第一篇：《生物制藥技術》實驗

《生物制藥技術》實驗指導

實驗一 金霉素鏈霉菌培養基的制備（驗證型）

實驗目的：

1、學會培養基的配制

2、掌握滅菌方法。實驗原理：

金霉素鏈霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦稱“金色鏈霉菌”，放線菌門(Actinobacteria)，放線菌綱(Actinobacteria)，放線菌目(Actinomycetales)，鏈霉菌科(Streptomycetaceae)，鏈霉菌屬(Streptomyces)。在固體培養基上產生金色色素，故名。其菌落為草帽型, 菌落直徑一般為3～5毫米, 表面較平坦, 中間有隆起。菌落開始為白色，長孢子后變青色。在顯微鏡下可以看到短桿狀的菌絲?？咕毓I上用以生產金霉素。

放線菌是一類介于細菌與真菌之間的單細胞微生物。放線菌在土壤中分布最多，大多數生活在含水量較低、有機質豐富和微堿性的土壤中。多數情況下，泥土中散發出的“泥腥味”就是由放線菌中鏈霉菌產生的土腥素造成的。放線菌大都好氧，屬于化能異養，菌絲纖細，分枝，常從一個中心向周圍輻射生長。因其生長具輻射狀，故名放線菌。放線菌能像真菌那樣形成分枝菌絲，并在菌絲末端產生外生的分生孢子，有些種類甚至形成孢子囊，因而曾被誤認是真菌。但其菌落較小而致密，不易挑取。不少菌種在醫藥、農業和工業上廣泛應用，可產生抗菌素，現已發現和分離出的由放線菌產生的抗生素多達4 000多種，其中，有50多種抗生素已經廣泛地得到應用，如鏈霉素、紅霉素、土霉素、四環素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于臨床治療人的多種疾病；有些可生產蛋白酶、葡萄糖異構酶；有的用于農業生產，如滅瘟素、井岡霉素、慶豐霉素等。

四環素類抗生素是由鏈霉菌生產或經半合成制取的一類廣譜抗生素?？咕V極廣，包括革蘭氏陽性和陰性菌、立克次體、衣原體、支原體和螺旋體。品種主要包括金霉素、四環素和土霉素。器材：

1ml移液槍；鋁鍋；電爐 試劑：

NaBr母液（100 g／L）KCl母液（100 g／L）

M-促進劑母液（2.5 g／L）實驗步驟： 1．種子培養基

種子培養基(g／L)：可溶性淀粉40，黃豆餅粉20，酵母粉5，蛋白胨5，CaCO3 4，(NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，KH2PO4 0.25。

先稱取黃豆餅粉20g，單獨煮沸10分鐘，加入少量涼水降溫，4層紗布壓榨取汁，與其它稱好的各成分混合，定容至1L。

每50ml分裝到250ml三角瓶中，每組2瓶。2．定向發酵培養基

發酵培養基(g／L)：可溶性淀粉100，黃豆餅粉40，蛋白胨15，CaCO3 5，酵母粉2.5，(NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，α—淀粉酶0.1。

配制方法同種子培養基，配好后分裝到500ml三角瓶中，每瓶100ml，分別加入如下成分，比較它們對四環素產量的影響：

(1)對照(不加其他成分)；

(2)加入NaBr母液至終濃度為2g／L；(3)加入KCl母液至終濃度為2g／L；

(4)加入NaBr母液至終濃度為2g／L及M-促進劑母液至終濃度為0.025g／L。每兩組配一套。3．滅菌

將封好口的培養基121℃滅菌30min。同時滅1ml 剪口移液槍頭、1.5mL離心管。（總過程：稱量——溶化——定容——分裝——封口——滅菌）注意事項：

1．黃豆餅粉煮沸取汁。

2．培養基封口最好用8層紗布或棉花塞，最好不用橡膠塞，以增加透氣性。3．滅菌時鍋內要補足水分。由于滅菌鍋較大，升溫排氣一定要充分（10min）。補充閱讀：

工業發酵中利用生產菌發酵得出最終產物是一個逐級放大的過程，各個不同的階段對于營養成分的要求也各有特點，根據發酵不同階段的要求，培養基可分為孢子培養基、種子培養基和發酵培養基三種。

孢子培養基孢子培養基是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培養基，對這種培養基的要求是能使菌體迅速生長，產生較多優質的孢子，并要求這種培養基不易引起菌種發生變異。所以對孢子培養基的基本配制要求是：第一，營養不要太豐富（特別是有機氮源），否則不易產孢子。如灰色鏈霉在葡萄糖－硝酸鹽－其它鹽類的培養基上都能很好地生長和產孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只長菌絲而不長孢子。第二，所用無機鹽的濃度要適量，不然也會影響孢子量和孢子顏色。第三，要注意孢子培養基的pH和濕度。生產上常用的孢子培養基有：麩皮培養基、小米培養基、大米培養基、玉米碎屑培養基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食鹽等配制成的瓊脂斜面培養基。大米和小米常用作霉菌孢子培養基，因為它們含氮量少，疏松、表面積大，所以是較好孢子培養基。

種子培養基種子培養基是供孢子發芽、生長和大量繁殖菌絲體，并使菌體長得粗壯，成為活力強的“種子”。所以種子培養基的營養成分要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也要高些，但總濃度以略稀薄為好，這樣可達到較高的溶解氧，供大量菌體生長繁殖。種子培養基的成分要考慮在微生物代謝過程中能維持穩定的pH，其組成還要根據不同菌種的生理特征而定。一般種子培養基都用營養豐富而完全的天然有機氮源，因為有些氨基酸能刺激孢子發芽。但無機氮源容易利用，有利于菌體迅速生長，所以在種子培養基中常包括有機及無機氮源。最后一級的種子培養基的成分最好能較接近發酵培養基，這樣可使種子進入發酵培養基后能迅速適應，快速生長。

發酵培養基發酵培養基是供菌種生長、繁殖和合成產物之用。它既要使種子接種后能迅速生長，達到一定的菌絲濃度，又要使長好的菌體能迅速合成需產物。因此，發酵培養基的組成除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有產物所需的特定元素、前體和促進劑等。但若因生長和生物合成產物需要的總的碳源、氮源、磷源等的濃度太高，或生長和合成兩階段各需的最佳條件要求不同時，則可考慮培養基用分批補料來加以滿足。

實驗二 金霉素鏈霉菌的定向發酵（驗證型）

實驗目的：

1、學習和掌握無菌操作技術。

2、掌握定向發酵四環素的原理。實驗原理：

定向發酵是指通過改變培養基組分(加入某些物質)改變微生物代謝途徑，使發酵按主觀要求產生較多的產物。

金霉素、四環素和土霉素，它們的化學結構極為相似：

R1 R2 Cl H H OH H H

金霉菌原是產生金霉素（Chlortetracycline）的菌種，但因金霉素比四環素只多一個氯離子，所以只要在發酵液中加入某些物質，阻止氯離子進入四環素分子，從而使菌種產生較多的四環素。另外，金色鏈霉菌在30℃以下時，合成金霉素的能力較強；當溫度超過35℃時則只合成四環素。

本實驗中，利用溴離子在生物合成過程中對氯離子有競爭性抑制劑作用的原理，以及加入2-硫醇基苯并噻唑(即M—促進劑，分子式：C7H5NS2，通常作為橡膠硫化促進劑)抑制氯化酶的作用，從而增加四環素的產量。材料和試劑：

金霉素鏈霉菌：購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（菌種保藏號：CGMCC4.1043；訂單號20111133 550元）。實驗步驟：

前期準備工作：配制斜面培養基（可選，1號培養基由菌種保藏中心提供）

1、麩皮36.0 g，K2HPO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，（NH4）2HPO4 3 g，瓊脂 15～20 g，定容至1L，pH 7。

2、可溶性淀粉20g，KN O3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl

0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，定容至1L，pH 7.2~7.5。

1、制備斜面孢子：將保藏的菌種的比例接種于液體培養基中（不加瓊脂的斜面培養基），28℃下200 r/min振蕩培養，將活化1d后的金霉素鏈霉菌種接入斜面培養基，28℃培養5～7天，金霉素 土霉素 四環素

待孢子長成灰色，于4℃冰箱中保藏。

2、種子培養：在斜面上用接種鏟挑取1cm2左右生長良好的菌體接入裝有50ml四環素種子培養基的250ml錐形瓶中，230 r/min、28℃下振蕩培養20～24h。

3、發酵培養：以剪口移液槍頭取10 ml種子液接入裝有100ml發酵培養液的500ml錐形瓶中（注意：同一處理組用同一瓶種子液接種），230 r/min、28℃下振蕩培養5 d。用于后面的測定效價和薄層層析實驗。

四環素的提取和精制（選作）

一、實驗目的 ．掌握沉淀法精制四環素的原理、方法和基本操作技術。2 ．熟悉pH 的控制與產量、質最的關系。

二、實驗原理

四環素為兩性化合物，其等電點為5.4。當溶液pH 等于等電點時，四環素呈游離堿形式，從水溶液中沉淀出來。利用四環素的這一性質，可將四環素從發酵液中提取出來。

在連續結晶過程中，pH 的高低對產量、質量都有一定的影響。四環素的等電點為5.4 , 在pH 4.5~7.5 之間，游離堿在水中的溶解度乎不變。若pH 控制在接近等電點時，沉淀結品雖然比較完全，收率也高，但此時會有大量雜質同時析出，影響產品的色澤和質量；若pH控制得較低一些，對提高產品質量雖有好處，但沉淀結晶不夠完全，收率會低些，影響產量。因此，在選擇沉淀結晶pH 時，就必須同時考慮到產量、質量的效果。在正常情況下，工藝上控制pH4.8左右。若沉淀結晶質量較差，pH可控制得稍低些，有利于結晶質量的改善，但不能低于4.5，否則收率低，影響產量。

四環素的提取和精制分酸化、純化、過濾、結晶和淋洗五個步驟。

(1)酸化加入草酸，使積聚在菌絲體內的四環素盡可能多地成為可溶性鹽，而轉入液相。四環素在酸性條件下較隱定，且草酸與鈣離子反應生成不溶性的草酸鈣，析出的草酸鈣能促進蛋白質的凝固，提高濾液的純度和過濾速度。

(2）純化 純化劑（黃血鹽、硫酸鋅和硼砂）與草酸一起混合作用，可以除去發酵液中大量酸溶性蛋白質、鐵離子和其他多種離子色素以及其他雜質，從而使濾液純凈，并減少發酵液的粘度，利于過濾。其中純化劑黃血鹽能與發酵液中的鐵離子作用，生成普魯士鹽而除去鐵離子。

(3）過濾 通過過濾，使四環素溶液與菌絲體以及其他雜質分離，再經過復濾、精濾，進一步提高濾液質址，得到澄清的濾液。

(4)結晶

將濾液的pH調節到等電點，在較低溫度下析出純凈的四環素。

(5）淋洗 雖然發酵液經酸化后大部分四環素已溶入溶液中，但仍有部分殘存在菌渣中，且過濾不可能十分徹底。所以用酸水淋洗，以提高收率。

三、實驗試劑及儀器 1．試劑

300 g/L草酸溶液、200 g/L 黃血酸鉀溶液、200 g/L 硫酸鋅溶液、200 g/L 硼砂溶液、濃氮水、3 g/L草酸溶液。2．儀器

1000 mL 燒杯、攪拌器、布氏漏斗、抽濾瓶、濾紙、量筒、pH 試紙、酸度計、溫度計、水泵、表面皿。

四、實驗步驟 1．酸化

取600ml 四環素發酵液，置裝有機械攪拌的1000 mL燒杯中，開始攪拌，待發酵液溫度降至20 ℃ 以下時，緩緩加入草酸溶液，草酸加入量為27～35g/L，并不時測定發酵液的pH。當發酵液pH為1.7~1.8 時（用酸度計測定），酸化完畢。2．純化

在酸化反應的燒壞中，按酸化的發酵液凈體積，攪拌下依次緩慢加入純化劑（黃血酸鉀溶液、硫酸鋅溶液、硼砂溶液），每種溶液終濃度均為2 g/L，加入時間間隔15min，以便作用完全。3．過濾

將布氏漏斗裝于抽濾瓶上，鋪好濾紙，開啟水泵，用少量水將濾紙濕潤，并使濾紙緊貼布氏漏斗。將純化后的溶液緩緩倒入布氏漏斗，過濾濾液應完全澄清，否則必須重新過濾，直到完全澄清。4.結晶

將抽濾瓶中的濾液倒入裝有機械攪拌的1000 mL燒杯中，開動攪拌，并用水或冰水冷卻。待濾液溫度冷至5 ～ 7 ℃ 時，徐徐加入經過濾的濃氨水，并隨時用pH 試紙測定溶液的pH，當pH 達到4.6 ～4.8 時（用酸度計測定），停止加入氨水，并繼續攪拌2 h，使結晶完全。

裝好布氏漏斗后，將上述液緩緩倒人布氏漏斗，過濾。結晶液全部倒入后，抽干。用35～45 ℃ 的熱水充分洗滌粗堿3 次，抽干，再用0.3 ％草酸洗滌，抽干。

五、注意事項

1．純化攪拌時間不應少于2h，溶液溫度保持在15 ℃ 以下。2．pH 要調準確。

六、結果與討論 ．計算四環素的得率。．討論影響四環素得率和純度的因素。

實驗三 四環素、金霉素的薄層層析鑒定（驗證型）

實驗目的：

掌握薄層層析的原理，四環素族抗生素的定性鑒定方法。實驗原理：

層析（色譜，chromatograpby）是相當重要、且相當常見的一種技術，在把微細分散的固體或是附著于固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動相的系統中（根據移動相種類的不同，分為液相層析和氣相層析二種），使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態邊移動，利用各成分對固定相親和力不同所引起的移動速度差，將它們彼此分離開的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。用作固定相的有硅膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土和纖維素那樣的無活性的載體上附著適當的液體。將作為固定相的微細粉末狀物質裝入細長形圓筒中進行的層析稱為柱層析（column chromatography），在玻璃板上涂上一層薄而均的支持物（硅膠、纖維素和淀粉等）作為固定相的稱為薄層層析（thin layer chromatography），或者用濾紙作為固定相的紙上層析。層析根據固定相與溶質（試料）間親和力的差異分為吸附型、分配型、離子交換型層析等類型。但這并不是很嚴格的，有時常見到其中間類型。此外，近來 5 也應用親和層析，即將與基質類似的化合物（通常為共價鍵）結合到固定相上，再利用其特異的親和性沉淀與其對應的特定的酶或蛋白質。

分配層析在支持物上形成部分互溶的兩相系統。一般是水相和有機溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和淀粉等親水物質，這些物質能儲留相當量的水。被分離物質在兩相中都能溶解，但分配系數不同，展層時就會形成以不同速度向前移動的區帶。一種溶質在兩種互不混溶的溶劑系統中分配時，在一定溫度下達到平衡后，溶質在固定相和流動相溶劑中的濃度之比為一常數，稱為分配系數。當欲被分離的各種物質在固定相和流動相中的分配系數不同時，它們就能被分離開。分配系數大的移動快（阻力?。?。

薄層層析是以薄層材料為支持物，在密閉容器中，樣品在其上展開。當斑點不易為肉眼觀察時，可利用適當的顯色劑，或通過紫外燈下產生熒光的方法進行觀察。通過這種展開操作，各成分呈斑點狀移動到各自的位置上，再根據Rf值的測定進行鑒定。薄層色譜法具有分離與鑒定的雙重功能，通過薄層圖譜與對照品的圖譜相比較，除了能鑒出有效成分或特征成分外，還以完整的色譜圖作為一個整體對制劑加以鑒別。薄層色譜分析法由于簡便、快速，能有效地、直觀地反映藥品地真實性、穩定性，現已成為藥物制劑的鑒別和質量控制的行之有效的方法之一。薄層層析是鑒別抗生素的方法之一，層析后進行顯色，并繪制層析圖譜，根據層析圖譜對抗生素進行鑒定。本實驗以四環素、金霉素標準品溶液作為對照對發酵液進行鑒定。

儀器和設備：

1.玻璃層析缸

2.層析板（薄層層析硅膠煙臺芝罘區黃務硅膠開發實驗廠有售）3.毛細玻璃管或微量注射器 4.紫外投射儀 試劑：

四環素、金霉素標準品 用0.01M鹽酸溶解定容，4℃冰箱保存（可使用7天）。展開劑：正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)2L。凡士林 實驗步驟：

1．層析板處理

層析板105℃烘烤過夜，均勻噴上0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PH4.5)，于空氣中晾干、備用。

2．點樣

選取兩種定向發酵液加草酸酸化至pH為1.5～2.0，取上清約l.2 ml于1.5ml離心管中，10000 rpm，5min，備用。在距層析板底邊2.5~3 cm起始線上(用鉛筆劃線，做出點樣點記號)，用毛細玻璃管在薄層層析板上點四環素標準品和金霉素標準品溶液3次，發酵液上清點8～10次，點樣點不大于0.4cm，每次都要吹干后再點。（一般效價在1000u／ml以上點3次，500～1000u／ml點4次，200～500u／ml點5次）。剩余的發酵液上清于4℃冰箱保存。

3.層析（展開）

用正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)的上相作展開劑。層析前需預先用展開劑預平衡層析缸，可在缸中倒入2cm高的展開劑，密閉，一般保持15－30分鐘。然后將層析板置于盛有展開劑的層析缸中，在室溫下展層6～8h（與溫度有關）。封口不嚴可涂抹凡士林。

4．熒光顯影

待溶劑前沿展至板的一半以上時將層析板取出，標出溶劑前沿，于通風櫥中晾干，用氨水熏數秒鐘后即可在紫外燈下顯影，畫出黃色斑點，分別算出Rf值。（四環素標準品慢和金霉素標準品快）

無水四環素在波長365nm下顯黃色熒光，根據與標準對照可定性測定。注意事項：

因四環素能和鈣鹽形成不溶性化合物，故發酵液中的四環素濃度不高，預處理時通常用草酸將發酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四環素盡量溶解。

點樣時必須注意勿損傷薄層表面。要控制好點樣量，樣品太少，斑點不清楚，難以觀察，但樣品量太多時往往出現斑點太大或拖尾現象。

若因樣品溶液太稀，可重復點樣，但應待前次點樣的溶劑揮發后方可重新點樣，以防樣點過大，造成拖尾、擴散等現象，而影響分離效果。

作展開劑中極少量強極性溶劑(0.5％)或pH值的改變可顯著改善拖尾現象。

實驗四 四環素的效價測定（綜合型）

實驗目的：

1、了解抗生素效價的表示方法

2、學習抗生素的測定方法 實驗原理：

實驗利用比色法測定四環素和金霉素的效價。效價(titer或titre)是評價抗生素效能的標準，它代表抗生素對微生物的抗菌效力，也是衡量發酵液中抗生素含量的尺度，人們以1μg金霉素或四環素標準品為1個單位，0.6μg青霉素G鈉鹽為1個單位。

四環素和金霉素在酸性條件下，加熱，可產生黃色的脫水金霉素和脫水四環素，其色度與含量成正比。

在堿性條件下，四環素較穩定，而金霉素則生成無色的異金霉素：

根據上述原理，可以在酸性條件下，利用比色法測定四環素、金霉素混合液的總效價；而四環素效價的測定可在堿性條件下，使金霉素生成無色的異金霉素，然后再在酸性條件下，使四環素生成黃色的脫水四環素，經比色測得四環素效價?？傂r與四環素效價二者之差即為金霉素的效價。本實驗只測定四環素的效價。

因四環素能和鈣鹽形成不溶性化合物，故發酵液中的四環素濃度不高，預處理時通常用草酸將發酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四環素盡量溶解。發酵液中，由于雜質的干擾，將影響比色的正確性，因此加入乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)作為螯合劑，掩飾金屬離子的干擾，改變四環素脫水條件(降低酸度或延長加熱時間)，可以減少雜質對比色反應的干擾。實驗步驟：

取上述保存的處理發酵液上清l ml(效價約為1000U／m1)于50ml容量瓶中，加入lml濃度為lg／l00ml EDTA溶液，加蒸餾水9ml，再加入lml濃度為3mol／L的NaOH，在20~25℃下保溫15min后，加入2.5ml濃度為6mol／L的HCl，煮沸15min后，冷卻，稀釋至刻度，在分光光度計上于440nm處測定其吸光度值。（紫外為100-390nm；可見光為380-780nm，根據波長選擇石英比色池或玻璃比色池，否則玻璃對于紫外光有吸收）

對照樣品（不加誘導劑）的前處理方法與上述步驟一樣，只是在加入HCl后，不加熱，稀釋至刻度，作為測定樣品的空白對照, 調零。

四環素標準品（1000U/ml）取1ml于50ml容量瓶中，加1ml濃度為6mol／L的HCl，水浴煮沸15min后，冷卻，稀釋至50ml，380nm測吸光度。（以蒸餾水作為空白測定）

以定向發酵培養基中的對照組作為空白對照，測定其它三個處理組的吸光度。（有時可能因對照組處理不當而使其它組的讀數為負值，這時可以以蒸餾水作為空白。）

計算公式：

發酵液中四環素的效價=

A發酵 A四環素標準

×四環素標準品的效價

第二篇：《生物制藥技術》實驗指導-實驗一

《生物制藥技術》實驗指導

實驗一 金霉素鏈霉菌培養基的制備（驗證型）

實驗目的：

1、學會培養基的配制

2、掌握滅菌方法。實驗原理：

金霉素鏈霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦稱“金色鏈霉菌”，放線菌門(Actinobacteria)，放線菌綱(Actinobacteria)，放線菌目(Actinomycetales)，鏈霉菌科(Streptomycetaceae)，鏈霉菌屬(Streptomyces)。在固體培養基上產生金色色素，故名。其菌落為草帽型, 菌落直徑一般為3～5毫米, 表面較平坦, 中間有隆起。菌落開始為白色，長孢子后變青色。在顯微鏡下可以看到短桿狀的菌絲?？咕毓I上用以生產金霉素。

放線菌是一類介于細菌與真菌之間的單細胞微生物。放線菌在土壤中分布最多，大多數生活在含水量較低、有機質豐富和微堿性的土壤中。多數情況下，泥土中散發出的“泥腥味”就是由放線菌中鏈霉菌產生的土腥素造成的。放線菌大都好氧，屬于化能異養，菌絲纖細，分枝，常從一個中心向周圍輻射生長。因其生長具輻射狀，故名放線菌。放線菌能像真菌那樣形成分枝菌絲，并在菌絲末端產生外生的分生孢子，有些種類甚至形成孢子囊，因而曾被誤認是真菌。但其菌落較小而致密，不易挑取。不少菌種在醫藥、農業和工業上廣泛應用，可產生抗菌素，現已發現和分離出的由放線菌產生的抗生素多達4 000多種，其中，有50多種抗生素已經廣泛地得到應用，如鏈霉素、紅霉素、土霉素、四環素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于臨床治療人的多種疾病；有些可生產蛋白酶、葡萄糖異構酶；有的用于農業生產，如滅瘟素、井岡霉素、慶豐霉素等。

四環素類抗生素是由鏈霉菌生產或經半合成制取的一類廣譜抗生素。抗菌譜極廣，包括革蘭氏陽性和陰性菌、立克次體、衣原體、支原體和螺旋體。品種主要包括金霉素、四環素和土霉素。四環素早在1948年即開始用于臨床，至今已有50余年歷史?，F在四環素已被收入中國藥典2005版，還被收入美國、英國、日本等許多國家的藥典。上世紀70～80年代四環素產銷處于全盛時期，我國有上百家企業生產，臨床用量很大。多年來由于四環素類的廣泛應用，臨床常見病原菌對金霉素耐藥現象嚴重。1950年，國外有報道四環素族藥物引起牙著色，病因是在牙的發育礦化期服用四環素族藥物，可被結合到牙組織內，使牙著色。四環素還可在母體通過胎盤引起乳牙著色。其后又后續報道四環素沉積于牙、骨骼以至指甲等，而且還能引起釉質發育不全。在這方面，國內直至70年代中期方引起注意。自20世紀80年代后期起，因細菌耐藥性增加以及新的抗生素大量上市等原因，四環素產銷逐漸萎縮，市場疲軟。因為副作用大，只外用，用于治療結膜炎、沙眼。材料、試劑和器材： 試劑：

NaBr母液（100 g／L）KCl母液（100 g／L）

M-促進劑母液（2.5 g／L）器材：

1ml移液槍；不銹鋼鍋；電爐；臺秤、天平其它物品：

蒸餾水、250ml三角瓶、500ml三角瓶、鑰匙、燒杯、玻璃棒、量筒、紗布、剪刀、棉花塞、報紙、線繩、皮筋、記號筆、1.5mL離心管、1ml移液槍頭、槍頭盒 實驗步驟： 1．種子培養基

種子培養基(g／L)：可溶性淀粉40，黃豆餅粉20，酵母粉5，蛋白胨5，CaCO3 4，(NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，KH2PO4 0.25。

先稱取黃豆餅粉20g，單獨煮沸10分鐘，加入少量涼水降溫，4層紗布壓榨取汁，與其它稱好的各成分混合，定容至1L。

每50ml分裝到250ml三角瓶中，每組2瓶。2．定向發酵培養基

發酵培養基(g／L)：可溶性淀粉100，黃豆餅粉40，蛋白胨15，CaCO3 5，(NH4)2SO4 3，酵母粉2.5，MgSO4·7H2O 0.25，α—淀粉酶0.1。

配制方法同種子培養基，配好后分裝到500ml三角瓶中，每瓶100ml，分別加入如下成分，比較它們對四環素產量的影響：

(1)對照(不加其他成分)；

(2)加入NaBr母液至終濃度為2g／L；(3)加入KCl母液至終濃度為2g／L；

(4)加入NaBr母液至終濃度為2g／L及M-促進劑母液至終濃度為0.025g／L。每兩組配一套。3．滅菌

將封好口的培養基121℃滅菌30min。同時滅1ml 剪口移液槍頭、1.5mL離心管。（總過程：稱量——溶化——定容——分裝——封口——滅菌）注意事項：

1．黃豆餅粉煮沸取汁。

2．培養基封口最好用8層紗布或棉花塞，最好不用橡膠塞，以增加透氣性。3．滅菌時鍋內要補足水分。由于滅菌鍋較大，升溫排氣一定要充分（10min）。補充閱讀：

工業發酵中利用生產菌發酵得出最終產物是一個逐級放大的過程，各個不同的階段對于營養成分的要求也各有特點，根據發酵不同階段的要求，培養基可分為孢子培養基、種子培養基和發酵培養基三種。

孢子培養基孢子培養基是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培養基，對這種培養基的要求是能使菌體迅速生長，產生較多優質的孢子，并要求這種培養基不易引起菌種發生變異。所以對孢子培養基的基本配制要求是：第一，營養不要太豐富（特別是有機氮源），否則不易產孢子。如灰色鏈霉在葡萄糖－硝酸鹽－其它鹽類的培養基上都能很好地生長和產孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只長菌絲而不長孢子。第二，所用無機鹽的濃度要適量，不然也會影響孢子量和孢子顏色。第三，要注意孢子培養基的pH和濕度。生產上常用的孢子培養基有：麩皮培養基、小米培養基、大米培養基、玉米碎屑培養基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食鹽等配制成的瓊脂斜面培養基。大米和小米常用作霉菌孢子培養基，因為它們含氮量少，疏松、表面積大，所以是較好孢子培養基。

種子培養基種子培養基是供孢子發芽、生長和大量繁殖菌絲體，并使菌體長得粗壯，成為活力強的“種子”。所以種子培養基的營養成分要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也要高些，但總濃度以略稀薄為好，這樣可達到較高的溶解氧，供大量菌體生長繁殖。種 2 子培養基的成分要考慮在微生物代謝過程中能維持穩定的pH，其組成還要根據不同菌種的生理特征而定。一般種子培養基都用營養豐富而完全的天然有機氮源，因為有些氨基酸能刺激孢子發芽。但無機氮源容易利用，有利于菌體迅速生長，所以在種子培養基中常包括有機及無機氮源。最后一級的種子培養基的成分最好能較接近發酵培養基，這樣可使種子進入發酵培養基后能迅速適應，快速生長。

發酵培養基發酵培養基是供菌種生長、繁殖和合成產物之用。它既要使種子接種后能迅速生長，達到一定的菌絲濃度，又要使長好的菌體能迅速合成需產物。因此，發酵培養基的組成除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有產物所需的特定元素、前體和促進劑等。但若因生長和生物合成產物需要的總的碳源、氮源、磷源等的濃度太高，或生長和合成兩階段各需的最佳條件要求不同時，則可考慮培養基用分批補料來加以滿足。

第三篇：《生物制藥技術》實驗指導-實驗三、四

《生物制藥技術》實驗指導

實驗三 四環素、金霉素的薄層層析鑒定（驗證型）

實驗目的：

掌握薄層層析的原理，四環素族抗生素的定性鑒定方法。實驗原理：

層析（色譜，chromatograpby）是相當重要、且相當常見的一種技術，在把微細分散的固體或是附著于固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動相的系統中（根據移動相種類的不同，分為液相層析和氣相層析二種），使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態邊移動，利用各成分對固定相親和力不同所引起的移動速度差，將它們彼此分離開的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。用作固定相的有硅膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土和纖維素那樣的無活性的載體上附著適當的液體。將作為固定相的微細粉末狀物質裝入細長形圓筒中進行的層析稱為柱層析（column chromatography），在玻璃板上涂上一層薄而均的支持物（硅膠、纖維素和淀粉等）作為固定相的稱為薄層層析（thin layer chromatography），或者用濾紙作為固定相的紙上層析。層析根據固定相與溶質（試料）間親和力的差異分為吸附型、分配型、離子交換型層析等類型。但這并不是很嚴格的，有時常見到其中間類型。此外，近來也應用親和層析，即將與基質類似的化合物（通常為共價鍵）結合到固定相上，再利用其特異的親和性沉淀與其對應的特定的酶或蛋白質。

分配層析在支持物上形成部分互溶的兩相系統。一般是水相和有機溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和淀粉等親水物質，這些物質能儲留相當量的水。被分離物質在兩相中都能溶解，但分配系數不同，展層時就會形成以不同速度向前移動的區帶。一種溶質在兩種互不混溶的溶劑系統中分配時，在一定溫度下達到平衡后，溶質在固定相和流動相溶劑中的濃度之比為一常數，稱為分配系數。當欲被分離的各種物質在固定相和流動相中的分配系數不同時，它們就能被分離開。分配系數大的移動快（阻力?。?。

薄層層析是以薄層材料為支持物，在密閉容器中，樣品在其上展開。當斑點不易為肉眼觀察時，可利用適當的顯色劑，或通過紫外燈下產生熒光的方法進行觀察。通過這種展開操作，各成分呈斑點狀移動到各自的位置上，再根據Rf值的測定進行鑒定。薄層色譜法具有分離與鑒定的雙重功能，通過薄層圖譜與對照品的圖譜相比較，除了能鑒出有效成分或特征成分外，還以完整的色譜圖作為一個整體對制劑加以鑒別。薄層色譜分析法由于簡便、快速，能有效地、直觀地反映藥品地真實性、穩定性，現已成為藥物制劑的鑒別和質量控制的行之有效的方法之一。薄層層析是鑒別抗生素的方法之一，層析后進行顯色，并繪制層析圖譜，根據層析圖譜對抗生素進行鑒定。本實驗以四環素、金霉素標準品溶液作為對照對發酵液進行鑒定。

材料、試劑和器材： 儀器和設備：

玻璃層析缸；層析板（薄層層析硅膠煙臺芝罘區黃務硅膠開發實驗廠有售）；吹風機；紫外投射儀；離心機（1.5ml轉子）試劑：

四環素、金霉素標準品（1000U/ml）用0.1 M鹽酸溶解并稀釋定容，4℃冰箱保存（可使用7天）。

展開劑：正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)2L。草酸、氨水 其它物品：

1.5ml離心管、小燒杯、玻璃棒、毛細玻璃管或微量注射器、pH試紙（pH覆蓋1.0～2.0）（或酸度計）、飯盒（或大培養皿）、凡士林 實驗步驟：

1．層析板處理

層析板105℃烘烤過夜，均勻噴上0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PH4.5)，于空氣中晾干、備用。

2．點樣

選取兩種定向發酵液加草酸酸化至pH為1.5～2.0，取上清約l.2 ml于1.5ml離心管中，10000 rpm，5min，備用。在距層析板底邊2.5~3 cm起始線上(用鉛筆劃線，做出點樣點記號)，用毛細玻璃管在薄層層析板上點四環素標準品和金霉素標準品溶液3次，發酵液上清點8～10次，點樣點不大于0.4cm，每次都要吹干后再點。（一般效價在1000u／ml以上點3次，500～1000u／ml點4次，200～500u／ml點5次）。剩余的發酵液上清于4℃冰箱保存。

3.層析（展開）

用正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)的上相作展開劑。層析前需預先用展開劑預平衡層析缸，可在缸中倒入2cm高的展開劑，密閉，一般保持15－30分鐘。然后將層析板置于盛有展開劑的層析缸中，在室溫下展層6～8h（與溫度有關）。封口不嚴可涂抹凡士林。

4．熒光顯影

待溶劑前沿展至板的一半以上時將層析板取出，標出溶劑前沿，于通風櫥中晾干，用氨水熏數秒鐘后即可在紫外燈下顯影，畫出黃色斑點，分別算出Rf值。（四環素標準品慢和金霉素標準品快）

無水四環素在波長365nm下顯黃色熒光，根據與標準對照可定性測定。注意事項：

因四環素能和鈣鹽形成不溶性化合物，故發酵液中的四環素濃度不高，預處理時通常用草酸將發酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四環素盡量溶解。

點樣時必須注意勿損傷薄層表面。要控制好點樣量，樣品太少，斑點不清楚，難以觀察，但樣品量太多時往往出現斑點太大或拖尾現象。

若因樣品溶液太稀，可重復點樣，但應待前次點樣的溶劑揮發后方可重新點樣，以防樣點過大，造成拖尾、擴散等現象，而影響分離效果。

作展開劑中極少量強極性溶劑(0.5％)或pH值的改變可顯著改善拖尾現象。

實驗四 四環素的效價測定（綜合型）

實驗目的：

1、了解抗生素效價的表示方法

2、學習抗生素的測定方法 實驗原理：

實驗利用比色法測定四環素和金霉素的效價。效價(titer或titre)是評價抗生素效能的標準，它代表抗生素對微生物的抗菌效力，也是衡量發酵液中抗生素含量的尺度，人們以1μg金霉素或四環素標準品為1個單位，0.6μg青霉素G鈉鹽為1個單位。

四環素和金霉素在酸性條件下，加熱，可產生黃色的脫水金霉素和脫水四環素，其色度與含量成正比。

在堿性條件下，四環素較穩定，而金霉素則生成無色的異金霉素：

根據上述原理，可以在酸性條件下，利用比色法測定四環素、金霉素混合液的總效價；而四環素效價的測定可在堿性條件下，使金霉素生成無色的異金霉素，然后再在酸性條件下，使四環素生成黃色的脫水四環素，經比色測得四環素效價。總效價與四環素效價二者之差即為金霉素的效價。本實驗只測定四環素的效價。

因四環素能和鈣鹽形成不溶性化合物，故發酵液中的四環素濃度不高，預處理時通常用草酸將發酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四環素盡量溶解。發酵液中，由于雜質的干擾，將影響比色的正確性，因此加入乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)作為螯合劑，掩飾金屬離子的干擾，改變四環素脫水條件(降低酸度或延長加熱時間)，可以減少雜質對比色反應的干擾。材料、試劑和器材： 試劑：

EDTA lg／l00ml、NaOH 3mol／L、HCl 6mol／L、蒸餾水

鹽酸四環素標準液: 精密稱取鹽酸四環素標準品0.0410 g 于燒杯中, 用適量蒸餾水(或0.1mol／L的鹽酸溶解)溶解, 轉移至200 m l容量瓶中定容配成0.2 m g /m l的溶液。器材：

分光光度計、玻璃比色池、水浴鍋、電爐、不銹鋼鍋、擦鏡紙、50ml容量瓶（或比色管）、大燒杯、移液槍、1mL槍頭、洗耳球 實驗步驟：

取上述保存的處理發酵液上清l ml(效價約為1000U／m1)于50ml容量瓶中，加入lml濃度為lg／l00ml EDTA溶液，加蒸餾水9ml，再加入lml濃度為3mol／L的NaOH，在20~25℃ 3 下保溫15min后，加入2.5ml濃度為6mol／L的HCl，煮沸15min后，冷卻，稀釋至刻度，在分光光度計上于440nm（或380 nm）處測定其吸光度值。（紫外為100-390nm；可見光為380-780nm，根據波長選擇石英比色池或玻璃比色池，否則玻璃對于紫外光有吸收）

對照樣品（不加誘導劑）的前處理方法與上述步驟一樣，只是在加入HCl后，不加熱，稀釋至刻度，作為測定樣品的空白對照, 調零。

取1ml四環素標準品于50ml容量瓶中，加1ml濃度為6mol／L的HCl，水浴煮沸15min后，冷卻，稀釋至50ml，440nm（或380 nm）測吸光度。（以蒸餾水作為空白測定）

以定向發酵培養基中的對照組作為空白對照，測定其它三個處理組的吸光度。（有時可能因對照組處理不當而使其它組的讀數為負值，這時可以以蒸餾水作為空白。）

計算公式：

發酵液中四環素的效價= A發酵 A四環素標準

×四環素標準品的效價

第四篇：生物制藥技術

08藥學***3陳省委

組合生物合成藥物進展

摘 要50年來抗生素在人類疾病治療中發揮了重要作用,今后的幾十年里它們也將是關鍵的治療劑。盡管在過去的20年中通過靶向篩選發現了一些微生物藥物,但是這種篩選方法很難發現新類型藥物。組合生物合成可以彌補這種不足,通過基因工程方法改造微生物基因和酶,產生新的抗生素,發現那些在自然界中不能發現的藥物。

關鍵詞 基因工程合生物合成新抗生素

微生物種類繁多,其產物化學結構豐富多彩,生物活性十分廣泛,是開發各種新產品的豐富資源,但是傳統的篩選方法已遠遠不能滿足社會發展的需要。隨著分子生物學和生物技術的發展,以及基因組學、蛋白質組學、生物信息組學、代謝組學研究的深入,人們對微生物基因組的研究也有了顯著進展,已經闡明了許多與微生物代謝有關的生物合成基因,為微生物組合生物合成藥物的研究和開發奠定了良好的基礎。

一、研究背景

自1928年弗萊明發現青霉素和1942年瓦克斯曼發現鏈霉素以來,微生物藥物在疾病防治和拯救人類生命中起著十分重要和不可替代的作用,特別是抗生素被國外科學家譽為20世紀醫學領域的皇冠寶石。微生物藥物一直是臨床最常用的藥物,在西方發達國家,抗生素占臨床處方藥物的20%以上,在中國約占處方藥物的30%。但自上世紀70年代后,隨著脊髓灰質炎、天花、麻風等傳染性疾病先后在全球范圍內被消滅,國家對微生物藥物研究的支持逐漸下降,抗傳染病藥物研究進入了困難時期。上世紀90年代后,我國在已有億乙肝病毒攜帶者的基礎上,又出現了100萬以上人類免疫缺陷病毒(HIV)攜帶者。2002年末以來,重急性呼吸窘迫綜合征(SARS)的出現使我國的傳病控制告急,不得不重新思考微生物藥物的研究策略在新的時期里,微生物藥物研究再度升溫,原因

①新病原微生物不斷出現,如SARS、艾滋病(AIDS)瘋牛病等;②生物武器的使用,如炭疽等;③各種耐菌株在世界范圍的傳播;④許多傳染性疾病,如肺核、血吸蟲病等的死灰復燃。目前國內外側重研究的生物藥物,主要有抗新病原微生物,抗耐藥菌,抗病毒,抗腫瘤抗生素以及微生物來源的生理活性物質。微物藥物的研究主要

包括以下內容:①抗新病原微生藥物的尋找與開發;②細菌耐藥機制及其抗耐藥細藥物研究;③微生物藥物的生物合成基因研究;④組生物合成微生物藥物研究。其中組合生物合成微生藥物是近年發展較快的研究領域,將在創新藥物研中發揮重要作用。

二、組合生物合成生物技術,尤其是基因工程技術的不斷發展,為生物醫藥領域開辟了廣闊的前景;通過基因工程技術所得到的藥物也在臨床治療某些疑難疾病中發揮著越來越重要的作用。

廣義,基因工程產品分為兩類

①單基因直接產物。通常是指單個基因編碼序列的翻譯產物(蛋白質),它們一般是生物大分子如干擾素和單克隆抗體,目前生物醫藥領域中開發的多數產品均屬于此類,其中包含有效地用于臨床治療的如重組人胰島素、干擾素和促紅細胞生成素。我國在此領域獨創的藥物不多,而且這類藥物的一個突出缺點是它們比較容易被仿制,只要有了相應的細胞系即可利用基本設備進行生產。

②多基因間接產物。是指由多基因編碼的多酶體系介導而合成的小分子化合物和多肽,包括自然界由微生物和植物產生的天然產物,如抗生素、生理活性物質或萜類化合物等結構比較復雜的化合物。它們品種繁多,性能各異,僅就目前研究得比較深入的聚酮體和萜類化合物,就包括具有抗腫瘤作用的阿霉素、紫杉醇,具有免疫抑制作用的FK506、西莫羅司,具有降血酯作用的洛伐他汀、銀杏內酯,具有抗結核桿菌作用的利福霉素,抗瘧藥物青蒿素等。

組合生物合成(combinatorial biosynthesis)是在微生物次級代謝產物合成基因和酶學研究基礎上形成的。組合生物合成的概念是結構不同但生物合成途徑相似的抗生素生物合成基因之間可以進行重組、組合或互補產生新結構的化合物。盡管微生物藥物的結構多樣,但形成這些產物的主要生化反應機制卻基本相同,它們通常是由非常簡單的化學物質,如小分子羧酸和某些氨基酸作為合成起始單位和延伸單位,通過由一系列基因編碼的多酶體系參與的生物化學反應(構成一個合成途徑)而形成的,參與這些天然產物生物合成的多酶體系是由多個結構明顯分開的功能區域所組成。研究表明,參與這類小分子生物合成的基因通常是連鎖或鄰接而構成一個基因簇(cluster),這為基因的克隆和操作提供了方便,同時由于參與

次級代謝生物合成酶系對底物的特異性,專一性要求不是很嚴格的,對結構相類似的底物均可識別,這一特點為不同基因組合產生新的化合物創造了條件。因此,有針對性地對某些基因進行操作,如替換、阻斷、重組以及添加、減少組件等,均有可能改變其生物合成途徑而產生新的代謝旁路(metabolic pathway),繼而形成新的化合物,這就為組合生物合成提供了基礎,國際上已有通過這些手段得到多個化合物的報道。

三、研究的科學意義

開展微生物基因工程組合生物合成創制新型藥物研究,具有如下意義。

1、利用組合生物合成體系,完成化學方法不能完或難以完成的活性化合物的合成,如抗癌藥物紫杉(taxol)等;這類活性化合物在自然界中含量少、需要大、醫學價值高,而且通常化學合成困難(成本高,難大,環境污染嚴重),為了確保紅豆杉資源的可持續用,除正在開展的苗圃栽培,并以苗圃作為紫杉醇提的原料之外,通過生物合成來使它們具最終的商業值是一個極具潛力的手段。例如,與抗癌藥物紫杉醇用相似的埃波霉素(epothilone)已在鏈霉菌中通過合生物合成方法獲得表達,現已進入開發研究階段。、對一些現有的結構復雜的天然產物如青蒿素銀杏內酯等有效組分進行定向合成,對臨床用抗生品種進行有針對性的修飾和改造,如對紅霉素進行造產生酮內酯型的大環內酯類抗生素,獲得對臨床藥菌具有活性的抗生素衍生物;或者通過對現有天產物或抗生素的結構改造,獲得具有全新活性的或化性能有明顯改善的天然產物或新抗生素。、組合生物合成產生新化合物的潛力很大,化合數是以可操作基因的指數方式形成,如設R為可利的基因數,n是每個基因的不同等位形式(即不同天產物來源的數目),從理論上講經過基因組合可得Rn種排列組合,即得到Rn個化合物。通過組合生合成,獲得一大批新化合物,作為高通量藥物篩選樣庫的來源之一。、由于多基因組合操作的平臺是以易于大規模產的微生物體系為基礎,使創制新型藥物的研究便產業化。、組合生物合成的研究,必將推動我國在基因水對天然資源的利用,更好地利用植物代謝產物,挖掘前實驗室條件下無法進行培養的生物體,包括海洋的生物體。隨著研究和應用的發展,植物和海洋生物級代謝產物的組合生物學研究,也將蓬勃

發展起來。

四、國內外研究現狀

1985年,Hopwood教授[4]在世界首次報道用遺工程的手段合成“非天然”的天然產物isochromanequinone,該工作為后來的組合生物合成奠定了礎。在以后的十幾年里,這一領域成為天然產物代工程研究中最活躍的領域,許多微生物次級代謝研的專家都加入這一領域的工作,因為組合生物合成潛力制造出很多先導化合物。目前的發展趨勢由最初的基礎研究逐步演變為基礎與應用兼顧,有的地向產業化邁進。該領域的研究也同樣得到工界的重視,美國加州高新技術產業公司研制的埃波素(epothilone D)已進入III期臨床評價階段。埃霉素原來由纖維堆囊黏細菌產生,其產量低,繁殖時間長,產品無法進行產業化生產。該公司利用基因組合技術使纖維堆囊黏細菌的埃波霉素生物合成基因在鏈霉菌中得到表達,并通過?；D移酶域替換及羥基化酶基因的阻斷,獲得了主要產生埃波霉素中抗腫瘤活性最好組分的epothilone D的基因工程菌。我國自上世紀80年代初開展以多基因組合工程技術研制新藥的研究,在聚酮類抗生素如大環內酯類抗生素、利福霉素、安莎霉素及抗生素產生菌分子生物學研究方面,取得一定進展。國家重大專項支持的基因工程必特螺旋霉素己進入臨床研究,基因工程必特螺旋霉素的研制為組合生物合成技術應用于小分子化合物的創制中提供了良好的工作基礎和經驗。我國微生物代謝產品研究歷史悠久,已形成多學科協調合作的體系,近年來在國家的支持下該體系已得到一定的發展,加強了微生物及代謝產物資源的開發。我們已逐步建立難培養極端微生物和未培養微生物資源及海洋微生物的挖掘工作,建立并完善從土壤或其他來源直接分離DNA技術。我國有很強的有機化學合成能力,可以合成進行組合合成的起始單元,開展前體介導的組合生物合成(precursor-directed biosynthesis)研究。我們已建立并不斷完善多種生物活性篩選模型,有天然產物化學分離鑒定及藥理、藥效、毒理評估的配套學科。

目前基因工程技術的發展水平,在單基因操作方面已經比較成熟;在多基因操作層次上雖然技術難度相對比較大,但近年來在此研究領域已有了迅猛的發展,已積累了較好的研究基礎,許多次級代謝產物生物合成基因簇已得到克隆,基因結構與功能已得到闡明,并且發展了一系列大容量載體和合適的宿主表達系統。組合生物合成已形成國際藥物領域研究的熱點和一個重要發展方向。

五、研究方向與前景

我國天然微生物及植物資源豐富,以微生物作為平臺的藥物生產歷史悠久、種類繁多,利用這一寶庫開展組合生物合成研究,建立新型化合物庫,作為新型藥物或先導化合物的重要來源之一,有重要的理論與實際意義。組合生物合成為當今世界研究熱點,我國也有一定工作基礎,開展這方面的研究將有利于加深對次級代謝生物合成機理的研究與應用、促進生物技術新藥研制中的作用,對發展我國新藥有重要意義,并推動新藥研究中高通量篩選技術與方法的建立與善,篩選出有價值的新藥。

我們要重點加強難培養微生物及海洋生物資源挖掘工作,建立并完善從土壤或其他來源直接分DNA技術,以豐富組合生物合成基因資源;加強微物天然化學研究,建立微量、快速、高效鑒定天然產化學結構的技術和方法;充分利用我們已經建立的種生物活性篩選模型,通過廣泛地聯合與協作,擴展合生物合成技術在創新藥物中的應用,建立我國基工程微生物組合生物合成創制新型藥物或先導化合研究的技術平臺。該研究將有助于開拓和促進我國新技術在新藥研究與開發中的應用,對創制具有我自主知識產權的新藥將會有積極推動作用。

對本課程的意見：

1、可能是因為選課人太少的問題，上課的時候沒有很好的聽課氣氛，不過主要

還可能是自己的原因，自己不能集中精神聽講。

2、以后只要選課的人比較多了，應該會好一些，上課的人少了，總是覺得就像

這門課不重要，老師講的很清晰，主要是我們上課時常開小差。自從上了大學，就沒太有人管了，有時聽起課來就愛聽不聽，這倒是對每門課都差不多的。

3、課堂上可以稍微提問一下，因為提問往往可以引起同學們的注意，這樣走神的情況可能會少一些。

4、課堂中還可以穿插一些與課程有關的歷史、說一下那些地方比較適合做研究、考研究生去哪里比較好啊什么的，這樣既可以對現在的科研大環境有所了解，課堂內容也不至于太單調。

最后謝謝老師兢兢業業地為我們把課上完，盡管上課人數少，你還是把課完整地給我們講完，謝謝老師為我們的付出。

第五篇：生物制藥技術

酶

分離純化酶的一般程序

1粗酶液的制備：材料的選擇，發酵液處理，細胞破碎及酶的抽提 2酶的初步分離：鹽析，等電點沉淀，有機溶劑沉淀，離心分離 3酶的高度純化（酶的精制）：層析法（凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析及親和層析），電泳（等電聚焦電泳）

4濃縮干燥及結晶：透析，旋轉蒸發，超濾，冷凍干燥

酶的主要純化技術－層析技術

利用混合液中各組分的物理化學性質的不同，(分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數)，使各組分以不同的比例分布在兩相中，當流動相以一定的速度流經固定相時，各組分的移動速度不同，從而使不同的組分分離的技術過程。稱為層析技術（chromatography）

離子交換層析（ion exchange chromatography）

在一定的pH條件下，帶電荷的蛋白質與高分子不溶性固定相偶聯的離子交換基團相吸附，流動相中解離的離子與被吸附的酶發生可逆的交換，而對不同吸附能力的蛋白質進行分離 離子交換劑的選擇：陰離子交換劑用于處理凈電荷為負的蛋白質，陽離子交換劑用于處理凈電荷為正的蛋白質

樣品在低離子濃度條件下上柱，逐漸增加洗脫液的離子濃度，使蛋白依次被洗脫下來 洗脫方式可以是步進式洗脫或線性梯度洗脫 洗脫液一般用 NaCl

凝膠過濾法（gel filtration）亦稱分子篩層析、排阻層析，是利用生物大分子的相對分子質量的差異進行層析分離的一種方法

凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內部具有立體網狀結構，形成很多孔穴。當含有不同分子大小的組分的樣品進入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內擴散，組分的擴散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴散到孔穴內部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動相向下流動，它們經歷的流程短，流動速度快，所以首先流出；而較小的分子則可以完全滲透進入凝膠顆粒內部，經歷的流程長，流動速度慢，所以最后流出；

分離提純 脫鹽 測定高分子物質的相對分子量

疏水層析（hydrophobic chromatography）

原理：蛋白質分子中含有亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸等疏水性較強的氨基酸，當蛋白質溶液經過疏水層析介質的疏水配基時，蛋白的疏水性集團（疏水補?。c疏水配基發生親和作用而被吸附在介質上。不同蛋白質分子中疏水基團的數量和特性有所不同。在洗脫時通過改變洗脫液的極性達到分離的目的

親和層析（affinity chromatography）

也稱功能層析、生物專一吸附或選擇層析。根據生物分子與特定的固相化配基（ligand）之間的親和力而使生物分子得到分離的方法 酶與激活劑/抑制劑/底物/輔酶；抗原與抗體；激素/配體與受體；蛋白質與DNA/RNA上特定區域

特定的配基（激活劑/抑制劑/底物/輔酶）固定于惰性載體 目的酶與配基特異性親和吸附，雜質被洗脫 改變洗脫條件，解除目的酶與配基的專一性結合

固定化酶（細胞）的定義

優點：

1.穩定性顯著提高；

2.同一批固定化酶能重復多次地使用； 3.固定化后，很容易與反應物分開（過濾），不污 染產物，而且有利于控制生產過程，同時也省去了 熱處理等使酶失活的步驟；

4.可長期使用，并可預測衰變的速度； 5.提供了研究酶動力學的良好模型。缺點：

①固定化時，酶活力往往有損失。②增加了生產的成本，初始投資大。

③只能用于可溶性底物，而且較適用于小分子底物，對大分子底物不適宜。④非均相反應。

①注意維持酶的催化活性及專一性。在酶的固定化過程中，酶與載體的結合部位不應當是酶的活性部位，而且要盡量避免那些可能導致酶蛋白高級結構破壞的條件。②固定化應該有利于生產自動化、連續化。為此，用于固定化的載體必須有一定的機械強度，不能因機械攪拌而破碎或脫落。

③固定化酶應有最小的空間位阻，盡可能不妨礙酶與底物的接近，以提高產品的產量。④酶與載體必須結合牢固，從而使固定化酶能回收貯藏，利于反復使用。

⑤固定化酶應有最大的穩定性，所選載體不與廢物、產物或溶劑發生化學反應。⑥固定化酶成本要低，以利于工業使用。

載體結合法

1物理吸附法2離子結合法3共價結合法 是將酶結合于不溶性載體上的一種固定化方法。1）物理吸附法 作用方式：非特異性物理吸附作用：范德華力；氫鍵；疏水作用；靜電作用 優點：制作簡單，酶分子的構象很少或基本不發生變化，固定化酶活力較高 缺點：酶與載體結合力弱，酶易從載體脫落 載體：纖維素、瓊脂糖、活性炭、沸石及硅膠等 2)離子結合法

作用方式：離子鍵結合

優點：制作簡單，處理條件緩和，酶蛋白的活性中心和高級結構破壞較少，可以制得活力較高的固定化酶。

缺點：離子鍵結合較松散，如在高離子強度下進行反應時，酶與載體易分開。載體：多糖類離子交換劑，合成高分子離子交換樹脂 3)共價鍵結合法

作用方式：共價鍵結合

優點：酶分子和載體間的共價鍵較牢固，有良好的穩定性及重復使用性 缺點：制備過程復雜，反應條件比較劇烈，酶活性損失比較嚴重。

制作方法：先將載體活化，在載體上引入一個活化基團，然后該活化基團再與酶分子表面的基團（羧基/氨基/羥基）反應結合。有戊二醛法、重氮化法、烷基化法等。

交聯法

利用雙功能（或多功能）基團的試劑，使酶蛋白分子之間發生交聯，凝集成網狀結構而成為固定化酶

常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐和雙偶氮苯等。其中最常用的是戊二醛

包埋法

1網格型2微囊型

將酶包埋在凝膠的微小空格內或埋于半透膜的微型膠束內，但底物仍能滲入到里面與酶接觸。

載體：凝膠，高分子聚合物（半透膜）

優點：利用此法制得的固定化酶，由于酶分子僅僅是被包埋起來，而未受到化學作用。酶蛋白幾乎不起變化。

缺點：酶被包埋在內部，對大分子底物很難發生催化作用。所以用包埋法制備的酶，一般只適用與小分子底物。

包埋法分為：網格包埋法和微囊包埋法。

酶傳感器（enzyme sensor）1生物傳感器的概念

由生物識別物質（如酶、微生物、動植物組織、抗體等）和能量轉換器相結合所構成的分析儀器，可以簡便快速的測定各種特異性很強的物質 要求識別物質對被測物具有高度的敏感性和選擇性

根據識別物質可分為：酶傳感器、組織傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器

2、生物傳感器的一般結構與工作原理 結構:有兩個部分組成

生物分子識別元件（感受器）：酶、核酸、抗體、細胞等 信號轉換器（換能器）：電化學電極、光學檢測元件、熱敏電阻、表面等離子共振器件等 原理：待測物質經擴散作用進入生物傳感器,通過分子識別發生特異的生物化學反應,產生的生化信號經換能器轉換為可定量和可處理的電信號,進而可檢測出該物質的濃度.根據反應產生的信號不同，可選擇相應的換能器.抗體

多克隆抗體：由于一個抗原通常都有幾個抗原決定簇，因此每個免疫細胞都可能產生一種針對某一抗原決定簇（antigenic determinant）的抗體，這些由同一抗原產生的不同抗體統稱為多克隆抗體。這些由不同B細胞克隆產生的抗體，稱為多克隆抗體（polyclonal antibodies，PcAb）。

單克隆抗體：單一類型的只針對某一抗原決定簇的抗體分子，是由單一的B淋巴細胞克隆產生的結構和特異性完全相同的高純度抗體。

抗原的制備

1.用基因工程技術制備重組蛋白抗原

2.提取純化天然抗原

3.合成多肽半抗原

4.小分子半抗原

5.多肽半抗原及小分子半抗原與載體偶聯

免疫

動物選擇：Balb/c小鼠，品系一致

途徑

體內，體外，脾內免疫

篩選陽性克隆及克隆化

克隆：由單個細胞繁殖擴增而形成性狀均一的細胞集落的過程。

目的：篩選陽性克?。淮_保雜交瘤細胞所分泌的抗體具有單克隆性以及從細胞群中篩選

出具有穩定表現型。

篩選陽性克隆鑒定

單克隆抗體活性檢測方法：

1）酶聯免疫吸附實驗（ELISA）：可溶性抗原、細胞核病毒。2）放免測定（RIA）：可溶性抗原、細胞抗體。3）FAC（熒光激活細胞分選儀，流式培養儀）：針對細胞表面

抗原的抗體檢測。

4）IFA（間接免疫熒光法）：用于細胞和病毒抗體的檢測。

雜交瘤細胞的克隆化

（1）有限稀釋技術 柏松分布（2）半固體瓊脂培養法

0.5%瓊脂培養基中進行克隆

1ml含不同數量的細胞懸液

1ml42度0.5%的瓊脂液

單克隆抗體的大量制備

基因工程抗體（genetically engineered antibodies,gAb）

是通過基因工程技術研制的，即通過PCR技術獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當載體重組后引入不同表達系統所產生的抗體?；蚬こ炭贵w既保持了單抗的均一性、特異性強的優點，又能克服其為鼠源性的不足，是拓展單抗廣泛人體使用的重要途徑。

（一）嵌合抗體（chimeric antibody）

特點：是用人抗體的C區替代鼠的C區。效果：使鼠源性單抗的免疫原性明顯減弱，并可延長其在體內的半衰期及改善藥物的動力學。嵌合抗體的優點：

保持了親本鼠單抗的特異性和親和力；

減少人源性的恒定區的HAMA現象；

能有效地介導產生補體依賴的細胞毒作用(CDC)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（ADCC）及免疫調理作用。缺點：

目前已有數十種嵌合抗體進入了臨床試用，雖然HAMA現象較鼠單抗大為下降，但有相當比例的患者仍會出現HAMA癥狀，針對可變區的抗獨特型抗體反應仍很明顯。

（二）改型抗體（reshaped antibody，RAb）亦叫“重構抗體”，“CDR移植抗體（CDR grafting antibody）”。它是利用基因工程技術，將人抗體可變區（V）中互補性決定區（complementarity determinative region，CDR）的氨基酸序列改換成鼠源單抗CDR 序列。

特點：此種抗體可以使人單抗獲得鼠單抗的特異性又保持人源抗體的親和力。

動物

動物細胞分類

1、貼壁依賴性細胞 概念：anchoraged-dependent cell需要有適量帶電荷的固體或半固體支持表面才能生長的細胞 大多數動物細胞都屬于此類。

2、非貼壁依賴性細胞

概念：anchoraged-independent cell不依賴于固體支持物表面生長的細胞，可在培養液中懸浮生長，被稱為懸浮細胞。舉例：血液、淋巴細胞、腫瘤細胞和某些轉化細胞，Namalwa細胞。

3、兼性貼壁細胞

概念：對支持物的依賴性不嚴格，既可貼壁生長，也可懸浮生長。舉例：CHO細胞、BHK細胞、L929細胞。理想的藥物生產細胞系

轉基因技術的基本原理

將體外構建的重組DNA分子(目的基因或基因組片段)通過顯微注射、或轉染胚胎干細胞等方法注入動物的受精卵或著床前的胚胎細胞,然后將此受精卵或胚胎再植入受體動物的輸卵管或子宮中，使其發育成攜帶外源基因的轉基因動物。

同源重組

雙鏈DNA的兩個區段的DNA序列基本一致，但不一定完全相同，叫做同源區。同源的雙鏈DNA可以通過相互交換進行重組。

外源DNA如有同源區，也可通過類似的同源重組過程整合到生物的染色體基因組上。

胚胎干細胞（Embryonic Stem Cell，ES）是從早期胚胎的內細胞團經體外培養建立起來的多潛能細胞系，具有胚胎細胞相似的形態特征和分化特征。

新型

反義技術：根據堿基互補原理，使用與目標靶的遺傳物質（DNA或mRNA）特定互補的核苷酸片段來封閉基因表達的技術方法。

反義藥物：人工合成或生物合成的DNA或RNA，能與RNA互補，抑制疾病基因的表達。反義核酸（antisense nucleic acid）是一段與靶基因的某段序列互補的天然存在或人工合成的核苷酸序列。它可通過堿基配對與細胞內核酸特異結合形成雜交分子，從而在轉錄和翻譯水平調節靶基因的表達，具有合成方便、序列設計簡單、容易修飾、選擇性高、親和力高等特點。

核酶(ribozyme)具有酶活性的RNA，可降解特異的mRNA序列。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）

由雙鏈RNA介導的細胞內特異性mRNA降解過程，導致靶基因的表達沉默。

基因導入方式

直接體內療法（in vivo）

是指將目的基因直接導入體內有關的組織器官，使其進入相應的細胞并進行表達。間接體內療法（ex vivo）

是指在體外將目的基因導入靶細胞，經過篩選和增殖后將細胞回輸給患者，使該基因在體內有效地表達相應產物，以達到治療的目的。

腫瘤的基因治療

（一）通過抑癌基因抑制腫瘤細胞生長和誘導細胞凋亡。

（二）通過病毒感染殺傷腫瘤細胞

（三）通過誘導免疫系統識別并殺傷腫瘤細胞

（四）腫瘤的自殺基因治療

（五）腫瘤抗原靶向的腫瘤基因治療

（六）細胞因子基因治療