽性標準品導出的標準曲線之斜率（－2.9～－3.9）、截距（26～34）、相關性（﹤－0.99）均在使用范圍內，表明該批試劑良好，可以投入臨床使用。4．6 將實驗結果歸入記錄。

十六、離心機操作維護程序

1．目的：保證離心機的正常使用。

2．適用范圍：適用于本室使用的普通離心機。3．負責人： 操作人： 4.性能參數:見說明書。5．程序：

5．1 離心機應放置在水平堅固的地板或平臺上，并力求使儀器處于水平位置以免離心時造成儀器振蕩。

5．2 打開電源開關，將預先平衡好的樣品對稱放置于轉頭的樣品架上，關閉機蓋。5．3 旋動定時旋鈕設定離心時間，緩慢旋轉轉速調節旋鈕使儀器轉速達到預定要求。5．4 離心完畢后，將轉速調節旋鈕調回零位，關閉電源開關。

5．5 待離心機完全停止轉動時打開機蓋，取出離心樣品，再次關閉機蓋結束離心。5．6 離心室的清潔：為了避免樣本等殘留物的污染，應經常對離心機外殼和離心室進行清潔處理。對離心室清潔，應先打開離心機蓋，撥掉電源線，用專用設備將離心機轉子旋下，再用中性去污劑（70%的異丙醇/水混合物或乙醇去污染）清潔離心室；離心室內的橡膠密封圈經去污劑處理后，用水沖洗，再用甘油潤滑。

5．7 轉子的清潔：轉子會被樣本殘留物污染，也可能會被某些化學試劑腐蝕，因此應對轉子每月進行清潔維護。每月用中性的清潔劑清潔轉子一次，并在儀器維護記錄本上作好記錄，以延長轉子的壽命。6.儀器維護

(1)為確保安全和離心效果,儀器必須放置在堅固水平的臺面上,塑料蓋門上不得放置任何物品,樣品必須對稱放置,并在開機前確保已擰緊螺母。

(2)應經常檢查轉頭及試驗用的離心管是否有裂紋,老化等現象,如有須及時更換.(3)試驗完畢后,需將儀器擦拭干凈,以防腐蝕.(4)如樣品比重超過1.2g/cm3,最高轉速n 按下式計算:n=nmax*√--1.2/樣呂比重.(5)當電機碳刷長度小于6mm 時,必須及時更換.(6)在離心機未停穩時不得開蓋.(7)儀器必須有可靠接地.(8)實驗結束后,請關閉后面的電源開關,撥掉電源插頭時,請不要忘了打開后面的電源開關.(9)該儀器在日常使用中請注意符合“5.6,5.7”要求。(10)嚴格按照儀器的開關機程序關機。7.期間核查

(1)本儀器不需要特別的周期間隔。

(2)校準物均為與ICSH 之標準相符合的校準物，測定值偏差均不超過其規定值。

十七、冰箱操作維護規程

1．目的：對冰箱進行適當的維護，以確保冰箱的正常使用。2．適用范圍：本實驗室使用的各種品牌、型號的冰箱。3．負責人： 操作人： 4.性能參數:見說明書。5．程序：

4．1 開、關機：冰箱按說明書要求放好后，插上電源線，冷藏室溫度開關置于4℃，冷凍室溫度開關置于-20℃，2 小時后用溫度計確認。系統進入正常運行狀態后即可使用。4．2 外冰箱應放置于水平地面并留有一定的散熱空間。外接電源電壓必須匹配，并要求有良好的接地線。

4．3 冰箱內禁止存放與本實驗室無關的物品。

4．4 放入冰箱內的所有試劑、樣品、質控品等必須密封保存。

4．5 保持冰箱出水口通暢；非自動除霜冰箱應在每月底除霜；月底清潔冰箱，清潔時切斷電源，用軟布蘸水擦拭冰箱內外，必要時可用中性洗滌劑。4．6 每日觀察冰箱內溫度并記錄于冰箱的質控圖上。

4．7 若溫度超出規定范圍，調節溫控使其回到正常范圍，并進行記錄。

4．8 若溫控調節無效，報請設備科維修，修理后須驗收合格并簽字后方能正常使用。6.儀器維護

(1)使用注意。該儀器在日常使用中請注意符合“4.注意事項”要求

(2)廢液瓶滿要及時倒掉廢液，切勿強行扯動紅黃兩根管來打開瓶蓋，檢查廢液瓶是否漏氣，防止低真空出現。

(3)當出現堵孔時，按自動沖洗鍵沖洗管道。(4)嚴格按照儀器的關機程序關機。7.期間核查

(1 冰箱不需要特別的周期間隔。

(2)校準物均為與ICSH 之標準相符合的校準物，測定值偏差均不超過其規定值。

十八、生物安全柜操作維護規程

1．目的：正確使用生物安全柜。

2．適用范圍：本SOP 適用于本實驗室使用的生物安全柜。3．負責人： 操作人： 4.性能參數:見說明書。5．程序：

5．1 新安裝或長期未使用的生物安全柜，使用前必須用超凈真空吸塵器或不產生纖維的物品認真進行清潔工作。

5．2 接通電源，使用前應提前15～30 分鐘同時開啟紫外燈和風機組工作。

5．3 當需要調節風機風速時，用生物安全柜操作面板上的風速調節鈕進行調節。風機、照明均由指示燈指示其工作狀態。

5．4 工作臺面上禁止存放不必要的物品，以保持工作區的潔凈氣流不受干擾。

5．5 禁止在工作臺面上記錄書寫，工作時應盡量避免作明顯擾動氣流的動作；禁止在預過濾進風口部位放置物品，以免擋住進風口造成進風量減少，降低凈化能力。

5．6 使用結束后，用消毒液清理工作臺面后打開紫外燈，15～30 分鐘后關閉紫外燈，關閉生物安全柜電源。每次使用生物安全柜后，均需對其進行清潔。

5．7 根據環境潔凈程度，定期將預過濾器中的濾料拆下清洗，一般間隔時間為3～6 個月。5．8 定期（一般每半年1 次）計測工作區風速，如發現不符合技術參數要求，則可調大風機供電電壓。當風機組電壓調到最大時，工作區風速仍達不到0.3m/s，則必須更換高效空氣過濾器（由廠家或院儀器維修人員進行）。

4．9 有相應的維護記錄，長期不使用的生物安全柜撥下電源插頭。6.儀器維護

(1)使用注意。該儀器在日常使用中請注意符合“4.注意事項”要求(2)廢液瓶滿要及時倒掉廢液，切勿強行扯動紅黃兩根管來打開瓶蓋，檢查廢液瓶是否漏氣，防止低真空出現。

(3)當出現堵孔時，按自動沖洗鍵沖洗管道。(4)嚴格按照儀器的關機程序關機。7.期間核查

(1)PE-5700 基因擴增儀的定標不需要特別的周期間隔，本實驗室PE-5700 基因擴增儀執行衛生部臨床檢驗中心的指定校準。

(2)校準物均為與ICSH 之標準相符合的校準物，測定值偏差均不超過其規定值。

十九、移液器操作維護規程

1．目的：確保移液的精確性，正確使用移液器。2．適用范圍：本實驗室使用的可調式移液器。3．負責人： 操作人： 4．程序： 4．1 移液器的使用

4．1．1 轉動旋鈕設定移液量，設定的移液量不可超出該移液器規定的范圍。4．1．2 裝上配套的Tip。4．1．3 前進移液法

a）將按鈕壓至第一停點位置；

b）將移液管管嘴浸入液面下2~3mm 深處，然后慢慢松開按鈕吸入液體。待移入管嘴吸滿液體后，將管嘴撤出液面，擦掉管嘴外側的所有液滴。

c）輕輕壓下操作按鈕至第一停點位置，放出液體。約1 秒鐘后，繼續將操作按鈕向下壓至第二停點位置。待管嘴液體放干凈后，將管嘴貼在容器瓶壁上防止形成液滴滴入瓶中，撤出管嘴。

d）松開按鈕使之回到起點位置。需要時，可更換管嘴繼續移液操作。4．1．4 倒退移液法：適用于高粘度液體及/或易起泡沫液體的移液。a）將操作按鈕向下壓至第二停點位置。

b）將移液管管嘴浸入試劑瓶液面下2~3mm 深處，然后慢慢松開鈕吸入液體。待移入管嘴吸滿液體后，將管嘴撤出液面，擦掉管嘴外側的所有液滴。c）輕輕壓下操作按鈕至第一停點位置，放出液體。

d）遺留在管嘴時的液體或者隨管嘴一起扔掉，或者放回原來的容器中。4．1．5 重復操作法：重復操作移液法可以快速、簡便地重復轉移同體積的同種液體。a）將操作按鈕向下壓至第二停點位置。

b）將移液管管嘴浸入液面下2~3mm 深處，然后慢慢松開按鈕吸入液體。待移入管嘴吸滿液體后，將管嘴貼在容器瓶壁上防止形成液滴滴入瓶中。

c）輕輕壓下操作按鈕至第一停點位置，放出液體。待放完所需體積液體后，把按鈕停在第一停點位置，不包括在移液量之內的少量液體仍留在管嘴內，管嘴外的液滴則需包括在移液量之內。

d）將管嘴浸入試劑液面下不遠處，然后慢慢松開按鈕使管嘴重新吸入液體。(3)e）重復步序c）和d）繼續移液操作，就可重復轉移相同體積液體。4．2 移液器的維護

每天對使用過的移液器用75%酒精進行擦拭。每周1 次對移液器咀進行75%酒精浸泡15 分鐘左右，若使用過程中發生污染應隨時浸泡處理。4．3 移液器的校準

為確保移液器加樣的精確性和準確性，正確使用移液器，需定期（一年）對移液器進行校準 4．3．1 校準環境和用具要求室溫：20～25℃，測定中波動范圍不大于±0.5℃。

電子天平：放置于無塵和震動影響的臺面上，房間盡可能有空調。稱量時，為保證天平內的濕度（相對濕度60～90%），天平內應放置一裝有10mL 蒸餾水的小燒杯。

小燒杯：5～10mL 體積。測定液體：溫度為20～25℃的去氣雙蒸水。選定校準體積： a）擬校準體積；

b）移液器標定體積的中間體積。

c）最小可調體積（不小于擬定體積的10%）。如為固定體積移液器，則只有一種校準體積。4．3．2 校準步驟

a）將移液器調至擬校準體積，選擇合適的吸頭； b）調節好天平；

c）來回吸吹蒸餾水3 次，以使吸頭濕潤，用紗布拭干吸頭；

d）垂直握住移液器，將吸頭浸入液面2～3mm，緩慢（1～3 秒）一致地吸取蒸餾水 e）將吸頭離開液面，靠在管壁，去掉吸頭外部的液體；

f）將移液器以30℃角放入稱量燒杯中，緩慢一致地將移液器壓至第一檔，等待1～3 秒，再壓至第二檔，使吸頭里的液體完全排出； g）記錄稱量值； h）擦干吸頭外面； i）按上步驟稱量10 次； j）取10 次測量值的均值作為最后移液器吸取的蒸餾水重量，按表1 所列蒸餾水Z 因子計算體積；

k）按校準結果調節移液器。4．3．3 比較校準法

利用經計量局校準并頒發校準報告之同型號移液器，在移液器量程范圍的高低兩個檔各選擇一個校準點

(4)用電子天平稱量結果與已校準移液器稱量結果進行比較，完成校準。

參考文件：

1.衛生部辦公廳關于印發《醫療機構臨床基因擴增管理辦法》的通知 2.衛生部檢驗中心《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》 3.《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。

4.ISO15189 質量管理體系范本文件（第六冊）