第一篇：PCR注意事項總結

PCR注意事項

PCR產物的電泳檢測時間

一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。

假陰性，不出現擴增條帶

PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及，④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

假陽性

出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現非特異性擴增帶

PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數 過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶 則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次 數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

出現片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環次數。

克隆PCR產物1)克隆PCR產物的最優條件是什么？

最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求，為提高連接效率，需4℃過夜。

2)PCR產物是否需要用凝膠純化？

如凝膠分析擴增產物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？ A）涂布未轉化的感受態細胞。

如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產生氨芐抗型的菌落。B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。

例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養過夜，產生1000個菌落。轉化率為： 產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。

鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為： 1000克隆X10（3次方）ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態細胞 如沒有菌落或少有菌落，感受態細胞的轉化率太低。

C）如用pGEM-T正對照，或PCR產物，產生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質量標準好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應為白斑，如產生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。

4)對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？

A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數克隆，為提高效率，需4℃過夜。B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新制備。如產生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。

C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發生。UV過度照射會產生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）。

E）高度重復序列可能會不穩定，在擴增中產生缺失和重排，如發現插入片段高頻率地產生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞

PCR反應體系與反應條件 標準的PCR反應體系：

10×擴增緩沖液

10ul

4種dNTP混合物

各200umol/L

引物

各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

Taq DNA聚合酶

2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至

100ul

PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。

模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。

PCR反應條件的選擇

PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。

溫度與時間的設置： 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。

②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復性溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時，DNA合成幾乎不能進行。

PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些

第二篇：PCR實驗室報批細節、注意事項、常見問題問答

報 批 細 節

1、技術檔案：

技術人員簡歷表、培訓檔案、要求有實質性文件如每人的學歷證書、上崗證、科研成果（課題）、技術文章、獲獎證書等的復印件

2、儀器檔案：

實驗室所有儀器的購買、使用、校正、放置地點、出廠編號、說明書復印件等

實驗室所有儀器維護校正記錄如：加樣器、溫度計、溫濕度計需出具計量局校正報告文件（可每種只校正一套作為標準）。

擴增儀需有儀器廠家專業技術人員維護校正報告，和校正后的參數。加樣器的出廠編號、使用時間、校正記錄。

5700維護后驗證記錄—用同一公司或校準試劑或用自制質控血清并記錄數值

3、其他細節: 垃圾處理：按生物污染性制品，交醫院統一處理。儀器簡單操作流程

標記筆、槍頭盒等一些小物品都要標明分區。儀器的申請、采購、使用、驗證程序

樣本采集（針對臨床醫護人員）、運輸、收集程序 樣品的唯一編號原則—應區分開不同天、不同種類的標本

標本的保存程序—包括處理前、剛處理后、報告發放后的原始標本（原則上至少保留一周）應有專人負責。

檢測結果的保存、備份記錄、質控記錄保存，除電腦記錄外應有相應的手抄記錄（類似于基因日檢測統計表類型的）。

抱怨記錄—應有時間、事件（項目）、接待人、處理方法、處理結果、處理人簽字確認

注 意 事 項

1、回答任何問題都應與自己寫的SOP文件相一致.“寫你所做的,做你所寫的”.2、SOP文件不能寫的太虛,無法做到的東西不要寫,比如公司版的SOP文件里的加樣器的校準一般實驗室就做不到.模棱兩可也不要寫,比如“消毒時間一到兩小時”不能這樣寫,多少就是多少.3、處理標本要在生物安全柜內,而加樣則在柜外.4、各區門口要貼有各區的工作制度,限入標志.還要準備兩個登記本,一個來記錄紫外消毒,一個來記錄工作人員出入.區內還要有一個工作記錄本,用來記錄各區每天的工作內容,便于監測每天的工作全過程.5、每把槍的用途要清楚,不能弄亂.比如稀釋陽模的槍和處理標本的槍不可混用.6、普通離心機處理分泌物標本時應在離心后靜置20分鐘才能開蓋.(許斌這樣認為)

7、所有儀器、設備都要有檔案卡.8、所有的清潔消毒要在實驗結束后馬上進行,尤其是儀器、設備.像擴增儀，每天都要清潔，做完的反應管決對不能留在樣品槽內。

9、各區的拖把、抹布不得混用,標記清楚.10、生物防護意識要強,手套要隨時更換.生物防護安全的保證要從三個方面:制度、硬件、意識。

11、爆管如何處理:立即停止實驗,水浴里的水要倒掉,沖洗.所有可能污染的地方要用消毒液擦洗,紫外照射,通風排風.12、各區應有日常工作核查表,做為每天工作記錄的補充.13、各區要有泡有消毒液的生物污物桶,用來處理生物垃圾.14、驗收組帶來的標本要按平時對待臨床標本一樣處理,要有接收記錄,結果登記等.15、拒絕電話或代領等非正常方式發放報告單.16、存放標本的冰箱要上鎖,鑰匙及電腦資料的密碼要由本科室人員專人保管.17、報告單上要注明試劑的檢測下限,不能寫成參考范圍.除了有操作者,還要有核校者,且兩者姓名除了電子打印還要用手簽.定量結果不能有陰陽性提示,只能報數值.18、SOP文件中PE5700的溫濕度要求應該為溫度15－30℃、濕度為< 80％。

19、SOP中

醫院申報實驗室注意事項

專家組參觀實驗室回答的問題

1，“你們的冰箱的鐵鏈我可以從底下抽上來，實驗室能做好保密性嗎？

可以的，你們能做到就行，注意保密！

2，實驗室需要配置冷凍離心機，生物安全柜，如果做HCV時,注意重新添置新實驗室。

3，生物防護中是否有銳器的防護注意事項？ 4，實驗室的溫濕度計的放置位置？ 最好放在實驗室內。

5，實驗室中如何做好離心管抑制物的檢測？ 而非爆管、裂管的檢測！

6，在做HCV時規定從抽血化驗到送達實驗室要幾個小時要有明規定！3小時左右！

7，溶血標本有何具體的判斷標準？脂血呢？

實驗室末次會議的提問

1，你們單位（達安）試劑，當我們新鮮標本做HBV時，提取中40微升+40微升提取液處理，待放置過夜后，第二天加樣時，有的標本特難取樣，有何處理辦法？ 2，實驗室中垃圾你們如何處理的？

3，實驗室中陰性標準檢測后變成陽性你怎么辦？（我們實驗室一共有三管陰性陰性對照，第一個陰性檢測管是試劑什么都不加，直接上機，第二個陰性檢測管是試劑中加入在實驗開始時打開蓋的1.5離心管帶有蒸餾水的，第三個陰性檢測管是與實驗一起提取的陰性血清。）4，實驗中如果陽性質控，陽性梯度，標本呈陰性請分別解釋？ 5，實驗室必須配置生物安全柜，高速離心機！

臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收現場問卷

（口試和/或筆試）

一.現有一個患者向你提出：“我在你們醫院檢測HBV DNA為陽性，但在另一家醫院檢測為陰性，你們醫院是怎么做的檢測？”，此時，你怎么辦？

（該題主要是考實驗室人員是否知道并遵守所制定的抱怨處理程序）

二．現有一個臨床大夫拿著幾張HBV DNA定量PCR檢驗報告單找到PCR實驗室，說：“你們的PCR結果到底準不準，我這個病人剛開始檢測，HBV DNA是57×10拷貝數/ml，用了拉米呋啶治療后二周，再檢測結果為3×107拷貝數/ml，降了不少，但再過二周檢測，又變成了6×107拷貝數/ml，升高不少，這到底是怎么回事？”，如果這個大夫剛好問的是你，你怎么辦？并如何解釋其提出的問題？

(該題除了考實驗室人員是否知道并遵守所制定的抱怨處理程序外，還要求其對特定PCR檢驗的批間變異有充分的認識)

回答思路：

這兩題分別對應患者和臨床醫生提出的抱怨。考點為你是否按照所制定的程序來處理：無論是患者還是醫生提出抱怨，我們都應該“按照”程序先記錄抱怨人姓名、抱怨內容等，然后等問題解決后記錄處理結果等，最后記錄反饋意見等。

注意：一般問題中出現“此時，你怎么辦？”，其考核的重點均為“形式”而非“內容”。所以題目中無論病人抱怨的是服務態度不好還是結果報告不準，醫生抱怨的是檢測結果和臨床診斷不符還是報告發放不及時，回答的方向都應該是：“我們接待他們后，先在登記表上記錄抱怨的什么什么相關信息，做相應處理，解決后記錄處理結果，最后填反饋表，歸檔總結，跟著以后改進等等等等”。對各種具體問題的處理就按照實際情況來回答就行。

如果題目中出現要你具體“解釋某某提出的問題”時，這時是具體考察某一“內容細節”了。第二題中看你對PCR檢驗的批間變異有否充分的認識：一般PCR檢測試劑盒存在著一定的批間甚至批內差異，而且PCR檢測前處理也存在著一定的誤差，分析軟件相關參數的選擇也會使定量結果發生變動，這是方法學造成的不可避免的事實。同一操作人、同一儀器、同一批號試劑、同一份標本同時做多份平行管，得到的結果都會不盡相同。所以我們都會允許結果存在一定范圍的偏差，一般為一個數量級的拷貝數。5×107、3×107和6×107均在允許的誤差范圍內，排除了各種影響因素后，出現這種情況很正常，這說明了該病人用藥效果不佳。若定量結果有1～2個數量級甚至更大的變化才能反映用藥療效。

三．現有一人打電話到科室，說：“我孩子在你們醫院做了一項丙肝的PCR檢測，名字叫XXX，請你告訴我檢測結果好嗎？”。如果是你剛好接了這個電話，你會怎樣去做？

（該題考的是實驗室人員在患者要求以電子郵件、電話、傳真等方式傳遞報告時，是否能按相應的程序去做）

回答思路： 也是考形式。“對于這種非正常的報告發放形式，我們按照程序，是這樣這樣處理的。”因為各個醫院實際情況不同，所以無論你怎樣處理，只要程序中體現了對患者結果的保密原則，具體細節不會太要求。

在程序中按以下幾個方式寫都是可以的：

1、我們均不以任何非正常形式發放報告。（最干脆！就是有點不近人情，不過對我們來說省事）

2、實在有特殊情況，可以電話查結果，其它發放形式不行。但必須確認身份，包括核對其所查詢的患者姓名、性別、年齡、檢測項目、送檢醫生、送檢日期、病區床號等情況，并提供患者ID號。

3、可以通過電話、圖文傳真、電子郵件等形式傳送結果，和上面一樣，需要核實身份。（最寬松了，不過麻煩了很多）

要注意的是：這些情況均應明確告知查詢者，這幾種非正常形式發放的報告均僅為臨床提供參考，實驗的最終結果以正式檢測報告單為準。特殊情況報告發放后需詳細登記，簽署報告人姓名，實驗室負責人簽字。

“報告的正確發放”為考核重點，一般可能還會引申出“你們是如何發放檢測結果報告？”之類的問題，按照程序中寫的實際情況回答就行的了。只要遵循保密原則就OK。

最簡單的無非把事情都推給醫院：說門診患者報告單送至服務臺門診報告發放處，由那里的醫生確認身份后發放。（具體她們是怎么確認、確不確認這已經不關我們的事了）。

若寫病人到科室領報告也行，只是“我們怎么確認病人身份”要在程序中體現：詢問相關信息、根據收費單或病歷唯一條形碼（若醫院采用計算機網絡系統）確認等等。

四．現有你科室同事，拿了一份血清標本給你，說：“這是我一個熟人的標本，他要做HCV RNA檢測，剛好他還做生化和免疫檢測，我從生化標本分了一些出來，給你做HCV RNA。”你覺得這樣行嗎？為什么？

（該題主要是考實驗室人員對有關標本的收集程序是否清楚并遵守）

回答思路：

問到了“為什么？”表示具體考到細節了。按照我們的收集程序，做PCR尤其是RNA項目需要獨立取血，不能從其它檢測的標本中分出一些來做。而且對RNA標本的采集、保存、運輸都有嚴格的要求。

一般驗收組會對這類問題加以引申。問你每天標本在哪兒采集？采血的人員有否經過專門培訓？采集的標本如何保存？

還可以順便問你結果發放后的標本如何保存、保存在哪兒？保存多久？甚至要你把這多久多久前的標本拿出來給他們看。

五．某一天，你在做HBV DNA熒光定量PCR檢測（方法的定量測定范圍為103～107拷貝數/ml）中，發現有1份標本的測定Ct值超出方法的測定上限，此時你怎么辦？對于沒有特異擴增曲線的標本你又怎么報告結果？

回答思路： 此為具體問題：題目已經假設了方法的定量測定范圍為103～107拷貝數/ml，我們就按照這個假設來考慮。先看是否為特異擴增的曲線（即看曲線是否為標準的S形曲線），若為標準S形曲線表示的確為陽性標本，Ct值超出檢測上限，表示未知標本HBV DNA濃度過大，不在檢測線性范圍內，應該進行濃度梯度稀釋（1/

10、1/100、1/1000??），重做實驗，看哪個梯度處于線性范圍內，得到原始濃度乘以相應稀釋倍數即得。

若不是特異擴增的曲線（也就是常見的那種前面翹、與閾值線有交點的陰性曲線，計算機不會具體分析，見有交點就給Ct值，而且Ct值還很小，小于測定上限的Cycle數），按陰性報。

六．在PCR檢測的核酸提取離心中，如發現有一管離心管出現破裂，此時你怎么辦？

（該題是考實驗室人員對于其制定的實驗室及儀器設備消毒清潔程序是否知道并遵守）

回答思路：

按照離心機的消毒清潔程序：必須先停止實驗，將破裂管密封放入生物垃圾 桶，再用75%酒精擦拭離心室消毒，用移動紫外燈照射30～60分鐘后才能開始實驗。

可以引申出：離心管破裂，可能質量有問題，為防止以后同類事情的發生，按照耗材質檢程序進行離心管質檢實驗，若不合格停止使用，重新購買并進行質檢，合格的耗材才能使用。

七．有一個PCR實驗室的熒光定量PCR儀如ABI 7000因某種原因搬動到了另一個實驗臺面，實驗室只是將儀器外表面擦了擦，即用于常規擴增檢測工作，你覺得該實驗室做得對嗎？為什么？

（該題是考實驗室人員對于其制定的PCR儀校準程序是否知道并遵守）

回答思路：

考核實驗室人員對于其制定的PCR儀校準程序是否知道并遵守。儀器移動應該按照程序進行校準后才能重新用于常規擴增檢測工作，以保證實驗結果。

7000型核酸擴增熒光檢測儀為復雜精密儀器，其校準工作需由專業工程師 進行。實驗室聯系儀器廠家派技術人員來校準儀器。

平時就算不搬動儀器，實驗室也應與儀器廠家達成協議，定期校準儀器。八．有一位實驗室工作人員在做PCR實驗中，一開始將化驗單帶至標本處理區，核酸提取完成后，進入了擴增區，但將化驗單忘在了標本處理區，此時，他應該怎樣做？

（該題是考實驗室人員對于其制定的實驗室單一流向工作程序是否知道并遵守）

回答思路：

很簡單，按照單一流向原則，該實驗員不能直接回2區拿單，要么請其他當日未進過擴增實驗室的人員幫拿，要么嚴格按要求淋浴、換衣服后再次進入2區拿化驗單。

第三篇：PCR實驗室

簡介

Pcr實驗室又叫基因擴增實驗室。PCR是聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復制。通過DNA基因追蹤系統，能迅速掌握患者體內的病毒含量，其精確度高達納米級別，精確檢測乙肝病毒在患者體內存在的數量、是否復制、是否傳染、傳染性有多強、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據

條件

1、必須擁有標準的的PCR熒光實驗室;實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出 由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它 有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣 泛應用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹

2、檢測設備必須符合標準PCR熒光實驗室設置要求;熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統。

3、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認證;

4、檢測人員必須通過國家臨檢中心業務培訓并取得合格證書;PCR實驗室內工作人員必須參加由國家衛生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓班，并持證上崗。PCR實驗室通過驗收，實驗室至少必須應有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”。PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛生部的要求，確保檢測結果準確、確保實驗室衛生安全，確保實驗室長期穩定運行

5、必須在無菌無塵環境下進行操作

功能

能夠對患者病情進行科學、準確、實時的掌控，并結合抗HBV與T細胞免疫來打破免疫耐受，阻斷肝病病毒復制的療法、有效的分解肝炎病毒，解決了乙肝病毒易變異、耐藥，病毒復制模板難以治療，人體免疫耐受狀態不易打破等醫學難題，能迅速消除臨床癥狀，而且有效抑制乙肝病毒復制，明顯加快e抗原、抗體的血清轉換速度，殺滅血液及肝細胞內的病毒，為防止再感染提供了長期保護，有效阻斷和逆轉肝纖維化、肝硬化進程。

建立方法

1、建立樣品準備區

這個區域專門用作樣品的準備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應該采取預防措施：⑴PCR產物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。⑵組織培養物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根據應用的需要提取DNA或RNA。⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產生，而且管子不能用力崩開，這樣會產生氣溶膠。⑺任何時候都應該穿實驗服和帶手套，手套要經常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間，經常清洗。

2、樣品準備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題，反轉錄一步可以在樣品準備區進行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。

3、建立前PCR區。

該去專門用于準備各種反應，這個區域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準備的污染。前PCR區必須要有試劑和準備，特別是專門用于前PCR區的正壓活塞式移液管。

4、PCR實驗室試劑的操作。

⑴所用的所有溶液都應該沒有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。⑷所用試劑都應該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。⑸所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。⑹新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗。⑺樣品準備和前PCR區所使用的移液管在不使用時都應該小心保存。

5、在前PCR區建立PCR混合物。

⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴增一種或少數幾種特異序列時這樣做很有用。⑵如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應混合物不夠經濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。⑶作為一個規則，應該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。⑷陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產物的污染，陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。⑸當做陽性對照時，有兩個理由決定了應該使用最少數量的核酸。⑹由于必須有對照反應，對照模板的特點應該予以考慮。

6、控制污染的方法。

已設計出很有力的酶學方法用來消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術能有效地消除由PCR產物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數量級。

7、后PCR區PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數據，應該留出一個專門用于反應后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區域的試劑或儀器用于任何前PCR活動

第四篇：PCR實驗室

高端PCR實驗室控制設計說明

PCR實驗室即分子生物學實驗室，在醫療、科研、生物技術方面得到廣泛的應用。因其在不同行業的應用各有區別，在具體設計時也有不同之處，就醫療機構的應用而言，主要使用三區或四區設計，即試劑準備區、樣品提取區、擴增分析區；此類三區設計時候應用于類似熒光定量型或同類PCR分析設備，及擴增與分析過程在設備內一次完成。而四區設計在三區的基礎上講擴增分析區拆分為擴增區與分析區適用于其他類型的pcr設備及手工處理。

在PCR實驗的設計上，經過多年的經驗累積，已經在一些關鍵技術上達成了共識。因為PCR實驗中所產生的DNA與RNA片段過于微小，以至于可以穿透高效過濾器，所以在實驗室設計上已經不在強制要求設計高效凈化系統，但是為了提高實驗環境水平及保護實驗室內的敖貴設備方面，如果在具備條件的情況下可考慮追加高效空氣凈化系統；建議凈化級別萬級。在PCR實驗中所產生的DNA與RNA片段污染是一直以來PCR實驗的重點問題。此類污染主要至上次試驗中所產生的基因片段對下次試驗產生的污染，而且一旦試驗環境中的污染形成后很難處理。因為消毒等傳統方式對于基因污染沒有很良好的效果。所以在PCR實驗室設計中一般將整套實驗室設計為全新風型實驗室，這樣而已通過有效的換氣次數來達到凈化室內污染的作用。而在控制方面也有很多不同之處，因為各單位對PCR實驗的重視程度各有不同，所以在設計上也有不同，主要的控制設計有定送定排式壓力控制系統、變送定排式壓力控制系統變送變排式壓力控制系統。在控制設備方面也有很多區分如壓力無關型控制系統、壓力有關型控制系統。

根據業主要求，本PCR實驗室為三區設計，各區可獨立使用，不設置高效過濾系統等相關要求，根據業主以上要求，我方給出的設計方案為壓力無關型變送變排壓力控制系統。本系統的特點是，設備啟動后可根據實驗室內使用節點調節送風量及排風量來控制各房間狀態，系統說明見下圖

? 每個房間可分別控制，使用時通過房間開關輸出啟動信號，當設備接到啟動信號時設備運行，運行中根據管道壓力反饋決定變頻器大小，房間內送排風量由壓力無關型風量調節閥控制。? 當有多個房間開啟或關閉時，設備更加管道壓力反饋，調節設備變頻器增加或減少送排風量來穩定管道壓力。各房間內壓力又房間內的壓力無關型定風量閥進行控制。

? 當BSC（生物安全柜，B2全排）開啟時BSC專用供風機組運行，BSC-供風機-排風機連鎖運轉。

? 當BSC做變風量調節時，根據房間內壓力變化，BSC專用供風機組前安裝的壓力無關型變風量調節閥根據壓力變化增減送風量，確保房間壓力執行在可控范圍內。

? 當房間不適用時，房間與緩沖間均關閉電動密閉閥，確保房間處在密閉狀態避免布朗運動造成的可能污染風險。

? 房間換氣次數均按照一定凈化標準設計，當室內污染發生時，通過一定時間的換氣處理后，污染問題可以基本解決。? 本系統如果業主需要，可在室內送風口末端加裝高效過濾設備，房間可升級為凈化型實驗室。

? 壓力無關型風閥簡介：壓力無關型風閥的特點是不會根據管道壓力的變化而影響風閥內部的送風量，在一定管道壓力區間內能夠自行調節閥體阻力，來穩定送風量，是高端實驗室必備的關鍵部件，目前此類閥體技術均有國外生產廠家控制，目前國內主用使用的產品有妥思、文丘里、西門子等品牌。

第五篇：PCR經驗總結

PCR經驗總結

實驗注意事項：

（1）DNA處理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有緩沖液吸頭、離心管等用前必須高溫高壓處理，常規消耗用品用后作一次性處理，避免反復使用造成污染。

（2）PCR操作應戴手套并勤于更換，必要時應戴好帽子和口罩，就像做手術一樣，要有“無菌觀念”。

（3）成套試劑，小量分裝，專一保存，防止它用。配制試劑用新器具，用后作一次性處理。（4）試劑管用前先瞬時離心（10s），使液體沉于管底，減少污染手套與加樣器機會。（5）最后加模板DNA，馬上蓋好，混勻，瞬時離心（10s），使水相與有機相分開。加入模板且忌噴霧污染，所有非即用管都應蓋嚴。加模板DNA后應更換手套。（6）實驗設陽性、陰性對照。

還有諸如：移液槍用完要放到最大計量位置，防止久了彈簧失靈；防止RNA酶污染標本；低溫下操作，防降解；試劑有致癌致畸作用，做好個人防護；頭腦中各操作步驟要清楚，不要加錯試劑。

問題及解決方案匯總：

一、假陰性，擴增無條帶

PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及活性 ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

二、假陽性

出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或 器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR來減輕或消除。

三、出現非特異擴增帶

PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設計引物。②減低酶量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。④適當提高退火溫度或采用兩步法。

四、出現片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：①減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環次數。

五、出現大量引物二聚體

1.從引物自身著手，重新設計引物，這是最根本解決這一問題的辦法； 2.可能模板有問題；

3.模板濃度過小，適當加大模板量；

4.Taq酶，引物，Mg2+濃度可能過高，可降低它們的濃度；

5.取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘，然后迅速拿出置于冰上瞬時冷卻，這時再加入反應體系當中，引物二聚體就會消失的；

6.所配Mix中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增強特異性；

7.PCR反應體系的配制在冰上進行，最后加Taq酶，PCR結束后，產物勿放置在室溫下過長時間，有人認為室溫下有些Taq酶會將多余的引物合成為二聚體。

8.增加循環數；

9.降低退火溫度后有條帶，則應逐漸提高溫度，若提高溫度的同時產物量減少，則考慮增加鎂離子濃度（根據擴增片斷長度而定，片段長則相應鎂離子濃度應該高一些）；

10.若降低退火溫度，發現還是只有引物二聚體，而且鎂離子的濃度在20-25mM沒有區別，則考慮Buffer等試劑沒有完全融解、混勻，導致吸取的試劑濃度不對。11.以上次的PCR產物作模板二次PCR，可以提高引物與模板的特異性，減少引物二聚體，如果兩次時間間隔短的話，可以把原產物稀釋100－1000倍，如果間隔較長可以稀釋50－100倍；

六、高GC與復雜結構的模板處理

將模板置于95℃水浴鍋中處理10分鐘以上，然后置于冰上瞬時冷卻，可大大降低二級結構對PCR的影響。

七、長片段與短片段拼接失敗（定點突變）

在做定點突變時，倘若突變位點距離基因的某一側較近（短片段<200bp）時，通常拼接困難或者難以通過電泳結果直觀判斷是否拼接成功。此時，可在短片段的上方（突變近5’端）或下方（突變近3’端）選取一條載體通用引物與基因另一條引物PCR（控制產物大小>300bp），然后再做基因拼接。確認大小無誤后，再以此產物為模板，用基因首尾引物PCR即可。

八、Long PCR無條帶

對于>5Kb片段擴增，常規PCR很難得到較好的條帶，建議①更換更適合于Long PCR的聚合酶；②添加PCR Enhancer調整體系；③設計多對引物分段擴增。

PCR增強劑（PCR Enhancer）：

常見的添加劑有：DMSO，甘油，甲酰胺，硫酸銨，甜菜堿，BSA等，它們對PCR反應的影響雖然有所不同，但都可提高PCR的擴增效率。

1.DMSO：解除模板DNA局部二級結構，增加引物與模板的特異性結合，使聚合酶更容易在二級結構處延伸，但是對酶活有抑制作用，且當其濃度大于10％時還會降低保真性。

2.甘油：可降低模板溶解溫度（Tm），提高產量，但是對酶活有抑制作用。3.甲酰胺：促進某些“引物－模板”退火，降低帶有二級結構的DNA的變性溫度。4.硫酸銨：增加反應體系的離子強度，改變DNA的變性及退火溫度，調節酶活。5.甜菜堿：有利于DNA雙鏈的解開，Polymerase的結合，提高PCR的效率。