第一篇：PCR經驗總結

PCR經驗總結

實驗注意事項：

（1）DNA處理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有緩沖液吸頭、離心管等用前必須高溫高壓處理，常規消耗用品用后作一次性處理，避免反復使用造成污染。

（2）PCR操作應戴手套并勤于更換，必要時應戴好帽子和口罩，就像做手術一樣，要有“無菌觀念”。

（3）成套試劑，小量分裝，專一保存，防止它用。配制試劑用新器具，用后作一次性處理。（4）試劑管用前先瞬時離心（10s），使液體沉于管底，減少污染手套與加樣器機會。（5）最后加模板DNA，馬上蓋好，混勻，瞬時離心（10s），使水相與有機相分開。加入模板且忌噴霧污染，所有非即用管都應蓋嚴。加模板DNA后應更換手套。（6）實驗設陽性、陰性對照。

還有諸如：移液槍用完要放到最大計量位置，防止久了彈簧失靈；防止RNA酶污染標本；低溫下操作，防降解；試劑有致癌致畸作用，做好個人防護；頭腦中各操作步驟要清楚，不要加錯試劑。

問題及解決方案匯總：

一、假陰性，擴增無條帶

PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及活性 ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

二、假陽性

出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或 器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR來減輕或消除。

三、出現非特異擴增帶

PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設計引物。②減低酶量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。④適當提高退火溫度或采用兩步法。

四、出現片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：①減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環次數。

五、出現大量引物二聚體

1.從引物自身著手，重新設計引物，這是最根本解決這一問題的辦法； 2.可能模板有問題；

3.模板濃度過小，適當加大模板量；

4.Taq酶，引物，Mg2+濃度可能過高，可降低它們的濃度；

5.取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘，然后迅速拿出置于冰上瞬時冷卻，這時再加入反應體系當中，引物二聚體就會消失的；

6.所配Mix中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增強特異性；

7.PCR反應體系的配制在冰上進行，最后加Taq酶，PCR結束后，產物勿放置在室溫下過長時間，有人認為室溫下有些Taq酶會將多余的引物合成為二聚體。

8.增加循環數；

9.降低退火溫度后有條帶，則應逐漸提高溫度，若提高溫度的同時產物量減少，則考慮增加鎂離子濃度（根據擴增片斷長度而定，片段長則相應鎂離子濃度應該高一些）；

10.若降低退火溫度，發現還是只有引物二聚體，而且鎂離子的濃度在20-25mM沒有區別，則考慮Buffer等試劑沒有完全融解、混勻，導致吸取的試劑濃度不對。11.以上次的PCR產物作模板二次PCR，可以提高引物與模板的特異性，減少引物二聚體，如果兩次時間間隔短的話，可以把原產物稀釋100－1000倍，如果間隔較長可以稀釋50－100倍；

六、高GC與復雜結構的模板處理

將模板置于95℃水浴鍋中處理10分鐘以上，然后置于冰上瞬時冷卻，可大大降低二級結構對PCR的影響。

七、長片段與短片段拼接失敗（定點突變）

在做定點突變時，倘若突變位點距離基因的某一側較近（短片段<200bp）時，通常拼接困難或者難以通過電泳結果直觀判斷是否拼接成功。此時，可在短片段的上方（突變近5’端）或下方（突變近3’端）選取一條載體通用引物與基因另一條引物PCR（控制產物大小>300bp），然后再做基因拼接。確認大小無誤后，再以此產物為模板，用基因首尾引物PCR即可。

八、Long PCR無條帶

對于>5Kb片段擴增，常規PCR很難得到較好的條帶，建議①更換更適合于Long PCR的聚合酶；②添加PCR Enhancer調整體系；③設計多對引物分段擴增。

PCR增強劑（PCR Enhancer）：

常見的添加劑有：DMSO，甘油，甲酰胺，硫酸銨，甜菜堿，BSA等，它們對PCR反應的影響雖然有所不同，但都可提高PCR的擴增效率。

1.DMSO：解除模板DNA局部二級結構，增加引物與模板的特異性結合，使聚合酶更容易在二級結構處延伸，但是對酶活有抑制作用，且當其濃度大于10％時還會降低保真性。

2.甘油：可降低模板溶解溫度（Tm），提高產量，但是對酶活有抑制作用。3.甲酰胺：促進某些“引物－模板”退火，降低帶有二級結構的DNA的變性溫度。4.硫酸銨：增加反應體系的離子強度，改變DNA的變性及退火溫度，調節酶活。5.甜菜堿：有利于DNA雙鏈的解開，Polymerase的結合，提高PCR的效率。

第二篇：PCR個人經驗總結

PCR經驗總結

1.primers design

這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件

a 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產量。

b GC% 40%-60% c 5'端和中間序列要多GC,以增加穩定性

d 避免3'端GC rich, 最后3個BASE不要有GC,或者最后5個有3個不要是GC e.避免3'端的互補, 否則容易造成DIMER f.避免3'端的錯配

g.避免內部形成二級結構

h.附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時不需要加上這些序列,但在檢測互補 和二級結構是要加上它們

i.需要使用兼并引物時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1uM-3uM)j.最好學會使用一種design software.PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.* 引物的另一個重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的 Tm低5℃。

設定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。有的是根據GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。

根據所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。

為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環，然后在根據較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。2.stability of primers

定制引物的標準純度對于大多數PCR應用是足夠的。引物產量受合成化學的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因為水的pH經常偏酸，會引起寡核苷的水解。引物的穩定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存 2個月。3.optimize reactants concentration a.magnesiom ions Mg離子的作用主要是 dNTP-Mg 與核酸骨架相互作用，并能影響Polymerase的活性。一般 的情況下 Mg的濃度在0.5-5mM之間調整。同樣要記住的是在調整了dNTPs的濃度后要相應的調整Mg離子的濃度。對實時定量PCR，使用3-5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液。

b.其他的離子

NH4+ K+都會影響PCR。增加K+的濃度后, 會因為中和了核酸骨架上磷酸基團的負電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的 嚴謹性(stringency).NH4+也有相同的作用.MBI公司的TAQ酶就提供了兩種BUFFER, 一種是加Mg的一種是已經混合了(NH4)2SO4的.當然, 過高的陽離子濃度(KCL>0.2M)時, DNA在94度根本不會發生變性, 當然也就無從談起PCR了.c.polymerase 不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度。一些高保真酶的效率要遠遠低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些.另外, 一般的 情況下, 變性的溫度可以使用90~92度, 變性的時間也可以縮短,從而保證polymerase的活性 d.template 50ul PCR SYSTEM human gDNA 0.1ug-1ug E.Coli 10ng-100ng Lamada DNA 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng 4.temperature a.denaturation 常規是94度5分鐘, GC Rich的摸板是95度5分鐘，除了GC Rich外, 常規的APPLICATIONS可以將這部分時間縮短到1到2分鐘, 或者在CYCLE 1時給予較長的時間,而取消開始的denaturation b.annealing 重點到了。一般情況下, 是從55度開始.根據情況配合以Mg離子濃度進行調整.有條件的可以做gradient pcr.退火的時間在30-60S, 時間短一些可以得到更好的效果.因為, polymerase 在annealing temp.時也會有一些活性.所以在A.T.的時間過長, 會極大的增加非特異性擴增的風險.另外,在對于一些困難戶, 比如從gDNA里擴增大片段, 還可使用two step PCR.5.touchdown PCR

原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子就OK, ANNEALING TEMP.55度 94 5min—（94 30s—60 30s—72 1min）×2—（94 30s—59 30s—72 1min）×2—（94 30s—58 30s—72 1min）×2—........—（94 30s—51 30s—72 1min）×2—（94 30s—50 30s—72 1min）×20—72 5min

6.hot start PCR

熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應配制過程中，以及在熱循環剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產生非特異性的產物。這些非特異性產物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構建和操作，熱啟動PCR尤為有效。限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液，并將其置于預熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產物的擴增。

熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶，在反應體系達到90度時，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這個方法 過于煩瑣，尤其是對高通量應用，并容易造成污染。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，加入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。

ampliwax PCR Gems(Perkin Elmer)Taq Bead Hot Start Polymerase(Promega)Magnesium wax beads(Stratagene).象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應用。還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase.polymerase被抗體抑制失活，當變性溫度超過70度時，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。

7.Booster PCR

我們知道1ug human genomic DNA 大約在3X105個模板分子,這樣的模板分子數目可以是引物與模板很好的結合.當模板的濃度過低,比如低于100個分子時, 引物和模板之間就很難發生反應.引物容易自身進行反應形成二聚體.這樣就有來了個 booster PCR 我一直找不到合適的詞來翻譯這個booster.具體是這樣的.開始幾個cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的 molar ratio在107~ 108.以確保開始擴增的準確性.然后booste Primer的濃度到正常的水平8.循環數和長度

確定循環數的基本原理是: 產物能夠保證你進一步分析操作的最小循環數.因為過多的循環數容易造 成ERRORS和非特異性產物的積累、產物的量不夠, 優化的方法有: 1.增加TEMPLATE 2.增加循環數

如何確定循環數,有一個方法.做一個PCR體系,40循環,50ul, 分別在20,25,30,35循環時從體系中取5ul,一起跑電泳分析.從而確定最佳的循環數另一個會影響PCR特異性的是PCR cycling時在兩個溫度間變化的速率(ramping rate).當然是越高越好.不過咱們大部分條件有限,就那么幾臺PCR儀,也沒有多少挑選的余地

9.thermal cycler

PCR儀的因素我們經常容易忽視.長時間的使用后需要調整PCR儀,以保證其能夠到達正確的溫度.現在的PCR儀基本上都有自檢功能(self-diagnosis).10.PCR additives

附加物或者說enhancer實在是多種多樣.基本上包括幾類, 能夠增加反應退火效率的化學因子, DNA結合蛋白和一些商業試劑.基本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯配, 增加產物的長度和產量.在GC Rich情況中, additive可以造成配對堿基間的的不穩定,從而提高擴增的效率.而在另一種情況下,additive由于造成錯配的primer-template 復合物的極大的不穩定, 而提高了擴增的忠實性.要注意的是,沒有萬能的enhancer全部通用,需要你根據自己的情況,最好結合gradient pcr選擇最優條件.====== dimethyl sulfoxide(DMSO)up to 10% formamide at 5% trimethylammonium chloride 10-100uM detergents such as Tween 20 0.1-2.5% polyethylene glycol(PEG)6000 5-15% glycerol 10-15% single stranded DNA binding proteins Gene 32 protein 1nM E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM 7 deaza-dGTP(for GC rich)150uM with 50uM dGTP Taq Extehder(stratagene)Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)Q-solution(Qiagen)====== 要注意的是,DMSO,GLYCEROL等會抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最適的濃度

11.Template DNA preparation

提取DNA時的試劑會抑制PCR反應的順利進行.因此需要對TEMPLATE DNA進行純化.特別是SDS(<0.01%)的情況下就能強烈抑制PCR的進行.可以加入一些nonionic試劑,如Tween, Nonid, Trition之類的反過來抑制SDS.還有proteinase K也要除干凈, 不然會降解polymerase.12.Nested PCR

簡單點說 設計兩對引物, 一對是長的, 一對是包含在長引物內的, 用長引物擴增的產物作為第二次擴增的模板,這樣可以增加產物的量.而且可以減少非特異性帶和錯配的情況.增加PCR的保真性 高保真酶

高溫DNA POLYMERASE是以單鏈DNA或RNA為模板，在dNTP和一些陽離子的存在情況下，在特定的引物指導下按3'-5'方向合成DNA.包括3種類型：

a.5'-3'方向的DNA合成能力,沒有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突變體.這類酶的合成能力強,因為他不糾正合成中出現的突變

b.與a類似,有合成活性,沒有3-5的外切活性.但他們能以RNA為模板,合成DNA.如Tth DNA Polymerase c.有DNA聚合活性,沒有逆轉錄活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠實性。但是這些聚合酶的產量比Taq DNA聚合酶低。酶的混合物

將Taq DNA聚合酶同帶有3'到5'外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨Taq DNA聚合酶高的忠實性，并可以得到高產量及擴增長模板。其他因素

除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會降低忠實性。將dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以增加精確度如果四種核苷的濃度不同，忠實性會受影響。進行較少的PCR循環也會有助于增加忠實性，因為增加循環數目和產物長度就會增加突變可能性。

第三篇：PCR實驗室

簡介

Pcr實驗室又叫基因擴增實驗室。PCR是聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復制。通過DNA基因追蹤系統，能迅速掌握患者體內的病毒含量，其精確度高達納米級別，精確檢測乙肝病毒在患者體內存在的數量、是否復制、是否傳染、傳染性有多強、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據

條件

1、必須擁有標準的的PCR熒光實驗室;實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出 由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它 有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣 泛應用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹

2、檢測設備必須符合標準PCR熒光實驗室設置要求;熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統。

3、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認證;

4、檢測人員必須通過國家臨檢中心業務培訓并取得合格證書;PCR實驗室內工作人員必須參加由國家衛生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓班，并持證上崗。PCR實驗室通過驗收，實驗室至少必須應有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”。PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛生部的要求，確保檢測結果準確、確保實驗室衛生安全，確保實驗室長期穩定運行

5、必須在無菌無塵環境下進行操作

功能

能夠對患者病情進行科學、準確、實時的掌控，并結合抗HBV與T細胞免疫來打破免疫耐受，阻斷肝病病毒復制的療法、有效的分解肝炎病毒，解決了乙肝病毒易變異、耐藥，病毒復制模板難以治療，人體免疫耐受狀態不易打破等醫學難題，能迅速消除臨床癥狀，而且有效抑制乙肝病毒復制，明顯加快e抗原、抗體的血清轉換速度，殺滅血液及肝細胞內的病毒，為防止再感染提供了長期保護，有效阻斷和逆轉肝纖維化、肝硬化進程。

建立方法

1、建立樣品準備區

這個區域專門用作樣品的準備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應該采取預防措施：⑴PCR產物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。⑵組織培養物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根據應用的需要提取DNA或RNA。⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產生，而且管子不能用力崩開，這樣會產生氣溶膠。⑺任何時候都應該穿實驗服和帶手套，手套要經常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間，經常清洗。

2、樣品準備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題，反轉錄一步可以在樣品準備區進行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。

3、建立前PCR區。

該去專門用于準備各種反應，這個區域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準備的污染。前PCR區必須要有試劑和準備，特別是專門用于前PCR區的正壓活塞式移液管。

4、PCR實驗室試劑的操作。

⑴所用的所有溶液都應該沒有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。⑷所用試劑都應該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。⑸所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。⑹新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗。⑺樣品準備和前PCR區所使用的移液管在不使用時都應該小心保存。

5、在前PCR區建立PCR混合物。

⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴增一種或少數幾種特異序列時這樣做很有用。⑵如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應混合物不夠經濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。⑶作為一個規則，應該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。⑷陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產物的污染，陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。⑸當做陽性對照時，有兩個理由決定了應該使用最少數量的核酸。⑹由于必須有對照反應，對照模板的特點應該予以考慮。

6、控制污染的方法。

已設計出很有力的酶學方法用來消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術能有效地消除由PCR產物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數量級。

7、后PCR區PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數據，應該留出一個專門用于反應后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區域的試劑或儀器用于任何前PCR活動

第四篇：PCR實驗室

高端PCR實驗室控制設計說明

PCR實驗室即分子生物學實驗室，在醫療、科研、生物技術方面得到廣泛的應用。因其在不同行業的應用各有區別，在具體設計時也有不同之處，就醫療機構的應用而言，主要使用三區或四區設計，即試劑準備區、樣品提取區、擴增分析區；此類三區設計時候應用于類似熒光定量型或同類PCR分析設備，及擴增與分析過程在設備內一次完成。而四區設計在三區的基礎上講擴增分析區拆分為擴增區與分析區適用于其他類型的pcr設備及手工處理。

在PCR實驗的設計上，經過多年的經驗累積，已經在一些關鍵技術上達成了共識。因為PCR實驗中所產生的DNA與RNA片段過于微小，以至于可以穿透高效過濾器，所以在實驗室設計上已經不在強制要求設計高效凈化系統，但是為了提高實驗環境水平及保護實驗室內的敖貴設備方面，如果在具備條件的情況下可考慮追加高效空氣凈化系統；建議凈化級別萬級。在PCR實驗中所產生的DNA與RNA片段污染是一直以來PCR實驗的重點問題。此類污染主要至上次試驗中所產生的基因片段對下次試驗產生的污染，而且一旦試驗環境中的污染形成后很難處理。因為消毒等傳統方式對于基因污染沒有很良好的效果。所以在PCR實驗室設計中一般將整套實驗室設計為全新風型實驗室，這樣而已通過有效的換氣次數來達到凈化室內污染的作用。而在控制方面也有很多不同之處，因為各單位對PCR實驗的重視程度各有不同，所以在設計上也有不同，主要的控制設計有定送定排式壓力控制系統、變送定排式壓力控制系統變送變排式壓力控制系統。在控制設備方面也有很多區分如壓力無關型控制系統、壓力有關型控制系統。

根據業主要求，本PCR實驗室為三區設計，各區可獨立使用，不設置高效過濾系統等相關要求，根據業主以上要求，我方給出的設計方案為壓力無關型變送變排壓力控制系統。本系統的特點是，設備啟動后可根據實驗室內使用節點調節送風量及排風量來控制各房間狀態，系統說明見下圖

? 每個房間可分別控制，使用時通過房間開關輸出啟動信號，當設備接到啟動信號時設備運行，運行中根據管道壓力反饋決定變頻器大小，房間內送排風量由壓力無關型風量調節閥控制。? 當有多個房間開啟或關閉時，設備更加管道壓力反饋，調節設備變頻器增加或減少送排風量來穩定管道壓力。各房間內壓力又房間內的壓力無關型定風量閥進行控制。

? 當BSC（生物安全柜，B2全排）開啟時BSC專用供風機組運行，BSC-供風機-排風機連鎖運轉。

? 當BSC做變風量調節時，根據房間內壓力變化，BSC專用供風機組前安裝的壓力無關型變風量調節閥根據壓力變化增減送風量，確保房間壓力執行在可控范圍內。

? 當房間不適用時，房間與緩沖間均關閉電動密閉閥，確保房間處在密閉狀態避免布朗運動造成的可能污染風險。

? 房間換氣次數均按照一定凈化標準設計，當室內污染發生時，通過一定時間的換氣處理后，污染問題可以基本解決。? 本系統如果業主需要，可在室內送風口末端加裝高效過濾設備，房間可升級為凈化型實驗室。

? 壓力無關型風閥簡介：壓力無關型風閥的特點是不會根據管道壓力的變化而影響風閥內部的送風量，在一定管道壓力區間內能夠自行調節閥體阻力，來穩定送風量，是高端實驗室必備的關鍵部件，目前此類閥體技術均有國外生產廠家控制，目前國內主用使用的產品有妥思、文丘里、西門子等品牌。

第五篇：PCR學習心得

參加《臨床基因擴增實驗室技術人員上崗培訓

班》心得

本人于2015年3月10至15日參加了廣東省臨檢中心舉辦的臨床基因擴增實驗室技術人員上崗培訓班。通過學習，除了取得廣東省臨檢中心頒發的培訓證書外，還極大的提高了理論和實驗操作水平，現總結如下。

此次培訓包括理論培訓和實驗操作。在理論培訓課程當中，衛生部臨床檢驗中心的李金明教授為我們詳細講解了《臨床基因擴增實驗室設計及質量管理體系的建立》、《臨床基因擴增檢驗的質量保證》等內容。通過學習，了解到臨床PCR實驗室設計必須遵循各區獨立、注意風向、因地制宜，方便工作的原則。質量管理的內涵：寫你所做的，做你所寫的，記錄你已做的，分析你已做的。認識到臨床標本的正確采集、運送、保存的重要性，是臨床檢驗的質量保證的關鍵性環節，是解決涉及實驗室檢驗的醫患糾紛的方法之一。同時通過病例分析，對于臨床基因擴增檢驗的檢驗前，檢驗中，檢驗后的質量控制，還有實驗的結果處理和分析有了重新認識。對于實驗室是否出現污染的鑒別，以及出現污染的處理措施有了深刻了解。

臨床實驗醫學的發展現在經歷了三個時代，分別是生化診斷時代，免疫診斷時代，和和現在的分子（基因）診斷時代，而現今時代的標志性技術正是PCR技術，是反映疾病本質的實驗。正是有臨床基因擴增檢驗技術在癌癥等疾病的診斷方面有了多方應用，通過驅動基因的選擇，為靶向治療患者延長了生存期。為個體化診療中對疾病的鑒別診斷，診治方案的設定提供重要的參考依據，同時也為治療過程中臨床對于治療方案的調整提供依據。臨床基因擴增檢驗技術在個體化診療中是不可或缺的一部分，是其重要的組成部分，具有強大的發展潛力和前景。

實驗操作內容為EGFR突變基因檢測。實驗操作過程中，通過認真學習和細致聽講帶教老師的規范實驗操作，了解到了實驗的關鍵操作，糾正了平常在臨床實際工作操作上的一些不良習慣，為日后規范檢驗操作提供了基礎。通過分組親自操做實驗，分析和判斷自己的實驗結果，做實驗記錄筆記，基本掌握EGFR突變基因檢測。

通過為期六天的理論和實驗培訓，從中學習到了很多知識，掌握了嚴格的防污染以及污染的處理措施，了解到實驗室設置的人流、物流、氣流的走向設計原則，解決了日常工作中的實際問題，為日后臨床基因擴增檢驗工作的開展打下了堅實的基礎。了解到臨床基因擴增檢驗技術的發展方向，受益匪淺。