第一篇：實(shí)驗(yàn)五 細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌的制片和簡(jiǎn)單染色

實(shí)驗(yàn)五

細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌的制片和簡(jiǎn)單染色

一．實(shí)驗(yàn)器材 1.菌種

枯草芽孢桿菌12—18h。金黃色葡萄球菌24h牛肉膏蛋白胨瓊脂泄密安培養(yǎng)物等。1.溶液和試劑

草酸銨結(jié)晶紫染液，齊氏碳酸復(fù)紅染液，呂氏堿性美藍(lán)染液，革蘭氏染色用典液，乳酸碳酸棉藍(lán)染液。

2.儀器和其他用品

酒精燈，載玻片，蓋玻片，顯微鏡，雙層瓶，擦鏡紙，接種環(huán)，接種鏟，接種針，鑷子，載玻片夾子，載玻片支架，玻璃紙，平皿v型玻璃棒，滴管，解剖針，解剖刀，生理鹽水，50%乙醇，20%甘油，高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板。二．目的要求

1.學(xué)習(xí)并掌握微生物的制片及簡(jiǎn)單染色的基本技術(shù) 2.初步了解細(xì)菌，放線菌，酵母菌及霉菌的形態(tài)特征 3.鞏固顯微鏡操作技術(shù)及無(wú)菌操作技術(shù) 三．基本原理

放線菌菌體由基內(nèi)菌絲，氣生菌絲和孢子絲組成，制片時(shí)不采用涂片法以免破壞細(xì)胞及菌絲體形態(tài)。通常采用插片法或玻璃紙法并結(jié)合菌絲體簡(jiǎn)單染色進(jìn)行觀察，在插片中首先將滅菌蓋玻片插入接種有放線菌的平板，使放線菌沿蓋玻片和培養(yǎng)基接觸生長(zhǎng)而附著在蓋玻片上，取除蓋玻片上，取出蓋玻片可直接在顯微鏡下觀察放線菌在自然生長(zhǎng)狀態(tài)下的形態(tài)特征，而且有利于對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的放線菌形態(tài)進(jìn)行觀察。利用單一染料對(duì)菌體進(jìn)行染色的方法稱為簡(jiǎn)單染色。用于染色的染料是一類苯環(huán)上帶有發(fā)色基因的有機(jī)化合物。常采用堿性染料進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，原因在于微生物細(xì)胞在堿性、中性及弱酸性溶液中通常帶負(fù)電荷，而染料電離后染料部分帶正電荷，很容易與細(xì)胞結(jié)合使其著色；當(dāng)細(xì)胞處于酸性條件下，所帶正電荷增加時(shí)，可采用酸性染料染色。

四、操作步驟

（一）細(xì)菌制片及簡(jiǎn)單染色。

1、涂片。

2、干燥。

3、固定。

4、染色。

5、水洗。

6、干燥。

7、鏡檢。

（二）酵母菌制片及簡(jiǎn)單染色。

水—碘液浸片法。將革蘭氏染色用碘液用水稀釋4倍后，滴加一滴于載破片中央，無(wú)菌操作取少許菌體置于染色中混勻，蓋上破片后鏡劍。

五、思考題。

第二篇：《酵母菌和霉菌》教案

第一節(jié) 酵母菌和霉菌

教學(xué)目標(biāo)

1.了解酵母菌和霉菌（青霉或曲霉）的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.了解酵母菌和霉菌（青霉或曲霉）的營(yíng)養(yǎng)方式和生殖方式。3.了解酵母菌和霉菌對(duì)自然界的意義和與人類的關(guān)系。

4.通過(guò)指導(dǎo)學(xué)生觀察酵母菌、青霉或曲霉，繼續(xù)培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手實(shí)驗(yàn)?zāi)芰陀^察能力。

5.嘗試培養(yǎng)青菌和曲菌，并用顯微鏡觀察。

6.通過(guò)了解酵母菌和霉菌與人類的關(guān)系，學(xué)會(huì)用一分為二的方法分析事物。重點(diǎn)、難點(diǎn)分析

重點(diǎn)：酵母菌和霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生活特點(diǎn)，酵母菌和霉菌對(duì)自然界的意義和與人類的關(guān)系是本章的重點(diǎn)知識(shí)。

1.通過(guò)學(xué)習(xí)酵母菌和霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)，讓學(xué)生與所學(xué)過(guò)的植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，歸納總結(jié)出它們?cè)诩?xì)胞結(jié)構(gòu)上的異同。

2.通過(guò)學(xué)習(xí)酵母菌和霉菌的生活特點(diǎn)，有利于了解酵母菌和霉菌對(duì)自然界的意義和與人類的關(guān)系，使學(xué)生懂得研究微生物的重要任務(wù)之一就是用其利，避其害。了解真菌在經(jīng)濟(jì)上所蘊(yùn)藏的潛在價(jià)值是巨大而多樣的。

難點(diǎn)：酵母菌的營(yíng)養(yǎng)方式是本節(jié)的教學(xué)難點(diǎn)：

酵母菌既是異養(yǎng)（腐生）厭氧型真菌，又是異養(yǎng)需氧型真菌，要講清酵母菌獲得能量的方式有一定難度。教學(xué)建議

一課時(shí)

實(shí)踐訓(xùn)練：觀察酵母菌的形態(tài) 創(chuàng)新訓(xùn)練：霉菌的培養(yǎng) 教學(xué)過(guò)程

1.課前準(zhǔn)備A：

首先做好酵母菌的培養(yǎng)。酵母菌的簡(jiǎn)易培養(yǎng)方法如下：

①提前2～3天用3％～5％的蔗糖或2％葡萄糖溶液放入鮮酵母或一小塊發(fā)面，恒溫22℃培養(yǎng)。

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②將蘋果皮切碎或用散發(fā)酒味的水果皮，裝入瓶?jī)?nèi)，注意瓶子不要太大，輕輕壓實(shí)，加入涼開水浸沒(méi)，不用接種，在較溫暖的地方培養(yǎng)2～3天鏡檢，即能找到酵母菌。

2.課前準(zhǔn)備B：

①介紹霉菌的簡(jiǎn)易培養(yǎng)方法。布置學(xué)生在課前2～3天用橘子或陳舊的饅頭培養(yǎng)青霉或曲霉。

②利用二次接種的方法培養(yǎng)較純凈的青霉或曲霉。在課前2～3天，制備好青霉或曲霉的培養(yǎng)裝片。具體操作方法詳見課本。講授新課

1．酵母菌

（1）關(guān)于酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的教學(xué)：

指導(dǎo)學(xué)生制作含有大量酵母菌的臨時(shí)裝片，并指導(dǎo)學(xué)生用顯微鏡觀察酵母菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察，對(duì)酵母菌建立感性認(rèn)識(shí)。課前畫好酵母菌結(jié)構(gòu)的投影片，利用掛圖及書中的插圖，在課上放一段酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的錄像片段。講述酵母菌結(jié)構(gòu)時(shí)注意指導(dǎo)學(xué)生與植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。讓學(xué)生指出它們的異同。這樣使學(xué)生明確認(rèn)識(shí)到：酵母菌的結(jié)構(gòu)中有成形的細(xì)胞核。酵母菌是單細(xì)胞個(gè)體，屬于個(gè)體微小的真菌。

（2）酵母菌營(yíng)養(yǎng)方式的教學(xué)

強(qiáng)調(diào)指出：酵母菌不含葉綠素，不能進(jìn)行光合作用，因此不屬于自養(yǎng)生物。酵母菌在有氧的條件下生活，能把葡萄糖分解成二氧化碳和水；而在在無(wú)氧條件下，又可把葡萄分解成二氧化碳和酒精。

做演示實(shí)驗(yàn)：在課前1～2天用兩個(gè)試管分別倒入含酵母菌的培養(yǎng)液，把其中一個(gè)試管用塞子堵上，一個(gè)敞著口，課上請(qǐng)學(xué)生分別聞一聞，讓學(xué)生說(shuō)出哪個(gè)有明顯的酒味。并問(wèn)為什么？同時(shí)讓學(xué)生觀察分析培養(yǎng)酵母的糖液中為什么會(huì)有氣泡？

（3）在酵母菌與人類的關(guān)系 利用學(xué)生已經(jīng)掌握的知識(shí)設(shè)問(wèn)，如：

1、饅頭、面包為什么是松軟多孔的？

2、你們知道酵母菌有哪些利用價(jià)值？

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歸納總結(jié)：酵母菌是我國(guó)古代勞動(dòng)人民應(yīng)用較早的一類微生物，自然界中幾乎到處都有酵母菌，已發(fā)現(xiàn)的酵母菌達(dá)數(shù)百種之多，絕大多數(shù)都是人類的好朋友，特另提在酒類釀造方面已經(jīng)有四千多年的歷史。另外酵母菌中含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此可利用酵母菌的菌體捉取輔酶A、細(xì)胞色素C、凝血質(zhì)、卵磷脂和多種氨基酸等。近幾年，酵母菌在石油脫蠟、酶制劑和發(fā)酵飼料等方面的應(yīng)用也有了新的進(jìn)展。

（4）關(guān)于酵母菌生殖方式的教學(xué)：

指導(dǎo)學(xué)生，制作臨時(shí)裝片，在顯微鏡下觀察正在進(jìn)行出芽生殖的酵母菌，在黑板上畫簡(jiǎn)圖示意，制作投影片。強(qiáng)調(diào)酵母菌出芽生殖的芽與綠色開花植物的芽不是一個(gè)概念。酵母菌細(xì)胞上長(zhǎng)出的突起，比母細(xì)胞小得多，是母細(xì)胞上的一個(gè)芽體，脫離母體后，即成為個(gè)新的酵母菌，屬于無(wú)性生殖。酵母菌還有另一種生殖方式為孢子生殖，在條件惡劣時(shí)，產(chǎn)生孢子，由孢子發(fā)育成新個(gè)體。

二、講述霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)時(shí)，運(yùn)用講述與實(shí)驗(yàn)結(jié)合的方法。具體方法如下：（1）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察：

①取一塊長(zhǎng)有青霉的橘皮或長(zhǎng)有曲霉的饅頭，用放大鏡進(jìn)行觀察。觀察青霉或曲霉的形態(tài)和顏色；

②指導(dǎo)學(xué)生制作橘皮培養(yǎng)出的青霉裝片，讓學(xué)生在顯微鏡下觀察。注意以下問(wèn)題：取材用解剖針挑取少量，要從顏色很淺的綠色部分取材做裝片，這樣既能看到無(wú)色的分枝菌絲，又能觀察到菌絲頂端的綠色孢子。

③課前制備好的青霉或曲霉的培養(yǎng)裝片，做好示范鏡，讓學(xué)生觀察。（2）學(xué)生觀察后提問(wèn)學(xué)生看到了什么？

讓學(xué)生描述青霉或曲霉的形態(tài)和顏色。告訴學(xué)生在鏡下觀察到大量綠色成串的青霉的孢子，曲霉的孢子。常見的是黑、黃和橙紅色，無(wú)色的部分是菌絲。然后進(jìn)行青霉和曲霉形態(tài)結(jié)構(gòu)的講解。指出：青霉和曲霉呈現(xiàn)出的不同顏色是孢子的顏色，而它們的菌絲是無(wú)色的。

青霉和曲霉的菌體是由許多菌絲組成的，分為直立菌絲和營(yíng)養(yǎng)菌絲。由于上有橫隔，是多細(xì)胞個(gè)體。但不是所有霉菌都是多細(xì)胞個(gè)體。青霉和曲霉的每個(gè)細(xì)胞中都有細(xì)胞核，是真核生物。另外參照書中插圖讓學(xué)生比較青霉與曲霉分生孢子梗的區(qū)別：青霉孢子梗頂端無(wú)膨大；曲霉分生孢子梗頂端膨大成為球狀。

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（3）關(guān)于青霉與曲霉的營(yíng)養(yǎng)方式

強(qiáng)調(diào)：由于青霉和曲霉菌絲體中無(wú)葉綠素，不能進(jìn)行光合作用，只能吸收現(xiàn)成有機(jī)物，進(jìn)行腐生生活，所以為異養(yǎng)生物。

（4）青霉和曲霉的生殖方式

讓學(xué)生從孢子梗的形態(tài)及孢子的顏色上分辨青霉和曲霉，指出它們是靠孢子生殖的，這種孢子可在空氣中傳播，每個(gè)孢子落到適宜的環(huán)境中，都可以發(fā)育成新個(gè)體。在溫暖潮濕的季節(jié)里衣物有時(shí)會(huì)發(fā)霉，正是霉菌孢子大量繁殖的結(jié)果。

青霉、曲霉與人類的關(guān)系是怎么樣的？

組織學(xué)生討論青霉和曲霉對(duì)人類有益和有害的地方是什么，而后歸納總結(jié)。著重指出：曲霉是發(fā)酵工業(yè)及食品加工方面的重要菌種。2000年以前我國(guó)就已利用曲霉制醬，也是我國(guó)民間用以釀酒、制醋曲，制某些副食品的重要菌種。例如我國(guó)生產(chǎn)的腐乳有白腐乳、青腐乳和紅腐乳之分，當(dāng)你看到紅腐乳時(shí)不要以為染了化學(xué)顏料，其實(shí)它是紅曲霉分泌的紅曲加工而成，由于人們選用了不同工藝，因而使腐乳各具特色。

青霉除了用于提取青霉素外，還用于制造有機(jī)酸、葡萄糖氧化酶和淀粉酶等。講完課后根據(jù)教學(xué)目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，及時(shí)反饋，并請(qǐng)學(xué)生回答“動(dòng)動(dòng)腦”中提出的問(wèn)題，而后指導(dǎo)學(xué)生看課外讀物“青霉素的來(lái)歷”。

作業(yè)布置：同步訓(xùn)練 板書設(shè)計(jì)：

第一節(jié)

酵母菌和霉菌

一.酵母菌：形態(tài)結(jié)構(gòu)----酵母菌是單細(xì)胞個(gè)體，屬于個(gè)體微小的真菌。營(yíng)養(yǎng)方式-----腐生生活。

生殖方式------無(wú)性生殖、孢子生殖。

二.青霉與曲霉: 形態(tài)結(jié)構(gòu)-----由許多菌絲組成的。生殖方式-----孢子生殖。營(yíng)養(yǎng)方式-----異養(yǎng)生物。

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第三篇：革蘭染色和血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)

革蘭染色和血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

掌握革蘭染色法的原理以及實(shí)驗(yàn)步驟；理解血漿凝固酶試驗(yàn)的原理；掌握血漿凝固酶試驗(yàn)的操作方法以及結(jié)果判斷。

試驗(yàn)儀器及試劑：

儀器：載玻片、特種鉛筆、試管夾、酒精燈、打火機(jī)、接種環(huán)、染色盤、顯微鏡

試劑：龍膽紫溶液、碘溶液、脫色液、沙黃溶液、生理鹽水、蒸餾水、菌種、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物、EDTA抗凝兔血漿等

實(shí)驗(yàn)原理：

革蘭染色：細(xì)菌的不同顯色反應(yīng)是由于細(xì)胞壁對(duì)乙醇的通透性和抗脫色能力的差異，主要是肽聚糖層厚度和結(jié)構(gòu)決定的。經(jīng)結(jié)晶紫染色的細(xì)胞用碘液處理后形成不溶性復(fù)合物，乙醇能使它溶解，所以染色的前二步結(jié)果是一樣的，但在G+細(xì)胞中,乙醇還能使厚的肽聚糖層脫水，導(dǎo)致孔隙變小，由于結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物分子太大，不能通過(guò)細(xì)胞壁，保持著紫色。在G-細(xì)胞中，乙醇處理不但破壞了胞壁外膜，還可能損傷肽聚糖層和細(xì)胞質(zhì)膜，于是被乙醇溶解的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物從細(xì)胞中滲漏出來(lái)，當(dāng)再用襯托的染色液復(fù)染時(shí)，顯現(xiàn)紅色。紅色染料雖然也能進(jìn)入已染成紫色的G+細(xì)胞，但被紫色蓋沒(méi)，紅色顯示不出來(lái)。

血漿凝固酶試驗(yàn)：致病的葡萄球菌可分泌游離型凝固酶到菌體外，游離型凝固酶能被血漿中的協(xié)同因子激活為凝酶樣物質(zhì)，將液態(tài)的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)的纖維蛋白而使血漿凝固。

實(shí)驗(yàn)步驟：

革蘭染色：1.標(biāo)記：用特種鉛筆在載玻片上畫一個(gè)小圈，用來(lái)大致確定菌液滴的位置。

2.涂片：滴加一小滴無(wú)菌生理鹽水與潔凈載玻片上，用打火機(jī)點(diǎn)燃酒精燈灼燒接種環(huán)，待接種環(huán)冷卻后在培養(yǎng)基中取細(xì)菌，然后將菌落或菌苔輕輕涂布散開（菌液標(biāo)本可直接涂在載玻片上），涂片完成消毒接種環(huán)，熄滅酒精燈。

3.干燥：涂片后在室溫下自然干燥，也可在酒精燈上略加溫，使之迅速干燥，但勿靠近火焰（火焰上方15cm左右，可用手背試溫，要求以玻片背面觸及手背皮膚熱而不燙為宜）

4.固定：用高溫進(jìn)行固定，即用夾子夾取載玻片一端，標(biāo)本面朝上，在酒精的外焰快速來(lái)回移動(dòng)3~4次，共約3~4秒，放置待冷卻后染色

5.染色：（1）初染：龍膽紫溶液染色10

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后用蒸餾水沖洗，瀝去水分

（2）煤染：碘液染色10

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后用蒸餾水沖洗，瀝去水分

（3）脫色：脫色劑脫色10-20

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后用蒸餾水沖洗，瀝去水分

（4）復(fù)染與水洗：沙黃溶液染色10

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后用蒸餾水沖洗，自然干燥后鏡檢

6.顯微鏡觀察

血漿凝固酶試驗(yàn)：1.取一張載玻片做好標(biāo)記，一側(cè)滴加生理鹽水作為對(duì)照，一側(cè)滴加兔血漿

2.接種環(huán)灼燒消毒，待冷卻后用接種環(huán)挑取金黃色葡萄球菌在生理鹽水側(cè)涂勻；接種環(huán)灼燒消毒，待接種環(huán)冷卻后再跳去金黃色葡萄球菌在兔血漿側(cè)涂勻，5-10秒內(nèi)觀察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)分析：

革蘭染色：1、涂片時(shí)動(dòng)作要輕柔，使其薄而均勻，動(dòng)作過(guò)大會(huì)改變細(xì)菌的排列形式

2、固定這一步驟能殺死細(xì)菌，固定細(xì)菌結(jié)構(gòu)，保證菌體能牢固地黏附在載玻片上，以免水洗時(shí)被水沖掉，并且能改變菌體對(duì)染料的通透性。

3、龍膽紫是堿性染料可與細(xì)菌的DNA

結(jié)合使細(xì)菌呈紫色

4、媒染劑的作用使增強(qiáng)染料與細(xì)菌的親和力更好地加強(qiáng)染料與細(xì)菌的結(jié)合5、脫色是革蘭染色的關(guān)鍵步驟，目的是幫助染料從被染色的細(xì)菌中

脫色，利用細(xì)菌對(duì)染料脫色的難易程度不同而將細(xì)菌加以區(qū)分；革蘭陽(yáng)性細(xì)菌不易被脫色劑脫色，而革蘭陰性菌則易被脫色

6、復(fù)染的目的是使脫色的細(xì)菌重新染上另一種顏色，以便與未脫色菌進(jìn)行比較

7、革蘭陽(yáng)性菌經(jīng)染色后呈紫色而革蘭陰性菌呈紅色，另外要注意，在實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果，假陽(yáng)性主要是由于脫色不完全，可能是由于涂片過(guò)厚,或者是結(jié)晶紫染色過(guò)度，導(dǎo)致脫色不完全。假陰性可能是因?yàn)榧?xì)胞固定過(guò)度，造成細(xì)胞壁通透性的改變，而出現(xiàn)假陰性結(jié)果;另外,細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng),可能已經(jīng)有部分細(xì)胞發(fā)生死亡或者自溶,也導(dǎo)致細(xì)胞壁通透性的改變而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

血漿凝固酶試驗(yàn)：1、血漿凝固酶是鑒定致病性葡萄球菌的重要指標(biāo)。

2、運(yùn)用玻片法血漿凝固酶試驗(yàn)可檢測(cè)游離型凝固酶，使用EDTA抗凝兔血漿試驗(yàn)效果最佳。

3、血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果的判斷:出現(xiàn)明顯的凝聚顆粒為陽(yáng)性、無(wú)凝集顆粒為陰性。

第四篇：土壤中放線菌的分離和純化實(shí)驗(yàn)

土壤中放線菌的分離和純化實(shí)驗(yàn)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、制作MS培養(yǎng)基的方法，掌握母液的保存方法。

2、掌握培養(yǎng)基的滅菌方法。

掌握外植體的消毒和超凈工作臺(tái)的使用。

4、掌握放線菌的分離純化及染色的基本流程；

5、掌握高氏一號(hào)培養(yǎng)基的配制方法；

6、復(fù)習(xí)分離純化放線菌的基本操作技術(shù)、培養(yǎng)方學(xué)會(huì)使用高壓蒸汽滅菌鍋。

7、培養(yǎng)微生物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路和動(dòng)手能力。

二、實(shí)驗(yàn)材料

高壓蒸汽鍋、培養(yǎng)瓶、石斛的愈傷組織、超凈工作臺(tái)，酒精燈、酒精棉球、鑷子、電子天平、稱量紙、燒杯、量筒、顯微鏡、三角錐形瓶、無(wú)菌培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精燈、分析天平；接種環(huán)、載玻片、蓋玻片、玻璃珠、移液槍、剪刀

三、實(shí)驗(yàn)原理

植物組織培養(yǎng)即植物無(wú)菌培養(yǎng)技術(shù)，又稱離體培養(yǎng)，是根據(jù)植物細(xì)胞具有全能性的理論，利用植物體離體的器官(如根、莖、葉、莖尖、花、果實(shí)等）、組織（如形成層、表皮、皮層、髓部細(xì)胞、胚乳等）

第 1 頁(yè) 或細(xì)胞（如大孢子、小孢子、體細(xì)胞等）以及原生質(zhì)體,在無(wú)菌和適宜的人工培養(yǎng)基及溫度等人工條件下，能誘導(dǎo)出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的學(xué)科。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、配制MS培養(yǎng)基8L，稱取馬鈴薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、活性炭8半勺、瓊脂80g、配制 母液。

2、配制培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)注意：

①在使用提前配制的母液時(shí)，應(yīng)在量取各種母液之前，輕輕搖動(dòng)盛放母液的瓶子，如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應(yīng)立即淘汰這種母液，重新進(jìn)行配制；為防止母液被微生物污染，有機(jī)母液放在冰箱里4℃保存；

②用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤(rùn)洗2次；

③量取母液時(shí)，最好將各種母液按將要量取的順序?qū)懺诩埳?，量?種，劃掉1種，以免出錯(cuò)。溶化瓊脂 用粗天平分別稱取瓊脂9 g、蔗糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸餾水750 mL，用電爐加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀。然后再將配好的混合培養(yǎng)液加入到煮沸的瓊脂中，最后加蒸餾水定容至1 000 mL，攪拌均勻。

需要注意的是，在加熱瓊脂，制備培養(yǎng)基的過(guò)程中，操作者千萬(wàn)不能離開，否則沸騰的瓊脂外溢，就需要重新稱量、制備。此外，如果沒(méi)有搪瓷量杯，可用大燒杯代替。但要注意大燒杯底的外表面不能沾水，第 2 頁(yè) 否則加熱時(shí)燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。調(diào)pH 用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)培養(yǎng)基的pH，一直調(diào)到培養(yǎng)基的pH為6（5.8~6.5）左右為止。培養(yǎng)基的分裝 溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。分裝時(shí)，先將培養(yǎng)基倒入燒杯中，然后將燒杯中的培養(yǎng)基倒入錐形瓶（50 mL或100 mL）中。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/5～1/4。每1 000 mL培養(yǎng)基，可分裝25～30瓶。培養(yǎng)基分裝完畢后，應(yīng)及時(shí)封蓋瓶口。用2塊硫酸紙（每塊大小約為9 cm×9 cm）中間夾1層薄牛皮紙封蓋瓶口，并用線繩捆扎。最后在錐形瓶外壁貼上標(biāo)簽。

3、高壓滅菌 培養(yǎng)基的高壓滅菌包括以下幾個(gè)步驟。

第一，碼放錐形瓶。將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶直立于金屬小筐中，再放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)。如果沒(méi)有金屬小筐，可以在兩層錐形瓶之間放一塊玻璃板隔開。

第二，放置其他需要滅菌的物品。將其他需要滅菌的物品也放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)，如裝有蒸餾水的錐形瓶、帶螺口蓋的玻璃瓶、燒杯、廣口瓶（以上物品都要用牛皮紙封口），用報(bào)紙包裹的培養(yǎng)皿、剪刀、解剖刀、鑷子、濾紙、鉛筆等。

第三，滅菌。待需要滅菌的物品碼放完畢，蓋上鍋蓋。在98 kPa、121 ℃下，滅菌20 min。滅菌后取出錐形瓶，讓其中的培養(yǎng)基自然冷卻凝固后再使用。

第 3 頁(yè) 4,、再在操凈工上進(jìn)行消毒，先用紫外線照射30MIN，然后送風(fēng)，關(guān)閉紫外燈，改 用日光燈，對(duì)手用酒精進(jìn)行消毒，對(duì)培養(yǎng)基表面也要用酒精進(jìn)行消毒。準(zhǔn)備工作好了，就進(jìn)行接種。并且要在酒精燈旁邊進(jìn)行操作，避免污染。鑷子要在雙孔滅菌器上進(jìn)行滅菌。

4、接種完成后要整理工作臺(tái)，并且把培養(yǎng)瓶拿到培養(yǎng)架上進(jìn)行日光培養(yǎng)。

五、放線菌的提取步驟

5、（1）稱取土樣2.00g，在火焰旁加到一個(gè)盛有48ml無(wú)菌水并裝有玻璃珠的100ml錐形瓶中。振蕩20-30min，使樣品的菌體、芽孢或孢子均勻分散。靜止20-30s，標(biāo)記為編號(hào)1。

6、（2）按照一定的梯度進(jìn)行稀釋（該實(shí)驗(yàn)采用10倍梯度）

①取3個(gè)各裝有9.5ml無(wú)菌水的25ml錐形瓶，分別按照順序標(biāo)記好2、3、4.②在超凈工作臺(tái)上，用微量移液器從1號(hào)錐形瓶中移取0.5ml土壤懸液加到2號(hào)錐形瓶中，搖勻后，再用微量移液器從2號(hào)錐形瓶中移取0.5ml土壤懸液加到3號(hào)錐形瓶中，依此類推，7、分別將土壤懸液制成10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-

6、10-

7、10-

8、10-

9、10-10的土壤稀釋液。

六、稀釋涂布法分離土壤中放線菌

8、（1）倒平板

9、將配制好并且滅菌的高氏一號(hào)培養(yǎng)基加熱融化，待冷卻至55—60℃時(shí)，往高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加入1ml的0.5%重鉻酸鉀, 然后分別倒平板。方法是在超凈工作臺(tái)，右手持盛培養(yǎng)基的三角燒瓶，置火焰旁

第 4 頁(yè) 邊，左手拿平皿并松動(dòng)瓶塞，用手掌邊緣和小指、無(wú)名指夾住拔出。令三角瓶瓶口在火焰上滅菌，左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)液約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。共制備6個(gè)平板（一個(gè)稀釋度做3個(gè)平行樣品）。

10、（3）涂布平板

11、用1ml無(wú)菌吸管分別精確地吸取10-

4、10-

5、10-6的稀釋菌液1ml，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每一濃度對(duì)應(yīng)兩個(gè)平板。用無(wú)菌涂布棒（從濃度小液開始）將加入平板培養(yǎng)基上的土壤稀釋液在整個(gè)平板表面涂勻，涂完一個(gè)平板用酒精燈滅菌。

12、（4）倒置平板

13、將培養(yǎng)基平板倒置（防皿蓋的冷凝水下滴），置于28度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d14、15、5、放線菌的純化

16、（1）倒平板

同上

17、（2）平板劃線

18、將蘸有菌種的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上做以Z字行劃線，每劃完一次要充分燃燒接種環(huán)燒掉殘余微生物，再?gòu)纳弦淮蝿澗€處末點(diǎn)開始下一次劃線。劃線完畢后蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置與恒溫箱中培養(yǎng)。

6、放線菌的觀察玻璃紙法

19、將玻璃紙剪成培養(yǎng)皿大小，用舊報(bào)紙隔層疊好后滅菌。

第 5 頁(yè) 20、將高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基熔化后在火焰旁倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿倒15ml左右，待培養(yǎng)基凝固后，在無(wú)菌操作下用鑷子將無(wú)菌玻璃紙履蓋在瓊脂平板上即制成玻璃紙瓊脂平板培養(yǎng)基。

21、（3）用接種環(huán)挑取純化后的放線菌，在玻璃紙上劃線接種。

22、（4）將接種的玻璃紙瓊脂平板置28—30℃下培養(yǎng)。

23、（5）在培養(yǎng)至3天，5天，7天時(shí)，從溫室中取出平皿。在超凈工作臺(tái)上，打開培養(yǎng)皿，用無(wú)菌鑷子將玻璃紙與培養(yǎng)基分離，用無(wú)菌剪刀取小片玻璃紙置于載玻片上用顯微鏡觀察。

7、放線菌保藏

斜面低溫保藏法

長(zhǎng)后，棉塞部分用油紙包扎好，移至 2—8 ℃的冰箱中保藏，保存 2—4 個(gè)月，移種一次。

將純化培養(yǎng)后的放線菌接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生

第 6 頁(yè)

第五篇：實(shí)驗(yàn)四：細(xì)菌的接種、培養(yǎng)和分離技術(shù)

實(shí)驗(yàn)四：細(xì)菌的接種、培養(yǎng)和分離技術(shù)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求：

（1）掌握從環(huán)境（土壤、水體、活性污泥等）中分離培養(yǎng)細(xì)菌的方法，從而獲得若干種細(xì)菌純培養(yǎng)技能

（2）掌握細(xì)菌純種分離的方法：稀釋平板分離法和平板劃線法。

（3）掌握幾種接種技術(shù)：斜面接種技術(shù)、穿刺接種、稀釋平板涂布法等。

二、實(shí)驗(yàn)原理

在土壤、水、空氣或人及動(dòng)、植物體中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當(dāng)我們希望獲得某一種微生物時(shí)，就必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。

為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)。一般是根據(jù)該微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長(zhǎng)，而抑制其他菌生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得到純菌株。

三、實(shí)驗(yàn)器材

1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

2、盛9ml無(wú)菌水的試管，盛90m1無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，1ml和5ml無(wú)菌 吸管，無(wú)菌培養(yǎng)皿；

3、接種環(huán)，土樣，酒精燈等。

四、操作步驟

1、倒平板 將加熱融化的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒平板，并標(biāo)明培養(yǎng)基的名稱。

2、貼標(biāo)簽 接種前在試管上貼上標(biāo)簽，注明菌名、接種日期、接種人姓名等。貼在距試管口徑2-3厘米的位置。

3、點(diǎn)燃酒精燈。

4、接種

取接種環(huán) 右手拿接種環(huán)(如握鋼筆一樣)、在火焰上將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部分，均用火燒過(guò)滅菌。

環(huán)冷卻 將灼燒過(guò)的接種環(huán)伸入菌種管，先使環(huán)接觸邊壁，使其冷卻。

取菌種 待環(huán)冷卻后輕輕沾取經(jīng)稀釋10倍的土壤懸液-環(huán)，然后將接種環(huán)移出菌種管，注意不要使環(huán)的部分碰到管壁，取出后不可使環(huán)通過(guò)火焰。

接種 在火焰旁迅速將沾有菌種的接種環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無(wú)論哪種方法劃線，其目的都是通過(guò)劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使形成單個(gè)菌落。常用的劃線方法有下列二種：

⑴用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線3-4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過(guò)第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過(guò)第三次平行劃線部分作第四次平行劃線(圖A)。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。

⑵將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線(圖B)。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置溫室培養(yǎng)。

環(huán)滅菌 將接種環(huán)燒紅滅菌。

5、挑菌 將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落分別挑取接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置25℃和28℃溫室中培養(yǎng)，待菌苔長(zhǎng)出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其他雜菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。

四、注意事項(xiàng)

1、實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中無(wú)菌操作。