第一篇：細(xì)胞凋亡檢測方法小結(jié)

細(xì)胞凋亡檢測方法小結(jié)

一、定性和定量研究

只定性的研究方法：常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳、脈沖場倒轉(zhuǎn)瓊脂糖凝膠電泳、形態(tài)學(xué)觀察（普通光學(xué)顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡）

進(jìn)行定量或半定量的研究方法：各種流式細(xì)胞儀方法、原位末端標(biāo)記法、ELISA定量瓊脂糖凝膠電泳。

二、區(qū)分凋亡和壞死

可將二者區(qū)分開的方法：瓊脂糖凝膠電泳，形態(tài)學(xué)觀察（透射電鏡是是區(qū)分凋亡和壞死最可靠的方法），Hoechst33342/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測，AnnexinV/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測等。

不能將二者區(qū)分開的方法：原位末端標(biāo)記法、PI單染色法流式細(xì)胞儀檢測等。

三、樣品來源不同選擇 組織：主要用形態(tài)學(xué)方法(HE染色，透射電鏡、石蠟包埋組織切片進(jìn)行原位末端標(biāo)記，ELISA或?qū)⒔M織碾碎消化做瓊脂糖凝膠電泳)。

四、細(xì)胞凋亡檢測

1、早期檢測: 1)PS(磷脂酰絲氨酸)在細(xì)胞外膜上的檢測 2)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測 3)細(xì)胞色素C的定位檢測 4)線粒體膜電位變化的檢測

2、晚期檢測：

細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。

對于晚期檢測通常有以下方法：

1)TUNEL(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記)2)LM-PCR Ladder(連接介導(dǎo)的PCR檢測)3)Telemerase Detection(端粒酶檢測)

3、生化檢測：

1）典型的生化特征：DNA 片段化

2）檢測方法主要有：瓊脂糖凝膠電泳、原位末端標(biāo)記（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記）4）通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的 dNTP（多為dUTP）間接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測定量分析結(jié)果。可做細(xì)胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細(xì)胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測。

4、LM-PCR Ladder(連接介導(dǎo)的PCR檢測)當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞比例較小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。通過LM-PCR,連上特異性接頭，專一性地擴(kuò)增梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產(chǎn)生梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進(jìn)行比較。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成。

上述兩種方法都針對細(xì)胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細(xì)胞受到其它損傷（如機械損傷，紫外線等）也會產(chǎn)生這一現(xiàn)象，因此它對細(xì)胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。需結(jié)合其它的方法來檢測細(xì)胞凋亡。其它方法：

1）Telemerase Detection(端粒酶檢測)端粒酶是由RNA和蛋白組成，它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列，使細(xì)胞獲得“永生化”。正常體細(xì)胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細(xì)胞年齡、復(fù)制衰老或細(xì)胞凋亡的信號。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌細(xì)胞或凋亡細(xì)胞都具有端粒酶的活性。2）mRNA水平的檢測

研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細(xì)胞凋亡時表達(dá)異常的基因，檢測這些特異基因的表達(dá)水平也成為檢測細(xì)胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報道，F(xiàn)as 蛋白結(jié)合受體后能誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cells）等靶細(xì)胞。Bcl-2 和bcl-X(長的)作為抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的調(diào)節(jié)物，它們的表達(dá)水平比例決定了細(xì)胞是凋亡還是存活。用熒光定量PCR技術(shù)來檢測基因表達(dá)水平無疑比之前者更快更準(zhǔn)確。通過檢測fas, bax-alpha 和 bcl-X(長的)基因的 mRNA表達(dá)水平來進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測。

5、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測：

正常狀態(tài)下,谷光苷肽(GSH)作為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非常活躍時，細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低，從而使細(xì)胞色素C（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中，啟動凋亡效應(yīng)器caspase的級聯(lián)反應(yīng)。

6、細(xì)胞色素C的定位檢測

細(xì)胞色素C作為一種信號物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞漿，結(jié)合Apaf-1（apoptotic protease activating factor-1）后啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)：細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

7、線粒體膜電位變化的檢測：

1）線粒體跨膜電位的耗散與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系

2）近年來陸續(xù)有報道說明線粒體跨膜電位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰絲氨酸暴露于細(xì)胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散，細(xì)胞就會進(jìn)入不可逆的凋亡過程。

3）在細(xì)胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由于線粒體內(nèi)膜的通透性轉(zhuǎn)變，這是由于生成了動態(tài)的由多個蛋白質(zhì)組成的位于線粒體內(nèi)膜與外膜接觸位點的通透性轉(zhuǎn)變孔道(PT孔道)能穩(wěn)定線粒體跨膜電位就能防止細(xì)胞凋亡。線粒體在細(xì)胞凋亡作用中的進(jìn)一步證據(jù)：

1）若將純化的正常的線粒體與純化的細(xì)胞核在一起保溫，并不導(dǎo)致細(xì)胞核的變化。但若將誘導(dǎo)生成PT孔道的線粒體與純化的細(xì)胞核一同保溫，細(xì)胞核即開始凋亡變化。2）形態(tài)學(xué)觀察，看到細(xì)胞數(shù)目有限，統(tǒng)計學(xué)上的準(zhǔn)確性受影響；

3）凝膠電泳檢測DNA破壞了細(xì)胞的完整性也不能測出凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的比例； 4）流式細(xì)胞術(shù)可檢測細(xì)胞、亞細(xì)胞及分子水平的特征性變化。用于流式細(xì)胞儀檢測的染料：

PI、Hoechst、EB、DAPI、丫啶橙等，其中PI、Hoechst最常用。PI和Hoechst33342雙標(biāo)：

PI、Hoechst33342均可與細(xì)胞核DNA（或RNA）結(jié)合。但是PI不能通過正常的細(xì)胞膜，Hoechst則為膜通透性的熒光染料，故細(xì)胞在處于壞死或晚期調(diào)亡時細(xì)胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。正常細(xì)胞和中早期調(diào)亡細(xì)胞均可被Hoechst著色，但是正常細(xì)胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒；而調(diào)亡細(xì)胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。

故PI著色為壞死細(xì)胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調(diào)亡細(xì)胞。PI和Annexin-V雙標(biāo)：

磷脂酰絲氨酸（PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期（或細(xì)胞損傷時）PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。

Annexin-V（green）可以和磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合。因此細(xì)胞處于調(diào)亡或壞死時，Annexin-V可為陽性（早期的壞死細(xì)胞可能為陰性）。但是只有壞死的細(xì)胞PI是陽性

五、形態(tài)學(xué)觀察

1、普通光學(xué)顯微鏡觀察

2、透射電子顯微鏡觀察

3、熒光顯微鏡觀察

1、普通光鏡下觀察：

1)用蘇木素-伊紅（HE）染色：細(xì)胞核固縮碎裂、呈藍(lán)黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細(xì)胞），正常細(xì)胞核呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色，壞死細(xì)胞核呈很淡的藍(lán)色或藍(lán)色消失

2)Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常細(xì)胞核的色澤均一，凋亡細(xì)胞染色變深，壞死細(xì)胞染色淺或沒染上顏色 直接用倒置顯微鏡觀察： 1）細(xì)胞體積變小，全面皺縮；

2）凋亡小體為數(shù)個圓形小體圍繞在細(xì)胞周圍。

2、透射電子顯微鏡觀察

凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。

細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

3、熒光顯微鏡

常用的熒光染料：丫啶橙、PI、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等

Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。1）PI雙染色法基本原理

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，能進(jìn)入正常細(xì)胞膜而對細(xì)胞沒有太大得細(xì)胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強度要比正常細(xì)胞中要高。DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。碘化丙啶(PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而將細(xì)胞核染紅。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。

注意事項：細(xì)胞凋亡時，其DNA可染性降低被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時應(yīng)該注意。

六、細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)檢測方法: 細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進(jìn)的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca 2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進(jìn)行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標(biāo)記或染色，然后分析凋亡細(xì)胞。TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用。過氧化物酶標(biāo)記測定法

原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結(jié)合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產(chǎn)生很強的顏色反應(yīng)，特異準(zhǔn)確的定位出正在凋亡的細(xì)胞，因而可在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結(jié)合的配體，因而非特異性反應(yīng)很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎動物甾體激素的交叉反應(yīng)不到1％，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細(xì)胞Fc受體非特異性的吸附作用。

本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養(yǎng)的或從組織中分離的細(xì)胞凋亡測定。(一)試劑配制

1、磷酸緩沖液PBS（pH7.4）：磷酸鈉鹽 50mM，NaCl 200mM。

2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。

3、含2%H2O2的PBS緩沖液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS緩沖液 98.0ml。

4、TdT酶緩沖液（新鮮配）：Trlzma堿 3.63g用 0.1N HCl調(diào)節(jié)pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸鈉 29．96g和氯化鈷0.238g。

5、TdT酶反應(yīng)液：TdT酶32μl；TdT酶緩沖液 76μl，混勻，置于冰上備用。

6、洗滌與終止反應(yīng)緩沖液：氯化鈉 17.4g；檸檬酸鈉 8.82g；ddH2O 1000ml 7、0.05％二氨基聯(lián)苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 臨用前過濾后，加過氧化氫至0.02%。8、0.5％甲基綠（pH4.0）：甲基綠0.5g；0.1M乙酸鈉100ml。9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。

10、過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體（ONCOR）

（二）實驗步驟

1、標(biāo)本預(yù)處理：（1）石蠟包埋的組織切片預(yù)處理：將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無水乙醇洗兩次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室溫水解15min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。

（2）冰凍組織切片預(yù)處理：將冰凍組織切片置10％中性甲醛中，于室溫固定10min后，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃處理5min，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。

（3）培養(yǎng)的或從組織分離的細(xì)胞的預(yù)處理：將約 5 × 107個/ml細(xì)胞于 4％中性甲醛室溫中固定 10min。在載玻片上滴加 50～100μl細(xì)胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。

2、色缸中加入含2％過氧化氫的PBS，于室溫反應(yīng)5min。用PBS洗兩次，每次5min。

3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1～5min。

4、用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應(yīng)液，置濕盒中于37C反應(yīng) 1hr（注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應(yīng)液）。

5、將切片置于染色缸中，加入已預(yù)熱到37℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液，于37℃保溫30min，每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動。

6、組織切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應(yīng)30min。

7、用PBS洗4次，每次5min。

8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05％DAB溶液，室溫顯色3～6min。

9、用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。

10、于室溫用甲基綠進(jìn)行復(fù)染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最后1次靜置30s。依同樣方法再用100％正丁醇洗三次。

11、用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實驗結(jié)果。

（三）注意事項

一定要設(shè)立陽性和陰性細(xì)胞對照。陽性對照的切片可使用DNaseI部分降解的標(biāo)本，陽性細(xì)胞對照可使用地塞米松（1μM）處理3-4hr的大、小鼠胸腺細(xì)胞或人外周血淋巴細(xì)胞。陰性對照不加TdT酶，其余步驟與實驗組相同。

第二篇：細(xì)胞凋亡檢測方法總結(jié)

1、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。

在雙變量流式細(xì)胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為早期凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。右上象限為獨立的核（FITC-/PI+）。

Annexin-V可以再鈣離子存在的情況下，和細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，而磷脂酰絲氨酸的外翻是細(xì)胞凋亡的早期事件。

PI是一種DNA染料，當(dāng)細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，PI從而進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合。

所以

Annexin-V陰性-PI陰性 代表正常細(xì)胞

Annexin-V陽性-PI陰性 代表凋亡早期的細(xì)胞

Annexin-V陽性-PI陽性 代表凋亡晚期的細(xì)胞或壞死的細(xì)胞

Annexin-V陰性-PI陽性 一般不存在這一群細(xì)胞，如果出現(xiàn)這一團(tuán)細(xì)胞可能是PI標(biāo)記時間過長，或者操作過于劇烈而傷害到原本正常的細(xì)胞。（還有一種說法是凋亡最后階段的細(xì)胞，細(xì)胞已經(jīng)沒有細(xì)胞膜了說以不結(jié)合Annexin-V而只結(jié)合PI）

2.線粒體膜電位變化的檢測

實驗原理

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想熒光探針。可以檢測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1 聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產(chǎn)生紅色熒光（FL-2 通道）；在線粒體膜電位較低時，JC-1 不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1 為單體(monomer)，可以產(chǎn)生綠色熒光（FL-1 通道）。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。通過 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細(xì)胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個檢測指標(biāo)。

JC-1 單體的最大激發(fā)波長為 514nm，最大發(fā)射波長為 527nm；JC-1 聚合物(J-aggregates)的最大激發(fā)波長為 585nm，最大發(fā)射波長為 590nm。

A-C 為對照，細(xì)胞亞群(R1)在 FL-2和FL-1 通道同時顯示 JC-1 的熒光信號。D-F 顯示 JC-1在FL-2通道熒光信號降低的細(xì)胞亞群(R2)顯著增加，證明線粒體膜電位△Ψm 下降，細(xì)胞發(fā)生凋亡。凋亡與線粒體膜電位的去極化相關(guān)。細(xì)胞凋亡時線粒體膜電位發(fā)生去極化，JC-1進(jìn)入線粒體以單體形式存在，僅在Fl-1通道有熒光。

檢測原理

正常細(xì)胞：JC-1聚集在線粒體內(nèi)，形成多聚體，呈鮮紅色熒光，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有綠色；即紅光++，綠光++。

凋亡細(xì)胞：由于線粒體跨膜電位的破壞，不能聚集到線粒體內(nèi)，紅色熒光減弱，單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。即紅光+，綠光++

3、Caspase-3活性的檢測

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。

(1)Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚ADP-核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

(2)熒光分光光度計分析

檢測原理：活化的Caspsae與其特異性底物DEVD-pNA結(jié)合切割，釋放出游離pNA，通過測定其吸光度，根據(jù)其發(fā)光強度的高低代表其活化程度。

(3)流式細(xì)胞術(shù)分析

PharMingen 多克隆或單克隆 Caspase-3 抗體可以識別 Caspase-3 活化形式，它特異性識別由無活性的 Pro-Caspase-3 活化水解后的暴露的斷裂端, 熒光標(biāo)記多克隆兔抗 Active-Caspase-3 抗體為流式細(xì)胞術(shù)分析凋亡細(xì)胞的 Caspase-3 而設(shè)計。1、2、3是早期凋亡現(xiàn)象；

4、5是晚期凋亡現(xiàn)象。

4、TUNEL法(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記)

細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。

5、DNA ladder 細(xì)胞凋亡晚期，核酸內(nèi)切酶在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder。在瓊脂糖凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。壞死細(xì)胞---連續(xù)性條帶。

一、形態(tài)學(xué)觀察方法

1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細(xì)胞呈圓形，胞核深染，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團(tuán)塊狀，細(xì)胞表面有“出芽”現(xiàn)象。【蘇木精 — 伊紅染色法，(hematoxylin-eosin staining)，簡稱HE染色法。蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色 ；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。】

2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀察：活細(xì)胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。

3、臺盼藍(lán)染色：如果細(xì)胞膜不完整、破裂，臺盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞變藍(lán)，即為壞死。如果細(xì)胞膜完整，細(xì)胞不為臺盼藍(lán)染色，則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。此方法對反映細(xì)胞膜的完整性，區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助。

4、透射電鏡觀察：可見凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實，細(xì)胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。

一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測

1、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

（1）未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。

（2）染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。

2、熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：HO 33342(Hoechst 33342)，HO 33258(Hoechst 33258), DAPI。三種染料與 DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。

DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。

結(jié)果評判：細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體(圖1)。

3、透射電子顯微鏡觀察

結(jié)果評判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。圖2

七、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國際上首先報導(dǎo)的一個擁有自己知識產(chǎn)權(quán)的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細(xì)胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達(dá)水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，伴隨著細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化，持續(xù)較長時間，在凋亡小體中仍然可見。同時我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細(xì)胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進(jìn)一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細(xì)胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。這為研究細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提供了一種新的技術(shù)和指標(biāo)。

第三篇：細(xì)胞凋亡總結(jié)

細(xì)胞凋亡 凋亡（apoptosis）一般是指機體細(xì)胞在發(fā)育過程中或在某些因素作用下，通過細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death)。一般表現(xiàn)為單個細(xì)胞的死亡，且不伴有炎癥反應(yīng)。

1．細(xì)胞凋亡的意義 細(xì)胞凋亡普遍存在于生物界，既發(fā)生于生理狀態(tài)下，也發(fā)生于病理狀態(tài)下。由于細(xì)胞凋亡對胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）、組織內(nèi)正常細(xì)胞群的穩(wěn)定、機體的防御和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時引起的細(xì)胞損傷、老化、腫瘤的發(fā)生進(jìn)展起著重要作用，并具有潛在的治療意義，至今仍是生物醫(yī)學(xué)研究的熱點。細(xì)胞凋亡過多可引起疾病發(fā)生，如：①愛滋病的發(fā)展過程中，CD4+T細(xì)胞數(shù)目的減少；②移植排斥反應(yīng)中，細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞死亡；③缺血及再灌注損傷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的凋亡增多；④神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病（Alzheimer病、Parkinson's病）的重要原因是細(xì)胞凋亡的異常增加。神經(jīng)細(xì)胞的凋亡參與老化及Alzheimer病的發(fā)生。Alzheimer氏病是一種常見的老年病，患者在臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性的智力減退。⑤暴露于電離輻射可引起多種組織細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡過少也可引起疾病發(fā)生：在腫瘤的發(fā)生過程中，誘導(dǎo)凋亡的基因如p53等失活、突變，而抑制凋亡的基因如bCL-2等過度表達(dá)，都會引起細(xì)胞凋亡顯著減少，在腫瘤發(fā)病學(xué)中具有重要意義；針對自身抗原的淋巴細(xì)胞的凋亡障礙可導(dǎo)致自身免疫性疾病；某些病毒能抑制其感染細(xì)胞的凋亡而使病毒存活。

2．細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化 電鏡下細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化是多階段的，可分為 ①細(xì)胞漿濃縮，核糖體、線粒體等聚集，細(xì)胞體積縮小，結(jié)構(gòu)更加緊密； ②染色質(zhì)逐漸凝聚成新月狀附于核膜周邊，嗜堿性增強。細(xì)胞核固縮呈均一的致密物，進(jìn)而斷裂為大小不一的片段：

③胞膜不斷出芽、脫落，細(xì)胞變成數(shù)個大小不等的由胞膜包裹的凋亡小體(apoptotic bodies)。凋亡小體內(nèi)可含細(xì)胞漿、細(xì)胞器和核碎片，有的不含核碎片；④凋亡小體被具有吞噬功能的細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等吞噬、降解： ⑤凋亡發(fā)生過程中，細(xì)胞膜保持完整，細(xì)胞內(nèi)容物不釋放出來，所以不引起炎癥反應(yīng)。左圖 典型凋亡小體：染色質(zhì)呈新月狀，并可見細(xì)胞器 右圖 凋亡細(xì)胞：凋亡細(xì)胞(↑)與鄰近細(xì)胞分離 細(xì)胞凋亡 光鏡下凋亡一般累及單個或少數(shù)幾個細(xì)胞，凋亡細(xì)胞呈圓形，胞漿紅染，細(xì)胞核染色質(zhì)聚集成團(tuán)塊狀。由于凋亡細(xì)胞迅速被吞噬，又無炎癥反應(yīng)，因此，在常規(guī)切片檢查時，一般不易發(fā)現(xiàn)，但在某些組織如反應(yīng)性增生的次級淋巴濾泡生發(fā)中心則易見到。病毒性肝炎時，嗜酸性小體形成即是細(xì)胞凋亡。

3．細(xì)胞凋亡的機制 細(xì)胞凋亡是一系列依賴能量的分子水平變化的終點，細(xì)胞凋亡過程包括以下4個階段，即：誘導(dǎo)啟動、細(xì)胞內(nèi)調(diào)控、實施和凋亡細(xì)胞的吞噬搬運階段。

（1）誘導(dǎo)啟動 引起凋亡的信號可以來自細(xì)胞外，通過跨膜傳導(dǎo)對細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控分子起作用；也可以直接作用于細(xì)胞內(nèi)的靶分子。一些跨膜作用的抑制因子(如生長因子、某些激素、細(xì)胞因子、某些病毒蛋白等)具有抑制凋亡的作用，有利于細(xì)胞的生存。當(dāng)這些因子缺乏時，會激發(fā)細(xì)胞凋亡。另外一些跨膜作用的刺激因子通過受體與配體的結(jié)合而激活細(xì)胞凋亡程序，其中最重要的是腫瘤壞死因子受體家族。此外，尚有多種其它凋亡誘導(dǎo)因子。在胚胎發(fā)育過程中，形態(tài)發(fā)生蛋白、生長因子、分化因子對細(xì)胞凋亡可起促進(jìn)作用，又可起抑制作用。

（2）細(xì)胞內(nèi)調(diào)控 細(xì)胞內(nèi)的某些特異蛋白與細(xì)胞死亡信號相連接，這些特異蛋白對細(xì)胞的死亡與否起決定作用。BCL-2蛋白家族(BCL-2 family of proteins)是調(diào)節(jié)線粒體通透性的主要成分，通過形成同源(BCL-2/BCL-2, Bax/Bax)和異源(BCL-2/Bax)二聚體對細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控。BCL-2同源二聚體抑制細(xì)胞凋亡，Bax同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，細(xì)胞表面受體Fas(CD95)，屬TNFR家族，當(dāng)免疫細(xì)胞產(chǎn)生的Fas的配體與T細(xì)胞表面的Fas結(jié)合時，也啟動了死亡程序。這種Fas-Fas配體介導(dǎo)的凋亡在清除免疫反應(yīng)(如自身免疫病)中被激活的淋巴細(xì)胞非常重要。細(xì)胞凋亡后的梯狀DNA 足葉乙甙誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡后的梯狀DNA

（3）凋亡的實施 細(xì)胞凋亡的實施是通過蛋白水解的一系列連鎖反應(yīng)實現(xiàn)的。各種組織的細(xì)胞凋亡都要激活caspase家族。Caspase成員作為酶原的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)裂解激活后，迅速啟動序列性酶解死亡程序，裂解細(xì)胞骨架和細(xì)胞核蛋白基質(zhì)并激活了核酸內(nèi)切酶。在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用下，DNA進(jìn)行有控降解，產(chǎn)生長度為180～200 bp整倍數(shù)的DNA片段，這正好是纏繞組蛋白多聚體的長度，提示染色質(zhì)DNA恰好是在核小體與核小體連接部被切斷。DNA瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)ladder也成為檢測凋亡發(fā)生的重要標(biāo)志。

（4）凋亡細(xì)胞的吞噬搬運 凋亡細(xì)胞碎片的表面有標(biāo)志分子(血小板反應(yīng)素、粘附糖蛋白)有利于臨近的巨噬細(xì)胞以及其他細(xì)胞的識別、吞噬和處理。凋亡細(xì)胞的吞噬搬運過程非常有效而迅速，凋亡細(xì)胞很快消失，不留痕跡，也無炎癥反應(yīng)。

4．細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別 凋亡 壞死

1機制 基因調(diào)控的程序化（programmed）細(xì)胞死亡，主動進(jìn)行（自殺性）意外事故性（accident）細(xì)胞死亡，被動進(jìn)行（他殺性）

2誘因 生理性或輕微病理性刺激因子誘導(dǎo)發(fā)生，如生長因子缺乏 病理性刺激因子誘導(dǎo)發(fā)生，如缺氧、感染、中毒 死亡范圍 多為散在的單個細(xì)胞 多為聚集的大片細(xì)胞

3形態(tài)特征 細(xì)胞固縮，核染色質(zhì)邊集，細(xì)胞膜及各細(xì)胞器膜完整，膜可發(fā)泡成芽，形成凋亡小體 細(xì)胞腫脹，核染色質(zhì)絮狀或邊集，細(xì)胞膜及各細(xì)胞器膜溶解破壞，溶酶體酶釋放，細(xì)胞自溶

4生化特征 耗能的主動過程，有新蛋白合成，DNA早期規(guī)律降解為180-200bp片段，瓊脂凝膠電泳呈特征性梯帶狀 不耗能的被動過程，無新蛋白合成，DNA降解不規(guī)律，片段大小不一，瓊脂凝膠電泳不呈梯帶狀

5周圍反應(yīng) 不引起周圍組織炎癥反應(yīng)和修復(fù)再生，但凋亡小體可被鄰近細(xì)胞吞噬 引起周圍組織炎癥反應(yīng)和修復(fù)再生

細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬的生理功能

1及時清除細(xì)胞中隨時產(chǎn)生的“垃圾”（如破損或衰老的細(xì)胞器、長壽命蛋白質(zhì)、合成錯誤或折疊錯誤的蛋白質(zhì)等），2維持細(xì)胞自穩(wěn)狀態(tài).無論是腫瘤細(xì)胞還是正常細(xì)胞，保持一種基礎(chǔ)、低水平的自噬活性是至關(guān)重要的

3.同時，自噬的產(chǎn)物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)，又可為細(xì)胞提供一定的能量和合成底物.可以說，細(xì)胞自噬就是一個“備用倉庫”.鑒于上述作用，在正常生理情況下，細(xì)胞自噬可以幫助細(xì)胞在缺乏營養(yǎng)的惡劣環(huán)境中生存.自噬也可為腫瘤細(xì)胞帶來幾大好處：

（1）首先，腫瘤細(xì)胞本身就具有高代謝的特點，對營養(yǎng)和能量的需求比正常細(xì)胞更高，但腫瘤微環(huán)境往往不能如意，如腫瘤發(fā)生初始期到血管發(fā)生之前、腫瘤長大發(fā)生血管崩塌時、腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶游走時等都會出現(xiàn)營養(yǎng)不足或供應(yīng)中斷，而此時提高自噬活性可以有助于度過這一危機

（2）（2）當(dāng)化療、放療后，腫瘤細(xì)胞會產(chǎn)生大量的破損細(xì)胞器、損壞的蛋白質(zhì)等有害成分，此時提高自噬活性可及時清除這些有害物質(zhì)，并提供應(yīng)急的底物和能量為修復(fù)受損DNA贏得時間和條件.(3)另外，抑制細(xì)胞自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡，然而，細(xì)胞自噬在腫瘤的生成和癌癥的發(fā)展中到底扮演怎樣的角色，目前還沒有取得廣泛一致的意見.細(xì)胞自噬可以抑制細(xì)胞發(fā)生癌變，可能產(chǎn)生于以下幾種機制

(1)細(xì)胞自噬的抑制會加重壞死細(xì)胞的局部炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致腫瘤的生長(2)而細(xì)胞自噬可以清除壞死的細(xì)胞器，調(diào)整內(nèi)源性的壓力，從而穩(wěn)定基因組,減少細(xì)胞向癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)變.(3)細(xì)胞自噬既可以加強細(xì)胞檢驗點的檢查作用，又起到了穩(wěn)定基因組的作用，從而減少了細(xì)胞的癌變

第四篇：生物細(xì)胞凋亡總結(jié)

課程報告

都在說二十一世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)，很榮幸能夠進(jìn)入生物科學(xué)這個行業(yè)。

關(guān)于對自己所學(xué)專業(yè)，可能最初是興趣讓我來到這個專業(yè)，不是太清楚為什么會對這個專業(yè)有這么大的熱情，但真的很喜歡它。生物技術(shù)，最官方的定義是指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合其他基礎(chǔ)科學(xué)的科學(xué)原理，采用先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)手段，按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的。生物技術(shù)是人們利用微生物、動植物體對物質(zhì)原料進(jìn)行加工，以提供產(chǎn)品來為社會服務(wù)的技術(shù)。它主要包括發(fā)酵技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)。現(xiàn)代生物技術(shù)綜合基因工程、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、胚胎學(xué)、免疫學(xué)、有機化學(xué)、無機化學(xué)、物理化學(xué)、物理學(xué)、信息學(xué)及計算機科學(xué)等多學(xué)科技術(shù)，可用于研究生命活動的規(guī)律和提供產(chǎn)品為社會服務(wù)等。

再我自己看來生物技術(shù)其實是一個既可以看做一個基礎(chǔ)學(xué)科也可以看做是一個很新興的，綜合性的學(xué)科。其實生物技術(shù)這是一個很綜合性的學(xué)科，現(xiàn)在和很多領(lǐng)域接軌，對我們而言這是機遇和挑戰(zhàn)。

對我自己而言，我想在生物技術(shù)這方面有所建樹，最主要的還是在科研方面能攻克一些難題，雖然可能現(xiàn)在想法不是太成熟但是我相信經(jīng)過幾年的磨練與努力我能夠攻破這些難題。希望能夠在大一下就能夠進(jìn)入實驗室，學(xué)一些基礎(chǔ)的實驗技能為以后自己做項目打下基礎(chǔ)。

然后關(guān)于自己的專業(yè)，現(xiàn)在我們所學(xué)的知識其實普遍落后，教科書的編排更新不及時，可能我們學(xué)到的東西可能學(xué)校外面已經(jīng)開始產(chǎn)業(yè)化了，測序技術(shù)已經(jīng)開始第四代了，而我們可能畢業(yè)前一年才開始學(xué)習(xí)切片制作，學(xué)習(xí)的東西很古老，再就是我們這個專業(yè)，并沒有像其他幾大理科領(lǐng)域一樣有清晰的邏輯和量化，這導(dǎo)致了很多小領(lǐng)域只有開頭和結(jié)果而沒有一個可復(fù)制的過程，而沒有可復(fù)制的過程就代表著無法帶領(lǐng)這個行業(yè)產(chǎn)業(yè)化，因此，這個行業(yè)在沒有開源的情況下就無法支撐這個領(lǐng)域下的大多數(shù)學(xué)生的溫飽，就只能節(jié)流，這樣就導(dǎo)致了本專業(yè)的人才無法繼續(xù)從事與本專業(yè)有關(guān)行業(yè)，轉(zhuǎn)而從事其他行業(yè)，從而導(dǎo)致人才流失，最終專業(yè)發(fā)展緩慢。而談到生物技術(shù)不得不說到它和其他行業(yè)接軌這一問題，的確，和其他領(lǐng)域接軌形成交叉學(xué)科是一個理想的出路，如合成生物學(xué)，生物信息學(xué)，的確給生物注入了一股生機。但是我們都知道越巨大的事物邁步子很大也很緩慢，何況在人才流失的情況下。

說到這里，可能真的學(xué)習(xí)這個專業(yè)我們更多的是在學(xué)習(xí)了基礎(chǔ)課程后，自己學(xué)習(xí)最新更新的知識，在老師的指導(dǎo)下自己收集資料自己進(jìn)行實驗，再完成項目。

很多人對生物技術(shù)這個專業(yè)有很多的誤解，我們在完成自己研究項目的同時也有義務(wù)科普大眾。畢竟這也是吸引人才的重要途徑，同時也是解決本專業(yè)人才流失的好方法。

我自己有一個不成熟的想法，很久之前曾了解到俄羅斯的“永生計劃”它的設(shè)計活體意識轉(zhuǎn)移到機器人身上，對此幾乎大多數(shù)人是不看好，不支持的。而對于這個“永生計劃” 我有一個想法，癌細(xì)胞是無限增殖，如果我們能夠完全弄清楚癌細(xì)胞的增殖過程及機理，并能夠運用到人體衰老細(xì)胞中，對衰老細(xì)胞進(jìn)行基因修飾添加經(jīng)過改良的癌細(xì)胞中能夠無限增殖的基因，或許“永生”并非不可能。同樣的癌細(xì)胞的無限增殖基因或許也能在器官移植這一領(lǐng)域有所貢獻(xiàn)，也是利用無限增殖，讓器官細(xì)胞增殖，成長成完整的細(xì)胞。或許研究出癌細(xì)胞無限增殖的機理并提取其這個基因?qū)θ祟悤泻艽筘暙I(xiàn)。

至于疑惑這個方面就是在教材更新?lián)Q代不及時的情況下，我們是否只能通過課外閱讀這些方式來擴(kuò)展自己的知識面，還有就是技術(shù)的更新我們是否能夠跟的上，倘若有同學(xué)本科畢業(yè)便想進(jìn)入行業(yè)工作，最新的技術(shù)他們又要從何學(xué)習(xí)。最后關(guān)于實驗室，畢竟如果想要真的從事生物研究該如何合理利用現(xiàn)有資源來完成自己的項目。

最后我個人的話最想獲得的是關(guān)于癌細(xì)胞無限增殖機理方面的指導(dǎo)，和我不成熟構(gòu)想的可實施率。

以上是我個人對本專業(yè)的認(rèn)識及理解，以及對未來設(shè)想。

謝謝老師閱讀，有不正確的地方請老師批評指正。

第五篇：細(xì)胞凋亡實驗技術(shù)總結(jié)

細(xì)胞凋亡實驗技術(shù)總結(jié) 一形態(tài)學(xué)檢測

1、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡觀察法

未染色細(xì)胞:凋亡細(xì)胞體積變小、變形，膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，變圓，脫落。染色細(xì)胞:姬姆薩染色，瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀，形成凋亡小體。

2、熒光顯微鏡檢測法-熒光染料

例如，碘化丙啶(PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI 能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。選用536nm 激發(fā)光，細(xì)胞核呈紅色熒光。

3、電子顯微鏡

收集細(xì)胞，2.5%戊二醛4°C 固定24h，1%四氧化鋨后固定，丙酮梯度脫水，經(jīng)包埋劑浸透后環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。凋亡Ⅰ期的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)。Ⅱa 期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

4、激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)

FITC-AnnexinV+PI雙染，觀察凋亡過程中細(xì)胞膜PS表面的變化，并區(qū)分正常細(xì)胞(An-PI-)，早期凋亡細(xì)胞(An+PI-)，晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞(An+PI+)，細(xì)胞收集過程中出現(xiàn)的損傷細(xì)胞(An-PI+)。

二、細(xì)胞凋亡的生化及分子生物學(xué)檢測

1、DNA 斷裂檢測法

如使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，細(xì)胞凋亡時，核染色質(zhì)凝聚，染色質(zhì)DNA 在核小體單位之間的連接處斷裂。凋亡早期可形成50~300kbp 的DNA 大片段，晚期核酸內(nèi)切酶在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長度在180~200bp 整數(shù)倍的寡核苷酸片段。

2、膜聯(lián)蛋白V 法

磷脂酰絲氨酸(PS)位于正常細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS 可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面。Annexin-Ⅴ(膜聯(lián)蛋白-V)是一種分子量為35-36KD 的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與PS高親和力。將Annexin-Ⅴ進(jìn)行熒光素或生物素標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

3、細(xì)胞凋亡的酶Caspase檢測

檢測Caspase活力可用免疫雜交技術(shù)分析酶原的加工和底物水解的產(chǎn)物，或用人工底物檢測酶活力，也可對活化的Caspase做親和標(biāo)記。例如分析底物的水解產(chǎn)物，PARP(多聚ADP-核糖聚合酶)第一個被認(rèn)識的caspase-3底物，它的相對分子質(zhì)量為116000，水解后形成相對分子質(zhì)量為85000 及相對分子質(zhì)量為25000 的兩個片段，用抗相對分子質(zhì)量為85000 片段的抗體檢測細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。

4、線粒體膜勢能變化的檢測

線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強或減弱反映了線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的熒光強度或熒光顯微鏡觀察，拍照正常細(xì)胞中, Rh123 能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì)，熒光強度減弱或消失。而凋亡時，線粒體膜完整性破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，引起線粒體跨膜電位的崩潰, Rh123 重新釋放出線粒體, 從而發(fā)出強黃綠色熒光。