第一篇：四川大學(xué)生物制藥技術(shù)復(fù)習(xí)資料

生物制藥技術(shù)復(fù)習(xí)資料

一、生物藥物生產(chǎn)原料選擇的主要原則。生物藥物的特性及種類。

主要原則：有效成分含量高，原料新鮮；來(lái)源豐富，易得；原料產(chǎn)地較近；雜技含量少；原料成本低；易提取。特性：（1）藥理學(xué)特性：治療的針對(duì)性強(qiáng)；藥理學(xué)活性高；毒副作用小，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高；生理副作用常有發(fā)生。（2）生產(chǎn)、制備中的特殊性：原料中的有效物質(zhì)含量低；穩(wěn)定性差；易腐敗；注射用藥有特殊要求。（3）檢驗(yàn)上的特殊性：要有理化檢驗(yàn)指標(biāo)，和生物活性檢驗(yàn)指標(biāo)。分類：

按藥物化學(xué)本質(zhì)和化學(xué)特性分類：（1）氨基酸及基衍生物類（2）多肽和蛋白質(zhì)類（3）酶和輔酶類（4）核酸及基降解物和衍生物類（5）糖類（6）脂類（7）細(xì)胞生長(zhǎng)因子類（8）生物制品類（9）小動(dòng)物制劑（10）動(dòng)物器官或組織制劑

按原料來(lái)源分類：（1）人體組織（2）動(dòng)物組織（3）植物組織（4）微生物（5）海洋生物來(lái)源的藥物

按生理功能和用途分類：（1）治療藥物（2）預(yù)防藥物（3）診斷藥物（4）其他

二、生物藥物提取分離制備方法的工藝過(guò)程。在對(duì)生物藥物進(jìn)行提取操作時(shí)，選擇提取試劑需注意的問(wèn)題。

工藝流程：

1、生物藥物原料的選擇、預(yù)處理與保存

2、生物藥物的提取：（1）生物組織與細(xì)胞破碎：磨切法，壓力法，反復(fù)凍融法，超聲波震蕩破碎法，自溶法，酶溶法（2）選擇合適的溶劑進(jìn)行提取

3、生物藥物的分享純化：（1）蛋白質(zhì)類藥物的分享純化：沉淀法，親和層析法，疏水層析法（2）核酸類藥物的分離純化：提取法，發(fā)酵法（3）糖類：沉淀法，離子交換層析法（4）脂類：沉淀法，吸附層析法，離子交換層析法（5）氨基酸類：沉淀法，吸附法，離子交換法

試劑的選擇：

1、對(duì)所需要提取的活性成分溶出度較高，對(duì)雜技較低。

2、不破壞活性成分。

3、利于后續(xù)預(yù)處理。

4、對(duì)環(huán)境影響較小，有利于回收和處理。

5、對(duì)設(shè)備要求不高。

6、成本較低。

7、對(duì)人體無(wú)害

三、基因工程制藥的主要工藝過(guò)程

獲得目的基因，組建重組質(zhì)粒，構(gòu)建基因工程菌（或細(xì)胞），培養(yǎng)工程菌，產(chǎn)物的分離純化，質(zhì)量控制，產(chǎn)品檢驗(yàn)包裝

四、目的基因及其獲取方法和要求，構(gòu)建cDNA文庫(kù)法分離目的基因主要步驟。

獲取方法：構(gòu)建基因文庫(kù)法，構(gòu)建cDNA文庫(kù)法，DNA的化學(xué)合成法，PCR法，反轉(zhuǎn)錄法 要求：不含多余干擾成分，純度高，片段大小適合重組操作

主要步驟：選擇分享表達(dá)目的基因的組織或細(xì)胞，制備總體RNA和mRNA-cDNA第一鏈和第二鏈的酶促合成和分級(jí)分離，與各種接頭連接并克隆到載體，包裝及轉(zhuǎn)染宿主菌，在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖成重組菌落或噬菌斑，篩選出含有目的基因的克隆，cDNA文庫(kù)的質(zhì)量檢測(cè)及保存

五、基因工程菌的培養(yǎng)方式，連續(xù)式發(fā)酵對(duì)基因工程產(chǎn)品大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)。影響基因工程菌發(fā)酵的主要因素有哪些？如何進(jìn)行基因工程菌發(fā)酵條件的研究。

培養(yǎng)方式：分批培養(yǎng)，補(bǔ)料分批培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)，透析培養(yǎng)，固定化培養(yǎng)

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連續(xù)培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)：

1、可為微生物提供恒定的生長(zhǎng)環(huán)境，控制其比生長(zhǎng)速率，2、可實(shí)現(xiàn)將工程菌的生長(zhǎng)階段和基因表達(dá)階段分開(kāi)進(jìn)行兩階段連續(xù)培養(yǎng)，并可通過(guò)優(yōu)化速率水平，稀釋率和比生長(zhǎng)速率這三個(gè)參數(shù)，保證在第一階段培養(yǎng)時(shí)質(zhì)粒穩(wěn)定，在第二階段獲得最高表達(dá)水平或最大產(chǎn)率。

影響基因工程菌發(fā)酵的主要因素：

1、培養(yǎng)基的影響。

2、接種量的影響。

3、溫度的影響。

4、溶解氧的影響。

5、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響。

6、誘導(dǎo)表達(dá)程序的影響。

7、pH的影響

研究?jī)?nèi)容：

1、選擇宿主菌：研究不同宿主菌對(duì)外源基因表達(dá)的影響

2、基因工程菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定3發(fā)酵條件對(duì)外源基因表達(dá)的影響

4、重組質(zhì)粒穩(wěn)定性研究

六、以包涵體表達(dá)形式的基因工程藥物的分離純化過(guò)程和方法，分離純化出具有活性的蛋白質(zhì)的一般步驟及其操作要點(diǎn)。如何進(jìn)行分離純化的研究。過(guò)程方法及操作要點(diǎn)：

1、菌體細(xì)胞的收集與破碎（既要使菌體破碎率盡可能高，又要保持包涵體的完整性）

2、包涵體的分離，洗滌與溶解（通過(guò)離心法使包涵體與上清液中的碎片及雜質(zhì)蛋白分開(kāi)。包涵體的洗滌基本原則：雜質(zhì)去除率盡可能高而不溶解包涵體中的目的蛋白。溶解包涵體的試劑選擇基本原則：（1）對(duì)目的蛋白的溶解性強(qiáng)，選擇性好，（2）保護(hù)蛋白質(zhì)的生物活性（3）安全性（4）適合后續(xù)各種純化操作（5）價(jià)廉）

3、變性蛋白的純化（對(duì)包涵體抽提物采用柱層析、凝膠過(guò)濾、離子交換層析和HPLC等方法進(jìn)一步分離純化）

4、蛋白質(zhì)的復(fù)性（恢復(fù)可溶性和生物活性，就考慮影響因素：蛋白質(zhì)嘗試，雜質(zhì)含量，重折疊速度，氧化還原劑用量和比例，重折疊配體的摻入，溫度，pH和離子強(qiáng)度等）分離純化研究：

1、破菌研究：破菌方法及其條件研究，鏡檢評(píng)價(jià)其破碎效果，原則是使菌體破碎率盡可能高，又要保持包涵體的完整性

2、包涵體的分離和洗滌研究：（1）分離包涵體時(shí)的離心力和時(shí)間的考察，（2）洗滌劑及其他濃度，用量研究（3）洗滌時(shí)間和溫度研究

3、目的蛋白的變性（抽提）研究：（1）變性劑及其濃度、用量的研究（2）變性操作時(shí)間和溫度研究（3）變性操作后的固液分離研究。

4、變性蛋白的純化研究：對(duì)包涵體抽提物可采取柱層析，凝膠過(guò)濾，離子交換層析和HPLC等方法進(jìn)一步分離純化。

5、變性蛋白的復(fù)必研究：考察比較不同復(fù)性方法對(duì)目的蛋白復(fù)性效果的影響。

6、目的蛋白的高度純化研究：對(duì)經(jīng)復(fù)性后得到的目的蛋白進(jìn)行進(jìn)一步高度純化，以滿足不同的需要。

七、基因工程藥物質(zhì)量控制的必要性及其質(zhì)控要點(diǎn)，基因工程藥物最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制特點(diǎn)及要點(diǎn)。必要性：

1、它是利用獲得細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)來(lái)制備產(chǎn)品，所獲得的蛋白質(zhì)往往分子量較大，并且具復(fù)雜的表達(dá)結(jié)構(gòu)

2、許多基因工程藥物都是參與人休一些生理功能精密的蛋白質(zhì)，在極微量的差別的情況下產(chǎn)生顯著效應(yīng)

3、宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因在翻譯，轉(zhuǎn)錄及工藝放大的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生變化、質(zhì)控要點(diǎn)：

1、原料的質(zhì)量控制。

2、生產(chǎn)的質(zhì)量控制。

3、最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制

質(zhì)控特點(diǎn)：任何單一的分析方法都無(wú)法滿足對(duì)該類產(chǎn)品的檢測(cè)要求，它需要綜合生物化學(xué)，2 / 5

免疫學(xué)，微生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等多門(mén)學(xué)科的理論和技術(shù)，才能切實(shí)保證基因工程產(chǎn)品的安全有效。

八、目的基因高效率表達(dá)的方式，全面提高目的基因表達(dá)水平的措施和方法。表達(dá)方式：

1、目的基因的不溶性高效表達(dá)：包涵體形式。

2、目的基因的可溶性高效表達(dá)：直接得到有生物活性的目的蛋白；

3、目的基因的高效分泌表達(dá)： 措施：

提高目的基因表達(dá)水平的措施(上游階段)1.對(duì)基因工程宿主菌進(jìn)行改造。2.選擇能高密度表達(dá)的宿主菌。3.選擇能提高目的蛋白表達(dá)質(zhì)量的宿主菌

提高目的基因表達(dá)水平的措施(下游階段)1.提高工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性。2.對(duì)重組菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)。3.減少乙酸等抑制性副產(chǎn)物的形成。4.選擇能提高目的蛋白表達(dá)質(zhì)量的方法

九、酶工程制藥的主要內(nèi)容

1、藥用酶的生產(chǎn)：發(fā)酵生產(chǎn)，分離純化，分子修飾

2、酶法制藥：酶催化反應(yīng)、固定化、非水相催化

十、酶法制藥研究中涉及到的研究項(xiàng)目及內(nèi)容

1、原料的選擇及反應(yīng)的研究。

2、酶或酶系的選擇研究。

3、酶催化反應(yīng)最佳工藝條件研究。

4、產(chǎn)物的分離純化研究

十一、植物細(xì)胞的生理特性，植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本流程和技術(shù)。生理特性：

1、比微生物細(xì)胞大得多；

2、具有群體生長(zhǎng)特性，單細(xì)胞難以生長(zhǎng)，繁殖；

3、對(duì)剪切力敏感，抗張力強(qiáng)度大，抗剪切力小；

4、生長(zhǎng)速度慢，操作周期長(zhǎng)；

5、容易結(jié)成細(xì)胞團(tuán)；

6、大多植物細(xì)胞的生長(zhǎng)及次級(jí)代謝物的生產(chǎn)都要求一定的光照和時(shí)間，且不同波長(zhǎng)的光具有不同的效果

基本流程：

1、外植體的獲得及預(yù)處理；

2、獲得懸浮細(xì)胞株

3、懸浮細(xì)胞株篩選

4、植物細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)；

5、大規(guī)模培養(yǎng) 基本技術(shù)：

1、植物細(xì)胞的獲得技術(shù)；

2、植物細(xì)胞的選育與改良技術(shù)；

3、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；

4、植物細(xì)胞培養(yǎng)次級(jí)代謝產(chǎn)物技術(shù)；

5、植物細(xì)胞培養(yǎng)生物轉(zhuǎn)化技術(shù)

十二、植物細(xì)胞獲取的主要方法及其操作過(guò)程

主要方法：從外植體直接分離，組織誘導(dǎo)獲取，原生質(zhì)體再生 操作過(guò)程：

1、外植體的選擇與預(yù)處理

2、直接分離：（1）機(jī)械搗碎法：先將外植體輕輕搗碎，然后通過(guò)過(guò)濾和離心分離細(xì)胞（2）酶解法：利用果膠酶，纖維素酶等處理，分離出具有代謝活性的細(xì)胞

3、愈傷組織誘導(dǎo)法：（1）誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備（2）外植體植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)生成愈傷組織（3）愈傷組織繼代培養(yǎng)

十三、植物細(xì)胞培養(yǎng)中提高植物次生代謝物生產(chǎn)的途徑。

1、添加誘導(dǎo)因子；

2、前體飼喂：在植物細(xì)胞培養(yǎng)中加入次生代謝物合成的前體物質(zhì)；

3、兩相法培養(yǎng)；

4、培養(yǎng)條件的控制；

5、在培養(yǎng)基中添加代謝產(chǎn)物合成抵制劑；

6、其他，如選育高產(chǎn)細(xì)胞株，二步法培養(yǎng)，新型生物反應(yīng)器等

十四、植物細(xì)胞培養(yǎng)制藥的培養(yǎng)方法。愈傷組織培養(yǎng)的基本過(guò)程和操作

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培養(yǎng)方法：

按培養(yǎng)對(duì)象分：愈傷組織培養(yǎng)，原生質(zhì)體培養(yǎng)，小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng) 按培養(yǎng)基類型分：固體培養(yǎng)，液體培養(yǎng)

按培養(yǎng)方式：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，固定化細(xì)胞培養(yǎng) 基本操作和過(guò)程：

1、愈傷組織培養(yǎng)基的配制；

2、愈傷組織的選擇；

3、接種；

4、培養(yǎng)

十五、植物細(xì)胞培養(yǎng)次級(jí)代謝物生產(chǎn)的基本工藝過(guò)程，如何對(duì)植物細(xì)胞培養(yǎng)次級(jí)代謝物生產(chǎn)制藥及植物細(xì)胞培養(yǎng)生物轉(zhuǎn)化制藥進(jìn)行研究 工藝過(guò)程：

1、外植體的選擇與處理；

2、植物細(xì)胞的獲得；

3、植物細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)；

4、植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)；

5、次級(jí)代謝物的分離純化 研究的內(nèi)容：

1、外植體的選擇和處理研究；

2、愈傷組織誘導(dǎo)；

3、植物細(xì)胞的誘變、篩選；

4、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的研究；

5、提取分離與純化方法研究

十六、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)，生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的種類及其特點(diǎn)，工程細(xì)胞庫(kù)的種類及要求，細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇技術(shù)及其操作要領(lǐng)

生理特點(diǎn)：

1、動(dòng)物細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng)；

2、細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象；

3、正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命有限；

4、對(duì)環(huán)境敏感；

5、對(duì)培養(yǎng)基要求高；

6、蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同 細(xì)胞種類及特點(diǎn)：

1、原代細(xì)胞：增殖能力有限，需大量動(dòng)物

2、二倍體細(xì)胞體：傳代壽命有限，具有明顯的貼壁依賴和接觸抑制特點(diǎn)，無(wú)致癌性

3、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：具有無(wú)限繁殖超額能力，倍增時(shí)間較短，對(duì)培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)因子要求較低

4、融合細(xì)胞系：雜交特性

5、重組工程細(xì)胞系

工程細(xì)胞庫(kù)的種類及要求：

1、原始細(xì)胞庫(kù)（MCB）:儲(chǔ)存于MCB的細(xì)胞應(yīng)該是單一來(lái)源的均質(zhì)細(xì)胞，對(duì)二倍體細(xì)胞應(yīng)該是群體倍增水平盡可能低的細(xì)胞。儲(chǔ)存時(shí)需有該細(xì)胞的詳細(xì)檔案，包括該細(xì)胞系的歷史，我和對(duì)各種有害因子的檢查結(jié)果

2、生產(chǎn)用細(xì)胞（MWCB）儲(chǔ)存于MWCB的細(xì)胞應(yīng)該是從MCB來(lái)的，或從單一安瓿來(lái)，或從多個(gè)安瓿在融化即刻混合在一起的然后經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增達(dá)一定數(shù)量后，再分裝儲(chǔ)存形成的細(xì)胞庫(kù)。該細(xì)胞庫(kù)同樣需要建檔案，而且需進(jìn)行無(wú)菌性的無(wú)細(xì)胞交叉污染的檢查 細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇技術(shù)及其操作要領(lǐng)：

常用技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加入適量保護(hù)劑的緩慢冷凍法保存細(xì)胞。步驟：細(xì)胞懸液制備，加保護(hù)劑，分裝和封口，液氮凍存。

復(fù)蘇一般采用快速融化法，以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞。

十七、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)與增殖過(guò)程，動(dòng)物細(xì)胞與微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞在培養(yǎng)上的區(qū)別，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方法和操作方式及其特點(diǎn) 生長(zhǎng)與增殖過(guò)程：原代培養(yǎng)期，傳代培養(yǎng)期，衰退期

培養(yǎng)區(qū)別：

1、動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，且大多哺乳動(dòng)物細(xì)胞附著在固體或半固體的表面才能生長(zhǎng)

2、對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)格，除氨基酸，維生素，鹽類，葡萄糖或半乳糖外，還需要血清

3、動(dòng)物細(xì)胞對(duì)環(huán)境敏感，包括pH，溶氧，溫度，剪切應(yīng)力都比微生物有更晉嚴(yán)的要求，4 / 5

培養(yǎng)方法及特點(diǎn)：

1、懸浮培養(yǎng)：適用于一切各類的懸浮細(xì)胞和兼性貼壁細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件較均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴(kuò)大規(guī)模培養(yǎng)。缺點(diǎn)：較難采用灌流培養(yǎng)，細(xì)胞密度一般較低

2、貼壁培養(yǎng)：適用于一切貼壁細(xì)胞和兼性貼壁細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：適用的細(xì)胞各類廣，較易采用灌流培養(yǎng)，細(xì)胞密度高，缺點(diǎn)：操作比較麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不均一，傳質(zhì)和傳氧較差。

3、貼壁－懸浮培養(yǎng)：將懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)兩者結(jié)合，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，主要方法有：微載體培養(yǎng)，包埋和微囊培養(yǎng)，結(jié)團(tuán)培養(yǎng)。操作方法及特點(diǎn)：

1、分批式操作：細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)

2、流加式操作：不斷加入營(yíng)養(yǎng)成分而不取出條件培養(yǎng)基

3、半連續(xù)式操作：每隔一段時(shí)間取出部分培養(yǎng)物，補(bǔ)充同樣數(shù)量新鮮培養(yǎng)基

4、連續(xù)式操作：連續(xù)地加入新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)等速地取出反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)液（包括細(xì)胞）

5、灌流式操作：不斷取出部分條件培養(yǎng)基（無(wú)細(xì)胞），補(bǔ)充等量新鮮培養(yǎng)基

十八、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥的基本工藝過(guò)程。目前用哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白工業(yè)化過(guò)程的主要通用技術(shù)平臺(tái)及其特點(diǎn)

動(dòng)物細(xì)胞－搗碎－組織碎片－酶處理－單個(gè)細(xì)胞－離心收集細(xì)胞－營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)－培養(yǎng)瓶培養(yǎng)－消化處理－接種－擴(kuò)大培養(yǎng)－種子細(xì)胞液氮保存－取出細(xì)胞種子－種子解凍復(fù)活培養(yǎng)－擴(kuò)大培養(yǎng)－接種－大規(guī)模培養(yǎng)－產(chǎn)物分離純化－產(chǎn)品 技術(shù)平臺(tái)及特點(diǎn)：

主要是以攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)（70％以上）作為通用技術(shù)平臺(tái),平臺(tái)工藝的特點(diǎn)是采用無(wú)血清培養(yǎng)（50％以上）和成熟的流加和灌流工藝。

懸浮培養(yǎng)工藝中影響細(xì)胞生產(chǎn)數(shù)量和質(zhì)量的因素,主要應(yīng)考慮細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境(營(yíng)養(yǎng)條件、產(chǎn)物積累、pH、溫度和滲透壓),終產(chǎn)物(乳酸和氨)毒性累積和必需營(yíng)養(yǎng)物的添加等。設(shè)計(jì)適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基,控制營(yíng)養(yǎng)物的添加,減少產(chǎn)物消耗積累是解決問(wèn)題的有效手段。對(duì)于攪拌的剪切損害可通過(guò)反應(yīng)器的優(yōu)化被減少, 另外在培養(yǎng)液中添加剪切保護(hù)劑。貼壁細(xì)胞生產(chǎn)工藝,最佳的生物反應(yīng)器形式是攪拌式微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng),并可提供最有效的優(yōu)化工藝和最適宜的流加工藝設(shè)計(jì)。最佳的工藝設(shè)計(jì)是高密度連續(xù)灌流培養(yǎng)。流加培養(yǎng)和灌流培養(yǎng)是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝中最常用的兩種操作方式

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第二篇：生物制藥技術(shù)

08藥學(xué)***3陳省委

組合生物合成藥物進(jìn)展

摘 要50年來(lái)抗生素在人類疾病治療中發(fā)揮了重要作用,今后的幾十年里它們也將是關(guān)鍵的治療劑。盡管在過(guò)去的20年中通過(guò)靶向篩選發(fā)現(xiàn)了一些微生物藥物,但是這種篩選方法很難發(fā)現(xiàn)新類型藥物。組合生物合成可以彌補(bǔ)這種不足,通過(guò)基因工程方法改造微生物基因和酶,產(chǎn)生新的抗生素,發(fā)現(xiàn)那些在自然界中不能發(fā)現(xiàn)的藥物。

關(guān)鍵詞 基因工程合生物合成新抗生素

微生物種類繁多,其產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)豐富多彩,生物活性十分廣泛,是開(kāi)發(fā)各種新產(chǎn)品的豐富資源,但是傳統(tǒng)的篩選方法已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足社會(huì)發(fā)展的需要。隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展,以及基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息組學(xué)、代謝組學(xué)研究的深入,人們對(duì)微生物基因組的研究也有了顯著進(jìn)展,已經(jīng)闡明了許多與微生物代謝有關(guān)的生物合成基因,為微生物組合生物合成藥物的研究和開(kāi)發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

一、研究背景

自1928年弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素和1942年瓦克斯曼發(fā)現(xiàn)鏈霉素以來(lái),微生物藥物在疾病防治和拯救人類生命中起著十分重要和不可替代的作用,特別是抗生素被國(guó)外科學(xué)家譽(yù)為20世紀(jì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的皇冠寶石。微生物藥物一直是臨床最常用的藥物,在西方發(fā)達(dá)國(guó)家,抗生素占臨床處方藥物的20%以上,在中國(guó)約占處方藥物的30%。但自上世紀(jì)70年代后,隨著脊髓灰質(zhì)炎、天花、麻風(fēng)等傳染性疾病先后在全球范圍內(nèi)被消滅,國(guó)家對(duì)微生物藥物研究的支持逐漸下降,抗傳染病藥物研究進(jìn)入了困難時(shí)期。上世紀(jì)90年代后,我國(guó)在已有億乙肝病毒攜帶者的基礎(chǔ)上,又出現(xiàn)了100萬(wàn)以上人類免疫缺陷病毒(HIV)攜帶者。2002年末以來(lái),重急性呼吸窘迫綜合征(SARS)的出現(xiàn)使我國(guó)的傳病控制告急,不得不重新思考微生物藥物的研究策略在新的時(shí)期里,微生物藥物研究再度升溫,原因

①新病原微生物不斷出現(xiàn),如SARS、艾滋病(AIDS)瘋牛病等;②生物武器的使用,如炭疽等;③各種耐菌株在世界范圍的傳播;④許多傳染性疾病,如肺核、血吸蟲(chóng)病等的死灰復(fù)燃。目前國(guó)內(nèi)外側(cè)重研究的生物藥物,主要有抗新病原微生物,抗耐藥菌,抗病毒,抗腫瘤抗生素以及微生物來(lái)源的生理活性物質(zhì)。微物藥物的研究主要

包括以下內(nèi)容:①抗新病原微生藥物的尋找與開(kāi)發(fā);②細(xì)菌耐藥機(jī)制及其抗耐藥細(xì)藥物研究;③微生物藥物的生物合成基因研究;④組生物合成微生物藥物研究。其中組合生物合成微生藥物是近年發(fā)展較快的研究領(lǐng)域,將在創(chuàng)新藥物研中發(fā)揮重要作用。

二、組合生物合成生物技術(shù),尤其是基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展,為生物醫(yī)藥領(lǐng)域開(kāi)辟了廣闊的前景;通過(guò)基因工程技術(shù)所得到的藥物也在臨床治療某些疑難疾病中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。

廣義,基因工程產(chǎn)品分為兩類

①單基因直接產(chǎn)物。通常是指單個(gè)基因編碼序列的翻譯產(chǎn)物(蛋白質(zhì)),它們一般是生物大分子如干擾素和單克隆抗體,目前生物醫(yī)藥領(lǐng)域中開(kāi)發(fā)的多數(shù)產(chǎn)品均屬于此類,其中包含有效地用于臨床治療的如重組人胰島素、干擾素和促紅細(xì)胞生成素。我國(guó)在此領(lǐng)域獨(dú)創(chuàng)的藥物不多,而且這類藥物的一個(gè)突出缺點(diǎn)是它們比較容易被仿制,只要有了相應(yīng)的細(xì)胞系即可利用基本設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)。

②多基因間接產(chǎn)物。是指由多基因編碼的多酶體系介導(dǎo)而合成的小分子化合物和多肽,包括自然界由微生物和植物產(chǎn)生的天然產(chǎn)物,如抗生素、生理活性物質(zhì)或萜類化合物等結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的化合物。它們品種繁多,性能各異,僅就目前研究得比較深入的聚酮體和萜類化合物,就包括具有抗腫瘤作用的阿霉素、紫杉醇,具有免疫抑制作用的FK506、西莫羅司,具有降血酯作用的洛伐他汀、銀杏內(nèi)酯,具有抗結(jié)核桿菌作用的利福霉素,抗瘧藥物青蒿素等。

組合生物合成(combinatorial biosynthesis)是在微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因和酶學(xué)研究基礎(chǔ)上形成的。組合生物合成的概念是結(jié)構(gòu)不同但生物合成途徑相似的抗生素生物合成基因之間可以進(jìn)行重組、組合或互補(bǔ)產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)的化合物。盡管微生物藥物的結(jié)構(gòu)多樣,但形成這些產(chǎn)物的主要生化反應(yīng)機(jī)制卻基本相同,它們通常是由非常簡(jiǎn)單的化學(xué)物質(zhì),如小分子羧酸和某些氨基酸作為合成起始單位和延伸單位,通過(guò)由一系列基因編碼的多酶體系參與的生物化學(xué)反應(yīng)(構(gòu)成一個(gè)合成途徑)而形成的,參與這些天然產(chǎn)物生物合成的多酶體系是由多個(gè)結(jié)構(gòu)明顯分開(kāi)的功能區(qū)域所組成。研究表明,參與這類小分子生物合成的基因通常是連鎖或鄰接而構(gòu)成一個(gè)基因簇(cluster),這為基因的克隆和操作提供了方便,同時(shí)由于參與

次級(jí)代謝生物合成酶系對(duì)底物的特異性,專一性要求不是很嚴(yán)格的,對(duì)結(jié)構(gòu)相類似的底物均可識(shí)別,這一特點(diǎn)為不同基因組合產(chǎn)生新的化合物創(chuàng)造了條件。因此,有針對(duì)性地對(duì)某些基因進(jìn)行操作,如替換、阻斷、重組以及添加、減少組件等,均有可能改變其生物合成途徑而產(chǎn)生新的代謝旁路(metabolic pathway),繼而形成新的化合物,這就為組合生物合成提供了基礎(chǔ),國(guó)際上已有通過(guò)這些手段得到多個(gè)化合物的報(bào)道。

三、研究的科學(xué)意義

開(kāi)展微生物基因工程組合生物合成創(chuàng)制新型藥物研究,具有如下意義。

1、利用組合生物合成體系,完成化學(xué)方法不能完或難以完成的活性化合物的合成,如抗癌藥物紫杉(taxol)等;這類活性化合物在自然界中含量少、需要大、醫(yī)學(xué)價(jià)值高,而且通常化學(xué)合成困難(成本高,難大,環(huán)境污染嚴(yán)重),為了確保紅豆杉資源的可持續(xù)用,除正在開(kāi)展的苗圃栽培,并以苗圃作為紫杉醇提的原料之外,通過(guò)生物合成來(lái)使它們具最終的商業(yè)值是一個(gè)極具潛力的手段。例如,與抗癌藥物紫杉醇用相似的埃波霉素(epothilone)已在鏈霉菌中通過(guò)合生物合成方法獲得表達(dá),現(xiàn)已進(jìn)入開(kāi)發(fā)研究階段。、對(duì)一些現(xiàn)有的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物如青蒿素銀杏內(nèi)酯等有效組分進(jìn)行定向合成,對(duì)臨床用抗生品種進(jìn)行有針對(duì)性的修飾和改造,如對(duì)紅霉素進(jìn)行造產(chǎn)生酮內(nèi)酯型的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,獲得對(duì)臨床藥菌具有活性的抗生素衍生物;或者通過(guò)對(duì)現(xiàn)有天產(chǎn)物或抗生素的結(jié)構(gòu)改造,獲得具有全新活性的或化性能有明顯改善的天然產(chǎn)物或新抗生素。、組合生物合成產(chǎn)生新化合物的潛力很大,化合數(shù)是以可操作基因的指數(shù)方式形成,如設(shè)R為可利的基因數(shù),n是每個(gè)基因的不同等位形式(即不同天產(chǎn)物來(lái)源的數(shù)目),從理論上講經(jīng)過(guò)基因組合可得Rn種排列組合,即得到Rn個(gè)化合物。通過(guò)組合生合成,獲得一大批新化合物,作為高通量藥物篩選樣庫(kù)的來(lái)源之一。、由于多基因組合操作的平臺(tái)是以易于大規(guī)模產(chǎn)的微生物體系為基礎(chǔ),使創(chuàng)制新型藥物的研究便產(chǎn)業(yè)化。、組合生物合成的研究,必將推動(dòng)我國(guó)在基因水對(duì)天然資源的利用,更好地利用植物代謝產(chǎn)物,挖掘前實(shí)驗(yàn)室條件下無(wú)法進(jìn)行培養(yǎng)的生物體,包括海洋的生物體。隨著研究和應(yīng)用的發(fā)展,植物和海洋生物級(jí)代謝產(chǎn)物的組合生物學(xué)研究,也將蓬勃

發(fā)展起來(lái)。

四、國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

1985年,Hopwood教授[4]在世界首次報(bào)道用遺工程的手段合成“非天然”的天然產(chǎn)物isochromanequinone,該工作為后來(lái)的組合生物合成奠定了礎(chǔ)。在以后的十幾年里,這一領(lǐng)域成為天然產(chǎn)物代工程研究中最活躍的領(lǐng)域,許多微生物次級(jí)代謝研的專家都加入這一領(lǐng)域的工作,因?yàn)榻M合生物合成潛力制造出很多先導(dǎo)化合物。目前的發(fā)展趨勢(shì)由最初的基礎(chǔ)研究逐步演變?yōu)榛A(chǔ)與應(yīng)用兼顧,有的地向產(chǎn)業(yè)化邁進(jìn)。該領(lǐng)域的研究也同樣得到工界的重視,美國(guó)加州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)公司研制的埃波素(epothilone D)已進(jìn)入III期臨床評(píng)價(jià)階段。埃霉素原來(lái)由纖維堆囊黏細(xì)菌產(chǎn)生,其產(chǎn)量低,繁殖時(shí)間長(zhǎng),產(chǎn)品無(wú)法進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。該公司利用基因組合技術(shù)使纖維堆囊黏細(xì)菌的埃波霉素生物合成基因在鏈霉菌中得到表達(dá),并通過(guò)酰基轉(zhuǎn)移酶域替換及羥基化酶基因的阻斷,獲得了主要產(chǎn)生埃波霉素中抗腫瘤活性最好組分的epothilone D的基因工程菌。我國(guó)自上世紀(jì)80年代初開(kāi)展以多基因組合工程技術(shù)研制新藥的研究,在聚酮類抗生素如大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、利福霉素、安莎霉素及抗生素產(chǎn)生菌分子生物學(xué)研究方面,取得一定進(jìn)展。國(guó)家重大專項(xiàng)支持的基因工程必特螺旋霉素己進(jìn)入臨床研究,基因工程必特螺旋霉素的研制為組合生物合成技術(shù)應(yīng)用于小分子化合物的創(chuàng)制中提供了良好的工作基礎(chǔ)和經(jīng)驗(yàn)。我國(guó)微生物代謝產(chǎn)品研究歷史悠久,已形成多學(xué)科協(xié)調(diào)合作的體系,近年來(lái)在國(guó)家的支持下該體系已得到一定的發(fā)展,加強(qiáng)了微生物及代謝產(chǎn)物資源的開(kāi)發(fā)。我們已逐步建立難培養(yǎng)極端微生物和未培養(yǎng)微生物資源及海洋微生物的挖掘工作,建立并完善從土壤或其他來(lái)源直接分離DNA技術(shù)。我國(guó)有很強(qiáng)的有機(jī)化學(xué)合成能力,可以合成進(jìn)行組合合成的起始單元,開(kāi)展前體介導(dǎo)的組合生物合成(precursor-directed biosynthesis)研究。我們已建立并不斷完善多種生物活性篩選模型,有天然產(chǎn)物化學(xué)分離鑒定及藥理、藥效、毒理評(píng)估的配套學(xué)科。

目前基因工程技術(shù)的發(fā)展水平,在單基因操作方面已經(jīng)比較成熟;在多基因操作層次上雖然技術(shù)難度相對(duì)比較大,但近年來(lái)在此研究領(lǐng)域已有了迅猛的發(fā)展,已積累了較好的研究基礎(chǔ),許多次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇已得到克隆,基因結(jié)構(gòu)與功能已得到闡明,并且發(fā)展了一系列大容量載體和合適的宿主表達(dá)系統(tǒng)。組合生物合成已形成國(guó)際藥物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和一個(gè)重要發(fā)展方向。

五、研究方向與前景

我國(guó)天然微生物及植物資源豐富,以微生物作為平臺(tái)的藥物生產(chǎn)歷史悠久、種類繁多,利用這一寶庫(kù)開(kāi)展組合生物合成研究,建立新型化合物庫(kù),作為新型藥物或先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源之一,有重要的理論與實(shí)際意義。組合生物合成為當(dāng)今世界研究熱點(diǎn),我國(guó)也有一定工作基礎(chǔ),開(kāi)展這方面的研究將有利于加深對(duì)次級(jí)代謝生物合成機(jī)理的研究與應(yīng)用、促進(jìn)生物技術(shù)新藥研制中的作用,對(duì)發(fā)展我國(guó)新藥有重要意義,并推動(dòng)新藥研究中高通量篩選技術(shù)與方法的建立與善,篩選出有價(jià)值的新藥。

我們要重點(diǎn)加強(qiáng)難培養(yǎng)微生物及海洋生物資源挖掘工作,建立并完善從土壤或其他來(lái)源直接分DNA技術(shù),以豐富組合生物合成基因資源;加強(qiáng)微物天然化學(xué)研究,建立微量、快速、高效鑒定天然產(chǎn)化學(xué)結(jié)構(gòu)的技術(shù)和方法;充分利用我們已經(jīng)建立的種生物活性篩選模型,通過(guò)廣泛地聯(lián)合與協(xié)作,擴(kuò)展合生物合成技術(shù)在創(chuàng)新藥物中的應(yīng)用,建立我國(guó)基工程微生物組合生物合成創(chuàng)制新型藥物或先導(dǎo)化合研究的技術(shù)平臺(tái)。該研究將有助于開(kāi)拓和促進(jìn)我國(guó)新技術(shù)在新藥研究與開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用,對(duì)創(chuàng)制具有我自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新藥將會(huì)有積極推動(dòng)作用。

對(duì)本課程的意見(jiàn)：

1、可能是因?yàn)檫x課人太少的問(wèn)題，上課的時(shí)候沒(méi)有很好的聽(tīng)課氣氛，不過(guò)主要

還可能是自己的原因，自己不能集中精神聽(tīng)講。

2、以后只要選課的人比較多了，應(yīng)該會(huì)好一些，上課的人少了，總是覺(jué)得就像

這門(mén)課不重要，老師講的很清晰，主要是我們上課時(shí)常開(kāi)小差。自從上了大學(xué)，就沒(méi)太有人管了，有時(shí)聽(tīng)起課來(lái)就愛(ài)聽(tīng)不聽(tīng)，這倒是對(duì)每門(mén)課都差不多的。

3、課堂上可以稍微提問(wèn)一下，因?yàn)樘釂?wèn)往往可以引起同學(xué)們的注意，這樣走神的情況可能會(huì)少一些。

4、課堂中還可以穿插一些與課程有關(guān)的歷史、說(shuō)一下那些地方比較適合做研究、考研究生去哪里比較好啊什么的，這樣既可以對(duì)現(xiàn)在的科研大環(huán)境有所了解，課堂內(nèi)容也不至于太單調(diào)。

最后謝謝老師兢兢業(yè)業(yè)地為我們把課上完，盡管上課人數(shù)少，你還是把課完整地給我們講完，謝謝老師為我們的付出。

第三篇：生物制藥技術(shù)

酶

分離純化酶的一般程序

1粗酶液的制備：材料的選擇，發(fā)酵液處理，細(xì)胞破碎及酶的抽提 2酶的初步分離：鹽析，等電點(diǎn)沉淀，有機(jī)溶劑沉淀，離心分離 3酶的高度純化（酶的精制）：層析法（凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析及親和層析），電泳（等電聚焦電泳）

4濃縮干燥及結(jié)晶：透析，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，超濾，冷凍干燥

酶的主要純化技術(shù)－層析技術(shù)

利用混合液中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的不同，(分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù))，使各組分以不同的比例分布在兩相中，當(dāng)流動(dòng)相以一定的速度流經(jīng)固定相時(shí)，各組分的移動(dòng)速度不同，從而使不同的組分分離的技術(shù)過(guò)程。稱為層析技術(shù)（chromatography）

離子交換層析（ion exchange chromatography）

在一定的pH條件下，帶電荷的蛋白質(zhì)與高分子不溶性固定相偶聯(lián)的離子交換基團(tuán)相吸附，流動(dòng)相中解離的離子與被吸附的酶發(fā)生可逆的交換，而對(duì)不同吸附能力的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離 離子交換劑的選擇：陰離子交換劑用于處理凈電荷為負(fù)的蛋白質(zhì)，陽(yáng)離子交換劑用于處理凈電荷為正的蛋白質(zhì)

樣品在低離子濃度條件下上柱，逐漸增加洗脫液的離子濃度，使蛋白依次被洗脫下來(lái) 洗脫方式可以是步進(jìn)式洗脫或線性梯度洗脫 洗脫液一般用 NaCl

凝膠過(guò)濾法（gel filtration）亦稱分子篩層析、排阻層析，是利用生物大分子的相對(duì)分子質(zhì)量的差異進(jìn)行層析分離的一種方法

凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進(jìn)入凝膠層析柱后，各個(gè)組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴(kuò)散，組分的擴(kuò)散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴(kuò)散到孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動(dòng)相向下流動(dòng)，它們經(jīng)歷的流程短，流動(dòng)速度快，所以首先流出；而較小的分子則可以完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，經(jīng)歷的流程長(zhǎng)，流動(dòng)速度慢，所以最后流出；

分離提純 脫鹽 測(cè)定高分子物質(zhì)的相對(duì)分子量

疏水層析（hydrophobic chromatography）

原理：蛋白質(zhì)分子中含有亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸等疏水性較強(qiáng)的氨基酸，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液經(jīng)過(guò)疏水層析介質(zhì)的疏水配基時(shí)，蛋白的疏水性集團(tuán)（疏水補(bǔ)丁）會(huì)與疏水配基發(fā)生親和作用而被吸附在介質(zhì)上。不同蛋白質(zhì)分子中疏水基團(tuán)的數(shù)量和特性有所不同。在洗脫時(shí)通過(guò)改變洗脫液的極性達(dá)到分離的目的

親和層析（affinity chromatography）

也稱功能層析、生物專一吸附或選擇層析。根據(jù)生物分子與特定的固相化配基（ligand）之間的親和力而使生物分子得到分離的方法 酶與激活劑/抑制劑/底物/輔酶；抗原與抗體；激素/配體與受體；蛋白質(zhì)與DNA/RNA上特定區(qū)域

特定的配基（激活劑/抑制劑/底物/輔酶）固定于惰性載體 目的酶與配基特異性親和吸附，雜質(zhì)被洗脫 改變洗脫條件，解除目的酶與配基的專一性結(jié)合

固定化酶（細(xì)胞）的定義

優(yōu)點(diǎn)：

1.穩(wěn)定性顯著提高；

2.同一批固定化酶能重復(fù)多次地使用； 3.固定化后，很容易與反應(yīng)物分開(kāi)（過(guò)濾），不污 染產(chǎn)物，而且有利于控制生產(chǎn)過(guò)程，同時(shí)也省去了 熱處理等使酶失活的步驟；

4.可長(zhǎng)期使用，并可預(yù)測(cè)衰變的速度； 5.提供了研究酶動(dòng)力學(xué)的良好模型。缺點(diǎn)：

①固定化時(shí)，酶活力往往有損失。②增加了生產(chǎn)的成本，初始投資大。

③只能用于可溶性底物，而且較適用于小分子底物，對(duì)大分子底物不適宜。④非均相反應(yīng)。

①注意維持酶的催化活性及專一性。在酶的固定化過(guò)程中，酶與載體的結(jié)合部位不應(yīng)當(dāng)是酶的活性部位，而且要盡量避免那些可能導(dǎo)致酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞的條件。②固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化。為此，用于固定化的載體必須有一定的機(jī)械強(qiáng)度，不能因機(jī)械攪拌而破碎或脫落。

③固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻，盡可能不妨礙酶與底物的接近，以提高產(chǎn)品的產(chǎn)量。④酶與載體必須結(jié)合牢固，從而使固定化酶能回收貯藏，利于反復(fù)使用。

⑤固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性，所選載體不與廢物、產(chǎn)物或溶劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。⑥固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用。

載體結(jié)合法

1物理吸附法2離子結(jié)合法3共價(jià)結(jié)合法 是將酶結(jié)合于不溶性載體上的一種固定化方法。1）物理吸附法 作用方式：非特異性物理吸附作用：范德華力；氫鍵；疏水作用；靜電作用 優(yōu)點(diǎn)：制作簡(jiǎn)單，酶分子的構(gòu)象很少或基本不發(fā)生變化，固定化酶活力較高 缺點(diǎn)：酶與載體結(jié)合力弱，酶易從載體脫落 載體：纖維素、瓊脂糖、活性炭、沸石及硅膠等 2)離子結(jié)合法

作用方式：離子鍵結(jié)合

優(yōu)點(diǎn)：制作簡(jiǎn)單，處理?xiàng)l件緩和，酶蛋白的活性中心和高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞較少，可以制得活力較高的固定化酶。

缺點(diǎn)：離子鍵結(jié)合較松散，如在高離子強(qiáng)度下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，酶與載體易分開(kāi)。載體：多糖類離子交換劑，合成高分子離子交換樹(shù)脂 3)共價(jià)鍵結(jié)合法

作用方式：共價(jià)鍵結(jié)合

優(yōu)點(diǎn)：酶分子和載體間的共價(jià)鍵較牢固，有良好的穩(wěn)定性及重復(fù)使用性 缺點(diǎn)：制備過(guò)程復(fù)雜，反應(yīng)條件比較劇烈，酶活性損失比較嚴(yán)重。

制作方法：先將載體活化，在載體上引入一個(gè)活化基團(tuán)，然后該活化基團(tuán)再與酶分子表面的基團(tuán)（羧基/氨基/羥基）反應(yīng)結(jié)合。有戊二醛法、重氮化法、烷基化法等。

交聯(lián)法

利用雙功能（或多功能）基團(tuán)的試劑，使酶蛋白分子之間發(fā)生交聯(lián)，凝集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而成為固定化酶

常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐和雙偶氮苯等。其中最常用的是戊二醛

包埋法

1網(wǎng)格型2微囊型

將酶包埋在凝膠的微小空格內(nèi)或埋于半透膜的微型膠束內(nèi)，但底物仍能滲入到里面與酶接觸。

載體：凝膠，高分子聚合物（半透膜）

優(yōu)點(diǎn)：利用此法制得的固定化酶，由于酶分子僅僅是被包埋起來(lái)，而未受到化學(xué)作用。酶蛋白幾乎不起變化。

缺點(diǎn)：酶被包埋在內(nèi)部，對(duì)大分子底物很難發(fā)生催化作用。所以用包埋法制備的酶，一般只適用與小分子底物。

包埋法分為：網(wǎng)格包埋法和微囊包埋法。

酶?jìng)鞲衅鳎╡nzyme sensor）1生物傳感器的概念

由生物識(shí)別物質(zhì)（如酶、微生物、動(dòng)植物組織、抗體等）和能量轉(zhuǎn)換器相結(jié)合所構(gòu)成的分析儀器，可以簡(jiǎn)便快速的測(cè)定各種特異性很強(qiáng)的物質(zhì) 要求識(shí)別物質(zhì)對(duì)被測(cè)物具有高度的敏感性和選擇性

根據(jù)識(shí)別物質(zhì)可分為：酶?jìng)鞲衅鳌⒔M織傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器

2、生物傳感器的一般結(jié)構(gòu)與工作原理 結(jié)構(gòu):有兩個(gè)部分組成

生物分子識(shí)別元件（感受器）：酶、核酸、抗體、細(xì)胞等 信號(hào)轉(zhuǎn)換器（換能器）：電化學(xué)電極、光學(xué)檢測(cè)元件、熱敏電阻、表面等離子共振器件等 原理：待測(cè)物質(zhì)經(jīng)擴(kuò)散作用進(jìn)入生物傳感器,通過(guò)分子識(shí)別發(fā)生特異的生物化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生的生化信號(hào)經(jīng)換能器轉(zhuǎn)換為可定量和可處理的電信號(hào),進(jìn)而可檢測(cè)出該物質(zhì)的濃度.根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)不同，可選擇相應(yīng)的換能器.抗體

多克隆抗體：由于一個(gè)抗原通常都有幾個(gè)抗原決定簇，因此每個(gè)免疫細(xì)胞都可能產(chǎn)生一種針對(duì)某一抗原決定簇（antigenic determinant）的抗體，這些由同一抗原產(chǎn)生的不同抗體統(tǒng)稱為多克隆抗體。這些由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體，稱為多克隆抗體（polyclonal antibodies，PcAb）。

單克隆抗體：?jiǎn)我活愋偷闹会槍?duì)某一抗原決定簇的抗體分子，是由單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)和特異性完全相同的高純度抗體。

抗原的制備

1.用基因工程技術(shù)制備重組蛋白抗原

2.提取純化天然抗原

3.合成多肽半抗原

4.小分子半抗原

5.多肽半抗原及小分子半抗原與載體偶聯(lián)

免疫

動(dòng)物選擇：Balb/c小鼠，品系一致

途徑

體內(nèi)，體外，脾內(nèi)免疫

篩選陽(yáng)性克隆及克隆化

克隆：由單個(gè)細(xì)胞繁殖擴(kuò)增而形成性狀均一的細(xì)胞集落的過(guò)程。

目的：篩選陽(yáng)性克隆；確保雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗體具有單克隆性以及從細(xì)胞群中篩選

出具有穩(wěn)定表現(xiàn)型。

篩選陽(yáng)性克隆鑒定

單克隆抗體活性檢測(cè)方法：

1）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）：可溶性抗原、細(xì)胞核病毒。2）放免測(cè)定（RIA）：可溶性抗原、細(xì)胞抗體。3）FAC（熒光激活細(xì)胞分選儀，流式培養(yǎng)儀）：針對(duì)細(xì)胞表面

抗原的抗體檢測(cè)。

4）IFA（間接免疫熒光法）：用于細(xì)胞和病毒抗體的檢測(cè)。

雜交瘤細(xì)胞的克隆化

（1）有限稀釋技術(shù) 柏松分布（2）半固體瓊脂培養(yǎng)法

0.5%瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行克隆

1ml含不同數(shù)量的細(xì)胞懸液

1ml42度0.5%的瓊脂液

單克隆抗體的大量制備

基因工程抗體（genetically engineered antibodies,gAb）

是通過(guò)基因工程技術(shù)研制的，即通過(guò)PCR技術(shù)獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當(dāng)載體重組后引入不同表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體。基因工程抗體既保持了單抗的均一性、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，又能克服其為鼠源性的不足，是拓展單抗廣泛人體使用的重要途徑。

（一）嵌合抗體（chimeric antibody）

特點(diǎn)：是用人抗體的C區(qū)替代鼠的C區(qū)。效果：使鼠源性單抗的免疫原性明顯減弱，并可延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期及改善藥物的動(dòng)力學(xué)。嵌合抗體的優(yōu)點(diǎn)：

保持了親本鼠單抗的特異性和親和力；

減少人源性的恒定區(qū)的HAMA現(xiàn)象；

能有效地介導(dǎo)產(chǎn)生補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）及免疫調(diào)理作用。缺點(diǎn)：

目前已有數(shù)十種嵌合抗體進(jìn)入了臨床試用，雖然HAMA現(xiàn)象較鼠單抗大為下降，但有相當(dāng)比例的患者仍會(huì)出現(xiàn)HAMA癥狀，針對(duì)可變區(qū)的抗獨(dú)特型抗體反應(yīng)仍很明顯。

（二）改型抗體（reshaped antibody，RAb）亦叫“重構(gòu)抗體”，“CDR移植抗體（CDR grafting antibody）”。它是利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（V）中互補(bǔ)性決定區(qū)（complementarity determinative region，CDR）的氨基酸序列改換成鼠源單抗CDR 序列。

特點(diǎn)：此種抗體可以使人單抗獲得鼠單抗的特異性又保持人源抗體的親和力。

動(dòng)物

動(dòng)物細(xì)胞分類

1、貼壁依賴性細(xì)胞 概念：anchoraged-dependent cell需要有適量帶電荷的固體或半固體支持表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞 大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都屬于此類。

2、非貼壁依賴性細(xì)胞

概念：anchoraged-independent cell不依賴于固體支持物表面生長(zhǎng)的細(xì)胞，可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)，被稱為懸浮細(xì)胞。舉例：血液、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞，Namalwa細(xì)胞。

3、兼性貼壁細(xì)胞

概念：對(duì)支持物的依賴性不嚴(yán)格，既可貼壁生長(zhǎng)，也可懸浮生長(zhǎng)。舉例：CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、L929細(xì)胞。理想的藥物生產(chǎn)細(xì)胞系

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本原理

將體外構(gòu)建的重組DNA分子(目的基因或基因組片段)通過(guò)顯微注射、或轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞等方法注入動(dòng)物的受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞,然后將此受精卵或胚胎再植入受體動(dòng)物的輸卵管或子宮中，使其發(fā)育成攜帶外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

同源重組

雙鏈DNA的兩個(gè)區(qū)段的DNA序列基本一致，但不一定完全相同，叫做同源區(qū)。同源的雙鏈DNA可以通過(guò)相互交換進(jìn)行重組。

外源DNA如有同源區(qū)，也可通過(guò)類似的同源重組過(guò)程整合到生物的染色體基因組上。

胚胎干細(xì)胞（Embryonic Stem Cell，ES）是從早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)體外培養(yǎng)建立起來(lái)的多潛能細(xì)胞系，具有胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征和分化特征。

新型

反義技術(shù)：根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，使用與目標(biāo)靶的遺傳物質(zhì)（DNA或mRNA）特定互補(bǔ)的核苷酸片段來(lái)封閉基因表達(dá)的技術(shù)方法。

反義藥物：人工合成或生物合成的DNA或RNA，能與RNA互補(bǔ)，抑制疾病基因的表達(dá)。反義核酸（antisense nucleic acid）是一段與靶基因的某段序列互補(bǔ)的天然存在或人工合成的核苷酸序列。它可通過(guò)堿基配對(duì)與細(xì)胞內(nèi)核酸特異結(jié)合形成雜交分子，從而在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，具有合成方便、序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、容易修飾、選擇性高、親和力高等特點(diǎn)。

核酶(ribozyme)具有酶活性的RNA，可降解特異的mRNA序列。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）

由雙鏈RNA介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)特異性mRNA降解過(guò)程，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默。

基因?qū)敕绞?/p>

直接體內(nèi)療法（in vivo）

是指將目的基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。間接體內(nèi)療法（ex vivo）

是指在體外將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選和增殖后將細(xì)胞回輸給患者，使該基因在體內(nèi)有效地表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物，以達(dá)到治療的目的。

腫瘤的基因治療

（一）通過(guò)抑癌基因抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

（二）通過(guò)病毒感染殺傷腫瘤細(xì)胞

（三）通過(guò)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞

（四）腫瘤的自殺基因治療

（五）腫瘤抗原靶向的腫瘤基因治療

（六）細(xì)胞因子基因治療

第四篇：生物制藥技術(shù)介紹

生物制藥技術(shù)作為一種高新技術(shù)，是70年代初伴隨著DNA重組技術(shù)和淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的發(fā)明和應(yīng)用而誕生的。三十多年來(lái)，生物制藥技術(shù)的飛速發(fā)展為醫(yī)療業(yè)、制藥業(yè)的發(fā)展開(kāi)辟了廣闊的前景，極大地改善了人們的生活。因此，世界各國(guó)都把生物制藥確定為21世紀(jì)科技發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)和新興產(chǎn)業(yè)。國(guó)家發(fā)改委新增 4.42 億元支持生物制藥產(chǎn)業(yè)，生物制藥專業(yè)前景看好。生物科技的重大突破正在迅速孕育和催生新的產(chǎn)業(yè)革命，生物產(chǎn)業(yè)將成為繼信息產(chǎn)業(yè)之后世界經(jīng)濟(jì)中又一個(gè)新的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)。近年來(lái)，從國(guó)家到地方各級(jí)政府不斷加大力度支持生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

培養(yǎng)目標(biāo)

旨在培養(yǎng)熟練掌握生物工程實(shí)用技術(shù)、精通現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室和生物制品生產(chǎn)車間的管理、擅長(zhǎng)生物制品推銷的實(shí)用型人才。學(xué)生畢業(yè)時(shí)能熟練掌握有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)、生物化學(xué)的基本技能、普通生物學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、動(dòng)植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、微生物發(fā)酵技術(shù)、生物制藥技術(shù)、實(shí)驗(yàn)室安全與管理等生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)；畢業(yè)生能夠在企、事業(yè)科研機(jī)構(gòu)、大專院校、生物技術(shù)公司從事生物技術(shù)產(chǎn)品研究、開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)管理、營(yíng)銷等工作。課程設(shè)置

①專業(yè)課：大學(xué)英語(yǔ)、無(wú)機(jī)及分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、普通生物學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)、藥劑學(xué)、微生物發(fā)酵技術(shù)、藥理學(xué)、基因工程技術(shù)、免疫學(xué)、藥事管理、植物組織培養(yǎng)技術(shù)、生物制藥技術(shù)細(xì)胞工程。②實(shí)驗(yàn)課：無(wú)機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)、普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、基礎(chǔ)分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)。③實(shí)習(xí)：針對(duì)人才市場(chǎng)的需求設(shè)置實(shí)習(xí)實(shí)訓(xùn)內(nèi)容，主要有生物制品的營(yíng)銷實(shí)戰(zhàn)、實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)技能實(shí)習(xí)、科研院所實(shí)戰(zhàn)實(shí)習(xí)、畢業(yè)實(shí)習(xí)。

就業(yè)面向

能在有關(guān)制藥企業(yè)、科研單位、高等院校及醫(yī)藥公司等部門(mén)從事生物藥物的研究與開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)和管理、藥物檢驗(yàn)、醫(yī)藥工程設(shè)計(jì)以及外貿(mào)、醫(yī)藥代表、營(yíng)銷等工作。

第五篇：《生物制藥技術(shù)》實(shí)驗(yàn)

《生物制藥技術(shù)》實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

實(shí)驗(yàn)一 金霉素鏈霉菌培養(yǎng)基的制備（驗(yàn)證型）

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、學(xué)會(huì)培養(yǎng)基的配制

2、掌握滅菌方法。實(shí)驗(yàn)原理：

金霉素鏈霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦稱“金色鏈霉菌”，放線菌門(mén)(Actinobacteria)，放線菌綱(Actinobacteria)，放線菌目(Actinomycetales)，鏈霉菌科(Streptomycetaceae)，鏈霉菌屬(Streptomyces)。在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生金色色素，故名。其菌落為草帽型, 菌落直徑一般為3～5毫米, 表面較平坦, 中間有隆起。菌落開(kāi)始為白色，長(zhǎng)孢子后變青色。在顯微鏡下可以看到短桿狀的菌絲。抗菌素工業(yè)上用以生產(chǎn)金霉素。

放線菌是一類介于細(xì)菌與真菌之間的單細(xì)胞微生物。放線菌在土壤中分布最多，大多數(shù)生活在含水量較低、有機(jī)質(zhì)豐富和微堿性的土壤中。多數(shù)情況下，泥土中散發(fā)出的“泥腥味”就是由放線菌中鏈霉菌產(chǎn)生的土腥素造成的。放線菌大都好氧，屬于化能異養(yǎng)，菌絲纖細(xì)，分枝，常從一個(gè)中心向周圍輻射生長(zhǎng)。因其生長(zhǎng)具輻射狀，故名放線菌。放線菌能像真菌那樣形成分枝菌絲，并在菌絲末端產(chǎn)生外生的分生孢子，有些種類甚至形成孢子囊，因而曾被誤認(rèn)是真菌。但其菌落較小而致密，不易挑取。不少菌種在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)上廣泛應(yīng)用，可產(chǎn)生抗菌素，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)和分離出的由放線菌產(chǎn)生的抗生素多達(dá)4 000多種，其中，有50多種抗生素已經(jīng)廣泛地得到應(yīng)用，如鏈霉素、紅霉素、土霉素、四環(huán)素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于臨床治療人的多種疾病；有些可生產(chǎn)蛋白酶、葡萄糖異構(gòu)酶；有的用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，如滅瘟素、井岡霉素、慶豐霉素等。

四環(huán)素類抗生素是由鏈霉菌生產(chǎn)或經(jīng)半合成制取的一類廣譜抗生素。抗菌譜極廣，包括革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌、立克次體、衣原體、支原體和螺旋體。品種主要包括金霉素、四環(huán)素和土霉素。器材：

1ml移液槍；鋁鍋；電爐 試劑：

NaBr母液（100 g／L）KCl母液（100 g／L）

M-促進(jìn)劑母液（2.5 g／L）實(shí)驗(yàn)步驟： 1．種子培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g／L)：可溶性淀粉40，黃豆餅粉20，酵母粉5，蛋白胨5，CaCO3 4，(NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，KH2PO4 0.25。

先稱取黃豆餅粉20g，單獨(dú)煮沸10分鐘，加入少量涼水降溫，4層紗布?jí)赫ト≈c其它稱好的各成分混合，定容至1L。

每50ml分裝到250ml三角瓶中，每組2瓶。2．定向發(fā)酵培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基(g／L)：可溶性淀粉100，黃豆餅粉40，蛋白胨15，CaCO3 5，酵母粉2.5，(NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，α—淀粉酶0.1。

配制方法同種子培養(yǎng)基，配好后分裝到500ml三角瓶中，每瓶100ml，分別加入如下成分，比較它們對(duì)四環(huán)素產(chǎn)量的影響：

(1)對(duì)照(不加其他成分)；

(2)加入NaBr母液至終濃度為2g／L；(3)加入KCl母液至終濃度為2g／L；

(4)加入NaBr母液至終濃度為2g／L及M-促進(jìn)劑母液至終濃度為0.025g／L。每?jī)山M配一套。3．滅菌

將封好口的培養(yǎng)基121℃滅菌30min。同時(shí)滅1ml 剪口移液槍頭、1.5mL離心管。（總過(guò)程：稱量——溶化——定容——分裝——封口——滅菌）注意事項(xiàng)：

1．黃豆餅粉煮沸取汁。

2．培養(yǎng)基封口最好用8層紗布或棉花塞，最好不用橡膠塞，以增加透氣性。3．滅菌時(shí)鍋內(nèi)要補(bǔ)足水分。由于滅菌鍋較大，升溫排氣一定要充分（10min）。補(bǔ)充閱讀：

工業(yè)發(fā)酵中利用生產(chǎn)菌發(fā)酵得出最終產(chǎn)物是一個(gè)逐級(jí)放大的過(guò)程，各個(gè)不同的階段對(duì)于營(yíng)養(yǎng)成分的要求也各有特點(diǎn)，根據(jù)發(fā)酵不同階段的要求，培養(yǎng)基可分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種。

孢子培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培養(yǎng)基，對(duì)這種培養(yǎng)基的要求是能使菌體迅速生長(zhǎng)，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)的孢子，并要求這種培養(yǎng)基不易引起菌種發(fā)生變異。所以對(duì)孢子培養(yǎng)基的基本配制要求是：第一，營(yíng)養(yǎng)不要太豐富（特別是有機(jī)氮源），否則不易產(chǎn)孢子。如灰色鏈霉在葡萄糖－硝酸鹽－其它鹽類的培養(yǎng)基上都能很好地生長(zhǎng)和產(chǎn)孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只長(zhǎng)菌絲而不長(zhǎng)孢子。第二，所用無(wú)機(jī)鹽的濃度要適量，不然也會(huì)影響孢子量和孢子顏色。第三，要注意孢子培養(yǎng)基的pH和濕度。生產(chǎn)上常用的孢子培養(yǎng)基有：麩皮培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、玉米碎屑培養(yǎng)基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食鹽等配制成的瓊脂斜面培養(yǎng)基。大米和小米常用作霉菌孢子培養(yǎng)基，因?yàn)樗鼈兒可伲杷伞⒈砻娣e大，所以是較好孢子培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)和大量繁殖菌絲體，并使菌體長(zhǎng)得粗壯，成為活力強(qiáng)的“種子”。所以種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也要高些，但總濃度以略稀薄為好，這樣可達(dá)到較高的溶解氧，供大量菌體生長(zhǎng)繁殖。種子培養(yǎng)基的成分要考慮在微生物代謝過(guò)程中能維持穩(wěn)定的pH，其組成還要根據(jù)不同菌種的生理特征而定。一般種子培養(yǎng)基都用營(yíng)養(yǎng)豐富而完全的天然有機(jī)氮源，因?yàn)橛行┌被崮艽碳ゆ咦影l(fā)芽。但無(wú)機(jī)氮源容易利用，有利于菌體迅速生長(zhǎng)，所以在種子培養(yǎng)基中常包括有機(jī)及無(wú)機(jī)氮源。最后一級(jí)的種子培養(yǎng)基的成分最好能較接近發(fā)酵培養(yǎng)基，這樣可使種子進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)基后能迅速適應(yīng)，快速生長(zhǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌種生長(zhǎng)、繁殖和合成產(chǎn)物之用。它既要使種子接種后能迅速生長(zhǎng)，達(dá)到一定的菌絲濃度，又要使長(zhǎng)好的菌體能迅速合成需產(chǎn)物。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長(zhǎng)所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進(jìn)劑等。但若因生長(zhǎng)和生物合成產(chǎn)物需要的總的碳源、氮源、磷源等的濃度太高，或生長(zhǎng)和合成兩階段各需的最佳條件要求不同時(shí)，則可考慮培養(yǎng)基用分批補(bǔ)料來(lái)加以滿足。

實(shí)驗(yàn)二 金霉素鏈霉菌的定向發(fā)酵（驗(yàn)證型）

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、學(xué)習(xí)和掌握無(wú)菌操作技術(shù)。

2、掌握定向發(fā)酵四環(huán)素的原理。實(shí)驗(yàn)原理：

定向發(fā)酵是指通過(guò)改變培養(yǎng)基組分(加入某些物質(zhì))改變微生物代謝途徑，使發(fā)酵按主觀要求產(chǎn)生較多的產(chǎn)物。

金霉素、四環(huán)素和土霉素，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)極為相似：

R1 R2 Cl H H OH H H

金霉菌原是產(chǎn)生金霉素（Chlortetracycline）的菌種，但因金霉素比四環(huán)素只多一個(gè)氯離子，所以只要在發(fā)酵液中加入某些物質(zhì)，阻止氯離子進(jìn)入四環(huán)素分子，從而使菌種產(chǎn)生較多的四環(huán)素。另外，金色鏈霉菌在30℃以下時(shí)，合成金霉素的能力較強(qiáng)；當(dāng)溫度超過(guò)35℃時(shí)則只合成四環(huán)素。

本實(shí)驗(yàn)中，利用溴離子在生物合成過(guò)程中對(duì)氯離子有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑作用的原理，以及加入2-硫醇基苯并噻唑(即M—促進(jìn)劑，分子式：C7H5NS2，通常作為橡膠硫化促進(jìn)劑)抑制氯化酶的作用，從而增加四環(huán)素的產(chǎn)量。材料和試劑：

金霉素鏈霉菌：購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（菌種保藏號(hào)：CGMCC4.1043；訂單號(hào)20111133 550元）。實(shí)驗(yàn)步驟：

前期準(zhǔn)備工作：配制斜面培養(yǎng)基（可選，1號(hào)培養(yǎng)基由菌種保藏中心提供）

1、麩皮36.0 g，K2HPO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，（NH4）2HPO4 3 g，瓊脂 15～20 g，定容至1L，pH 7。

2、可溶性淀粉20g，KN O3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl

0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，定容至1L，pH 7.2~7.5。

1、制備斜面孢子：將保藏的菌種的比例接種于液體培養(yǎng)基中（不加瓊脂的斜面培養(yǎng)基），28℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)，將活化1d后的金霉素鏈霉菌種接入斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5～7天，金霉素 土霉素 四環(huán)素

待孢子長(zhǎng)成灰色，于4℃冰箱中保藏。

2、種子培養(yǎng)：在斜面上用接種鏟挑取1cm2左右生長(zhǎng)良好的菌體接入裝有50ml四環(huán)素種子培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，230 r/min、28℃下振蕩培養(yǎng)20～24h。

3、發(fā)酵培養(yǎng)：以剪口移液槍頭取10 ml種子液接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)液的500ml錐形瓶中（注意：同一處理組用同一瓶種子液接種），230 r/min、28℃下振蕩培養(yǎng)5 d。用于后面的測(cè)定效價(jià)和薄層層析實(shí)驗(yàn)。

四環(huán)素的提取和精制（選作）

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．掌握沉淀法精制四環(huán)素的原理、方法和基本操作技術(shù)。2 ．熟悉pH 的控制與產(chǎn)量、質(zhì)最的關(guān)系。

二、實(shí)驗(yàn)原理

四環(huán)素為兩性化合物，其等電點(diǎn)為5.4。當(dāng)溶液pH 等于等電點(diǎn)時(shí)，四環(huán)素呈游離堿形式，從水溶液中沉淀出來(lái)。利用四環(huán)素的這一性質(zhì)，可將四環(huán)素從發(fā)酵液中提取出來(lái)。

在連續(xù)結(jié)晶過(guò)程中，pH 的高低對(duì)產(chǎn)量、質(zhì)量都有一定的影響。四環(huán)素的等電點(diǎn)為5.4 , 在pH 4.5~7.5 之間，游離堿在水中的溶解度乎不變。若pH 控制在接近等電點(diǎn)時(shí)，沉淀結(jié)品雖然比較完全，收率也高，但此時(shí)會(huì)有大量雜質(zhì)同時(shí)析出，影響產(chǎn)品的色澤和質(zhì)量；若pH控制得較低一些，對(duì)提高產(chǎn)品質(zhì)量雖有好處，但沉淀結(jié)晶不夠完全，收率會(huì)低些，影響產(chǎn)量。因此，在選擇沉淀結(jié)晶pH 時(shí)，就必須同時(shí)考慮到產(chǎn)量、質(zhì)量的效果。在正常情況下，工藝上控制pH4.8左右。若沉淀結(jié)晶質(zhì)量較差，pH可控制得稍低些，有利于結(jié)晶質(zhì)量的改善，但不能低于4.5，否則收率低，影響產(chǎn)量。

四環(huán)素的提取和精制分酸化、純化、過(guò)濾、結(jié)晶和淋洗五個(gè)步驟。

(1)酸化加入草酸，使積聚在菌絲體內(nèi)的四環(huán)素盡可能多地成為可溶性鹽，而轉(zhuǎn)入液相。四環(huán)素在酸性條件下較隱定，且草酸與鈣離子反應(yīng)生成不溶性的草酸鈣，析出的草酸鈣能促進(jìn)蛋白質(zhì)的凝固，提高濾液的純度和過(guò)濾速度。

(2）純化 純化劑（黃血鹽、硫酸鋅和硼砂）與草酸一起混合作用，可以除去發(fā)酵液中大量酸溶性蛋白質(zhì)、鐵離子和其他多種離子色素以及其他雜質(zhì)，從而使濾液純凈，并減少發(fā)酵液的粘度，利于過(guò)濾。其中純化劑黃血鹽能與發(fā)酵液中的鐵離子作用，生成普魯士鹽而除去鐵離子。

(3）過(guò)濾 通過(guò)過(guò)濾，使四環(huán)素溶液與菌絲體以及其他雜質(zhì)分離，再經(jīng)過(guò)復(fù)濾、精濾，進(jìn)一步提高濾液質(zhì)址，得到澄清的濾液。

(4)結(jié)晶

將濾液的pH調(diào)節(jié)到等電點(diǎn)，在較低溫度下析出純凈的四環(huán)素。

(5）淋洗 雖然發(fā)酵液經(jīng)酸化后大部分四環(huán)素已溶入溶液中，但仍有部分殘存在菌渣中，且過(guò)濾不可能十分徹底。所以用酸水淋洗，以提高收率。

三、實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 1．試劑

300 g/L草酸溶液、200 g/L 黃血酸鉀溶液、200 g/L 硫酸鋅溶液、200 g/L 硼砂溶液、濃氮水、3 g/L草酸溶液。2．儀器

1000 mL 燒杯、攪拌器、布氏漏斗、抽濾瓶、濾紙、量筒、pH 試紙、酸度計(jì)、溫度計(jì)、水泵、表面皿。

四、實(shí)驗(yàn)步驟 1．酸化

取600ml 四環(huán)素發(fā)酵液，置裝有機(jī)械攪拌的1000 mL燒杯中，開(kāi)始攪拌，待發(fā)酵液溫度降至20 ℃ 以下時(shí)，緩緩加入草酸溶液，草酸加入量為27～35g/L，并不時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的pH。當(dāng)發(fā)酵液pH為1.7~1.8 時(shí)（用酸度計(jì)測(cè)定），酸化完畢。2．純化

在酸化反應(yīng)的燒壞中，按酸化的發(fā)酵液凈體積，攪拌下依次緩慢加入純化劑（黃血酸鉀溶液、硫酸鋅溶液、硼砂溶液），每種溶液終濃度均為2 g/L，加入時(shí)間間隔15min，以便作用完全。3．過(guò)濾

將布氏漏斗裝于抽濾瓶上，鋪好濾紙，開(kāi)啟水泵，用少量水將濾紙濕潤(rùn)，并使濾紙緊貼布氏漏斗。將純化后的溶液緩緩倒入布氏漏斗，過(guò)濾濾液應(yīng)完全澄清，否則必須重新過(guò)濾，直到完全澄清。4.結(jié)晶

將抽濾瓶中的濾液倒入裝有機(jī)械攪拌的1000 mL燒杯中，開(kāi)動(dòng)攪拌，并用水或冰水冷卻。待濾液溫度冷至5 ～ 7 ℃ 時(shí)，徐徐加入經(jīng)過(guò)濾的濃氨水，并隨時(shí)用pH 試紙測(cè)定溶液的pH，當(dāng)pH 達(dá)到4.6 ～4.8 時(shí)（用酸度計(jì)測(cè)定），停止加入氨水，并繼續(xù)攪拌2 h，使結(jié)晶完全。

裝好布氏漏斗后，將上述液緩緩倒人布氏漏斗，過(guò)濾。結(jié)晶液全部倒入后，抽干。用35～45 ℃ 的熱水充分洗滌粗堿3 次，抽干，再用0.3 ％草酸洗滌，抽干。

五、注意事項(xiàng)

1．純化攪拌時(shí)間不應(yīng)少于2h，溶液溫度保持在15 ℃ 以下。2．pH 要調(diào)準(zhǔn)確。

六、結(jié)果與討論 ．計(jì)算四環(huán)素的得率。．討論影響四環(huán)素得率和純度的因素。

實(shí)驗(yàn)三 四環(huán)素、金霉素的薄層層析鑒定（驗(yàn)證型）

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

掌握薄層層析的原理，四環(huán)素族抗生素的定性鑒定方法。實(shí)驗(yàn)原理：

層析（色譜，chromatograpby）是相當(dāng)重要、且相當(dāng)常見(jiàn)的一種技術(shù)，在把微細(xì)分散的固體或是附著于固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動(dòng)相的系統(tǒng)中（根據(jù)移動(dòng)相種類的不同，分為液相層析和氣相層析二種），使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態(tài)邊移動(dòng)，利用各成分對(duì)固定相親和力不同所引起的移動(dòng)速度差，將它們彼此分離開(kāi)的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。用作固定相的有硅膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹(shù)脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土和纖維素那樣的無(wú)活性的載體上附著適當(dāng)?shù)囊后w。將作為固定相的微細(xì)粉末狀物質(zhì)裝入細(xì)長(zhǎng)形圓筒中進(jìn)行的層析稱為柱層析（column chromatography），在玻璃板上涂上一層薄而均的支持物（硅膠、纖維素和淀粉等）作為固定相的稱為薄層層析（thin layer chromatography），或者用濾紙作為固定相的紙上層析。層析根據(jù)固定相與溶質(zhì)（試料）間親和力的差異分為吸附型、分配型、離子交換型層析等類型。但這并不是很嚴(yán)格的，有時(shí)常見(jiàn)到其中間類型。此外，近來(lái) 5 也應(yīng)用親和層析，即將與基質(zhì)類似的化合物（通常為共價(jià)鍵）結(jié)合到固定相上，再利用其特異的親和性沉淀與其對(duì)應(yīng)的特定的酶或蛋白質(zhì)。

分配層析在支持物上形成部分互溶的兩相系統(tǒng)。一般是水相和有機(jī)溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和淀粉等親水物質(zhì)，這些物質(zhì)能儲(chǔ)留相當(dāng)量的水。被分離物質(zhì)在兩相中都能溶解，但分配系數(shù)不同，展層時(shí)就會(huì)形成以不同速度向前移動(dòng)的區(qū)帶。一種溶質(zhì)在兩種互不混溶的溶劑系統(tǒng)中分配時(shí)，在一定溫度下達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相溶劑中的濃度之比為一常數(shù)，稱為分配系數(shù)。當(dāng)欲被分離的各種物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同時(shí)，它們就能被分離開(kāi)。分配系數(shù)大的移動(dòng)快（阻力小）。

薄層層析是以薄層材料為支持物，在密閉容器中，樣品在其上展開(kāi)。當(dāng)斑點(diǎn)不易為肉眼觀察時(shí)，可利用適當(dāng)?shù)娘@色劑，或通過(guò)紫外燈下產(chǎn)生熒光的方法進(jìn)行觀察。通過(guò)這種展開(kāi)操作，各成分呈斑點(diǎn)狀移動(dòng)到各自的位置上，再根據(jù)Rf值的測(cè)定進(jìn)行鑒定。薄層色譜法具有分離與鑒定的雙重功能，通過(guò)薄層圖譜與對(duì)照品的圖譜相比較，除了能鑒出有效成分或特征成分外，還以完整的色譜圖作為一個(gè)整體對(duì)制劑加以鑒別。薄層色譜分析法由于簡(jiǎn)便、快速，能有效地、直觀地反映藥品地真實(shí)性、穩(wěn)定性，現(xiàn)已成為藥物制劑的鑒別和質(zhì)量控制的行之有效的方法之一。薄層層析是鑒別抗生素的方法之一，層析后進(jìn)行顯色，并繪制層析圖譜，根據(jù)層析圖譜對(duì)抗生素進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)以四環(huán)素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為對(duì)照對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行鑒定。

儀器和設(shè)備：

1.玻璃層析缸

2.層析板（薄層層析硅膠煙臺(tái)芝罘區(qū)黃務(wù)硅膠開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)廠有售）3.毛細(xì)玻璃管或微量注射器 4.紫外投射儀 試劑：

四環(huán)素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)品 用0.01M鹽酸溶解定容，4℃冰箱保存（可使用7天）。展開(kāi)劑：正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)2L。凡士林 實(shí)驗(yàn)步驟：

1．層析板處理

層析板105℃烘烤過(guò)夜，均勻噴上0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PH4.5)，于空氣中晾干、備用。

2．點(diǎn)樣

選取兩種定向發(fā)酵液加草酸酸化至pH為1.5～2.0，取上清約l.2 ml于1.5ml離心管中，10000 rpm，5min，備用。在距層析板底邊2.5~3 cm起始線上(用鉛筆劃線，做出點(diǎn)樣點(diǎn)記號(hào))，用毛細(xì)玻璃管在薄層層析板上點(diǎn)四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品和金霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液3次，發(fā)酵液上清點(diǎn)8～10次，點(diǎn)樣點(diǎn)不大于0.4cm，每次都要吹干后再點(diǎn)。（一般效價(jià)在1000u／ml以上點(diǎn)3次，500～1000u／ml點(diǎn)4次，200～500u／ml點(diǎn)5次）。剩余的發(fā)酵液上清于4℃冰箱保存。

3.層析（展開(kāi)）

用正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)的上相作展開(kāi)劑。層析前需預(yù)先用展開(kāi)劑預(yù)平衡層析缸，可在缸中倒入2cm高的展開(kāi)劑，密閉，一般保持15－30分鐘。然后將層析板置于盛有展開(kāi)劑的層析缸中，在室溫下展層6～8h（與溫度有關(guān)）。封口不嚴(yán)可涂抹凡士林。

4．熒光顯影

待溶劑前沿展至板的一半以上時(shí)將層析板取出，標(biāo)出溶劑前沿，于通風(fēng)櫥中晾干，用氨水熏數(shù)秒鐘后即可在紫外燈下顯影，畫(huà)出黃色斑點(diǎn)，分別算出Rf值。（四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品慢和金霉素標(biāo)準(zhǔn)品快）

無(wú)水四環(huán)素在波長(zhǎng)365nm下顯黃色熒光，根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照可定性測(cè)定。注意事項(xiàng)：

因四環(huán)素能和鈣鹽形成不溶性化合物，故發(fā)酵液中的四環(huán)素濃度不高，預(yù)處理時(shí)通常用草酸將發(fā)酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四環(huán)素盡量溶解。

點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面。要控制好點(diǎn)樣量，樣品太少，斑點(diǎn)不清楚，難以觀察，但樣品量太多時(shí)往往出現(xiàn)斑點(diǎn)太大或拖尾現(xiàn)象。

若因樣品溶液太稀，可重復(fù)點(diǎn)樣，但應(yīng)待前次點(diǎn)樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點(diǎn)樣，以防樣點(diǎn)過(guò)大，造成拖尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象，而影響分離效果。

作展開(kāi)劑中極少量強(qiáng)極性溶劑(0.5％)或pH值的改變可顯著改善拖尾現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)四 四環(huán)素的效價(jià)測(cè)定（綜合型）

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、了解抗生素效價(jià)的表示方法

2、學(xué)習(xí)抗生素的測(cè)定方法 實(shí)驗(yàn)原理：

實(shí)驗(yàn)利用比色法測(cè)定四環(huán)素和金霉素的效價(jià)。效價(jià)(titer或titre)是評(píng)價(jià)抗生素效能的標(biāo)準(zhǔn)，它代表抗生素對(duì)微生物的抗菌效力，也是衡量發(fā)酵液中抗生素含量的尺度，人們以1μg金霉素或四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品為1個(gè)單位，0.6μg青霉素G鈉鹽為1個(gè)單位。

四環(huán)素和金霉素在酸性條件下，加熱，可產(chǎn)生黃色的脫水金霉素和脫水四環(huán)素，其色度與含量成正比。

在堿性條件下，四環(huán)素較穩(wěn)定，而金霉素則生成無(wú)色的異金霉素：

根據(jù)上述原理，可以在酸性條件下，利用比色法測(cè)定四環(huán)素、金霉素混合液的總效價(jià)；而四環(huán)素效價(jià)的測(cè)定可在堿性條件下，使金霉素生成無(wú)色的異金霉素，然后再在酸性條件下，使四環(huán)素生成黃色的脫水四環(huán)素，經(jīng)比色測(cè)得四環(huán)素效價(jià)。總效價(jià)與四環(huán)素效價(jià)二者之差即為金霉素的效價(jià)。本實(shí)驗(yàn)只測(cè)定四環(huán)素的效價(jià)。

因四環(huán)素能和鈣鹽形成不溶性化合物，故發(fā)酵液中的四環(huán)素濃度不高，預(yù)處理時(shí)通常用草酸將發(fā)酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四環(huán)素盡量溶解。發(fā)酵液中，由于雜質(zhì)的干擾，將影響比色的正確性，因此加入乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)作為螯合劑，掩飾金屬離子的干擾，改變四環(huán)素脫水條件(降低酸度或延長(zhǎng)加熱時(shí)間)，可以減少雜質(zhì)對(duì)比色反應(yīng)的干擾。實(shí)驗(yàn)步驟：

取上述保存的處理發(fā)酵液上清l ml(效價(jià)約為1000U／m1)于50ml容量瓶中，加入lml濃度為lg／l00ml EDTA溶液，加蒸餾水9ml，再加入lml濃度為3mol／L的NaOH，在20~25℃下保溫15min后，加入2.5ml濃度為6mol／L的HCl，煮沸15min后，冷卻，稀釋至刻度，在分光光度計(jì)上于440nm處測(cè)定其吸光度值。（紫外為100-390nm；可見(jiàn)光為380-780nm，根據(jù)波長(zhǎng)選擇石英比色池或玻璃比色池，否則玻璃對(duì)于紫外光有吸收）

對(duì)照樣品（不加誘導(dǎo)劑）的前處理方法與上述步驟一樣，只是在加入HCl后，不加熱，稀釋至刻度，作為測(cè)定樣品的空白對(duì)照, 調(diào)零。

四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（1000U/ml）取1ml于50ml容量瓶中，加1ml濃度為6mol／L的HCl，水浴煮沸15min后，冷卻，稀釋至50ml，380nm測(cè)吸光度。（以蒸餾水作為空白測(cè)定）

以定向發(fā)酵培養(yǎng)基中的對(duì)照組作為空白對(duì)照，測(cè)定其它三個(gè)處理組的吸光度。（有時(shí)可能因?qū)φ战M處理不當(dāng)而使其它組的讀數(shù)為負(fù)值，這時(shí)可以以蒸餾水作為空白。）

計(jì)算公式：

發(fā)酵液中四環(huán)素的效價(jià)=

A發(fā)酵 A四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)

×四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)