第一篇：臨床基因擴增PCR實驗室質量手冊的書寫

臨床基因擴增PCR實驗室質量手冊的書寫

許

斌

（江蘇省臨床檢驗中心）質量管理的歷史

1950年代臨床實驗室開始質量控制（Quality Control,QC）;1980年代參照工業(yè)的GMP管理思路建立良好實驗室實踐準則（Good Laboratory Practice,GLP）；進入質量保證（Quality assurance,QA）；1990年代實驗室引入質量體系認證及實驗室認可制度，實現全面質量管理（TQM，Total Quality Management）。質量體系認證——ISO9000（2000版）；實驗室認可——ISO/IEC標準17025-2000《校準和檢測實驗室資格的通用要求》；ISO/DIS標準15189-1999“醫(yī)學實驗室的質量管理?！? 美國臨床實驗室認證

?發(fā)證機構：HCFA（Health Gare Financing Administrations）,衛(wèi)生保健署 ?認證依據，CLOA38，行業(yè)認可，強制，體系+能力 ?認證中介機構：

*JCAHO（Joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations）衛(wèi)生機構認可聯合委員會

*CAP(College of American Pathologist)美國病理家學會

*COLA（Commission on Office Laboratory Accred-itation）

醫(yī)生實驗室認可委員會 我國實驗室合格評定

?認可

*依據：ISO/IEC 17025，15189 *國家評審，自愿，體系+能力 ?認證

*依據：ISO 9000：2000版 *中介機構，自愿，體系 ?行業(yè)技術驗收

*《臨床實驗室管理辦法》，《江蘇省醫(yī)院檢驗科建設與管理規(guī)范》 *省、市臨床檢驗中心，強制，體系+能力 4 PCR驗收意義及驗收依據

2002年開始的PCR實驗室驗收工作開創(chuàng)臨床檢驗技術準入的先河、推動臨床實驗室標準化建設、規(guī)范檢測市場、建立醫(yī)療事故預防機制。其依據為： 《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號 《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范》衛(wèi)檢字[2002]8號 《關于成立臨床基因擴增檢驗專家組的通知》蘇衛(wèi)醫(yī)[2002]42號 規(guī)定應具有的SOP（13個）

儀器設備的維護保養(yǎng)程序、儀器設備的校準程序、儀器設備的操作程序、臨床標本收集程序、臨床標本的處理（核酸純化）程序、臨床標本的保存程序、試劑的質檢操作程序、消耗品購置驗收和儲存程序、廢棄物的處理程序、內務管理程序、室內質量控制程序、核酸擴增及產物分析檢測的操作程序、抱怨處理程序。質量管理體系

6.1 定義 在質量方面指揮和控制組織的管理體系。（Quality Management System）管理體系是指建立方針和目標并實現這些目標的體系。實驗室通過把組織機構、職責、工作程序、質量活動過程和各類資源、信息等協調統一起來所形成的有機整體即為實驗室的質量體系。

6.2 質量體系的文件構成 第一層：質量手冊（綱領性文件）；第二層：程序性文件（體系要素的規(guī)定）；第三層：作業(yè)指導書（具體項目的操作指導）；第四層：記錄包括表格、簽名、原始記錄、報告等質量記錄和技術記錄。

6.3 質量手冊定義

GB/T6583定義：質量手冊是闡明一個實驗室的質量方針，并描述質量體系的文件。它既是質量體系的表征形式，又是質量體系建立和運行的綱領。它對實驗室的組織結構（含職責）、程序、活動能力（過程）和資源作出規(guī)定，是實驗室長期遵循的文件。

6.4 質量手冊的分類

根據手冊的內容和用途分為二類：質量保證手冊——用于證明，供客戶使用，質量管理手冊——用于運行，供實驗室內部使用。

6.5 質量手冊的作用

編寫質量手冊的健全和完善質量體系的首要環(huán)節(jié)。根據實驗室的內外因素合理調整、選擇體系要素，分配和落實質量職責，理順管理關系，明確管理責任，合理安排各類文件的層次，把實驗室積累的經驗變成法規(guī)性文件。協調各工作環(huán)節(jié)的準則。

內部質量審核的依據；對外證實實驗室的質量保證能力，提高客戶的信任度。

6.6 質量手冊的特征

?以客戶為關注焦點：以病人為中心，為臨床服務 ?領導作用：創(chuàng)造使員工能夠充分參與實現目標的環(huán)境 ?全員參與：各負其責

?過程方法：將資源和活動作為過程進行有效管理 ?管理的系統方法：各個過程的有效連接 ?持續(xù)改進：根據實際不斷完善

?基于事實的決策方法：遵循科學，實事求是出報告 ?與供方互利的關系：相互協作，共同獲利

6.7 質量手冊的結構 ?封面

?批準頁：包括實驗室名稱、標志，發(fā)行版次，生效日期，批準人簽名，手冊編號，受控狀態(tài)。

?實驗室公正性聲明

?修訂頁：以表格描述修訂序號、修訂的章節(jié)條款和簡要內容、批準人及日期。?目錄：各章節(jié)條款的名稱及頁碼

?前言：介紹實驗室的一般情況和手冊的適用范圍以及手冊中術語或縮略語的定義 ?手冊的管理：對手冊的保存、分發(fā)、評審、修訂以及保密作出規(guī)定 ?質量方針及目標

?組織結構及人員責權利關系

?要素描述：由系列SOP文件對溯源、人、機、料、樣、法、測等質量諸要素的陳述 ?支持性文件：包括實驗室平面圖、人員一覽表、儀器設備一覽表、引用標準及參考文獻等

6.8 標準操作程序

Standard Operational Procedure,簡稱SOP。程序的定義為：為進行某項活動所規(guī)定的途徑。SOP是臨床實驗室內部以文件的形式對質量活動用規(guī)定的方法進行連續(xù)而恰當的控制。實驗室的SOP應涵蓋所有的質量活動，包括檢測或校準計劃、管理性程序、技術性程序、項目操作程序和記錄表格等。由于影響每個實驗室的質量活動的條件和因素不一樣，一個SOP只在某個實驗室內有效，而不一定適用于其他實驗室。

6.9 標準操作程序的一般要求

?對完成各項質量活動的方法作出規(guī)定，每個SOP都應對一個或一組相互關系的活動進行描述；

?每個SOP應說明該項質量各環(huán)節(jié)的輸入、轉換和輸出所需的文件、物資、人員、記錄以及它們與有關活動的接口關系；

?規(guī)定開展質量活動的各個環(huán)節(jié)的物資、人員、信息和環(huán)境等方面應具備的條件； ?明確每個環(huán)節(jié)轉換過程中各項因素的要求，即由誰做、做什么、做到什么程序、達到什么要求，如何控制、形成什么記錄和報告，以及相應的審批手續(xù)； ?規(guī)定在質量活動中需要注意的例外或特殊情況的糾正措施； ?SOP應簡練、明確和易懂并且工作人員熟練掌握和嚴格遵守。

6.10 推薦PCR實驗室質量手冊目錄 1.質量方針和宗旨 2.工作制度

2.1 實驗室的設置、布局及組織結構 2.2 實驗室內務管理制度 2.3 實驗室的人員配置及管理制度 2.4 生物防護與安全制度 2.5 實驗室廢棄物處理制度 2.6 實驗室清潔消毒制度 2.7 儀器設備的管理制度

2.8 儀器、試劑、耗材購置程序及管理制度 2.9 臨床標本的管理制度 2.10 實驗室記錄的管理制度 2.11 質量控制工作管理制度 2.12 結果報告管理制度 2.13 崗位責任制 2.14 抱怨制度 3.操作指導書（SOP）3.1 消毒標準操作程序

3.2 超凈工作臺使用標準操作程序 3.3 超凈工作臺維護和保養(yǎng)標準操作程序 3.4 PCR儀使用標準操作程序 3.5 PCR儀維護和保養(yǎng)標準操作程序 3.6 臺式離心機使用標準操作程序 3.7 高速冷凍離心操作標準操作程序 3.8 移液器使用標準操作程序 3.9 加樣器校準標準操作程序 3.10 冰箱維護和保養(yǎng)標準操作程序 3.11 電熱恒溫水浴箱操作程序 3.12 電子天平使用和校正操作程序 3.13 可移動紫外消毒車使用操作程序 3.14 溫度計校準程序 3.15 試劑的質檢操作程序 3.16 標本唯一標識編號編制規(guī)則 3.17 臨床標本的采集及處理操作程序 3.18 臨床標本的保存程序

3.19 乙肝病毒核酸擴增熒光檢測標準操作程序 3.20 室內質量控制標準操作程序 3.21 室間質評標準操作程序 4.引用圖表

4.1 實驗室組織結構圖 4.2 實驗室工作人員一覽表 4.3 人員培訓計劃及培訓記錄表 4.4 主要儀器設備一覽表 4.5 臨床送檢標本流程圖 4.6 PCR擴增可接受標本記錄表 4.7 PCR擴增拒收標本記錄表 4.8 室內質控結果記錄表 4.9 室間質控記錄表 4.10 消耗性材料驗收記錄表 4.11 試劑驗收記錄表 4.12 故障處理表 4.13 儀器設備使用記錄表 4.14 儀器設備維護保養(yǎng)記錄表 4.15 實驗室清潔消毒記錄表 4.16 工作區(qū)溫度、濕度記錄表 4.17 抱怨記錄表

4.18 標本超低溫保存記錄表 4.19 應急處理記錄表 4.20 垃圾處理記錄表 4.21 冰箱溫度記錄表 4.22 水浴箱溫度記錄表 4.23 移動紫外消毒車記錄表 4.24 設備校正記錄表 4.25 檢測結果報告流程 4.26 報告單樣張 6.11 文件格式 一 目的 二 范圍 三 職責 四 工作流程 五 引用文件及表格

6.12 寫作技巧

?目的：WHY，為什么要開展這項活動 ?范圍：WHAT，活動涉及的方面 ?職責：WHO+WHAT，誰做，誰負責

?工作流程：列出活動順序和細節(jié)，明確各環(huán)節(jié)“輸入——轉換——輸出”，即做何事（WHAT）、何人做（WHO）、何時做（WHEN）、何地做（WHERE）、如何做（HOW）?引用文件和表格：

開展此項活動涉及的文件、標準以及使用的表格、證明文件和記錄保存期 評審中常見問題

7.1 手冊

文件不全，無系統性；質量要素描述不全；格式不對；與實際工作脫節(jié)；無現行有效性（無手簽，各區(qū)無相應手冊）；記錄不全、不規(guī)范

7.2 人員

人員檔案：每人一個檔案袋，有關資格證書（如上崗證）、培訓、技能和經歷等。培訓計劃及實施記錄：每人有年度、季度、月的培訓內容及實施記錄；內容包括外出學習、進修，內部質量手冊學習、業(yè)務學習、新項目引進等。

7.3 設施與環(huán)境

通風、紫外、清潔、消毒的程序及記錄、生物安全防護的程序及記錄、生物垃圾的處理。

7.4 儀器設備

采購程序及驗收標準；校準程序及狀態(tài)標識，使用、維護、保養(yǎng)的程序及記錄；檔案：每個與檢測質量相關的設備均應建檔，內容包括：設備的名稱；制造商名稱、型號、序號或其它唯一性標識；接收日期和啟用日期；）目前放置地點；接收時的狀態(tài)（例如全新的、經改裝的）；儀器使用說明書或其復印件；校準和/或檢測的日期和結果以及下次校準和/或檢測的日期；迄今所進行的維護和今后維護計劃的細節(jié)；損壞、故障、改裝或修理的歷史。

7.4 料（試劑、耗品）

采購程序及領用記錄，質檢標準、程序及記錄，應急程序；缺貨、試劑變質；室內質控品。

7.5 樣（品）

標本唯一編號，年月日項目順序號；標本采集標準操作程序；標本接受（拒收）標準、交接記錄；標本保存、銷毀的程序及記錄；標本處理標準操作程序

7.6（方）法

方法學的有效性——依據；SOP的合理性——生搬硬套；分區(qū)操作的協作——流程合理；質控點的安排——提取效率、擴增效率；基線的調整——CT值、本底熒光值。

7.7（檢）測

?室內質控的SOP：耗品質檢，試劑質檢，質控方法（糾錯措施），質控圖。?室間質評的SOP：糾偏措施

7.8 報告

?發(fā)放范圍：門診、病區(qū)、外單位 ?發(fā)放方式：保密、電子、郵件

?報告單的格式：唯一編號、檢測下限、實驗室申明 ?審核、標準、不合格報告的處理

7.9 抱怨

?實驗室服務、質量改進的依據

?對象：病人、醫(yī)生、工作人員。SOP應明確方式、職責、反饋、記錄。

摘自《2003年華東區(qū)臨床檢驗中心協作線臨床實驗室質量管理

及新技術應用高級研討會資料匯編》

第二篇：臨床基因擴增(PCR)診斷實驗室工作規(guī)范(試行)

附件

2臨床基因擴增（PCR）診斷實驗室工作規(guī)范（試行）

為使基因擴增診斷技術規(guī)范有效的用于臨床，保證檢測質量，更好地為臨床疾病的診療服務，特制定本規(guī)范。

1．臨床基因擴增實驗室的設置：和儀器設備

臨床PCR實驗室應分為四個隔開的工作區(qū)域，每一區(qū)域都應有專用的儀器設備。即1）試劑貯存和準備區(qū)；2）標本制備區(qū)；3）擴增反應混合物配制和擴增區(qū)和的擴增產物分析區(qū)。如使用擴增和產物檢測同時完成的熒光定量PCR方法或全自動分析儀如Cobas－T（Anplicor）等，則3）和4）兩個區(qū)可合并。

與上述特定實驗區(qū)有關的各個房間必須有明確的標記，以避免不同工作區(qū)內的設備物品如加樣器、試劑等的移出或不同的工作區(qū)間發(fā)生混淆。進入各個工作區(qū)必須遵循一嚴格的）順序，只能按單一方向進行，即從試劑貯存和準備區(qū)～標本制備區(qū)～擴增反應混合物配制和擴增區(qū)～擴增產物分析區(qū)。不同的工作區(qū)必須使用不同的工作服，可以不同的顏色來區(qū)別。此外，當工作人員離開各工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。

1．l．試劑貯存和準備區(qū)

本區(qū)用于貯存溶液的制條、溶液的分裝和主反應混合液的制各。本區(qū)儀器設備配置：（l）4 冰箱和一20 冰柜；（2）混勻器；（3）微量加樣器若干支（覆蓋1～1000pl）；（5）專用工作服和工作鞋；（6）專用辦公用品；（7）消耗品： 一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離。心管和加樣器吸頭（帶濾心）；（8）可移動紫外燈（近工作臺面）。

1．2．標本制備區(qū)

標本貯存、核酸提取及貯存均在本區(qū)內進行。RNA測定時的單鍵。cDNA合成也在本區(qū)進行。本區(qū)儀器設備自己置：（l）4冰箱、－20 或-70 冰柜三（2）高達臺式冷凍離心機；（3）混勻器；（4）水浴箱或加熱模塊；（5）微量如排器若干支（覆蓋l～1000μl）；（6）專用工作服和工作鞋；（7）專用辦公用品；（8）消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的部心管和加樣器吸頭（帶濾心）；（9）可移動紫外燈（近工作臺面）；（10）超凈工作臺；（11）超聲波水?。ㄌ幚泶蠓肿覦NA適用）。

1．3．擴增反應混合物配制和擴增區(qū)

模板材料（來自標本制備區(qū)）和主反應混合液（來自試劑貯存和準備區(qū)）的加入以及擴增反應等專門在本二．作區(qū)內近行。本區(qū)儀器設備自己置：（l）核酸擴增僅三（2）微量加樣器（覆蓋1～1000 μl）；（3）專用工作服和工作鞋；（4）專用辦公用品；（5）消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、高壓處理的部心管和加樣器吸頭（帶濾心）；（6）可移動紫外燈（近工作臺面）。

1．4.擴增產物分析區(qū)

本區(qū)面積應為6～8m。擴增嚴物的分析在本區(qū)進行。本區(qū)儀器設備配置：視檢測方法不同而定，如為PCR�ELISA，則需（l）微量加樣器若干支（覆蓋l～2s（2）酶標權、洗報機和恒溫箱;（3）專用工作服和工作鞋；（4）專用辦么，用品；（5）消耗品：～次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心）；（6）可移動紫外燈（近工作臺面）。

2．臨床基因擴增診斷實驗室質量保證

臨床基因擴增診斷實驗室質量保證涉及到整個基因擴增檢測的所有階段，即測定分析前的標本來集處理、測定中的核酸提取、擴增和產物分析以及測定后的結果報告等。

2．1．標本的采集

常用于基因擴增檢測的臨床標本包括EDTA或拘檬酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿．痰、腦普液、尿及分泌物等。采樣容器最好是密閉的一次性的，如真空系血管。一次性塑料容器使用時無需進一步預處理。當使用非密鬧采樣系統時，如尿、分泌物和骨髓的采禪，必須注意防止來自來樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣者采樣時起碼要談．一次性手套?？芍貜褪褂玫牟Ａ鳌矐邏禾幚?，因為玻璃器（常含有不易失活的ANA酶。RNA酶的主要來源是實驗人員的手。最好是熱滅菌，250 烘烤 4小時以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓標本必須進行抗凝處理。通常EDTA和拘檬酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因為肝素是Taq酶的強抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除肝素。臨床用于RNA（如HCV RNA）測定的血標本最好進行抗凝處理，并盡快（3小時以內）分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則物血后，必須在1小時內分離血清。

2．2．標本的穩(wěn)定化處

DNA分析，標本采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標本應及時送到實驗室。由于RNA易于降解，因此用于RNA測定的標本的穩(wěn)定化處理有時是必不可少的，Chaotropic物質[特別是異硫氨酸抓鹽（Guanidine thiocyanate，GITC）]可使DNAse和RNAse立即失活。在采集標本時，可將標本材料如血清或血漿加入含有GITC的試劑管中進行穩(wěn)定化處理。GITC可使RNAse不可逆失活的適合濃度為5mol/L。如果GITC濃度小于 4mol／L；RNA會很快降解。在適當的穩(wěn)定化處理后，標本一般不需要冷藏即可郵寄。如果溫度低于室溫，GITC即會結晶，所以在加入標本前應使之完全溶解。如標本不能及時送到實驗室，最好選用 GITC處理方法以穩(wěn)定標本。

2．3標本的運送

標本來集后應盡快送至實驗室，經過適當穩(wěn)定化處理的標本可在常溫下通過郵寄運送。如用于 DNA提取的含 EDTA的全血標本及用于 RNA提取的經 GITC 穩(wěn)定化處理的標本。是否冷藏取決于標本的用途，較長時間在室溫貯存會導致靈敏度大大降低。通常應采用不易破碎的容器裝載標本。用于RNA檢測的標本，如果在未經穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運送。

2．4．標本的貯存

臨床體液標本如血清／血漿等可于-70 下長時間貯存。用于DNA測定的核酸樣本應在 10mmol／L Tris，lmmol／L EDTA緩沖液（pH 7．5－8．0）中 4 保存。用于RNA測定的核酸樣本應在緩沖液中一80 C或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在一20OC即可。用 GIT（：穩(wěn)定化處理的 RNA標本在室溫可保存 7天，如貯存時間較長，則RNA測定敏感性略有下降。

2．5．標本的處理（核酸提?。?/p>

核酸提取是決定擴增檢測成敗的關鍵性步驟。通常，核酸制備質量不高是由于抑制物去除不完全所致。抑制物可能來源于標本本身（如血紅素及其前體或降解產物）或核酸提取過程中確．留的有機溶劑（如酚、氯份等），這些物質對其后的酶反應步驟具有強烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴增測定。如在 HBVDNA PCR測定中。采用對血清杯水煮沸裂解以釋放DNA的方法時，肉眼觀察不明顯的溶血也會對擴增測定有很強的抑制作用，應使用正規(guī)的核酸提取方法（如經典的酚一氯份提取方法、硅吸附法等）。當標本為疾時，則必須先進行液化處理。再提取核酸。需注意的是；液化時不能加熱，液化時間不能過長。此外，當靶核酸為 RNA時，降解是一個主要問題。RT－PCR測定失敗的常見原因是標本在運送前來經充分的穩(wěn)定化處理．及核酸提取試劑的RNase的污染。對于前者，要核查測定分析前的步驟，如果沒．現RNA降解的證據。實驗室則應拒絕接受標本，要求重新采取標本，并對運送者給以詳細的指導。對于后者，建議常規(guī)使用高質量的商品核酸提取試劑。

2．6靶核酸的逆轉錄和擴增

2．6.l靶RNA的逆轉錄

cDNA合成為RT-PCR中的第一個酶反應步驟，所產生的 cDNA為靶RNA的反向互補鏈。為后面擴增的模板。下述因素通常影響cDNA合成的效率：

l）RT活性的降低或完全缺乏。必須排除由于酶質量不高、試劑降解或加樣錯誤而引起的 cDNA合成不充分。

2）RT或熱穩(wěn)定聚合酶的抑制物（如酚、血紅素）。當RNA明顯為完整而沒有擴增時，應懷疑有此類抑制物。

3）RNA的降解。

2．6．2影響擴增的因素

有多種因素可引起PCR的假陽性或假陰性結果，如抑制劑或酶活性喪失（見上）、遲大溫度不對、晚十十濃度不佳、患者標本或試劑受污染等。反應孔中熱傳導的均一性極為重要，循環(huán)儀的溫度控制和加熱塊中熱傳導的一致性必須有常規(guī)的檢查以避免假陰性結果。

2．7污染

在實際工作中，常見有以下幾種污染類型：PCR片段的污染（產物污染）三天然基因組DNA的污染；試劑污染（貯存液或工作液）：以及交及污染（如氣溶膠從一個陽性標本擴散到原本陰性的標本）。對于所有的擴增技術，由于圍繞實驗室來尋找污染源不僅耗時而且還很繁瑣，所以防止污染重在預防。一旦發(fā)生了污染，實驗就必須停止，直到發(fā)現了污染源為止。如果沒有例外，實驗結果必須作廢，即使平行的污染質控中僅有一管顯示出有PCR片段污染。

2．7．l．測定分析前的污染源。

測定分析前實驗材料的污染主要來自非病人標本來源的核酸。

2．7．2．測定分析階段的污染源。

通常，測定分析階段的每一步都可能發(fā)生對樣本的污染。反應混合液的任何成分及核酸的制備和反應建立階段所涉及到的實驗設備的任何部位都是可能的污染源。如受污染的試劑（例如今血清白蛋白，明腋成礦物油）；商品酶制劑；消耗品（如反應管，吸頭）和實驗設備（如加樣器、離心機）。污染的來源之一是許多樣本在同時制備時的交及污染，但最主要的污染來源為以前擴增產生的特異產物DNA片段。在前面三個工作區(qū)中，不當的實驗操作

會引起所使用的試劑、消耗品或實驗設備的污染。而在產物分析區(qū)，當吸取PCR產物用于檢測時，非常容易引起污染，因此必須制定并嚴格執(zhí)行標準操作程序。

2．7．3．污染的避免。

要避免污染，首先應是預防而不是排除污染，前面所述工作區(qū)的嚴格劃分的目的正是為了預防污染。為避免以前測定中所產生的擴增產物的污染，可設法將其破壞掉。如在擴增反應中用dUTP取代部分dTTP：從而產生的特異擴增片段含有尿嘧啶，這樣擴增前在反應混合液中加入尿嘧啶糖激酶（UNG），可破壞來自以前測定的擴增產物，從而避免其對將要進行的擴增測定的污染。另外一種方法是持續(xù)的長波紫外燈照射，通過異補骨脂素光化；單產生DNA加合物，由于DNA加合物對擴增沒有反應但又不妨礙PCR后雜交過程，所以這些方法也能防止污染。由于上面提到的方法會給人一種假的安全感，所以不能以其來替代嚴格的實驗室設置和管理，尤其是這些方法不能防止外來非擴增的天然 DNA的污染。

2．7．4．去除污染的措施。

工作完后必須定期采取有效的去污染措施，結合各種不同的方法可達到最佳效果。去污染措施包括但不僅限下面幾種：用100ml／L次氨酸鈉清潔表面；試驗了后長時間的紫外照射實驗操作臺和其他表面；實驗設備如加樣器的高壓消毒。

2．8．擴增產物的分析

擴增產物的測定有各種方法。如電泳、限制性酶切、斑點印跡、雜交、測序、分光光度法定量等。但臨床PCR測定項目基本上都使用探針雜交方法。

2．8．l．與雜交檢測有關的干擾。

雜交結果不充分的原因可能是基因探針不合適、標記方法不對、對探針的標記不夠、雜交或洗滌方法不合適。最常使用的基因探針有：DNA片段、合成的尊核普酸和體外的轉錄本（反義 RNA探針）。探針的標記物常用的有生物素、地高辛、熒光景和同位素等。在擴增后的雜交檢測中，應該嚴格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交條件。溫度太低或離子強度太高都會降低雜交的嚴格性。還會給檢測信號的特異性帶來負面影響。相反，提高潤度和／或降低離子強度會增加雜交的嚴格性。因此，嚴密控制溫度和試劑是避免假陽性和假陰性結果的先決條件，要注意的是，溫度和離子強度不能同時改變。

2．9．質量控制

如上所述，應該開展各種質控來評價測定分析當中各步驟的質量，如RNA的完整性、對擴增是否合適和敏感。

2．9．1．室內質量控制

必須對DNA和RNA分析的各步進行質量控制，以避免假陽性和假陰性，保證測定結果的準確性。由于PCR測定的高敏感性，所以試劑的生產、實驗材料的準備、PCR本身和實驗中的每一步都要求有質控。擴增反應前后的酶反應各步也應有質控，只不過在質控細節(jié)上稍有不同。

2．9．1．1．與實驗材料的準備有關的質控。

對DNA提取試劑的效果最常用球脂糖凝膠電冰來檢測?？芍崛〉腄NA是否發(fā)生降解。用常規(guī)的手工提取方法制備的DNA的平均長度一般為～100kb，用適合PCR的DNA

提取試劑盒制備的DNA的長度平均范圍為30�40kb。然而；明顯出現降解的DNA（在1和10kb的低分子量范圍內）在經瓊脂糖凝膠電冰分離和用溴化乙錠染色后也可見有強的熒光信號。用對甲基化不敏感的限制性內切酶（如EcoRI）消化DNA，然后電泳分離，能夠對酶活性的抑制劑進行質控（在抑制劑存在的情況下，高分子量的片段不被酶切）。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測定來估計，好的 DNA提取物，A260/A280 比值應該在 1． 75--2．0之間；否則，污染（殘留的蛋白或酚）可能會很高。僅用光度計比色方法不能對DNA的完整性下結論。

最快的對總RNA提取質量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電冰，這一點跟DNA分離相同，然而，如果對結果產生懷疑，就應該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。在理想情況下，三種主要的核糖體RNA(28S、18s和 5S）在凝膠上出現的帶相對較窄。如發(fā)生RNA的降解。則帶被拖向低分子量或出現帶的缺失。測定核糖體RNA帶的密度指數可作為對RNA制備的質量評價的實驗室內的標準；對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評估也是RNA完整性的合適的指標。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些原因，單獨的光電比色不能對RNA的完整性下結論。

2．9．1．2．對cDNA合成和擴增的質控。

本部分包括陽性質控和陰性質控。

2．．9．l．2．l．cDNA的合成。

對CDNA合成的效率進行監(jiān)控的關鍵性的質控是使用一個內反應質控。cDNA的合成可以從存在子每一個RNA提取物中的cRNA 轉錄本開始(即普遍表達的mRNA，如核糖體蛋白轉錄本這一類的所謂的管家基因），也可從在制備時加入樣本中的作為內標準的 RNA開始。cDNA合成的內質控是能夠產生確定產物的陽性質控；如果擴增不成功，質控就顯示出有RNA的降解、cDNA合成的過程中錯誤啟動或酶活性喪失。

加入確定量的擴增質控物可以檢測RT�PCR的靈敏度。對于RT－PCR方法 所必須的污染質控為無逆轉錄靶RNA的陰性質控。

2．9．1．2．2．PCR反應。

內反應質控是陽性質控?？墒褂脤τ袡C體存活所必須的靶基因作質按，這些基因至少以豐臺子狀態(tài)存在，因為如果基因組缺失這些基因，將使有機體致死（所謂的致死因子），一個比較好的例子就是維生素D血漿結合蛋白的基因；在世界范圍內的許多種族已發(fā)現其廣泛的多態(tài)性，并且還沒有發(fā)現基因活性的同源性丟失，因此，通過PCR共同擴增這種基因的一個片段，在所有患者中均可獲得成功，并且也會證明擴增反應是成功的。

在測定血清／血漿病原體核酸如HBV DNA、HCV RNA等時，應使用已知的弱陽性血清／血漿作為質控樣本，與持測臨床標本等同處理提取核酸及擴增，以判斷擴增檢測的有效性。

使用這些外加弱陽性質控不但可檢測擴增反應液的質量，還可獲得有關PCR檢測下限和特異性的信息。這些質控必須使用與診斷實驗（即患者的標本）所使用的相同的主反應混合液。如果懷疑方法的檢測下限不足以檢測出產物時，則每一個反應管都必須加擴增質控。

外加陰性質控（污染質控）在每一個PCR實驗中都必須設有，應該包括幾種陰性質控。通常，這些質控是民來指明PCR過程中污染出現的階段。包括在樣品制備的整個過程中所帶的空白反應管、含有樣品制備時所用的所有反應液但不含可擴增的模板（所謂的模擬制備）的反應管等。模擬質援可以評估PCR實驗的綜合質量。

此外，為對吸樣過程進行質控，可以水質控樣本來代替核酸樣本加入至反應管，反應管中含所有的反應成分。實際工作中僅通過水樣本來檢測污染是否存在的方法是不可取的，因為它不能發(fā)現樣本處理過程中的污染源，水僅可作為擴增試劑的質控。

在擴增靶RNA的PCR實驗中，應做省略逆轉錄的污染質控，通過這種方法，可發(fā)現以前擴增的DNA片段所引起的污染。

2．9．l．3．對測定結果評價的質控．

2．9．1．3．1．板上來交和膜上斑點印跡雜交的質控。

在板上雜交和斑點雜交時，陽性和陰性質控應該在同一板或膜上與病人標本平行進行分析，這可排除不同反應中使用了不同雜交條件而造成的對結果的錯誤解釋。

2． 9． 2．室間質量評價能力驗證，proficiency testing）

所有開展臨床基因擴增檢測的實驗室都應參加由衛(wèi)生部臨床控驗中心組織的全國臨床基因擴增項目的空間質量評價，并作為開展臨床基因擴增診斷的依據之一。

本工作規(guī)范自公布之日起實施。

衛(wèi)生部醫(yī)政司

第三篇：臨床基因擴增實驗室設計

臨床基因擴增（PCR）實驗室設計探討

核心提示:摘要：介紹了什么叫做基因擴增實驗室以及基因擴增實驗室是如何保證實驗結果的安全性和可靠性的。并從平面布置、通風空調系統設計、污染的預防與控制幾個方面探討了基因擴增實驗室設計的主要特點和應注意的問題。關鍵詞：基因擴增 基因擴增實驗室 1 概述 臨

摘要：介紹了什么叫做基因擴增實驗室以及基因擴增實驗室是如何保證實驗結果的安全性和可靠性的。并從平面布置、通風空調系統設計、污染的預防與控制幾個方面探討了基因擴增實驗室設計的主要特點和應注意的問題。

關鍵詞：基因擴增 基因擴增實驗室概述

臨床基因擴增實驗又稱PCR實驗，是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段。它可以通過將病毒體內所含的基因進行擴增的方法，測出一些病毒含量不高的感染者體內是否含有特定的病毒。由于該檢測方法可以測出普通檢驗難以檢測出的病毒并具有靈敏度高、特異性高、快捷、對樣品要求低等優(yōu)點，因此被臨床醫(yī)生廣為認可，已廣泛應用于醫(yī)院的臨床診斷和各防疫檢測部門的禽疫病診斷。但是，這種實驗需要有能保證絕對安全、配置合理的實驗室和非常規(guī)范的操作為前提。近年來對臨床基因擴增檢驗實驗室的建設越來越得到重視，因為它對檢測結果的可靠性、準確性和安全性起到至關重要的作用。本文主要從臨床基因擴增檢驗實驗室的平面布局，空調通風系統設計、氣流控制和污染的防制幾個方面對實驗室設計中的主要特點進行了闡述。

臨床基因擴增檢驗實驗室設計的核心問題是如何避免污染。因此，實驗室的平面布局、空調通風系統設計、氣流控制等都是圍繞這個核心問題進行的。下面就對這幾個方面分別進說明。PCR實驗室平面布局

臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增反應混合物配制和擴增區(qū)、擴增產物分析區(qū)。為避免交叉污染，進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增反應混合物配制和擴增區(qū)→擴增產物分析區(qū)。

各實驗區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應通過傳遞窗進行。

PCR實驗室平面布置示意圖如圖1所示。

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圖1 PCR實驗室平面布置示意圖實驗室空調通風系統設計及壓力控制

PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求，但是為避免各個實驗區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴格控制送、排風的比例以保證各實驗區(qū)的壓力要求。

3.1 試劑貯存和準備區(qū)

該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于標本制作的材料應直接運送至該區(qū)，不得經過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內，并在本區(qū)內制備成所需的貯存試劑。

對與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴格的要求。

3.2 標本制備區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。

本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應避免在本區(qū)內不必要的走動。

3.3 擴增反應混合物配制和擴增區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應混合液等也可在本區(qū)內進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內進行。

本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區(qū)內的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內進行。

3.4 擴增產物分析區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設。

本區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免擴增產物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。污染的預防與控制

PCR實驗室設計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴增產物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實驗就必須停止，直到找到污染源為止，而且實驗結果必須作廢，需重新進行實驗。所以發(fā)生污染后再圍繞實驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費人力物力。因此要避免污染，首先應是預防，而不是排除。

4.1 工作區(qū)域的嚴格劃分

（1）各個實驗區(qū)域設置合理；

（2）各個實驗區(qū)域要有明顯的標記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個不同實驗區(qū)域設備物品、試劑等發(fā)生混淆。

4.2 合理的系統設置

（1）合理的空調通風系統設置，盡量采用全送全排的空調系統；

（2）嚴格的氣流壓力控制，保證不同的實驗區(qū)內不同的壓力要求。

4.3 規(guī)范的操作

（1）臨床基因擴增檢驗實驗室的技術人員必須進行上崗培訓，經培訓合格后才能從事臨床基因擴增檢驗的工作；

（2）在實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施；

（3）清潔工作及時、正確。實驗工作結束后，必須立即對本區(qū)進行清潔。除常規(guī)的消毒液體對表面進行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對一些實驗設備還應進行高壓消毒處理。

4.4 嚴格的管理

（1）嚴格控制進出實驗室的人員。與實驗無關的人員不得隨意進出實驗室，有條件的情況下要設置獨立的通道和進出整個實驗區(qū)的門；

（2）在各個實驗區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標志的工作服（如不同顏色），當工作人員離開時不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域；

（3）盡量減少在實驗區(qū)內不必要的走動以減少交叉污染的可能性。

（4）擴增產物分析區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應經消毒液浸泡消毒后統一處理，如焚燒等；

（5）擴增產物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物質，應特別注意實驗人員的安全防護。

4.5 完備的實驗室配套設施

完備的實驗室配套設施是保證實驗工作的必要條件，應根據各個實驗室實驗內容的不同

配備相應的設備和儀器，如超凈工作臺、離心機、加樣器等。

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第四篇：臨床基因擴增檢驗實驗室規(guī)章制度

臨床基因擴增檢驗實驗室規(guī)章制度

一、臨床基因擴增檢驗實驗室的規(guī)范化設置及其管理

臨床基因擴增檢驗實驗室四個隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設備。各區(qū)域都必須有明確的標記，以避免設備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內移出從而造成不同的工作區(qū)域間設備物品發(fā)生混淆。進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增反應混合物配制和擴增區(qū)(簡稱擴增區(qū))至產物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。在不同的工作區(qū)域應使用不同顏色或有明顯區(qū)別標志的工作服，以便于鑒別。此外，當工作者離開工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。

清潔方法不當也是污染發(fā)生的一個主要原因，因此實驗室的清潔應按試劑貯存和準備區(qū)至擴增產物分析區(qū)的方向進行。不同的實驗區(qū)域應有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

(一)試劑貯存和準備區(qū)

下述操作在該區(qū)進行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。

(二)標本制備區(qū)

在該區(qū)進行下述操作：臨床標本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。

(三)擴增區(qū)

下述工作在本區(qū)內進行：DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應混合液等也可在本區(qū)內進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內進行。

不能從本區(qū)再進入任何“上游”區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。

(四)擴增產物分析區(qū)

下述操作在本區(qū)內進行：擴增片段的測定

二、臨床基因擴增檢驗實驗室質量保證

臨床基因擴增檢驗實驗室質量保證涉及到整個基因擴增檢驗的所有階段，即測定分析前的標本采集處理、測定中的核酸提取、擴增和產物分析以及測定后的結果報告等。

第五篇：臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收報告

(一)實驗室所屬法人單位名稱:

地址:

郵編:

法定代表人:實驗室負責人:聯系人:email:

電話:傳真:

(二)接受現場技術驗收的實驗室代表姓名及職務:

二.驗收依據:衛(wèi)生部下發(fā)文《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》和《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范》

三.驗收時間:

四.驗收評審地點:

五.技術驗收結論:

合格,建議授予驗收合格證書;

基本合格,尚存在部份缺陷,缺陷為項,限期改進,改進后授予驗收合格證書;

不合格,停止驗收,實驗室改進后需重新申請.(一)驗收中發(fā)現的問題及意見:

附件1:臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收表;

附件2:臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收意見匯總表;

附件3:整改要求.(二)需要說明的其它問題:□如果有的話見附件4;□無.(三)驗收評審員姓名及簽名:

主評審員姓名:簽名:

評審員姓名:簽名:

簽名:

簽名:

協調員姓名:簽名:

簽字時間:

(四)簽字地點:

驗收評審組意見:

附件1臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收表

序號

驗收內容

驗收意見

符合基但本有

符缺

合陷

不符合缺此項

暫不需考核

評論與說明

實驗室設置和設備

1.1

實驗室的規(guī)范化分區(qū):原則上應分為四個區(qū),但如使用全自動擴增檢測儀,區(qū)域可適當合并

1.2

各工作區(qū)的明確標記

1.3

實驗室應配備開展臨床基因擴增檢測所需的所有儀器設備(包括質控物).保證《臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》和《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范》的有關要求得到滿足.1.4

試劑貯存和準備區(qū)

冰箱;

混勻器;

微量加樣器;

可移動紫外燈;

專用工作服和工作鞋;

消耗品(帶濾心吸頭,一次性手套等);

專用實驗記錄本,記號筆等.1.5

標本制備區(qū)

(a)冰箱(2~8℃和-20℃或-80℃);

高速臺式冷凍離心機

(c)水浴箱和/或加熱模塊

(d)超凈工作臺或防污染罩

混勻器;

注:請在驗收所選項打“

臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收表

序號

驗收內容

驗收意見

符合基但本有

符缺

合陷

不符合缺此項

暫不需考核

評論與說明

微量加樣器;

可移動紫外燈;

專用工作服和工作鞋;

消耗品(帶濾心吸頭,一次性手套等);

專用實驗記錄本,記號筆等.1.6

擴增區(qū)

(a)核酸擴增儀;

微量加樣器;

可移動紫外燈;

專用工作服和工作鞋;

消耗品(帶濾心吸頭,一次性手套等);

專用實驗記錄本,記號筆等.1.7

擴增產物分析區(qū)

微量加樣器;

可移動紫外燈;

專用工作服和工作鞋;

消耗品(帶濾心吸頭,一次性手套等);

專用實驗記錄本,記號筆等.2.設施和環(huán)境

2.1

實驗室的設施,工作區(qū)域,能源,照明,采暖,通風等

應便于檢測工作的正常進行.2.2

實驗室應配備溫度濕度計,穩(wěn)壓電源等.2.3

進入和使用實驗室各區(qū)域應有明確的限制和控制.注:請在驗收所選項打”“.臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收表

序號

驗收內容

驗收意見

符合基但本有

符缺

合陷

不符合缺此項

暫不需考核

評論與說明

2.4

應有實驗室”內務管理"(如人員流動,清潔等)制度;

2.5

實驗室應有關化學試劑管理,廢棄血清處理,生物防護等的措施

3.人員

3.1

實驗室應配備足夠數量的人員;這些人員必須經過培訓,并取得上崗證.3.2

實驗室應有培訓計劃和措施,保證其技術人員得到及時培訓.3.3

實驗室應保存其技術人員有關資格證書(如上崗證),培訓,技能和經歷,發(fā)表論文,科研成果等技術業(yè)績檔案.4.設備管理和質控物

4.1

所有設備應有維護程序文件;

*

如