第一篇：霉菌毒素總結

霉菌毒素

蘇圣華

霉菌毒素是毒性很強的霉菌次生代謝產物，這些霉菌主要屬于曲菌屬，青霉菌屬以及鐮孢菌屬（Fusarium，Aspergillus，Penicillium及Alternaria species）。據估計，至少有300 種這類真菌代謝物對人類和動物具有潛在毒性，但是為大眾熟知并被廣泛研究的只有黃曲霉毒素B1（AFB1），玉米赤霉烯酮（ZON），嘔吐毒素(DON)，T-2 毒素，赭曲霉毒素(OTA)以及伏馬毒素/煙曲霉毒素(FUM)。全球范圍內動物飼料、飼料原料和人類食品中都廣泛存在霉菌毒素，根據世界糧農組織的調查，世界上每年有25%的糧食受到已確認的霉菌毒素的污染。這些霉菌毒素可以通過被污染的谷物、飼料和由這些飼料喂養的動物所提供的動物性食品（奶、肉、蛋）進入我們的食物鏈。

一、黃曲霉毒素 1．黃曲霉毒素特點

黃曲霉毒素(Aflatoxin 簡稱AFT)是一類結構相似的衍生物的總稱。目前已發現的AFT 及其衍生物有20 多種,除了AFT B1、B2、G1、G2 是天然產生的毒素外,其余的都為它們的衍生物。在上述4 種天然毒素中,以B1 的毒性最強,在食品和動物飼料的AFT 檢測中,一般以B1 作為主要檢測指標。

黃曲霉毒素主要是在倉儲過程中感染感染產生的。黃曲霉生長繁殖需要一定溫度和濕度條件，溫度25 ℃ ~30 ℃、相對濕度80%~90% 是黃曲霉最適生長條件。一般南方地區黃曲霉發生率要高于北方，因南方氣溫和濕度更適于黃曲霉生長繁殖，特別在梅雨季節；因玉米、麥類、稻谷等谷物水分含量為17%~18% 時是黃曲霉生長繁殖最適條件。黃曲霉毒素耐熱，只有通過長時間高溫（100—120℃）作用，如高壓消毒和灼燒才能使其大部分失活；對強酸和強堿較敏感。在提煉油時，用氫氧化鈉萃取游離脂肪酸的工藝可以進一步破壞毒素的活性。

黃曲霉毒素以肝臟含量最高,腎、脾、腎上腺亦可檢出,有極微量存在于血液中,肌肉中一般不能檢出。AFT如不連續攝入,一般不在體內蓄積,一次攝入后約經一周即可經呼吸或由尿糞等將大部分排出。AFB1 在沒有經過代謝活化之前的母體化合物是無致癌性的，因此AFB1 被稱為前致癌物，因為它必須通過體內的生物轉化即“代謝激活或生物激活” 形成活性中間體才具有致癌性。

2、黃曲霉毒素脫毒

AFT 污染糧食的防治原則是以防為主,污染嚴重的糧食和飼料應該廢棄,對于輕度污染的糧食和飼料,則必須認真地進行脫毒處理。霉菌毒素的脫毒可有物理、化學以及生物降解等方法。2.1 化學方法

氨化法

此法是利用塑料薄膜密封被霉菌污染的飼料,然后加氨封閉一定時間,氨與AFTB1 結合后發生脫羥作用,致使AFTB1的內酯環發生裂解,達到去毒效果。一般來說,，對于含毒量在0.2 mg/ kg 以下的飼料采用0.2 %～0.4 %的氨劑量,含毒量在0.2 ～0.5mg/ kg 含毒量的飼料采用0.5 %～0.7 %氨劑量,含毒量0.6 mg/ kg 以上的飼料常用0.7 %～1.0 %的氨劑量,如果密閉時間延長,劑量可相應降低。氨化作用對黃曲霉毒素的降解作用比較顯著，但這種方法對其他霉菌毒素的作用效果較差，同時可能因氨在飼料中的殘留而影響動物的健康。另外，堿煉法也對其脫毒有效果，但用于飼料脫毒不夠方便。2.2 機械脫毒

機械脫毒是指用人工或機械的方法，將谷物和飼料中的發霉顆粒剔除，或通過機械的碾軋除去毒素含量較高的外皮而降低毒素的含量。機械脫毒主要利用霉菌毒素在谷物和飼料中的分布特點而進行，所以該方法能在一定程度上除掉因蟲鼠害、破損等霉粒。但由于該方法費時費力，而且效力很低，在現代化大規模飼料生產中很少應用。

2.3 物理脫毒

物理脫毒法主要有吸附法、水洗法、剔除法、脫胚去毒法、溶劑提取法、加熱去毒法、輻射法等。物理方法主要是通過在飼料或谷物中添加各種吸附劑，降低霉菌毒素在胃腸道的吸收，即在飼料中添加可以吸附霉菌毒素的物質，使毒素在經過動物腸道時不被動物所吸收，直接排出動物體外。在這其中吸附法是現代飼料中霉菌毒素脫毒最為有效的方法。

2.3.1 活性炭

對毒素有一定的吸附作用，但沒有選擇性，對某些營養元素及藥物也有吸附作用，因此臨床效果不佳。

2.3.2 鋁硅酸鹽類

天然鋁硅酸鹽,如沸石、蒙脫石、硅藻土、高嶺土等,天然鋁硅酸鹽礦物吸附力小,效率低,占飼料容量大,對營養物質有一定吸附,因而直接用于飼料效果不好。對天然的鋁硅酸鹽進行改性后可以改善它對霉菌毒素的選擇性吸附能力。鋁硅酸鹽類吸附劑對黃曲霉毒素有良好的吸附能力,并且有不少體內(喂養)試驗結果證實了這類吸附劑的實際效,但它們存在對玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、單端孢菌素等毒素吸附能力不足的問題。不過通過適當的改性有可能使它具有更廣泛的吸附能力。這類吸附劑的另一個缺點是,它們表現出了對維生素及礦物鹽的非選擇性吸附能力。2.3.3 酵母細胞壁提取物

從酵母培養物細胞壁中提取的甘露糖（MOS）,這類新型抗原活性物質,在調整動物腸道微生態區系,在對抗有害微生物的過程中發揮重要作用。MOS 對AFT 的總結合率可達100 % ,具有添加量少,作用顯著以及結合的霉菌毒素種類范圍廣等特點。

酯化的葡甘露聚糖（EGM）是一種新型的霉菌毒素吸附劑，是從酵母細胞中提取出的功能性碳水化合物。EGM有很大的表面區域，1 kg的EGM有相當于2.2萬 m2的表面區域。其表面富含不同孔徑的孔穴，用以大面積地撲捉不同種類的霉菌毒素。而且酯化葡配甘露聚糖與霉菌毒素結合后，霉菌毒素不易被解離。所以，酯化葡配甘露聚糖對多種霉菌毒素具有較強的吸附作用，而且對飼料中其他營養成分無顯著的負作用，同時還可能對動物的其他生理功能有著積極的作用，是一種廣譜的，具有很大潛力的霉菌毒素吸附劑。

除上述方法，還有在飼料中添加營養元素，如蛋白質、氨基酸以及硒可提高肝臟的解毒能力，以轉化毒素；酶制劑高效地催化、降解AFT 為無毒物質。

二、玉米赤霉烯酮

1、玉米赤霉烯酮基本特性

一種鐮孢菌毒素,該毒素主要來源于玉米，濕度22%-25%為其產生適宜條件。熔點161 ℃～163 ℃,不溶于水,溶于堿性溶液、乙醚、苯及甲醇、乙醇等。

ZEN 可由胃腸道持續吸收, 肝腸循環可使ZEN在胃腸道滯留時間延長, ZEN主要隨糞便排出, 少量ZEN 可由乳汁排泄。豬攝入Z E A 后，其劑量的67% 在48h內被排出，尿中含45%，糞中含22%。ZEN 在動物體內主要有兩條代謝途徑，一個是經3α和3β羥基類固醇脫氫酶催化形成α和β-玉米赤霉烯醇(Zearaleno l, ZEL)；另一個途徑是與葡萄糖醛酸結合。研究表明，ZEN 在不同動物肝臟轉化的主要代謝物不同，豬主要轉化為α-玉米赤霉烯醇，而奶牛主要代謝為β-玉米赤霉烯醇。α-玉米赤霉烯醇對大鼠的雌激素活性大約比ZEN 高400%，α-玉米赤霉烯醇對豬子宮內膜的雌激素受體具有較高的親和力，通過和雌激素競爭目標組織細胞上的受體發揮作用。

2、玉米赤霉烯酮的脫毒

對于玉米赤霉烯酮等霉菌毒素的解脫毒研究主要集中在吸附法和生物降解法上。2.1 物理脫毒法

研究結果表明，消除ZEN 污染最實際、有效的方法是在飼料中添加霉菌毒素吸附劑，在腸道內選擇性地吸附ZEN，使其經過消化道排出體外。研究較多的吸附劑主要有硅鋁酸鹽類和甘露聚糖。其中以硅鋁酸鹽類吸附劑研究應用最為廣泛。

未經修飾的硅鋁酸鹽類對ZEN的吸附能力不佳，經十六烷基吡啶鎓或十六烷基三甲基銨溴化物等對硅鋁酸鹽類吸附劑進行化學改性，以增強硅鋁酸鹽表面的疏水性，從而增加對ZEN的吸附能力。

消膽胺具有顯著降低ZEN 腸吸收的作用，尤其是2% 組使ZEN的小腸吸收率由32% 顯著降低到16%。經試驗證實，消膽胺可以作為一種飼料添加劑防止母豬的雌激素過多癥。

研究表明,通過酶解的方法從酵母的細胞壁提取出的葡甘露聚糖可以結合飼料、谷物中大部分的ZEN。胞壁上的β葡聚糖等多糖是細胞壁吸附的主體,疏水作用在其中起著重要作用。熱處理或酸處理時,細胞壁多聚糖和肽聚糖的糖苷鍵或者肽鍵斷裂,使肽聚糖結構變薄而孔徑增大,菌體對真菌毒素的吸附能力增加。試驗結果表明，酵母細胞壁可以吸附ZEN 2.7 mg/kg，并且這種吸附平衡可以在10 min 內達到。甘露聚糖由酵母細胞內壁提取而得，對ZEN 有一定的吸附作用。Swamy 等進行的體內試驗結果表明，甘露聚糖可使豬避免ZEN 造成的生產性能下降。

2.2生物降解

應用微生物生成的特殊酶來分解或使ZEN 變性。此類脫毒法條件溫和，可將毒素徹底分解而不會有毒性物質殘留，只針對ZEN 起作用而不會破壞飼料和原料中的其他成分。

三、單端孢霉烯族毒素

1、單端孢霉烯族毒素含有特征性的12，13-環氧-單端孢霉-9-烯環結構，根據它們的化學結構的不同，分成4 種類型：目前已經鑒定了超過200 種單端孢霉烯族毒素，但是主要污染食品和飼料的單端孢霉烯族毒素是A（T-2 毒素、HT-2 毒素）、B（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、雪腐鐮刀菌烯醇（NIV））型單端孢霉烯族毒素。

潮濕、溫和多雨的氣候有利于DON生長。有研究認為9天以上的陰雨天和21℃的平均氣溫為其生長最適條件。

2、單端孢霉烯族毒素的脫毒

對于DON、T-2等單端孢霉烯族毒素的脫毒研究，物理處理的效果常常不太理想，并且往往會改變營養成分。雖然許多化學處理能顯著降低單端孢霉烯族毒素的濃度，但可能會降低食物和飼料中的營養價值，也有可能殘留有害物質，這些副作用限制了它們的應用。目前，能有效轉化單端孢霉烯族毒素的微生物不多，它們主要來源于動物腸道、土壤、植物等自然環境中。生物方法通過脫環氧化、羰基化、羥基化、水解及葡萄糖苷酸化等反應，在溫和的條件下，將單端孢霉烯 族毒素轉化成低毒或無毒產物。

2.1 牛瘤胃液中分離得到菌株BBSH 797，主要的作用是在體內和體外將DON 轉化成DOM-1。后來證明，菌株BBSH797 也能轉化A 型單端孢霉烯族毒素，脫環氧作用，例如將SCP 轉化成脫環氧SCP，或者脫乙酰作用，將T-2 毒素轉化成HT-2 毒素。后者毒性均明顯小于前者。

2.2 從雞腸道消化物中分離純化和鑒定了細菌菌株LS100（IDAC180507-1）和SS3，檢驗了它們對12 種單端孢霉烯族毒素的轉化能力。轉化的類型與它們的分子結構有關。對無乙酰化的單端孢霉烯族毒素例如DON、NIV 和疣孢霉素，脫環氧代謝物是主要的的轉化產物。但是，單乙酰單端孢霉烯族毒素3-ADON，15-ADON 和鐮刀菌烯酮X 主要轉化成脫乙酰產物。二乙酰單端孢霉烯族毒DAS 和NEO僅表現出脫乙酰作用。T-2 毒素也僅有脫乙酰作用，而HT-2 毒素和T-2 三醇普遍的反應是脫環氧作用。大鼠腸道微生物將T-2 毒素轉化成脫環氧產物，脫環氧HT-2，脫環氧T-2 三醇，進一步轉化成T-2 四醇和SCP。

除此以外，單端孢霉烯族毒素是谷類農作物中比較常見的真菌毒素，它們具有很強的物理化學穩定性，但是它們在自然環境中并沒有蓄積，這表明自然環境中可能存在著DON 生物轉化降解作用。土壤、水體等自然環境被作為篩選單端孢霉烯族毒素轉化微生物的來源。植物病原物微生物也可通過脫環氧化以及脫乙酰化來降解毒素。

四、赭曲霉毒素

第二篇：食品毒素

臺灣塑化劑事件

鑒于臺灣有毒起云劑生產鏈已存在多年。有專家建議，大陸相關部門也應對相關食品進行排查，并對消費者的血液進行抽查調查，以確認危害性及危害范圍

《國際先驅導報》記者傅雙琪、張勇 特約撰稿鄭雯發自臺北短短一周內，一種化工業用劑“塑化劑”突然闖入臺灣食品業界，并打翻了全臺的飲料、保健品市場。

截止本報記者6月1日發稿時，臺灣已被發現受塑化劑污染的產品超過500項，其中更有“統一”、“白蘭氏”等知名品牌。“這是我30年來看過的最嚴重食品摻毒事件。”臺灣大學食品研究所教授孫璐西說。

意外發現揭露“冰山一角”

最早發現“毒素”的，是一位在食品藥物管理局服務近26年的楊姓檢驗員。她現年52歲，是兩個孩子的母親。今年3月中旬，在抽驗益生菌是否違法摻雜減肥西藥時，她意外發現檢驗儀器出現異常訊號。用臺衛生署相關官員的話說，“她本來可以裝作沒看見”，但出于對食品安全的格外關注，這位檢驗員認真比對數據后，終于如抽絲剝繭般，赫然發現了不應出現在食品當中的塑化劑。這才使臺灣衛生部門順藤摸瓜查出這起“有毒食品案”。

5月23日，臺衛生部門通報，發現臺灣最大的食品添加劑供應商昱伸香料有限公司在食品添加劑“起云劑”中非法添加可致癌的塑化劑“鄰苯二甲酸二酯”(DEHP)。另一家起云劑供應商賓漢香料化學公司也被曝光非法添加另一種塑化劑“鄰苯二甲酸二異壬酯”(DINP)。目前，受這兩家供應商波及的企業達200多家。

按照臺灣法規，“起云劑”為合法食品添加物，通常是由阿拉伯膠、乳化劑、棕櫚油及多種食品添加物混合制成，可幫助食品乳化。而不法商販用化工原料塑化劑替代了起云劑中的棕櫚油，以降低成本，提高效果。據孫璐西介紹，DEHP和DINP是普遍用于塑料材料的塑化劑，會危害男性生殖能力，促使女性性早熟。其中，DEHP的毒性比三聚氰胺高20倍。

隨著相關部門的調查進展，有毒塑化劑的波及面之大，令島內外震驚。

繼運動飲料、果汁、益生菌粉驗出塑化劑后，連蜆錠、山藥薏仁谷粉、嬰幼兒營養補給品也相繼“淪陷”，塑化劑似乎無所不加。由于起云劑本身的功能可使食品油水變得黏稠，看起來更原汁原味，所以現階段只要是看起來混濁、呈霧狀食品，比如臺民眾鐘愛的珍珠奶茶等食品的錠狀劑都被合理懷疑添加了有毒的起云劑。

在對昱伸公司的調查中，臺方更發現其下游廠商“金果王公司”向臺北著名的士林夜市約50多家冰品、冷飲攤商供貨。至此，享譽海內外的臺北夜市美食，也未能幸免于難。

“我執教生物化學將近30年，自認是此行業專家。我敢保證民眾目前看到的、聽到的，只是冰山之一角，說不定只是冰山之十分之一角。大家還是回家乖乖吃媽媽煮的東西吧。”臺灣清華大學分子醫院研究所教授李寬容如是說。

第三篇：霉菌的基因工程技術

霉菌的基因工程技術

課程：食品生物技術 專業： 班級： 學號： 姓名：

完成時間：2011 年5月26日

霉菌的基因工程技術

摘要：霉菌在自然界中分布廣泛，與人們的日常生活極為密切。自從弗萊明發現青霉素以來，國內外對霉菌的研究引起眾多學者的關注，本文對目前霉菌的應用現狀作一綜述，并介紹了利用基因工程改良霉菌菌種常用的幾種方法。

關鍵詞：霉菌 基因工程 菌種改良 應用

0前言

霉菌是能引起物種霉變的絲狀真菌的統稱，是真菌的一部分。凡是生長在培養基上呈絨毛狀、蜘蛛網狀或絮狀菌絲體的菌落，都稱之為霉菌。霉菌在自然界中分布非常廣泛，與人們的日常生活極為密切，用途很多，如用于傳統的釀酒、制醬和制作副食品及其他的發酵食品，并可從中提取藥物、色素等。總之霉菌在農業、紡織、食品、醫藥、皮革及促進自然界的物質循環等方面都起著極為重要的作用。當然它對人類也有有害的方面，如可使人、畜、農作物患病，使食品、紡織品霉變等。1霉菌的應用 1.1抗生素

抗生素是微生物在代謝過程中產生的能選擇性地抑制其它種微生物生長和活動，甚至殺滅它種微生物的生物活性物質。隨著青霉素的發現和由此研制而成的多種抗生素使人類得以治愈傳染病、有效地控制傳染病的流行。除了青霉素，還有許多抗生素來源于霉菌，例如灰黃霉素、頭孢霉素等。1.2 生物農藥

自然界中有很多生物合成的天然物質具有農藥功能，提取其有效成分加工為農藥應用,這是制取生物農藥的主要途徑。目前包括我國在內的許多國家還大量應用化學農藥，已普遍導致了對環境的污染，致使農產品安全衛生問題嚴重，品種下降，并頻繁危及人類身體健康。生物農藥有以下幾個優點:能有效的控制害蟲，不殺傷天敵，不破壞生態平衡，不污染環境，因而有廣闊的開發前景。目前從霉菌著手尋找生物農藥的研究也很深入廣泛，例如：木霉菌是一類具有廣譜性、拮抗性生物防治菌。1.3天然色素

食品及化妝品生產領域中都離不開色素，但多使用化學合成色素，其毒性問題已逐步引起人們的關注，國內外在其用量及使用范圍方面均有限制。從生物中提取的天然食用色素無毒性，食用安全性好，但大多數因原料來源少，價格高限制了其廣泛應

用。目前用霉菌生產色素的例子也很多，例如:紅曲霉菌，是用于提取色素最多的霉菌，中國利用紅曲已有上千年的歷史，用于紅腐乳、酒類和其他食品中。1.4抗腫瘤

在霉菌發酵產物中還發現有能抑制缺氧信號傳遞的小分子物質，很多類型的人類腫瘤細胞都處在嚴重缺氧的狀態下，它們為了生存，建立了一系列的級聯反應來緩解缺氧。Pladienolides是一類由普拉特鏈霉菌 Mer2 11107發酵產生的大環內酯類抗生素，可抑制腫瘤細胞生長和缺氧信號傳遞，它在小鼠異種皮移植入腫瘤的模型中表現出了強大的抗腫瘤效果。可見它有望成為新型的抗腫瘤藥物。1.5具有特殊活性的酶

木霉菌能產生纖維素酶，它可直接作用于纖維素使其斷裂分解為低分子的化合物及葡萄糖等被動物所利用，另一方面，纖維素酶可使粗纖維素分解從而可使更多的植物細胞內容物分離出來，提高了這些營養物質的消化率。此外，木霉菌還可產生半纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、果膠酶，這些酶的共同作用可提高對碳水化合物、蛋白質和礦物質的消化吸收率，促進吸收[1]。1.6食品發酵

腐乳是我國獨特的傳統發酵食品之一，系用豆腐坯經毛霉菌培養釀制而成。毛霉菌種的質量好壞關系到腐乳的形狀、色澤滋味及理化質量，目前經過菌種選育，已獲得一株生長快速、菌絲旺盛、蛋白酶活性強的毛霉菌株，用它制成的接種劑可用于腐乳和臘八生產，其產品質量優良、穩定[2]。此外，常用于腐乳的霉菌還有黑根霉、米曲霉、紅曲霉等[3]。2基因工程

2.1基因工程的涵義

用酶學方法，將異源基因與載體DNA在體外進行重組，將形成的重組子DNA導入宿體細胞，使異源基因在宿體細胞中復制表達，從而達到改造生物品種或性狀，大量生產出人類所需要的生物品種和產物。[4]2.2基因工程操作的主要步驟：

（1）采用cDNA文庫人工合成或PCR擴增，分離制取目的基因片段（2）采用核酸限制性內切酶Ⅱ同時剪切目的基因和克隆載體

（3）在T1DNA連接酶的作用下將目的基因與基因載體連接而成重組DNA（4）把重組DNA分子導入受體細胞，并在一起擴增而成克隆子（5）標記分析和篩選出獲得重組DNA分子的克隆受體細胞

（6）進一步了擴增、轉化、表達，最終生成新的優良性狀的菌種或人類所需要的產品

2.3基因工程的工具酶

酶在基因工程操作中是不可缺少的工具，在基因工程中應用的酶統稱為工具酶。要取得所需的目的基因DNA并與載體DNA連接在一起形成DNA重組體，首先要提供限制性內切酶和DNA連接酶。此外，還有其他工具酶，如T1多聚核苷酸激酶、堿性磷酸酯酶、核酸酶S1、反向轉錄酶和末端脫氧核苷酸轉移酶等。到目前為止，常用的工具酶已有3000多種。2.4基因工程的載體

目前，在基因工程中應用的基因載體主要是質粒、病毒和噬菌體。載體的具備以下幾個性能：

（1）分子較小，可攜帶比較大的ＤＮＡ片段。

（2）能獨立于染色體而進行自主復制并且是高效的復制。

（3）要有盡可能多種限制酶的切割位點，但每一種限制酶又要最少的切割位點。（4）有適合的標記，易于選擇。

（5）有時還要求載體要能啟動外源基因進行轉錄及表達，并且盡可能是高效的表達。

（6）從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉移，僅限于在某些實驗室內特殊菌種內才可復制等等。3霉菌的基因工程改良 3.1目的基因的制備

3.1.1限制酶法 用限制性內切酶消化含有目的基因的外源，使其獲得目的基因,并使之產生粘性或平頭末端 ,以與載體連接。限制酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種類型,常用的為Ⅱ型酶 ,因為它有特異性識別位點 ,切口有規律 ,只要有鎂離子即可激活,且效率極高。

3.1.2cDNA法 由于真核生物的基因中含有非編碼間隔區 ,在原核生物中無法正常表達 ,必須除去內含子。mRNA是經轉 錄加工過 的RNA,無內含子 ,在反轉錄酶下,以mRNA為模板合成出互補DNA再加上接頭,即可與載體連接。

3.1.3 PCR擴增技術實際是體外DNA合成放大技術。其基本原理是依據細胞分裂中DNA合成半保留機制，及在體外DNA分子于同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉變的性質 ,人為控制體外合成系統的溫度,使雙鏈變成單鏈。單鏈DNA和人工引物退火。以

及在dNTP存在下 ,耐高溫的DNA 聚合酶使引物沿單鏈模板延升雙鏈DNA高溫變性,低溫退火,適溫延升等三步循環使DNA 擴增。

3.1.4鳥槍法 鳥槍法實質上是采用基因工程手段把染色體DNA用限制性內切酶切割，將所有的片段都連接到某種載體上，轉入大腸桿菌中增值。再用適當方法來篩選含該基因的重組體菌落，從重組體細菌提取DNA，經酶切后即可制取該基因。對真核細胞基因，因酶切后形成大小不等的成千上萬DNA片段，若采用此法則難于篩選出所需要的基因。因此，可采用凝膠電泳、密度梯度離心法或液相層析等方法。先把DNA片段按大小分成幾個組，然后，在采用鳥槍法分離目的基因。

3.2選擇適當的載體 載體是用于傳遞外源DNA序列進人宿主細胞,其本身也為DNA分子。

合適的載體有如下要求：必須能 自我復制。有可克隆位點 ,供外源DNA插人。有可供選擇的遺傳標記 ,如抗藥性基因、酶基因、營養缺陷型等。載體應盡量小 ,抗剪切力。表達型載體應具備與宿住基因相應的啟動子、增強子、前導序列。常用的載體有：質粒載體、入噬菌體、粘粒、絲狀噬菌體、病毒載體、酵母人工染色體卡粒載體。

3.3目的基因的體外重組

目的基因的體外重組即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來，得到重新組合后的DNA分子。重組有如下方法：:粘粒末端法 ,且常用雙標記法。平頭末端連接法 ,用T4DNA連接法。人工接頭法,其大小應為8─12bp。用同聚物接尾法 ,常用cDNA法。

3.3.1粘性末端連接法：當載體DNA和目的基因均用同一種限制酶進行切斷時，二者即可帶有相同的粘性末端。如將載體與目的基因混合在一起，二者即可通過粘性末端進行互補粘合，再加入DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。較少的情況下，對產生的平端也可直接進行連接。

3.3.2人工接尾法：即同聚物加尾連接法。當載體和目的基因無法采用同一種限制酶進行切斷，無法得到相同得粘性末端時，采用此方法。首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的3'-端，如載體上添加一段polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通過堿基互補進行粘合，再由DNA連接酶連接。

3.3.3人工接頭連接法：將人工連接器（即一段含有多種限制酶切點的DNA片段）連接到載體和目的基因上，即有可能使用同一種限制酶對載體和目的基因進行切斷，得到可以互補的粘性末端。3.4重組DNA導入宿主細胞

重組子構建后 ,必須送人宿主細胞使之發揮作用 ,常用物理方法、化學方法和生物方法。其一般過程為：

（1）將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁的通透性。（2）使含有目的基因的重組質粒進入受體細胞。

（3）目的基因在受體細胞內，隨其繁殖而復制，由于細菌繁殖的速度非常快，在很短的時間內就能獲得大量的目的基因。3.4.1物理方法

3.4.1.1基因槍法 該方法是利用一種物理儀器裝置，將鎢、金等金屬微粒加速沖擊細胞，把細胞擊孔，使目的基因進入受體。

3.4.1.2電激法 是利用高壓電脈沖的作用對原生質體或細胞擊出微孔而使基因轉移的一種新方法。

3.4.1.3激光微束法，此方法是利用直徑很小、能量很高的激光微束引起細胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下找出合適的細胞，然后用激光光源代替熒光光源，聚焦后發出激光微束脈沖，造成膜穿孔，處于細胞周圍的外源DNA分子隨之進入細胞。

3.1.4.4超聲波法基本原理：是利用低聲強脈沖超聲波的物理作用，擊穿細胞膜造成通道，使外源DNA進入細胞。3.4.2化學方法

3.4.2.1PEG法(聚乙二醇)PEG是細胞融合劑，它可以使細胞膜之間或DNA與膜之間形成分子橋，促使相互之間的接觸和粘連；還可以引起膜表面電荷的紊亂，干擾細胞間的識別，從而有利于細胞膜之間的融合和外源DNA進入原生質體。

3.4.2.2脂質體法

脂質體是由人工構建的磷脂雙分子層組成的膜結構，可將DNA包在其內，并通過脂質體與原生質體的融合或由于原生質體的吞噬過程，把外源DNA轉運到細胞內。3.4.3生物方法

3.4.3.1轉化 以質粒作載體構建的重組體導入受體細胞的過程 3.4.3.2轉染 以病毒作載體構建的重組體導入受體細胞的過程 3.4.3.3轉導 以噬菌體作載體構建的重組體導入受體細胞的過程 3.5重組DNA的篩選與鑒定

基因工程的最終目的是通過載體將外源基因導入合適的宿主細胞中高效表達，產生有重要價值的蛋白質產品。

3.5.1克隆基因表達有三個條件： ⑴ 基因的編碼區不能被插入序列中斷

⑵ 基因轉錄要有啟動子，而啟動子必須能被宿主細胞的RNA聚合酶有效地識別 ⑶ mRNA必須相當穩定，并有效地被翻譯，產生的外源蛋白質必須不為宿主細胞的蛋白酶所降解。

3.5.2篩選含重組體的陽性菌落的方法：平板篩選、限制酶切圖譜篩選、PCR篩選重組體、原位雜交技術。

3.5.2.1平板篩選

平板篩選是指利用載體的遺傳性標記在平板上直接篩選的方法。具有抗藥性標記的載體，轉化宿主細胞后，能在含抗生素的培養平板上生長；未轉化的則不能生長。

(1)插入失活 當外源DNA序列插入質粒中某一抗藥基因內，使該基因失活，轉化細胞就不能生長在含相應抗生素的培養平板上。

(2)藍-白篩選 利用藍色化合物的形成作為指示劑，篩選帶重組質粒的細菌。當外源片段插入到pBS質粒的多克隆位點上后會導致讀碼框架改變,表達蛋白失活,產生的氨基酸片段失去α-互補能力,含重組質粒的轉化子在生色誘導培養基上只能形成白色菌落。而沒有重組質粒的轉化子產生α-互補，在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫-β-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。

3.5.2.2原位雜交技術

原位雜交技術的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結合成專一的核酸雜交分子，經一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。

3.5.2.3限制酶切圖譜篩選

所謂的限制性酶切圖譜法就是對載體上插入的外源DNA片段進行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對比，因此利用這種方法不僅能區分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數千規模的轉化子篩選時，工作量極大，實驗成本也高。

4用基因工程獲得抗生素高產菌株的實例

青霉素G酞化酶活力的提高[5] 青霉素G酞化酶可把青霉素G轉化為 6一APA,它是新合成或半合成青霉素的有用原料 ,在抗生素工業中有著重要作用 ,因大腸桿 菌ATC-CL105菌株可產生青霉素G酞化酶,可將這種酶基因連接于一個多拷貝質粒載體上 ,通過基因測量應提高青霉素G酞化酶活力水平,用裝配型質粒克隆系統進行青霉素G酞化酶基因的克隆,ATC-CL105菌株DNA用 ΗindⅢ切開并插人裝配型質粒上 ,得到由3000個克隆組成的ATC-CL105的基因文庫,克隆帶有青霉素G酞化酶基因被生物測試系統選得 ,文庫的單菌落涂布于含有青霉素G和一株對6一APA敏感的粘質少母氏菌菌株的軟瓊脂上,產生青霉G酞化酶的克隆通過對敏感性測試菌抑制 圈來識別 ,篩選文庫中的 10000個菌落,獲得一個陽性克隆,把亞克隆青霉素G酞化酶基因轉移于PBR322質粒上,該質粒在每個細胞中擴增約50個拷貝,但酞化酶只增產6倍,大腸桿菌中PBR322質粒上的克隆青霉素G酞化酶基因在發酵條件下使用相當穩定。

參考文獻：

[1]吳裕本,林潘平.某些木霉菌株的產酶高峰及其纖維素酶制劑飼喂兔的試驗〔J〕.福建農業大學學報 1994, 23(3)[2]鄧芳席,劉素純.腐乳毛霉菌種選育及產酶條件研究〔J.湖南農學院學報 1995,21(1)[3] 潭周進,喻科,李仲強,等.霉菌腐乳品質的影響因素研究〔J.食品與機械 2002，(2)[4]彭志英主編.食品生物技術導論.北京:中國輕工業出版社，2010，（9）[5]王獄 ,方金瑞 ·抗生素 科學 出版社1988,220-111,

第四篇：毛霉菌感染控制措施

毛霉菌感染控制措施

1、做好人員管理

1.1 工作人員管理

醫院及科室高度重視毛霉菌感染管理工作，多次積極組織對醫務人員進行感染預防與控制知識教育及培訓，以提高醫務人員對毛霉菌感染預防和控制的認識，確保醫務人員掌握正確有效的預防和控制措施。同時組織科室內護工及保潔人員進行毛霉菌感染控制相關知識教育，以使每一名ICU內工作人員認識到毛霉菌的危害及應對措施，更好地開展毛霉菌感染控制工作。對毛霉菌感染病人固定管床護士，非管床的工作人員盡量減少進出隔離病室。入隔離病室工作人員要求戴口罩、帽子、手套，穿ICU專用鞋，做好消毒隔離工作。

1.2 病人管理

為了切斷傳播途徑，防止毛霉菌在病人、工作人員中擴散，感染病人盡量入住單間病房，將其與非毛霉菌感染病人分開，做好隔離措施，在標準預防基礎上實施嚴密的床旁接觸隔離，病人臨床癥狀好轉或治愈，連續2次培養結果陰性(每次間隔>24 h)方可解除隔離。對病人積極治療原發病，增強抵抗力，以減少感染毛霉菌的幾率。

1.3 探視人員的管理

探視人員每日在病室外專用探視通道隔玻璃窗探視病人，盡量減少不必要的室內訪客探視。入室探視的訪客應穿專用的清潔隔離衣，穿鞋套或ICU內專用鞋，戴好口罩，探視時盡量避免接觸病人及周圍物品，入室探視前和結束探視離開病房時，應洗手或用快速手消毒液擦拭消毒雙手。

2、加強環境管理

科室規范病房結構，設立單間為毛霉菌感染病人的隔離病室，病室每日上下午至少各開窗通風1次，病室內使用動態空氣消毒機，2 h～4 h定時對房間進行換氣及空氣消毒，保證空氣質量[10]。門窗、物體表面儀器設備表面每日用1 000 mg/L含氯消毒液濕式清潔，保持墻面和門窗無塵，有血跡或體液污染時應立即用1 000 mg/L含氯消毒劑擦拭消毒。病室內地面每日用含氯消毒劑拖地3次或4次，污染時及時清理。病床、床旁桌、床頭柜、治療車等每日用含氯消毒劑擦拭消毒兩遍，使用過的抹布、拖布用1 000 mg/L含氯消毒液浸泡2小時以上再清潔晾干。儀器設備專人專用，如呼吸機、血糖儀等固定。公用物品避免進入隔離房間，物品一旦進入此房間，需經過消毒處理(1 000 mg/L含氯消毒劑)后方可拿出。呼吸機、監護儀每日清洗過濾網，用75%乙醇擦拭按鈕及表面用含氯制劑擦拭外殼;微量泵、聽診器、血糖儀等每日用75%乙醇擦拭消毒。一次性物品嚴格一次性使用，用后按感染性醫療廢物分類處理。

3、加強醫療護理操作流程管理

3.1 加強接口流程管理

本組7例病人為ICU外帶入的毛霉菌感染，經過積極的搶救治療后3例病人病情好轉轉出ICU回普通病房。為了防止轉運過程導致毛霉菌的傳播，制訂了特殊感染病人接口流程管理規程，要求收到病人即將轉入的通知，接聽電話者詢問清楚病人目前的基本狀況，有無特殊事項(如有無特殊感染，是否需要準備搶救儀器設備等)。本組病人經細菌培養結果為毛霉菌感染后，立即選擇單間病房，備好用物，通知管床護士做好迎接準備。病人到達ICU病房后以ICU專用對接車接病人入住隔離病房，對接車上鋪一次性床單，使用后取下床單，按感染性醫療廢物處理。與病房護士做好病人病情、治療、護理交接，床頭掛隔離標識牌，病歷上貼“隔離”字樣。病人轉出ICU前通知病房做好迎接準備，以ICU專用對接車護送病員回病房，并做好交接。

3.2 加強消毒隔離及無菌技術，嚴格手衛生

對毛霉菌感染病人，在標準預防的基礎上實施接觸隔離，同時，因空氣中的毛霉菌孢子也可經過吸入導致感染，故應注意呼吸道隔離。在診療護理操作過程中嚴格遵守無菌技術操作規程，特別是行中心靜脈置管、氣管插管、氣管切開、留置尿管等操作時，應當避免污染，減少感染的危險，對留置深靜脈導管、留置尿管、氣管插管或機械輔助通氣者嚴格按三管感染控制要求處理。醫務人員的手衛生是預防和控制醫院感染最簡單和最有效的環節[11]。要求直接接觸病人前后，進行清潔或侵入性操作前，接觸病人體液或分泌物后，接觸病人使用過的物品后，從病人的污染部位轉到清潔部位實施操作時，嚴格實施手衛生。隔離病室內設有獨立的洗手設施，床旁配備快速手消毒液，以增加醫務人員洗手的依從性。手上有明顯污染時應洗手;無明顯污染時可使用快速手消毒液擦手或洗手。進行操作時可戴一次性袖套及手套，以減少手臂及手的污染，完成診療護理操作，離開房間前必須及時脫去袖套及手套至黃色垃圾袋中，再洗手或用快速手消毒液進行手消毒。

3.3 合理使用抗菌藥物

遵醫囑合理使用抗生素，減少耐藥菌的產生。掌握藥代動力學知識，自覺按規定時間給藥，保證病人的有效血藥濃度，以最大限度提高抗生素的使用效果，防止耐藥菌的產生[12]。

3.4 加強醫療廢物管理

醫療廢物嚴格分類收集，日產日清。處理醫療廢物時做好個人防護，防止污液污染操作者和發生銳器傷。針頭、刀片等利器放入銳器盒內，注明標記，輸液管路、敷料分別放入室內雙層醫用垃圾袋中，外貼“隔離”標志，以感染性醫療廢物送焚燒或無害化處理。

3.5 加強終末處理

嚴格的終末消毒處理是防止毛霉菌傳播最有效的措施之一，有效的終末處理能去除及殺死殘留在儀器設備、物體表面、及空氣中的毛霉菌，防止毛霉菌的繼續傳播。實施終末處理人員做好個人防護，戴口罩、帽子、手套、穿隔離衣。拆除病室內床單元布類及窗簾，用雙層塑料袋封裝，注明名稱、數量及“隔離”標志，送洗漿房處理。一次性醫療廢物(吸氧管、吸痰管等)及醫用垃圾以雙層黃色塑料袋封裝，外貼“隔離”標志，以感染性醫療廢物處理。監護儀、呼吸機等醫療儀器嚴格消毒處理，呼吸機管道一次性使用，污染管道以感染性醫療廢物處理，濕化罐、螺紋管高壓滅菌。床單位周圍物體表面擦拭消毒，地面以1 000 mg/L含氯制劑清掃;床墊、被褥、枕芯以移動式三氧消毒機消毒30 min以上;關閉門窗、空調及換氣扇，以三氧消毒機行病室空氣消毒2 h，后通知感染科行終末消毒后細菌學監測，監測內容包括病室內物體表面，醫療儀器表面。地面及空氣菌落數量等，監測結果陰性才可收治其他病人。做好監測登記工作

積極留取標本開展毛霉菌監測，以及時發現，早期診斷，采取有效的治療和感染控制措施。對隔離期間的病人定期進行監測，直至臨床癥狀好轉或治愈。建立毛霉菌感染病人登記本，做好記錄，內容包括病人姓名、年齡、病案號、診斷、簡要病史、臨床診治經過、結果以及感染菌種、藥敏試驗結果、感染控制措施及結果等

第五篇：食品加工廠霉菌污染及其控制措施

食品加工廠霉菌污染及其控制方法

在食品加工過程中“微污染源”很多，如何防止食品被污染乃是一重要課題。霉菌作為為微污染源中的一種，如果不加以控制勢必會影響到食品質保期的長短，那又如何控制霉菌污染食品呢？

殺菌消毒專家周立法先生認為：控制霉菌污染，首先要了解霉菌的生長環境、污染食品的條件。在此基礎上，方可以提出合理的防控措施，提高食品衛生質量。

一、霉菌的生長環境

1、生產車間的墻壁，比較潮濕部位容易生長霉菌。

2、加工設備存在冷凝水的管路、機殼等容易生長霉菌，3、空氣中所包含的水蒸氣，在冷凝、液化時最容易產生霉菌，如車間中溫度最低的 部位，含天花板、地面、設備表面、墻面等溫度低的部位，4、車間內無法保證正常換氣，無法讓車間濕度保持在55%情況下時，容易生長霉菌。

5、車間忽冷忽熱，容易產生冷凝水的地方，容易遭到霉菌侵害。

6、離墻近的設備、制冷風機容易產生冷凝水，容易產生霉菌。

7、溫度相對較低的車間速凍庫門，請一直保持關閉狀態。如果這些溫度較低車間的 門沒有關閉的話，那么旁邊車間傳過來的熱空氣涌進行，就形成很高的濕度，從而在空 氣冷卻的時候形成液化，容易生長霉菌。

8、車間的空調系統、凈化管道系統等，其自身容易產生霉菌。

二、霉菌的生長習性

與霉菌的生長繁殖關系密切的有水份、溫度、基質、通風等條件，為此，只有充分的了解霉菌的生長習性，才能為下一步控制霉菌提供理論依據。

1、水份 霉菌生長繁殖主要條件之一是必須保持一定的水份，當食品中的水分活性值為0.98時，霉菌最易生長繁殖；當水分活性值降為0.93以下時，霉菌繁殖受到抑制，但依然仍能生長；當水分活性值在0.7以下時，霉菌的繁殖受到真正的抑制，可以阻止產毒的霉菌繁殖。

2、溫度 溫度對霉菌的繁殖及產毒均有重要的影響，不同種類的霉菌其最適溫度是不一樣的，大多數霉菌繁殖最適宜的溫度為25～30℃，在0℃以下或30℃以上，不能產毒或產毒力減弱。如黃曲霉的最低繁殖溫度范圍是6-8℃，最高繁殖溫度是44～46℃，最適生長溫度37℃左右。但產毒溫度則不一樣，略低于生長最適溫度，如黃曲霉的最適產毒溫度為28-32℃。

3、食品基質 與其它微生物生長繁殖的條件一樣，不同的食品基質霉菌生長的情況是不同的，一般而言，營養豐富的食品其霉菌生長的可能性就大，天然基質比人工培養基產毒為好。

三、霉菌污染食品的條件

1、通過包材的污染，如包裝或罐裝食品的包裝袋、包裝瓶、瓶蓋等，若殺菌不徹底，則其殘留的霉菌素則會直接污染食品。

2、空氣中霉菌的二次污染，如空氣中滋生的霉菌、人員走動時地面揚塵中含有的細菌、空調或新風管道中吹出的細菌等。

3、操作人員自身的二次污染，如手部消毒不徹底、不潔凈衣物接觸食品等。

4、設備、容器，生產環境的交叉感染，如設備、容器清洗消毒不徹底，不按規定流程定期清洗等、消毒液選用不當或使用劑量不夠，生產車間的墻壁天花板的本身的霉菌殘留等

四、霉菌的控制措施

1、首先要保持生產車間的內部環境的清潔和衛生，注意對一些衛生死角進行嚴格 的衛生清理和保持（每半月實施一次深度清潔）：如操作案面的背面，天花板、墻壁、制冷風機的衛生清理，清理衛生后所有的墻壁、天棚、設備、器具、案面表面要用酒精 擦兩遍以上，尤其注意清理制冷風機的散熱片和冷氣的出風口以及內部電機葉片，這是 一個很容易忽視的角落。據泰日得涂料科技有限公司的外聘的專家工程師Mr.hanksen介 紹：若有條件的廠家，建議車間的天花板及墻壁采用泰日得防霉涂料，做好防霉的同時簡單 易清洗（高壓水槍直接清洗）從環境上防霉抑霉，杜絕環境的霉菌二次污染。

2、對生產車間霉菌有控制，首先必須控制車間的溫度和濕度，溫度在24度以下，濕度在55％以下，因為過高的溫濕度會促進霉菌的生長。

3、在生產時，采用NICOLER動態空氣消毒設備對空氣消毒,此設備可以在有人的情 況下對生產車間進行消毒，代表性企業為上海康久環保科技有限公司，市場占有率高達 80%。晚上工人下班后采用臭氧或紫外線對空氣消毒，防止空氣中滋生細菌累加到白天 造成對產品不利，因為一個細菌在24小時內會繁殖成百上千甚至上百萬細菌。

4、每天班前、班后對車間內部墻壁、風機、下水道、案面、手部、圍裙套袖、預 冷庫和庫門、速凍庫門、包裝室、工器具消毒間使用75%的酒精噴灑消毒，班中每2小 時對風機、墻壁、下水道實施75%的酒精噴灑，殺滅霉菌。

5、人員的工作服、更衣室等，必須保持衛生清潔，定期清洗和進行紫外線或臭氧 殺菌30分鐘以上，防止人為造成霉菌的交叉污染（不可在有人情況下殺菌）。

6、保證車間風機的正常運轉，保證車間內部空氣能夠達到要求指標，空調的換氣 程度好壞直接影響到霉菌的產生。如果車間能保證及時將含有大量水份的空氣排出車 間，則極大程度縮小了可能存在霉菌的可能性。據上海康久消毒技術有限公司安全工程 師Mr.hanksen介紹：若有條件的廠家，建議在新回風管道內安裝動態殺菌裝置，防止 管道內壁、過濾器及空調表冷器滋生細菌，給食品安全形成衛生隱患。