第一篇：自考現代生物制藥技術

自考現代生物制藥技術

一、名詞概念

二、知識點

自考現代生物制藥技術

吉林大學現代生物制藥技術)

一、名詞概念 1.生物工程：應用生物科學17微細胞：是某些細菌的突變株在生長期間產生的一類微小的圓形的無核細胞，它具細胞壁及細胞膜、DNA上，并引入受體細胞，從而可使受體細胞獲得外源基因的遺傳信息，并進行正常的復制，表達和遺傳。細胞大規模培養。

52半連續培養法：在反應器中投料和接種，培養一段時間后，將培養液和新鮮培的理論、方法，按照人們設計的藍圖，改良加工生物或用生物及其制備物作為加工原料，以提供所需生物制品為人類社會服力的綜合性科學技術。

2.養液進行交換的掊養方法，稱為半連續培養法。

53動物細胞工程：根據細胞生物學及工程學原理定向改造動物細胞遺傳性、創造新物種，通過工程化為人類提供名貴藥品服務的技術，稱為動物細胞工程。54動物細胞培養技術：在一定條件下，通過人工供給營養物質及生長因子，使離體動物細胞或組織生長繁殖的方法，稱為動物細胞培養技術。

55細胞塊培養法：將動物組織切成直徑1～2mm小塊，進行培養的方法，稱為組織塊培養法。

56細胞單層培養法：動物組織塊經銷化分散成單個細胞或細胞團塊后，粘附于培養容器表面培養成新生細胞單層的培養法，稱為細胞單層培養法。

57單細胞分離培養：動物組織分散后，將其單個細胞培養成純系細胞集群的技術，稱之為單胞分離培養。58確立細胞株：正常細胞在移植繼代過程中，有些細胞增殖力突增強，在特定條件下可無限繁殖，與初代細胞相比，其形態、生理生化特性，病毒敏感生，抗原性及染色體結構均發生變化，具有致癌性，這些細胞稱為確立細胞株。

59動物體細胞雜交技術：在外力作用下，令兩上或兩上以上異源細胞合并為一個多核細胞的過程，稱為動物體細胞雜交技術。

60核體：細胞核連同其外表薄層細胞質構成的顆粒稱為核體。

61胞質體：不具有細胞核的細胞稱為胞質體。

62微核雜種細胞：按完整細胞之間的融合方式，將微核與另一完整細胞融合，使后者獲得另一種細胞中的若干個染色體，所獲融合子稱為微核雜種細胞。

63抗藥性篩選系統：利用生物細胞對藥物敏感性差異篩選雜種細胞的方法。64營養缺陷型細胞：在一些營養物質的合成能力上出現缺陷，因此必須在基本培養基中加入相應的有機成分才能正常生長的變異細胞。

65營養互補選擇法：利用兩種親本細胞營養互補作用原理篩選雜種細胞的方法稱為營養互補選擇法。66雜交瘤技術：骨髓瘤細胞與免疫淋巴細胞融合制自考現代生物制藥技術

備雜種細胞的方法為雜交瘤技術。

67雜合瘤：骨髓瘤細胞與免疫淋巴細胞融合制備的雜種細胞稱為雜合瘤。68微載體培養法：將細胞吸附于微載體表面的培養方法。

69酶工程：應用酶的特異性催化功能并通過工程化為人類生產有用產品及提供有益服備的技術為本酶工程。

70酶：生物體內具有特殊催化功能的蛋白質稱為酶。85腫瘤壞死因子：是一種由巨噬細胞分泌能產生細胞素，使腫瘤細胞溶解的因子。

86干擾素：是一類在同種細胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質，其活性的發揮又受細胞基因組的調節和控制，涉及RNA和蛋白質的合成。

87集落刺激因子：CSF為一組糖蛋白物質，由淋巴細胞和單核細胞自然產生，有刺激紅細胞系以外造血細胞增殖和分化的作用。

質粒。

11．雄性大腸桿菌表面的性纖毛是一種接合質粒形成的表面物質。12．根據質粒在細胞中拷貝數的不同，可把質粒分為松馳型質粒和嚴緊型質粒。13．嚴緊質粒大多為具有自身傳遞能力的大質粒。14．分子量較大，自身傳遞上嚴緊型質粒的特點。15．分子量較小，不具自身傳遞性是松馳型質粒的特點。16．基因工程中使用的質粒39．大腸桿菌DNA連接酶只能催化DNA雙鏈的單鏈缺口和帶粘性末端的雙鏈DNA。

40．TDT即末端脫氧核苷酸轉移酶。

41．DNA連接酶的最適溫度

0

是37C。42．連接反應溫度應介于催化反應與末端粘合之間。43．根據受體系統不同，基因工程可分為微生物基因工程、動物基因工程和植物基因工程。44．關于感受態本質的假說71固定比酶：限制或定位于特定空間位置的酶稱為固定化醇。

72固定化細胞：被限制或定位于特定空間位置的細胞稱為固定化細胞。

73載體結合法：將細胞懸浮液直接與水不溶性轂體相結合的固定化方法。74包埋法：將細胞定位于凝膠網格內的技術稱為包埋法。

75偶聯效率：偶聯固定化反應過程中載體結合蛋白質的能力稱為偶聯效率。QQ：806235356 76酶活力：醇類催化特定化學反應的能力稱為酶活力。

77酶比活：指每毫克酶蛋白所表現的活力。

78固定化反應的酶活力回收串：固定醇所顯示的活力與加入偶聯液中酶總活力的比值稱為固定化反應的酶活力回收率。

79酶試劑盒；將酶、反應試劑、穩定劑、激活劑，填充劑、及緩沖劑等配成檢測用的混合制劑稱酶試劑盒。80細胞因子：是人類或動物的各類細胞分泌的具有多樣生物活性的因子，是可溶性物質，是一組不均一的蛋白質分子，能調節細胞的生長與分化。

81白細胞介素：由白細胞或其它細胞產生的又在白細胞間起調節作用和介導作用的因子。

82.IL-3：即白細胞介素3，由激活的T淋巴細胞產生，能刺激多能造血干細胞和各系細胞的分化和增殖，促進和維持肥大細胞的增殖，增殖中性粒細胞、酸性粒細胞的活性，促進NX細胞殺傷實體瘤的活性。

83.IL-10：由TH2細胞產生，能抑制TH1細胞合成因子的能力，是一種糖蛋白。84.IL-12：是由B淋巴細胞分泌的一種細胞因子，分子量為75KD的糖蛋白，其主要作有得促進PHA活化的PBMC增殖以及亞適劑量IL-2協同促進作用。88超誘導：是指細胞在某都是松馳型質粒。種大分子合成抑制物的適17．松馳型質粒可被氯霉素當作用，誘生蛋白合成增加擴增。的現象。

18．細菌收獲可通過離心進89生物反應調節劑：是生行。

物體體內的某些細胞和某19．細菌裂爭可采用：非離些分子，它們既是機體對內子型或離子型去污劑，有機外環境刺激應答的效應機溶劑，堿處理及加熱處理。制，也是機體維持內環境的20．λ噬菌體長約48.5kb。穩定因素。21．野生型λ噬菌體為雙鏈

線形分子，具有12個堿基

二、知識點 的粘性末端，進入大腸桿菌

包括局部原生質體化假說及酶受體假說。45．大腸桿菌感受的制備方法包括Hanahan法，氯化鈣法及電轉化法。46．局限性轉導只能轉導宿主染色體上少數基因。47．普遍性轉導可轉導宿主染色體上任何基因。

48．β-半乳糖基因插入失活法的重組質粒產生白色菌落。

49．不帶β-半糖苷酶活性蛋白的菌落中央也可出現淡藍色斑點。50．動植物病毒也可作為外源基因的載體。51．目的基因重組克隆的篩選方法包括：根據重組體表型篩選，重組體結構分析法，檢測目的基因法及檢測目的基因表達產的法。52．原核生物中基因表達以操縱子形式進行。

53．原核生物細胞沒有核膜，因此表達過程中的轉錄與翻譯往往同時進行。54．原核生物的mRNA在翻譯完畢之后，隨即被水解掉。

55．真核生物轉錄成不均-RNA之后，還需加工，如

去掉內含子，修飾，加工5，末端和3，末端。56．基因工程中基因表達的研究，是指外源基因在某一種細胞中的表達活動。57．大腸桿菌，酵母與哺乳動物細胞三大基因表達體系已成為當前基因工程工業性生產的核心。58．基因表達合成功能蛋白的基本條件是依賴于基因的有效轉錄，mRNA正確的轉譯和轉譯后的加工。59．閱讀框架是由起始密碼子決定的。60．用于保證目的基因處于正確的閱讀框架中的方法有：選用適當的酶切位點；用人工接頭調節閱讀框架；構建一組適合不同閱讀框架的載體。61．基因的表達受到啟動子等調控元件的控制。62．基因的高效表達必須依賴一個強的啟動子。自考現代生物制藥技術

63．適當的啟動子，只能保證目的基因的正確轉錄，而并不能保證基因的完全正確表達。64．對已知功能的基因表達產物的檢測，可以采用蛋白質電泳，免疫擴散和凝集，酶聯免疫和放射免疫等方法。65．對未知目的基因功能的表達產物的檢測方法是在18．水的主要生理功能是參與代謝反應，作為反應的價質，提供氫、氧元素；參與物質運輸；傳遞熱量，調節體溫。19．培養基中的生長因素的主要功能是作為酶的重要組成成分。20．化學物質來菌只適用于局部空間或某些器械消毒。21．用于輻射滅菌的射線有性營養環境不利于放線菌

孢子形成。

43．一般情況下，干燥和限制營養可直接或間接誘導放線菌孢子形成。

44．霉菌的孢子培養，一般以大米、小米、玉米、麥米、麥粒等天然農產品為培養基。45．細菌的斜面基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。4．植物細胞實驗室培養法是懸浮、微室、平板、看護、懸滴及單花粉等多種培養方式。

5．懸浮培養特點是培養過程中，細胞總數不斷增加，一定時間后產量達最高點，生長趨于停止。

6．植物細胞接種濃度通常

4為2.5×10～5.0×10細胞/毫升。

攜帶有重組體分子的細胞中尋找新合成的蛋白質。66．應用大細胞系統檢測基因表達時，主要是利用質粒或λ載體擴增的途徑。67．微細胞不含有染色體DNA。

68.HbsAg是指乙肝表面抗原。

69．HGH是指人生長激素。70．HGH可以治療侏儒癥，促進燒傷及骨折等創傷性組織的恢復。

7．植物細胞單細胞培養技術有平板培養法，微室培養法、看護培養法等。

8．微室培養法的優點是可直接觀察分裂繁殖及分化全過程，胞質環流規律及線粒體生長與分裂活動，亦可進行連續觀察原生質體融合，細胞壁再生及融合后細胞分裂活動，同時可進行顯微攝像。

9．看護培養法培養時間較微室培養長。10．細胞突變的主要原因是染色體缺失、重復、倒位、異位、堿基順序轉換、顛換及移碼所引起。11．植物細胞培養物易發生自發突變，其突變頻率在10-7～10-6

之間。12．人工誘發植物細胞突變的化學因素主要有堿基類似物、烷化劑、抗生素等。13．篩選植物突變細胞的目的在于獲得某些藥物高產細胞株或某些物質轉化的高產酶細胞株。14．篩選細胞突變體主要依據細胞表型變化。15．自離體植物細胞培養物中篩選細胞突變體的方法有直接選擇法，間接選擇法及綠島法。16．植物細胞培養物處于無組織無器官分化的分散狀態時許多重要基因并不表達。17．目前已建立植物細胞種質保存法有：干燥保存法，液體石蠟覆蓋法，低溫保存法，低壓低氧保存法及超低溫深凍保存法。18．超低溫深凍保存法系將

植物種質于-1960

C的液氮中保存。

19．常用的凍凍保護劑有DMSO，甘油，PEG，葡萄糖、山梨糖及蔗糖。20．為提高存活力，凍存材料應選用抗寒力強的幼齡培養細胞。

21．對于種子、花粉、球莖等高度脫水材料可以采用快速降溫的凍存。22．對于不耐寒植物細胞需采用慢速冰凍法。23．對于木本植物冬芽凍存

物需于00

C慢速化凍。24．深凍細胞活力及存活率測定的方法有再培養法、二醋酸熒光素染色法及氯化自考現代生物制藥技術

三笨四氮唑還原法。25．再培養法是檢查細胞活力的根本方法。26．植物原生質體制備的材49．以組織塊為材料的培養方法叫組織塊培養法。50．細胞培養包括細胞及細胞團塊單層培養及單細胞程謂之電場誘導融合作用。72．完整細胞間融合是擴大生物變異的有效手段。73．兩種完整細胞融合時，95．微載體培養優點在于兼有固定化培養與懸浮培養的雙重特點。

95．動物細胞生長緩慢，又料應用較多的是葉片，愈傷組織及懸浮培養細胞。27．高等植物細胞壁主要成分為纖維素，其次為半纖維素，果膠質及蛋白質。28．植物原生質體制備時的脫壁酶有纖維素酶，果膠酶，斗纖維素酶，蝸牛酶及崩潰酶。

29．纖維素酶使用時的pH值為5.4。

30．果膠酶最適pH值為5.8。31．纖維素酶及果膠酶混合使用的pH值為5.4～5.6之間。

32．脫壁酶液采用0.45μm微孔濾膜過濾除菌。33．純化植物原生質體的方法有離心法、飄浮法、界面法及滴洗法。34．植物原生質體活力測定方法有：根據形態特征判斷其活力，活體染色法及光染料活體染色法。35．大多數植物原生質培養1～3day，即再生新細胞壁。36．大多數植物原生質體通常在1～2周內發生

具有錨地依賴依。96．組織纖維溶酶原激活劑是一川絲氨酸蛋白酶。97．抗乙型肝炎表現抗原單克隆抗體是專一性識別HbsAg的單一抗體。98．體外法生產單克隆抗體是使雜交瘤細胞在人工反應器內大規模培養并表達相應抗體。99．體內法生產克隆抗體是利用生物體為細胞反應器大規模培養雜交瘤細胞生產抗體的方法。

100．檢出分泌特異抗體細胞后，應即時進行克隆化篩選與鑒定，以免非必需細胞過分生長。QQ：806235356

定的是IFNa。37．干擾素的受體主要存在于細胞膜中。

38．白介素-2的生物學作用主要是刺激細胞增生。39．酵母屬于真核生物，大腸肝菌，放線菌及蘭細菌等屬于原核生物，但它們均為單細胞生物。

40．NK細胞對射線照射最為敏感。

41．CTL細胞對射線照射最為敏感。

42．B細胞具有表面球蛋白，而T細胞、NK細胞，K細胞的表面則不具有表面球蛋白。

44．TNF對蛋白酶最為敏感。45．具有生物活性的腫瘤壞死因子為三聚體構型。46．細胞因子使用的最終效應部位在細胞的細胞核內。47．細胞因子多為單鏈分子，其基因多由多個外顯子和內含子組成，但其基因均為單拷貝。

48．IL-5對細胞的作用包括增強B細胞的功能，促進活性B細胞分泌，并可誘導B細胞表達IL-2受體。49．IL-8可來源于單核細胞、巨噬細胞、肺泡巨噬細胞、血管內皮細胞、T細胞等。

50．IFN的蛋的產物包括IFN-α，IFN-β及IFN-y。51．IFN-β在成纖維細胞中誘生。

52．IFN也可誘生IFN。53．TNF也可誘生IFN。54．IFN可抑制病素的生活周期的許多階段，包括病毒的吸附和脫殼、早期病毒轉錄、病毒轉譯、蛋白合成及從細胞表面芽生。

55．EPO的主要來源為腎小管，腎間質細胞。56．可導致EPO生成增加的因素包括高原氣候、冠心病、肺心病、溶血性貧血等。57．細胞因子研究發展前景包括細胞因子的加工改造，細胞因子的受體及其免疫調節的信息傳遞，細胞因子基因表達的調控，分子水平上了解在疾病治療中的作用以及作為有效的免疫佐自考現代生物制藥技術

劑。58．天然干擾素是一種糖蛋白。

59．干擾素對蛋白酶敏感。60．干擾素可導致病毒繁殖中斷。61．干擾素具有廣泛的抗病毒活性。62．干擾素基因在正常生理狀態下不表達。

63．IFN對免疫功能的調節作用包括增強巨噬細胞活力，使補體水平下降及延長同種移植物的排斥反應。84．細胞因子很難用常規方法純化。

86．TNF具有抗腫瘤作用。87．誘導TEF合成須經過兩個階段：起動期、促發期。88．TNF經鑒定有兩類：TNFα，TNFβ。

89．TNF分子量因來源不同，制備方法不同及測定方法不同相差較大。

90．TNF與其它細胞因子，化療藥物聯合作用可以降低TNF劑量及副作用，提高療效。制，是以雙鏈DNA庫間媒介；利于體外純化；（2）不論單鏈DNA還是雙鏈復制形式DNA均能夠感染大腸桿菌；（3）單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA多制約，而不存在包裝限制問題；（4）可以容易地測定出外源DNA片段的插入取向。

9．T4DNA連接酶的作用機制：（1）T4DNA連接酶與輔因子ATP形成酶-AMP復合物；25mMTris-HCL(pH8.0),10m

M EDTA Ph8.0）中劇烈振蕩；（4）加200μl親配制液溶液II（0.2M NaOH1%SDS）,混合內容物，不要振蕩，置冰上；（5）加150μl冰預冷溶液III（5M Kac60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml），溫和振蕩10s置

0

于闊步3-5min；（6）4C。12000rpm離心5min，轉移上清；（7）上清加等量酚；

0

氯仿抽提，4C，12000rpm離心2min，收集上清；（8）64．人白細胞干擾素制劑的半成品檢定包括比活性測定、無菌試驗、余毒試驗、安全試驗及硫氰酸鉀殘余量檢測。65．干擾素制劑大劑量使用的最佳途徑是批注，皮下注射。66．干擾素制劑的局部用藥多采用噴霧、貼敷、滴鼻。67．干擾素臨床應用的適應癥包括急性病毒性感染、慢性病毒性感、惡性腫瘤、器官移植患者、乙型腦炎等。68．T細胞的激活與增殖包括三個時期，即細胞產生白介素-2及其受體表達，細胞進入不依賴白介-2的增殖期。

69．白介素-2的臨床應用包括抗病毒感染、抗細菌感染、抗腫瘤及艾滋病的治療等。70．關于集落刺激因子的特性，目前認為四種集落刺激因子無序列同源性，均為糖蛋白分子，四種集落刺激因子各有特征的膜受體。71．紅細胞生成素的臨床應用包括慢性腎功能衰竭、類風濕性關節炎、癌性貧血、早產嬰兒自體輸血及用于外科手術的輔助治療等。72．細胞因子大都是糖蛋白類物質。73．糖基成份對細胞因子活性影響不大。

74．IL-lα與IL-1β可識別相同的受體。

75．LPS可誘導單核細胞但不能誘導皮膚纖維母細胞產生IL-8。76．去除糖鏈后IL-10的抗原性不受影響。

77．TNF發揮作用有相對的細胞周期特異性。

78．TNF直接注入是很有效的。79．體內IFN通常在嚴格的誘導控制下產生。

80．IFN可以抑制正常細胞的生長。

81．對晚期癌癥IFNy不優于IFNα。82．體外實CSF可引起腫瘤細胞增殖。83．高原居民的EPO年成增加。

（2）酶-AMP復合物再結合三、重點問題 到具有5，一磷酸基與3，羥1．重組DNA技術通常包括： 基切口的DNA上，使DNA（1）基因重組載體的選擇腺苷化。（3）產生一個新的和制備；（2）目的基因的分磷酸二酯鍵，把缺口封起離純化；（3）目的基因與載來。

體的重組；（4）重組克隆的10．DNA連接反應中的注意轉化與感染；（5）重組克隆事項： 的篩選與鑒定；（6）目的基（1）連接及反應溫度；（2）因的表達及表達產物的分防止粘末端的自身環化應離與提純；

采取以下措施：①控制載體2．載體的基本條件： 與外源DNA分子的濃度與（1）本身是一個復制子，比例；②用堿性磷酸酶處理能自我復制；（2）分子量要載體防止自身環化；③定向小；（3）帶選擇標記，以便克隆；（3）用λDNA和科斯進入宿主細胞后有可辨認質粒的載體時的連接；①λ的表型特征；（4）對幾種限DNA載體應考慮兩個參數：制性酶有單一切點：（5）有插入分子左右臂的比例，兩一定的非必要區，在這段插者的濃度；②科斯質粒常用入外源基因不影響其復制。兩種方法連接，一種是用堿3．可作為載體的有： 性磷酸酶處理，另一種是多（1）質粒；（2）λ噬菌體；酶反應進行的克隆。（3）M13噬菌體；（4）科11．受體細胞一般具有的性斯質粒；（5）動、植物病毒。能：

4．選擇裂解細菌的方法取（1）有接受外源DNA的能決于：

力；（2）限制系統缺陷或限（1）質粒的大小；（2）大制與修飾系統均缺陷型；腸桿菌菌株；（3）裂解后用（3）DNA重組缺陷型；（4）于純化質粒DNA的技術； 不適于在非培養條件下生5．選擇裂解細胞的一般準存。

則：

12．DNA分子轉化機理：（1）大質粒（大于15Kb）（1）吸附：完整的雙鏈DNA易受損，故應采用溫和裂解分子吸附在受體菌的表面；法（SDS裂解法）從細胞中（2）轉入：雙鏈DNA分子釋放出來；

解鏈，單鏈DNA進入受體（2）對于小質粒，可加入菌，另一鏈降解；（3）自穩：EDTA后采用溶菌酶處理，外源質粒DNA分子在細胞再通過煮沸或堿處理使之內又復制成雙鏈環狀DNA裂解。

（4）表達：供體基因隨同6．λ噬菌體作為克隆載體復制子同時復制，并被轉錄的特點是：

和翻譯。（1）λ噬菌體可在體外包13．基因表達的三個基本條裝成病毒顆粒，高效地轉染件：

大腸桿菌；（2）λDNA的長（1）基因的密碼區不能被度只有在野生λ噬菌體的插入序列所中斷；（2）基因75%-105%之間才能夠包裝；必須在啟動子控制之下；（3）λ噬菌體適于克隆大（3）mRNA必須相當穩定并片段DNA及組建基因文庫。有效轉譯，產生的外源蛋白7．科斯質粒的特點是： 不被宿主很快降解。

（1）具有λ噬菌體的特性，14．堿裂解法制備質粒DNA能高效地轉染宿主細胞，但的方法：

它不含λ噬菌體的全部必（1）接種菌落于含抗生素要基因，不能裂解生成噬菌的LB中，370

C劇烈振蕩反斑；（2）具有質粒載體的特應；（2）培養液性，帶有質粒的抗性基因而40

C12000rpm30min離心；易于篩選。

（3）重懸細菌于100μl8．M13載體的優點： 冰預冷的溶液I（50mM葡萄（1）單鏈DNA噬菌體的復

糖，加入2倍體積乙醇，振蕩混合，室溫放置2min；（9）40

C，12000rpm，離心5min，棄上清；（10）倒置離心管，傾干液體；（11）1ml70%乙

醇40

C洗滌沉淀，棄上清，空氣中干燥10min；（12）用500μl含無DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE重新溶解核酸，振蕩，貯于

-200

C。15．配制工業發酵培養基的一般要求：（1）營養物質的組成比較豐富，濃度恰當，能滿蹉力種發芽和生長繁殖成大量的有生理功能的菌絲體之需要；（2）在一定條件下，所采用的原料彼此之間不發生化學反應，理化性質相對穩定；

（3）粘度適中，最有適當的滲透壓；（4）要考慮所采用的原材料的品種和濃度，與代謝產物生物合成過程中的調節關系；（5）生產過程中，既不影響通氣與攪拌的效果，又不影響產物的分離，精制，以及廢物的處理。（6）原材料盡量做到因地制宜，質優價廉，成本低。16．培養基的配制原則：1）營養成分配制原則：2）營養成分配比應恰當；（3）滲透壓應合適；（34）pH值應合適；（5）氧化還原電位需符合要求。17．工業微生物篩選一般要求：（1）穩定而高產的遺傳特性；（2）抗噬菌體能力強；（3）發酵過程泡沫少；（4）需氧量低；（5）底物轉化率高；（6）對培養基和前體耐受力強；（7）營養特性；（8）最適溫度高；（9）菌種既要高的遺傳穩定性，又要有基因操作的可修飾性；（10）產物微生物常用的分離篩選途徑： 18．工業微生物常用的分離篩選途徑：（1）從菌種保存機構的已知菌種中分離；（2）從自然界中分離篩選；（3）從生產過程中分離篩選。

19．單孢子懸液的制備方法：（1）對于細菌，因其在固體斜面培養基上常粘在一起，故要求轉接到新鮮肉自考現代生物制藥技術

湯液體中進行培養，以取笪分散且生長活躍的菌體；（2）對放線菌和霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂振蕩打散孢子后，用濾紙或棉花過濾。20．原生質體融合技術的特點：（1）打破物種界限，可實現遠緣雜交；（2）可實現兩上以上同種或不同種微生物細胞融合；（3）原生質體易于受到誘變劑的作用而成為較好的誘變對象；（4）可使重組頻率大大提高。

21．微生物菌種保存方法：及基因型變異；2）森林及土地無止盡開發利用，自然種質庫破壞，需建產人工種質庫；（3）細胞工程中獲得的中草藥及農作物優良品種的特殊變異細胞及雜種細胞，常規保存法易于變異，需進行種質資源廣泛收集與長期保存；（4）細胞培養建立的人工種質庫可節省土地與勞務。29．植物原生質體制備的預處理方法：（1）預質壁分離；（2）預培養；（3）暗處理；（4）光處理；（5）低溫處理； 38．動物細胞融合的基本過

程：取數量(10-10個/ml)的兩種親本細胞充分混合，離心除去上清液，取下層細胞懸液0.1ml，逐滴加入

0

0.4ml37C的40%PEG溶液，0

37C靜置90s，緩慢加入5-10ml無血清培養液，輕搖離心管4-5次，離心去上清液，按每0.1ml融合混合液加25ml完全培養基，以每孔0.1ml分裝于96孔培養板及每孔0.5ml分裝于

0

24孔培養板上，于37C CO2培養箱中培養之。39．脂質體介導的細胞融合量與常規單層培養相同，通

過增加培養罐體積即可達到擴大培養規模的目的，減少廠房及設備投資，節約動力消耗及人力，又便于對反應系統進行檢測控制。46．利用有限稀法篩選雜交瘤細胞的過程：于克隆前一日向96孔板中加入0。1ml

2細胞懸液，于37℃CO培養箱中溫育，然后從陰性孔中吸取細胞計數，用完全培養基稀釋成30個／ml加入96孔板中，每孔0.1ml，余下細胞再稀釋成10／ml，再加于兩塊96孔板中，每孔（1）斜面低溫保藏法；（2）液體石蠟封存法；（3）沙土管保存法；（4）冷凍干燥保存法；（5）超低溫保藏法。22．工業微生物表面培養法的優缺點：（1）優點：①簡單易行；②投資少；③適于小型生產（2）缺點：①勞動強度大；②占地面積大；③產量低；④易污染。23．工業發酵中提高發酵液的溶氧水平的措施：（1）提高通氣強度；（2）增加攪拌轉速；（3）增加罐壓；（4）增加擋板；（5）通氣中摻入純氧；（6）控制基質培養基；（7）控制補料率；（8）調節溫度；（9）添加表面活性劑；（10）中間補水；11）液化培養基。24．影響微生物原生質體制備的因素：1）菌體的預處理；（2）菌體的培養時間；3）酶濃度；（4）酶解溫度；（5）酶解時間；（6）滲透壓穩定劑。25．微生物工程產品主要類型：（1）微生物菌體；（2）初級代謝物；（3）次級代謝物；（4）生物活性大分子； 26．微生物工程在醫藥工業中的應用：（1）抗生素類；（2）氨基酸類；（3）核苷酸類；（4）維生素類；（5）甾體類激素；（6）治療酶及酶抑制劑。

27．植物細胞培養的特性：（1）植物細胞較微生物細胞大得多，有纖維素細胞壁，細胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；（2）培養過程生長速度緩慢，易受微生物污染，需用抗生素；（3）細胞生長的中期及對數期，易凝聚成團塊，懸浮培養較難；（4）培養時需供氧，培養液粘度大，不能耐受強力通風攪拌；（5）具有群體效應，無錨地依賴性及接觸抑制性；（6）培養細胞產物滯留于細胞內，且產量較低；（7）培養過程具有結構與功能全能性。

28．種質保存意義：（1）植物組織及細胞移植繼代培養過程可能導師致染色體30．植物細胞生長所需的營過程：動物細胞破碎后，經養成份：H2O、無機營養物、差分分離出線粒體及溶酶維生素、碳源、天然物、植體等細胞器，或采用生化技物激素、氨基酸類、核酸及術分離出的DNA，mRNA，逆其水解物以及其它成分。轉錄酶及其它生物大分子30．制備原生質常用酶：（1）并將其包裝成脂質體，然后纖維素酶；（2）果膠酶；（3）按完整細胞之間的融合方崩潰酶；（4）半纖維素酶；式，將脂體與另一種細胞融（5）蝸牛酶。合，即或獲得相應雜種細31．測定植物原生質體活力胞。的方法：（1）根據形態特征40．雜種動物細胞篩選系統判斷其活力；（2）活體染色及方法：（1）HAT選擇系統；法；（3）熒光染料活體染色（2）抗藥性篩選系統；（3）法。互補選擇法；（4）原位雜交32．植物細胞分化培養基與法；（5）基因探針選擇法。原生質體培養基的差別：41．動物雜種細胞遺傳表現（1）分化培養基中只有蔗型：（1）互補作用是指兩種糖為碳源，不加滲透壓穩定親本細胞生物學特征在雜劑；（2）原生質體培養基中，種細胞中共同表達的現象；生長素濃度高于細胞分裂（2）激活作用是指一個親素濃度，分化培養基正相本細胞的非活動基因在雜反；

種細胞中得到表達的現象。33．植物細胞融合的特點：（3）消失作用指親本細胞（1）可以實現遠緣雜交，某些遺傳性狀在雜種細胞獲得種間雜種，克服有性雜中消失的現象；（4）激活與交配系不親和性；（2）可獲消失作用指在雜種細胞中得另一親本非整倍性雜種原親本非活動基因被激活，或胞質雜種，且獲得的遺傳而同一親本某些遣傳性狀變異范圍極廣；（3）一次操同時消失的現象。作可實現兩個以上親本的42．MCAb的基本特性：（1）融合作用；（4）可獲得呈現MCAb為高純度單一抗性，雙親個體基因型總和的雜檢測靈敏度極高；（2）可通種；（5）可形成有性生殖障過雜交瘤大規模培養進行礙植物種間雜種；（6）獲得生產；（3）雜交瘤可用液氮具有不同后生遺傳變化親深凍法長期保；（4）可在分本的雜種。子水平上解析出存在于病34．篩選植物雜種細胞的方毒表面的抗原或受體；（5）法；1）遺傳互補篩選法；可用不純抗原制備純（2）抗性互補篩選法；（3）MCAb；（6）但MCAb專一性利用物理特性篩選法；4）太強，難于檢出微生物突變利用生長特性篩選法。株，有時不能產生與抗原交35．動物細胞培養包括：（1）聯的功能易受PH、溫度及鹽組織塊培養法；（2）細胞單濃度影響，又親和力較低，層培養法；（3）單細胞分離半衰期短，又需長期持之以培養；（4）二倍體細胞株培恒的艱苦工作。

養。

43．單克隆抗體生產技術；36．二倍體細胞特征：（1）（1）體外培養法；（2）體具有兩倍性染色體（2n），內培養法。組型正常；（2）培養條件下44．無血清培養基分類：（1）呈有限生命力，不能無限期基本合成培養基；（2）基本分裂繁殖；（3）無致癌性。合成培養基加生長因子；37．動物細胞融合過程的促（3）基本合成培養加組織融因素：（1）病毒誘導融合；抽提物。（2）PEG誘導融合；（3）45．微載體培養的優點：兼電場誘導融合；（4）聚乙烯有固定培養與懸浮培養雙醇分離心力也能促進融合。

重特點，培養過程細胞產物

板中，每孔0.1ml。再制備3個／ml細胞懸液，加入另外兩塊96孔板中，將上述

各板置37℃CO

2培養箱中培養2-3周，待出現可見細胞集落后，檢查培養液中抗體活性，選出陽性孔，擴大培養，如上法進行反復克隆，直至選出純雜交瘤細胞為止。47．動物細胞培養過程中所具有的特性：（1）細胞生長緩慢，易受微生物污染，培養時需用抗生素；(2）動物細胞較微生物大得多，無細胞壁，機械強度低，適應環境能力差；(3）培養過程需氧量少，且不耐受強力通風與攪拌；(4）在機體中，細胞相互粘連以集群形式存在，培養過程具有群體效應、錨地依賴性、接觸抑制性及功能全能性；（5）培養過程產物分布于細胞內外，反應過程成本較高，但產品價格昂貴；（6）大規模培養時，不可套用微生物反應的經驗；（7）原代培養細胞一般繁殖50代即退化死亡。48．深凍植物細胞復蘇后測其生命活力與存活率的三種方法：

（1）再培養法：將復蘇后細胞立即接種于新鮮培養 基上再培養，同時測定細胞增殖量，愈傷組織形成情況及人化為新植株能力；（2）二醋酸光素染色法：用1滴0.1%熒光素染料溶液與一滴化凍后細胞懸浮液混合，活細胞染色，死細胞不著色，用普通顯微鏡觀察計數得細胞總數，用紫外光顯微鏡觀計數得活細胞數，據此可計算出凍存細胞存活率；

（3）TTC法：根據活細胞內脫氫酶可將氯化三苯四氮唑還原為for mazam,后者溶于乙醇而不溶于水，故前者與凍細胞保溫反應用乙醇抽提，再用分光光度法測定吸收度，用以判斷細胞存活率及生活力。49．動物細胞固定化培養的優點：（1）細胞可維持在較自考現代生物制藥技術

小體積培養液中生長；（2）細胞損傷程度低；（3）易于更換培養液；4）細胞和培養液易于分離；5）培養液中產物濃度高，簡化了產品分離純化操作。

50．中空纖維培養器優點：（1）細胞生長密度高；（2）營養牧質可有效分布，代謝產物可及時排除；（3）細胞培養可達數日，易于實現連續培養；（4）細胞分泌蛋白質濃度高；（5）反應器體積小并可用于培養多種細胞。液，混合均勻，再冷卻凝固成型和破碎即成固定化酶；(2)微囊化包埋法是將醇定位于具有豐透性膜的微小囊內的技術，其基本制備方法有界面沉降法及界面聚合法兩類。

58.固定化酶反應器：(1)攪拌罐型反應器；(2)固定床型反應器；(3)流化床型反應器；(4)膜型反應器；(5)鼓泡塔型反應器； 59．固定化酶的形狀：（1）顆粒狀固定化酶；（2）纖維應液，置于沸水中，加熱使

酶失知；（2）立即加入適宜的酶變性劑，使酶變性失活；3）加入酸或堿溶液，使反應液的pH值迅速遠離酶催化應的最適pH值；（4）將取出的反應液立即置于冰，或冰鹽溶液中，使反應

0

液的溫度迅速低至10C以下。

63．酶與一般催化劑相比，所具有的優點：（1）催化效率高；（2）專一性強；（3）反應條件溫和；（4）酶的活體酶的合成，釋放增強，促

進過氧化物酶合增強；（3）可促使白血病細胞分化及抑制白血病細胞生長。74．集落刺激因子的臨床應用：（1）治療血細胞減少癥；（2）治療再生障礙性貧血、骨髓發育不良和自體骨髓移植后的恢復；（3）治療癌癥；（4）治療AIDS。75．細胞因子受體的信息傳遞途徑：（1）通過受體本身的酷氨酸激傳遞遞信息；（2）通過

息。76．用于制備細胞因子的培養細胞標準十分嚴格，對這些細胞的要求包括：（1）細胞來源要清楚；（2）細胞建株的鑒定資料要記錄清楚；（3）了解細胞系的生長特性和在培養條件下的細胞的穩定性；（4）培養細胞時所用的血清不含細菌、病菌、真菌和支原體。77．干擾素的基本特性：（1）種屬特異性；（2）作用廣譜性和選擇性；（3）相對無害性；（4）特殊穩定性。78．真核基因在原核細胞中獲得表達必須具備的三個條件：（1）要有原核細胞的啟動子；（2）要有能與原核細胞16SrRNA3’端相配合的順序；（3）表達的干擾素多肽要不被細胞酶類所迅速降解。

79．IL-2的生物學作用：（1）促T細胞增殖；（2）對自然殺傷細胞（NK）的作用；（3）誘導細胞毒性T淋巴細胞產生和增殖；（4）誘導淋巴因子活化淋巴細胞產生；（5）促B細胞增殖分化作用；（6）IL-2與其他白介素協同作用。

80．集落刺激因子的功能：（1）刺激造血細胞增殖；（2）維持細胞存活；（3）分化定型；（4）刺激終末細胞的功能活性。81．三種檢測重組基因工程CSF的方法（1）生物學檢測法；（2）分子生物學檢測法；（3）免疫學檢測法。82．TNF抗腫瘤作用的可能機制：（1）細胞的直接細胞毒及細胞生長抑制作用；（2）腫瘤內血管陰塞引起腫瘤缺血性壞死；（3）TNF的免疫調節作用可能在其抗瘤效應中起一定的作用。QQ：806235356 83．細胞因子共有特性：（1）多源性；（2）多效性；（3）高效性；（4）快速反應性；（5）理化性質：①化學本質為大分子多肽或蛋白；②多為單鏈分子；③多具有“分泌型激素”的特性；④基因多由數個外顯子和內含子組成；⑤基因均為單拷自考現代生物制藥技術

貝；⑥分子量均小于80KD。84．細胞因子的受體，根據其結構特點和功能分類：抗細菌、抗真菌作用；（8）熱原質作用；（9）參與骨質重吸收。

種蛋白質的結構基因與調節基因廣泛地存在于脊椎動物以上的細胞內，在一般2激活的細胞表面抗原標

志，也說明LAK殺傷腫瘤細胞效應是白介素—2激恬（1）細胞因子受體的新家族；（2）腫瘤壞死因子受體家族；（3）免疫球蛋白超級家族受體； 85．基因工程細胞因子制備的基本步驟：1）制備含特異性細胞因子基因的cDNA文庫；（2）從cDNA文庫中篩選目cDNA克隆；（3）構建表達性載體，制備高級表達性工程菌（細胞）。86．干擾素的生物功能本質：（1）抗細胞內侵害；①抑制病毒繁殖；②抑制胞內的其它微生物繁殖；（2）抗細胞分裂活性；（3）調節免疫功能活性；①調節免疫監視功能；②調節免疫自穩功能； 87．基因工程干擾素的制備方法：（1）干擾素工程菌的組建；①分離提取干擾素基因；②制備人工重組質粒；③轉化宿主菌；（2）基因工程干擾素的制備；（3）基因工程干擾素的質量控制； 88．集落刺激因子的檢測方法：（1）生物活性檢測法；①骨髓細胞集落形成法；②依賴細胞株；（2）分子生物學檢測法；斑點雜交法；（3）免疫學檢測技術；雙抗體夾心ELISA法。89．CSFs制檢的一般步驟：（1）制備工程菌（或細胞）；2）工程菌（或細菌）的培養；（3）分離純化；①工程菌的破碎，沉淀；②離心；③層析：離子交換層析、親和層析；④超濾濃縮，分子篩層析；（4）除菌過濾，分裝，凍干；（5）半成品檢定，主要包括下列檢定項目：①蛋白含量測定②活性測定③比活性測定；④分子量測定；⑤純度測定；⑥核酸含量測定；⑦鼠lgG含量測定；⑧等電測定；⑨無菌試驗；⑩熱原質等檢定項目；（6）成品檢定：①外觀檢查；②活性測定；③水分測定；④無菌試驗；⑤安全毒性試驗；⑥熱原質試驗；⑦肽圖測定等檢測等檢測項目；（7）分包裝；（8）貯存。90．紅細胞生成素的測定方法：（1）生物體內測定法；（2）生物體外測定法；（3）放射免疫測定法。91．腫瘤壞死因子生物學活性：（1）抗腫瘤活性；①TNF直接抗腫瘤細胞的作用；②TNF在體內的抗腫瘤作用；（2）抗炎癥活性；（3）促凝血活性；（4）對脂肪細胞合成脂蛋白脂酶（LPL）和LPL活性的抑制作用；（5）促進細胞因子分泌；（6）免疫調節作用（7）抗病毒、92．IL-13的作用：（1）強生理狀態下，細胞的干擾素烈報制外周血單核細胞分基因呈靜止狀態，只有在特泌IL-

6、IL-1β、TNF-α、定誘生劑的作用下，細胞的IL-8和gro-β；（2）能抑干擾素基因才活動，轉錄合制細胞培養分化的巨噬細成相應的mRNA，進而轉譯胞產生HIV，并能抑制體外出具有種屬特異性的干擾HIV復制；（3）較小程度直素蛋白； ③干擾素本身并接作用于大顆粒淋巴細胞不能直接滅活病毒，干擾素（LGL）合成IEN-y，并與作用于細胞后，使后者又產適量和亞適量的IL-2的協生多種其它蛋白質(抗病毒同作用；（4）它能影響B蛋白)，從而阻斷病毒的繁淋巴細胞，增強其增殖并能殖； ④干擾素必須具有廣表達CD23表面抗原；（5）譜的抗病毒活性，如果某一有抗炎作用（敗血性休克和種抗病毒物質僅對特定的風濕性關節炎）并刺激體液病毒有作用，就不能稱為干免疫應答；（6）增強由IL-2擾素。

誘導產生的細胞因子激活96．人淋巴細胞幾—2的制的殺傷細胞活性。備產物檢定方法：

93．基因工程重組細胞因子(1)活性檢定：采用CTLL的制備質控：(1)詳細記錄細胞株的3H摻人法進行活表達載體和宿主細胞，包括性測定，比活性必須在克隆基因的來源和鑒定，以106IU／mg以上；

及表達載體的構建、遺傳學(2)純度檢定：①SDS—和結構等，此外還要介紹載PAGE檢測，用銀染色，在體引入宿主細胞的方法，和15KD處呈單一條帶，后掃載體在宿主細胞中的狀況； 描測得幾—2條帶占95％(2)應有詳細的插入基因和以上；

表達載體側翼調控區核苷 ②HPLC檢測，反相柱(C4、酸序列的資料；(3)在生產C8、C18等)或正相分子篩柱中啟動和控制有關基因的測得IL—2主峰占95％以表達方法要有詳細記錄；(4)上；

產品純化方法要有明確詳(3)氨芐青霉素測定：因為盡記載，如采用單抗法和層大腸桿菌發酵的基因工程析法，要采取適當措施，保產品均采用氨芐青霉素抗證這些單抗或其它潛在污性菌株生產，所以必須檢定染物不損害終產品的質量氨芐青霉素殘余量； 和安全性。(4)殘余DNA檢測：采用同94．細胞因子的分子生物學位素探針法，每劑殘余DNA測定法：

量不得超過100pg；

目前采用的分子生物學技 還有生物制品要求的常規術有RNA印跡法、核酸酶保實驗檢定，如熱原質測定、護分析、原位雜交和多聚酶制劑水分測定、安全試驗、鏈式反應。均為通過檢測相急性毒性實驗、無菌試驗等應的mRNA量、推算出幾量均必須合格。的方法。多聚酶鏈式反應97．LAK細胞的殺腫瘤細胞(PCR)是目前檢測幾最敏感作用：LAK細胞殺傷腫瘤細的方法，尤其適用于極微量胞分如下三個階段： 的標本，或僅有極少數細胞(1)識別階段：LAK細胞對才能表達幾基因，或幾基因正常細胞無損傷作用，而對以低水平表達的標本，目前腫瘤細胞結合進而殺傷，而已可作半定量分析，且對多種腫瘤細胞結合而95．干擾素的定義及含義： 殺傷，說明多種腫瘤的細胞(1)干擾素的定義：干擾素表面存在著共同抗原決定是一類在同種細胞上具有簇，可被LAK細胞所識別；廣譜抗病毒活性的蛋白質，正常細胞表面可能不存在其活性的發揮又受細胞基腫瘤抗原決定簇，就不能被因組的調節和控制，涉及LAK細胞所殺傷；關于LAKRNA和蛋白質的合成； 細胞對腫瘤細胞結合分子(2)目前認為，干擾素是一特性研究發現了“淋巴因子種類似多肽激素的細胞功活化細胞相關抗原”(LAA)，能的調節物質，是一種細胞而用LAA制備了單克隆抗素，這一定義的含義如下：體(KBA MoAb)可以抑制LAK①干擾素必須是一種蛋白細胞殺傷活性，提示了LAK質，它對蛋白酶類是敏感細胞殺傷腫瘤細胞的物質的，而對DNA酶或RNA酶卻基礎，從分子水平認識LAA有抵抗；天然干擾素是一種抗原為兩條鏈的糖蛋白組糖蛋白，采用DNA重組技術成的二聚體，LAA只存在受由大腸桿菌表達的人干擾白介素—2激活后的細胞素多肽不帶糖分子； ②這

表面，說明LAA是白介素—

的結果；

(2)殺傷階段：LAK細胞殺傷腫瘤細胞主要是通過細胞介導的細胞毒作用對腫瘤細胞的殺傷；LAK細胞內含有溶細胞顆粒(C．C)，該顆粒中含有一種穿孔蛋白質，所謂穿孔因子(Peffoin)；LAK細胞與腫瘤細胞結合時，LAK細胞發生極化，首先高爾基體向與腫瘤細胞接觸點方向移動，通過微管將顆粒分泌到兩

種細胞接觸面上，在Ca2+

激活下，LAK細胞也釋放一種腫瘤壞死因子樣毒素，對腫瘤細胞作用慢，不需Ca2+，又稱之為不依賴鈣離子的殺傷作用，常常使腫瘤細胞DNA變性和細胞核裂解，從而抑制腫瘤細胞生長；

(3)裂解階段：瘤細胞受到攻擊后，經上述兩階段后，完成裂解，抑制腫瘤生長。98．集落刺激因子的功能：

各種CSF的活性是以半固體培養基中CSF刺激造血細胞形成集落的能力來衡量的。其功能可分為四個方面：(1)刺激造血細胞增殖。集落形成細胞的分裂需要CSF持續存在，如從培養基中撤掉CSF，則細胞分裂停止，CSF的濃度決定細胞周期長短和產生子代細胞的總數目；(2)CSF既維系祖細胞的存活，也延長成熟細胞的壽命；(3)分化定型；(4)刺激終末細胞的功能活性。目前已知CSF能影響細胞作用、膜抗原的表達、吞噬作用、過氧化物的產生、殺傷微生物及腫瘤細胞，并產生許多重要的生物活性物質，如前列腺素E、腫瘤壞死因子、白細胞介素—

1、丫干擾素、血纖溶酶原活化因子等。

99．C—CSF和GM—CSF的異同點：

由于G—CSF和GM—CSF在許多相關的臨床病例中可能有用，所以它們之間生物學特性差異，對某些疾病發病機理的認識有一定的意義；

(1)C—CSF特異性刺激中性白細胞，而GM—CSF則是所有粒細胞的總刺激因子，例如若要通過提高嗜酸性效應細胞水平來治療寄生蟲感染，則GM—CSF作用比G—CSF為好；

(2)GM—CSF是單核細胞和巨噬細胞的強激活劑，則G—CSF則不是，這種激活包括誘導產生諸如腫瘤壞死因子和IL—1類的其他自考現代生物制藥技術

細胞因子，如需提高單核細胞和巨噬細胞活性，可選用CM—CSF，而不是C—CSF； 的主要部位，也是參與炎癥的主要組織，內皮細胞本身也是產生細胞因子的重要

（另附：工藝流程圖）

(3)CM—CSF是中性白細胞移動的強抑制劑，然而G—CSF則增強中性白細胞的移 動，例如當局部損傷時，GM—CSF可在局部產生，起弱的化學引誘劑作用，抑制炎癥細胞離開炎癥部位，而G—CSF則可增強炎癥狀細胞向炎癥部位移動，這可能是兩種造血生長因子共同提高宿主防御力的一種途徑，在細菌性膿毒癥時，接觸內毒素可刺激單核細胞、巨噬細胞產生G—CSF，然后G—CSF刺激T細胞產生GM—CSF和IL—3，以增加骨髓內的骨髓細胞生成和進一步增強白細胞應答。100．CSFs三種檢測方法的特點：

(1)生物活性檢測法，特點是靈敏、方便，但因造血前體細胞、依賴株細胞一般都受幾種因子的影響，因此，該法不能明確因子的特性； 質產物合成；

(3)免疫學檢測法，特點是特異、靈敏，更高，缺點是不能證明有功能性蛋白缺點是不能證明被檢CSF是否為具有(2)分子生物學檢測法，特點是敏感性完整生物活性結構的蛋白質而非變性蛋白質，因此檢測時最好將

自考現代生物制藥技術

名詞概念

1、生物工程：應用生物科學的理論、方法、按照人們設計的藍圖，改良加工生物或用生物及其制備物作為加工原料，以提供所需生物制品為人類社會服務的綜合性科學技術。2、51、植物細胞大規模培養：在人工控制下高密度大朗養有益植物細胞即植物細胞大規模培養。

52、半連續培養法：在反應器中投料和接種，培養尸段時間后，將培養液和新鮮培養液進行交換的培養方法，稱為半連續培養法。

53、動物細胞工程：根據細胞生物學及工程學原理定向改造動物細胞遺傳性、創造新物種，通過工程化為人類提供名貴藥品服務的技術，稱為動物細胞工程。

54、動物細胞培養技術：在一定條件下，通過人工供給營養物質及生長因子，使離體動物細胞或組織生長繁殖的方法，稱為動物細胞培養技術。

55、細胞塊培養法：將動物組織切成直徑1-2mm小塊，進行培養的方法，稱為組織塊培養法。

56、細胞單層培養法：動物組織塊經消化分散成單個細胞或細胞團塊后，粘附于培養容器表面培養成新生細胞單層的培養法，稱為細胞單層培養法。

57、單細胞分離培養：動物組織分散后，將其單個細胞培養成純系細胞集群的技術，稱之為單細胞分離培養。

58、確立細胞株：正常細胞在移植繼代過程中，有些細胞增殖力突然增強，在特定條件下可無限繁殖，與初代細胞相比，其形態、生理生化特性，病毒敏感性，抗原性及染色體結構均發生變化，具有致癌性，這些細胞稱為確立細胞株。

59、動物體細胞雜交技術：在外力作用下，令兩個或兩個以上異源細胞合并為一個多核細胞的過程，稱為動物體細胞雜交技術。60、核體：細胞核連同其外表薄層細胞質構成的顆粒稱為核體。61、胞質體：不具有細胞核的細胞稱為胞質體。62、微核雜種細胞：按完整細胞之間的融合方式，將微核與另一完整細胞融合，使后者獲得另一種細胞中的若于個染色體，所獲融合子稱為微核雜種細胞。63、抗藥性篩選系統：利用生物細胞對藥物敏感性差異篩選雜種細胞的方法。64、營養缺陷型細胞：在一些營養物質的合成能力上出現缺陷，因此必須在基本培養基中加入相應的有機成分才能正常生長的變異細胞。65、營養互補選擇法：利用兩種親本細胞營養互補作用原理篩選雜種細胞的方法稱為營養互補選擇法。66、雜交瘤技術：骨髓瘤細胞與免疫淋巴細胞融合制備雜種細胞的方法為雜交瘤技術。67、雜合瘤：骨髓瘤細胞與免疫淋巴細胞融合制備的雜種細胞稱為雜合瘤。68：微載體培養法；將細胞吸附于微載體表面的培養方法。69、酶工程：應用酶的特異性催化功能并通過工程化為人類生產有用產品及提供有益服務的技術為酶工程。70、酶：生物體內具有特殊催化功能的蛋白質稱為酶。71、固定化酶：限制或定位于特定空間位置的酶稱為固定化酶。

72、固定化細胞：蘋限制或定位于特定空間位置的細胞稱為固定化細胞。73、載體結合法：將細胞懸浮液直接與水不溶性載體相結合的固定化方法。74、包埋法：將細胞定位于凝膠網格內的技術稱為包埋法。75、偶聯效率：偶聯固定化反應過程中載體結合蛋白質的能力稱為偶聯效率。76、酶活力：酶類催化特定化學反應的能力稱為酶活力。77、酶比活：指每毫克酶蛋白所表現的活力。78、固定化反應的酶活力回收率：固定酶所顯示的活力與加入偶聯液中酶總活力的比值稱為固定化反應的酶活力回收率。

79、酶試劑盒：將酶、反應試劑、穩定劑、激活劑、填充劑、及緩沖劑等配成檢測用的混合制劑稱酶試劑盒。80、細胞因子：是人類或動物的各類細胞分泌的具有多樣生物活性因子，是可溶性物質，是一組不均一的蛋白質能調節細胞的生長與分化。81、白介素細胞：郵包細胞或其它體細胞產生的又在細胞間起調節作用和介導作用的因子。82、IL-3：即白細胞介素3，有激活的T淋巴細胞產生，能刺激多能造血干細胞和各系細胞的分化和增值，促進和維持肥大細胞的增值，增值中性粒細胞、酸性粒細胞的活性，促進NK細胞殺傷實體瘤的活性。

83、IL-10：由TH2細胞產生，能抑制TH1細胞合成細胞因子的能力，是一種糖蛋白。84、IL-12：是由B淋巴細胞分泌產生的一種細胞因子，分子量為75KD的糖蛋白，其主要作用是促進PHA活化的PBMC增殖自考現代生物制藥技術

以及亞適劑量IL-2協同促進作用。85、腫瘤壞死因子：是一種由巨噬細胞分泌能產生細胞毒，使腫瘤細胞溶解的因子。86、干擾素：是一類在同種細胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質，其活性的發揮又受細胞基因組的調節與控制，涉及RNA和蛋白質的合成。

87、集落刺激因子：CSF為一組糖蛋白物質，由淋巴細胞和單核細胞自然產生，有刺激紅細胞系以外造血細胞增殖和分化作用。88、超誘導：是指細胞在某種大分子合成抑制物的適當作用下，誘生蛋白合成增加的現象。89、生物反應調節劑：是生物體體內的某些細胞和某些分子，它們既是機體對內外環境刺激應答的效應機制，也是機體維持內環境的穩定因素。

第二篇：現代生物制藥技術的研究進展

燕京理工學院

Yanching Institute of Technology（2016）屆化工與制藥專業現代制藥技術論文 題目：現代生物制藥技術的研究進展

學院： XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 專業：

XXXXX

學號： XXXXXXX

姓名：

Dream

指導教師：林貝

教研室主任（負責人）：林貝 2015 年 6 月 4 日

現代生物制藥技術的研究進展 Dream 化工與材料工程學院化藥1204班學號XXXXXXX 指導教室林貝 摘要

本文簡述了近年來基因工程在生物制藥技術的發展和應用。其中主要從基因操作中大分子的分離、PCR技術、基因芯片、外源基因的表達這4個方面敘述基因工程相關技術的應用和發展,以及基因工程藥物的產業化現狀與發展趨勢。關鍵詞：生物技術基因工程基因操作技術生物制藥 1 基本概念 1.1 生物技術

廣義的生物技術是指人類對生物資源(包括動物、植物、微生物)的利用、改造的相關技術。其發展經歷了三個不同的階段——以釀造為代表的傳統生物技術，以微生物發酵為代表的近代生物技術，以基因工程、細胞工程、酶工程和蛋白質工程為代表的現代生物技術。

現代生物技術可以理解為是直接操縱有機體細胞和基因的一種全新技術是二十世紀70年代開始異軍突起的高技術領域，在醫療、制藥、農業、輕工食品及環保業發展迅速。[1]以上的生物技術成果集中應用于醫藥工業。1.2 現代生物技術兩大核心工程 1.2.1 工程 概念：基因工程是分子遺傳學和工程技術結合的產物。是現代生物技術的核心它能按人類需要把遺傳物質DNA分子從生物體中分離出來，進行剪切、組合、拼裝合成新的DNA分子。再將新的DNA分子植入某種生物細胞中，使遺傳信息在新的宿主細胞或個體中得到表達，以達到定向改造或重建新物種的目的。1.2.2 細胞工程 概念：利用細胞融合技術把含有不同遺傳物質的細胞合成雜種細胞。并使之分裂生長成為雜種生物。它包括體細胞融合、核移植、細胞器攝取和染色體片段的重組等。 1.3 現代生物制藥

主要指基因重組的蛋白質分子類藥物的制造過程，即利用基因工程、抗體工程或細胞工程技術生產的源自生物體內的天然物質，用于體內診斷、治療或預防藥物的生產過程(也可稱基因工程制藥)。2 基因操作技術

基因大分子的分離主要指質粒(plasmid DNA)和基因組DNA的分離。質粒分離的常用方法有堿變性抽提法、煮沸法、去污劑裂解法、質粒DNA釋放法、酸酚法等。質粒在基因工程中最常用來做成各種克隆載體(cloning vector)或表達載體(expression vector)。質粒載體還可用于RNA干擾(RNA inter-ference)的研究[1](由于這一技術的研究和應用,美國科學家Andrew Z.Fire博士和Craig C.Mello博士獲得了2006的諾貝爾生理學或醫學獎)。基因組DNA的分離通常采用酚-氯仿法、基因文庫(gene library)、Southern雜交以及PCR擴增技術等。其中基因文庫是指含有某種生物基因組不同基因片段的一群DNA重組體克隆,包括cDNA文庫(com-plementaryDNA library, cDNA library)和基因組DNA文庫(genomic library)。最近又有研究者利用名為chum-RNA的小分子RNA建立非PCR擴增的單細胞cDNA文庫[2]。2.1 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)是一種在體外模擬天然DNA復制過程的核酸擴增技術。該法由Mullis等人于1985年發明,并于1993年獲得了諾貝爾化學獎。PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。PCR技術可分為定性PCR和定量PCR。2.2 定性PCR技術

定性PCR技術包括:反轉錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR),是從非常少量的mRNA樣品構建大容量cDNA文庫的方法,還發展出實時RT-PCR用于定量實驗[3];多重PCR(multiplex PCR),是指在同一PCR反應體系中加入多對不同的引物,以擴增同一模板的不同區域;反向PCR(inverse PCR),該法可以對一個已知DNA片段兩側的未知序列進行擴增和研究;錨定PCR(an-chored PCR),現稱為cDNA末端快速擴增技術(rap-id amplification of cDNA ends,RACE)[4]。2.3 熒光標記分子

定量PCR技術以實時PCR(real time PCR)為代表,其基本原理是在PCR反應體系中引入熒光標記分子,對每一反應時刻的熒光信號積累進行實時監測,計算出PCR產物量,或通過標準曲線法得出初始模板量。2.4 基因芯片

基因芯片(gene chip ormicroarray),是生物芯片的一種,其基本技術包括:核酸方陣的構建、樣品的制備、雜交和雜交圖譜的檢測及讀出。根據用途不同可分為表達譜芯片(expression profile chip)、測序芯片和診斷芯片。其中表達譜芯片的應用最為廣泛,可用于基因功能分析、疾病發生機制的探討及藥物研究和篩選[5]。(1)確定藥靶基因:通過比較正常細胞與異常細胞表達譜之間的差異,從而確定藥靶基因。(2)監測藥物治療前后的基因表達變化:該監測可有3方面的作用。一是用于研究藥物作用機制,通過監測基因表達的變化,可研究藥物作用途徑和對細胞信號轉導的影響,從而了解該藥物的作用機制;二是用于研究藥物毒理,從表達譜的改變和異常表達,便可分析藥物毒理;三是用于藥物篩選,利用用藥前后表達譜的改變,通過分析病理、生理、生化原理,能高效地篩選出新的藥物或先導化合物。N A 芯片技術在藥物基因組學的應用, 一方面可加速藥物基因組學的發展;另一方面: D N A 芯片利用藥物基因組學的研究成果, 根據基因型將人群劃分為各種類型。D N A芯片可自動快速地檢測哪些可影響藥物效應的基因(為藥物代謝酶、藥物作用靶標等)例如設計一種淋巴白血病藥物基因組芯片, 包括所有可能影響病人化療反應的基因, 借助于這種芯片, 根據病人的基因型分類, 醫生為每一個病人選擇合適的治療藥物和劑量。2.5 外源基因

導入宿主細胞的外源基因,通過基因表達得到相應的蛋白質產物。根據宿主細胞的不同可分為原核細胞表達系統和真核細胞表達系統。在外源基因表達時,通常把一個報告蛋白的基因與一個目的蛋白的基因融合在一起,形成融合蛋白,用于目的蛋白的檢測與純化。常用的報告蛋白有β-半乳糖苷酶(β-gal-actosidase)、谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione s-transfer-ase,GST)、綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)以及硫還蛋白(thioredoxin, Trx)等。其中值得一提的是GFP,2008年8月有3位科學家因此獲得諾貝爾化學獎:日本科學家Osamu Shimomura、美國科學家Martin Chalfie、美籍華人科學家錢永健。除了直接標記目的蛋白用于檢測與純化外,還可利用某些GFP具有熒光共振能量轉移(fluorescence resonanceenergy transfer,FRET)的現象,用于蛋白質折疊[6]、蛋白質-蛋白質相互作用[7]、信號轉導通路等[8]方面的研究。3 現代生物制藥的現狀

國際上,生物制藥業主要集中在美國日本和歐洲,其中美國作為生物制藥的發源地,無論是在經費投入、產品開發和研制,還是在產品生產和市場卜都居于國際領先地位,其它開發的產品和市場銷售額占全球的90%以上。目前, 美國共有生物制藥公司約1400家,具中形成規模生產的有Alzlgen、Seherir一g一Plougll、EliIJ1l一yMcrk、Gelexlteell等20多家公司。日本在生物技術的開發僅次美國, 目前共有生物制藥公司約600家,其中麒麟啤灑、中外制藥、味之素等著名廠商不僅在日本習內處與生物制藥各方面的領先地位,而不斷加強世界市場的開拓,進入歐洲和亞洲市場。歐洲在生物技術的開發上稍落后于日本但近兩年來歐洲在生物技術的投入和新公司成眾的數量上急速增長,目前歐洲的生物制藥公司約有300家但還處在發展的開始階段。

3.1 我國生物制藥的現狀

至2004年我國有現代生物制藥企業114家，其中疫苗生產企業28家，可以生產27種基因工程藥物和26種病毒的41種疫苗。按現價統計規定，生物生化制品生產企業全國409家，總產值220億元，銷售收入196億元。“十五”前四年，平均每年大于20%的速度增長用于該領域的投資不斷加大于固定資產平均增長32.5%。我國現已成為世界疫苗最大生產國年產量超過了10億個計量單位。兒科常見病疫苗年產量達5億人民幣除滿足自用外還向世界衛生組織(WHO)提供疫苗產品用于其他國家。3.2 我國生物制藥存在的問題及應采取的措施

我國生物制藥存在一系列問題開發水平低缺少創新產品生物制藥產業下游技術薄弱重復生產嚴重、資源浪費過大產業化規模小、市場競爭無序。可采取的措施以仿制促進創新最終以創新實現產業飛躍，多渠道建立融資網絡改革科研體制建立新的產學研一體化的機制，加強國際交流與合作積極應對國際競爭加強宏觀調控強化和規范財稅優惠政策。4 基因工程在生物制藥中的發展趨勢

目前基因工程藥物的研發趨勢是:(1)發展表達載體:目前最主要的用于生產的表達載體是哺乳動物細胞和大腸桿菌。大腸桿菌屬于原核表達系統,沒有糖基化功能,只能用于表達功能蛋白不需要糖基化的重組藥物,如胰島素等,且目的蛋白大量表達之后易形成包涵體,不易復性。而功能蛋白需要糖基化的則主要在哺乳動物細胞中表達。也有用真核化的原核表達載體[9]。目前還有“人源化”酵母表達體系和植物表達體系正在發展。(2)對現有的重組藥進行基因工程改造和修飾:通過基因工程的改造和修飾使蛋白藥物在臨床應用上更安全更有療效,如G-CSF和EPO等突變體藥物研究與開發。目前,由于天然基因工程藥物品種的研究已經相當普遍,因此采取對現有的重組藥進行基因工程改造和修飾的策略,既可以避免侵犯知識產權,又可以為新藥研究開辟出新途徑。(3)改變給藥途徑:在繼續改進注射用溶液和注射用無菌粉末的穩定性之外,還發展出化學修飾型、控釋微球型和脈沖式給藥系統。而在鼻腔、口服、直腸、口腔、肺部給藥方面也已取得重大進展。5 生物制藥研究新進展

5.1 計算機輔助藥物設計技術發展

計算機技術的發展和向藥物化學學科的滲透，促進了藥物設計的發展。20世紀90年代計算機輔助藥物設計取得突破性進展，現已成為藥物研究和開發的重要方法和工具。

計算機輔助藥物設計利用了計算機快速、全方位的邏輯推理功能、圖形顯示控制功能，并將量子化學、分子力學、藥物化學、生物化學和信息科學結合起來，研究受體生物分子與藥物結合部位的結構與性質、藥物與受體復合物的構型和立體化學特征、藥物與受體結合的模式和選擇性、特異性、、藥物分子的活性基團和藥效構象關系等，從藥物機理出發，改進現有生物活性物質的結構，快速發現并優化先導化合物，使其盡早進入臨床前研究，減少傳統的新藥研究的盲目性，縮短新藥研制的時間。

計算機輔助藥物設計有兩類方法，一類是基于機理的藥物設計（MBDD），另一類是基于結構的藥物設計（SBDD），基于機理的藥物設計要針對藥物作用機理，從靶點出發，考慮藥物與受體的作用過程，并要模擬藥物在體內的吸收、轉運、代謝等動態過程，比基于結構的藥物設計更合理，但該法還不成熟。目前的計算機輔助藥物設計主要還是基于結構的藥物設計，今后的計算機輔助藥物設計的目標是向基于機理的藥物設計方向發展。相信隨著生命科學和計算機科學的發展，考慮藥物不同作用機理和全部作用過程的計算機輔助藥物設計技術將逐步建立并不斷完善。

5.2 組合化學與高通量篩選技術發展

組合化學是近20年發展起來的一種合成大量化合物的新方法，它是建立在高效平行的合成之上，在同一個反應器內使用相同條件同時制備出多種化合物，建立各類化合物庫的策略。組合化學通常采用操作、分離簡便的固相化學合成。液相化學合成技術也在快速發展和完善中。

在藥物研究過程中，通過化合物活性篩選而獲得具有藥物活性的先導化合物是新藥研究的基礎。隨著分子水平的藥物篩選模型的建立，篩選方法和技術都發生了根本性的變化，出現了高通量篩選的新技術，大大加快了先導化合物的尋找和發現，并促進了高通量有機合成。近年來，組合化學與高通量篩選結合，使組合化學的化合物庫種類、數量不斷擴大，篩選的先導化合物數量和種類也在不斷地增多，使新藥的種類和數量也在不斷地增加。組合化學實現的自動化合成僅20世紀90年代后得到的各類化合物總和已超過了人類有史以來所發現化合物的總和，故有人把組合化學與高通量篩選結合技術稱為“新藥發現的高速公路”，據文獻記載，1992年～1998年的幾年，經過組合化學化合物庫與高通量篩選，確定的候選藥物已有46個，并已進入人體測試階段。[10]顯然，組合化學與高質量篩選的結合技術，大大地加快了新藥研制的步伐。雖然如此，組合化學建立的大型化合物庫，為篩選也帶來了困難，因此，利用組合化學設計，構建具有結構多樣性的小型而便于篩選的組合化合物庫，結合化學信息學和高通量篩選，將是組合化學與高通量篩選結合的一項重要課題。5.3 藥物手性合成技術發展

化學合成技術在新藥發現過程中發揮著十分重要的作用。近年來由于有機化學學科新理論、新反應、新技術不斷發現，使得合成反應具有化學選擇性成為現實，并促進了藥物合成技術的快速發展，其中手性合成技術使新藥研制的領域不斷擴大。

手性是自然界的本質屬性。在生物體手性環境，如酶、受體、離子通道、蛋白質、載體中，分子之間手性匹配是分子識別的基礎，受體與配體的專一作用，酶與底物的高度、區域、位點和立體催化專一性，抗原與抗體的免疫識別都與手性有關，同時藥物的生物應答常受到手性影響，包括藥物在體內的吸收、轉運、分配、位點活性的作用以及代謝和消除。所以，手性藥物的開發是當前醫藥界重點研究的熱點之一，并取得了令人注目的成就。目前已上市的藥物中手性藥物約占1/3，如2000年全球手性藥物銷售額達1233億美元。手性藥物的制備技術主要有拆分法、化學合成法和生物合成等三大類，發展較快的是后二類。化學合成法是在不對稱催化劑存在下，利用化學反應的動力學和熱力學不對稱性，進行單一對映體合成。在已上市的手性藥物中，其手性中間體均可通過現有的重（雙）鍵不對稱還原技術，特別是不對稱氫化和不對稱轉移氫化來合成。至今為止在不對稱催化合成中，昂貴的手性配體和貴金屬的使用，以及手性催化劑的催化效率仍是制約其在手性技術上應用的關鍵。因而，手性催化劑的設計和合成，以及催化劑的回收循環使用是當今不對稱催化合成研究的方向。

生物合成法則利用催化劑, 酶-催化反應的高度、底物、區域、位點和立體選擇性來合成手性藥物。生物合成法具有選擇性高、產率高、反應條件溫和等特點，隨著科學技術的發展，生物合成法將成為手性制備的高效手段。5.4 藥物生物技術發展[11] 生物技術藥物是指利用DNA重組技術或單克隆抗體技術或其它生物技術研制的蛋白質、抗體或核酸類藥物，它是目前生物技術研究最為活躍的領域，給生命科學的研究和生物制藥工業帶來了革命性變化。參考文獻

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[11]生物制藥產業發展概況[J].化學試劑, 2008,(04)

第三篇：生物制藥技術

08藥學***3陳省委

組合生物合成藥物進展

摘 要50年來抗生素在人類疾病治療中發揮了重要作用,今后的幾十年里它們也將是關鍵的治療劑。盡管在過去的20年中通過靶向篩選發現了一些微生物藥物,但是這種篩選方法很難發現新類型藥物。組合生物合成可以彌補這種不足,通過基因工程方法改造微生物基因和酶,產生新的抗生素,發現那些在自然界中不能發現的藥物。

關鍵詞 基因工程合生物合成新抗生素

微生物種類繁多,其產物化學結構豐富多彩,生物活性十分廣泛,是開發各種新產品的豐富資源,但是傳統的篩選方法已遠遠不能滿足社會發展的需要。隨著分子生物學和生物技術的發展,以及基因組學、蛋白質組學、生物信息組學、代謝組學研究的深入,人們對微生物基因組的研究也有了顯著進展,已經闡明了許多與微生物代謝有關的生物合成基因,為微生物組合生物合成藥物的研究和開發奠定了良好的基礎。

一、研究背景

自1928年弗萊明發現青霉素和1942年瓦克斯曼發現鏈霉素以來,微生物藥物在疾病防治和拯救人類生命中起著十分重要和不可替代的作用,特別是抗生素被國外科學家譽為20世紀醫學領域的皇冠寶石。微生物藥物一直是臨床最常用的藥物,在西方發達國家,抗生素占臨床處方藥物的20%以上,在中國約占處方藥物的30%。但自上世紀70年代后,隨著脊髓灰質炎、天花、麻風等傳染性疾病先后在全球范圍內被消滅,國家對微生物藥物研究的支持逐漸下降,抗傳染病藥物研究進入了困難時期。上世紀90年代后,我國在已有億乙肝病毒攜帶者的基礎上,又出現了100萬以上人類免疫缺陷病毒(HIV)攜帶者。2002年末以來,重急性呼吸窘迫綜合征(SARS)的出現使我國的傳病控制告急,不得不重新思考微生物藥物的研究策略在新的時期里,微生物藥物研究再度升溫,原因

①新病原微生物不斷出現,如SARS、艾滋病(AIDS)瘋牛病等;②生物武器的使用,如炭疽等;③各種耐菌株在世界范圍的傳播;④許多傳染性疾病,如肺核、血吸蟲病等的死灰復燃。目前國內外側重研究的生物藥物,主要有抗新病原微生物,抗耐藥菌,抗病毒,抗腫瘤抗生素以及微生物來源的生理活性物質。微物藥物的研究主要

包括以下內容:①抗新病原微生藥物的尋找與開發;②細菌耐藥機制及其抗耐藥細藥物研究;③微生物藥物的生物合成基因研究;④組生物合成微生物藥物研究。其中組合生物合成微生藥物是近年發展較快的研究領域,將在創新藥物研中發揮重要作用。

二、組合生物合成生物技術,尤其是基因工程技術的不斷發展,為生物醫藥領域開辟了廣闊的前景;通過基因工程技術所得到的藥物也在臨床治療某些疑難疾病中發揮著越來越重要的作用。

廣義,基因工程產品分為兩類

①單基因直接產物。通常是指單個基因編碼序列的翻譯產物(蛋白質),它們一般是生物大分子如干擾素和單克隆抗體,目前生物醫藥領域中開發的多數產品均屬于此類,其中包含有效地用于臨床治療的如重組人胰島素、干擾素和促紅細胞生成素。我國在此領域獨創的藥物不多,而且這類藥物的一個突出缺點是它們比較容易被仿制,只要有了相應的細胞系即可利用基本設備進行生產。

②多基因間接產物。是指由多基因編碼的多酶體系介導而合成的小分子化合物和多肽,包括自然界由微生物和植物產生的天然產物,如抗生素、生理活性物質或萜類化合物等結構比較復雜的化合物。它們品種繁多,性能各異,僅就目前研究得比較深入的聚酮體和萜類化合物,就包括具有抗腫瘤作用的阿霉素、紫杉醇,具有免疫抑制作用的FK506、西莫羅司,具有降血酯作用的洛伐他汀、銀杏內酯,具有抗結核桿菌作用的利福霉素,抗瘧藥物青蒿素等。

組合生物合成(combinatorial biosynthesis)是在微生物次級代謝產物合成基因和酶學研究基礎上形成的。組合生物合成的概念是結構不同但生物合成途徑相似的抗生素生物合成基因之間可以進行重組、組合或互補產生新結構的化合物。盡管微生物藥物的結構多樣,但形成這些產物的主要生化反應機制卻基本相同,它們通常是由非常簡單的化學物質,如小分子羧酸和某些氨基酸作為合成起始單位和延伸單位,通過由一系列基因編碼的多酶體系參與的生物化學反應(構成一個合成途徑)而形成的,參與這些天然產物生物合成的多酶體系是由多個結構明顯分開的功能區域所組成。研究表明,參與這類小分子生物合成的基因通常是連鎖或鄰接而構成一個基因簇(cluster),這為基因的克隆和操作提供了方便,同時由于參與

次級代謝生物合成酶系對底物的特異性,專一性要求不是很嚴格的,對結構相類似的底物均可識別,這一特點為不同基因組合產生新的化合物創造了條件。因此,有針對性地對某些基因進行操作,如替換、阻斷、重組以及添加、減少組件等,均有可能改變其生物合成途徑而產生新的代謝旁路(metabolic pathway),繼而形成新的化合物,這就為組合生物合成提供了基礎,國際上已有通過這些手段得到多個化合物的報道。

三、研究的科學意義

開展微生物基因工程組合生物合成創制新型藥物研究,具有如下意義。

1、利用組合生物合成體系,完成化學方法不能完或難以完成的活性化合物的合成,如抗癌藥物紫杉(taxol)等;這類活性化合物在自然界中含量少、需要大、醫學價值高,而且通常化學合成困難(成本高,難大,環境污染嚴重),為了確保紅豆杉資源的可持續用,除正在開展的苗圃栽培,并以苗圃作為紫杉醇提的原料之外,通過生物合成來使它們具最終的商業值是一個極具潛力的手段。例如,與抗癌藥物紫杉醇用相似的埃波霉素(epothilone)已在鏈霉菌中通過合生物合成方法獲得表達,現已進入開發研究階段。、對一些現有的結構復雜的天然產物如青蒿素銀杏內酯等有效組分進行定向合成,對臨床用抗生品種進行有針對性的修飾和改造,如對紅霉素進行造產生酮內酯型的大環內酯類抗生素,獲得對臨床藥菌具有活性的抗生素衍生物;或者通過對現有天產物或抗生素的結構改造,獲得具有全新活性的或化性能有明顯改善的天然產物或新抗生素。、組合生物合成產生新化合物的潛力很大,化合數是以可操作基因的指數方式形成,如設R為可利的基因數,n是每個基因的不同等位形式(即不同天產物來源的數目),從理論上講經過基因組合可得Rn種排列組合,即得到Rn個化合物。通過組合生合成,獲得一大批新化合物,作為高通量藥物篩選樣庫的來源之一。、由于多基因組合操作的平臺是以易于大規模產的微生物體系為基礎,使創制新型藥物的研究便產業化。、組合生物合成的研究,必將推動我國在基因水對天然資源的利用,更好地利用植物代謝產物,挖掘前實驗室條件下無法進行培養的生物體,包括海洋的生物體。隨著研究和應用的發展,植物和海洋生物級代謝產物的組合生物學研究,也將蓬勃

發展起來。

四、國內外研究現狀

1985年,Hopwood教授[4]在世界首次報道用遺工程的手段合成“非天然”的天然產物isochromanequinone,該工作為后來的組合生物合成奠定了礎。在以后的十幾年里,這一領域成為天然產物代工程研究中最活躍的領域,許多微生物次級代謝研的專家都加入這一領域的工作,因為組合生物合成潛力制造出很多先導化合物。目前的發展趨勢由最初的基礎研究逐步演變為基礎與應用兼顧,有的地向產業化邁進。該領域的研究也同樣得到工界的重視,美國加州高新技術產業公司研制的埃波素(epothilone D)已進入III期臨床評價階段。埃霉素原來由纖維堆囊黏細菌產生,其產量低,繁殖時間長,產品無法進行產業化生產。該公司利用基因組合技術使纖維堆囊黏細菌的埃波霉素生物合成基因在鏈霉菌中得到表達,并通過酰基轉移酶域替換及羥基化酶基因的阻斷,獲得了主要產生埃波霉素中抗腫瘤活性最好組分的epothilone D的基因工程菌。我國自上世紀80年代初開展以多基因組合工程技術研制新藥的研究,在聚酮類抗生素如大環內酯類抗生素、利福霉素、安莎霉素及抗生素產生菌分子生物學研究方面,取得一定進展。國家重大專項支持的基因工程必特螺旋霉素己進入臨床研究,基因工程必特螺旋霉素的研制為組合生物合成技術應用于小分子化合物的創制中提供了良好的工作基礎和經驗。我國微生物代謝產品研究歷史悠久,已形成多學科協調合作的體系,近年來在國家的支持下該體系已得到一定的發展,加強了微生物及代謝產物資源的開發。我們已逐步建立難培養極端微生物和未培養微生物資源及海洋微生物的挖掘工作,建立并完善從土壤或其他來源直接分離DNA技術。我國有很強的有機化學合成能力,可以合成進行組合合成的起始單元,開展前體介導的組合生物合成(precursor-directed biosynthesis)研究。我們已建立并不斷完善多種生物活性篩選模型,有天然產物化學分離鑒定及藥理、藥效、毒理評估的配套學科。

目前基因工程技術的發展水平,在單基因操作方面已經比較成熟;在多基因操作層次上雖然技術難度相對比較大,但近年來在此研究領域已有了迅猛的發展,已積累了較好的研究基礎,許多次級代謝產物生物合成基因簇已得到克隆,基因結構與功能已得到闡明,并且發展了一系列大容量載體和合適的宿主表達系統。組合生物合成已形成國際藥物領域研究的熱點和一個重要發展方向。

五、研究方向與前景

我國天然微生物及植物資源豐富,以微生物作為平臺的藥物生產歷史悠久、種類繁多,利用這一寶庫開展組合生物合成研究,建立新型化合物庫,作為新型藥物或先導化合物的重要來源之一,有重要的理論與實際意義。組合生物合成為當今世界研究熱點,我國也有一定工作基礎,開展這方面的研究將有利于加深對次級代謝生物合成機理的研究與應用、促進生物技術新藥研制中的作用,對發展我國新藥有重要意義,并推動新藥研究中高通量篩選技術與方法的建立與善,篩選出有價值的新藥。

我們要重點加強難培養微生物及海洋生物資源挖掘工作,建立并完善從土壤或其他來源直接分DNA技術,以豐富組合生物合成基因資源;加強微物天然化學研究,建立微量、快速、高效鑒定天然產化學結構的技術和方法;充分利用我們已經建立的種生物活性篩選模型,通過廣泛地聯合與協作,擴展合生物合成技術在創新藥物中的應用,建立我國基工程微生物組合生物合成創制新型藥物或先導化合研究的技術平臺。該研究將有助于開拓和促進我國新技術在新藥研究與開發中的應用,對創制具有我自主知識產權的新藥將會有積極推動作用。

對本課程的意見：

1、可能是因為選課人太少的問題，上課的時候沒有很好的聽課氣氛，不過主要

還可能是自己的原因，自己不能集中精神聽講。

2、以后只要選課的人比較多了，應該會好一些，上課的人少了，總是覺得就像

這門課不重要，老師講的很清晰，主要是我們上課時常開小差。自從上了大學，就沒太有人管了，有時聽起課來就愛聽不聽，這倒是對每門課都差不多的。

3、課堂上可以稍微提問一下，因為提問往往可以引起同學們的注意，這樣走神的情況可能會少一些。

4、課堂中還可以穿插一些與課程有關的歷史、說一下那些地方比較適合做研究、考研究生去哪里比較好啊什么的，這樣既可以對現在的科研大環境有所了解，課堂內容也不至于太單調。

最后謝謝老師兢兢業業地為我們把課上完，盡管上課人數少，你還是把課完整地給我們講完，謝謝老師為我們的付出。

第四篇：生物制藥技術

酶

分離純化酶的一般程序

1粗酶液的制備：材料的選擇，發酵液處理，細胞破碎及酶的抽提 2酶的初步分離：鹽析，等電點沉淀，有機溶劑沉淀，離心分離 3酶的高度純化（酶的精制）：層析法（凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析及親和層析），電泳（等電聚焦電泳）

4濃縮干燥及結晶：透析，旋轉蒸發，超濾，冷凍干燥

酶的主要純化技術－層析技術

利用混合液中各組分的物理化學性質的不同，(分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數)，使各組分以不同的比例分布在兩相中，當流動相以一定的速度流經固定相時，各組分的移動速度不同，從而使不同的組分分離的技術過程。稱為層析技術（chromatography）

離子交換層析（ion exchange chromatography）

在一定的pH條件下，帶電荷的蛋白質與高分子不溶性固定相偶聯的離子交換基團相吸附，流動相中解離的離子與被吸附的酶發生可逆的交換，而對不同吸附能力的蛋白質進行分離 離子交換劑的選擇：陰離子交換劑用于處理凈電荷為負的蛋白質，陽離子交換劑用于處理凈電荷為正的蛋白質

樣品在低離子濃度條件下上柱，逐漸增加洗脫液的離子濃度，使蛋白依次被洗脫下來 洗脫方式可以是步進式洗脫或線性梯度洗脫 洗脫液一般用 NaCl

凝膠過濾法（gel filtration）亦稱分子篩層析、排阻層析，是利用生物大分子的相對分子質量的差異進行層析分離的一種方法

凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內部具有立體網狀結構，形成很多孔穴。當含有不同分子大小的組分的樣品進入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內擴散，組分的擴散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴散到孔穴內部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動相向下流動，它們經歷的流程短，流動速度快，所以首先流出；而較小的分子則可以完全滲透進入凝膠顆粒內部，經歷的流程長，流動速度慢，所以最后流出；

分離提純 脫鹽 測定高分子物質的相對分子量

疏水層析（hydrophobic chromatography）

原理：蛋白質分子中含有亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸等疏水性較強的氨基酸，當蛋白質溶液經過疏水層析介質的疏水配基時，蛋白的疏水性集團（疏水補丁）會與疏水配基發生親和作用而被吸附在介質上。不同蛋白質分子中疏水基團的數量和特性有所不同。在洗脫時通過改變洗脫液的極性達到分離的目的

親和層析（affinity chromatography）

也稱功能層析、生物專一吸附或選擇層析。根據生物分子與特定的固相化配基（ligand）之間的親和力而使生物分子得到分離的方法 酶與激活劑/抑制劑/底物/輔酶；抗原與抗體；激素/配體與受體；蛋白質與DNA/RNA上特定區域

特定的配基（激活劑/抑制劑/底物/輔酶）固定于惰性載體 目的酶與配基特異性親和吸附，雜質被洗脫 改變洗脫條件，解除目的酶與配基的專一性結合

固定化酶（細胞）的定義

優點：

1.穩定性顯著提高；

2.同一批固定化酶能重復多次地使用； 3.固定化后，很容易與反應物分開（過濾），不污 染產物，而且有利于控制生產過程，同時也省去了 熱處理等使酶失活的步驟；

4.可長期使用，并可預測衰變的速度； 5.提供了研究酶動力學的良好模型。缺點：

①固定化時，酶活力往往有損失。②增加了生產的成本，初始投資大。

③只能用于可溶性底物，而且較適用于小分子底物，對大分子底物不適宜。④非均相反應。

①注意維持酶的催化活性及專一性。在酶的固定化過程中，酶與載體的結合部位不應當是酶的活性部位，而且要盡量避免那些可能導致酶蛋白高級結構破壞的條件。②固定化應該有利于生產自動化、連續化。為此，用于固定化的載體必須有一定的機械強度，不能因機械攪拌而破碎或脫落。

③固定化酶應有最小的空間位阻，盡可能不妨礙酶與底物的接近，以提高產品的產量。④酶與載體必須結合牢固，從而使固定化酶能回收貯藏，利于反復使用。

⑤固定化酶應有最大的穩定性，所選載體不與廢物、產物或溶劑發生化學反應。⑥固定化酶成本要低，以利于工業使用。

載體結合法

1物理吸附法2離子結合法3共價結合法 是將酶結合于不溶性載體上的一種固定化方法。1）物理吸附法 作用方式：非特異性物理吸附作用：范德華力；氫鍵；疏水作用；靜電作用 優點：制作簡單，酶分子的構象很少或基本不發生變化，固定化酶活力較高 缺點：酶與載體結合力弱，酶易從載體脫落 載體：纖維素、瓊脂糖、活性炭、沸石及硅膠等 2)離子結合法

作用方式：離子鍵結合

優點：制作簡單，處理條件緩和，酶蛋白的活性中心和高級結構破壞較少，可以制得活力較高的固定化酶。

缺點：離子鍵結合較松散，如在高離子強度下進行反應時，酶與載體易分開。載體：多糖類離子交換劑，合成高分子離子交換樹脂 3)共價鍵結合法

作用方式：共價鍵結合

優點：酶分子和載體間的共價鍵較牢固，有良好的穩定性及重復使用性 缺點：制備過程復雜，反應條件比較劇烈，酶活性損失比較嚴重。

制作方法：先將載體活化，在載體上引入一個活化基團，然后該活化基團再與酶分子表面的基團（羧基/氨基/羥基）反應結合。有戊二醛法、重氮化法、烷基化法等。

交聯法

利用雙功能（或多功能）基團的試劑，使酶蛋白分子之間發生交聯，凝集成網狀結構而成為固定化酶

常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐和雙偶氮苯等。其中最常用的是戊二醛

包埋法

1網格型2微囊型

將酶包埋在凝膠的微小空格內或埋于半透膜的微型膠束內，但底物仍能滲入到里面與酶接觸。

載體：凝膠，高分子聚合物（半透膜）

優點：利用此法制得的固定化酶，由于酶分子僅僅是被包埋起來，而未受到化學作用。酶蛋白幾乎不起變化。

缺點：酶被包埋在內部，對大分子底物很難發生催化作用。所以用包埋法制備的酶，一般只適用與小分子底物。

包埋法分為：網格包埋法和微囊包埋法。

酶傳感器（enzyme sensor）1生物傳感器的概念

由生物識別物質（如酶、微生物、動植物組織、抗體等）和能量轉換器相結合所構成的分析儀器，可以簡便快速的測定各種特異性很強的物質 要求識別物質對被測物具有高度的敏感性和選擇性

根據識別物質可分為：酶傳感器、組織傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器

2、生物傳感器的一般結構與工作原理 結構:有兩個部分組成

生物分子識別元件（感受器）：酶、核酸、抗體、細胞等 信號轉換器（換能器）：電化學電極、光學檢測元件、熱敏電阻、表面等離子共振器件等 原理：待測物質經擴散作用進入生物傳感器,通過分子識別發生特異的生物化學反應,產生的生化信號經換能器轉換為可定量和可處理的電信號,進而可檢測出該物質的濃度.根據反應產生的信號不同，可選擇相應的換能器.抗體

多克隆抗體：由于一個抗原通常都有幾個抗原決定簇，因此每個免疫細胞都可能產生一種針對某一抗原決定簇（antigenic determinant）的抗體，這些由同一抗原產生的不同抗體統稱為多克隆抗體。這些由不同B細胞克隆產生的抗體，稱為多克隆抗體（polyclonal antibodies，PcAb）。

單克隆抗體：單一類型的只針對某一抗原決定簇的抗體分子，是由單一的B淋巴細胞克隆產生的結構和特異性完全相同的高純度抗體。

抗原的制備

1.用基因工程技術制備重組蛋白抗原

2.提取純化天然抗原

3.合成多肽半抗原

4.小分子半抗原

5.多肽半抗原及小分子半抗原與載體偶聯

免疫

動物選擇：Balb/c小鼠，品系一致

途徑

體內，體外，脾內免疫

篩選陽性克隆及克隆化

克隆：由單個細胞繁殖擴增而形成性狀均一的細胞集落的過程。

目的：篩選陽性克隆；確保雜交瘤細胞所分泌的抗體具有單克隆性以及從細胞群中篩選

出具有穩定表現型。

篩選陽性克隆鑒定

單克隆抗體活性檢測方法：

1）酶聯免疫吸附實驗（ELISA）：可溶性抗原、細胞核病毒。2）放免測定（RIA）：可溶性抗原、細胞抗體。3）FAC（熒光激活細胞分選儀，流式培養儀）：針對細胞表面

抗原的抗體檢測。

4）IFA（間接免疫熒光法）：用于細胞和病毒抗體的檢測。

雜交瘤細胞的克隆化

（1）有限稀釋技術 柏松分布（2）半固體瓊脂培養法

0.5%瓊脂培養基中進行克隆

1ml含不同數量的細胞懸液

1ml42度0.5%的瓊脂液

單克隆抗體的大量制備

基因工程抗體（genetically engineered antibodies,gAb）

是通過基因工程技術研制的，即通過PCR技術獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當載體重組后引入不同表達系統所產生的抗體。基因工程抗體既保持了單抗的均一性、特異性強的優點，又能克服其為鼠源性的不足，是拓展單抗廣泛人體使用的重要途徑。

（一）嵌合抗體（chimeric antibody）

特點：是用人抗體的C區替代鼠的C區。效果：使鼠源性單抗的免疫原性明顯減弱，并可延長其在體內的半衰期及改善藥物的動力學。嵌合抗體的優點：

保持了親本鼠單抗的特異性和親和力；

減少人源性的恒定區的HAMA現象；

能有效地介導產生補體依賴的細胞毒作用(CDC)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（ADCC）及免疫調理作用。缺點：

目前已有數十種嵌合抗體進入了臨床試用，雖然HAMA現象較鼠單抗大為下降，但有相當比例的患者仍會出現HAMA癥狀，針對可變區的抗獨特型抗體反應仍很明顯。

（二）改型抗體（reshaped antibody，RAb）亦叫“重構抗體”，“CDR移植抗體（CDR grafting antibody）”。它是利用基因工程技術，將人抗體可變區（V）中互補性決定區（complementarity determinative region，CDR）的氨基酸序列改換成鼠源單抗CDR 序列。

特點：此種抗體可以使人單抗獲得鼠單抗的特異性又保持人源抗體的親和力。

動物

動物細胞分類

1、貼壁依賴性細胞 概念：anchoraged-dependent cell需要有適量帶電荷的固體或半固體支持表面才能生長的細胞 大多數動物細胞都屬于此類。

2、非貼壁依賴性細胞

概念：anchoraged-independent cell不依賴于固體支持物表面生長的細胞，可在培養液中懸浮生長，被稱為懸浮細胞。舉例：血液、淋巴細胞、腫瘤細胞和某些轉化細胞，Namalwa細胞。

3、兼性貼壁細胞

概念：對支持物的依賴性不嚴格，既可貼壁生長，也可懸浮生長。舉例：CHO細胞、BHK細胞、L929細胞。理想的藥物生產細胞系

轉基因技術的基本原理

將體外構建的重組DNA分子(目的基因或基因組片段)通過顯微注射、或轉染胚胎干細胞等方法注入動物的受精卵或著床前的胚胎細胞,然后將此受精卵或胚胎再植入受體動物的輸卵管或子宮中，使其發育成攜帶外源基因的轉基因動物。

同源重組

雙鏈DNA的兩個區段的DNA序列基本一致，但不一定完全相同，叫做同源區。同源的雙鏈DNA可以通過相互交換進行重組。

外源DNA如有同源區，也可通過類似的同源重組過程整合到生物的染色體基因組上。

胚胎干細胞（Embryonic Stem Cell，ES）是從早期胚胎的內細胞團經體外培養建立起來的多潛能細胞系，具有胚胎細胞相似的形態特征和分化特征。

新型

反義技術：根據堿基互補原理，使用與目標靶的遺傳物質（DNA或mRNA）特定互補的核苷酸片段來封閉基因表達的技術方法。

反義藥物：人工合成或生物合成的DNA或RNA，能與RNA互補，抑制疾病基因的表達。反義核酸（antisense nucleic acid）是一段與靶基因的某段序列互補的天然存在或人工合成的核苷酸序列。它可通過堿基配對與細胞內核酸特異結合形成雜交分子，從而在轉錄和翻譯水平調節靶基因的表達，具有合成方便、序列設計簡單、容易修飾、選擇性高、親和力高等特點。

核酶(ribozyme)具有酶活性的RNA，可降解特異的mRNA序列。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）

由雙鏈RNA介導的細胞內特異性mRNA降解過程，導致靶基因的表達沉默。

基因導入方式

直接體內療法（in vivo）

是指將目的基因直接導入體內有關的組織器官，使其進入相應的細胞并進行表達。間接體內療法（ex vivo）

是指在體外將目的基因導入靶細胞，經過篩選和增殖后將細胞回輸給患者，使該基因在體內有效地表達相應產物，以達到治療的目的。

腫瘤的基因治療

（一）通過抑癌基因抑制腫瘤細胞生長和誘導細胞凋亡。

（二）通過病毒感染殺傷腫瘤細胞

（三）通過誘導免疫系統識別并殺傷腫瘤細胞

（四）腫瘤的自殺基因治療

（五）腫瘤抗原靶向的腫瘤基因治療

（六）細胞因子基因治療

第五篇：現代生物制藥技術的研究進展

燕京理工學院現代制藥技術論文

燕京理工學院

Yanching Institute of Technology

（2016）屆化工與制藥專業現代制藥技術論

文

題目： 現代生物制藥技術的研究進展 學院： XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 專業： XXXXX 學號： XXXXXXX 姓名： Dream 指導教師： 林貝 教研室主任（負責人）： 林貝

2015 年 6 月 4 日

燕京理工學院現代制藥技術論文

現代生物制藥技術的研究進展

Dream 化工與材料工程學院 化藥1204班 學號XXXXXXX

指導教室 林貝

摘 要

本文簡述了近年來基因工程在生物制藥技術的發展和應用。其中主要從基因操作中大分子的分離、PCR技術、基因芯片、外源基因的表達這4個方面敘述基因工程相關技術的應用和發展,以及基因工程藥物的產業化現狀與發展趨勢。

關鍵詞：生物技術

基因工程

基因操作技術

生物制藥 基本概念 1.1 生物技術

廣義的生物技術是指人類對生物資源(包括動物、植物、微生物)的利用、改造的相關技術。其發展經歷了三個不同的階段——以釀造為代表的傳統生物技術，以微生物發酵為代表的近代生物技術，以基因工程、細胞工程、酶工程和蛋白質工程為代表的現代生物技術。

是二十世紀70年代開始異軍突起的高技術領域，在醫療、制藥、農業、輕工食品及環保業發展迅速。[1]以上的生物技術成果集中應用于醫藥工業。

1.2 現代生物技術兩大核心工程 1.2.1 工程

概念：基因工程是分子遺傳學和工程技術結合的產物。是現代生物技術的核心它能按人類需要把遺傳物質DNA分子從生物體中分離出來，進行剪切、組合、拼裝合成新的DNA分子。再將新的DNA分子植入某種生物細胞中，使遺傳信息在新的宿主細胞或個體中得到表達，以達到定向改造或重建新物種的目的。

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1.2.2 細胞工程

概念：利用細胞融合技術把含有不同遺傳物質的細胞合成雜種細胞。并使之分裂生長成為雜種生物。它包括體細胞融合、核移植、細胞器攝取和染色體片段的重組等。

1.3 現代生物制藥

主要指基因重組的蛋白質分子類藥物的制造過程，即利用基因工程、抗體工程或細胞工程技術生產的源自生物體內的天然物質，用于體內診斷、治療或預防藥物的生產過程(也可稱基因工程制藥)。基因操作技術

基因大分子的分離主要指質粒(plasmid DNA)和基因組DNA的分離。質粒分離的常用方法有堿變性抽提法、煮沸法、去污劑裂解法、質粒DNA釋放法、酸酚法等。質粒在基因工程中最常用來做成各種克隆載體(cloning vector)或表達載體(expression vector)。質粒載體還可用于RNA干擾(RNA inter-ference)的研究[1](由于這一技術的研究和應用,美國科學家Andrew Z.Fire博士和Craig C.Mello博士獲得了2006的諾貝爾生理學或醫學獎)。基因組DNA的分離通常采用酚-氯仿法、基因文庫(gene library)、Southern雜交以及PCR擴增技術等。其中基因文庫是指含有某種生物基因組不同基因片段的一群DNA重組體克隆,包括cDNA文庫(com-plementaryDNA library, cDNA library)和基因組DNA文庫(genomic library)。最近又有研究者利用名為chum-RNA的小分子RNA建立非PCR擴增的單細胞cDNA文庫[2]。

2.1 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)是一種在體外模擬天然DNA復制過程的核酸擴增技術。該法由Mullis等人于1985年發明,并于1993年獲得了諾貝爾化學獎。PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引

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物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。PCR技術可分為定性PCR和定量PCR。

2.2 定性PCR技術

定性PCR技術包括:反轉錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR),是從非常少量的mRNA樣品構建大容量cDNA文庫的方法,還發展出實時RT-PCR用于定量實驗[3];多重PCR(multiplex PCR),是指在同一PCR反應體系中加入多對不同的引物,以擴增同一模板的不同區域;反向PCR(inverse PCR),該法可以對一個已知DNA片段兩側的未知序列進行擴增和研究;錨定PCR(an-chored PCR),現稱為cDNA末端快速擴增技術(rap-id amplification of cDNA ends,RACE)[4]。

2.3 熒光標記分子

定量PCR技術以實時PCR(real time PCR)為代表,其基本原理是在PCR反應體系中引入熒光標記分子,對每一反應時刻的熒光信號積累進行實時監測,計算出PCR產物量,或通過標準曲線法得出初始模板量。

2.4 基因芯片

基因芯片(gene chip ormicroarray),是生物芯片的一種,其基本技術包括:核酸方陣的構建、樣品的制備、雜交和雜交圖譜的檢測及讀出。根據用途不同可分為表達譜芯片(expression profile chip)、測序芯片和診斷芯片。其中表達譜芯片的應用最為廣泛,可用于基因功能分析、疾病發生機制的探討及藥物研究和篩選[5]。(1)確定藥靶基因:通過比較正常細胞與異常細胞表達譜之間的差異,從而確定藥靶基因。(2)監測藥物治療前后的基因表達變化:該監測可有3方面的作用。一是用于研究藥物作用機制,通過監測基因表達的變化,可研究藥物作用途徑和對細胞信號轉導的影響,從而了解該藥物的作用機制;二是用于研究藥物毒

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理,從表達譜的改變和異常表達,便可分析藥物毒理;三是用于藥物篩選,利用用藥前后表達譜的改變,通過分析病理、生理、生化原理,能高效地篩選出新的藥物或先導化合物。N A 芯片技術在藥物基因組學的應用, 一方面可加速藥物基因組學的發展;另一方面: D N A 芯片利用藥物基因組學的研究成果, 根據基因型將人群劃分為各種類型。D N A芯片可自動快速地檢測哪些可影響藥物效應的基因(為藥物代謝酶、藥物作用靶標等)例如設計一種淋巴白血病藥物基因組芯片, 包括所有可能影響病人化療反應的基因, 借助于這種芯片, 根據病人的基因型分類, 醫生為每一個病人選擇合適的治療藥物和劑量。

2.5 外源基因

導入宿主細胞的外源基因,通過基因表達得到相應的蛋白質產物。根據宿主細胞的不同可分為原核細胞表達系統和真核細胞表達系統。在外源基因表達時,通常把一個報告蛋白的基因與一個目的蛋白的基因融合在一起,形成融合蛋白,用于目的蛋白的檢測與純化。常用的報告蛋白有β-半乳糖苷酶(β-gal-actosidase)、谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione s-transfer-ase,GST)、綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)以及硫還蛋白(thioredoxin, Trx)等。其中值得一提的是GFP,2008年8月有3位科學家因此獲得諾貝爾化學獎:日本科學家Osamu Shimomura、美國科學家Martin Chalfie、美籍華人科學家錢永健。除了直接標記目的蛋白用于檢測與純化外,還可利用某些GFP具有熒光共振能量轉移(fluorescence resonanceenergy transfer,FRET)的現象,用于蛋白質折疊[6]、蛋白質-蛋白質相互作用[7]、信號轉導通路等[8]方面的研究。現代生物制藥的現狀

國際上,生物制藥業主要集中在美國日本和歐洲,其中美國作為生物制藥的發源地,無論是在經費投入、產品開發和研制,還是在產品生產和市場卜都居于國際領先地位,其它開發的產品和市場銷售額占全球的90%以上。目前, 美國共有生物制藥公司約1400家,具中形成規模生產的有Alzlgen、Seherir一g一Plougll、EliIJ1l一yMcrk、Gelexlteell等20多家公司。日本在生物技術的開發僅次美國, 目前共有生物制藥公司約600家,其中麒麟啤灑、中外制藥、味之素等著名廠商不僅在日本習內處與生物制藥各方面的領先地位,而不斷加強世界市場的開拓,進入歐洲和亞洲市場。歐洲在生物技術的開發上稍落后于日本但

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近兩年來歐洲在生物技術的投入和新公司成眾的數量上急速增長,目前歐洲的生物制藥公司約有300家但還處在發展的開始階段。

3.1 我國生物制藥的現狀

至2004年我國有現代生物制藥企業114家，其中疫苗生產企業28家，可以生產27種基因工程藥物和26種病毒的41種疫苗。按現價統計規定，生物生化制品生產企業全國409家，總產值220億元，銷售收入196億元。“十五”前四年，平均每年大于20%的速度增長用于該領域的投資不斷加大于固定資產平均增長32.5%。我國現已成為世界疫苗最大生產國年產量超過了10億個計量單位。兒科常見病疫苗年產量達5億人民幣除滿足自用外還向世界衛生組織(WHO)提供疫苗產品用于其他國家。

3.2 我國生物制藥存在的問題及應采取的措施

我國生物制藥存在一系列問題開發水平低缺少創新產品生物制藥產業下游技術薄弱重復生產嚴重、資源浪費過大產業化規模小、市場競爭無序。可采取的措施以仿制促進創新最終以創新實現產業飛躍，多渠道建立融資網絡改革科研體制建立新的產學研一體化的機制，加強國際交流與合作積極應對國際競爭加強宏觀調控強化和規范財稅優惠政策。基因工程在生物制藥中的發展趨勢

目前基因工程藥物的研發趨勢是:(1)發展表達載體:目前最主要的用于生產的表達載體是哺乳動物細胞和大腸桿菌。大腸桿菌屬于原核表達系統,沒有糖基化功能,只能用于表達功能蛋白不需要糖基化的重組藥物,如胰島素等,且目的蛋白大量表達之后易形成包涵體,不易復性。

而功能蛋白需要糖基化的則主要在哺乳動物細胞中表達。也有用真核化的原核表達載體[9]。目前還有“人源化”酵母表達體系和植物表達體系正在發展。(2)對現有的重組藥進行基因工程改造和修飾:通過基因工程的改造和修飾使蛋白藥物在臨床應用上更安全更有療效,如G-CSF和EPO等突變體藥物研究與開發。目前,由于天然基因工程藥物品種的研究已經相當普遍,因此采取對現有的重組藥進行基因工程改造和修飾的策略,既可以避免侵犯知識產權,又可以為新藥研究

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開辟出新途徑。(3)改變給藥途徑:在繼續改進注射用溶液和注射用無菌粉末的穩定性之外,還發展出化學修飾型、控釋微球型和脈沖式給藥系統。而在鼻腔、口服、直腸、口腔、肺部給藥方面也已取得重大進展。生物制藥研究新進展

5.1 計算機輔助藥物設計技術發展

計算機技術的發展和向藥物化學學科的滲透，促進了藥物設計的發展。20世紀90年代計算機輔助藥物設計取得突破性進展，現已成為藥物研究和開發的重要方法和工具。

計算機輔助藥物設計利用了計算機快速、全方位的邏輯推理功能、圖形顯示控制功能，并將量子化學、分子力學、藥物化學、生物化學和信息科學結合起來，研究受體生物分子與藥物結合部位的結構與性質、藥物與受體復合物的構型和立體化學特征、藥物與受體結合的模式和選擇性、特異性、、藥物分子的活性基團和藥效構象關系等，從藥物機理出發，改進現有生物活性物質的結構，快速發現并優化先導化合物，使其盡早進入臨床前研究，減少傳統的新藥研究的盲目性，縮短新藥研制的時間。

計算機輔助藥物設計有兩類方法，一類是基于機理的藥物設計（MBDD），另一類是基于結構的藥物設計（SBDD），基于機理的藥物設計要針對藥物作用機理，從靶點出發，考慮藥物與受體的作用過程，并要模擬藥物在體內的吸收、轉運、代謝等動態過程，比基于結構的藥物設計更合理，但該法還不成熟。目前的計算機輔助藥物設計主要還是基于結構的藥物設計，今后的計算機輔助藥物設計的目標是向基于機理的藥物設計方向發展。相信隨著生命科學和計算機科學的發展，考慮藥物不同作用機理和全部作用過程的計算機輔助藥物設計技術將逐步建立并不斷完善。

5.2 組合化學與高通量篩選技術發展

組合化學是近20年發展起來的一種合成大量化合物的新方法，它是建立在高效平行的合成之上，在同一個反應器內使用相同條件同時制備出多種化合物，建立各類化合物庫的策略。組合化學通常采用操作、分離簡便的固相化學合成。液

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相化學合成技術也在快速發展和完善中。

在藥物研究過程中，通過化合物活性篩選而獲得具有藥物活性的先導化合物是新藥研究的基礎。隨著分子水平的藥物篩選模型的建立，篩選方法和技術都發生了根本性的變化，出現了高通量篩選的新技術，大大加快了先導化合物的尋找和發現，并促進了高通量有機合成。近年來，組合化學與高通量篩選結合，使組合化學的化合物庫種類、數量不斷擴大，篩選的先導化合物數量和種類也在不斷地增多，使新藥的種類和數量也在不斷地增加。組合化學實現的自動化合成僅20世紀90年代后得到的各類化合物總和已超過了人類有史以來所發現化合物的總和，故有人把組合化學與高通量篩選結合技術稱為“新藥發現的高速公路”，據文獻記載，1992年～1998年的幾年，經過組合化學化合物庫與高通量篩選，確定的候選藥物已有46個，并已進入人體測試階段。[10]顯然，組合化學與高質量篩選的結合技術，大大地加快了新藥研制的步伐。雖然如此，組合化學建立的大型化合物庫，為篩選也帶來了困難，因此，利用組合化學設計，構建具有結構多樣性的小型而便于篩選的組合化合物庫，結合化學信息學和高通量篩選，將是組合化學與高通量篩選結合的一項重要課題。

5.3 藥物手性合成技術發展

化學合成技術在新藥發現過程中發揮著十分重要的作用。近年來由于有機化學學科新理論、新反應、新技術不斷發現，使得合成反應具有化學選擇性成為現實，并促進了藥物合成技術的快速發展，其中手性合成技術使新藥研制的領域不斷擴大。

手性是自然界的本質屬性。在生物體手性環境，如酶、受體、離子通道、蛋白質、載體中，分子之間手性匹配是分子識別的基礎，受體與配體的專一作用，酶與底物的高度、區域、位點和立體催化專一性，抗原與抗體的免疫識別都與手性有關，同時藥物的生物應答常受到手性影響，包括藥物在體內的吸收、轉運、分配、位點活性的作用以及代謝和消除。所以，手性藥物的開發是當前醫藥界重點研究的熱點之一，并取得了令人注目的成就。目前已上市的藥物中手性藥物約占1/3，如2000年全球手性藥物銷售額達1233億美元。

手性藥物的制備技術主要有拆分法、化學合成法和生物合成等三大類，發展較快的是后二類。化學合成法是在不對稱催化劑存在下，利用化學反應的動力學

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和熱力學不對稱性，進行單一對映體合成。在已上市的手性藥物中，其手性中間體均可通過現有的重（雙）鍵不對稱還原技術，特別是不對稱氫化和不對稱轉移氫化來合成。至今為止在不對稱催化合成中，昂貴的手性配體和貴金屬的使用，以及手性催化劑的催化效率仍是制約其在手性技術上應用的關鍵。因而，手性催化劑的設計和合成，以及催化劑的回收循環使用是當今不對稱催化合成研究的方向。

生物合成法則利用催化劑, 酶-催化反應的高度、底物、區域、位點和立體選擇性來合成手性藥物。生物合成法具有選擇性高、產率高、反應條件溫和等特點，隨著科學技術的發展，生物合成法將成為手性制備的高效手段。

5.4 藥物生物技術發展[11]

生物技術藥物是指利用DNA重組技術或單克隆抗體技術或其它生物技術研制的蛋白質、抗體或核酸類藥物，它是目前生物技術研究最為活躍的領域，給生命科學的研究和生物制藥工業帶來了革命性變化。

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