第一篇：細胞增殖與毒性檢測實驗方法及經驗總結

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細胞增殖與毒性檢測實驗方法及經驗總結-CCK-8 法

實驗原理：Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

一、用途：

藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗等。

二、優點：

1.使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑； 2.CCK-8法能快速檢測；

3.CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細胞密度； 4.CCK-8法的重復性優于MTT 法，MTT 實驗生成的formazan不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機溶劑溶解；

5.而本方法產生的formazan是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差；

6.CCK-8法對細胞毒性小，可以多次測定選取最佳測定時間，與MTT 方法相比線性范圍更寬，靈敏度更高；

7.CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預制，即開即用。

三、所需設備及儀器：

1.10ul，100-200ul及多通道移液器 2.酶標儀（帶有450nm濾光片）3.96孔培養板

4.二氧化碳培養箱

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四、方法及步驟：

實驗一：細胞增殖分析

1、制備細胞懸液：細胞計數。

2、接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數（約1-2×104），每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做4-6個重復。3、37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議將槍頭浸入培養液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。或者直接配置含10%CCK8的培養基（現用現配），以換液的形式加入。

5、培養0.5-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認最佳條件（建議預實驗先摸清楚時間點）。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。

6、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

實驗二：細胞毒性分析

1、制備細胞懸液：細胞計數

2、接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數（約≥5×104），每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做4-6個重復。3、37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入不同濃度的毒性物質。5、37℃培養箱中培養：加入毒性物質的培養時間，要看毒性物質的性質和細胞的敏感性，一般要根據細胞周期來決定，起碼要一代以上的時間（例如：6、12、24、48、60、72小時）。

6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議將槍頭浸入培養液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。

7、培養0.5-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。

8、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

五、實驗注意事項：

·若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發生變化。

·如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。

·當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔(100 μl 培養基)。檢 一站式科研技術服務商—武漢金開瑞生物www.tmdps.cn

測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔(100 μl 培養基)。

·酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

· CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細胞。在細胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細菌污染，以免影響結果。

· CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。

·當在培養箱內培養時，培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔加培養基或者PBS，不作為測定孔用。

·在培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗時，還應考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。

·金屬對CCK-8顯色有影響：當終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話，將會100%抑制。

·懸浮細胞由于染色比較困難，一般需要增加細胞數量和延長培養時間。

·加入CCK-8 時，如果細胞培養時間較長，培養基顏色或pH 值已變化，建議換用新鮮的培養基。

·用酶標儀檢測前需確保每個孔內沒有氣泡，否則會干擾測定，且要擦拭干凈樣品板了。

六、經驗總結及分享：

CCK8的說明書大家一定要認真閱讀，里面很多細節的問題都有提到。而且說明書里提供的一些關于各種細胞的種板數都很有參考價值，因為那是反復驗證過的最佳數值。但無論如何，做這個試驗一定要摸條件。你就算再懶，這個懶不得，否則你都只是在做無用功。以下言論全部以細胞毒性試驗為前提，如果你做的是促進細胞生長的藥物的藥效實驗那就另當別論了。

摸條件包括

1、種板數；

2、種板后細胞的貼壁生長時間；

3、加藥后的孵育時間；

4、cck8試劑加入量；

5、cck8試劑加入后細胞孵育時間。看起來很多，其實這就是一個實驗。而且都是種的空白板，也就是不加藥物，只加細胞和CCK8。

1、種板數：這個要查文獻，看你所用細胞別人有無做過，把范圍大致找出。記住還要參考說明書，這個很重要。然后稀釋一系列濃度種板。首先你要觀察多長時間細胞可貼壁完全，一般貼壁生長24小時。然后還有在你的實驗時間內，不同細胞數下孔內生長情況。比如我擬定考察4天的時間，那么在4天內，細胞是剛好鋪滿還是堆積生長？因為每塊板都會設置對照孔，也就是含有細胞的培養基+CCK8，這個數值是板上的最大數值，CCK8試驗最佳OD 一站式科研技術服務商—武漢金開瑞生物www.tmdps.cn

值在1.0附近，所以這個最大數值最好能控制在1.0左右。我的實驗經驗是不要讓細胞長滿，一旦長滿了很難去判斷是否堆積生長了，對藥物能否順利進入細胞有影響此為其一，其二生長不均勻易導致孔間OD值數據偏差大，而且OD值也很大。

2、貼壁生長的時間我一般就直接讓它貼壁長24h了，這個時間細胞已經貼壁完全，而且這樣設置時間對自己安排實驗時間也方便。沒人愿意大半夜爬起來做實驗吧。

3、加藥后的孵育時間，我的實驗摸了3個時間，24h，48h，72h。然后根據數據的穩定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來選擇最好的時間。太長了就沒有必要了，細胞呆在孔里幾天不換液結果可想而知了。

4、CCK8試劑加入量，說明書中明確寫出建議加入量為培養基體積的10%。這里有一個問題：假設我要孔內是200微升的體系，即細胞懸液+藥液+CCK8=200微升呢，還是細胞懸液+藥液=200微升，cck8不算在體系內呢。關于這一點文獻報道不一致。本人最終采用的是后者。

5、cck8試劑加入后孵育時間，隨著時間的增加，OD值就會增大。總之原則就是把OD值控制在1.0左右。這里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。

再說一下關于種板設置問題。眾所周知周圍一圈孔因為邊緣效應都是不用來做實驗的。一般每組樣品我會設置6個復孔，得到的OD值去掉最大值與最小值，其余取平均值。我用的是排槍，會省很多力氣，但是也會增大組內誤差。這個只有通過校正移液槍和選用最適槍頭了。

做這個實驗我想大家遇到的最大問題應該是數據不穩定，組內數據偏差大。講了很多怎樣摸條件，其實就一個原則，把OD值控制在1.0左右。數據不穩定也只能通過增大樣品數，借助數據處理來彌補。還有實驗操作一定要仔細小心，盡量平行操作。

補充

突然想起用酶標儀檢測的時候還有一些細節問題。比如孔里不能有氣泡，如果有氣泡，就用吸耳球吹掉，氣泡會很影響檢測結果。樣品板要擦拭干凈，當然了，蓋子一定要記得拿掉啊Big Smile補充說明：這幾天有同學提出了一個問題，這個問題非常好也非常關鍵：將OD值控制在1.0這個說法是否有依據？

這里我還是想提醒大家一定要認真閱讀試劑盒的說明書，試想一個試劑盒的上市并且作為技術手段得到認可需要經過多少試驗反復驗證。我購買的是同仁化學研究所的CCK8試劑盒，說明書的P7Q23：OD值在什么范圍比較合適？答：一般情況下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比較好。

再說到自己的實驗設計，酶標儀的原理其實和紫外分光光度計是一樣的，所以UV上很多減小誤差的注意事項在酶標儀上同樣受用。這就能夠理解為什么不能有氣泡，為什么要擦拭干凈樣品板了。再者熟悉UV原理的同學會了解利用紫外檢測有一個最佳檢測范圍，超過了這個范圍，數值就會呈現出不穩定，無規律。（大家可以把自己的數據統計分析看看是不是數值控制在1.0附近更穩定。）而更有甚者就是超出了儀器的檢測范圍，儀器讀數為—。一站式科研技術服務商—武漢金開瑞生物www.tmdps.cn

我在摸條件的時候，cck8加入2.0h后檢測就出現過酶標儀讀不出數據的情況。

第二篇：LDH乳酸脫氫酶細胞毒性檢測實驗方法

LDH乳酸脫氫酶細胞毒性檢測

LDH釋放檢測

方法：

a.根據細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96孔細胞培養板中，使待檢測時細胞密度不超過80-90%滿。

b.吸去培養液，用PBS液洗滌一次。換新鮮培養液(推薦使用含1%血清的低血清培養液或適當的無血清培養液)，將各培養孔分成如下幾組：包括無細胞的培養液孔(背景空白對照孔)，未經藥物處理的對照細胞孔(樣品對照孔)，未經藥物處理的用于后續裂解的細胞孔(樣品最大酶活性對照孔)，以及藥物處理的細胞孔(藥物處理樣品孔)，并做好標記。按照實驗需要給予適當藥物處理(如加入0-10μl左右特定的藥物刺激，可設置不同濃度，不同處理時間，對照孔中需加入適當的藥物溶劑對照)，繼續按常規培養。到預定的檢測時間點前1小時，從細胞培養箱里取出細胞培養板，在“樣品最大酶活性對照孔”中加入試劑盒提供的LDH釋放試劑，加入量為原有培養液體積的10%。加入LDH釋放試劑后，反復吹打數次混勻，然后繼續在細胞培養箱中孵育。

c.到達預定時間后，將細胞培養板用多孔板離心機400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應孔中，隨即進行樣品測定。

準備工作：

a.INT溶液(1X)的配置：根據所需的INT溶液(1X)的量，取適量INT溶液(10X)用INT稀釋液稀釋至1X。例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT稀釋液，混勻后即配置為200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜現配現用，配置后4℃保存可于當天使用，不宜配置后凍存。

b.LDH檢測工作液的配制: 根據待測定的樣品數(含對照)，參考下表在臨檢測前新鮮配制適量的檢測工作液。注意：LDH檢測工作液必須現配現用，配制和使用過程中均要注意適當避光。樣品測定:

a.各孔分別加入60μl LDH檢測工作液。

b.混勻，室溫(約25℃)避光孵育30min(可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側擺搖床上緩慢搖動)。然后在490nm處測定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波長作為參考波長進行雙波長測定。c.計算(測得的各組吸光度均應減去背景空白對照孔吸光度)

細胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度－樣品對照孔吸光度)/(細胞最大酶活性的吸光度－樣品對照孔吸光度)×100

d.可繪制細胞毒性曲線：縱座標為實際吸光度，橫坐標為藥物濃度；據此可計算該藥物作用特定時間的半致死劑量LD50。

第三篇：細胞凋亡檢測方法總結

1、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

PS轉移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為早期凋亡細胞，顯現（FITC+/PI-）。右上象限為獨立的核（FITC-/PI+）。

Annexin-V可以再鈣離子存在的情況下，和細胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸結合，而磷脂酰絲氨酸的外翻是細胞凋亡的早期事件。

PI是一種DNA染料，當細胞凋亡的晚期，細胞的細胞膜通透性增加，PI從而進入細胞核與DNA結合。

所以

Annexin-V陰性-PI陰性 代表正常細胞

Annexin-V陽性-PI陰性 代表凋亡早期的細胞

Annexin-V陽性-PI陽性 代表凋亡晚期的細胞或壞死的細胞

Annexin-V陰性-PI陽性 一般不存在這一群細胞，如果出現這一團細胞可能是PI標記時間過長，或者操作過于劇烈而傷害到原本正常的細胞。（還有一種說法是凋亡最后階段的細胞，細胞已經沒有細胞膜了說以不結合Annexin-V而只結合PI）

2.線粒體膜電位變化的檢測

實驗原理

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1 聚集在線粒體的基質(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產生紅色熒光（FL-2 通道）；在線粒體膜電位較低時，JC-1 不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1 為單體(monomer)，可以產生綠色熒光（FL-1 通道）。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。通過 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。

JC-1 單體的最大激發波長為 514nm，最大發射波長為 527nm；JC-1 聚合物(J-aggregates)的最大激發波長為 585nm，最大發射波長為 590nm。

A-C 為對照，細胞亞群(R1)在 FL-2和FL-1 通道同時顯示 JC-1 的熒光信號。D-F 顯示 JC-1在FL-2通道熒光信號降低的細胞亞群(R2)顯著增加，證明線粒體膜電位△Ψm 下降，細胞發生凋亡。凋亡與線粒體膜電位的去極化相關。細胞凋亡時線粒體膜電位發生去極化，JC-1進入線粒體以單體形式存在，僅在Fl-1通道有熒光。

檢測原理

正常細胞：JC-1聚集在線粒體內，形成多聚體，呈鮮紅色熒光，細胞質內有綠色；即紅光++，綠光++。

凋亡細胞：由于線粒體跨膜電位的破壞，不能聚集到線粒體內，紅色熒光減弱，單體的形式存在于胞質內發綠色熒光。即紅光+，綠光++

3、Caspase-3活性的檢測

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。

(1)Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚ADP-核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

(2)熒光分光光度計分析

檢測原理：活化的Caspsae與其特異性底物DEVD-pNA結合切割，釋放出游離pNA，通過測定其吸光度，根據其發光強度的高低代表其活化程度。

(3)流式細胞術分析

PharMingen 多克隆或單克隆 Caspase-3 抗體可以識別 Caspase-3 活化形式，它特異性識別由無活性的 Pro-Caspase-3 活化水解后的暴露的斷裂端, 熒光標記多克隆兔抗 Active-Caspase-3 抗體為流式細胞術分析凋亡細胞的 Caspase-3 而設計。1、2、3是早期凋亡現象；

4、5是晚期凋亡現象。

4、TUNEL法(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記)

細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。

5、DNA ladder 細胞凋亡晚期，核酸內切酶在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。細胞經處理后，采用常規方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。在瓊脂糖凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。壞死細胞---連續性條帶。

一、形態學觀察方法

1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有“出芽”現象。【蘇木精 — 伊紅染色法，(hematoxylin-eosin staining)，簡稱HE染色法。蘇木精染液為堿性，主要使細胞核內的染色質與胞質內的核糖體著紫藍色 ；伊紅為酸性染料，主要使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色。】

2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。

3、臺盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性，區別壞死細胞有一定的幫助。

4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。

一、細胞凋亡的形態學檢測

1、光學顯微鏡和倒置顯微鏡

（1）未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。

（2）染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。

2、熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：HO 33342(Hoechst 33342)，HO 33258(Hoechst 33258), DAPI。三種染料與 DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。

Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。

DAPI為半通透性，用于常規固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。

結果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質出現濃縮狀態；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體(圖1)。

3、透射電子顯微鏡觀察

結果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象（cavitations）的空泡結構(圖2)；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。圖2

七、凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國際上首先報導的一個擁有自己知識產權的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發現，凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現快速核轉位現象，伴隨著細胞核形態學的變化，持續較長時間，在凋亡小體中仍然可見。同時我們發現，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉位是細胞凋亡更早期發生的事件之一。進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉位具有普遍意義，不同細胞凋亡早期均出現TFAR19高表達和核轉位。這為研究細胞凋亡早期所發生的事件，提供了一種新的技術和指標。

第四篇：細胞凋亡檢測方法小結

細胞凋亡檢測方法小結

一、定性和定量研究

只定性的研究方法：常規瓊脂糖凝膠電泳、脈沖場倒轉瓊脂糖凝膠電泳、形態學觀察（普通光學顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡）

進行定量或半定量的研究方法：各種流式細胞儀方法、原位末端標記法、ELISA定量瓊脂糖凝膠電泳。

二、區分凋亡和壞死

可將二者區分開的方法：瓊脂糖凝膠電泳，形態學觀察（透射電鏡是是區分凋亡和壞死最可靠的方法），Hoechst33342/PI雙染色法流式細胞儀檢測，AnnexinV/PI雙染色法流式細胞儀檢測等。

不能將二者區分開的方法：原位末端標記法、PI單染色法流式細胞儀檢測等。

三、樣品來源不同選擇 組織：主要用形態學方法(HE染色，透射電鏡、石蠟包埋組織切片進行原位末端標記，ELISA或將組織碾碎消化做瓊脂糖凝膠電泳)。

四、細胞凋亡檢測

1、早期檢測: 1)PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測 2)細胞內氧化還原狀態改變的檢測 3)細胞色素C的定位檢測 4)線粒體膜電位變化的檢測

2、晚期檢測：

細胞凋亡晚期中，核酸內切酶在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。

對于晚期檢測通常有以下方法：

1)TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記)2)LM-PCR Ladder(連接介導的PCR檢測)3)Telemerase Detection(端粒酶檢測)

3、生化檢測：

1）典型的生化特征：DNA 片段化

2）檢測方法主要有：瓊脂糖凝膠電泳、原位末端標記（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記）4）通過DNA末端轉移酶將帶標記的 dNTP（多為dUTP）間接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯顯色或熒光檢測定量分析結果。可做細胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養物等多種樣本的檢測。

4、LM-PCR Ladder(連接介導的PCR檢測)當凋亡細胞比例較小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。通過LM-PCR,連上特異性接頭，專一性地擴增梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產生梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。

上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細胞受到其它損傷（如機械損傷，紫外線等）也會產生這一現象，因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。需結合其它的方法來檢測細胞凋亡。其它方法：

1）Telemerase Detection(端粒酶檢測)端粒酶是由RNA和蛋白組成，它可以自身RNA為模板逆轉錄合成端粒區重復序列，使細胞獲得“永生化”。正常體細胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細胞年齡、復制衰老或細胞凋亡的信號。研究發現，90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。2）mRNA水平的檢測

研究者們發現了很多在細胞凋亡時表達異常的基因，檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種常用方法。據報道，Fas 蛋白結合受體后能誘導癌細胞中的細胞毒性T細胞（cytotoxic T cells）等靶細胞。Bcl-2 和bcl-X(長的)作為抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的調節物，它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。用熒光定量PCR技術來檢測基因表達水平無疑比之前者更快更準確。通過檢測fas, bax-alpha 和 bcl-X(長的)基因的 mRNA表達水平來進行細胞凋亡的檢測。

5、細胞內氧化還原狀態改變的檢測：

正常狀態下,谷光苷肽(GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被去除。當細胞內GSH的排除非常活躍時，細胞液就由還原環境轉為氧化環境，這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低，從而使細胞色素C（三羧酸循環中的重要組分）從線粒體內轉移到細胞液中，啟動凋亡效應器caspase的級聯反應。

6、細胞色素C的定位檢測

細胞色素C作為一種信號物質，在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞漿，結合Apaf-1（apoptotic protease activating factor-1）后啟動caspase級聯反應：細胞色素C/Apaf-1復合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

7、線粒體膜電位變化的檢測：

1）線粒體跨膜電位的耗散與細胞凋亡有密切關系

2）近年來陸續有報道說明線粒體跨膜電位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰絲氨酸暴露于細胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散，細胞就會進入不可逆的凋亡過程。

3）在細胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由于線粒體內膜的通透性轉變，這是由于生成了動態的由多個蛋白質組成的位于線粒體內膜與外膜接觸位點的通透性轉變孔道(PT孔道)能穩定線粒體跨膜電位就能防止細胞凋亡。線粒體在細胞凋亡作用中的進一步證據：

1）若將純化的正常的線粒體與純化的細胞核在一起保溫，并不導致細胞核的變化。但若將誘導生成PT孔道的線粒體與純化的細胞核一同保溫，細胞核即開始凋亡變化。2）形態學觀察，看到細胞數目有限，統計學上的準確性受影響；

3）凝膠電泳檢測DNA破壞了細胞的完整性也不能測出凋亡細胞占總細胞的比例； 4）流式細胞術可檢測細胞、亞細胞及分子水平的特征性變化。用于流式細胞儀檢測的染料：

PI、Hoechst、EB、DAPI、丫啶橙等，其中PI、Hoechst最常用。PI和Hoechst33342雙標：

PI、Hoechst33342均可與細胞核DNA（或RNA）結合。但是PI不能通過正常的細胞膜，Hoechst則為膜通透性的熒光染料，故細胞在處于壞死或晚期調亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。正常細胞和中早期調亡細胞均可被Hoechst著色，但是正常細胞核的Hoechst著色的形態呈圓形，淡蘭色，內有較深的蘭色顆粒；而調亡細胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。

故PI著色為壞死細胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調亡細胞。PI和Annexin-V雙標：

磷脂酰絲氨酸（PS）正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期（或細胞損傷時）PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。

Annexin-V（green）可以和磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結合。因此細胞處于調亡或壞死時，Annexin-V可為陽性（早期的壞死細胞可能為陰性）。但是只有壞死的細胞PI是陽性

五、形態學觀察

1、普通光學顯微鏡觀察

2、透射電子顯微鏡觀察

3、熒光顯微鏡觀察

1、普通光鏡下觀察：

1)用蘇木素-伊紅（HE）染色：細胞核固縮碎裂、呈藍黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細胞），正常細胞核呈均勻淡藍色或藍色，壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失

2)Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常細胞核的色澤均一，凋亡細胞染色變深，壞死細胞染色淺或沒染上顏色 直接用倒置顯微鏡觀察： 1）細胞體積變小，全面皺縮；

2）凋亡小體為數個圓形小體圍繞在細胞周圍。

2、透射電子顯微鏡觀察

凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。

細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質出現濃縮狀態；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。

3、熒光顯微鏡

常用的熒光染料：丫啶橙、PI、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等

Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI三種染料與DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。1）PI雙染色法基本原理

Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，能進入正常細胞膜而對細胞沒有太大得細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高。DAPI為半通透性，用于常規固定細胞的染色。碘化丙啶(PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而將細胞核染紅。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

注意事項：細胞凋亡時，其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結構的改變使其與染料結合的能力發生改變所致。在分析結果時應該注意。

六、細胞凋亡的分子生物學檢測方法: 細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca 2+和Mg2+依賴的核酸內切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3’-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標記或染色，然后分析凋亡細胞。TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。過氧化物酶標記測定法

原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產生很強的顏色反應，特異準確的定位出正在凋亡的細胞，因而可在普通光學顯微鏡下進行觀察。

毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結合的配體，因而非特異性反應很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎動物甾體激素的交叉反應不到1％，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細胞Fc受體非特異性的吸附作用。

本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養的或從組織中分離的細胞凋亡測定。(一)試劑配制

1、磷酸緩沖液PBS（pH7.4）：磷酸鈉鹽 50mM，NaCl 200mM。

2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。

3、含2%H2O2的PBS緩沖液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS緩沖液 98.0ml。

4、TdT酶緩沖液（新鮮配）：Trlzma堿 3.63g用 0.1N HCl調節pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸鈉 29．96g和氯化鈷0.238g。

5、TdT酶反應液：TdT酶32μl；TdT酶緩沖液 76μl，混勻，置于冰上備用。

6、洗滌與終止反應緩沖液：氯化鈉 17.4g；檸檬酸鈉 8.82g；ddH2O 1000ml 7、0.05％二氨基聯苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 臨用前過濾后，加過氧化氫至0.02%。8、0.5％甲基綠（pH4.0）：甲基綠0.5g；0.1M乙酸鈉100ml。9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。

10、過氧化物酶標記的抗地高辛抗體（ONCOR）

（二）實驗步驟

1、標本預處理：（1）石蠟包埋的組織切片預處理：將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無水乙醇洗兩次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室溫水解15min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2min，然后按下述步驟2進行操作。

（2）冰凍組織切片預處理：將冰凍組織切片置10％中性甲醛中，于室溫固定10min后，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃處理5min，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進行操作。

（3）培養的或從組織分離的細胞的預處理：將約 5 × 107個/ml細胞于 4％中性甲醛室溫中固定 10min。在載玻片上滴加 50～100μl細胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進行操作。

2、色缸中加入含2％過氧化氫的PBS，于室溫反應5min。用PBS洗兩次，每次5min。

3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1～5min。

4、用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應液，置濕盒中于37C反應 1hr（注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應液）。

5、將切片置于染色缸中，加入已預熱到37℃的洗滌與終止反應緩沖液，于37℃保溫30min，每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動。

6、組織切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應30min。

7、用PBS洗4次，每次5min。

8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05％DAB溶液，室溫顯色3～6min。

9、用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。

10、于室溫用甲基綠進行復染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最后1次靜置30s。依同樣方法再用100％正丁醇洗三次。

11、用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、干燥后，在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結果。

（三）注意事項

一定要設立陽性和陰性細胞對照。陽性對照的切片可使用DNaseI部分降解的標本，陽性細胞對照可使用地塞米松（1μM）處理3-4hr的大、小鼠胸腺細胞或人外周血淋巴細胞。陰性對照不加TdT酶，其余步驟與實驗組相同。

第五篇：細胞裂解實驗方法總結

細胞裂解是改變細胞通透性和活性的重要實驗方法。主要分為化學法和機械法，前者比較溫和，后者雖然產量高，但反應更劇烈，很有可能造成細胞中的DNA斷裂。本文主要是介紹細胞的裂解方法以及實驗過程中的方法探討。

裂解方法包括化學裂解、酶裂解和機械裂解。化學裂解和酶裂解通常是比較溫和的方法，通常會很少使DNA 斷裂。這兩種方法(包括SDS 和溶菌酶處理等)提取純化DNA中常用的方法。機械裂解可以更均一的裂解細胞，同化學裂解相比，機械處理具有更高的裂解效率和更低的選擇性。機械處理可以更劇烈和全面的裂解細胞，但也會造成DNA 的斷裂。

一、機械裂解法主要有以下兩種：

1.熱休克(Thermal shock)，既反復凍溶法，是一種常用的機械裂解方式比，通常由冷凍和解凍兩部分組成(freezing and thawing)。原理：由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。冷凍通常在液氮或-20 ℃ 冰上進行，解凍可以在37、50、65 或100 ℃水浴中進熱休克比化學裂解溫和，但是很有效，有資料表明用熱休克和溶菌酶與SDS的方法獲得了90%的細胞裂解率。

2.超聲波處理(Ultrasonication)既利用超聲加熱的方法，把細胞破碎。但這種處理會導致DNA 的斷裂，所以加熱不宜過劇烈，要設定好超聲時間和間隙時間，一般超聲時間不超過5秒，間隙時間最好大于超聲時間，這些都有利于保護酶的活性。bead-beating 也是常用的機械處理方式，有報道指出bead-beating 比熱休克和化學裂解的細胞裂解效果更好雖然DNA產量較高，但通常得到的DNA片段較小。

二、化學裂解和酶裂解法(在提核酸時聯合使用)主要是裂解液處理法，細胞裂解液的主要目的有以下幾種：

（1）利用去污劑破壞脂質雙分子層，破裂細胞；

（2）溶解蛋白；

（3）蛋白變性使其穩定；

（4）抑制蛋白酶活性。

主要根據不同的目的，裂解液的組成有所不同，主要有提取核酸和蛋白兩中。在提取RNA或DNA時，我們主要是要充分裂解細胞，得到更多的核酸；如果我們的目的是蛋白，那要根據蛋白的位置、特性等因素考慮裂解液，在提取蛋白后，再根據實驗需要復性蛋白等。以下是細胞裂解中常用試劑和其作用： 50 mMTris-HCl pH 7.4(緩沖體系)，150 mMNaCl(等滲體系)，1 mM PMSF(強大的蛋白酶抑制劑)，1 mM EDTA(變性劑和穩定劑)，5 μg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制劑)，5 μg/ml Leupeptin(蛋白酶抑制劑)，1% Triton x-100(破壞細胞)，1% Sodium deoxycholate(中度變性劑和蛋白溶解劑)，0.1% SDS(強變性劑和蛋白溶解劑)。7M 尿素，2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解)，蛋白酶K等。細胞裂解時間把握問題：孔板里細胞用PBS洗2次后，加入細胞裂解液，然后去測總蛋白含量和酶的活力，不知道細胞要裂解到什么程度? 答：因為所用的細胞類型不一樣，所以實驗的條件也需要摸索，建議這樣來做：加入細胞裂解液后，不同時間取樣，以時間和總蛋白含量和酶的活力作曲線，這樣就可以找到裂解的最佳時間，僅供參考。

原核表達的細胞裂解問題：做原核表達，用BL21表達，之后如何裂解細胞才行呢?我的菌液只有300微升，說明書上用超聲裂解細胞，但沒給出具體做法，我們這只有大的探頭，不好做，有什么好的辦法么? 要是用超聲裂解，要怎么做才行?我是超聲15 s間隔10 s座4次。裂解不好，應該怎樣改呀?!答：請試一試IFCC推薦法： 1.收集細胞懸液

2.4 ℃ 低溫離心(3000 rpm，5min)3.棄上清，加入一定量PBS(200 ul)，輕輕吹打混勻，-20 ℃ 冷凍30 min，37 ℃ 解凍，如此反復3次，可形成細胞裂解液

三、western blot細胞裂解方法個人小結：

過些天準備做western blot，昨天就提前把細胞裂解了，提出蛋白來保存。一下是我做的方法，大家參考，可能有不正確的地方，希望大家指出來，謝謝!1.取一瓶細胞(100 ml的瓶子)，PBS洗2次，胰酶消化，加入10 ml 培養液，制備成細胞懸液；

2.將細胞懸液移入10 ml離心管中，4 ℃，2500 rpm，離心5 min；

3.棄上清，加入預冷的PBS(即4 ℃ 存放的PBS)于離心管中，吹打，4 ℃，2500 rpm，離心5min；棄上清，重復上述步驟一次；共洗細胞2次，充分洗掉培養液；

4.棄上清，加入200 ul細胞裂解液(每1 ml裂解液中加入10 ulPMSF)，置于冰上，裂解40 min～1 h；裂解過程中可用槍頭吹打或間斷搖動離心管，以使蛋白充分裂解； 5.取出離心管，于4 ℃，12000 rpm，離心5 min； 6.將上清移入EP管中，-20 ℃ 保存，即可。

注：本來應該在培養瓶或培養皿中裂解，但出于某種原因，我為節約細胞裂解液，故試著在離心管中裂解，不知道這樣裂解是否充分。但我想這種方法也是可以考慮的。

四、核蛋白裂解液配方與步驟： 1.核蛋白裂解液配方 Buffer A 10 mM HEPES 1.5 mM MgCl2 10 mMKCl 0.5 mM DTT，0.05% NP40(or 0.05% Igepal or Tergitol)pH 7.9 Buffer B 5 mM HEPES 1.5 mM MgCl2 0.2 mM EDTA 0.5 mM DTT 26% glycerol(v/v)，pH 7.9 2.核蛋白裂解操作步驟 Method 1.Prepare 1 ml of buffer A with added cocktail of usual inhibitors from frozen stock and store on ice.2.Add 500 μl of buffer a per large petri dish on ice and scrape thoroughly，leave on ice for 10 min.3.Centrifuge at 4 °C at 3000 rpm for 10 min.4.Remove supernatant and keep it(this will contain everything except large plasma membrane pieces，DNA，nucleoli)，extract out 10 μl for Bradford assay.5.On ice resuspend pellet in 374 μl of buffer B and add 26 μl of 4.6 M NaCl to give 300mM NaCl(high salt helps lyse membranes and forces DNA into solution).6.Homogenize with 20 full strokes in Dounce or glass homogenizer on ice.7.Leave on ice for 30 min.8.Centrifuge at 24，000 g for 20 min at 4 °C.9.Aliquot supernatant，remove 10 μl for Bradford assay and store at-70 °C.細胞裂解機制被廣泛應用于各類的生物實驗中，最突出的當屬WB。為達到最佳的實驗結果，需要注意的是所有的實驗步驟都需在四度以下進行，并且避免過多的反復凍融。而且整個實驗過程中記得戴手套。編輯： 嗚咽