第一篇：細胞裂解實驗方法總結

細胞裂解是改變細胞通透性和活性的重要實驗方法。主要分為化學法和機械法，前者比較溫和，后者雖然產量高，但反應更劇烈，很有可能造成細胞中的DNA斷裂。本文主要是介紹細胞的裂解方法以及實驗過程中的方法探討。

裂解方法包括化學裂解、酶裂解和機械裂解。化學裂解和酶裂解通常是比較溫和的方法，通常會很少使DNA 斷裂。這兩種方法(包括SDS 和溶菌酶處理等)提取純化DNA中常用的方法。機械裂解可以更均一的裂解細胞，同化學裂解相比，機械處理具有更高的裂解效率和更低的選擇性。機械處理可以更劇烈和全面的裂解細胞，但也會造成DNA 的斷裂。

一、機械裂解法主要有以下兩種：

1.熱休克(Thermal shock)，既反復凍溶法，是一種常用的機械裂解方式比，通常由冷凍和解凍兩部分組成(freezing and thawing)。原理：由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。冷凍通常在液氮或-20 ℃ 冰上進行，解凍可以在37、50、65 或100 ℃水浴中進熱休克比化學裂解溫和，但是很有效，有資料表明用熱休克和溶菌酶與SDS的方法獲得了90%的細胞裂解率。

2.超聲波處理(Ultrasonication)既利用超聲加熱的方法，把細胞破碎。但這種處理會導致DNA 的斷裂，所以加熱不宜過劇烈，要設定好超聲時間和間隙時間，一般超聲時間不超過5秒，間隙時間最好大于超聲時間，這些都有利于保護酶的活性。bead-beating 也是常用的機械處理方式，有報道指出bead-beating 比熱休克和化學裂解的細胞裂解效果更好雖然DNA產量較高，但通常得到的DNA片段較小。

二、化學裂解和酶裂解法(在提核酸時聯合使用)主要是裂解液處理法，細胞裂解液的主要目的有以下幾種：

（1）利用去污劑破壞脂質雙分子層，破裂細胞；

（2）溶解蛋白；

（3）蛋白變性使其穩定；

（4）抑制蛋白酶活性。

主要根據不同的目的，裂解液的組成有所不同，主要有提取核酸和蛋白兩中。在提取RNA或DNA時，我們主要是要充分裂解細胞，得到更多的核酸；如果我們的目的是蛋白，那要根據蛋白的位置、特性等因素考慮裂解液，在提取蛋白后，再根據實驗需要復性蛋白等。以下是細胞裂解中常用試劑和其作用： 50 mMTris-HCl pH 7.4(緩沖體系)，150 mMNaCl(等滲體系)，1 mM PMSF(強大的蛋白酶抑制劑)，1 mM EDTA(變性劑和穩定劑)，5 μg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制劑)，5 μg/ml Leupeptin(蛋白酶抑制劑)，1% Triton x-100(破壞細胞)，1% Sodium deoxycholate(中度變性劑和蛋白溶解劑)，0.1% SDS(強變性劑和蛋白溶解劑)。7M 尿素，2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解)，蛋白酶K等。細胞裂解時間把握問題：孔板里細胞用PBS洗2次后，加入細胞裂解液，然后去測總蛋白含量和酶的活力，不知道細胞要裂解到什么程度? 答：因為所用的細胞類型不一樣，所以實驗的條件也需要摸索，建議這樣來做：加入細胞裂解液后，不同時間取樣，以時間和總蛋白含量和酶的活力作曲線，這樣就可以找到裂解的最佳時間，僅供參考。

原核表達的細胞裂解問題：做原核表達，用BL21表達，之后如何裂解細胞才行呢?我的菌液只有300微升，說明書上用超聲裂解細胞，但沒給出具體做法，我們這只有大的探頭，不好做，有什么好的辦法么? 要是用超聲裂解，要怎么做才行?我是超聲15 s間隔10 s座4次。裂解不好，應該怎樣改呀?!答：請試一試IFCC推薦法： 1.收集細胞懸液

2.4 ℃ 低溫離心(3000 rpm，5min)3.棄上清，加入一定量PBS(200 ul)，輕輕吹打混勻，-20 ℃ 冷凍30 min，37 ℃ 解凍，如此反復3次，可形成細胞裂解液

三、western blot細胞裂解方法個人小結：

過些天準備做western blot，昨天就提前把細胞裂解了，提出蛋白來保存。一下是我做的方法，大家參考，可能有不正確的地方，希望大家指出來，謝謝!1.取一瓶細胞(100 ml的瓶子)，PBS洗2次，胰酶消化，加入10 ml 培養液，制備成細胞懸液；

2.將細胞懸液移入10 ml離心管中，4 ℃，2500 rpm，離心5 min；

3.棄上清，加入預冷的PBS(即4 ℃ 存放的PBS)于離心管中，吹打，4 ℃，2500 rpm，離心5min；棄上清，重復上述步驟一次；共洗細胞2次，充分洗掉培養液；

4.棄上清，加入200 ul細胞裂解液(每1 ml裂解液中加入10 ulPMSF)，置于冰上，裂解40 min～1 h；裂解過程中可用槍頭吹打或間斷搖動離心管，以使蛋白充分裂解； 5.取出離心管，于4 ℃，12000 rpm，離心5 min； 6.將上清移入EP管中，-20 ℃ 保存，即可。

注：本來應該在培養瓶或培養皿中裂解，但出于某種原因，我為節約細胞裂解液，故試著在離心管中裂解，不知道這樣裂解是否充分。但我想這種方法也是可以考慮的。

四、核蛋白裂解液配方與步驟： 1.核蛋白裂解液配方 Buffer A 10 mM HEPES 1.5 mM MgCl2 10 mMKCl 0.5 mM DTT，0.05% NP40(or 0.05% Igepal or Tergitol)pH 7.9 Buffer B 5 mM HEPES 1.5 mM MgCl2 0.2 mM EDTA 0.5 mM DTT 26% glycerol(v/v)，pH 7.9 2.核蛋白裂解操作步驟 Method 1.Prepare 1 ml of buffer A with added cocktail of usual inhibitors from frozen stock and store on ice.2.Add 500 μl of buffer a per large petri dish on ice and scrape thoroughly，leave on ice for 10 min.3.Centrifuge at 4 °C at 3000 rpm for 10 min.4.Remove supernatant and keep it(this will contain everything except large plasma membrane pieces，DNA，nucleoli)，extract out 10 μl for Bradford assay.5.On ice resuspend pellet in 374 μl of buffer B and add 26 μl of 4.6 M NaCl to give 300mM NaCl(high salt helps lyse membranes and forces DNA into solution).6.Homogenize with 20 full strokes in Dounce or glass homogenizer on ice.7.Leave on ice for 30 min.8.Centrifuge at 24，000 g for 20 min at 4 °C.9.Aliquot supernatant，remove 10 μl for Bradford assay and store at-70 °C.細胞裂解機制被廣泛應用于各類的生物實驗中，最突出的當屬WB。為達到最佳的實驗結果，需要注意的是所有的實驗步驟都需在四度以下進行，并且避免過多的反復凍融。而且整個實驗過程中記得戴手套。編輯： 嗚咽

第二篇：細胞凋亡實驗技術總結

細胞凋亡實驗技術總結 一形態學檢測

1、光學顯微鏡和倒置顯微鏡觀察法

未染色細胞:凋亡細胞體積變小、變形，膜完整但出現發泡現象，晚期出現凋亡小體。貼壁細胞出現皺縮，變圓，脫落。染色細胞:姬姆薩染色，瑞氏染色等。凋亡細胞染色質濃縮，邊緣化，核膜裂解，染色質分割成塊狀，形成凋亡小體。

2、熒光顯微鏡檢測法-熒光染料

例如，碘化丙啶(PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI 能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。選用536nm 激發光，細胞核呈紅色熒光。

3、電子顯微鏡

收集細胞，2.5%戊二醛4°C 固定24h，1%四氧化鋨后固定，丙酮梯度脫水，經包埋劑浸透后環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。凋亡Ⅰ期的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象的空泡結構。Ⅱa 期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。

4、激光掃描共焦顯微鏡技術

FITC-AnnexinV+PI雙染，觀察凋亡過程中細胞膜PS表面的變化，并區分正常細胞(An-PI-)，早期凋亡細胞(An+PI-)，晚期凋亡細胞及壞死細胞(An+PI+)，細胞收集過程中出現的損傷細胞(An-PI+)。

二、細胞凋亡的生化及分子生物學檢測

1、DNA 斷裂檢測法

如使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，細胞凋亡時，核染色質凝聚，染色質DNA 在核小體單位之間的連接處斷裂。凋亡早期可形成50~300kbp 的DNA 大片段，晚期核酸內切酶在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180~200bp 整數倍的寡核苷酸片段。

2、膜聯蛋白V 法

磷脂酰絲氨酸(PS)位于正常細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS 可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜表面。Annexin-Ⅴ(膜聯蛋白-V)是一種分子量為35-36KD 的Ca2+ 依賴性磷脂結合蛋白，與PS高親和力。將Annexin-Ⅴ進行熒光素或生物素標記，以標記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細胞凋亡的發生。

3、細胞凋亡的酶Caspase檢測

檢測Caspase活力可用免疫雜交技術分析酶原的加工和底物水解的產物，或用人工底物檢測酶活力，也可對活化的Caspase做親和標記。例如分析底物的水解產物，PARP(多聚ADP-核糖聚合酶)第一個被認識的caspase-3底物，它的相對分子質量為116000，水解后形成相對分子質量為85000 及相對分子質量為25000 的兩個片段，用抗相對分子質量為85000 片段的抗體檢測細胞是否發生凋亡。

4、線粒體膜勢能變化的檢測

線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結合到線粒體基質，其熒光的增強或減弱反映了線粒體內膜電負性的增高或降低流式細胞儀檢測細胞的熒光強度或熒光顯微鏡觀察，拍照正常細胞中, Rh123 能夠依賴線粒體跨膜電位進入線粒體基質，熒光強度減弱或消失。而凋亡時，線粒體膜完整性破壞，線粒體膜通透性轉運孔開放，引起線粒體跨膜電位的崩潰, Rh123 重新釋放出線粒體, 從而發出強黃綠色熒光。

第三篇：細胞凋亡檢測方法總結

1、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

PS轉移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為早期凋亡細胞，顯現（FITC+/PI-）。右上象限為獨立的核（FITC-/PI+）。

Annexin-V可以再鈣離子存在的情況下，和細胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸結合，而磷脂酰絲氨酸的外翻是細胞凋亡的早期事件。

PI是一種DNA染料，當細胞凋亡的晚期，細胞的細胞膜通透性增加，PI從而進入細胞核與DNA結合。

所以

Annexin-V陰性-PI陰性 代表正常細胞

Annexin-V陽性-PI陰性 代表凋亡早期的細胞

Annexin-V陽性-PI陽性 代表凋亡晚期的細胞或壞死的細胞

Annexin-V陰性-PI陽性 一般不存在這一群細胞，如果出現這一團細胞可能是PI標記時間過長，或者操作過于劇烈而傷害到原本正常的細胞。（還有一種說法是凋亡最后階段的細胞，細胞已經沒有細胞膜了說以不結合Annexin-V而只結合PI）

2.線粒體膜電位變化的檢測

實驗原理

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1 聚集在線粒體的基質(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產生紅色熒光（FL-2 通道）；在線粒體膜電位較低時，JC-1 不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1 為單體(monomer)，可以產生綠色熒光（FL-1 通道）。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。通過 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。

JC-1 單體的最大激發波長為 514nm，最大發射波長為 527nm；JC-1 聚合物(J-aggregates)的最大激發波長為 585nm，最大發射波長為 590nm。

A-C 為對照，細胞亞群(R1)在 FL-2和FL-1 通道同時顯示 JC-1 的熒光信號。D-F 顯示 JC-1在FL-2通道熒光信號降低的細胞亞群(R2)顯著增加，證明線粒體膜電位△Ψm 下降，細胞發生凋亡。凋亡與線粒體膜電位的去極化相關。細胞凋亡時線粒體膜電位發生去極化，JC-1進入線粒體以單體形式存在，僅在Fl-1通道有熒光。

檢測原理

正常細胞：JC-1聚集在線粒體內，形成多聚體，呈鮮紅色熒光，細胞質內有綠色；即紅光++，綠光++。

凋亡細胞：由于線粒體跨膜電位的破壞，不能聚集到線粒體內，紅色熒光減弱，單體的形式存在于胞質內發綠色熒光。即紅光+，綠光++

3、Caspase-3活性的檢測

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。

(1)Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚ADP-核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

(2)熒光分光光度計分析

檢測原理：活化的Caspsae與其特異性底物DEVD-pNA結合切割，釋放出游離pNA，通過測定其吸光度，根據其發光強度的高低代表其活化程度。

(3)流式細胞術分析

PharMingen 多克隆或單克隆 Caspase-3 抗體可以識別 Caspase-3 活化形式，它特異性識別由無活性的 Pro-Caspase-3 活化水解后的暴露的斷裂端, 熒光標記多克隆兔抗 Active-Caspase-3 抗體為流式細胞術分析凋亡細胞的 Caspase-3 而設計。1、2、3是早期凋亡現象；

4、5是晚期凋亡現象。

4、TUNEL法(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記)

細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。

5、DNA ladder 細胞凋亡晚期，核酸內切酶在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。細胞經處理后，采用常規方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。在瓊脂糖凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。壞死細胞---連續性條帶。

一、形態學觀察方法

1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有“出芽”現象。【蘇木精 — 伊紅染色法，(hematoxylin-eosin staining)，簡稱HE染色法。蘇木精染液為堿性，主要使細胞核內的染色質與胞質內的核糖體著紫藍色 ；伊紅為酸性染料，主要使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色。】

2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。

3、臺盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性，區別壞死細胞有一定的幫助。

4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。

一、細胞凋亡的形態學檢測

1、光學顯微鏡和倒置顯微鏡

（1）未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。

（2）染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。

2、熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：HO 33342(Hoechst 33342)，HO 33258(Hoechst 33258), DAPI。三種染料與 DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。

Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。

DAPI為半通透性，用于常規固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。

結果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質出現濃縮狀態；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體(圖1)。

3、透射電子顯微鏡觀察

結果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象（cavitations）的空泡結構(圖2)；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。圖2

七、凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國際上首先報導的一個擁有自己知識產權的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發現，凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現快速核轉位現象，伴隨著細胞核形態學的變化，持續較長時間，在凋亡小體中仍然可見。同時我們發現，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉位是細胞凋亡更早期發生的事件之一。進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉位具有普遍意義，不同細胞凋亡早期均出現TFAR19高表達和核轉位。這為研究細胞凋亡早期所發生的事件，提供了一種新的技術和指標。

第四篇：細胞增殖與毒性檢測實驗方法及經驗總結

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細胞增殖與毒性檢測實驗方法及經驗總結-CCK-8 法

實驗原理：Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

一、用途：

藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗等。

二、優點：

1.使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑； 2.CCK-8法能快速檢測；

3.CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細胞密度； 4.CCK-8法的重復性優于MTT 法，MTT 實驗生成的formazan不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機溶劑溶解；

5.而本方法產生的formazan是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差；

6.CCK-8法對細胞毒性小，可以多次測定選取最佳測定時間，與MTT 方法相比線性范圍更寬，靈敏度更高；

7.CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預制，即開即用。

三、所需設備及儀器：

1.10ul，100-200ul及多通道移液器 2.酶標儀（帶有450nm濾光片）3.96孔培養板

4.二氧化碳培養箱

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四、方法及步驟：

實驗一：細胞增殖分析

1、制備細胞懸液：細胞計數。

2、接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數（約1-2×104），每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做4-6個重復。3、37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議將槍頭浸入培養液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。或者直接配置含10%CCK8的培養基（現用現配），以換液的形式加入。

5、培養0.5-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認最佳條件（建議預實驗先摸清楚時間點）。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。

6、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

實驗二：細胞毒性分析

1、制備細胞懸液：細胞計數

2、接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數（約≥5×104），每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做4-6個重復。3、37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入不同濃度的毒性物質。5、37℃培養箱中培養：加入毒性物質的培養時間，要看毒性物質的性質和細胞的敏感性，一般要根據細胞周期來決定，起碼要一代以上的時間（例如：6、12、24、48、60、72小時）。

6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議將槍頭浸入培養液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。

7、培養0.5-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。

8、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

五、實驗注意事項：

·若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發生變化。

·如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。

·當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔(100 μl 培養基)。檢 一站式科研技術服務商—武漢金開瑞生物www.tmdps.cn

測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔(100 μl 培養基)。

·酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

· CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細胞。在細胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細菌污染，以免影響結果。

· CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。

·當在培養箱內培養時，培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔加培養基或者PBS，不作為測定孔用。

·在培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗時，還應考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。

·金屬對CCK-8顯色有影響：當終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話，將會100%抑制。

·懸浮細胞由于染色比較困難，一般需要增加細胞數量和延長培養時間。

·加入CCK-8 時，如果細胞培養時間較長，培養基顏色或pH 值已變化，建議換用新鮮的培養基。

·用酶標儀檢測前需確保每個孔內沒有氣泡，否則會干擾測定，且要擦拭干凈樣品板了。

六、經驗總結及分享：

CCK8的說明書大家一定要認真閱讀，里面很多細節的問題都有提到。而且說明書里提供的一些關于各種細胞的種板數都很有參考價值，因為那是反復驗證過的最佳數值。但無論如何，做這個試驗一定要摸條件。你就算再懶，這個懶不得，否則你都只是在做無用功。以下言論全部以細胞毒性試驗為前提，如果你做的是促進細胞生長的藥物的藥效實驗那就另當別論了。

摸條件包括

1、種板數；

2、種板后細胞的貼壁生長時間；

3、加藥后的孵育時間；

4、cck8試劑加入量；

5、cck8試劑加入后細胞孵育時間。看起來很多，其實這就是一個實驗。而且都是種的空白板，也就是不加藥物，只加細胞和CCK8。

1、種板數：這個要查文獻，看你所用細胞別人有無做過，把范圍大致找出。記住還要參考說明書，這個很重要。然后稀釋一系列濃度種板。首先你要觀察多長時間細胞可貼壁完全，一般貼壁生長24小時。然后還有在你的實驗時間內，不同細胞數下孔內生長情況。比如我擬定考察4天的時間，那么在4天內，細胞是剛好鋪滿還是堆積生長？因為每塊板都會設置對照孔，也就是含有細胞的培養基+CCK8，這個數值是板上的最大數值，CCK8試驗最佳OD 一站式科研技術服務商—武漢金開瑞生物www.tmdps.cn

值在1.0附近，所以這個最大數值最好能控制在1.0左右。我的實驗經驗是不要讓細胞長滿，一旦長滿了很難去判斷是否堆積生長了，對藥物能否順利進入細胞有影響此為其一，其二生長不均勻易導致孔間OD值數據偏差大，而且OD值也很大。

2、貼壁生長的時間我一般就直接讓它貼壁長24h了，這個時間細胞已經貼壁完全，而且這樣設置時間對自己安排實驗時間也方便。沒人愿意大半夜爬起來做實驗吧。

3、加藥后的孵育時間，我的實驗摸了3個時間，24h，48h，72h。然后根據數據的穩定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來選擇最好的時間。太長了就沒有必要了，細胞呆在孔里幾天不換液結果可想而知了。

4、CCK8試劑加入量，說明書中明確寫出建議加入量為培養基體積的10%。這里有一個問題：假設我要孔內是200微升的體系，即細胞懸液+藥液+CCK8=200微升呢，還是細胞懸液+藥液=200微升，cck8不算在體系內呢。關于這一點文獻報道不一致。本人最終采用的是后者。

5、cck8試劑加入后孵育時間，隨著時間的增加，OD值就會增大。總之原則就是把OD值控制在1.0左右。這里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。

再說一下關于種板設置問題。眾所周知周圍一圈孔因為邊緣效應都是不用來做實驗的。一般每組樣品我會設置6個復孔，得到的OD值去掉最大值與最小值，其余取平均值。我用的是排槍，會省很多力氣，但是也會增大組內誤差。這個只有通過校正移液槍和選用最適槍頭了。

做這個實驗我想大家遇到的最大問題應該是數據不穩定，組內數據偏差大。講了很多怎樣摸條件，其實就一個原則，把OD值控制在1.0左右。數據不穩定也只能通過增大樣品數，借助數據處理來彌補。還有實驗操作一定要仔細小心，盡量平行操作。

補充

突然想起用酶標儀檢測的時候還有一些細節問題。比如孔里不能有氣泡，如果有氣泡，就用吸耳球吹掉，氣泡會很影響檢測結果。樣品板要擦拭干凈，當然了，蓋子一定要記得拿掉啊Big Smile補充說明：這幾天有同學提出了一個問題，這個問題非常好也非常關鍵：將OD值控制在1.0這個說法是否有依據？

這里我還是想提醒大家一定要認真閱讀試劑盒的說明書，試想一個試劑盒的上市并且作為技術手段得到認可需要經過多少試驗反復驗證。我購買的是同仁化學研究所的CCK8試劑盒，說明書的P7Q23：OD值在什么范圍比較合適？答：一般情況下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比較好。

再說到自己的實驗設計，酶標儀的原理其實和紫外分光光度計是一樣的，所以UV上很多減小誤差的注意事項在酶標儀上同樣受用。這就能夠理解為什么不能有氣泡，為什么要擦拭干凈樣品板了。再者熟悉UV原理的同學會了解利用紫外檢測有一個最佳檢測范圍，超過了這個范圍，數值就會呈現出不穩定，無規律。（大家可以把自己的數據統計分析看看是不是數值控制在1.0附近更穩定。）而更有甚者就是超出了儀器的檢測范圍，儀器讀數為—。一站式科研技術服務商—武漢金開瑞生物www.tmdps.cn

我在摸條件的時候，cck8加入2.0h后檢測就出現過酶標儀讀不出數據的情況。

第五篇：高中生物實驗方法總結

1．顯微觀察法：如“觀察細胞有絲分裂”“觀察葉綠體和細胞質流動”“用顯微鏡觀察多種多樣的細胞”等。

2．觀色法：如“生物組織中還原糖、脂肪和蛋白質的鑒定”“觀察動物毛色和植物花色的遺傳”“DNA和RNA的分布”等。

3．同位素標記法（元素示蹤法）：如“噬菌體浸染細菌的實驗”“恩格爾曼實驗”等。

4．補充法：如用飼喂法研究甲狀腺激素，用注射法研究動物胰島素和生長激素，用移植法研究性激素等。

5．摘除法：如用“閹割法、摘除法研究性激素、甲狀腺激素或生長激素的作用”“雌蕊受粉后除去正在發育著的種子”等。

6．雜交法：如植物的雜交、測交實驗等。

7．化學分析法：如“番茄對Ca和Si的選擇吸收”“葉綠體中色素的提取和分離”等。

8．理論分析法：如“大、小兩種草履蟲的競爭實驗”“植物向性動物的研究”等。

9．模擬實驗法：如“滲透作用的實驗裝置”“分離定律的模擬實驗”等。

10．引流法：臨時裝片中液體的更換，用吸水紙在一側吸引，于另一側滴加換進的液體。

11．實驗條件的控制方法

⑴增加水中O2：泵入空氣或吹氣或放入綠色植物；

⑵減少水中O2：容器密封或油膜覆蓋或用涼開水；

⑶除去容器中CO2：NaOH溶液、Na2CO3溶液；

⑷除去葉中原有淀粉：置于黑暗環境（饑餓）；

⑸除去葉中葉綠素：酒精水浴加熱（酒精脫色）；

⑹除去植物光合作用對呼吸作用的干擾：給植株遮光；

⑺單色光的獲得：棱鏡色散或透明薄膜濾光；

⑻血液抗疑：加入檸檬酸鈉（去掉血液中的Ca2+）；

⑼線粒體提取：細胞勻漿離心；

⑽骨無機鹽的除去：HCl溶液；

⑾消除葉片中脫落酸的影響：去除成熟的葉片；

⑿消除植株本身的生長素：去掉生長旺盛的器官或組織（芽、生長點）；

⒀補充植物激素的方法：涂抹、噴灑、用含植物激素的羊毛脂膏或瓊脂作載體；

⒁補充動物激素的方法：口服（飼喂）、注射；

⒂阻斷植物激素傳遞：插云母片法。

12．實驗結果的顯示方法——實驗現象的觀測指標

⑴光合作用：O2釋放量或CO2吸收量或有機物生成量。例：水生植物可依氣泡的產生量或產生速率；離體葉片若事先沉入水底可依單位時間內上浮的葉片數目；植物體上的葉片可依指示劑（如碘液）處理后葉片顏色深淺。

⑵呼吸作用：O2吸收量或CO2釋放量或有機物消耗量

⑶原子或分子轉移途徑：同位素標記法或元素示蹤法

⑷細胞液濃度大小或植物細胞活性：質壁分離與復原

⑸溶液濃度的大小：U型管+半透膜

⑹甲狀腺激素作用：動物耗氧量、發育速度等

⑺生長激素作用：生長速度(體重、體長變化)

⑻胰島素作用：動物活動狀態（是否出現低血糖癥狀——昏迷）

⑼胰高血糖素作用：尿糖的檢測（在尿液中加班氏試劑進行沸水浴，看是否出現磚紅色沉淀）

⑽菌量的多少：菌落數、亞甲基藍褪色程度

⑾生長素作用及濃度高低的顯示：可通過去除胚芽鞘后補充生長素后的胚芽生長情況來判斷（彎曲、高度）

⑿淀粉：碘液（變藍色）

⒀還原性糖：斐林試劑/班氏試劑（沸水浴后生成磚紅色沉淀）

⒁CO2：Ca(OH)2溶液（澄清石灰水變渾濁)

⒂乳酸：pH試紙

⒃O2：余燼復燃

⒄蛋白質：雙縮脲試劑（紫色）

⒅脂肪：蘇丹Ⅲ染液(橘黃色）；蘇丹Ⅳ染液(紅色）

⒆DNA：二苯胺（沸水浴，藍色）、甲基綠（染色后，呈綠色）

⒇RNA：吡羅紅（呈紅色）、苔黑酚乙醇溶液