第一篇：PCR學習心得

參加《臨床基因擴增實驗室技術人員上崗培訓

班》心得

本人于2015年3月10至15日參加了廣東省臨檢中心舉辦的臨床基因擴增實驗室技術人員上崗培訓班。通過學習，除了取得廣東省臨檢中心頒發的培訓證書外，還極大的提高了理論和實驗操作水平，現總結如下。

此次培訓包括理論培訓和實驗操作。在理論培訓課程當中，衛生部臨床檢驗中心的李金明教授為我們詳細講解了《臨床基因擴增實驗室設計及質量管理體系的建立》、《臨床基因擴增檢驗的質量保證》等內容。通過學習，了解到臨床PCR實驗室設計必須遵循各區獨立、注意風向、因地制宜，方便工作的原則。質量管理的內涵：寫你所做的，做你所寫的，記錄你已做的，分析你已做的。認識到臨床標本的正確采集、運送、保存的重要性，是臨床檢驗的質量保證的關鍵性環節，是解決涉及實驗室檢驗的醫患糾紛的方法之一。同時通過病例分析，對于臨床基因擴增檢驗的檢驗前，檢驗中，檢驗后的質量控制，還有實驗的結果處理和分析有了重新認識。對于實驗室是否出現污染的鑒別，以及出現污染的處理措施有了深刻了解。

臨床實驗醫學的發展現在經歷了三個時代，分別是生化診斷時代，免疫診斷時代，和和現在的分子（基因）診斷時代，而現今時代的標志性技術正是PCR技術，是反映疾病本質的實驗。正是有臨床基因擴增檢驗技術在癌癥等疾病的診斷方面有了多方應用，通過驅動基因的選擇，為靶向治療患者延長了生存期。為個體化診療中對疾病的鑒別診斷，診治方案的設定提供重要的參考依據，同時也為治療過程中臨床對于治療方案的調整提供依據。臨床基因擴增檢驗技術在個體化診療中是不可或缺的一部分，是其重要的組成部分，具有強大的發展潛力和前景。

實驗操作內容為EGFR突變基因檢測。實驗操作過程中，通過認真學習和細致聽講帶教老師的規范實驗操作，了解到了實驗的關鍵操作，糾正了平常在臨床實際工作操作上的一些不良習慣，為日后規范檢驗操作提供了基礎。通過分組親自操做實驗，分析和判斷自己的實驗結果，做實驗記錄筆記，基本掌握EGFR突變基因檢測。

通過為期六天的理論和實驗培訓，從中學習到了很多知識，掌握了嚴格的防污染以及污染的處理措施，了解到實驗室設置的人流、物流、氣流的走向設計原則，解決了日常工作中的實際問題，為日后臨床基因擴增檢驗工作的開展打下了堅實的基礎。了解到臨床基因擴增檢驗技術的發展方向，受益匪淺。

第二篇：PCR實驗室

簡介

Pcr實驗室又叫基因擴增實驗室。PCR是聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復制。通過DNA基因追蹤系統，能迅速掌握患者體內的病毒含量，其精確度高達納米級別，精確檢測乙肝病毒在患者體內存在的數量、是否復制、是否傳染、傳染性有多強、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據

條件

1、必須擁有標準的的PCR熒光實驗室;實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出 由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它 有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣 泛應用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹

2、檢測設備必須符合標準PCR熒光實驗室設置要求;熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統。

3、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認證;

4、檢測人員必須通過國家臨檢中心業務培訓并取得合格證書;PCR實驗室內工作人員必須參加由國家衛生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓班，并持證上崗。PCR實驗室通過驗收，實驗室至少必須應有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”。PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛生部的要求，確保檢測結果準確、確保實驗室衛生安全，確保實驗室長期穩定運行

5、必須在無菌無塵環境下進行操作

功能

能夠對患者病情進行科學、準確、實時的掌控，并結合抗HBV與T細胞免疫來打破免疫耐受，阻斷肝病病毒復制的療法、有效的分解肝炎病毒，解決了乙肝病毒易變異、耐藥，病毒復制模板難以治療，人體免疫耐受狀態不易打破等醫學難題，能迅速消除臨床癥狀，而且有效抑制乙肝病毒復制，明顯加快e抗原、抗體的血清轉換速度，殺滅血液及肝細胞內的病毒，為防止再感染提供了長期保護，有效阻斷和逆轉肝纖維化、肝硬化進程。

建立方法

1、建立樣品準備區

這個區域專門用作樣品的準備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應該采取預防措施：⑴PCR產物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。⑵組織培養物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根據應用的需要提取DNA或RNA。⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產生，而且管子不能用力崩開，這樣會產生氣溶膠。⑺任何時候都應該穿實驗服和帶手套，手套要經常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間，經常清洗。

2、樣品準備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題，反轉錄一步可以在樣品準備區進行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。

3、建立前PCR區。

該去專門用于準備各種反應，這個區域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準備的污染。前PCR區必須要有試劑和準備，特別是專門用于前PCR區的正壓活塞式移液管。

4、PCR實驗室試劑的操作。

⑴所用的所有溶液都應該沒有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。⑷所用試劑都應該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。⑸所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。⑹新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗。⑺樣品準備和前PCR區所使用的移液管在不使用時都應該小心保存。

5、在前PCR區建立PCR混合物。

⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴增一種或少數幾種特異序列時這樣做很有用。⑵如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應混合物不夠經濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。⑶作為一個規則，應該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。⑷陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產物的污染，陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。⑸當做陽性對照時，有兩個理由決定了應該使用最少數量的核酸。⑹由于必須有對照反應，對照模板的特點應該予以考慮。

6、控制污染的方法。

已設計出很有力的酶學方法用來消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術能有效地消除由PCR產物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數量級。

7、后PCR區PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數據，應該留出一個專門用于反應后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區域的試劑或儀器用于任何前PCR活動

第三篇：PCR實驗室

高端PCR實驗室控制設計說明

PCR實驗室即分子生物學實驗室，在醫療、科研、生物技術方面得到廣泛的應用。因其在不同行業的應用各有區別，在具體設計時也有不同之處，就醫療機構的應用而言，主要使用三區或四區設計，即試劑準備區、樣品提取區、擴增分析區；此類三區設計時候應用于類似熒光定量型或同類PCR分析設備，及擴增與分析過程在設備內一次完成。而四區設計在三區的基礎上講擴增分析區拆分為擴增區與分析區適用于其他類型的pcr設備及手工處理。

在PCR實驗的設計上，經過多年的經驗累積，已經在一些關鍵技術上達成了共識。因為PCR實驗中所產生的DNA與RNA片段過于微小，以至于可以穿透高效過濾器，所以在實驗室設計上已經不在強制要求設計高效凈化系統，但是為了提高實驗環境水平及保護實驗室內的敖貴設備方面，如果在具備條件的情況下可考慮追加高效空氣凈化系統；建議凈化級別萬級。在PCR實驗中所產生的DNA與RNA片段污染是一直以來PCR實驗的重點問題。此類污染主要至上次試驗中所產生的基因片段對下次試驗產生的污染，而且一旦試驗環境中的污染形成后很難處理。因為消毒等傳統方式對于基因污染沒有很良好的效果。所以在PCR實驗室設計中一般將整套實驗室設計為全新風型實驗室，這樣而已通過有效的換氣次數來達到凈化室內污染的作用。而在控制方面也有很多不同之處，因為各單位對PCR實驗的重視程度各有不同，所以在設計上也有不同，主要的控制設計有定送定排式壓力控制系統、變送定排式壓力控制系統變送變排式壓力控制系統。在控制設備方面也有很多區分如壓力無關型控制系統、壓力有關型控制系統。

根據業主要求，本PCR實驗室為三區設計，各區可獨立使用，不設置高效過濾系統等相關要求，根據業主以上要求，我方給出的設計方案為壓力無關型變送變排壓力控制系統。本系統的特點是，設備啟動后可根據實驗室內使用節點調節送風量及排風量來控制各房間狀態，系統說明見下圖

? 每個房間可分別控制，使用時通過房間開關輸出啟動信號，當設備接到啟動信號時設備運行，運行中根據管道壓力反饋決定變頻器大小，房間內送排風量由壓力無關型風量調節閥控制。? 當有多個房間開啟或關閉時，設備更加管道壓力反饋，調節設備變頻器增加或減少送排風量來穩定管道壓力。各房間內壓力又房間內的壓力無關型定風量閥進行控制。

? 當BSC（生物安全柜，B2全排）開啟時BSC專用供風機組運行，BSC-供風機-排風機連鎖運轉。

? 當BSC做變風量調節時，根據房間內壓力變化，BSC專用供風機組前安裝的壓力無關型變風量調節閥根據壓力變化增減送風量，確保房間壓力執行在可控范圍內。

? 當房間不適用時，房間與緩沖間均關閉電動密閉閥，確保房間處在密閉狀態避免布朗運動造成的可能污染風險。

? 房間換氣次數均按照一定凈化標準設計，當室內污染發生時，通過一定時間的換氣處理后，污染問題可以基本解決。? 本系統如果業主需要，可在室內送風口末端加裝高效過濾設備，房間可升級為凈化型實驗室。

? 壓力無關型風閥簡介：壓力無關型風閥的特點是不會根據管道壓力的變化而影響風閥內部的送風量，在一定管道壓力區間內能夠自行調節閥體阻力，來穩定送風量，是高端實驗室必備的關鍵部件，目前此類閥體技術均有國外生產廠家控制，目前國內主用使用的產品有妥思、文丘里、西門子等品牌。

第四篇：PCR經驗總結

PCR經驗總結

實驗注意事項：

（1）DNA處理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有緩沖液吸頭、離心管等用前必須高溫高壓處理，常規消耗用品用后作一次性處理，避免反復使用造成污染。

（2）PCR操作應戴手套并勤于更換，必要時應戴好帽子和口罩，就像做手術一樣，要有“無菌觀念”。

（3）成套試劑，小量分裝，專一保存，防止它用。配制試劑用新器具，用后作一次性處理。（4）試劑管用前先瞬時離心（10s），使液體沉于管底，減少污染手套與加樣器機會。（5）最后加模板DNA，馬上蓋好，混勻，瞬時離心（10s），使水相與有機相分開。加入模板且忌噴霧污染，所有非即用管都應蓋嚴。加模板DNA后應更換手套。（6）實驗設陽性、陰性對照。

還有諸如：移液槍用完要放到最大計量位置，防止久了彈簧失靈；防止RNA酶污染標本；低溫下操作，防降解；試劑有致癌致畸作用，做好個人防護；頭腦中各操作步驟要清楚，不要加錯試劑。

問題及解決方案匯總：

一、假陰性，擴增無條帶

PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及活性 ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

二、假陽性

出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或 器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR來減輕或消除。

三、出現非特異擴增帶

PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設計引物。②減低酶量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。④適當提高退火溫度或采用兩步法。

四、出現片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：①減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環次數。

五、出現大量引物二聚體

1.從引物自身著手，重新設計引物，這是最根本解決這一問題的辦法； 2.可能模板有問題；

3.模板濃度過小，適當加大模板量；

4.Taq酶，引物，Mg2+濃度可能過高，可降低它們的濃度；

5.取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘，然后迅速拿出置于冰上瞬時冷卻，這時再加入反應體系當中，引物二聚體就會消失的；

6.所配Mix中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增強特異性；

7.PCR反應體系的配制在冰上進行，最后加Taq酶，PCR結束后，產物勿放置在室溫下過長時間，有人認為室溫下有些Taq酶會將多余的引物合成為二聚體。

8.增加循環數；

9.降低退火溫度后有條帶，則應逐漸提高溫度，若提高溫度的同時產物量減少，則考慮增加鎂離子濃度（根據擴增片斷長度而定，片段長則相應鎂離子濃度應該高一些）；

10.若降低退火溫度，發現還是只有引物二聚體，而且鎂離子的濃度在20-25mM沒有區別，則考慮Buffer等試劑沒有完全融解、混勻，導致吸取的試劑濃度不對。11.以上次的PCR產物作模板二次PCR，可以提高引物與模板的特異性，減少引物二聚體，如果兩次時間間隔短的話，可以把原產物稀釋100－1000倍，如果間隔較長可以稀釋50－100倍；

六、高GC與復雜結構的模板處理

將模板置于95℃水浴鍋中處理10分鐘以上，然后置于冰上瞬時冷卻，可大大降低二級結構對PCR的影響。

七、長片段與短片段拼接失敗（定點突變）

在做定點突變時，倘若突變位點距離基因的某一側較近（短片段<200bp）時，通常拼接困難或者難以通過電泳結果直觀判斷是否拼接成功。此時，可在短片段的上方（突變近5’端）或下方（突變近3’端）選取一條載體通用引物與基因另一條引物PCR（控制產物大小>300bp），然后再做基因拼接。確認大小無誤后，再以此產物為模板，用基因首尾引物PCR即可。

八、Long PCR無條帶

對于>5Kb片段擴增，常規PCR很難得到較好的條帶，建議①更換更適合于Long PCR的聚合酶；②添加PCR Enhancer調整體系；③設計多對引物分段擴增。

PCR增強劑（PCR Enhancer）：

常見的添加劑有：DMSO，甘油，甲酰胺，硫酸銨，甜菜堿，BSA等，它們對PCR反應的影響雖然有所不同，但都可提高PCR的擴增效率。

1.DMSO：解除模板DNA局部二級結構，增加引物與模板的特異性結合，使聚合酶更容易在二級結構處延伸，但是對酶活有抑制作用，且當其濃度大于10％時還會降低保真性。

2.甘油：可降低模板溶解溫度（Tm），提高產量，但是對酶活有抑制作用。3.甲酰胺：促進某些“引物－模板”退火，降低帶有二級結構的DNA的變性溫度。4.硫酸銨：增加反應體系的離子強度，改變DNA的變性及退火溫度，調節酶活。5.甜菜堿：有利于DNA雙鏈的解開，Polymerase的結合，提高PCR的效率。

第五篇：PCR防污染措施

【分享】PCR污染與對策

PCR污染與對策

PCR反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生.污染原因

(一)標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染.(二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三)PCR擴增產物污染.這是PCR反應中最主要最常見的污染問題.因為PCR產物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可造成假陽就可形成假陽性.還有一種容易忽視，最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題.(四)實驗室中克隆質粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見.因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力.其污染可能性也很大.污染的監測

一個好的實驗室，要時刻注意污染的監測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施，防止和消除污染.對照試驗

1.陽性對照:在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR 反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志.陽性 對照要選擇擴增度中等、重復性好，經各種鑒定是該產物的標本，如以重組質粒為陽 性對照，其含量宜低不宜高(100個拷貝以下).但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽 性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大.因而當某一PCR試劑經自己使用穩 定，檢驗人員心中有數時，在以后的實驗中可免設陽性對照.2.陰性對照:每次PCR實驗務必做陰性對照.它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用 鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照.②試劑 對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以監測試劑是否污染.3.重復性試驗

4.選擇不同區域的引物進行PCR擴增 防止污染的方法 一． 污染的預防

進行PCR操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規程，最大程度地降低可能出現的PCR污染或杜絕污染的出現。

（一）劃分操作區：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區域內進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區內進行： 1.標本處理區，包括擴增摸板的制備； 2.PCR擴增區，包括反應液的配制和PCR擴增；

3.產物分析區，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。

各工作區要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR擴增→產物分析→產物處理。

切記：產物分析區的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。

（二）分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA： 1． PCR用水應為高壓的雙蒸水；

2． 引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區配制；

3． 引物和dNTP應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發生污染時查找原因。

(三)實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意： 1.戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；

2.使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；

3.避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；

4.操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度； 5.最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管； 6.操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性； 7.盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區； 8.重復實驗，驗證結果，慎下結論。二． 追蹤污染源

如果不慎發生污染情況，應從下面幾條出發，逐一分析，排除污染。

（一）設立陰陽性對照：有利于監測反應體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應選擇擴增弱，且重復性好的樣品，因強陽性對照可產生大量不必要的擴增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質粒為對照，100個拷貝之內的靶序列就足以產生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為PCR敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點雜交等）檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應包括PCR體系中各試劑的時機對照，即包括PCR反應所需的全部成分，而不加模板DNA，這對監測試劑中PCR產物殘留污染是非常有益的。如果擴增結果中試劑對照為陽性結果，就是某一種或數種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設立不同的反應管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應馬上處理。

（二）環境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發現試劑被污染了，如果預防措施比較嚴密，則考慮可能為環境污染。環境污染中常見的污染源主要有： 1.模板提取時真空抽干裝置； 2.凝膠電泳加樣器； 3.電泳裝置； 4.紫外分析儀；

5.切膠用刀或手術刀片； 6.離心機；

7.冰箱門把手，冷凍架，門把手或實驗臺面等；

此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源。1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2）0.1ml去離子水浸泡；3）取5ml做PCR實驗；4）電泳檢測結果。

8.氣溶膠。如果經過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR產物的氣溶膠造成的，此時就應該更換實驗場所，若條件不允許，則重新設計新的引物（與原引物無相關性）。三．污染處理

（一）環境污染

1.稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤；

2.紫外照射（UV）法：紫外波長（nm）一般選擇254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產物污染時，要考慮PCR產物的長度與產物序列中堿基的分布，UV照射僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大。UV照射時，PCR產物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰核苷酸的序列。在受照射的長DNA鏈上，形成二聚體缺陷的數量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環丁烷型嘧啶復合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA鏈間與鏈內的交聯和DNA斷裂等）均可終止Taq DNA聚合酶的延伸。這些位點的數量與二聚體位點相當。如果這些位點（0.13/堿基）在DNA分子上隨機分布，一個500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點，那么，105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反，如果100bp的片段，每條鏈上僅有6處損傷，105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長度限制的原因。

（二）反應液污染

可采用下列方法之一處理：

1.DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室溫反應30 min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進行正常PCR擴增。該方法的優點是不需要知道污染DNA的序列；

2.內切酶法：選擇識別4個堿基的內切酶（如Msp I和Taq I等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進行PCR；

3.紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進行紫外照射，注意事項與方法同上述UV照射法； 4.g射線輻射法：1.5kGy的輻射可完全破壞0.1ng基因組DNA，2.0 kGy可破壞104拷貝的質粒分子，4.0 kGy仍不影響PCR，但高于此限度會使PCR擴增效率下降。引物可受照射而不影響PCR，g射線是通過水的離子化產生自由基來破壞DNA的。

（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法

由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR擴增片段通常為300bp左右，因此UNG的預防作用日益受到重視和肯定。

1.原理：在PCR產物或引物中用dU 代替dT。這種dU化的PCR產物與UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG對不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。

2.dUTP法：用dUTP代替dTTP，使產物中摻入大量dU。在再次進行PCR擴增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產物的殘留污染。由于UNG在PCR循環中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU的新的PCR產物。

3.dU引物法：合成引物時以dU 代dT，這樣PCR產物中僅5%u2ca端帶dU。UNG處理后，引物失去了結合位點而不能擴增。對長片段（1-2kb以上）的擴增用dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點。dU引物最好將dU設計在3%u2ca端或近%u2ca端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。

4.優點：可以去除任何來源的污染；UNG處理可以和PCR擴增在同一個反應管內進行；由于擴增產物中有大量dU存在，可徹底消除污染源。

5.需注意的是摻入dUTP的DNA不應對產物的任何操作有影響，在進行PCR產物克隆時，應該轉化UNG-（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉化產物會被受體菌UNG消化掉。

（四）固相捕獲法

用于去除標本中污染的核酸和雜質，原理如下：1）用一生物素標記的單鏈RNA探針與待擴核酸雜交，雜交區域是非擴增區；2）用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸，通過漂洗可去除污染的擴增產物和雜質；3）洗脫靶分子后用特異引物擴增非RNA探針雜交區域。第2）步的漂洗后可用PCR檢測以確定標本是否被擴增產物或重組質粒污染。

（五）RS-PCR法（RNA-specific PCR）

也稱為鏈特異性PCR，主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。其關鍵在于設計引物，逆轉錄引物的3%u2ca端（A區）有2 0個核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5%u2ca端2 0個核苷酸（C區）為附加修飾堿基。與mRNA逆轉錄后，經超速離心使 cDNA與多余引物分開，再用和第二引物（C）以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，以后的PCR循環中用逆轉錄引物的B區和引物C進行擴增加尾cDNA，而污染的DNA或質粒DNA才不會被擴增。

（六）抗污染引物法

該對引物擴增時通過病毒DNA克隆如入質粒的位點。這一區域只存在完整的原病毒中，在重組質粒中，這一區域分成兩個區域與克隆位點被。如果重組質粒污染了標本，也不能擴增出任何條帶，即使出現了擴增帶，其大小也與預期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴增，因此只要出現預期大小的擴增帶就可以證明標本是陽性的，該法試用于環狀靶分子系列。

四．其它PCR檢測方法：

（一）兩步法：是指在用套式PCR方法擴增某些含量低微的標本時，兩對引物在同一個管中以簡化步驟，減少污染。通常第一步進行20-25個循環，擴增外引物片段；第二步再進行10個循環，擴增內引物片段。兩步法對內外引物的Tm值有特殊要求，即內外引物的退火溫度高（如68℃），在此溫度下內引物不與模板退火，然后降低退火溫度（至55℃）再擴增內引物片段，這樣，在操作過程中，僅打開PCR反應管一次，大大減少了污染的可能性。

（二）熒光法：亦稱熒光PCR技術（fluoresence PCR, F-PCR），是1995年由美國PE公司首先研制成功的，它融匯了PCR的靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術精確定量的優點，電腦同步跟蹤，數據自動化處理，直接探測PCR過程中的變化以獲得定量的結果，不需要做PCR后處理或檢測，完全閉管操作。探針標記除用TET和FAM外，還可用HEX、JOE作為報告熒光，3′端的淬滅基團常用TAMRA。在探針保持完整時，熒光報告基團的熒光被熒光抑制基團淬滅，而在探針被切斷后，熒光報告基團才發出報告熒光，且熒光的強度與PCR產物的數量呈正比。熒光檢測儀器透過PCR管壁能直接檢測到熒光信號的波長和長度變化。

主要有以下優點：

1.探針特異性強，假陽性率低； 2.操作快速，不需要PCR后處理；

3.定量范圍寬，HBV 0.4fg-4000fg/ml(102-106 Dane′s particle/ml)； 4.閉管操作，PCR產物污染少； 5.靈敏度高。主要方法有： 1..熒光探針法：進行熒光PCR檢測時，要求熒光探針必須完全與靶基因互補，長度以20-30個堿基為宜，必要時3′端磷酸化封閉，以防在擴增時作為引物延伸。該方法利用Taq酶的3′→5′聚合酶活性及5′→3′外切酶活性，可以在鏈延伸過程中實現鏈替換，并將被替換的探針切斷，故可進行定性與定量檢測。

熒光探針5′端標記的TAMRA，在480nm激發下產生530nm的紅色熒光；3′端標記的FAM，激發后產生綠色熒光。PE公司推出的TaqMan系統，即采用雙熒光探針，如配合使用PCR擴增與熒光檢測合二為一的儀器，可進行實時（real-time）定量檢測。2．分子信標法：分子信標（molecular beacon）是一個發夾樣結構的特異探針，其環狀部分與靶序列互補。在室溫時，分子信標的發夾緊閉，熒光淬滅。PCR擴增時，隨著溫度升高，發夾松開，與單鏈模板特異結合，發出熒光。熒光強度與模板呈正比，故可用于PCR產物的定性及定量。