第一篇：細胞毒性試驗總結

（一）實驗前應明確的問題

1.選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間，以保證培養終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀察不到差異。

2.藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。

3.時間點的設定。在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，最后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應該就是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現的最明顯）。

4.培養時間。200ul的培養液對于10的4～5次方的增殖期細胞來說，很難維持68h，如果營養不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結果，我們是在48h換液的。

5.MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。做MTT時，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。6.理論未必都是對的。要根據自己的實際情況調整。

7.實驗時應設置調零孔，對照孔，加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質，而加藥組加入不同濃度的藥物。

8.避免血清干擾。用含15％胎牛血清培養液培養細胞時，高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10％胎牛血清的培養液進行。在呈色后，盡量吸凈培養孔內殘余培養液。

（二）實驗步驟

貼壁細胞：

1.收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。

2.5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況.3.5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。5.終止培養，小心吸去孔內培養液。

6.每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

7.同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜）懸浮細胞：

1）收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將①補足的1640（無血清）培養基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養液稀釋 lug/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100ul(儲存液100 1640）。2）置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4 h后可跳過步驟4），直接酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）

4）離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。

5）同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。

（三）MTT的配制

MTT一般最好現用現配，過濾后4℃避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那么多,尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉。配制MTT時用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。

PBS配方:Nacl 8g，Kcl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，調ph 7.4，定容1L。

（四）關于細胞的接種(鋪板)

細胞過了30代以后就不要用了,因為狀態不好了;培養板要用好的（最好進口板），不好的板或重復利用的板只可做預實驗。接種時最好按照預實驗摸索出的密度接種, 因為細胞密度在10000/ml左右時，所測得的OD值的區間即細胞抑制率（或者增值率）的所呈現的線性關系最好，結果最可信。如果鋪的太稀細胞的殺傷不會很明顯，太密細胞可能都會凋亡，因為細胞長的太快營養會不夠，最后導致死亡。且而細胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關系不佳。故而MTT細胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。

細胞密度要根據不同細胞的特點來定.如果你做的藥品對細胞具有刺激作用那么取小點的細胞濃度，如果你做的藥品對細胞具有抑制作用那么取大點的細胞濃度，這樣與對照的區別更明顯，數據更好。懸浮細胞每孔的細胞數可達到105,貼壁細胞可為103-104.（五）加入MTT

個人認為MTT最關鍵的是你的細胞數目和你加入真正起作用的的MTT的適當比例，具體細胞數目和真正起作用的的MTT之間的關系確實不好確定，我認為MTT多加一些比少加好一些 MTT的量各家報道不同，一般是過量的，所以10ul即夠了。如果不使用96孔板，培養基超過100ul，MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振蕩一下讓MTT與培養基混勻，不過這個應該關系不大。

如加入MTT后都有個別孔立即變為藍黑色，則污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的。因為血清中白蛋白對大部分的藥物都有結合效應，所以可以單獨將藥物和MTT加在一起，看會不會起反應。如果不起反應，就不用去除含藥物的培液，直接加MTT即可。首先說說我的一點經驗：

1.吹打時懸液總量不能太多，達到吸管吸液量的3到4倍，可能比較容易混勻。10ml的離心管里面最好裝3~4ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太多又不容易吹成單細胞懸液。。2.吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量過多的話，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過少，吹打的力度就不夠，吹打就會不均勻。如果是吸液量1ml多的吸管，總液量在5ml左右為益

3.吸的時候要在懸液底部，然后提起來一點，但是吹下去的時候不要離開液面，否則容易吹打出氣泡。

4.吹打次數100左右，就可以吹打均勻了（有人認為加細胞前吹打30－50次基本就差不多均勻了。加細胞的時候每接種2孔反復吹打3次，每吹打3次后槍頭垂懸與細胞懸液中5秒鐘，然后再以一定的速度吸取懸液。）

5.向每孔中用槍頭加入細胞時不要太快，否則你會發現細胞在加入的瞬間會由于槍頭的沖力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周邊很少，這種不均勻的分散會產生接觸抑制，影響細胞的生長。所以速度不能太快也不能太慢。我習慣每塊板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回復3下移動，目的是使得細胞能分散的均勻些。（鋪板技術是MTT實驗的關鍵，也是基礎，一定要練好。曾經有同學用漩渦振蕩器混勻細胞，最后細胞全死了，建議不要采用這種方法混勻細胞。其它的聲音：

1.首先細胞的接種密度一定不能過大，一般每孔1000個左右就夠了，我認為寧少勿多。尤其是對于腫瘤細胞。10000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現不出的，最佳點板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會很大。

2.MTT本身就是比較粗的實驗，增殖率10%左右的波動都不算奇怪。特別是新手，20％的波動也是常見的，所以很可能是技術原因引起的，特別是種板技術一定要過關。

3.我做的是腫瘤細胞的MTT實驗,這種細胞長的很快一開始我是用100000/ML的濃度來接種的,結果細胞長的太滿結果是沒有梯度也沒有線性關系.后來調整濃度,用過40000~80000/ML的濃度都做過MTT實驗,結果發現做的結果比較好點的是60000~70000/ML的濃度組的.用40000/M的濃度的組,由于細胞少,藥物作用的梯度還是有,只是沒有很好的線性關系.還有根據細胞生長速度以及藥物的特性(有時間依賴性和濃度依賴性的藥物)來確定培養時間是48小時還是72小時.注意細胞懸液一定要混勻，已避免細胞沉淀下來，導致每孔中的細胞數量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多，但是如果操作不熟，CV會在8%左右。另外，吹散次數過多也會影響細胞活力。所以要熟練些、快些上板。

第二篇：有機溶劑毒性總結

有機溶劑毒性總結 1.有機溶劑之毒性

人若長時間吸入有機溶劑之蒸氣將會引起慢性中毒的現象，但短時間暴露高濃度有機溶劑蒸氣之下，也會有急性中毒致命的危險。在工業衛生上，有機溶劑對人體之危害與溶劑的揮發性具有密切的關系。在常溫下，低揮發性溶劑在空氣中不易造成危險。其他對人體危害有關系者尚有溶劑之脂溶性，反應性、含雜質情形、人體吸收之方式及途徑、人體之代謝速率、累積情形、個體感受及敏感性、暴露時間之長短等。

2.對人體危害之途徑

(1)經由皮膚接觸引起之危害：

有機溶劑蒸氣會刺激眼睛粘膜而使人流淚；與皮膚接觸會溶解皮膚油脂而滲入組織，干擾生理機能、脫水；且因皮膚干裂而感染污物及細菌。表皮膚角質溶解引起表皮角質化，刺激表皮引起紅腫及氣泡部份。溶劑滲入人體內破壞血球及骨髓等。(2)經由呼吸器官引起之危害：

有機溶劑蒸氣經由呼吸器官吸入人體后，人往往會產生麻醉作用。蒸氣吸入后大部份經企管而達肺部，然后經血液或淋巴液傳送至其他器官，造成不同程度之中毒現象。因人體肺泡面積為體表面積數十倍以上，且血液循環擴散速率甚快，常會對呼吸道、神經系統、肺、腎、血液及造血系統產生重大毒害，固有機溶劑經由呼吸器官引起之中毒現象，最受人重視。(3)經由消化器官引起之危害：

有機溶劑經由消化企管主要引起之原因，為在污染溶劑蒸氣場所進食、抽煙或手指沾口等，其引起之危害，首先受害為口腔，進入食道及胃腸，引起惡心、嘔吐現象，然后在由消化系統，危害到其他器官。

3.對人體危害之生理作用

有機溶劑中毒之一般癥狀為頭痛、疲怠、食欲不振、頭昏等。高濃度之急性中毒抑制中樞神經系統，使人喪失意識，而產生麻醉現象，初期引起興奮、昏睡、頭痛、目眩、疲怠趕、食欲不振、意識消失等；低濃度蒸氣引起之慢性中毒則影響血小板、紅血球等造血系統，鼻孔、齒齦及皮下組織出血，造CHENGREN體貧血現象。一般有機溶劑對人體危害生理之影響有下列幾種：(1)對神經系統破壞：

因抑制神經系統的傳導沖動功能，產生麻醉，神經系統障礙或引起神經炎等。如二硫化碳引起的神經炎；甲醇中毒影響視神經等。此類溶劑尚有酒精、苯、氯化乙醇、二氯乙烷、汽油、甲酸戊酯、醋酸戊酯、二甲苯、三氯乙烯、丁醇、松節油、煤油、丙酮、酚、三氯甲烷、異丙苯等。

(2)對肝臟機能損傷：

因損傷肝臟機能，引起惡心、嘔吐、發燒、黃疸炎及中毒性肝炎；一般氯化烴類均會引起肝臟中毒現象。此類溶劑有四氯化碳、氯仿、三氯乙烯、四氯乙烷、苯及其衍生物等。(3)對腎臟機能破壞： 腎臟為毒物排泄器官，故最易中毒，且因血氧量減少，亦足以使腎臟受害，發生腎炎及腎病。此類溶劑包括烴類之鹵化物、苯及其衍生物、二元醇及其單醚類、四氯化碳、乙醇等。(4)對造血系統破壞：

因破壞骨髓造成貧血現象。此類溶劑包括苯及其衍生物如甲苯、氯化苯、二元醇等。(5)對粘膜及皮膚刺激：

因刺激粘膜，使鼻粘膜出血，喉頭發炎，嗅覺喪失或因皮膚敏感產生紅腫、發癢、紅斑及壞疽病等。此類溶劑包括氯仿、三氯甲烷、醚、苯、醋酸甲酯、煤油、丙酮、甲醇、石油、氯酚、二氯乙烯、四氯化碳等。

溶劑名稱沸點（1ATM）溶解性毒性

液氨 33.35℃特殊溶解性：能溶解堿金屬和堿土金屬劇毒性、腐蝕性

液態二氧化硫 10.08 溶解胺、醚、醇苯酚、有機酸、芳香烴、溴、二硫化碳，多數飽和烴不溶劇毒

甲胺 6.3 是多數有機物和無機物的優良溶劑，液態甲胺與水、醚、苯、丙酮、低級醇混溶，其鹽酸鹽易溶于水，不溶于醇、醚、酮、氯仿、乙酸乙酯中等毒性，易燃

二甲胺 7.4 是有機物和無機物的優良溶劑，溶于水、低級醇、醚、低極性溶劑強烈刺激性 石油醚不溶于水，與丙酮、乙醚、乙酸乙酯、苯、氯仿及甲醇以上高級醇混溶與低級烷相似 乙醚 34.6 微溶于水，易溶與鹽酸.與醇、醚、石油醚、苯、氯仿等多數有機溶劑混溶麻醉性 戊烷 36.1 與乙醇、乙醚等多數有機溶劑混溶低毒性

二氯甲烷 39.75 與醇、醚、氯仿、苯、二硫化碳等有機溶劑混溶低毒，麻醉性強 二硫化碳 46.23 微溶與水，與多種有機溶劑混溶麻醉性，強刺激性 溶劑石油腦與乙醇、丙酮、戊醇混溶較其他石油系溶劑大

丙酮 56.12 與水、醇、醚、烴混溶低毒，類乙醇，但刺激性較大 溶劑名稱沸點（1ATM）溶解性毒性

1，1-二氯乙烷 57.28 與醇、醚等大多數有機溶劑混溶低毒、局部刺激性

氯仿 61.15 與乙醇、乙醚、石油醚、鹵代烴、四氯化碳、二硫化碳等混溶中等毒性，強麻醉性

甲醇 64.5 與水、乙醚、醇、酯、鹵代烴、苯、酮混溶中等毒性，麻醉性

四氫呋喃 66 優良溶劑，與水混溶，很好的溶解乙醇、乙醚、脂肪烴、芳香烴、氯化烴吸入微毒，經口低毒

己烷 68.7 甲醇部分溶解，比乙醇高的醇、醚丙酮、氯仿混溶低毒。麻醉性，刺激性

三氟代乙酸 71.78 與水乙醇、乙醚、丙酮苯、四氯化碳、己烷混溶,溶解多種脂肪族、芳香族化合物

1，1，1-三氯乙烷 74.0 與丙酮、、甲醇、乙醚、苯、四氯化碳等有機溶劑混溶低毒類溶劑 四氯化碳 76.75 與醇、醚、石油醚、石油腦、冰醋酸、二硫化碳、氯代烴混溶氯代甲烷中毒性最強

乙酸乙酯 77.112 與醇、醚、氯仿、丙酮、苯等大多數有機溶劑溶解，能溶解某些金屬鹽低毒，麻醉性

乙醇 78.3 與水、乙醚、氯仿、酯、烴類衍生物等有機溶劑混溶微毒類，麻醉性 丁酮 79.64 與丙酮相似，與醇、醚、苯等大多數有機溶劑混溶低毒，毒性強于丙酮 苯 80.10 難溶于水，與甘油、乙二醇、乙醇、氯仿、乙醚、、四氯化碳、二硫化碳、丙酮、甲苯、二甲苯、冰醋酸、脂肪烴等大多有機物混溶強烈毒性

環己烷 80.72 與乙醇、高級醇、醚、丙酮、烴、氯代烴、高級脂肪酸、胺類混溶低毒，中樞抑制作用

乙睛 81.60 與水、甲醇、乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酮、醚、氯仿、四氯化碳、氯乙烯及各種不飽和烴混溶，但是不與飽和烴混溶中等毒性，大量吸入蒸氣，引起急性中毒 異丙醇 82.40 與乙醇、乙醚、氯仿、水混溶微毒，類似乙醇 1，2-二氯乙烷 83.48 與乙醇、乙醚、氯仿、四氯化碳等多種有機溶劑混溶高毒性、致癌 乙二醇二甲醚 85.2 溶于水，與醇、醚、酮、酯、烴、氯代烴等多種有機溶劑混溶。能溶解各種樹脂，還是二氧化硫、氯代甲烷、乙烯等氣體的優良溶劑吸入和經口低毒

三氯乙烯 87.19 不溶于水，與乙醇.乙醚、丙酮、苯、乙酸乙酯、脂肪族氯代烴、汽油混溶有機有毒品

三乙胺 89.6 水:18.7以下混溶，以上微溶。易溶于氯仿、丙酮，溶于乙醇、乙醚易爆，皮膚黏膜刺激性強

丙睛 97.35 溶解醇、醚、DMF、乙二胺等有機物，與多種金屬鹽形成加成有機物高毒性，與氫氰酸相似

溶劑名稱沸點（1ATM）溶解性毒性

庚烷 98.4 與己烷類似低毒，刺激性、麻醉性 水 100 略略

硝基甲烷 101.2 與醇、醚、四氯化碳、DMF、等混溶麻醉性，刺激性

1，4-二氧六環 101.32 能與水及多數有機溶劑混溶，仍溶解能力很強微毒，強于乙醚2~3倍

甲苯 110.63 不溶于水與甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙醚、冰醋酸、苯等有機溶劑混溶低毒類，麻醉作用

硝基乙烷 114.0 與醇、醚、氯仿混溶，溶解多種樹脂和纖維素衍生物局部刺激性較強

吡啶 115.3 與水、醇、醚、石油醚、苯、油類混溶。能溶多種有機物和無機物低毒，皮膚黏膜刺激性

4-甲基-2-戊酮 115.9 能與乙醇、乙醚、苯等大多數有機溶劑和動植物油相混溶毒性和局部刺激性較強

乙二胺 117.26 溶于水、乙醇、苯和乙醚，微溶于庚烷刺激皮膚、眼睛 丁醇 117.7 與醇、醚、苯混溶低毒，大于乙醇3倍 乙酸 118.1 與水、乙醇、乙醚、四氯化碳混溶不溶于二硫化碳及C12以上高級脂肪烴低毒，濃溶液毒性強

乙二醇一甲醚 124.6 與水、醛、醚、苯、乙二醇、丙酮、四氯化碳、DMF等混溶低毒類 辛烷 125.67 幾乎不溶于水，微溶于乙醇，與醚、丙酮、石油醚、苯、氯仿、汽油混溶低毒性，麻醉性

乙酸丁酯 126.11 優良有機溶劑，廣泛應用于醫藥行業，還可以用做萃取劑一般條件毒性不大

嗎啉 128.94 溶解能力強，超過二氧六環、苯、和吡啶，與水混溶，溶解丙酮、苯、乙醚、甲醇、乙醇、乙二醇、2己酮、蓖麻油、松節油、松脂等腐蝕皮膚，刺激眼和結膜，蒸汽引起肝腎病變

氯苯 131.69 能與醇、醚、脂肪烴、芳香烴、和有機氯化物等多種有機溶劑混溶 低于苯，損害中樞系統

乙二醇一乙醚 135.6 與乙二醇一甲醚相似，但是極性小，與水、醇、醚、四氯化碳、丙酮混溶低毒類，二級易燃液體

對二甲苯 138.35 不溶于水，與醇、醚和其他有機溶劑混溶一級易燃液體

二甲苯 138.5~141.5 不溶于水，與乙醇、乙醚、苯、烴等有機溶劑混溶，乙二醇、甲醇、2氯乙醇等極性溶劑部分溶解一級易燃液體，低毒類

間二甲苯 139.10 不溶于水，與醇、醚、氯仿混溶，室溫下溶解乙睛、DMF等一級易燃液體 醋酸酐 140.0 鄰二甲苯 144.41 不溶于水，與乙醇、乙醚、氯仿等混溶一級易燃液體 溶劑名稱沸點（1ATM）溶解性毒性

N，N-二甲基甲酰胺 153.0 與水、醇、醚、酮、不飽和烴、芳香烴烴等混溶，溶解能力強低毒

環己酮 155.65 與甲醇、乙醇、苯、丙酮、己烷、乙醚、硝基苯、石油腦、二甲苯、乙二醇、乙酸異戊酯、二乙胺及其他多種有機溶劑混溶低毒類，有麻醉性，中毒幾率比較小

環己醇 161 與醇、醚、二硫化碳、丙酮、氯仿、苯、脂肪烴、芳香烴、鹵代烴混溶低毒無血液毒性刺激性

N，N-二甲基乙酰胺 166.1 溶解不飽和脂肪烴，與水、醚、酯、酮、芳香族化合物混溶微毒類

糠醛 161.8 與醇、醚、氯仿、丙酮、苯等混溶部分溶解低沸點脂肪烴，無機物一般不溶有毒品，刺激眼睛，催淚

N-甲基甲酰胺 180~185 與苯混溶，溶于水和醇，不溶于醚一級易燃液體

第三篇：細胞增殖與毒性檢測實驗方法及經驗總結

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細胞增殖與毒性檢測實驗方法及經驗總結-CCK-8 法

實驗原理：Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

一、用途：

藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗等。

二、優點：

1.使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑； 2.CCK-8法能快速檢測；

3.CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細胞密度； 4.CCK-8法的重復性優于MTT 法，MTT 實驗生成的formazan不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機溶劑溶解；

5.而本方法產生的formazan是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差；

6.CCK-8法對細胞毒性小，可以多次測定選取最佳測定時間，與MTT 方法相比線性范圍更寬，靈敏度更高；

7.CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預制，即開即用。

三、所需設備及儀器：

1.10ul，100-200ul及多通道移液器 2.酶標儀（帶有450nm濾光片）3.96孔培養板

4.二氧化碳培養箱

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四、方法及步驟：

實驗一：細胞增殖分析

1、制備細胞懸液：細胞計數。

2、接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數（約1-2×104），每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做4-6個重復。3、37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議將槍頭浸入培養液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。或者直接配置含10%CCK8的培養基（現用現配），以換液的形式加入。

5、培養0.5-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認最佳條件（建議預實驗先摸清楚時間點）。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。

6、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

實驗二：細胞毒性分析

1、制備細胞懸液：細胞計數

2、接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數（約≥5×104），每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做4-6個重復。3、37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入不同濃度的毒性物質。5、37℃培養箱中培養：加入毒性物質的培養時間，要看毒性物質的性質和細胞的敏感性，一般要根據細胞周期來決定，起碼要一代以上的時間（例如：6、12、24、48、60、72小時）。

6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議將槍頭浸入培養液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。

7、培養0.5-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。

8、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

五、實驗注意事項：

·若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發生變化。

·如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。

·當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔(100 μl 培養基)。檢 一站式科研技術服務商—武漢金開瑞生物www.tmdps.cn

測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔(100 μl 培養基)。

·酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

· CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細胞。在細胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細菌污染，以免影響結果。

· CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。

·當在培養箱內培養時，培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔加培養基或者PBS，不作為測定孔用。

·在培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗時，還應考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。

·金屬對CCK-8顯色有影響：當終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話，將會100%抑制。

·懸浮細胞由于染色比較困難，一般需要增加細胞數量和延長培養時間。

·加入CCK-8 時，如果細胞培養時間較長，培養基顏色或pH 值已變化，建議換用新鮮的培養基。

·用酶標儀檢測前需確保每個孔內沒有氣泡，否則會干擾測定，且要擦拭干凈樣品板了。

六、經驗總結及分享：

CCK8的說明書大家一定要認真閱讀，里面很多細節的問題都有提到。而且說明書里提供的一些關于各種細胞的種板數都很有參考價值，因為那是反復驗證過的最佳數值。但無論如何，做這個試驗一定要摸條件。你就算再懶，這個懶不得，否則你都只是在做無用功。以下言論全部以細胞毒性試驗為前提，如果你做的是促進細胞生長的藥物的藥效實驗那就另當別論了。

摸條件包括

1、種板數；

2、種板后細胞的貼壁生長時間；

3、加藥后的孵育時間；

4、cck8試劑加入量；

5、cck8試劑加入后細胞孵育時間。看起來很多，其實這就是一個實驗。而且都是種的空白板，也就是不加藥物，只加細胞和CCK8。

1、種板數：這個要查文獻，看你所用細胞別人有無做過，把范圍大致找出。記住還要參考說明書，這個很重要。然后稀釋一系列濃度種板。首先你要觀察多長時間細胞可貼壁完全，一般貼壁生長24小時。然后還有在你的實驗時間內，不同細胞數下孔內生長情況。比如我擬定考察4天的時間，那么在4天內，細胞是剛好鋪滿還是堆積生長？因為每塊板都會設置對照孔，也就是含有細胞的培養基+CCK8，這個數值是板上的最大數值，CCK8試驗最佳OD 一站式科研技術服務商—武漢金開瑞生物www.tmdps.cn

值在1.0附近，所以這個最大數值最好能控制在1.0左右。我的實驗經驗是不要讓細胞長滿，一旦長滿了很難去判斷是否堆積生長了，對藥物能否順利進入細胞有影響此為其一，其二生長不均勻易導致孔間OD值數據偏差大，而且OD值也很大。

2、貼壁生長的時間我一般就直接讓它貼壁長24h了，這個時間細胞已經貼壁完全，而且這樣設置時間對自己安排實驗時間也方便。沒人愿意大半夜爬起來做實驗吧。

3、加藥后的孵育時間，我的實驗摸了3個時間，24h，48h，72h。然后根據數據的穩定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來選擇最好的時間。太長了就沒有必要了，細胞呆在孔里幾天不換液結果可想而知了。

4、CCK8試劑加入量，說明書中明確寫出建議加入量為培養基體積的10%。這里有一個問題：假設我要孔內是200微升的體系，即細胞懸液+藥液+CCK8=200微升呢，還是細胞懸液+藥液=200微升，cck8不算在體系內呢。關于這一點文獻報道不一致。本人最終采用的是后者。

5、cck8試劑加入后孵育時間，隨著時間的增加，OD值就會增大。總之原則就是把OD值控制在1.0左右。這里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。

再說一下關于種板設置問題。眾所周知周圍一圈孔因為邊緣效應都是不用來做實驗的。一般每組樣品我會設置6個復孔，得到的OD值去掉最大值與最小值，其余取平均值。我用的是排槍，會省很多力氣，但是也會增大組內誤差。這個只有通過校正移液槍和選用最適槍頭了。

做這個實驗我想大家遇到的最大問題應該是數據不穩定，組內數據偏差大。講了很多怎樣摸條件，其實就一個原則，把OD值控制在1.0左右。數據不穩定也只能通過增大樣品數，借助數據處理來彌補。還有實驗操作一定要仔細小心，盡量平行操作。

補充

突然想起用酶標儀檢測的時候還有一些細節問題。比如孔里不能有氣泡，如果有氣泡，就用吸耳球吹掉，氣泡會很影響檢測結果。樣品板要擦拭干凈，當然了，蓋子一定要記得拿掉啊Big Smile補充說明：這幾天有同學提出了一個問題，這個問題非常好也非常關鍵：將OD值控制在1.0這個說法是否有依據？

這里我還是想提醒大家一定要認真閱讀試劑盒的說明書，試想一個試劑盒的上市并且作為技術手段得到認可需要經過多少試驗反復驗證。我購買的是同仁化學研究所的CCK8試劑盒，說明書的P7Q23：OD值在什么范圍比較合適？答：一般情況下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比較好。

再說到自己的實驗設計，酶標儀的原理其實和紫外分光光度計是一樣的，所以UV上很多減小誤差的注意事項在酶標儀上同樣受用。這就能夠理解為什么不能有氣泡，為什么要擦拭干凈樣品板了。再者熟悉UV原理的同學會了解利用紫外檢測有一個最佳檢測范圍，超過了這個范圍，數值就會呈現出不穩定，無規律。（大家可以把自己的數據統計分析看看是不是數值控制在1.0附近更穩定。）而更有甚者就是超出了儀器的檢測范圍，儀器讀數為—。一站式科研技術服務商—武漢金開瑞生物www.tmdps.cn

我在摸條件的時候，cck8加入2.0h后檢測就出現過酶標儀讀不出數據的情況。

第四篇：LDH乳酸脫氫酶細胞毒性檢測實驗方法

LDH乳酸脫氫酶細胞毒性檢測

LDH釋放檢測

方法：

a.根據細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96孔細胞培養板中，使待檢測時細胞密度不超過80-90%滿。

b.吸去培養液，用PBS液洗滌一次。換新鮮培養液(推薦使用含1%血清的低血清培養液或適當的無血清培養液)，將各培養孔分成如下幾組：包括無細胞的培養液孔(背景空白對照孔)，未經藥物處理的對照細胞孔(樣品對照孔)，未經藥物處理的用于后續裂解的細胞孔(樣品最大酶活性對照孔)，以及藥物處理的細胞孔(藥物處理樣品孔)，并做好標記。按照實驗需要給予適當藥物處理(如加入0-10μl左右特定的藥物刺激，可設置不同濃度，不同處理時間，對照孔中需加入適當的藥物溶劑對照)，繼續按常規培養。到預定的檢測時間點前1小時，從細胞培養箱里取出細胞培養板，在“樣品最大酶活性對照孔”中加入試劑盒提供的LDH釋放試劑，加入量為原有培養液體積的10%。加入LDH釋放試劑后，反復吹打數次混勻，然后繼續在細胞培養箱中孵育。

c.到達預定時間后，將細胞培養板用多孔板離心機400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應孔中，隨即進行樣品測定。

準備工作：

a.INT溶液(1X)的配置：根據所需的INT溶液(1X)的量，取適量INT溶液(10X)用INT稀釋液稀釋至1X。例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT稀釋液，混勻后即配置為200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜現配現用，配置后4℃保存可于當天使用，不宜配置后凍存。

b.LDH檢測工作液的配制: 根據待測定的樣品數(含對照)，參考下表在臨檢測前新鮮配制適量的檢測工作液。注意：LDH檢測工作液必須現配現用，配制和使用過程中均要注意適當避光。樣品測定:

a.各孔分別加入60μl LDH檢測工作液。

b.混勻，室溫(約25℃)避光孵育30min(可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側擺搖床上緩慢搖動)。然后在490nm處測定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波長作為參考波長進行雙波長測定。c.計算(測得的各組吸光度均應減去背景空白對照孔吸光度)

細胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度－樣品對照孔吸光度)/(細胞最大酶活性的吸光度－樣品對照孔吸光度)×100

d.可繪制細胞毒性曲線：縱座標為實際吸光度，橫坐標為藥物濃度；據此可計算該藥物作用特定時間的半致死劑量LD50。

第五篇：細胞凋亡總結

細胞凋亡 凋亡（apoptosis）一般是指機體細胞在發育過程中或在某些因素作用下，通過細胞內基因及其產物的調控而發生的一種程序性細胞死亡(programmed cell death)。一般表現為單個細胞的死亡，且不伴有炎癥反應。

1．細胞凋亡的意義 細胞凋亡普遍存在于生物界，既發生于生理狀態下，也發生于病理狀態下。由于細胞凋亡對胚胎發育及形態發生（morphogenesis）、組織內正常細胞群的穩定、機體的防御和免疫反應、疾病或中毒時引起的細胞損傷、老化、腫瘤的發生進展起著重要作用，并具有潛在的治療意義，至今仍是生物醫學研究的熱點。細胞凋亡過多可引起疾病發生，如：①愛滋病的發展過程中，CD4+T細胞數目的減少；②移植排斥反應中，細胞毒性T細胞介導的細胞死亡；③缺血及再灌注損傷，導致心肌細胞和神經細胞的凋亡增多；④神經系統退化性疾病（Alzheimer病、Parkinson's病）的重要原因是細胞凋亡的異常增加。神經細胞的凋亡參與老化及Alzheimer病的發生。Alzheimer氏病是一種常見的老年病，患者在臨床上表現為進行性的智力減退。⑤暴露于電離輻射可引起多種組織細胞的凋亡。細胞凋亡過少也可引起疾病發生：在腫瘤的發生過程中，誘導凋亡的基因如p53等失活、突變，而抑制凋亡的基因如bCL-2等過度表達，都會引起細胞凋亡顯著減少，在腫瘤發病學中具有重要意義；針對自身抗原的淋巴細胞的凋亡障礙可導致自身免疫性疾病；某些病毒能抑制其感染細胞的凋亡而使病毒存活。

2．細胞凋亡的形態變化 電鏡下細胞凋亡的形態學變化是多階段的，可分為 ①細胞漿濃縮，核糖體、線粒體等聚集，細胞體積縮小，結構更加緊密； ②染色質逐漸凝聚成新月狀附于核膜周邊，嗜堿性增強。細胞核固縮呈均一的致密物，進而斷裂為大小不一的片段：

③胞膜不斷出芽、脫落，細胞變成數個大小不等的由胞膜包裹的凋亡小體(apoptotic bodies)。凋亡小體內可含細胞漿、細胞器和核碎片，有的不含核碎片；④凋亡小體被具有吞噬功能的細胞如巨噬細胞、上皮細胞等吞噬、降解： ⑤凋亡發生過程中，細胞膜保持完整，細胞內容物不釋放出來，所以不引起炎癥反應。左圖 典型凋亡小體：染色質呈新月狀，并可見細胞器 右圖 凋亡細胞：凋亡細胞(↑)與鄰近細胞分離 細胞凋亡 光鏡下凋亡一般累及單個或少數幾個細胞，凋亡細胞呈圓形，胞漿紅染，細胞核染色質聚集成團塊狀。由于凋亡細胞迅速被吞噬，又無炎癥反應，因此，在常規切片檢查時，一般不易發現，但在某些組織如反應性增生的次級淋巴濾泡生發中心則易見到。病毒性肝炎時，嗜酸性小體形成即是細胞凋亡。

3．細胞凋亡的機制 細胞凋亡是一系列依賴能量的分子水平變化的終點，細胞凋亡過程包括以下4個階段，即：誘導啟動、細胞內調控、實施和凋亡細胞的吞噬搬運階段。

（1）誘導啟動 引起凋亡的信號可以來自細胞外，通過跨膜傳導對細胞內的調控分子起作用；也可以直接作用于細胞內的靶分子。一些跨膜作用的抑制因子(如生長因子、某些激素、細胞因子、某些病毒蛋白等)具有抑制凋亡的作用，有利于細胞的生存。當這些因子缺乏時，會激發細胞凋亡。另外一些跨膜作用的刺激因子通過受體與配體的結合而激活細胞凋亡程序，其中最重要的是腫瘤壞死因子受體家族。此外，尚有多種其它凋亡誘導因子。在胚胎發育過程中，形態發生蛋白、生長因子、分化因子對細胞凋亡可起促進作用，又可起抑制作用。

（2）細胞內調控 細胞內的某些特異蛋白與細胞死亡信號相連接，這些特異蛋白對細胞的死亡與否起決定作用。BCL-2蛋白家族(BCL-2 family of proteins)是調節線粒體通透性的主要成分，通過形成同源(BCL-2/BCL-2, Bax/Bax)和異源(BCL-2/Bax)二聚體對細胞凋亡進行調控。BCL-2同源二聚體抑制細胞凋亡，Bax同源二聚體促進細胞凋亡。此外，細胞表面受體Fas(CD95)，屬TNFR家族，當免疫細胞產生的Fas的配體與T細胞表面的Fas結合時，也啟動了死亡程序。這種Fas-Fas配體介導的凋亡在清除免疫反應(如自身免疫病)中被激活的淋巴細胞非常重要。細胞凋亡后的梯狀DNA 足葉乙甙誘導白血病細胞凋亡后的梯狀DNA

（3）凋亡的實施 細胞凋亡的實施是通過蛋白水解的一系列連鎖反應實現的。各種組織的細胞凋亡都要激活caspase家族。Caspase成員作為酶原的形式存在于細胞內，經裂解激活后，迅速啟動序列性酶解死亡程序，裂解細胞骨架和細胞核蛋白基質并激活了核酸內切酶。在內源性核酸內切酶作用下，DNA進行有控降解，產生長度為180～200 bp整倍數的DNA片段，這正好是纏繞組蛋白多聚體的長度，提示染色質DNA恰好是在核小體與核小體連接部被切斷。DNA瓊脂糖凝膠電泳出現ladder也成為檢測凋亡發生的重要標志。

（4）凋亡細胞的吞噬搬運 凋亡細胞碎片的表面有標志分子(血小板反應素、粘附糖蛋白)有利于臨近的巨噬細胞以及其他細胞的識別、吞噬和處理。凋亡細胞的吞噬搬運過程非常有效而迅速，凋亡細胞很快消失，不留痕跡，也無炎癥反應。

4．細胞凋亡與壞死的區別 凋亡 壞死

1機制 基因調控的程序化（programmed）細胞死亡，主動進行（自殺性）意外事故性（accident）細胞死亡，被動進行（他殺性）

2誘因 生理性或輕微病理性刺激因子誘導發生，如生長因子缺乏 病理性刺激因子誘導發生，如缺氧、感染、中毒 死亡范圍 多為散在的單個細胞 多為聚集的大片細胞

3形態特征 細胞固縮，核染色質邊集，細胞膜及各細胞器膜完整，膜可發泡成芽，形成凋亡小體 細胞腫脹，核染色質絮狀或邊集，細胞膜及各細胞器膜溶解破壞，溶酶體酶釋放，細胞自溶

4生化特征 耗能的主動過程，有新蛋白合成，DNA早期規律降解為180-200bp片段，瓊脂凝膠電泳呈特征性梯帶狀 不耗能的被動過程，無新蛋白合成，DNA降解不規律，片段大小不一，瓊脂凝膠電泳不呈梯帶狀

5周圍反應 不引起周圍組織炎癥反應和修復再生，但凋亡小體可被鄰近細胞吞噬 引起周圍組織炎癥反應和修復再生

細胞自噬

細胞自噬的生理功能

1及時清除細胞中隨時產生的“垃圾”（如破損或衰老的細胞器、長壽命蛋白質、合成錯誤或折疊錯誤的蛋白質等），2維持細胞自穩狀態.無論是腫瘤細胞還是正常細胞，保持一種基礎、低水平的自噬活性是至關重要的

3.同時，自噬的產物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物質，又可為細胞提供一定的能量和合成底物.可以說，細胞自噬就是一個“備用倉庫”.鑒于上述作用，在正常生理情況下，細胞自噬可以幫助細胞在缺乏營養的惡劣環境中生存.自噬也可為腫瘤細胞帶來幾大好處：

（1）首先，腫瘤細胞本身就具有高代謝的特點，對營養和能量的需求比正常細胞更高，但腫瘤微環境往往不能如意，如腫瘤發生初始期到血管發生之前、腫瘤長大發生血管崩塌時、腫瘤細胞脫離原發灶游走時等都會出現營養不足或供應中斷，而此時提高自噬活性可以有助于度過這一危機

（2）（2）當化療、放療后，腫瘤細胞會產生大量的破損細胞器、損壞的蛋白質等有害成分，此時提高自噬活性可及時清除這些有害物質，并提供應急的底物和能量為修復受損DNA贏得時間和條件.(3)另外，抑制細胞自噬可以導致細胞更容易發生凋亡，然而，細胞自噬在腫瘤的生成和癌癥的發展中到底扮演怎樣的角色，目前還沒有取得廣泛一致的意見.細胞自噬可以抑制細胞發生癌變，可能產生于以下幾種機制

(1)細胞自噬的抑制會加重壞死細胞的局部炎癥反應，從而導致腫瘤的生長(2)而細胞自噬可以清除壞死的細胞器，調整內源性的壓力，從而穩定基因組,減少細胞向癌細胞的轉變.(3)細胞自噬既可以加強細胞檢驗點的檢查作用，又起到了穩定基因組的作用，從而減少了細胞的癌變