第一篇：PCR實驗技術總結

PCR實驗技術總結點擊次數：422 作者：佚名 發表于：2008-06-15 20:53 轉載請注明來自丁香園

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PCR技術簡史

一、PCR的最早設想

核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術，Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想：“經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。

二、PCR的實現

1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內復制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。

三、PCR的改進與完善

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優點，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫學界的足夠重視。

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環一次，仍需加入新酶。

1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發現使PCR廣泛的被應用。

PCR技術的基本原理

類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

（一）模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

（二）模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

（三）引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。(Plateau)。到達平臺期所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

PCR的反應動力學

PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA 片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現“停滯效應” 這種效應稱平臺期數、PCR 擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素。大多數情況下，平臺期的到來是不可避免的。

PCR反應體系與反應條件

一、標準的PCR反應體系：

10×擴增緩沖液10ul 4種dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA0.1～2ug Taq DNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/L 加雙或三蒸水至100ul

二、PCR反應五要素

參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

（一）引物

引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

設計引物應遵循以下原則：

1、引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

2、引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

3、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

4、避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

5、引物3'端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

6、引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。

7、引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

（二）酶及其濃度

目前有兩種Taq DNA聚合酶供應，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2。5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

（三）dNTP的質量與濃度

dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。

（四）模板(靶基因)核酸

模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

（五）Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。

三、PCR反應條件的選擇

PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。

（一）溫度與時間的設置

基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。

1、變性溫度與時間

變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。

2、退火(復性)溫度與時間

退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)復性溫度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

3、延伸溫度與時間

Taq DNA聚合酶的生物學活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時，DNA合成幾乎不能進行。

PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。

（二）循環次數 循環次數決定PCR擴增程度。PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環次數選在30～40次之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。

PCR反應特點

一、特異性強

PCR反應的特異性決定因素為：

（一）引物與模板DNA特異正確的結合；

（二）堿基配對原則；

（三）Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；

（四）靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能

保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。

二、靈敏度高

PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。

三、簡便、快速 PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

四、對標本的純度要求低

不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測。

PCR擴增產物

可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5'端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由于引物所結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3'端開始延伸，其5'端是固定的，3' 端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產物片段”。進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即“長產物片段”)結合。引物在與新鏈結時，由于新鏈模板的5'端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3'端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內、形成長短一致的“短產物片段”。不難看出“短產物片段”是按指數倍數增加，而“長產物片段”則以算術倍數增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。

PCR擴增產物的分析

PCR產物是否為特異性擴增，其結果是否準確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定，才能得出正確的結論。PCR產物的分析，可依據研究對象和目的不同而采用不同的分析方法。

一、凝膠電泳分析 PCR產物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產物的特異性。PCR產物片段的大小應與預計的一致，特別是多重PCR，應用多對引物，其產物片斷都應符合預訐的大小，這是起碼條件。

（一）瓊脂糖凝膠電泳： 通常應用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。

（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測分析。

二、酶切分析： 根據PCR產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。

三、分子雜交： 分子雜交是檢測PCR產物特異性的有力證據，也是檢測PCR 產物堿基突變的有效方法。

（一）Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記后做探針，與PCR產物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。

（二）斑點雜交： 將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用于PCR產物特異性鑒定及變異分析。

四、核酸序列分析： 是檢測PCR產物特異性的最可靠方法。

PCR產物克隆方法

一、平端連接

通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能在兩6條DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為3'突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產物的效率通過較高。在采用大量T4DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率。對于較短PCR產物，用PUS19的HincⅡ位點進行克隆，以X－gal和IPTG篩選，常可得到足量重組子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將PCR產物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產物。

二、粘端連接

（一）引物中設計入限制酶位點

由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互補堿基，因此可以在兩引物的5'末端設計單限制酶或雙限制酶切位點。這樣得到的PCR產物用限制酶消化產生粘性末端，即可與有互補粘端的載體DNA重組。這種克隆方法效率較高，且當兩引物中設計不同酶切位點時，可有效地定向克隆PCR產物。其缺點是需要加長PCR引物，除限制酶識別序列外，還需要在其5'端多合成3-4個堿基以利于限制性內切酶與PCR產物末端的穩定結合。即使如此，其酶切效率也不夠高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等較為難切。采用突變PCR方法可克服上述缺點。該方法是通過在兩PCR引物序列中改變1至數個核苷酸創造出一個限制性內切酶位點。鑒于PCR引物的3'末端序列的互補性是PCR成功的關鍵，在PCR引物的中部或近5'端改變1個或幾個堿基對PCR擴增效果影響不大。這種方法不需要增加PCR引物的長度，而且酶切效果優于5'加端法。對于特定DNA片段的克隆，此方法較為經濟、實用。但對于基因診斷PCR產物的克隆，似乎5'加端法更為適宜。

（二）T4DNA聚合回切產生粘端

如PCR兩引物的5'末端是A或T，則可在其5'端分別加上CG和CCGG。用此二引物擴增的PCR產物在dATP和dTTP存在的情況下，用T4DNA聚合酶進行處理，則T4DNA聚合酶因具有3'→5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，產生AccI和XmaI粘性末端。此DNA片段直接與用AccI和XmaI切開的載體進行連接。這種方法只需在PCR引物的5'端加2-4個堿基，但其可選擇的限制酶類有限。

三、T－vector法

TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3'末端加一個堿基，所加堿基幾乎全是腺苷。據此，Marchuk等人采用3'端突出一個胸苷的質粒DNA來克隆PCR產物，其克隆效率比平端的連接至少高出100倍。他們用EcoRV將pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的兩個3'末端各加一處胸苷。因為在4種dNTP都存在時，Taq聚合酶選擇性參入dATP，而當僅一種dNTP存在時，它只能參入該種堿基。因此，在只加入ddTTP時，用TaqDNA聚合酶可使平端載體DNA轉變成3'末端突出一個胸苷的T尾載體，稱為T－vector。用這種T－vectorsk可以較有效地直接克隆PCR產物。Hotton等人也報道了另一種制備T－vector的方法。他們使用脫氧核苷酸末端轉移酶在切成平端的載體DNA的3'末端加上一個胸苷。由于末端轉移酶可以催化多個堿基（ddTTP）作為底物，使平端載體DNA分子的兩個3'末端各加上一個T。用這種方法制備的T－vector的不同之處在于前者3'末端不能與待克隆PCR產物的5'末端連接，僅5'末端可與PCR產物的3'末端形成磷酸二脂鍵。

四、共環消解法

最近，Jung等人報道了一種有效的PCR產物克隆方法。用磷酸化的PCR引物擴增得到的PCR產物，先用T4DNA連接酶催化連接反應，使5'端帶有限制酶切位點的擴增DNA片段連接成共環結構。然后再用相應的限制酶進行消化，產生粘端DNA片段。對于對稱性限制酶位點，只需在引蛾的5'末端加上一關識別序列，因為在串接成共環后能恢復限制酶切位點難于切開的缺點，且可用于雙限制酶切位點的設計，只不過有PCR產物共環化后，僅約1/4的限制酶切點得以恢復。故此法較適用于單限制酶位點的克隆。

五、無連接酶亞克隆法

無連接酶克隆法（ligase-free subcloning，LFS）是利用引物5'末端附加堿基修飾法，修飾堿基不是酶切位點，而是與某一質粒兩端分別互補的堿基。兩引物的3'端約20-25個核苷酸分別與待擴增DNA兩翼互補，5'端各有約24個核苷酸分別與線性化質粒的3'端相同的附加序列。由于線性化質粒的3'端序列各不相同，PCR片段可以通過選擇各引物的合適5'附加序列與引物3'端定向雜交。由此物a和b產生的兩端有附加序列的PCR產物與未反應引物分離后，分別加入兩只含有線性化質粒的反應管中進行第二次PCR。第1管中用引物a和c，引物a即為第一PCR擴增的上游引物a，引物c為下游引物，與緊鄰5'端附加序列內測的質粒（+）鏈互補。同樣，第2管的引物為b和d，引物b與第一次PCR擴增的下游引物b相同，引物d為上游引物，與緊鄰5'附加序列內側的質粒（-）鏈互補。

第二次PCR的第一循環中，PCR產物與質粒均變性與復性。除自身復性產物（這種復性產物不被擴增）外，PCR產物與質粒可通過各自3'端互補序列雜交成部分異源雙鏈，延伸時，重疊的3'端互為此物沿各自互補鏈延伸，結果可產生PCR片段與線性質粒的“連接”。然后兩管中PCR擴增各進行15-20個循環。這便可產生大量一端管1）或另一端連接有PCR插入片段的質粒。第二次PCR后將第1管與第2管反應液混合，用堿變性雙鏈，中和后稀釋變性的DNA。反應管中的單鏈DNA可以復性或幾種不同的產物，除各自本身復性產物外，管1產物ssDNA與管2中ssDNA可形成部分異源雙鏈DNA，并各自有一較長的5'或3'懸端，這種長的5'或3'懸端相互互補，在低DNA濃度時可復性產生環化DNA。

盡管這種環化的DNA有兩個缺口，但它們可以直接用來轉化受體大腸直桿菌。一旦進入體內，兩個缺口便共價連接，修復的質粒即可復制，下面以從λ噬菌體DNA中擴增-500bp片段，并克隆入pGem4Z載體中為例說明LFS法。

這種方法同樣適于復雜基因組中基因片段的克隆。需注意的是第一次PCR時兩引物的5'附加序列不應太短以免影響第二次PCR時異源雙鏈的形成，以24個核苷酸較為合適。擴增時若形成，引物二聚體，一定要去除，否則會嚴重影響轉化率。用LFS法已成功地克隆了長達1.7kb的基因片段。這種方法的優點是：①可用于常規方法無法進行亞克隆的片段；②適于任何PCR產物和任何質粒；③可亞克隆特殊目的（如含點突變、缺失或插入等）片段；④在某些情況下，對已構建了啟動子或增強子等序列的載體，可使待表達片段插入定向合適位置；⑤較快，可在1d內完成，較常規方法可靠，不需DNA連接酶。

DNA克隆是分子生物學的重要內容。特定基因的克隆常因兩端缺乏合適限制酶切點而受因，cDNA的克隆通常也效率不高、篩選因難。采用PCR技術行DNA和cDNA的克隆，則可大大縮短克隆時間，比之全基因合成更為經濟和方便，因而愈來愈受重視。用PCR方法進行傳染性疾病和遺傳性疾病的診斷常遇到產物的異性問題和分型問題，采用產物克隆和測序方法，比之寡核苷酸探針雜交方法更為準確。隨著PCR技術的不斷發展和推廣，新的PCR產物的克隆方法也將不斷出現。

PCR基礎的檢測工具的優缺點

首先，PCR反應是快速的。整個DNA提取，擴增和檢測的過程通常少于6小時，如果反應利用嵌套的引物，過程可能長些。對于一些樣本來說，比如來自糞便和表皮，就需要在DNA提取中增加步驟。這樣就延長了整個檢測的時間到14小時。

用購買的核苷酸提取工具就能縮短檢測時間，機械進行提取，使PCR方案最優化或使用加快熱循環技術。有了優化的樣本，快速提取和光循環熱循環，整個檢測時間能縮短到2小時。但通常是6-8小時。

于培養基基礎的方法2-5天的時間相比較，這是巨大的進展了。這也比一些需要有精確計算結果的培養基濃縮的抗體檢測實驗要快。當購買的實用抗體基礎的檢測工具比PCR基礎的方法快時，大部分這樣的化驗只能用于非常有限的生物體上。

第二，PCR不需要培養。這是與PCR基礎的檢測的速度密切相關的。既然PCR是十分靈敏的（少到10 cfus的樣本就能被檢測），培養通常是沒必要的。大多數最新的實用PCR檢測工具需要有選擇性的濃縮，特別是當樣本包括大量的PCR抑制劑時。用核苷酸提取方法能夠避免培養，核苷酸提取方法產生了PCR質量的DNA并且優化了PCR反應。如果在大量樣本中檢測少量的病原體或者病源有機體在PCR靈敏度的極限以下的情況下，將需要使用培養。在一般情況下，使用培養的情況是很少的，去除了培養的步驟，時間將被節省下來。

比節省時間更重要的是，去除了培養，那些難以或不能培養的生物體就可以進行檢測。這些生物體包括某種病毒、真菌、厭氧性生物和支原體。

第三，PCR的花費合理。與培養或抗體基礎的化驗相比，PCR基礎的診斷是十分經濟的。考慮到細菌的培養，有較昂貴的花費。大多數樣本為了正確的鑒定需要培養和重復培養。這需要大量的手工時間（加上化驗的花費），也增加了污染的危險。

作為比較，大多數抗體化驗所需的手工時間很少但化驗本身很昂貴。

PCR反應的成分（引物，酶，dNTPs和緩沖液）的花費比每次化驗的花費少40%，而反應的時間包括核苷酸分離，通常在一小時以內。當然這依賴于樣本、技術員和用于分離核苷酸的技術。既然PCR所用的時間少，它的花費也少。

但是，PCR需要熱循環，UV來源和一些類型的圖象捕獲裝置，因此PCR實驗室的最初花費是很高的。

這里討論另外一些在臨床領域的PCR使用的基本原理

第一，PCR不是抗原基礎的。

抗體基礎的檢測工具（ELISA和其他）不僅檢測直接抗病原體的人類抗體，而且能檢測病原體上的表面抗原。人類抗體檢測工具因此需要免疫反應的存在，以及在正確檢測抗原存在之前抗體濃度的測定。在新近感染的情況下，這種測試不能檢測針對病原體的人類抗體，可能不能正確反映是否有感染。事實上，被感染的病人，沒有充足的時間來提高用于檢測的濃度。這是HIV抗體基礎檢測的通常的問題。由于相同的原因，這種類型的測試對檢測無免疫應答患者的病原體存在困難。反過來講，抗體基礎的測試也會給出錯誤相反的結果。

然而抗體基礎的檢測最大的問題是它不能檢測新的病原體亞型，由于表面抗原發生改變，而導致了錯誤的陰性結果。（PCR基礎的檢驗也可能由于DNA的變化、突變而遇到相似的問題。但PCR基礎的檢驗能夠進行設計，使這些錯誤的陰性結果最小化。）盡管有這些缺點，抗原基礎的檢測工具是十分重要的檢測方法，在大多數情況下比PCR檢測要迅速。

第二，檢驗易按客戶的要求設置，以適合特殊的需要

通過簡單使用不同的特殊目標引物，工具能迅速設計，用于許多檢測。

第三，PCR容易使用，是由時間證實的技術

通過使用有商業價值的核苷酸提取產物，用于病原體檢測的樣本能在少于十分鐘的時間內被例行操作。一旦進行操作，樣本被加入反應體系中，進入熱循環。反應完成后，樣本能被自動系統或凝膠電泳所分析。

少數的PCR檢測將能完全自動化。儀器將進行所有操作，從樣品的準備到分析結果。這樣的系統將十分昂貴，可能只能適應制造商的平臺。這對大多數臨床實驗室無吸引力，但當價格下降后，將最終使PCR診斷自動化。

第二篇：PCR實驗常見問題

【實驗】PCR常見問題總結

作者: gene121(站內聯系TA)發布: 2005-07-04 PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。一.假陰性，不出現擴增條帶

PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及活性 ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。1假陽性

出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或 器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。2出現非特異性擴增帶

PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設計引物。②減低酶量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。3出現片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：①減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環次數。二.PCR污染與對策

PCR反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。污染原因

(一)標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。

(二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三)PCR擴增產物污染:這是PCR反應中最主要最常見的污染問題，因為PCR產物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物 污染，就可造成假陽就可形成假陽性。

還有一種容易忽視，最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由 其造成的污染是一個值得特別重視的問題.(四)實驗室中克隆質粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。污染的監測

一個好的實驗室，要時刻注意污染的監測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。對照試驗

1.陽性對照:在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好，經各種鑒定是該產物的標本，如以重組質粒為陽性對照，其含量宜低不宜高(100個拷貝以下)，但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經自己使用穩定，檢驗人員心中有數時，在以后的實驗中可免設陽性對照。

2.陰性對照:每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。②試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以監測試劑是否污染。

3.重復性試驗

4.選擇不同區域的引物進行PCR擴增 防止污染的方法

(一)合理分隔實驗室:將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環擴增及PCR產物的鑒定等步驟分區或分室進行，特別注意樣本處理及PCR產物的鑒定應與其它步驟嚴格分開。最好能劃分①標本處理區;②PCR反應液制備區;③PCR循環擴增區;④PCR產物鑒定區。其實驗用品及吸樣槍應專用，實驗前應將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。

(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產生氣溶膠污染。

(三)預混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應小量分裝，如有可能，PCR反應液應預先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復加樣次數，避免污染機會。另外，PCR試劑，PCR反應液應與樣品及PCR產物分開保存，不應放于同一冰盒或同一冰箱。

(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用。(五)設立適當的陽性對照和陰性對照，陽性對照以能出現擴增條帶的最低量的標準病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。

(六)減少PCR循環次數，只要PCR產物達到檢測水平就適可而止。

(七)選擇質量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內液體濺出。

第三篇：pcr檢測技術

《食品安全學》綜述

PCR快速檢測技術綜述

1．前言

聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點；能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍，是肉眼能直接觀察和判斷；可從一根頭發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾個星期才能做到的事情，用PCR幾個小時便可完成。PCR技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑。

該酶促反應最基本的3個環節是：[1]模板DNA的變性，即在94℃下模板雙鏈DNA變為單鏈DNA；[2]引物與模板鏈的特異性復性；[3]引物鏈的延伸。

2.研究的目的與意義

聚合酶鏈反應（PCR）技術建立以來，定性技術不斷改進和完善，可以達到檢測單個靶序列的水平、但實際工作中常需要定量檢測標本中核酸，而不是某一特定序列存在與否，借助PCR對基因快速、敏感、特異而準確定量成為目前分子生物學技術研究的熱點之一。定量PCR旨在評估樣品中靶分子數，此測定可以是絕對的，如每微克樣本中靶DNA的分子數；也可以是相對定量，即與設定的內參照或外參照比較而言。鑒于PCR方法主要有5個，即對PCR產物的直接定量、極限稀釋法、靶基因與參照基因的同步擴增、競爭性PCR和熒光定量PCR[1]。這幾種放啊各有利弊，對其選擇取決于靶基因的特性、對PCR產量的期望值、對準確度的要求、需要相對還是絕對定量。

人類對于核酸的研究已經有100多年的歷史。20世紀60年代末70年代初，人們致力于研究基因的體外分離技術。但是，由于核酸的含量較少，一定程度上限制了DNA的體外操作。Khorana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想。但是，當時的基因序列分析方法尚未成熟，對熱具有較強穩定性的DNA聚合酶還未發現，寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動合成階段，這種想法似乎沒有任何實際意義。

1985年，美國科學家Kary Mullis在高速公路的啟發下，經過兩年的努力，發明了PCR技術，并在Science雜志上發表了關于PCR技術的第一篇學術論文。從此，PCR技術得到了生命科學界的普遍認同，Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學獎。

但是，最初的PCR技術相當不成熟，在當時是一種操作復雜、成本高昂、“中看不中用”的實驗室技術。1988年初，Keohanog通過對所使用的酶的改進，提高了擴增的真實性。爾后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術的擴增效率大大提高。也正是由于此酶的發現使得PCR技術得到了廣泛地應用，使該技術成為遺傳與分子生物學 分析的根本性基石。在以后的幾十年里，PCR方法被不斷改進：它從一種定性的分析方法發展到定量測定；從原先只能擴增幾個kb的基因到目前已能擴增長達幾十個kb的DNA片段。到目前為止，PCR技術已有十幾種之多，例如，將PCR與反轉錄酶結合，成為反轉錄PCR，將PCR與抗體等相結合就成為免疫PCR等。3.國內外研究現狀

3.1.基礎研究方面的應用

目前從事分子生物學的實驗室和研究人員，幾乎每天都在使用PCR，可以說幾乎沒有一個分子生物學家沒有使用過PCR。因此，PCR與分子克隆一樣是分子生物學實驗室的常規方法，可用于達到以下目的：

[1] 擴增目的基因和鑒定重組子； [2]克隆基因；

[3]基因功能和表達調控的研究； [4]基因組測序； [5]制備單鏈模板； [6]致突變；

3.2.PCR在臨床上的應用[2]

[1]在遺傳學上的應用：人類的遺傳性疾病是因為某一堿基序列發生了突變，使之缺失或形成某一限制性內切酶的識別位點，通過PCR結合限制片段長度多態性分析（PCR-RFLP），就可以從基因的水平對遺傳性疾病進行分析。例如，血友病甲是一種常見的遺傳性出血性疾病，患者體內缺乏凝血因子FVIII這是由于基因第14個外顯子的第336位氨基酸的編碼基因發生了突變，產生了一個新的PstI酶切點，因此可以使用PCR-RFLP對血友病進行診斷。PCR還可以用來檢測遺傳性耳聾和Leber遺傳性視神經病。

[2]在腫瘤研究中的應用：PCR已日益廣泛應用于腫瘤的病因與發病機理研究以及腫瘤診斷與治療的研究中。例如，差異顯示PCR技術能針對不同腫瘤尋找其特異而敏感的標志物，并用于腫瘤早期診斷、判斷預后及療效評估。另一方面，在使用普通放療、化療的同時可結合定量PCR技術檢測微小殘留病灶，以進一步改進治療方案。此外，由于癌癥的發生在一定意義上是單個細胞分子發生變化，因而可以使用單細胞PCR技術對癌癥的發病機理進行研究。[3]在基因分型中的應用：當進行器官移植時并須先組織配型工作，此時常應用序列特異性寡核苷酸多態性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）對人類白細胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）進行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段長度多態性也可以用于對HLA的分型。3．3.在法醫學中的應用[3]

例如：最早應用DNA限制性片段長度多態性結合PCR-RFLP來進行法醫學個體識別和親子鑒定。目前發現在真核生物基因組編碼和非編碼序列中的短串聯重復序列的重復次數在個體間存在著差異，因此可以使用短串聯重復PCR技術對其進行分析。使用PCR技術進行法醫鑒定的優點是樣品用量小并且適于對高度降解材料的檢測。除剛才提到的之外，可變數目串聯重復序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法醫學個體識別和親子鑒定。所以，綜上所述，PCR的確是一種分子生物學研究的基礎技術。在它30多年的發展中衍生出了諸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突變PCR和定量PCR等十幾種不同的技術方法。PCR技術可以為基因工程提供目的基因，并廣泛地應用于個體識別、親子鑒定、免疫配型、疾病診斷等方面。可以說，PCR已經滲透到了生命科學的各個領域。21世紀是生物工程的世紀。我相信，在今后的發展中PCR技術會不斷地得到擴充和完善，PCR技術也將4.相關檢測技術 4.1.技術原理

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。實驗中發現，DNA在高溫下也能發生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。發現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床。4.2.工作原理

類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR 擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍 4.3.工作步驟

標準的PCR過程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2.退火（25℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度 5.研究方案

醫學檢驗大致可分為形態學、生物化學、血清免疫學和分子生物學幾大類，其分別代表幾代實驗診斷技術。60年代DNA雙螺旋結構及半保留復制模式的出現，70年代基因重組及體外基因克隆技術、分子雜交技術的應用使分子生物學在疾病診斷中得到了長足的發展。特別是1985年Mullis發明了聚合酶鏈式反應（PCR）技術，使醫學界真正興起了基因診斷技術熱，成為現代醫學發展的又一里程碑。用于臨床檢驗的PCR技術與經典的PCR反應在操作上稍有區別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對DNA純化有限，但適應臨床微量、快速的特點。另外PCR反應體系中各組成成份往往都預分裝到反應管中，既減少操作者的工作強度而且也減少了污染的機會，具有極高的使用價值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創性意義。這些改進都不影響PCR效果，同樣表現出高特異性、高敏感性、簡便快捷等PCR最優秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優生優育、法醫學等廣泛領域中有相當高的實際應用價值。5.1研究方法

① 早期診斷，因為PCR擴增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。

② 對低持續感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內的病毒長期低復制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。

③ 療效跟蹤及病程判斷，因為PCR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數量多少的最直接指標。在治療過程中通過監測血清或白細胞中病毒基因存在與否及其動態變化即能準確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗的方法主要是ELISA法測定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時血清中抗體的出現及動態變化與病人病情無線性相關關系。RT－PCR技術使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉錄為cDNA（RT）后再進行PCR擴增，這種技術稱之為逆轉錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內復制的動態狀況。RNA純化要求嚴格，是RT－PCR的技術關鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對樣本中的RNA進行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉錄酶，如AMV/MLV逆轉錄酶，高溫逆轉錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實現單管單酶單人份的擴增要求，這樣就在不降低擴增敏感性的條件下，一步完成擴增，不僅簡化操作，而且又減少污染，提高檢測的準確性。國內本公司已采用這種技術推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長期存在于血清中。在PCR檢測時，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經口－口途經傳播并定位于胃粘膜上皮細胞，早期表現為淺表性胃炎，可發展成為胃潰瘍。我國胃炎發病率之高估計比乙型肝炎更嚴重，對HP的檢測應受到廣大醫務工作者的重視。對HP的檢測可以用生化法測試尿素酶或用免疫法測試血清中對HP特異性抗體，也可對胃液、胃粘膜樣本進行細菌培養及菌種鑒定。PCR法檢測HP非常敏感且特異性高，有研究發現可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP.PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，5.2.技術路線

PCR技術

聚合酶鏈式反應技術（PCR）是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的方法。具有特異性強、敏感性高、快速、簡便、可擴增RNA或cDNA、對起始材料質量要求低等優點。5.3.所用儀器與材料

引物: PCR產物的特異性主要取決于引物鏈的特異性。由于存在同源序列，隨意設計的引物鏈，其PCR產物在電泳分析時可能出現多條鏈，因此在設計引物鏈時應充分考慮引物特異性。引物長度一般為15-30個堿基,G+C含量為40-60%,濃度0.1-1umol/L。TaqDNA聚合酶：濃度為1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶單位用量增長可能導致非特異DNA擴增。模板DNA：應避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑及能結合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制備方法有加熱法、凍溶法、超聲波粉碎法、堿變性法、SDS裂解法等多種。

4×dNTPs ： dNTP儲存液pH應為7.0，在反應體系中，4種dNTP的濃度應相同，每種dNTP的濃度以50-200 umol/L為宜。緩沖液及其他成份：PCR反應體系中，一般采用Tris-HCl緩沖液。適宜的Mg2+濃度為高于dNTP總濃度0.2-2.5 mmol/L。

6．研究內容

PCR技術的出現對法醫學的發展也有不可低估的作用。在法醫物證如血斑、毛發、組織碎片等的確證，DAN多態性分析遠比血清學或等方法確實可靠。早期DNA多態性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個內含子中的串聯重復序列作探針，從人的基因庫中篩選出小衛量DNA，使用阿交法產生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術成功地應用于個人識別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當樣本DNA數量不足時或DAN嚴重降解則不能正常檢出。且雜交技術常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護措施。PCR技術的出現，可以對極少量物證如一根毛發、一滴血液、極小精斑都可以進行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構成的串聯重復DNA序列，具有單位點特征的稱為VNTR結構，多位點串聯成為衛星DNA。6．1.檢測對象

常見的傳染性疾病有細菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環、泌尿生殖等不同系統相應的病變。消化系統感染性疾病在我國具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國是乙肝高發區，乙肝病人為世界乙肝病人總數的50％。[4]乙肝病毒經血液傳播，病毒主要在肝細胞中增殖，也可以長期存留在骨髓細胞或外周血白細胞中。通常用PCR法檢測血清中的乙肝病毒。有報道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細胞中檢出乙肝病毒，這些發現提示其它傳染途經存在的可能 6．2檢測內容

PCR反應混合物經過循環擴增后，所需做的工作就是檢測反應液中是否存在預期擴增產物及產物的特異性。目前已經發展了許多檢測分析PCR擴增產物的方法。包括凝膠電泳、高壓液相色譜、核酸探針雜交、探針捕獲酶免疫分析、酶切圖譜分析、單鏈構型多態性分析、核酸序列分析。

PCR技術類型[5]

免疫PCR技術 原位PCR技術 不對稱PCR技術 巢式PCR技術 反向PCR技術 逆轉錄PCR技術

復合PCR技術

彩色PCR技術

抗原捕獲PCR技術 增敏PCR技術

酶標PCR技術

二溫式PCR技術

錨定PCR技術

定量PCR技術

毛細管PCR技術

多重PCR技術

巢式或套式PCR技術 7.預期目標PCR 技術在大腸桿菌O157: H7檢測中

（1)簡單PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段為基礎設計了一對引物,擴增產物為633bp的DNA片段。其退火溫度為60℃－63℃, 應用煮沸法與基因釋放法,大腸桿菌O157: H7檢出限分別為25與38CFU/ml,檢測時間為3h。Thomas等用PCR擴增了slt基因片段。引物： 正鏈5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3', 反鏈5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’

其PCR產物由凝膠電泳測定,檢測時間為ld。

徐建國等根據O157: H7 特有的hlyA、B基因序列設計了PCR引物,產物為338bp。

PCR技術在大腸桿菌O157: H7檢測中（2）多重PCR:由于鑒定O157: H7血清型不能僅僅依靠簡單PCR,近年來國外學者對多重PCR方法在大腸桿菌O157: H7的診斷價值方面進行了研究。Meng等同時擴增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其長度分別為633、210、484bp。此引物設計可有效區別O157: H7血清型與O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一個單一反應中同時擴增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa質粒保守序列,其產物分別為1087、227、224、166bp。嚴笠選用針對大腸桿菌O157: H7志賀樣毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三對引物,在同一擴增體系中進行PCR,檢測12株不同來源的O157: H7大腸桿菌及其它致病性大腸桿菌及沙門菌、志賀菌15株。結果復合PCR方法較單一PCR方法具有較高的特異性，12株O157: H7取得了穩定、可靠的陽性結果。能迅速、有效地與其它致病性大腸桿菌及沙門氏菌、志賀菌相鑒別。

PCR技術在大腸桿菌O157: H7檢測中的應用（3）原位PCR: kurokawa等不用培養過程,直接用原位PCR技術結合落射顯微鏡,在單細胞水平快速檢測O157: H7。

4.23SrRNA在大腸桿菌O157: H7分型、檢測中

傳統的細菌分類方法主要依賴于細菌的形態學、代謝產物、酶活性和表面抗原等特征。隨著現代分子生物學理論和技術的迅速發展，微生物檢測進入了基因時代，以核糖體核糖核酸序列為基礎的分類方法為微生物的鑒別提供了新的分子生物學方法。[6]如16srRNA、23srRNA、16-23srRNA區間序列分析等等，它完全不同于傳統方法，具有快速、簡便、敏感和特異等優點。

參考文獻

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[2] 徐煥賓,賁昆龍,曾濤,李勁光;檢測HIV-1載量的熒光實時定量PCR技術的建立及其應用[J];中國病毒學;2001年02期

[3] 顧鳴，韓偉.復合PCR鑒定沙門菌的方法.中國衛生檢驗雜志[J]，2003，13(2):154-157 [4] 冉陸.腸出血性大腸埃希菌(EHEC)流行趨勢.中國食品衛生雜志[J]，1999，3:31-35 [5] 石嵐;實時定量PCR檢測IgH基因重排的研究[D];昆明醫學院;2004年 [6] 王穎.食品安全學技能訓練.2010.10

第四篇：PCR技術原理及心得.

PCR技術原理與心得體會

PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內,有些最好于當日電泳檢測,大于48h 后帶型不規則甚致消失。

一.假陰性,不出現擴增條帶

PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備,②引物的質量與特異性,③酶的質量及活性 ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板:①模板中含有雜蛋白質,②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質沒有消化除凈,特別是染色體中的組蛋白,④在提取制備模板時丟失過多,或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時,不出現擴增帶,極有可能是標本的消化處理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩定的消化處理液,其程序亦應固定不宜隨意更改。

酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物:引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴增,對策為:①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現,而且兩引物帶的亮度應大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導致引物變質降解失效。④引物設計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴增的特異性,濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變:通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul,應用多大體積進行PCR擴增,是根據科研和臨床檢測不同目的而設定,在做小體積如20ul后,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗。

物理原因:變性對PCR擴增來說相當重要,如變性溫度低,變性時間短,極有可能出現假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計,檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異:如靶序列發生突變或缺失,影響引物與模板特異性結合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列,其PCR擴增是不會成功的。

二.假陽性,出現非特異性擴增帶 1.假陽性

出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,有時其條帶更整齊,亮度更高。引物設計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行PCR 擴增時,擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個基因組或大片段的交叉污染,導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:①操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質外,所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片

段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,與引物互補后,可擴增出PCR產物,而導致假陽性的產生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。

2.出現非特異性擴增帶

PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現,其原因:一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR 循環次數過多有關。其次是酶的質和量,往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現,酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有:①必要時重新設計引物。②減低酶量或調換另一來源的酶。③降低引物量,適當增加模板量,減少循環次數。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸。

3.出現片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多引起。其對策有:①減少酶量,或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃度。④增加模板量,減少循環次數。

三.PCR污染與對策

PCR反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性,但令人頭痛 的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽性的產生。污染原因

(一標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染,或標本放置時,由于密封不嚴溢于容器外,或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中,由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散,導致彼此間的污染。

(二PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三PCR擴增產物污染:這是PCR反應中最主要最常見的污染問題,因為PCR產物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml,遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限,所以極微量的PCR產物 污染,就可造成假陽就可形成假陽性。

還有一種容易忽視,最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠,在操作時比較劇烈地搖動反應管,開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝,因而由 其造成的污染是一個值得特別重視的問題.(四實驗室中克隆質粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室,這個問題也比較常見。因為克隆質粒在單位容積內含量相當高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細胞內的質粒,由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力,其污染可能性也很大。污染的監測

一個好的實驗室,要時刻注意污染的監測,考慮有無污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。

四.對照試驗

1.陽性對照:在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照,它是PCR反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好,經各種鑒定是該產物的標本,如以重組質粒為陽性對照,其含量宜低不宜高(100個拷貝以下,但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽性標本,其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經自己使用穩定,檢驗人員心中有數時,在以后的實驗中可免設陽性對照。

2.陰性對照:每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。②試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增,以監測試劑是否污染。

3.重復性試驗

4.選擇不同區域的引物進行PCR擴增 五.防止污染的方法

(一合理分隔實驗室:將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環擴增及PCR產物的鑒定等步驟分區或分室進行,特別注意樣本處理及PCR產物的鑒定應與其它步驟嚴格分開。最好能劃分①標本處理區;②PCR反應液制備區;③PCR循環擴增區;④PCR產物鑒定區。其實驗用品及吸樣槍應專用,實驗前應將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。

(二吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源,因而加樣或吸取模板

核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免 交叉污染或產生氣溶膠污染。(三預混和分裝 PCR 試劑:所有的 PCR 試劑都應小量分裝，如有可能，PCR 反應液應預先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復加樣次數，避免污染機會。另外，PCR 試劑，PCR 反應液應與樣品及 PCR 產物分開保存，不應放于同一冰盒或同一冰箱。(四防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使 用。(五設立適當的陽性對照和陰性對照，陽性對照以能出現擴增條帶的最 低量的標準病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一 管不加模板的試劑對照及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。(六減少 PCR 循環次數，只要 PCR 產物達到檢測水平就適可而止。(七選擇質量好的 Eppendorf 管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內液體濺出。呵呵 其實 DNA（或 RNA）的提取方法及 DNA 的質量也很關鍵 例如：SDS 法和 CTAB 法提取的 DNA 與 RNA 的 PCR 結果有很大的差異的。呵呵。

第五篇：PCR實驗中的幾點體會

PCR實驗中的幾點體會

PCR實驗是一項對儀器設備、環境設施及操作步驟要求非常嚴格的實驗，實驗過程中檢測目的成份會被擴增放大到千百萬倍。因而實驗過程中很小的一點誤差、非常微量的污染都可能導致結果錯誤甚至實驗失敗。我們在實際工作中，從環境控制到儀器維護及工作流程的每一步做到嚴格要求細致入微，樣本檢測、室內質控及室間質評都取得了滿意成績，在此次PCR實驗室復審中得到專家老師的肯定，現將我們在工作中認為需地注意的地方提出來，以供商榷：

一、環境控制 為控制溫度而使用空調時必須特別注意避免污染。我們的做法是清潔空調過濾網，待干，紫外線消毒30分鐘，正反面相同。開機之前用1：100“84”消毒液浸濕的紗布包住出風口，運行30分鐘，使吸附空調機內的灰塵。

二、試劑配制

所有的試劑都盡可能平衡到室溫后再使用。HBV-DNA檢測中的濃縮液及質控物，融化后定量分裝離心管中，一次用不完的凍存到下次使用，避免反復凍融。

三、樣本制備

吸取上清液 吸頭不要接觸到離心管內壁，盡量在離心管中央，懸停在液面下隨液面下降而逐漸下移，盡量吸凈上清液。

沉淀處理 HBV-DNA濃縮過程中的沉淀，用振蕩器很難完全分散也可能影響核酸的提取，導致測定結果偏低。我們的做法是用一只小鑷子輕敲離心管底部使沉淀盡可能分散，充分混勻，然后點離一下。

提取 提取液是一種混懸液，易沉淀，加取過程中要不斷抽吸混勻。加樣 核酸的提取液2ul加入反應管中，這一步移液器使用非常關鍵。首先保證移液器和吸頭是配套的，再就是吸頭是垂直于液面吸取樣本，移液時用力要均勻，盡可能一次性移出全部樣本。2ul移液器校正困難，當標準曲線線性關系不好時，可以考慮是否是移液器使用時間過久，應該及時更換。

四、擴增分析 擴增儀最好先預熱一下，再使用。擴增開始后應注意觀察溫度曲線。不符合溫度變化規律的曲線如升溫曲線變得平坦提示儀器部分或全部加熱模塊功能損壞，從而導致結果錯誤。在結果判定時應注意分析擴增曲線，曲線出現倒“S”形，常提示病毒含量較高，必須稀釋后復查。